CN103736150B

CN103736150B - 褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化药物中的应用

Info

Publication number: CN103736150B
Application number: CN201310747944.0A
Authority: CN
Inventors: 龚逸鸿; 何帆; 曾易; 刘小珍; 蒋庆
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: CN103736150A

Abstract

本发明公开了褪黑素的新用途，褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化药物中的应用，褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备治疗骨疾病药物中的应用。通过实验表明：褪黑素协同细胞外基质生物材料体系能促进间充质干细胞体外增殖，保持细胞良好的成纤维形状，降低胞内ROS及促进外基质钙沉积的产生，提高成骨基因表达，确定了褪黑素协同细胞外基质生物材料促进间充质干细胞体外成骨分化及机制，为褪黑素协同细胞外基质生物材料用于治疗骨关节炎，骨缺损，骨创伤等疾病的修复材料奠定了基础。

Description

褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化药物中的应用

技术领域

本发明属于组织工程修复与再生领域，具体涉及褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化（Osteogenesis）药物中的应用及褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备治疗骨疾病药物中的应用。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞、间充质干细胞和多能诱导干细胞，可以进一步分化为各种不同的组织，构成各种复杂的机体器官，已被广泛地应用于再生医学与组织工程领域。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在发育、生长、组织器官自体再生、维持体内微环境平衡等方面发挥着重要的作用，由于其具有容易提取、较强的自我更新能力和多向分化能力、较强的免疫抑制效果等特点，已经广泛应用于再生医用、基因治疗、组织工程、细胞因子替代疗法等领域。

骨关节炎，骨损伤，骨创伤是影响人类健康最常见疾患之一。以骨关节炎为例，在超过50岁以上人群中，骨关节炎在导致长期残疾的疾病中仅次于心血管疾病排名第二，骨关节炎致残比例在人群中约占2%-6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为5亿美元，其中一半以上消耗缘于工作能力丧失。骨关节炎较其他疾病更易于影响老年患者的行走、上下楼梯和其他下肢功能。骨关节炎及骨损伤是导致50岁以上人群功能残疾、造成经济损失和影响社会发展的主要疾病之一，医学及临床急需开发优良的治疗骨关节疾病的方法迫在眉睫。

褪黑素是松果体产生的一种吲哚胺类激素，褪黑激素的生物合成受光周期的制约，在刚出生的婴儿体内也能检出很少量的褪黑激素，直到三月龄时分泌量才增加，并呈现较明显的昼夜节律现象，3～5岁幼儿的夜间褪黑激素分泌量最高，青春期分泌量略有下降，以后随着年龄增大而逐渐下降，到青春期末反而低于幼儿期，到老年时昼夜节律渐趋。多项研究表明，褪黑素可以促进睡眠，调节免疫作用以及抗衰老抗肿瘤等多项功能。同时，褪黑素具有抗氧化抗炎症的作用，调节细胞内活性氧和一氧化氮诱导酶产生。近几年褪黑素作用于细胞增殖及分化研究深入，特别是成骨分化研究。最新研究报道指出褪黑素能提高间充质干细胞碱性磷酸酶（ALP）；一些体内研究表明褪黑素在药理学剂量上能促进小鼠骨密质形成。

褪黑素已被证明通过减少活性氧保护神经系统且能阻止过氧化氢引起的骨髓间充干细胞凋亡。然而，褪黑素协同细胞外基质生物材料促进间充质干细胞成骨分化的潜在保护作用及机制的报道非常少。

发明内容

本发明的发明目的在于公开一种褪黑素的新应用，填补现有技术空白。

褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化药物中的应用，所述细胞外基质生物材料的制备步骤为先在普通细胞培养基材上体外培养外源细胞并诱导外源细胞分泌基质，再脱细胞处理；所述外源细胞为骨髓间充质干细胞。

优选的，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞（MSCs）。种子细胞研究是骨组织工程学的重要内容。理想的骨种子细胞应该具有以下特点：结构比较简单，是不具有特定机能的原始细胞；取材容易，对机体损伤小；体外培养时增殖力强；自我更新，一定的条件下能向特定的方向分化；稳定表达成骨细胞表型；植入体内后能继续产生成骨活动；无致瘤性。目前，做为骨组织工程的种子细胞有4种来源：骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。比较而言，骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC)是骨髓内存在的一类非造血干细胞，其在体内外具有支持和调控造血的作用，并且在体内可分布于多种组织和器官，并具有多向分化潜能，能够向成骨系细胞、成纤维系细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞等分化，是目前应用较广泛的重要种子细胞之一。

褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备治疗骨疾病药物中的应用，其特征在于，所述细胞外基质生物材料的制备步骤为先在普通细胞培养基材上体外培养外源细胞并诱导外源细胞分泌基质，再脱细胞处理；所述外源细胞为骨髓间充质干细胞。

所述骨疾病为骨关节炎症、骨缺损或骨创伤。

由于细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)，是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖、蛋白或蛋白聚糖。细胞外基质影响细胞的存活、生长与死亡决定细胞的形状，决定细胞的形状参与细胞的迁移，它对细胞的形状、结构、功能、存活、增殖、分化、迁移等一切生命现象具有全面的影响，因而无论在胚胎发育的形态发生、器官形成过程中，或在维持成体结构与功能完善（包括免疫应答及创伤修复等）的一切生理活动中均具有不可忽视的重要作用。

本发明将褪黑素与细胞外基质生物材料协同使用，通过实验发现褪黑素与细胞外基质生物材料组成的调控体系能促进间充质干细胞体外增殖，保持细胞良好的成纤维形状，降低胞内ROS及促进外基质钙沉积的产生，提高成骨基因表达，效果明显由于褪黑素或细胞外基质生物材料的单独使用。

本发明所述细胞外基质生物材料的制备步骤为先在普通细胞培养基材上体外培养外源细胞并诱导外源细胞分泌基质，再脱细胞处理、干燥、灭菌消毒。上述步骤中体外培养外源细胞、诱导外源细胞分泌基质、脱细胞处理、干燥、灭菌消毒等步骤均采用本领域常规操作，采用的培养液等试剂也为本领域常规选择，所述外源细胞为骨髓间充质干细胞。

出于获取难度和成本考虑，优选地，本发明所述骨髓间充质干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。

作为一种实施方案，所述细胞外基质的制备步骤如下：

S1. 从人源、猪源、鼠源或兔源组织获取骨髓间充质干细胞；

S2. 配置诱导培养液；

S3. 在普通细胞培养基材上体外培养骨髓间充质干细胞并诱导其分泌细胞外基质，培养7~20天，隔日换液；

S4. 脱细胞处理；

步骤S3所述普通细胞培养基材为商用细胞培养皿、培养板或培养瓶。

步骤S2中所述诱导培养液的组成为：普通商用培养基α-MEM 80~90%体积比，胎牛血清10~20%体积比，抗生素10~200 U/mL，腺嘌呤0.2~0.25 mM，刺激因子组分。

所述刺激因子组分由抗坏血酸10~100μg/mL，脯氨酸20~60μg/mL，地塞米松100nM~1μM中的一种或几种组成。

步骤S4中所述脱细胞处理为先加入含有氨水和Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）的脱细胞处理液处理，再加入脱氧核糖核酸酶处理。

所述脱细胞处理液由pH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有Triton X-100 1~5%体积比和氨水0.8~5%体积比。

所述脱氧核糖核酸酶溶液由pH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有500~800 U/mL脱氧核糖核酸酶。

本发明所述细胞外基质生物材料脱细胞处理后，可直接与褪黑素协同使用或干燥、灭菌消毒后备用，所述灭菌消毒采用⁶⁰Co或环氧乙烷灭菌。

本发明将间充质干细胞培分别培养于四种不同培养体系：传统培养板体系（TCPS），传统培养板与褪黑素体系（TCPS+MT），细胞外基质生物材料体系（ECM），褪黑素协同细胞外基质生物材料调控体系(ECM+MT)，研究比较褪黑素协同细胞外基质生物材料促进间充质干细胞体外增殖及成骨化及机制，进一步将褪黑素协同细胞外基质生物材料用于临床对骨关节炎，骨缺损，骨创伤等疾病修复治疗奠定基础，为骨组织工程相关治疗提供一种有效的方法。

本发明的检测内容包括：（1）细胞外基质生物材料对褪黑素吸附检测（2）DNA检测细胞增殖；（3）流式细胞仪检测间充质干细胞胞内活性氧（ROS）；（4）成骨钙沉积检测；（5）实时荧光定量RT-PCR 在mRNA 水平检测І型胶原及OPN成骨目标基因表达水平。

为了证明上述应用的实用性，本发明通过如下技术方案予以证明：

（A）采用上述细胞外基质的制备方法制备细胞外基质生物材料。

（B）取用骨髓来源的间充质干细胞P3代分别培养于传统培养板（TCPS）与细胞外基质生物材料培养板（ECM）中，分别更换基础培养基或含100uM 褪黑素的基础培养基，依次创建四种培养体系：传统培养板体系（TCPS），传统培养板与褪黑素体系（TCPS-MT），细胞外基质生物材料体系（ECM），褪黑素协同细胞外基质生物材料调控体系(ECM-MT)，置于5%CO₂，37℃恒温培养箱中，隔天更换一次培养基，培养5~7天。

（C）检测以下结果：细胞外基质生物材料对褪黑素的吸附、间充质干细胞增殖及细胞内活性氧（ROS）、细胞外基质钙沉积量及І型胶原与OPN成骨目标基因检测，验证褪黑素协同细胞外基质生物材料调控体系对间充质干细胞成骨分化促进作用。

具体分析步骤如下：

（1）高效液相色谱仪检测上清液褪黑素量，分析细胞外基质生物材料对褪黑素的吸附；

（2）DNA量检测分析不同培养体系对间充质干细胞增殖影响；

（3）流式细胞术检测分析，不同培养体系对间充质干细胞内活性氧影响；

（4）成骨诱导14天后，细胞外基质钙沉积量检测及实时荧光定量RT-PCR分析成骨目标基因表达，分析不同培养体系对间充质干细胞在成骨分化影响。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开了褪黑素的新用途，褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化药物中的应用，褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备治疗骨疾病药物中的应用。通过实验设计四种不同的培养体系，研究褪黑素生物材料调控体系对人来源的间充质干细胞体外增殖及成骨分化的促进作用研究，研究表明：细胞外基质生物材料对褪黑素具有一定程度的吸附作用，与褪黑素协同使用构成褪黑素生物材料调控体系，褪黑素生物材料调控体系能促进间充质干细胞体外增殖，保持细胞良好的成纤维形状，降低胞内ROS及促进外基质钙沉积的产生，提高成骨基因表达。本研究确定了褪黑素协同细胞外基质生物材料促进间充质干细胞体外成骨分化及机制，为褪黑素协同细胞外基质生物材料用于治疗骨关节炎，骨缺损，骨创伤等疾病的修复材料奠定了基础。

附图说明

图1为生物材料对褪黑素吸附检测结果图；

图2为四种不同培养体系中，骨髓间充质干细胞细胞形态及增殖研究；

图3为四种不同培养体系中，骨髓间充质干细胞细胞胞内活性氧研究；

图4为四种不同培养体系中，骨髓间充质干细胞成骨分化钙沉积量检测；

图5为四种不同培养体系中，骨髓间充质干细胞体外成骨分化COL І、OPN成骨目标基因表达研究。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例 1 细胞外基质生物材料的制备

制备步骤为：

S1. 从人源组织获取骨髓间充质干细胞；

S2. 配置诱导培养液：培养基α-MEM 80体积比，胎牛血清20%体积比，抗生素10~200 U/mL，腺嘌呤0.25 mM，脯氨酸50 μg/mL，地塞米松100nM；

S3. 按照20，000个细胞/cm²的密度在普通商用细胞培养板上体外培养骨髓间充质干细胞并诱导其分泌细胞外基质，于37ºC的5%的CO₂培养箱中培养7~20天，隔日换液；

S4. 脱细胞处理：先用pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，接着加入含有Triton X-100 5% 体积比和氨水4%体积比的脱细胞处理液，于37ºC的5%的CO₂培养箱中静置5分钟，用pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，再加入含有800U/mL脱氧核糖核酸酶溶液于37ºC的5%的CO₂培养箱中静置60分钟，用pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次。

实施例 2 细胞外基质生物材料对褪黑素的吸附检测

将实施例1中脱细胞后细胞外基质生物材料细胞培养板及传统未经任何处理的商用培养板孵育于100uM 褪黑素磷酸缓冲液，至于37℃ 5%CO₂恒温箱中，分别收集0，0.5，1，2，4，6，12，24，48，72小时上清液进行高效液相色谱仪检测。采用55/45体积比甲醇和水的流动相，流速为1ml/min222um紫外检测，上清液褪黑素含量同原始含量比值如图1所示。TCPS组上清液褪黑素含量为95.4%-97.9%，而生物材料组仅含有71.1%-87.4%，表明生物材料组对褪黑素有明显吸附作用，可构建细胞外基质生物材料协同褪黑素调控体系。

实施例 3 四种培养体系中骨髓间充质干细胞增殖及胞内活性氧研究

P3代骨髓间充干细胞按3000cell/cm²接种6孔板中，包括有未经任何处理的传统商用培养板和实施例1制得含有细胞外基质生物材料的培养板，加入基础培养基（α-MEM，10%FBS，100 U/mL 青霉素， 100 μg/mL 链霉素，0.25 μg/mL二性霉素B）或含有100uM褪黑素基础培养基，隔天换液，依次创建四种培养体系：传统培养板体系（TCPS），传统培养板与褪黑素体系（TCPS-MT），细胞外基质生物材料体系（ECM），褪黑素协同细胞外基质生物材料调控体系(ECM-MT)。

1）使用0.25%胰酶收集培养5天后孔板的细胞。收集细胞采用125 μg/mL木瓜蛋白酶60℃消化4小时，木瓜蛋白酶溶解于含有10 mM L-半胱氨酸PBE缓冲液(100 mM 磷酸盐，10 mM EDTA，pH 6.5)中。消化的细胞DNA量采用Quant-iT^TM PicoGreen^® dsDNA assay kit照试剂说明书操作，最后多功能酶标仪检测读数。如图2 所示。从图2可以看出，与TCPS相比，仅加入褪黑素组细胞增殖无明显的差异性，但含有细胞外基质生物材料组的细胞增殖效率明显提高，其中ECM组DNA含量达49.1 ± 5.5 ng/孔，而ECM+MT组DNA增加到 64.2 ± 7.9 ng/孔。

2）使用0.25%胰酶收集培养7天后孔板的细胞，步骤同上。细胞内ROS采用2′,7′-二氯荧光乙酰乙酸盐 (DCFH-DA)检测。10 μM DCFH-DA 37℃孵育10min孵育细胞后，采用BD双波长激光流式细胞仪进行检测细胞内的荧光强度，每个样品收集10000个细胞。结果如图3所示，从图3可以看出，传统培养板中加入褪黑素后，胞内活性氧明平均值显下降30.1%，ECM组及ECM+MT组胞内活性氧达到最低水平。

实施例 4 四种培养体系中骨髓间充质干细胞 体外成骨分化研究

P3代骨髓间充干细胞按15000cell/cm²接种6孔板中，包括有未经任何处理的传统商用培养板和实施例1制得含有细胞外基质生物材料的培养板，待细胞密度大95%以上换成骨培养基（成骨培养基：基础培养基，0.2 mM抗坏血酸，10^-7 M 地塞米松，10 mM β-甘油磷酸酯）或含有100uM褪黑素成骨培养基，隔天换液，依次创建四种培养体系：传统培养板体系（TCPS），传统培养板与褪黑素体系（TCPS-MT），细胞外基质生物材料体系（ECM），褪黑素协同细胞外基质生物材料调控体系(ECM-MT)。

1）图4为成骨诱导14天后，细胞外基质的钙沉积采用0.5%茜草素红液进行染色1小时，PBS洗涤后采用500ul 1%氯化氢孵育，采用多功能酶标仪在420nm处检测吸光值分析成骨分化细胞外基质钙沉积量结果。从图4可以看出，与TCPS组相比，ECM组钙沉积量提高61.9%，而加入褪黑素的生物材料体系，钙沉积量比仅生物材料组提高30.5%，存在极显著性差异。

2）四种不同培养体系中，间充质干细胞成骨分化的分子水平机制解释。分组同本实施例步骤1），成骨诱导14天后，Trizol 法提取总RNA、逆转录，用实时荧光定量定量RT-PCR 鉴定成骨相关基因（COL I，OPN），结果如图5所示，ECM-MT组中，COL I表达量比TCPS组提高了69.1%，比仅生物材料组表达量提高40.5%，存在极显著性差异。其中OPN基因的表达同COL I趋势相同，褪黑素生物材料组能明显提高OPN的表达。

综上实验表明，褪黑素，特别是褪黑素协同细胞外基质生物材料调控体系可用于促进间充质干细胞体外大规模增殖，促进间充质干细胞体外成骨分化，可作为骨组织工程中治疗修复骨关节炎，骨损伤，骨创伤等疾病优良的材料体系。

Claims

1.褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化药物中的应用，其特征在于，所述细胞外基质生物材料的制备步骤为先在普通细胞培养基材上体外培养外源细胞并诱导外源细胞分泌基质，再脱细胞处理；所述外源细胞为骨髓间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化药物中的应用，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。

3.根据权利要求1所述褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化药物中的应用，其特征在于，所述诱导外源细胞分泌基质时使用的诱导培养液组成为：培养基α-MEM 80~90%体积比，胎牛血清10~20%体积比，抗生素10~200 U/mL，腺嘌呤0.2~0.25 mM，刺激因子组分；所述所述刺激因子组分由抗坏血酸10~100μg/mL，脯氨酸20~60μg/mL，地塞米松100nM~1μM中的一种或几种组成。

4.根据权利要求1所述褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备促进间充质干细胞成骨分化药物中的应用，其特征在于，所述脱细胞处理为先加入含有氨水和Triton X-100的脱细胞处理液处理，再加入脱氧核糖核酸酶处理，所述脱细胞处理液由pH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有Triton X-100 1~5%体积比和氨水0.8~5%体积比，所述脱氧核糖核酸酶溶液由pH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有500~800 U/mL脱氧核糖核酸酶。

5.褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备治疗骨疾病药物中的应用，其特征在于，所述细胞外基质生物材料的制备步骤为先在普通细胞培养基材上体外培养外源细胞并诱导外源细胞分泌基质，再脱细胞处理；所述外源细胞为骨髓间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备治疗骨疾病药物中的应用，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。

7.根据权利要求5所述褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备治疗骨疾病药物中的应用，其特征在于，所述骨疾病为骨关节炎症、骨缺损或骨创伤。

8.根据权利要求5所述褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备治疗骨疾病药物中的应用，其特征在于，所述诱导外源细胞分泌基质时使用的诱导培养液组成为：培养基α-MEM 80~90%体积比，胎牛血清10~20%体积比，抗生素10~200 U/mL，腺嘌呤0.2~0.25 mM，刺激因子组分；所述所述刺激因子组分由抗坏血酸10~100μg/mL，脯氨酸20~60μg/mL，地塞米松100nM~1μM中的一种或几种组成。

9.根据权利要求5所述褪黑素协同细胞外基质生物材料在制备治疗骨疾病药物中的应用，其特征在于，所述脱细胞处理为先加入含有氨水和Triton X-100的脱细胞处理液处理，再加入脱氧核糖核酸酶处理，所述脱细胞处理液由pH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有Triton X-100 1~5%体积比和氨水0.8~5%体积比，所述脱氧核糖核酸酶溶液由pH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有500~800 U/mL脱氧核糖核酸酶。