WO2010137780A1 - 줄기세포의 생착률 향상을 위한 생분해성 봉합사형 세포 전달체 - Google Patents

줄기세포의 생착률 향상을 위한 생분해성 봉합사형 세포 전달체 Download PDF

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WO2010137780A1
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suture
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유수정
유기동
박규남
채규태
문석환
김한준
위정희
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가톨릭대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a biodegradable suture cell type cell carrier, a method for producing the same, and a biodegradable suture using the same. More particularly, the present invention relates to a biodegradable suture material comprising a biodegradable polymer material, It is possible to improve cell affinity by adhesion of a cell affinity substance after surface modification with a hydrophilic property by fixing a compound containing a functional group and to proliferate cells or a living tissue in the above bulky structure, A biodegradable suture cell type cell carrier useful for improving the engraftment rate of stem cells, a method for producing the same, and a biodegradable suture using the same.
  • stem cell utilization has been evaluated as a state-of-the-art medical technology that can bring about dramatic changes in drug and surgery-oriented clinical treatments.
  • tissue engineering agent refers to a method of introducing a delivery medium into a stem cell to take a biocompatible material in a suitable form, and then culturing the stem cell to apply it to a site requiring treatment.
  • tissue engineering agents can be manufactured in various forms depending on the disease site.
  • biodegradable synthetic polymer materials used in tissue engineering preparations are hydrophobic materials, they are required to be treated with hydrophilic materials for tissue engineering applications.
  • the support made of a hydrophobic material floats in the cell culture solution, it is difficult to raise the cell, and the surface modification should precede not only a role as a support but also a role for doubling the cell growth and the function of the cell itself.
  • the present inventors have made efforts to increase the usability of a cell culture support made of a hydrophobic material.
  • a biodegradable synthetic polymer can be used as a hydrophilic material.
  • the present invention has been completed by confirming the function as a support for cell culture by not only improving cell affinity by adhering a cell affinity substance after the modification, but also being advantageous in propagation of a cell or a living tissue in the above-mentioned bulky structure .
  • An object of the present invention is to provide a biodegradable suture cell type cell carrier in which a surface of a biodegradable suture having a partially bulky structure is hydrophilically surface-modified and then a cell affinity substance is adhered, and a method for producing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a biodegradable suture which has hydrophilically surface modified biodegradable suture surface of a hydrophilic material with hydrophilic structure and then adheres a cell affinity substance to improve the engraftment rate of stem cells.
  • the present invention relates to a method for producing a biodegradable suture comprising the steps of fixing a hydrophilic functional compound on a surface of a biodegradable suture made of a biodegradable polymer material having a partially bulky structure to hydrophilically surface-
  • a biodegradable suture cell type cell carrier in which a harmful substance is adhered is provided.
  • the biodegradable suture-type cell transporter of the present invention functions as a supporter for cell culture because it is advantageous in that the cell or the biotissue grows in the bulky structure.
  • the biodegradable suture- .
  • the biodegradable suture-type cell carrier of the present invention is partially provided with a bulky property of 150 to 1000% in a multifilament false-twist yarn made of a biodegradable polymer material, and the biodegradable multifilament false- Mu m.
  • the biodegradable polymer material used in the present invention is a homopolymer of a compound selected from the group consisting of glycolide, glycolic acid, lactide, lactic acid, caprolactone, dioxanone, trimethylene carbonate and ethylene glycol, , And more preferably a copolymer obtained by copolymerizing glycolide and lactide in a weight ratio of 90:10 to 70:30.
  • the compound containing a hydrophilic functional group may be any hydrophilic functional group selected from the group consisting of an amine group (-NH 2 ), a carboxyl group (-COOH) and a hydroxyl group (-OH) And more preferably a hydrophilic amine compound is used.
  • the cell affinity substance can induce adhesion and proliferation of the cell, can affect the intrinsic function of the cell, or can be used as an extracellular substrate including a motif including a peptide (RGD).
  • RGD a motif including a peptide
  • Collagen, gelatin, laminin, fibronectin, galactose and chitosan can be used.
  • the present invention provides a method for producing the biodegradable suture cell type cell carrier. More specifically, a process for partially imparting a bulky structure to a multifilament false twist yarn made of a biodegradable polymer material, a process for twisting or braiding a multifilament false twist yarn having the above-mentioned bulky structure, A step of adhering a compound containing a hydrophilic functional group to the surface of the multifilament false-twist yarn to which the bulky structure is imparted by a plasma chemical vapor deposition method, and a step of adhering a cell affinity substance using a coupling agent after the fixing .
  • the monofilament diameter of the multifilament false-twist yarns is 5 to 30 ⁇ ⁇ , and the multifilament false-twist yarns have a merged diameter of 40 to 1000 ⁇ ⁇ .
  • the multifilament false twist yarns used in the production method of the present invention partially have a bulky property of 150 to 1000%, and the multifilament false twist yarns having the bulky structure have pores of 1 to 150 mu m.
  • the compound containing a hydrophilic functional group is fixed by the plasma chemical vapor deposition method under a low pressure of 25 mtorr or less and a power of 50 to 100 W.
  • the hydrophilic functional group may be any one selected from the group consisting of an amine group (-NH 2 ), a carboxyl group (-COOH) and a hydroxyl group (-OH) .
  • the cell affinity substance of the present invention can induce adhesion and proliferation of cells and can affect the intrinsic function of the cell, or an extracellular matrix including a motif including a peptide (RGD) can be used.
  • RGD an extracellular matrix including a motif including a peptide
  • any one selected from the group consisting of collagen, gelatin, laminin, fibronectin, galactose, and chitosan is used, and in the examples of the present invention, galactose or collagen is described but is not limited thereto .
  • the present invention provides a biodegradable multifilament false twist yarn having a surface of a draw filed yarn (hereinafter referred to as " DTY ") partially having a bulky property of 150 to 1000% and pores of 1 to 150 ⁇ , A biodegradable suture in which a cell-affinity substance is adhered after a compound containing a hydrophilic functional group is fixed.
  • biodegradable polymer material a copolymer obtained by copolymerizing glycolide and lactide in a weight ratio of 90:10 to 70:30 is used.
  • biodegradable suture wherein a hydrophilic amine compound is fixed on the biodegradable multifilament false twist yarn (DTY) surface, and then collagen is adhered as a cell affinity substance.
  • DTY biodegradable multifilament false twist yarn
  • a biodegradable suture cell type cell carrier in which a biodegradable suture made of a biodegradable polymer material is hydrophilically surface-modified and then a cell affinity substance is adhered, and in particular,
  • the suture suture is a multifilament false twist yarn structure having a bulky structure, and cells or living tissues are proliferated in the bulky structure.
  • the present invention also relates to a biodegradable suture material comprising a biodegradable polymer material having a bulky structure and hydrophilically surface-modifying the surface of the biodegradable suture material to improve cell affinity and improve the engraftment rate of stem cells, .
  • FIG. 1 is a photograph of a biodegradable multifilament false-twist yarn with a bulky structure according to the present invention
  • FIG. 2 shows the result of measurement of the chemical structure change using FTIR-ATR in the surface treatment reaction of the biodegradable multifilament false-twist yarn with the bulky structure of the present invention.
  • Fig. 3 shows the result of measurement of chemical structure change using ESCA in the surface treatment reaction of the biodegradable multifilament false-twist yarn with the bulky structure of the present invention.
  • Fig. 4 shows C1s peaks of PLGA modified by surface treatment during ESCA measurement of Fig. 3.
  • Fig. 5 shows the O1s peak of PLGA modified by surface treatment during ESCA measurement of Fig. 3.
  • FIG. 6 is a graph showing the surface roughness of the biodegradable multifilament false-twist yarn to which the present invention is applied by using the AFM in the surface treatment reaction.
  • Fig. 7 shows the result of cell proliferation after the surface treatment reaction of the biodegradable suture with the bulky structure of the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph showing cell proliferation after one week of cell culture in biodegradable suture without surface treatment.
  • FIG. 9 is a photograph of cell proliferation after one week of cell culture in a biodegradable suture provided with the surface-treated bulky structure of the present invention.
  • the present invention relates to a biodegradable suture made of a biodegradable polymer material having a partially bulky structure and a method of surface-modifying the surface of the biodegradable suture by hydrophilically fixing a compound containing a hydrophilic functional group and then sticking the cell-
  • a biodegradable suture cell type cell carrier capable of proliferating cells or living tissues in a bulky structure is provided.
  • the biodegradable suture-type cell carrier of the present invention uses a false-twist yarn (DTY) obtained by subjecting a multifilament made of a biodegradable polymer material to a stretch toughening treatment, and has bulkiness and excellent softness, which are characteristics inherent to false twist yarn. Further, By providing the bulky structure of the multifilament false twist yarn partially, it is suitable for cell culture, cell delivery, or drug delivery through the bulky structure when applied to medical applications.
  • DTY false-twist yarn
  • the term " bulky structure" refers to a structure in which a plurality of pores of 1 mu m or more exist between fibers. &Quot; Bulk property " refers to a structure of multifilament yarn made of biodegradable polymer material, And the biodegradable multifilament false twist yarns are partially imparted with a bulge property of 150 to 1000%, more preferably 200 to 600% by the above-mentioned twisting or braiding treatment it means.
  • the multifilament false wares of the present invention have a bulky structure having pores of 1 to 150 mu m, more preferably 5 to 50 mu m, it is easy to form a gas space open structure due to high porosity.
  • the bulkiness of the multifilament false-twist yarns of the present invention can be freely controlled depending on the intended use and objects such as cell culture, cell transfer or drug delivery, but when processed to less than 150%, the pores between the yarns become smaller, It is difficult to proliferate and the cell or drug content which can be delivered into the living body is decreased and the utility as a support which can be used for medical use is lowered.
  • it is more than 1000% the incidence of threading increases due to the weak durability of the biodegradable polymer resin, and the pores between the threads become too large to easily deteriorate the ability to retain cells and drugs.
  • FIG. 1 is an enlarged photograph of a biodegradable multifilament false-twist yarn having a bulky structure according to the present invention using a scanning electron microscope, wherein the biodegradable multifilament false twist yarn of the present invention is a network structure having pores in a bulky structure, The pore size to some extent can be controlled by tensile or stretching conditions in the false-twist yarn manufacturing process.
  • the pore size can be suitably controlled depending on the cell or drug size selected. More specifically, the bulky structure of the multifilament false-twist yarn of the present invention has pores of 1 to 150 mu m, more preferably 5 to 50 mu m. At this time, if the pore size is less than 1 ⁇ , voids between the pores become small, cell proliferation is difficult during cell culture, and the cell or drug content capable of being delivered into the living body is decreased, and the utility as a support for medical use is inferior. When the pore size is more than 150 mu m, the voids between the chambers become too large and the ability to hold cells, drugs and the like tends to be deteriorated.
  • the present invention it is effective to use a biodegradable polymer because it is preferable that the bulky structure multifilament false-twisted yarn for cell culture, in vivo cell or drug delivery is decomposed and absorbed in the body after achieving the purpose.
  • the biodegradable polymer used in the present invention may be any biodegradable aliphatic polyester that satisfies biocompatibility and biodegradability, and may be used without particular limitation, and preferably glycolide, glycolic acid, lactide, lactic acid, caprolactone, A homopolymer of a compound selected from the group consisting of polydimethylsiloxane, pentaerythritol, trimethylene carbonate, and ethylene glycol, or copolymers thereof.
  • glycolide and lactide are referred to as "poly (DL-lactide-co-glycolide) acid (hereinafter referred to as” PLGA ”) copolymerized at a weight ratio of 90:10 to 70:30 ],
  • PLGA poly (DL-lactide-co-glycolide) acid
  • a copolymer obtained by copolymerizing glycolide and lactide in a weight ratio of 90:10 is used as the biodegradable polymer resin, but it should be understood that it is not limited thereto.
  • the hydrophilic surface-modified biodegradable suture cell transporter of the present invention has an amine group (-NH 2 ), a carboxyl group (-COOH) and a hydroxyl group (-OH) on the biodegradable multifilament twist yarn (DTY)
  • amine group -NH 2
  • -COOH carboxyl group
  • -OH hydroxyl group
  • DTY biodegradable multifilament twist yarn
  • a hydrophilic amine compound as a compound containing a hydrophilic functional group.
  • allylamine is used, but it is not limited thereto.
  • the biodegradable suture thread type cell carrier of the present invention is surface-modified with a compound containing a hydrophilic functional group on the biodegradable multifilament twist yarn (DTY) surface, the cell affinity substance is adhered to improve cell affinity, And can perform cell functioning as a support for cell culture because it is advantageous to grow cells or living tissues in the bulky structure of the false-twist yarn.
  • DTY biodegradable multifilament twist yarn
  • the cell affinity substance used in the present invention can induce adhesion and proliferation of cells and can affect the intrinsic function of the cell or can be used without any particular limitation if it meets the conditions including the motif including the peptide (RGD) But may preferably be selected from the group consisting of collagen, gelatin, laminin, fibronectin, galactose and chitosan.
  • the present invention relates to a first process for partially imparting a bulky structure to a multifilament false twist yarn (DTY) made of a biodegradable polymer material,
  • a biodegradable polymer material is spun through a spinneret to produce an ultra-fine multifilament yarn having a diameter of 5 to 30 mu m.
  • the ultrafine multifilament satisfies the properties of the strength of 2.0 to 9.0 g / d and the elongation of 20 to 80%, so that occurrence of yarn breakage and degradation of quality can be minimized in the subsequent stretchable twisting process.
  • the elongation of the multifilament yarn is less than 20%, the twisting performance is rapidly deteriorated due to the high tensile strength, and the workability is improved as the elongation is increased.
  • the monofilament diameter of the multifilament false-twist yarn of the present invention exceeds 30 mu m, the degradation rate after cell culture, cell transfer or drug delivery may be slowed and the stiffness is increased, resulting in deterioration of workability and convenience of procedure.
  • the monofilament yarns of the multifilament yarn produced according to the present invention may be varied depending on the field and application of the multifilament yarn. However, when the multifilament yarn is applied to a medical suture, the preferred diameter of the multifilament yarn is 40 to 1000 mu m, .
  • the diameter of the pile is less than 40 ⁇ , the threading and the like are liable to occur during the stretching and twisting process, and the efficiency of forming a bulky structure is low and the strength is low. It is difficult to perform the procedure through the surgical operation method to be used and the foreign body reaction of the polymer used in vivo becomes large.
  • the multifilament yarn made of the biodegradable polymer material is cut at a working speed (speed) 200 to 700 m / min, more preferably 250 to 400 m / min, and the stretching ratio is 1.01 to 1.8, more preferably 1.02 to 1.7.
  • the produced multifilament false-twist yarn is stretched or stretched to give a bulky structure.
  • the biodegradable multifilament false-twist yarn is wound on a holder capable of being stretched and then stretched to 3 to 10%, more preferably to 4 to 7%. At this time, if the tensile ratio is less than 3%, it is difficult to form a bulky structure, and if it exceeds 10%, filing is likely to occur.
  • Another method of imparting a bulky structure is by a stretching method in a continuous process.
  • the second step of the present invention is a step of further twisting or braiding the multifilament false warp yarn having the bulky structure formed in the first step.
  • the additional twisting process or the braiding process is performed to improve the collecting property, strength, and usability of the multi-filament false twist yarn portion having a bulky structure.
  • the multifilament false twist yarn is separated from the holder In order to improve the property of the house while maintaining the bulky structure, twisting is applied within 200 times / meter to perform the twisting process.
  • a braiding method may be used instead of the twisting process.
  • the braiding method may be a method of braiding .
  • the biodegradable multifilament false-twisted yarn of the present invention has a bulky structure with a pore size of 1 to 150 mu m, more preferably 5 to 50 mu m, High porosity.
  • a coating treatment process may be further performed on the part of the multifilament twist yarn subjected to further twisting or braiding so as to further improve the collecting property and to reduce damage to the biotissue in use.
  • the unfocused multifilament false twist yarn can be partially reduced to 150 to 1000% Thereby imparting a bulky property of 200 to 600%.
  • the coating treatment process is a surface coating treatment by a conventional method such as coating and impregnation of a multifilament false-twist yarn which has been subjected to further twisting or braiding treatment in a coating liquid containing 1 to 10% by weight of a biodegradable polymer resin in an organic solvent.
  • the biodegradable polymer resin capable of forming a film layer on the seal surface used in the coating liquid is selected from the group consisting of glycolide, glycolic acid, lactide, lactic acid, caprolactone, dioxanone, trimethylene carbonate and ethylene glycol
  • a biodegradable natural polymer selected from the group consisting of collagen, cellulose oxide, chitosan, gelatin, fibrin, hyaluronic acid, and alginate, and more preferably, a biodegradable natural polymer selected from the group consisting of collagen, Is to use glycolide and lactide (30:70) copolymer or polycaprolactone dissolved in ethylene acetate or methylene chloride.
  • a softening agent such as calcium stearate may be added to the coating solution.
  • the third step of the present invention is a step of fixing a compound containing a hydrophilic functional group on the surface of the multifilament false-twist yarn having the above-mentioned bulky structure by a plasma chemical vapor deposition method.
  • the surface modification by the plasma chemical vapor deposition method is performed such that the radical is generated on the surface of the polymer having no reactor, and the bonding part of the radicals generated is cut off, so that the polymerization reaction with the compound containing the hydrophilic functional group do.
  • PLGA used as a biodegradable polymer material preferred in the present invention is a substance which is weak against heat, surface modification by plasma chemical vapor deposition is suitable.
  • a compound containing a hydrophilic functional group can be fixed to the surface of the false warper under a low pressure of 25 mtorr or less and a power of 50 to 100 W.
  • the deposition utilizes the phenomenon that, when gas and organic vapors are converted from a low pressure state to a plasma, a polymer material is generated and deposited in the form of a thin film on the surrounding solid surface.
  • the pressure is 25 mTorr, but is not limited thereto.
  • the plasma CVD method of the present invention exceeds 100 W, the generated gases and organic vapors are dissociated by the plasma, Or may no longer affect the deposition.
  • the thickness of the adhesion by plasma CVD can be controlled by electric power and time treatment, the monomer state of the amine-based material is toxic. However, when the polymer is converted into the polymer state during the deposition process, Have not been reported. Therefore, when an amine compound is used as a compound containing a hydrophilic functional group, it is preferable to control so that the thickness of the adhesion does not exceed 100 ANGSTROM.
  • the fourth step of the present invention is to adhere the cell affinity substance using a coupling agent after the fixation.
  • the coupling agent can be used as long as it satisfies the requirement to cause a condensation reaction between -NH 2 group and -COOH group, and preferred examples thereof include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbamoyl 1-ethyl-3- (3-dimethylamino propyl) carbodiimide (EDC) or N-hydroxysuccinimide (NHS).
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbamoyl 1-ethyl-3- (3-dimethylamino propyl) carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • FIG. 2 to FIG. 6 show the results of measurement of the chemical structure change during the surface treatment reaction on the biodegradable multifilament false-twist yarn with the bulky structure of the present invention.
  • FTIR-ATR As a result of FTIR-ATR in FIG. 2, And the binding of the compound containing a hydrophilic group and the adhered cell affinity substance can be confirmed as a result of the ESCA measurement in FIGS. 3 to 5.
  • the present invention is characterized in that a compound containing a hydrophilic functional group is fixed on the surface of a multifilament false twist yarn (DTY) partially having a bulky property of 150 to 1000% and a pore of 1 to 150 ⁇ in a biodegradable multifilament false- Thereby providing a biodegradable suture to which the cell affinity substance is adhered.
  • DTY multifilament false twist yarn
  • the biodegradable suture of the present invention is composed of a PLGA material, which is a copolymer obtained by copolymerizing glycolide and lactide in a weight ratio of 90:10 to 70:30.
  • the PLGA used in the present invention is biodegradable by heat and moisture, and the biodegradation time can be controlled according to the synthesis ratio of polylactic acid (PLA) and polyglycolide (PGA).
  • PGA has a short disintegration time of about 3 months, and it can be used as a surgical suture because the bonding time of damaged skin and decomposition time of PGA are almost same.
  • it is difficult to knot in operation due to stiff physical property Has been pointed out.
  • PLGA which is a new suture material copolymerized with PGA and copolymerized with PGA, is made of a synthetic material having a low water solubility in both PLA and PGA, it has been pointed out that the affinity to cells is lowered.
  • the compound containing the hydrophilic functional group is first fixed so that the second modification can be performed, and then the cell affinity substance is adhered to improve the cell affinity.
  • a biodegradable suture incorporating a collagen as a cell affinity substance after the hydrophilic amine compound is fixed and surface-modified with a hydrophilic substance has excellent biocompatibility due to improved cell affinity .
  • allylamine is used as an example of the hydrophilic amine compound.
  • the present invention is not limited thereto.
  • Collagen is used as a cell affinity substance, but depending on the cell or drug delivery vehicle It will be understood that it can be changed.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of cell proliferation after the surface treatment reaction of the biodegradable suture provided with the bulky structure of the present invention, showing that the suture modified according to the present invention, which has been surface modified through the plasma treatment, A marked increase in cell proliferation can be seen from the density results.
  • the result of cell proliferation was labeled with green fluorescent protein (GFP) and observed.
  • GFP green fluorescent protein
  • Step 1 Manufacture of PLGA false-twist yarn with a bulky structure
  • Poly (glycolide-co-lactide) (hereinafter referred to as " PLGA ") obtained by copolymerizing glycolide and lactide in a weight ratio of 90:10, A multifilament yarn composed of 56 filaments having a diameter of 15 to 17 mu m was produced.
  • the fabricated multifilament yarn was subjected to compaction and thermal processing using Murata 33H (Belata type, Belt angle 110 °) to produce stretchable warp yarn (DTY).
  • Murata 33H Belata type, Belt angle 110 °
  • the multi-filament yarn was twisted to Z-stitch at the first roller while folding four multifilament yarns with Murata 33H (Murata 33H, Belt type, Belt angle 110 °) Lt; 0 > C to prepare a stretchable warp yarn (DTY) composed of 224 filaments.
  • Murata 33H Murata 33H, Belt type, Belt angle 110 °
  • Lt Long Term Evolution
  • 0 &gt a stretchable warp yarn
  • DTY stretchable warp yarn
  • the stretchable warp yarn made of the glycolide-lactide copolymer material was wound on a tensionable rack, followed by 4% stretching to obtain a multifilament false warp yarn having a bulky structure.
  • the manufactured multi-filament twisted yarn of the bulky structure was separated from the holder and twisted at 80 times / meter.
  • the twisted multifilament false twist yarn was cut to a length of 45 cm and then only the remaining portion except for the center portion of 5 cm was coated with a tensile force of 4% and then dried for about 3 seconds in a hot air dryer set at 40 ° C Respectively.
  • a coating solution in which 2 wt% of glycolide and lactide 30:70 copolymer were dissolved in ethylene acetate was used.
  • the PLGA false-twist yarn was fixed in a PECVD chamber using a device capable of plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD), and vaporized allylamine (KANTO CHEMICAL CO., INC. Japan) was deposited and reacted at a pressure of 25 mTorr and at a pressure of 50 W to a thickness of 100 ⁇ .
  • PECVD plasma enhanced chemical vapor deposition
  • KANTO CHEMICAL CO., INC. Japan vaporized allylamine
  • Example 1 The procedure of Example 1 was repeated except that galactose was used instead of collagen.
  • FTIR-ATR Fullier transform infrared spectroscopy
  • the measurement was performed using an infrared spectroscope (Nicolet AVATAR 360 spectrometer, WI, USA) Photoelectron spectroscopy (Physical Electronic PHI 5800 ESCA system, Physical Electronics Inc., MN, USA) was used.
  • infrared spectroscope Nicolet AVATAR 360 spectrometer, WI, USA
  • Photoelectron spectroscopy Physical Electronic PHI 5800 ESCA system, Physical Electronics Inc., MN, USA
  • the surface treatment reaction of the biodegradable multifilament false-twist yarn with the bulky structure prepared in Example 2 is shown in the following reaction formula 1.
  • FIG. 2 shows the results of measurement of the chemical structure change of the biodegradable multifilament false-twist yarn obtained in Example 2 of the present invention using the FTIR-ATR during the surface treatment reaction.
  • a is a characteristic peak of the PLGA, to check out 1750cm -1 peak of carbonyl group in the main chain of the PLGA, it can be found the methyl peaks at 1452, 1380 and 1269cm -1 region.
  • b is to check as a result after processing the primary surface allyl amine, 1630cm -1 and 3000-3500cm -1 by identifying a new peak in the vicinity of the zone, the grafting reaction of allyl amine, c is the amine coupler is coupled Thereafter, since the reaction peak of the allylamine is maintained even after collagen is introduced, it is possible to stably introduce the cell-affinity substance.
  • FIG. 3 is a graph showing the change in chemical structure of the biodegradable multifilament false-twist yarn obtained in Example 2 of the present invention when subjected to a surface treatment reaction using ESCA.
  • FIG. 3 (a) B is surface treated with allylamine (AA), c is surface treated with allylamine (AA) and galactose (LA), and new peak formation can be confirmed at around 400 eV. The peak is generated by the carbon and nitrogen groups of the allylamine.
  • FIG. 4 shows the C1s peak of PLGA modified by surface treatment during ESCA measurement
  • FIG. 5 shows the peak of O1s.
  • FIG. 6 is a graph showing the surface roughness of the biodegradable multifilament false-twist yarn prepared in Example 2 of the present invention by using AFM in the surface treatment of the biodegradable multifilament yarn, and the surface roughness of the untreated PLGA was 1.639 As a result, the roughnesses of allylamine treated and allylamine and galactose treated samples were measured as 21.392 nm and 12.555 nm, respectively.
  • the biodegradable suture (PLGA) surface was first modified with allylamine, and then modified with collagen to confirm cell proliferation and adhesion directly.
  • the umbilical cord blood derived from the umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells was donated to the subject by the subject's consent [IRS No. 08-4] of Catholic University of Medicine.
  • the umbilical cord blood was centrifuged (560 g , 30 min) using a Ficoll-Paque TM PLUS radient (GE Healthcare Bio-sciences AB, Uppsala, Sweden) to collect monocytes and washed with PBS (Welgene, Daegu, South Korea).
  • Cells were suspended in low glucose-DME supplemented with 10% FB and 1% antibiotics / antimycotic and incubated at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. After 7 days, the nonadherent cells were removed and adherent cells were continuously cultured. After the cells attached to the spindle were washed, the cells were removed with 0.25% trypsin EDTA and neutralized with fresh culture medium. 2 ⁇ 10 5 cells were placed in a 75-cm 2 flask and cultured. The culture medium was maintained until it grew to the bottom of 75-90%. The passage of the initial cell culture was called passage 1 (p1).
  • step 1 isolated and cultured umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were labeled with a green fluorescent protein (hereinafter referred to as "GFP") using a lenti-viral vector.
  • GFP green fluorescent protein
  • the lentiviral vector containing the GFP factor was purchased from Macrogen Co., Ltd., Lentivi Lab.
  • the mesenchymal stem cells were dispensed to be about 1 ⁇ 10 5 cells / well in 6 well plates.
  • Lenti-GFP was infected with 8 ⁇ g / ml of polybrene and mesenchymal stem cells were infected. After 6 hours, medium was changed and cultured for 2 to 3 days. After 2 to 3 days, intracellular GFP was confirmed by fluorescence microscopy.
  • Sutures that were not surface treated as a control were used, and the suture treated with collagen in Example 1 and the control group were subjected to overnight sterilization under ultraviolet light conditions.
  • Each of the sterilized sutures was placed in a 96-well plate without any voids by taking a portion having a constant thickness and length in a clean bench. After washing with PBS, pre-wetting was induced and 10 3 cells were added with 200 ⁇ l of complete media (DMEM, FBS 10%, PS 1%, Gibco, USA). Cell proliferation was measured by WST-1 reagent and UV spectroscopy on days 1, 3, and 7.
  • FIG. 7 The results of FIG. 7 are compared with the cell proliferation of sutures of an untreated control group and sutures modified by collapsed sutures (col soak) and plasma treated sutures (plasma + col). As a result, a significant increase in cell proliferation was confirmed from the optical density (s) between the untreated suture modified with the plasma treatment and the suture obtained by simply dipping in collagen.
  • FIG. 7 the cells cultured for one week on the surface of each of the untreated suture and the surface-treated suture were observed with a fluorescence microscope, and the results are shown in FIG. 8 and FIG.
  • the surface of the biodegradable suture including the multi-filament false twist yarn (DTY) made of a biodegradable polymer material having a bulk structure is subjected to hydrophilic surface modification, and then the biodegradable suture type cell carrier Lt; / RTI >
  • the biodegradable suture cell type cell transporter of the present invention has improved cell affinity and proliferation of cells or living tissues in the bulky structure, and can particularly improve the engraftment rate of stem cells.
  • a biodegradable suture composed of a PLGA material copolymerized with glycolide and lactide in a weight ratio of 90:10 to 70:30 can be surface modified by plasma treatment to provide a cell-friendly suture that improves cell affinity.

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Abstract

본 발명은 생분해성 봉합사형 세포 전달체, 그의 제조방법 및 그를 이용한 생분해성 봉합사에 관한 것이다. 본 발명의 생분해성 봉합사형 세포 전달체는 부분적으로 벌키 구조가 부여된 생분해성 고분자 소재로 이루어진 소수성 재질의 생분해성 봉합사 표면에, 친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시켜 친수성으로 표면개질한 후, 세포친화성 물질을 점착함에 따라, 세포친화성을 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 상기 벌키 구조에서 세포 또는 생체조직의 증식이 유리하므로 세포배양용 지지체로서 기능을 수행하며, 따라서, 본 발명의 생분해성 봉합사형 세포 전달체는 줄기세포의 생착률을 향상시킬 수 있다.

Description

줄기세포의 생착률 향상을 위한 생분해성 봉합사형 세포 전달체
본 발명은 생분해성 봉합사형 세포 전달체, 그의 제조방법 및 그를 이용한 생분해성 봉합사에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 부분적으로 벌키 구조가 부여된 생분해성 고분자 소재로 이루어진 소수성 재질의 생분해성 봉합사 표면에, 친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시켜 친수성으로 표면개질한 후, 세포친화성 물질을 점착함에 따라, 세포친화성을 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 상기 벌키 구조에서 세포 또는 생체조직의 증식이 유리하고, 특히, 줄기세포의 생착률 향상에 유용한 생분해성 봉합사형 세포 전달체, 그의 제조방법 및 그를 이용한 생분해성 봉합사에 관한 것이다.
줄기세포를 이용한 난치병 정복은 현세기 생명과학계의 중요한 과제로 심혈관계, 신경계, 혈액을 비롯한 대부분의 의학분야에서 주목 받고 있다. 특히, 치료가 불가능하다고 간주된 퇴행성 질환에도 줄기세포를 통한 치료요법을 적용함으로써, 많은 긍정적인 결과를 도출하고 있다. 이러한 결과로부터, 줄기세포 이용은 약물 및 수술위주의 임상치료에 획기적인 변화를 가져 올 수 있는 첨단 의료기술로 평가되고 있다.
그러나, 줄기세포만을 단일적으로 사용하여 시행되는 시술법은 임상적 결과에 의해 다양한 문제점들이 지적되어 왔는데, 가장 크게 대두된 문제점으로는 타겟성과 효율성에 관한 것이다.
상세하게는 종래의 주입하는 형태의 치료제의 경우, 목표로 하고자 하는 부위에 정확히 전달이 안될 수도 있다는 문제점과 함께 주입된 세포들이 흩어질 우려가 있어 자리잡고 분화하기까지 어려움이 있다는 결과가 연구에 의해 밝혀졌다. 따라서, 줄기세포 전달의 효율성 문제를 해결하기 위한 연구로서, 안정한 형태로 치료하고자 하는 부위에 정확히 전달할 수 있는 방법에 대한 연구가 각계 연구분야 협력을 통해 진행되고 있다.
이러한 노력의 일환으로서, 줄기세포에 조직공학적 기술을 접목한 하이브리드형의 조직공학제제가 활발히 연구되고 있다. 상기 조직공학제제란 줄기세포에 전달매개체를 도입하는 방법으로 생체적합성이 우수한 물질을 적합한 형태로 취한 후, 줄기세포를 배양하여 시술이 필요한 부위에 적용하는 것을 말한다. 이러한 조직공학제제는 질환부위에 따라 다양한 형태로 제작될 수 있다.
그러나, 조직공학제제에 사용되는 대부분의 생분해성 합성 고분자 물질은 소수성 재질이므로, 조직공학적 응용을 위해서는 친수성 물질로의 처리가 요구된다. 즉, 소수성 재질로 만들어진 지지체는 세포배양액에 뜨게 되므로, 세포를 키우기 어렵고, 단순한 지지체로서의 역할뿐만 아니라 세포의 성장과 세포 자체의 기능을 배가시켜주기 위한 역할을 하기 위해서도 표면개질이 선행되어야 한다.
이에, 본 발명자들은 소수성 재질로 이루어진 세포배양용 지지체의 활용성을 높이기 위하여 노력한 결과, 소수성 재질의 생분해성 합성 고분자 표면상에, 2차 개질을 위한 관능기의 도입이 가능하도록 친수성 물질로 1차 표면개질한 후 세포친화성 물질을 점착시킴으로써, 세포친화성을 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 상기 벌키 구조에서 세포 또는 생체조직의 증식이 유리하므로 세포배양용 지지체로서의 기능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 부분적으로 벌키 구조가 부여된 소수성 재질의 생분해성 봉합사 표면을 친수성으로 표면개질한 후, 세포친화성 물질을 점착시킨 생분해성 봉합사형 세포 전달체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 벌키 구조가 부여된 소수성 재질의 생분해성 봉합사 표면을 친수성으로 표면개질한 후, 세포친화성 물질을 점착시켜 줄기세포의 생착률을 향상시킨 생분해성 봉합사를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 부분적으로 벌키 구조가 부여된 생분해성 고분자 소재로 이루어진 소수성 재질의 생분해성 봉합사 표면에, 친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시켜 친수성으로 표면개질한 후, 세포친화성 물질을 점착시킨 생분해성 봉합사형 세포 전달체를 제공한다.
본 발명의 생분해성 봉합사형 세포 전달체는 상기 벌키 구조에서 세포 또는 생체조직의 증식이 유리하므로 세포배양용 지지체로서의 기능을 수행하며, 특히, 본 발명의 생분해성 봉합사형 세포 전달체는 줄기세포의 생착률을 향상시킨다.
본 발명의 생분해성 봉합사형 세포 전달체는 생분해성 고분자 소재로 이루어진 멀티필라멘트 가연사에, 부분적으로 150 내지 1000%의 벌키성이 부여되며, 상기 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사는 1∼150㎛의 기공을 가진다.
본 발명에서 사용되는 생분해성 고분자 소재는 글리콜라이드, 글리콜산, 락타이드, 젖산, 카프로락톤, 다이옥사논, 트리메틸렌카보네이트 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 화합물의 단일 중합체 또는 이들을 포함하는 공중합체가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 글리콜라이드 및 락타이드가 90:10 내지 70:30 중량비율로 공중합된 공중합체를 사용하는 것이다.
본 발명의 생분해성 봉합사형 세포 전달체에서, 친수성 관능기를 포함하는 화합물은 아민기(-NH2), 카르복실기(-COOH) 및 하이드록시기(-OH)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 친수성 관능기를 포함하며, 더욱 바람직하게는 친수성 아민 화합물을 사용한다.
또한, 세포친화성 물질은 세포의 점착 및 증식을 유도할 수 있으며 세포 고유기능에 영향을 줄 수 있거나, 펩티드(RGD)를 포함한 모티브(motif)를 포함한 세포외 기질이면 사용가능하고, 그 일례로서, 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 파이브로넥틴, 갈락토오스 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 생분해성 봉합사형 세포 전달체의 제조방법을 제공한다. 더욱 구체적으로는, 생분해성 고분자 소재로 이루어진 멀티필라멘트 가연사에 부분적으로 벌키 구조를 부여하는 공정, 상기 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사를 추가 연사(Twisting) 또는 브레이딩(braiding) 처리하여 집속성을 향상하는 공정, 상기 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사 표면에 플라즈마 화학증착법으로 친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시키는 공정 및 상기 고착 이후, 커플링제를 이용하여 세포친화성 물질을 점착시키는 공정을 포함한다.
이때, 상기 멀티필라멘트 가연사의 단사 직경은 5 내지 30㎛이며, 멀티필라멘트 가연사의 합사 직경은 40 내지 1000㎛이다.
또한, 본 발명의 제조방법에서 사용되는 멀티필라멘트 가연사는 부분적으로 150 내지 1000%의 벌키성이 부여된 것이며, 상기 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사가 1 내지 150㎛의 기공을 가진다.
본 발명의 제조방법에서, 친수성 관능기를 포함하는 화합물은 25 mtorr 이하의 낮은 압력 및 50 내지 100W 전력조건하에서 플라즈마 화학증착법에 의해 고착된다. 이때, 본 발명에서 사용되는 친수성 관능기를 포함하는 화합물에서 친수성 관능기라 함은 아민기(-NH2), 카르복실기(-COOH) 및 하이드록시기(-OH)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이다.
본 발명의 세포친화성 물질은 세포의 점착 및 증식을 유도할 수 있으며 세포 고유기능에 영향을 줄 수 있거나, 펩티드(RGD)를 포함한 모티브(motif)를 포함한 세포외 기질을 사용할 수 있다. 바람직한 일례로서, 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 파이브로넥틴, 갈락토오스 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하며, 본 발명의 실시예에서는 갈락토오스 또는 콜라겐에 한정하여 설명하고 있으나, 이에 한정되는 것을 아니다.
나아가, 본 발명은 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 부분적으로 150 내지 1000%의 벌키성 및 1 내지 150㎛의 기공을 가지는 멀티필라멘트 가연사(Draw Textured Yarn, 이하, “DTY”라 함) 표면에, 친수성 관능기를 포함하는 화합물이 고착된 후 세포친화성 물질이 점착된 생분해성 봉합사를 제공한다.
이때, 상기 생분해성 고분자 소재로서, 글리콜라이드 및 락타이드가 90:10 내지 70:30 중량비율로 공중합된 공중합체를 사용한다.
더욱 구체적으로는, 생분해성 멀티필라멘트 가연사(DTY) 표면에, 친수성 아민 화합물이 고착된 후, 세포친화성 물질로서 콜라겐이 점착된 생분해성 봉합사를 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, 생분해성 고분자 소재로 이루어진 소수성 재질의 생분해성 봉합사를 친수성으로 표면개질한 후, 세포친화성 물질을 점착시킨 생분해성 봉합사형 세포 전달체를 제공할 수 있으며, 특히, 본 발명의 생분해성 봉합사는 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사 구조로서, 상기 벌키 구조에서 세포 또는 생체조직이 증식된다.
또한, 본 발명은 벌키 구조가 부여된 생분해성 고분자 소재로 이루어진 소수성 재질의 생분해성 봉합사 표면을 친수성으로 표면개질하여, 세포친화성이 향상되는 동시에, 줄기세포의 생착률을 향상시킨 친세포성 봉합사를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사를 주사전자현미경을 이용하여 확대 관찰한 사진이고,
도 2는 본 발명의 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 대한 표면처리 반응시 FTIR-ATR을 이용하여 화학적 구조 변화를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 대한 표면처리 반응시 ESCA를 이용하여 화학적 구조 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 도 3의 ESCA 측정시, 표면처리에 의해 개질된 PLGA의 C1s 피크를 나타낸 것이다.
도 5는 도 3의 ESCA 측정시, 표면처리에 의해 개질된 PLGA의 O1s 피크를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 대한 표면처리 반응시 AFM을 이용하여 표면의 거칠기를 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 벌키 구조가 부여된 생분해성 봉합사에 대한 표면처리 반응 후, 세포 증식 결과이다.
도 8은 표면 미처리된 생분해성 봉합사에 세포배양 일주일 경과 후, 세포증식을 관찰한 사진이다.
도 9는 본 발명의 표면처리된 벌키 구조가 부여된 생분해성 봉합사에 세포배양 일주일 경과 후, 세포증식을 관찰한 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 부분적으로 벌키 구조가 부여된 생분해성 고분자 소재로 이루어진 소수성 재질의 생분해성 봉합사 표면에, 친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시켜 친수성으로 표면개질한 후, 세포친화성 물질을 점착시킴으로써, 상기 벌키 구조에서 세포 또는 생체조직이 증식되도록 하는 생분해성 봉합사형 세포 전달체를 제공한다.
본 발명의 생분해성 봉합사형 세포 전달체는 생분해성 고분자 소재로 이루어진 멀티필라멘트를 연신 가연처리한 가연사(DTY)를 사용하며, 가연사 본연의 특성인 벌키성과 우수한 소프트감을 가지며, 나아가, 본 발명은 상기 멀티필라멘트 가연사에 부분적으로 벌키 구조를 더 부여함으로써, 의료용도에 적용시, 상기 벌키 구조를 통해 세포배양, 세포전달 또는 약물전달에 적합하도록 한다.
본 발명의 명세서 상에서 "벌키 구조"라 함은 섬유 사이에 1㎛ 이상의 다수의 기공이 존재하는 구조를 말하며, "벌키성"이라 함은 생분해성 고분자 소재로 이루어진 멀티필라멘트 가연사 제조 후 인장 또는 연신을 통해 형성하며, 상기 추가 연사(Twisting) 또는 브레이딩(braiding) 처리에 의해, 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 부분적으로 150 내지 1000%, 더욱 바람직하게는 200 내지 600%의 벌키성이 부여되는 것을 의미한다.
구체적으로 본 발명의 멀티필라멘트 가연사는 1∼150㎛, 더욱 바람직하기로는 5∼50㎛의 기공을 가진 벌키 구조를 가지므로, 높은 다공도로 인하여 기공간 오픈 구조 형성이 용이하다.
이때, 본 발명의 멀티필라멘트 가연사의 벌키성은 세포배양, 세포전달 또는 약물전달 등의 사용목적 및 대상에 따라 자유로이 조절될 수 있으나, 150% 미만으로 가공되면, 실간의 공극이 작아져 세포 배양시 세포 증식이 어렵고, 생체 내로 전달할 수 있는 세포나 약물 함유량이 떨어져 의료용도로 사용될 수 있는 지지체로서의 효용성이 떨어진다. 또한, 1000%를 초과하면, 생분해성 고분자 수지의 취약한 내구성으로 인하여 사절발생률이 높아지고, 실간의 공극이 지나치게 커져 세포나 약물 등의 보유 능력이 떨어지기 쉬워 바람직하지 않다.
도 1은 본 발명의 벌키 구조를 가지는 생분해성 멀티필라멘트 가연사를 주사전자현미경을 이용하여 확대 관찰한 사진으로서, 본 발명의 생분해성 멀티필라멘트 가연사는 벌키 구조 내 기공을 가지는 망상 구조로서, 상기 벌키한 정도나 기공크기는 가연사 제조공정 시, 인장 또는 연신 조건에 의해 조절 가능하다.
기공크기는 선택되는 세포 또는 약물크기에 따라 적절히 조절될 수 있음은 당연히 이해될 수 있을 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 멀티필라멘트 가연사의 벌키 구조는 1∼150㎛, 더욱 바람직하기로는 5∼50㎛의 기공을 갖는다. 이때, 기공크기가 1㎛ 미만이면, 실간의 공극이 작아져 세포 배양시 세포 증식이 어렵고, 생체 내로 전달할 수 있는 세포나 약물 함유량이 떨어져 의료용도로 사용될 수 있는 지지체로서의 효용성이 떨어진다. 또한, 기공크기가 150㎛를 초과하면, 실간의 공극이 지나치게 커져 세포나 약물 등의 보유 능력이 떨어지기 쉬워 바람직하지 않다.
본 발명에서 세포 배양, 생체 내로 세포나 약물 전달을 목적으로 하는 벌키 구조의 멀티필라멘트 가연사는 그 목적을 달성한 후 체내에서 분해 흡수되는 것이 바람직하므로 생분해성 고분자를 사용하는 것이 효과적이다.
본 발명에서 사용되는 생분해성 고분자는 생체적합성과 생분해성을 충족하는 생분해성 지방족 폴리에스테르라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 바람직하게는 글리콜라이드, 글리콜산, 락타이드, 젖산, 카프로락톤, 다이옥사논, 트리메틸렌카보네이트 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 화합물의 단일 중합체 또는 이들을 포함하는 공중합체이다.
더욱 바람직하게는 글리콜라이드 및 락타이드가 90:10 내지 70:30 중량비율로 공중합된 폴리락티드-공중합 글리콜라이드 애시드[Poly(DL-lactide-co-glycolide) acid, 이하, “PLGA"라 한다]를 사용하며, 본 발명의 실시예에서는 글리콜라이드 및 락타이드가 90:10 중량비율로 공중합된 공중합체를 생분해성 고분자 수지로 사용하나, 이에 한정되지 않음은 당연히 이해될 것이다.
본 발명의 친수성으로 표면개질된 생분해성 봉합사형 세포 전달체는 소수성 재질의 생분해성 멀티필라멘트 가연사(DTY) 표면에 아민기(-NH2), 카르복실기(-COOH) 및 하이드록시기(-OH)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 친수성 관능기를 포함하는 화합물이 먼저 고착된다.
이때, 친수성 관능기를 포함하는 화합물로는 친수성 아민 화합물을 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 알릴아민을 사용하나, 이에 한정되지 않는다.
특히, 본 발명의 생분해성 봉합사형 세포 전달체는 생분해성 멀티필라멘트 가연사(DTY) 표면이 친수성 관능기를 포함하는 화합물로 표면개질된 이후, 세포친화성 물질이 점착됨으로써, 세포친화력이 향상되어 세포를 안정적으로 성장시킬 수 있으며, 상기 가연사의 벌키 구조에서 세포 또는 생체조직의 증식이 유리하므로 세포배양용 지지체의 기능을 수행한다.
본 발명에서 사용되는 세포친화성 물질이란, 세포의 점착 및 증식을 유도할 수 있으며 세포 고유기능에 영향을 줄 수 있거나, 펩티드(RGD)를 포함한 모티브(motif)를 포함한 조건을 충족하면 특별한 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 파이브로넥틴, 갈락토오스 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 생분해성 고분자 소재로 이루어진 멀티필라멘트 가연사(DTY)에 부분적으로 벌키 구조를 부여하는 제1공정,
상기 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사를 추가 연사(Twisting) 또는 브레이딩(braiding) 처리하여 집속성을 향상하는 제2공정,
상기 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사 표면에 플라즈마 화학증착법으로 친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시키는 제3공정 및
상기 고착 이후, 커플링제를 이용하여 세포친화성 물질을 점착시키는 제4공정을 특징으로 하는 생분해성 봉합사형 세포 전달체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 제조방법을 공정별로 상세히 설명한다.
본 발명의 제1공정은 생분해성 고분자 소재를 방사구금을 통하여 방사하여, 단사의 직경이 5 내지 30㎛인 극세 멀티필라멘트사를 제조한다. 이때, 극세 멀티필라멘트는 강도 2.0∼9.0g/d 및 신도 20∼80%의 물성을 만족하여 이후 연신 가연 공정시, 사절 발생 및 품위저하를 최소화할 수 있다. 특히, 멀티필라멘트사의 신도가 20% 미만이면, 높은 장력으로 인해 가연 작업성이 급속히 저하되며, 신도가 높을수록 작업성은 향상되지만 신도가 80%를 초과하는 멀티필라멘트사는 작업성이 현저히 떨어진다. 이에, 더욱 바람직하게는 신도 25∼40%를 충족하는 것을 선택 사용한다. 또한, 강도가 2.0g/d 미만이면, 강도 저하에 따라 가연 작업성이 떨어지며, 9.0g/d을 초과하면, 가연사의 소프트한 촉감이 감소하게 된다.
반면에, 본 발명의 멀티필라멘트 가연사의 단사 직경이 30㎛를 초과하면, 세포배양, 세포전달 또는 약물전달 후 분해 속도가 느려질 수 있으며 뻣뻣함이 증가해 작업성이나 시술 편의성이 저하된다.
상기 제조된 멀티필라멘트 가연사의 단사는 적용하는 분야 및 용도 따라 달라질 수 있으나, 적용분야가 의료용 봉합사에 적용될 경우, 합사된 멀티필라멘트의 바람직한 직경을 40 내지 1000㎛이고, 더욱 바람직하게는 40 내지 800㎛로 제조한다.
이때, 합사의 직경이 40㎛ 미만이면, 연신 가연공정 시 사절 등이 발생하기 쉽고 벌키 구조 생성효율이 낮고 강력이 낮아 시술편의성이 떨어지고, 1000㎛를 초과하면, 생체 내 적용 시, 통상의 봉합사를 사용하는 외과 수술 방법을 통한 시술이 어렵고, 생체 내에서의 사용한 고분자의 이물반응(foreign body reaction)이 커지는 단점이 있다.
이후, 상기 합사된 멀티필라멘트사를 연신 가연공정을 거쳐 멀티필라멘트 가연사를 제조하는 공정으로서, 가연 작업성 및 가연사의 품질 확보를 위하여, 생분해성 고분자 소재로 이루어진 멀티필라멘트사를 작업속도(사속) 200∼700m/min, 더욱 바람직하게는 250∼400m/min 조건으로 수행하고, 연신비를 1.01∼1.8, 더욱 바람직하게는 1.02∼1.7로 수행한다.
본 발명의 제1공정은 상기 제조된 멀티필라멘트 가연사를 인장 또는 연신하여 벌키 구조를 부여한다.
벌키 구조를 부여하는 방식은 생분해성 멀티필라멘트 가연사를 인장이 가능한 거치대에 권취한 후, 3∼10%, 더욱 바람직하게는 4∼7%로 인장하는 방식을 사용한다. 이때, 인장률이 3% 미만이면, 벌키 구조를 만들기 어렵고, 10%를 초과하여 실시하면 사절이 발생하기 쉬워 바람직하지 않다. 벌키 구조를 부여하는 다른 방식으로는 연속공정시 연신방법으로 수행한다.
본 발명의 제2공정은 상기 제1공정에서 벌키 구조가 형성된 멀티필라멘트 가연사를 추가 연사처리(Twisting) 또는 브레이딩(braiding) 처리하는 공정이다.
상기 추가 연사처리 또는 브레이딩 처리공정은 벌키 구조가 형성된 멀티필라멘트 가연사부의 집속성, 강력, 사용편의성을 향상시키기 위하여 수행하며, 상기 벌키 구조의 부여 공정 이후, 멀티필라멘트 가연사를 거치대에서 분리한 후 벌키 구조를 유지하면서도 집속성을 향상시키기 위해 200회/meter 이내의 꼬임(twisting)을 부여하여 연사 처리한다.
반면에, 본 발명의 벌키 구조를 가지는 생분해성 멀티필라멘트 가연사를 봉합사로 사용할 경우, 연사 공정 대신 브레이딩(braiding)하는 방법도 가능하며, 상기 브레이딩 방법은 브레이딩 시 일정길이만큼 브레이딩 되지 않도록 제어한다.
따라서, 상기 공정들을 통해, 본 발명의 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사는 1∼150㎛, 더욱 바람직하기로는 5∼50㎛의 기공을 가진 벌키 구조로서, 기공의 크기조절이 용이하고, 높은 다공도를 나타낸다.
나아가 본 발명의 제2공정은 상기 추가 연사 또는 브레이딩 처리된 멀티필라멘트 가연사 일부에 대하여, 집속성을 더욱 향상시키고, 사용 시 생체 조직의 손상을 줄이기 위하여 코팅처리공정을 더 수행할 수 있다.
상기 추가 연사처리 또는 브레이딩 처리하는 공정과 코팅공정들을 통해, 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사 일부만을 추가 집속함으로써, 집속되지 않은 멀티필라멘트 가연사에 부분적으로 150 내지 1000%, 더욱 바람직하게는 200 내지 600%의 벌키성을 부여하게 된다.
코팅처리공정을 상세히 살펴보면, 유기용매에 생분해성 고분자 수지가 1 내지 10 중량% 함유된 코팅액에 추가 연사 또는 브레이딩 처리된 멀티필라멘트 가연사를 도포, 함침 등의 통상의 방법으로 표면 코팅처리한다.
이때, 코팅액에 사용되는 실 표면에 필름층을 형성할 수 있는 생분해성 고분자 수지는 글리콜라이드, 글리콜산, 락타이드, 젖산, 카프로락톤, 다이옥사논, 트리메틸렌카보네이트 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 화합물의 단일 중합체 또는 이들을 포함하는 공중합체의 생분해성 합성 고분자 또는 콜라겐, 산화셀룰로오스, 키토산, 젤라틴, 피브린, 히알루론산 및 알지네이트로 이루어진 군에서 선택되는 생분해성 천연 고분자에서 선택되며, 더욱 바람직한 일례로는 글리콜라이드 및 락타이드(30:70) 공중합체 또는 폴리카프로락톤을 에틸렌아세테이트 또는 메틸렌클로라이드에 용해시켜 사용하는 것이다. 또한, 시술 편의성을 위해 코팅 용액에 칼슘 스테아레이트와 같은 유연제를 추가 첨가할 수 있다.
본 발명의 제3공정은 상기 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사 표면에 플라즈마 화학증착법으로 친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시키는 공정이다.
이때, 플라즈마 화학증착법에 의한 표면개질은 일차적으로 반응기가 없는 고분자 표면에 라디칼을 생성시키고, 이차적으로 생성된 라디칼의 결합부분을 끊어줌으로써, 처리하고자 하는 친수성 관능기를 포함하는 화합물과 중합반응이 진행되도록 한다.
특히, 본 발명에서 바람직한 생분해성 고분자 소재로서 사용되는 PLGA는 열에 약한 물질이므로, 플라즈마 화학증착법에 의한 표면개질이 적합하다.
이때, 본 발명의 플라즈마 화학증착을 통해, 25 mtorr 이하의 낮은 압력 및 50 내지 100W 전력조건하에서 가연사 표면에 친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시킬 수 있다.
이때, 증착은 기체 및 유기 증기들이 저압 상태에서 플라즈마로 전환될 때, 고분자 물질이 생성되면서 주위의 고체 표면에 박막의 형태로 입혀지는 현상을 이용한 것으로, 저압상태에서 기체나 유기용매를 전기적으로 방전시켜 사용한다. 따라서, 압력은 낮을수록 바람직하며, 본 실시예에서는 25mTorr로 수행하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 전력 설정은 증착 속도에 결정되는 종래의 화학증착법과는 달리, 본 발명의 플라즈마 화학증착법에 의한 경우, 100W를 초과하면, 발생된 기체 및 유기증기들이 플라즈마에 의해 해리되므로, 증착속도의 감소를 초래하거나 더 이상 증착에 영향을 미치지 않는 결과를 가져올 수 있다.
플라즈마 화학증착법에 의한 고착 두께는 전력 및 시간처리에 따라 조절이 가능하나, 아민계 물질의 단량체(monomer) 상태는 독성이 강한 물질이나, 증착과정에서 폴리머(polymer) 상태로 변환되면 폴리머 상태에서는 독성이 보고된 바 없다. 이에, 친수성 관능기를 포함하는 화합물로서, 아민 화합물을 사용할 경우, 고착두께가 100Å를 초과하지 않도록 제어하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제4공정은 상기 고착 이후, 커플링제를 이용하여 세포친화성 물질을 점착시키는 것이다.
이때, 커플링제는 -NH2기와 -COOH기의 축합(condensation) 반응을 일으킬 수 있는 요건을 충족한 것이라면 사용가능하고, 바람직한 일례로는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide, EDC) 또는 N-하이드록시숙시미나이드(N-Hydroxysuccimide, NHS)를 사용한다.
도 2 내지 도 6은 본 발명의 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 표면처리 반응시 화학적 구조 변화를 측정한 결과를 도시한 것으로서, 도 2의 FTIR-ATR 결과, 친수성기를 포함한 화합물의 결합을 확인할 수 있으며, 도 3 내지 도 5의 ESCA 측정결과, 친수성기를 포함한 화합물의 결합과 이후 점착된 세포친화성 물질을 확인할 수 있다.
또한, 도 6에서 보이는 바와 같이, AFM을 이용하여 표면의 거칠기를 측정한 결과, 미처리된 PLGA의 표면거칠기에 비해 친수성기를 포함한 화합물로 표면처리된 경우 거칠기 증가하고, 이후 세포친화성 물질 즉, 갈락토오스가 점착되어 표면을 덮음에 따라, 표면의 거칠기가 감소한다.
나아가, 본 발명은 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 부분적으로 150 내지 1000%의 벌키성 및 1 내지 150㎛의 기공을 가지는 멀티필라멘트 가연사(DTY) 표면에, 친수성 관능기를 포함하는 화합물이 고착된 후 세포친화성 물질이 점착된 생분해성 봉합사를 제공한다.
본 발명의 생분해성 봉합사는 글리콜라이드 및 락타이드가 90:10 내지 70:30 중량비율로 공중합된 공중합체인 PLGA 소재로 이루어진다.
본 발명에서 사용되는 PLGA는 열과 수분에 의해 생분해가 가능하며, 폴리락틱산(PLA)와 폴리글리콜라이드(PGA)의 합성비율에 따라 생분해 시간을 조절할 수 있다.
특히, PGA는 분해소요시간이 3개월 정도로 짧으며, 손상피부의 접합시간과 PGA의 분해시간이 거의 일치하기 때문에 수술용 봉합사로서 활용가능하나, 뻣뻣한 물성으로 수술 시 매듭짓기 어렵고 쉽게 풀어지는 문제점이 지적되어 왔다. 그러나, PGA에 PLA를 공중합하여 새로운 봉합사 재료로 제안된 PLGA는 이를 구성하는 PLA와 PGA 모두 극소수성을 가지는 합성재료로 제조되므로, 세포에 대한 친화도가 저하되는 문제점이 지적되어 왔으나, 본 발명의 PLGA 봉합사 소재의 봉합사는 2차 개질이 가능하도록 친수성 관능기를 포함하는 화합물이 먼저 고착된 후 세포친화성 물질이 점착되어, 세포친화성이 향상된다.
특히, 친수성 관능기를 포함하는 화합물로서, 친수성 아민 화합물이 고착되어 친수성 물질로 표면개질된 후, 세포친화성 물질로서, 콜라겐이 도입된 생분해성 봉합사는 향상된 세포친화성으로 인하여, 생체적합성이 우수하다. 더욱 구체적으로는, 본 발명의 실시예에서는 친수성 아민 화합물의 일례로 알릴아민을 사용하여 설명하고 있으나, 이에 한정되지 않으며, 세포친화성 물질로서 콜라겐을 사용하고 있으나, 대상하는 세포 또는 약물전달체에 따라 달라질 수 있음은 당연히 이해될 것이다.
도 7은 본 발명의 벌키 구조가 부여된 생분해성 봉합사에 대한 표면처리 반응 후 세포 증식한 결과로서, 플라즈마 처리를 통해 표면개질된 본 발명의 봉합사가 미처리된 봉합사와 단순히 콜라겐에 담궜다 뺀 봉합사간의 광학밀도 결과로부터 세포증식력의 현저한 증가를 확인할 수 있다.
도 8 및 도 9에서 보이는 바와 같이, 세포증식결과를 형광단백질(green fluorescent protein, GFP)로 표지한 후, 관찰한 결과, 미처리된 봉합사에 비해 본 발명의 플라즈마 처리를 통해 콜라겐으로 표면개질된 봉합사에서 더 잘 생존하고 있음을 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 벌키 구조를 가지는 PLGA 가연사의 표면처리
단계 1: 벌키 구조가 부여된 PLGA 가연사 제조
글리콜라이드 및 락타이드가 90:10중량비율로 공중합된 이루어진 폴리글리콜라이드 락타이드 공중합체[Poly(glycolide-co-lactide), 이하, “PLGA”라 한다]를 일반 방사법을 사용하여, 단섬유의 직경이 15∼17㎛인 56 필라멘트로 이루어진 멀티필라멘트사를 제조하였다.
제조된 멀티필라멘트사를 무라다 33H (Murata 33H, Belt type, Belt angle 110°)를 이용하여 합사 및 열공정 과정을 거쳐 연신 가연사(DTY)를 제조하였다.
상기 멀티필라멘트사를 무라다 33H (Murata 33H, Belt type, Belt angle 110°)를 이용하여 멀티필라멘트사 4추를 합사하면서 첫 번째 롤러에서 Z연으로 가연하고, 두 번째 롤러에서 해연한 후, 170℃에서 열세팅하여 224 필라멘트로 구성된 연신 가연사(DTY)를 제조하였다. 이때, 가연시 연신비는 1.024, 선속도 250 m/min로 수행하였다.
이후, 상기 글리콜라이드-락타이드 공중합체 소재로 이루어진 연신 가연사를 인장이 가능한 거치대(Rack)에 권취한 후, 4% 인장하였다 풀어서 벌키한(bulky) 구조를 가지는 멀티필라멘트 가연사를 제조하였다.
제조된 벌키 구조의 멀티필라멘트 가연사를 거치대에서 분리한 후 80회/meter로 꼬임(twisting)을 주었다. 꼬여진 멀티필라멘트 가연사를 길이 45cm가 되도록 자른 후, 4% 정도 신장이 되도록 장력을 가한 상태에서 중심부분의 5cm 가량을 제외한 나머지 부분만을 코팅한 후 40℃로 셋팅된 열풍건조기에서 약 3초간 건조하였다. 이때, 코팅은 에틸렌아세테이트에 글리콜라이드와 락타이드 30:70 공중합체 2중량%가 용해된 코팅액을 이용하였다.
단계 2: 봉합사의 표면처리
상기 단계 1에서 제조된 PLGA 가연사 표면을 개질 시키기 위하여, 플라즈마 화학증착(plasma enhanced chemical vapor deposition, PECVD)이 가능한 장치를 사용하여, 상기 PLGA 가연사를 PECVD 챔버 안에 잘 고정시킨 후 기화된 알릴아민(KANTO CHEMICAL CO., INC. Japan)을 25 mtorr의 압력 및 50W 조건에서 100Å 두께로 증착반응시켰다.
이후, 알릴아민이 그래프팅된 PLGA 가연사(PLGA-g-AA)에 커플링제(NHS(Fluka, China) 및 EDC(Sigma, USA)) 10 mg을 이용하여, 콜라겐(BD, USA)을 도입하였다.
<실시예 2>
콜라겐 대신에 갈락토오스를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
<실험예 1> 표면 분석
상기 실시예 2에서 제조된 PLGA 가연사 표면을 관찰하기 위하여, 퓨리에 변환 적외선 반사 분광법(Fourier transform infrared spectroscopy in the attenuated total reflectance, FTIR-ATR), X선의 광전효과를 이용한 표면분석법으로서, 화학분석용 광전자분광법(Electron spectroscopy of chemical analysis, ESCA), 원자력현미경(Atomic force microscopy, AFM) 및 측각기(goniometry)를 이용하여 접촉각(contact angle)을 측정하였다.
또한, 알릴아민과 2차 물질 증착 후, 표면의 관능기의 변화를 관찰하기 위하여, 적외선 분광기(Nicolet AVATAR 360 spectrometer, WI, USA)를 이용하여 측정하였으며, 원소간의 구성을 측정하기 위하여, 화학분석용 광전자분광법(Physical Electronic PHI 5800 ESCA system, Physical Electronics Inc., MN, USA)을 이용하였다.
1. FTIR-ATR 측정결과
상기 실시예 2에서 제조된 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 대한 표면처리 반응을 하기 반응식 1에 의해 나타내었다.
반응식 1
Figure PCTKR2009006795-appb-I000001
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 제조된 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 대한 표면처리 반응시 화학적 구조 변화를 FTIR-ATR를 이용하여 측정한 결과이다. 도 1에서, a는 PLGA의 특징적인 피크로서, PLGA의 주사슬에 있는 카보닐 그룹인 1750cm-1 피크를 확인할 수 있으며, 1452, 1380 및 1269cm-1 영역에서 메틸 피크를 확인할 수 있다. b는 알릴아민으로 1차 표면처리한 후의 결과로서, 1630cm-1 및 3000-3500cm-1 부근 영역에서 새로운 피크를 확인함으로써, 알릴아민의 그래프팅 반응을 확인할 수 있으며, c는 아민 결합기가 결합된 이후, 콜라겐이 도입된 이후에도, 알릴아민의 반응피크가 유지되므로, 안정적으로 세포친화성 물질 도입이 가능함을 뒷받침한다.
2. ESCA 측정결과
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 제조된 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 대한 표면처리 반응시 화학적 구조 변화를 ESCA 이용하여 측정한 결과로서, 도 3의 a는 PLGA자체의 피크이고, b는 알릴아민(AA)으로 표면처리, c는 알릴아민(AA)과 갈락토오스(LA)로 표면처리된 경우로서, 400eV 부근에서 새로운 피크 생성을 확인할 수 있다. 상기 피크는 알릴아민의 탄소기와 질소기에 의해 생성된 것이다.
이에, 도 4는 ESCA 측정시, 표면처리에 의해 개질된 PLGA의 C1s 피크를 나타낸 것이고, 도 5는 O1s의 피크를 나타낸 것이다.
그 결과, 알릴아민과 갈락토오스로 처리된 그래프 간에도 피크의 양상이 다른 것을 확인할 수 있다. 상세하게는, 갈락토오스로 표면처리된 경우, 알릴아민에서는 볼 수 없던 O=C-NH, HO-C 결합이 새롭게 생겼으며 이는 알릴아민으로만 처리해서는 생성될 수 없는 결합으로 알릴아민으로 일차 처리된 후, 갈락토오스가 성공적으로 표면 처리됨을 뒷받침한다.
3. 원자력현미경(AFM) 측정결과
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 제조된 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 대한 표면처리 반응시 AFM을 이용하여 표면의 거칠기를 측정한 결과로서, 미처리된 PLGA의 표면거칠기가 1.639 nm인 결과 대비, 알릴아민 처리, 알릴아민과 갈락토오스로 처리된 시료의 거칠기는 각각 21.392 nm와 12.555 nm로 측정되었다.
따라서, 알릴아민으로 의한 1차 처리로 굉장히 거칠어진 표면이 형성되고, 이후, 갈락토오스기에 의해 덮혀짐에 따라, 표면의 거칠기가 감소한 것으로 보인다.
4. 접촉각 측정결과
상기 실시예 2에서 제조된 벌키 구조가 부여된 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 대한 표면처리 반응시, 미처리된 PLGA 대비, 알릴아민(AA)로 표면처리, 알릴아민(AA)과 갈락토오스(LA)로 표면처리된 PLGA의 접촉각 및 표면장력을 하기 표 1에 기재하였다.
Figure PCTKR2009006795-appb-I000002
상기 표 1의 결과로부터, 알릴아민 처리 및 알릴아민 처리후 갈락토오스에 의해 표면처리된 PLGA 필름의 경우, 감소한 접촉각을 확인함으로써, 표면에 존재하는 친수성 관능기(-NH2, -COOH 및 -OH)에 의해 PLGA 표면이 알릴아민과 갈락토오스로 잘 처리되어 부착된 것을 뒷받침한다.
이상의 표면분석 결과, 본 발명의 직접 증착 방식으로 반응기가 도입되어 1차 개질된 생분해성 봉합사(PLGA) 표면상에, 또 다른 물질로 2차 개질이 가능하다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 실시예 1의 경우, 생분해성 봉합사(PLGA) 표면상에 알릴아민으로 일차 개질시킨 후, 콜라겐으로 2차 개질하여, 직접적인 세포의 증식과 점착을 확인하였다.
<실험예 2> 세포증식 및 점착 확인실험
1. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 분리와 배양
사전에 피험자의 동의를 받은 제대혈을 공여받았으며, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 사용은 가톨릭의과대학교 생명윤리심의위원회로부터 심의를 통과하였다[가성의 IRB 제08-4호].
제대혈을 Ficoll-PaqueTM PLUS radient[GE Healthcare Bio-sciences AB, Uppsala, Sweden]를 이용해 원심분리하여(560g, 30min) 단구를 수집하고, PBS(Welgene, Daegu, South Korea)로 세척하였다. 세포들을 10% FB와 1% Antibiotics/antimycotic가 첨가된 low glucose-DME에 부유하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 7일 경과 후, 비부착 세포들을 제거하고 부착 세포들은 계속해서 배양하였다. 방추모양의 부착세포들을 세척한 후, 0.25% 트립신(trypsin) EDTA로 세포들을 떼어내고 신선한 배양액으로 중화하였다. 75-cm2 플라스크에 2×105개의 세포를 넣어준 후 배양하였다. 75∼90% 바닥에 자랄 때까지 배양액을 계속해서 유지시켜 주었고, 초기 세포 배양의 passage를 passage 1(p1)이라고 하였다.
2. 중간엽 줄기세포에 GFP 형광인자 표지
상기 단계 1에서, 분리 및 배양된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에, 렌티바이알 벡터(Lenti-viral vector)를 이용하여 형광단백질(green fluorescent protein, 이하 “GFP"이라 한다)를 표지하였다.
GFP 인자가 포함된 렌티바이알 벡터는 ㈜마크로젠 부설 렌티벡터 연구소로부터 구입하였다. 중간엽 줄기세포를 6 웰 플레이트에 약 1×105 cells/well이 되도록 분주하였다. 폴리브렌(Polybrene) 8㎍/㎖ 과 함께 Lenti-GFP를 중간엽 줄기세포에 접종(infection)하고 6시간 후 배지를 갈아주고 2∼3일간 배양하였다. 2∼3일 후 형광현미경으로 세포 내 GFP를 확인하였다.
3. WST-1 에세이
대조군으로 표면처리되지 않은 봉합사를 사용하고, 실시예 1에서 콜라겐으로 표면처리된 봉합사와 상기 대조군을 자외선 조건하에서, 밤새(overnight) 멸균을 수행하였다. 상기 멸균된 각 봉합사는 클린 벤치 안에서 두께 및 길이가 일정한 부분을 취하여 96 웰 플레이트에 빈 공간이 없게 깔아주었다. PBS를 사용하여 세척하여, 예비 적시기(pre wetting)을 유도해 준 후, 200㎕ 매개체(complete media, DMEM, FBS10%, PS 1%, Gibco, USA)와 함께 103 셀을 넣어주었다. 1, 3, 7 일별로 WST-1 시약과 UV 분광기를 사용하여 셀 증식 정도를 측정하였다.
4. 형광현미경 관찰
봉합사의 경우, 일반적으로 셀 형태(cell morphology)를 측정하기 위하여 사용되는 방법(Gimmesa’s test)으로는 세포의 점착을 확인하기가 어려움이 있어 형광인자를 가진 세포를 사용하여 봉합사 처리에 따른 세포 점착을 비교하였다.
하루 전에 자외선(UV)으로 멸균된 봉합사의 두께가 일정한 부분을 같은 길이로 취하여 96 웰 플레이트에 빈 공간이 없게 채우고, PBS를 사용한 세척을 통해, 예비 적시기(pre wetting)을 유도한 후, 200㎕ 매개체(complete media, DMEM, FBS10%, PS 1%, Gibco, USA)와 함께 103 셀을 넣어주었다. 7일 경과 후, 형광현미경을 사용하여 봉합사 표면의 셀을 관찰하였다.
도 7의 결과는 처리되지 않은 대조군의 봉합사(suture)와 콜라겐에 담궜다 뺀 봉합사(col soak)와 플라즈마 처리를 통해 개질된 봉합사(plasma+col)의 세포 증식을 비교 확인한 것이다. 그 결과, 플라즈마 처리를 통해 개질된 봉합사(plasma+col)는 미처리된 봉합사와 단순히 콜라겐에 담궜다 뺀 봉합사간의 광학밀도(Optical Density) 결과로부터, 세포증식력의 현저한 증가를 확인하였다.
도 7에서, 미처리 봉합사와 표면처리된 봉합사 각각의 표면상에 일주일간 배양된 세포를 형광현미경으로 관찰한 결과를 도 8 및 도 9에 도시하였다.
도 8 및 도 9에서 보이는 바와 같이, GFP로 표지된 세포들은 미처리된 봉합사에 비해 콜라겐으로 표면개질된 봉합사에서 더 잘 생존하고 있음을 확인할 수 있었다.
이상의 결과들로부터, 생분해성 고분자 재료의 표면개질을 성공적으로 수행할 수 있으며, 친수성 물질로의 표면개질이 세포의 점착에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다. 이에, 생분해성 고분자 표면상에 친수성 물질을 도입한 친세포성 봉합사를 제공할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은
첫째, 벌키 구조가 부여된 생분해성 고분자 소재로 이루어진 소수성 재질의 멀티필라멘트 가연사(DTY)를 포함하는 생분해성 봉합사 표면을 친수성으로 표면개질 후, 세포친화성 물질을 점착시킨 생분해성 봉합사형 세포 전달체를 제공하였다.
둘째, 본 발명의 생분해성 봉합사형 세포 전달체는 세포친화성이 향상되고, 상기 벌키 구조에서 세포 또는 생체조직의 증식이 유리하며 특히, 줄기세포의 생착률을 향상시킬 수 있다.
셋째, 상기 세포친화성을 향상시킨 생분해성 봉합사형 세포 전달체를 제조하기 위한 최적의 제조방법을 제공하였다.
넷째, 글리콜라이드 및 락타이드가 90:10 내지 70:30 중량비율로 공중합된 PLGA 소재로 이루어진 생분해성 봉합사를 플라즈마 처리로 표면개질하여 세포친화성을 향상시킨 친세포성 봉합사를 제공할 수 있다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (19)

  1. 부분적으로 벌키 구조가 부여된 생분해성 고분자 소재로 이루어진 소수성 재질의 멀티필라멘트 가연사를 포함하는 생분해성 봉합사 표면에,
    친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시켜 친수성으로 표면개질한 후, 세포친화성 물질을 점착시킨 생분해성 봉합사형 세포 전달체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자 소재로 이루어진 가연사에 부분적으로 150 내지 1000%의 벌키성이 부여된 것을 특징으로 하는 상기 생분해성 봉합사형 세포 전달체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 벌키성이 부여된 생분해성 고분자 소재로 이루어진 가연사가 1∼150㎛의 기공을 가지는 것을 특징으로 하는 상기 생분해성 봉합사형 세포 전달체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자 소재가 글리콜라이드, 글리콜산, 락타이드, 젖산, 카프로락톤, 다이옥사논, 트리메틸렌카보네이트 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 화합물의 단일 중합체 또는 이들을 포함하는 공중합체인 것을 특징으로 하는 상기 생분해성 봉합사형 세포 전달체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자 소재가 글리콜라이드 및 락타이드가 90:10 내지 70:30 중량비율로 공중합된 공중합체인 것을 특징으로 하는 상기 생분해성 봉합사형 세포 전달체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 친수성 관능기가 아민기, 카르복실기 및 하이드록시기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기 생분해성 봉합사형 세포 전달체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포친화성 물질이 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 파이브로넥틴, 갈락토오스 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기 생분해성 봉합사형 세포 전달체.
  8. 생분해성 고분자 소재로 이루어진 멀티필라멘트 가연사(DTY)에 부분적으로 벌키 구조를 부여하는 공정,
    상기 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사를 추가 연사(Twisting) 또는 브레이딩(braiding) 처리하여 집속성을 향상하는 공정,
    상기 벌키 구조가 부여된 멀티필라멘트 가연사 표면에 플라즈마 화학증착법으로 친수성 관능기를 포함하는 화합물을 고착시키는 공정 및
    상기 고착 이후, 커플링제를 이용하여 세포친화성 물질을 점착시키는 공정을 포함하는 생분해성 봉합사형 세포 전달체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 멀티필라멘트 가연사의 단사 직경이 5 내지 30㎛인 것을 특징으로 하는 상기 세포 전달체의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 멀티필라멘트 가연사의 합사 직경이 40 내지 1000㎛인 것을 특징으로 하는 상기 세포 전달체의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 멀티필라멘트 가연사에 부분적으로 150 내지 1000%의 벌키성이 부여된 것을 특징으로 하는 상기 세포 전달체의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 벌키성이 부여된 멀티필라멘트 가연사가 1 내지 150㎛의 기공을 가지는 것을 특징으로 하는 상기 세포 전달체의 제조방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 플라즈마 화학증착법이 25 mtorr이하의 압력 및 50 내지 100W 전력조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 상기 세포 전달체의 제조방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 친수성 관능기를 포함하는 화합물이 아민기, 카르복실기 및 하이드록시기로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 친수성 관능기를 포함하는 화합물인 것을 특징으로 하는 상기 세포 전달체의 제조방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 세포친화성 물질이 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 파이브로넥틴, 갈락토오스 및 키토산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 상기 세포 전달체의 제조방법.
  16. 생분해성 멀티필라멘트 가연사에 부분적으로 150 내지 1000%의 벌키성 및 1 내지 150㎛의 기공을 가지는 멀티필라멘트 가연사 표면 상에,
    친수성 관능기를 포함하는 화합물이 고착된 후 세포친화성 물질이 점착된 생분해성 봉합사.
  17. 제16항에 있어서, 상기 생분해성 고분자 소재가 글리콜라이드 및 락타이드가 90:10 내지 70:30 중량비율로 공중합된 공중합체인 것을 특징으로 하는 상기 생분해성 봉합사.
  18. 제16항에 있어서, 상기 친수성 관능기를 포함하는 화합물이 친수성 아민 화합물인 것을 특징으로 하는 상기 생분해성 봉합사.
  19. 제16항에 있어서, 상기 세포친화성 물질이 콜라겐인 것을 특징으로 하는 상기 생분해성 봉합사.
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