CN114832157A - 一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料，制备方法如下：A.将明胶溶解于六氟异丙醇溶剂中，37℃摇床混匀2‑2.5h，配置电纺液；B.将电纺液置于静电纺丝机中，通过静电纺丝法制备得到静电纺丝纤维膜；C.将材料置于36～38℃真空干燥箱72～120h后，在3～5℃条件下在N‑羟基琥珀酰亚胺/1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中交联24～48h；D.75％乙醇浸泡8～10min完成预收缩，继续真空干燥24～48h，以13～16kGy剂量进行伽马射线辐照灭菌。本发明具有良好的生物相容性和降解性，加快伤口愈合速度，为软组织功能性愈合提供最佳的生理环境。

Description

一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种促进全层皮肤缺损功能性愈合的胶原膜材料及其制备方法。
背景技术
皮肤是抵御外部危害的第一道重要防线，然而目前临床上较深的大面积创伤愈合后的效果并不令人满意。大面积缺损除了面临伤口感染可能性增加、愈合速度变慢等问题，新生皮肤组织常由过度沉积的胶原束构成，缺乏毛囊等皮肤附属器官，造成皮肤生理功能缺失，大大影响患者生存质量。毛囊具有感觉、内分泌及促进创面愈合等功能，促进毛囊新生可通过调控新生皮肤胶原沉积、改变温度等，促进皮肤创伤功能性修复。
传统的皮肤修复(特别是大面积组织缺损的修复)移植物主要是来自自体或同种异体(甚至异种组织)。但存在组织来源有限，额外创伤和治疗费用，免疫抵抗以及伦理安全等方面的限制。因此与人体组织细胞外基质有相似结构的生物合成材料是目前研究的热点。皮肤是由从纳米到微米级不同直径的纤维组成，不同软组织移植材料微结构不仅能够影响材料抗张强度、亲水性、降解性等理化性能，还能够提供一系列的生物、化学和物理线索来调节早期细胞的行为。不同纤维排列方向及直径能够影响免疫细胞的募集和极化，影响成纤维细胞、角质形成细胞的爬行和分化过程，从而影响软组织愈合的结局。
目前对皮肤全层创面植入材料的研究多针对于小面积缺损材料的抗菌、抗炎作用，而针对大面积创伤的功能性愈合的材料的研究和应用较少。近年来，静电纺丝技术由于其操作简单、高成本效益和通用性广的优势，可制备出具有可控孔隙率、纤维结构、直径的仿细胞外基质多功能纳米纤维支架，在生物医学领域已被广泛应用。在支架成分方面，由于天然生物材料由于降解速度不可控、免疫原性、获取来源有限等缺陷，合成高分子材料类材料在力学性能、加工性、降解性和免疫原性等方面都具有一定的优势。明胶是由胶原部分降解得到的仍保存胶原功能的物质，与胶原成分相似，生物相容性好，易降解，可溶于多种溶剂，且价格较低廉，广泛应用在组织工程领域中。Michal
Figure BDA0003612255130000011
等发现相比于聚乳酸纤维，明胶纳米纤维较快促进上皮形成与增加肉芽组织深度，伤口处成纤维细胞密度也显著增加。
大型皮肤创面对材料的生物相容性、降解性、柔软性以及促进附属器官再生能力提出了更高的要求，对适应于大面积皮肤缺损的软组织愈合材料的研发具有较迫切的临床需求。
发明内容
基于上述研究现状和缺陷，本发明提供一种促进皮肤大面积创面功能性愈合的静电纺丝膜。通过调控电纺液配比、电纺收集器类别、电压强度、推注速度、推注距离和推注时间，调控静电纺丝膜材料的纤维排列方向和直径，改善材料的生物相容性、机械性能和降解性，从而为组织功能性再生提供最佳的生理环境。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料，制备方法如下：
A.将明胶溶解于六氟异丙醇溶剂中，37℃摇床混匀2-2.5h，配置电纺液；
B.将电纺液置于静电纺丝机中，通过静电纺丝法制备得到静电纺丝纤维膜；
C.将步骤B中得到的静电纺丝纤维膜置于36～38℃真空干燥箱72～120h后，在3～ 5℃条件下，在N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中交联24 ～48h；
D.步骤C中的制备的材料于75％乙醇浸泡8～10min完成预收缩，继续真空干燥24 ～48h，以13～16kGy剂量进行伽马射线辐照灭菌，得到所需胶原膜材料。
作为优选，所述步骤A的药用级明胶强度～240g Bloom；明胶的浓度为4.8～5.2％W/V。
作为优选，所述步骤B中所述静电纺丝机采用2700～2900rpm转速滚筒进行电纺膜收集；施加电压：低压-2kv，高压7kv；使用内径0.5mm的21G金属针头，针头尖端距离收集器11cm；电纺液推注速率0.028mm/min；电纺时间2～5小时。
作为优选，所述步骤C中扫描电子显微镜扫描得到静电纺丝材料纤维间夹角小于15°，纤维直径为200～400nm。
本发明的有益效果为：
本发明提供的促进皮肤大面积创面功能性愈合的纳米静电纺丝膜，具有特定取向形貌结构和200～400nm纤维直径。和对照组(生理盐水)相比，具有良好的生物相容性和降解性。植入小鼠全层皮肤缺损模型后，术后7天能够促进修复型免疫细胞活化并引导角质形成细胞迁移和分化，加快伤口愈合速度；术后21天能够观察到皮肤附属器官毛囊及皮脂腺的再生，为软组织功能性愈合提供最佳的生理环境。
附图说明
图1为电纺膜的微观结构图；
图2为缺损愈合评价试验过程图；
图3为对照组与实验组7天剩余伤口面积统计图；
图4为对照组与实验组7天剩余间隙宽度对比图；
图5为对照组与实验组7天剩余间隙宽度数据图；
图6为对照组与实验组21天新生毛囊数量对比图；
图7为对照组与实验组21天新生毛囊数量数据图；
图8为对照组与实验组7天Cd3免疫荧光面积对比图；
图9为对照组与实验组7天Cd3免疫荧光面积数据图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1:一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料，包括如下制备方法：
A.将明胶溶解于六氟异丙醇溶剂中，37℃摇床混匀2-2.5h，配置电纺液；
B.将电纺液置于静电纺丝机中，通过静电纺丝法制备得到静电纺丝纤维膜；
C.将步骤B中得到的静电纺丝纤维膜置于36～38℃真空干燥箱72～120h后，在3～5℃条件下，在N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中交联24～48h；
D.步骤C中的制备的材料于75％乙醇浸泡8～10min完成预收缩，继续真空干燥24～48h，以13～16kGy剂量进行伽马射线辐照灭菌，得到所需胶原膜材料。
所述步骤A的药用级明胶强度～240g Bloom；明胶的浓度为(4.8～5.2)％W/V。
所述步骤B中所述静电纺丝机采用2700～2900rpm转速滚筒进行电纺膜收集；施加电压：低压-2kv，高压7kv；使用内径0.5mm的21G金属针头，针头尖端距离收集器11cm；电纺液推注速率0.028mm/min；电纺时间2～5小时。
所述步骤C中扫描电子显微镜扫描得到静电纺丝材料纤维间夹角小于15°，纤维直径为200～400nm。
实验例：胶原膜材料小鼠大型创面全层皮肤缺损植入试验。
根据上述步骤所得到的电纺膜进行测试如下：
一、扫描电镜(SEM)检测
观察电纺膜的微观结构(图1)可见，明胶电纺膜的纳米纤维分别排列成有一定取向性，纤维直径为200～400nm。
二、缺损愈合大体评价
对照、实验组的电纺膜植入小鼠背部大面积皮肤缺损(15mm直径的全层切除性缺损)，空白对照组进行生理盐水处理，缺损上部覆盖Tegaderm(3M)敷料，并用硅胶圈(内径18mm，外径22mm，边宽2mm，厚度1mm)缝合固定，避免小鼠肉膜肌收缩，使之更符合人体创面再上皮化愈合模式(图2)。根据对照组与实验组7天剩余伤口面积统计(图3)，实验组缺损愈合相对对照组较快。
三、组织切片评价愈合效果
1、对愈合第7天(免疫反应期)、14天(修复期)，21天(重塑期)的样本进行HE染色，半定量测量剩余间隙宽度、新生毛囊数量度等指标。可见实验组早在第7天即可见分层新生角化上皮形成，较对照组上皮爬行距离更远(图4)。21天时，实验组伤口皮肤产生大量新生毛囊，单位面积的毛囊数量与正常皮肤没有统计学差异(图5)。
2、免疫荧光染色评价免疫调节作用对愈合第7天(免疫反应期)的样本进行免疫荧光染色，半定量测量肉芽组织Cd3荧光着色面积，实验组有更多的Cd3阳性面积，提示取向材料诱导了T细胞介导的适应性免疫(图6)。
上述各项测试表明，本发明提供了一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料。以明胶为原料进行静电纺丝得到取向形貌电纺膜材料，应用于作为大面积皮肤全层缺损植入材料。术后7天可促进角质形成细胞爬行覆盖创面，术后21天能促进新生毛囊再生、从而促进伤口功能愈合。同时材料能够促进创面处T细胞浸润，诱导适应性免疫系统激活，降低材料周围异物纤维反应，适用于大面积全层缺损皮肤组织修复。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (4)

1.一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料，其特征在于，制备方法如下：
A.将明胶溶解于六氟异丙醇溶剂中，于37℃摇床混匀2-2.5h，配置得到电纺液；
B.将步骤A中得到的电纺液置于静电纺丝机中，通过静电纺丝法制备得到静电纺丝纤维膜；
C.将步骤B中得到的静电纺丝纤维膜置于36～38℃真空干燥箱72～120h后，在3～5℃条件下，在N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中交联24～48h；
D.步骤C中的制备的材料于75％乙醇浸泡8～10min完成预收缩，继续真空干燥24～48h，以13～16kGy剂量进行伽马射线辐照灭菌，得到所需胶原膜材料。
2.根据权利要求1所述的一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料，其特征在于：所述步骤A中，明胶强度～240g Bloom；明胶的浓度为4.8～5.2％W/V。
3.根据权利要求1所述的一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料，其特征在于：所述步骤B中，所述静电纺丝机采用2700～2900rpm转速滚筒进行电纺膜收集；施加电 压：低压-2kv，高压7kv；使用内径0.5mm的21G金属针头，针头尖端距离收集器11cm；电纺液推注速率0.028mm/min；电纺时间2～5小时。
4.根据权利要求1所述的一种促进全层皮肤创面功能性愈合的胶原膜材料，其特征在于：所述步骤C中，扫描电子显微镜扫描得到静电纺丝材料纤维间夹角小于15°，纤维直径为200～400nm，用于检测步骤C中材料是否符合要求。
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