CN100462059C - 修复皮肤缺损的人工皮肤的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于修复皮肤缺损的人工皮肤的制备方法，本发明是采用组织工程方法制备，包括培养液的配制、人工皮肤基质溶液的制备、人工皮肤的培养，能够将所缺失的真皮和表皮层同时修复；其人工皮肤包括表面的表皮细胞和其下的成纤维细胞；本发明制备的人工皮肤结构接近于天然皮肤，具有一定的弹性和韧性，可直接应用于炎症、溃疡、烧创伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的修复。
Description
技术领域
本发明属于人工器官组织工程技术领域，涉及一种用于修复皮肤缺损的人工皮肤的制备方法。
背景技术
皮肤是覆盖和保护体表的重要组织器官。由于炎症、溃疡、烧创伤、医源性等原因常造成皮肤的缺损，对于这种组织缺损目前多采用自体皮肤的移植，然而这种方法不仅造成供皮区新的创伤缺陷，而且常受到供皮来源的限制。此外，移植物经常与移植部位邻近的皮肤存在有色泽、质地和功能上的差异。理想的人工皮肤替代物应具有以下特性：与正常皮肤组织相似的结构，对伤口有一定的贴附性，可防止细菌入侵及生长，可用于修复皮肤组织缺损，无毒性、不产生免疫排斥反应，并有良好的生物相容性等。近年来，国际上运用组织工程方法研制人工皮肤的技术进步迅速，已经成为皮肤缺损移植治疗的热点。
组织工程方法是通过获得自体或异体的极少量皮肤组织，将其在体外(实验室中)经过灭菌、消化、分离、培养，在获得足够的细胞数量时将其重组制备全层皮肤组织(包括表皮层及真皮层)，用于患者皮肤创伤的修复，这种全层皮肤组织在种植后不易变形，易于愈合，将有着重要的临床价值和社会经济效益。组织工程研究已经达到一定深度，已有人工皮肤的产品在美国应用于临床。
理想的人工皮肤能够将所缺失的真皮和表皮层同时修复，其包括两种细胞成分，即位于表层的表皮细胞和位于真皮层的成纤维细胞。ApligrafTM(Organogenesis，Inc.U.S.A.)是美国FDA批准的一种含有人体活细胞的人工皮肤，是由活细胞和结构蛋白构成，分上下两层(模拟表皮和真皮)；其是将成纤维细胞持续培养35天，在平皿中形成含有细胞外基质的纤维膜，然后在其上接种表皮细胞，移行、增殖、复层化形成人工皮肤替代物。Composite CultureSkin-CCS(Ortec International Inc.U.S.A.)最近被FDA批准用于治疗隐性皮肤异常—大泡性表皮松解(也可用于治疗静脉溃疡)，其为双层的人工皮肤，使用牛胶原蛋白为支架，在其上下层各培养人表皮细胞及真皮成纤维细胞。它们共同的缺点是制备过程较长、价格昂贵、适用范围窄。(I.Jones，BritishJournal of Plastic Surgery(2002)55，185-193.)
经检索，伍津津申请的专利(公开号CN 1148230C)，其内容包括各种溶液的配制、基质凝胶的制备和细胞的三维培养；基质凝胶由I、III型胶原、壳多糖、硫酸软骨素、硫酸肝素、弹性蛋白、透明质酸或/和纤维粘连蛋白组成。所制备的人工皮肤弹性和柔韧性好，能够被剪切，但尚存在一些缺陷：(1)基质凝胶的成分复杂，使临床应用成本增加；(2)未明确人工皮肤中细胞的来源，获得的人工皮肤的应用和用途不明；(3)我们的研究证明：表皮细胞和成纤维细胞的体外培养条件相差很大，而该专利使用的培养基并不适合表皮细胞和成纤维细胞的共同培养，会直接影响表皮细胞和成纤维细胞的生长，导致人工皮肤的质地结构不能满足临床使用的需要；(4)未使用利于表皮细胞角化的培养基，使培养的人工皮肤无角质层，与天然皮肤有差异；(5)文献中无人工皮肤体外培养的详细方案，技术人员无法重复。
马克-艾森泊格申请的专利(公开号CN 1062441C)，该发明是在多孔的、交联化的胶原海绵膜的一面上接种成纤维细胞，培养使其遍布生长在胶原海绵膜上；其另一面形成一层无孔胶原，然后在此面接种培养的表皮细胞。从文献中看该发明的不足在于：(1)该发明未建立三维培养环境，成纤维细胞不能长入胶原海绵膜中而只是在其表面生长，因而并未形成真正的真皮组织；(2)该发明在多孔胶原的另一面(无细胞的无孔胶原面)上接种培养表皮细胞，使表皮细胞与真皮层中的成纤维细胞没有相互的关系，因而无法形成皮肤中重要的基底膜结构，使得表皮层与真皮层极易剥离，影响移植修复效果；(3)该发明的皮肤无法使表皮细胞复层化(表皮的成熟过程)，最终导致培养的皮肤与天然皮肤差异显著。
曹谊林申请的专利(申请号02136043.X)“双层人工皮肤及其制备方法”，该发明是将连续的表皮细胞生长在成纤维细胞—PGA膜表面，且表皮细胞有明显的分层。该发明的不足在于(1)真皮支架材料使用聚羟基乙酸(PGA)，该材料的降解产物偏酸性，会影响创面的愈合；(2)成纤维细胞是种植在PGA膜表面而不是材料内部，所以很难按照生理条件下进行三维方向的生长，与天然皮肤结构有差别；(3)无具体的体外培养详细方案，技术人员无法重复。
以上三项发明均没有临床应用或动物实验的证明或效果说明，所以这些产品能否应用于临床没有说服力。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于修复皮肤缺损的人工皮肤的制备方法，使其具有制备周期短、成本低、方法简便、易于操作的优点；使所获得的人工皮肤具有一定的弹性、韧性、结构近似天然皮肤，同时能用应于临床。
本发明用于修复皮肤缺损的人工皮肤的制备方法，包括人工皮肤培养液的配制、人工皮肤基质溶液的制备、人工皮肤培养的步骤。本发明的主要特征在人工皮肤培养的环节。为便于理解本发明技术方案的内容，以下按操作顺序进行描述。
1、细胞来源：本发明制备人工皮肤所使用的表皮细胞和成纤维细胞，可以来自青少年包皮切除术后的皮肤组织或手术中的废弃皮肤，通过消化培养或组织块培养获得；也可来自可向表皮细胞或成纤维细胞分化的干细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞(如骨髓间充质干细胞，造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞，肝脏干细胞、神经干细胞中的一种或是几种)。在获取上述两种细胞来源后，可以按类型建立细胞库，这样可保障人工皮肤制备过程的稳定性，也为临床的应用提供方便。
2、人工皮肤培养液的配制(按体积百分比)
(1)基础培养液的配制
(2)人工皮肤培养液的配制：
培养液A： 基础培养液+表皮生长因子(1～100ng/ml)+牛垂体提取物(0.2％v/v)
培养液B： 基础培养液+氯化钙(0.1～1mM)+L-抗坏血酸(10～100mg/ml)+表皮生长因子(1～100ng/ml)
培养液C： 基础培养液+氯化钙(0.2～2.0mM)+L-抗坏血酸(10～100mg/ml)
培养液D： 基础培养液+氯化钙(0.3～3.0mM)
3、人工皮肤基质溶液的制备：
1)人工皮肤基质是由I、II、III、IV型胶原的一种或几种混合制成，其及其溶液的制备为已有技术。
2)将盛有人工皮肤基质溶液的容器置于冰上，紫外线下照射(确保溶液处于冷却状态)；将消毒好的支撑膜(用于支撑人工皮肤基质，避免收缩，为具有一定强度、机体可接受的网状膜，如尼龙膜、硅胶膜、橡胶膜、高分子材料膜、生物衍生材料膜等)浸透人工皮肤基质溶液后，置于培养器皿中在37℃下固化。
4、人工皮肤的培养
1)在人工皮肤基质溶液中按体积比加入10％的胎牛血清和10mg/ml的DMEM培养液，调节pH值至7.2-7.4，加入体外培养的人成纤维细胞悬液，使细胞终浓度为104—106个细胞/ml；再将其加至培养器皿中已固化的支撑膜上，在37℃、5％CO2条件下固化30分钟；再将人工皮肤基础培养液加至其中；37℃、5％CO2条件下培养2—4天，每天换液，形成人工皮肤的真皮部分。
2)按10—100个/cm2的密度在制备的真皮表面扎孔；将体外培养的人表皮细胞，按104～5×105个细胞/cm2加至已制备的真皮的表面，加入培养液A，37℃、5％CO2条件下培养2～3天，每天换液；形成未成熟的人工皮肤。真皮表面的扎孔可使表皮细胞长入针孔，形成人工上皮钉突，使真、表皮结合更加紧密。
3)人工皮肤的成熟和角化。将人工皮肤培养支架(表面有通透网格、下面有支腿的平板支架，可采用不锈钢、塑料、玻璃、高分子材料、生物材料制作)另置于培养器皿中，把制备的未成熟的人工皮肤取出放在培养支架表面，加入培养液A淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养液B，淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养液C，液面与皮肤表面齐平，培养1～2天后更换为培养液D，液面与培养支架齐平培养4～6天，每天换液；培养条件均为37℃，5％CO2环境。
4)按上述方法制备的成熟的人工皮肤为便于临床使用，(在使用前)可采用机械或物理方法在皮肤上均匀地切或扎制若干个平行交错的缝隙，缝隙长5—15mm，缝隙穿透皮肤，缝隙的平行间距和纵向间距均为2—10mm。
本发明中人工皮肤的面积和厚度可根据临床的不同需求，改变制备过程中培养器皿的大小、人工皮肤基质溶液和细胞的加入量来进行调整。
本发明用于修复皮肤缺损的人工皮肤的制备方法以及按其方法获得的人工皮肤与现有技术和产品相比，具有以下优点：
1)本发明的制备方法具有制备周期短、成本低、方法简便、易于操作的优点。
2)本发明制备的人工皮肤可以直接应用于炎症、溃疡、烧创伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的修复，具有一定的弹性、韧性，形状大小和厚度易于改变。
3)本发明使用的同种异体的人体成纤维细胞和表皮细胞，本身抗原性不高；而且由于细胞的体外培养、冻存等过程，使其部分抗原丢失，进一步降低了免疫排斥反应；同时缺乏朗格罕细胞及树突状细胞，无抗原呈递作用，因此具有免疫排斥反应低的特点。
4)本发明制备的人工皮肤的形态和超微结构观察结果表明，人工皮肤的结构与天然皮肤都具有表皮层和真皮层。表皮层中含有基底层、棘层、颗粒层和角质层。棘层细胞之间存在细胞间桥，表皮层和真皮层之间有完整的基底膜，并有连续的、长度不等的上皮钉突的出现。透射电镜观察结果，人工皮肤的表皮层中，棘层细胞之间以桥粒连接，并具有天然皮肤中所具有的板层体、张力纤维和脂滴等超微结构。
5)本发明所制备的人工皮肤经过人体移植临床试验，结果表明：移植后的人工皮肤，能够保护创面、营养创面、迅速关闭创面、减轻创面疼痛、缩短创面愈合时间，产生的瘢痕少、无明显的免疫排斥反应，能明显促进炎症、溃疡、烧创伤、医源性等原因造成的多种类型皮肤缺损的愈合，病程平均缩短5～15天，尤其对糖尿病溃疡、放射性溃疡等慢性、难愈性溃疡创面治疗效果更加明显，是临床皮肤缺损治疗的较为理想的方法。
附图及其说明
附图1为本发明制备的人工皮肤组织学结构(横断面)的低倍显微镜照片，图中显示皮肤全层结构，可见表皮层与真皮层，真皮层约为表皮层的3倍厚度，真皮层中成纤维细胞形态正常、分布均匀。
附图2为本发明制备的人工皮肤组织学结构的(横断面)高倍显微镜照片，显示表皮、真皮层，表皮层有钉突(箭头所示)伸入真皮层。
附图3为本发明制备的人工皮肤的透射电子显微镜照片，显示人工皮肤的超微结构，表皮细胞间的桥粒(箭头所示)。
附图4为本发明制备的人工皮肤治疗糖尿病溃疡的照片。患者为糖尿病胫前溃疡3个月，面积为5×10cm2。A为术前；B为术中；C为术后一月愈合；D为术后六个月。
具体实施方式
1、取青少年包皮切除术后的皮肤组织，Dispase消化，37℃，80分钟消化后分离表皮和真皮组织，用胰酶在37℃条件下，消化表皮组织5分钟获取表皮细胞。使用胶原酶消化真皮组织，37℃消化120分钟后，获取成纤维细胞。
2、人工皮肤培养液的配制
1.)基础培养液的配制
成份 最终浓度
商用最低必需培养液(DMEM) 67.5％
商用培养液F12 22.5％
胎牛血清 10％
胰岛素 40ng/ml
氢化可的松 800ng/ml
碱性成纤维细胞生长因子 6ng/ml
转铁蛋白 2mg/ml
腺嘌呤 0.1mM
抗生素 800i.u/ml
2.)人工皮肤培养液的配制：
培养液A： 基础培养液+表皮生长因子(40ng/ml)+牛垂体提取物(0.2％v/v)
培养液B： 基础培养液+氯化钙(0.5mM)+L-抗坏血酸(80mg/ml)+表皮生长因子(40ng/ml)
培养液C： 基础培养液+氯化钙(1.0mM)+L-抗坏血酸(80mg/ml)
培养液D： 基础培养液+氯化钙(2.0mM)
3、人工皮肤基质溶液的制备：
1)人工皮肤基质是由I、II、III、IV型胶原混合而成，其溶液的制备可参见中国专利申请号03134535.2中关于凝胶溶液的制备方法。
2)将盛有人工皮肤基质溶液的容器置于冰上，于紫外线下照射50分钟；将消毒好的尼龙膜浸透人工皮肤基质溶液后，置于培养器皿中在370C下固化30分钟。
4、人工皮肤的培养：
1)在50ml人工皮肤基质溶液中加入5ml胎牛血清和0.5g的DMEM培养液，调节pH值至7.2-7.4，加入107个人成纤维细胞混匀；再将该混合液加至培养器皿中已固化的支撑膜上，在37℃、5％CO2条件下固化30分钟；再将人工皮肤基础培养液加至其中；37℃、5％CO2条件下培养3天，每天换液，形成人工皮肤的真皮部分。
2)按100个/cm2的密度在制备的真皮表面用针板扎孔；将体外培养的人表皮细胞按105个细胞/cm2加至已制备的真皮表面，加入培养液A，37℃、5％CO2条件下培养2天，每天换液；形成未成熟的人工皮肤。
3)人工皮肤的成熟和角化。将不锈钢支架另置于培养器皿中，把制备的未成熟的人工皮肤取出放在培养支架表面，加入培养液A淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养液B，淹没皮肤表面，培养2天后更换为培养液C，液面与皮肤表面平齐，培养1天后更换为培养液D，液面与培养支架齐培养4天，每天换液；培养条件均为37℃，5％CO2环境。
4)按上述方法制备的成熟的人工皮肤为便于临床使用，在使用前采用10mm长的刀片在皮肤上均匀地扎制若干个平行交错的缝隙，缝隙长10mm，缝隙穿透皮肤，缝隙的平行间距为5mm，纵向间距为8mm。还可以采用激光的方法切缝。
Claims (3)
1.一种用于修复皮肤缺损的人工皮肤的制备方法，包括人工皮肤培养液的配制、人工皮肤基质溶液的制备、人工皮肤培养的步骤，其特征在于，所述的人工皮肤培养是按以下方法操作：
1)在人工皮肤基质溶液中按体积比加入10％的胎牛血清和10mg/ml的DMEM培养液，调节pH值至7.2-7.4，加入体外培养的人成纤维细胞悬液，使细胞终浓度为104-106个细胞/ml；再将其加至培养器皿中已固化的支撑膜上，在37℃、5％CO2条件下固化30分钟；再将人工皮肤基础培养液加至其中；37℃、5％CO2条件下培养2-4天，每天换液，形成人工皮肤的真皮部分；
2)按10-100个/cm2的密度在制备的真皮表面扎孔；将体外培养的人表皮细胞，按104～5×105个细胞/cm2加至已制备的真皮表面，加入培养液A，37℃、5％CO2条件下培养2～3天，每天换液；形成未成熟的人工皮肤；
3)人工皮肤的成熟和角化：将人工皮肤培养支架另置于培养器皿中，把制备的未成熟的人工皮肤取出放在培养支架表面，加入培养液A淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养液B，淹没皮肤表面，培养1～2天后更换为培养液C，液面与皮肤表面齐平，培养1～2天后更换为培养液D，液面与培养支架齐平培养4～6天，每天换液；培养条件均为37℃，5％CO2环境，获得成熟人工皮肤；所述的人工皮肤培养液按体积百分比配制，分为基础培养液和培养液A、B、C、D，其中基础培养液的配制为：
所述的培养液A：基础培养液+表皮生长因子1～100ng/ml+牛垂体提取物0.2％
所述的培养液B：基础培养液+氯化钙0.1～1mM+L-抗坏血酸10～100mg/ml+表皮生长因子1～100ng/ml
所述的培养液C：基础培养液+氯化钙0.2～2.0mM+L-抗坏血酸10～100mg/ml
所述的培养液D：基础培养液+氯化钙0.3～3.0mM。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将所制备的成熟人工皮肤采用机械或物理方法均匀地切或扎制若干个平行交错的缝隙，缝隙长5-15mm，缝隙穿透皮肤，缝隙的平行间距和纵向间距均为2-10mm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述固化的支撑膜的制备是将盛有人工皮肤基质溶液的容器置于冰上，紫外线下照射；将消毒好的支撑膜浸透人工皮肤基质溶液后，置于培养器皿中在37℃下固化。
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