CN104873498A - 褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，从人源、猪源、鼠源或兔源组织获取，用CCK-8检测褪黑素对早衰间充质干细胞增殖能力的影响，用SA-β-Gal染色检测分析褪黑素作用于早衰间充质干细胞后SA-β-Gal染色阳性率的变化，用流式细胞术检测分析褪黑素作用于早衰间充质干细胞后细胞周期的变化，用钙结节茜素红染色，钙结节定量检测分析褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响。本发明为以间充质干细胞为基础的细胞疗法防御氧化应激损伤提供了一种策略。

Description

褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用

技术领域

本发明属于医学应用领域，尤其涉及褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）最初发现于骨髓基质中，由于其具有较强的自我更新和多向分化潜能，在组织工程和再生医学领域中已得到广泛运用。为了达到治疗目的，MSCs必须通过体外扩增得到足够的数量，然而MSCs在体外扩增却不得不面临复制衰老的命运。

细胞衰老是细胞逐渐失去增殖能力，细胞周期停滞在G1期的一种现象。此外，据报道，细胞受到氧化应激可能经历一个过早衰老的过程。早衰细胞表现出与复制衰老的细胞相同的功能特征：细胞形状变扁平、变大，丧失增殖的潜力，不可逆的细胞周期停滞，β-半乳糖肝酶(SA-β-Gal)染色阳性率增加。更重要的是，MSCs一旦被诱导成早衰细胞，其分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、甚至非中胚层起源的细胞以及肝细胞和神经元等能力将会受到显著影响。这些阻碍MSCs在临床中的应用。

活性氧(ROS)如过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基、超氧化物阴离子，会诱导氧化应激和导致DNA损伤。如果不妥善修复DNA损伤，细胞将进展到过早衰老和凋亡。中等水平的ROS对各种细胞过程至关重要，如增殖、分化。然而，在病理条件下ROS过多是有害的，会导致细胞衰老或细胞死亡。最近的研究表明，长期细胞内H₂O₂的积累和接触亚致死剂量的外源性H₂O₂可能诱导MSCs过早衰老。

褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)是一种主要来自松果体分泌的吲哚胺类激素，最近被发现在骨髓中也有高水平的分泌。许多研究表明，褪黑素调节各种生理功能，如促进睡眠、调节昼夜节律和神经内分泌活动。褪黑素有众所周知的抗氧化性能，包括清除过多的自由基和增加细胞内抗氧化酶的合成。研究表明，褪黑素通过减少活性氧生成和提高超氧化物歧化酶产生保护细胞免受促炎性细胞因子损害。此外，褪黑素已被证明可调控终末分化细胞(关节软骨细胞)的生物功能和MSCs的多向分化。然而，褪黑素对氧化应激引起的早衰的MSCs的影响尚未阐明。

发明内容

解决的技术问题：针对现有的褪黑素对氧化应激引起的早衰的间充质干细胞的影响尚未阐明的缺陷，本发明提供一种褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用。

技术方案：本发明提供一种褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用。

优选的，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，从人源、猪源、鼠源或兔源组织获取。

所述的间充质干细胞衰老指细胞丧失增殖能力，SA-β-Gal染色阳性率≥80%，细胞周期停滞在G0/G1期比率≥80%。

所述的药物通过静脉途径或口腔途径进行给药。

所述的药物的制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、缓释剂、冲击、片剂或胶囊。

所述的褪黑素的应用包括在组织工程和再生医学方面的应用。

本发明通过测试系列浓度的H₂O₂对间充质干细胞衰老的影响。研究结果表明，低浓度的H₂O₂，如100μM和200μM，诱发SA-β-gal活性，细胞周期停滞在G0/G1期，高浓度的H₂O₂，如400μM，导致细胞死亡，因此本发明采用100-200uM的H₂O₂ 诱导间充质干细胞早衰。

本发明的检测内容包括：（1）褪黑素对H₂O₂ 诱导的早衰间充质干细胞增殖能力的影响；（2）褪黑素对H₂O₂ 诱导的早衰间充质干细胞SA-β-Gal染色阳性率的影响；（3）褪黑素对H₂O₂ 诱导的早衰间充质干细胞细胞周期的影响；（4）褪黑素对H₂O₂ 诱导的早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响。

上述内容通过以下技术方案予以实现：

     (A) 骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived MSCs ，BM-MSCs)培养在完全培养基中，密度≥50%时，加入H₂O₂ (100-200uM)处理2-4h，制成间充质干细胞衰老模型，所述培养基组分为α-MEM和胎牛血清，它们的体积比为（4-9）:1，抗生素含量为10~200 U/mL；

（B）去除H₂O₂   后加入无血清的培养基清洗两次，加入不同浓度梯度（10nM，1uM，100uM）的褪黑素，3-5天后检测早衰间充质干细胞的增殖能力、SA-β-Gal染色阳性率、细胞周期中G0/G1期比例；

（C）早衰间充质干细胞在褪黑素作用下成骨诱导14-21天后检测其成骨分化能力。

上述内容的具体分析步骤如下：

（1）CCK-8检测褪黑素对早衰间充质干细胞增殖能力的影响；

（2）SA-β-Gal染色检测分析褪黑素作用于早衰间充质干细胞后SA-β-Gal染色阳性率的变化；

（3）流式细胞术检测分析褪黑素作用早衰间充质干细胞后细胞周期的变化；

（4）钙结节茜素红染色，钙结节定量检测分析褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响。

有益效果：本发明提供的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，该应用具有以下有益效果，外源性补充褪黑素能够有效保护干细胞免受H₂O₂诱导衰老，并呈现剂量依赖的方式，表现为细胞增殖潜力增加，SA-β-gal染色阳性率降低，细胞周期中G0/G1期比率下降，成骨分化能力增强。同时，本发明为以间充质干细胞为基础的细胞疗法防御氧化应激损伤提供了一种策略。

附图说明

图1为褪黑素对早衰间充质干细胞增殖能力的影响检测图。

图2为褪黑素作用于早衰间充质干细胞后SA-β-Gal染色阳性率的变化检测图；

图3为褪黑素作用于早衰间充质干细胞后细胞周期的变化检测图；

图4 为褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响检测图，用钙结节的茜素红染色（Scale bar = 200μm）；

图5 为褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响检测图，用钙结节定量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例1

1、褪黑素对早衰的间充质干细胞增殖能力、SA-β-Gal染色阳性率、细胞周期的影响。

人源BM-MSCs在37℃、5%CO₂ 培育箱中培养于175cm²培养瓶中（培养基各组分的体积比为89%的α-MEM，10%的胎牛血清，1%的青霉素、链霉素），每三天换一次液。当细胞密度≥90%时用0.25% trypsin-EDTA消化细胞，按3000/cm²接种于三种规格（96孔板用于增殖实验，12孔板用于SA-β-gal染色，6孔板用于细胞周期检测）的孔板中培养，用于下一步实验。当细胞密度达到50%时，加入200μM H₂O₂ （在生长培养基中稀释），孵育2 h。2h后用无血清的α-MEM培养基清洗两次，再加入含有不同浓度梯度（10nM,1uM,100uM）的褪黑素的完全培养基中继续培养4天，用于后续各单独实验的检测。

A. 褪黑素对早衰间充质干细胞增殖能力的影响

细胞增殖评估采用CCK-8检测试剂盒。吸掉原培养液后每孔按照CCK-8原液和无血清的培养液1:10的体积比的混合液110ul，37℃孵育1h后在酶联免疫检测仪上测定各孔在450nm波长处的光吸收值，每组取6孔测定值的平均值。

结果如图1所示，褪黑素增强早衰的BM-MSCs增殖能力，并呈现浓度依赖性。

B. 褪黑素作用早衰间充质干细胞后SA-β-Gal染色阳性率的变化

SA-β-gal染色阳性一直作为一个典型的过早衰老的生物标志物，SA-β-gal染色使用SA-β-gal染色试剂盒。按照试剂商提供的操作说明，细胞过夜孵育在无CO₂ 的37℃摇床中，第二天吸出染色液，PBS清洗两次后DAPI复染3 min，再用PBS清洗3次，在Olympus IX51倒置显微镜下拍照。为了量化SA-β-gal染色阳性细胞（细胞染成蓝色）的百分比，每组随机选择所拍摄的10张图片，每张图片至少含有200个细胞，统计衰老细胞的比例。

结果如图2所示，褪黑素明显降低早衰BM-MSCs的SA-β-gal染色阳性率，并呈现浓度依赖性。

C. 褪黑素作用早衰间充质干细胞后细胞周期的变化

细胞周期分布通过PI染色分析评估。贴壁细胞被胰蛋白酶分离，分离的细胞收集在EP管中，4℃固定在70%的乙醇溶液中24小时。第二天用预冷的PBS洗涤一次后，每管样品用100ul的PI染液（含有50ug/ml PI和50ug/ml RNase A，PBS配置）在37℃水浴箱中避光孵育30分钟，转移到流式管后上机检测，每个样品至少检测5000个细胞。

结果如图3所示，褪黑素显著减少早衰BM-MSCs的G0/G1期比例。

2、褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响

细胞培养方式与1中的相同，分离细胞接种于12孔板中培养，待细胞密度达到90%时加入200uM H₂O₂ 处理2h，造成BM-MSCs早衰。2h后用无血清的α-MEM培养基清洗两次，再加入含有不同浓度梯度（10nM,1uM,100uM）褪黑素的成骨诱导培养液（89%体积比的低糖DMEM培养基，10%体积比的胎牛血清，1%体积比的青霉素、链霉素，0.2 mM 抗坏血酸，100 nM 地塞米松，10 mM β-磷酸甘油）诱导分化21天，每三天换一次液。

A.  钙结节的茜素红染色

矿化的细胞外基质(ECM)是成骨分化的一个标记。茜素红染色的深浅可以评估成骨分化能力的强弱。细胞用4%多聚甲醛固定10分钟，PBS清洗2次，每孔加入0.1%的茜素红染液1ml（去离子水配置，ph调至4.2），室温孵育30分钟，PBS清洗2次后在Olympus IX51倒置显微镜下拍照。

结果如图4所示，茜素红染色深浅随褪黑素浓度递增，褪黑素明显增强早衰BM-MSCs的成骨分化能力。

B.  钙结节的定量检测

拍照完毕后每孔立即加入1%的高氯酸200ul，室温孵育10分钟，溶解钙结节，转移上清液至96孔板，酶联免疫检测仪上测定各孔在420nm波长处的光吸收值，每组取6孔测定值的平均值。

结果如图5所示，钙结节量呈现褪黑素浓度依赖性，褪黑素明显增强早衰BM-MSCs的成骨分化能力。

综上实验表明，褪黑素能够增强早衰BM-MSCs的增殖能力，降低SA-β-gal染色阳性率，减少细胞停滞在G0/G1期比例，提高其成骨分化能力，能够有效预防干细胞的过早衰老，在组织工程和再生医学领域中有着广泛的应用前景。

Claims (10)

1.褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，其特征在于：所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞，获取于人源、猪源、鼠源或兔源组织。

3.根据权利要求1所述的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，其特征在于：用100-200uM的H₂O₂ 诱导间充质干细胞早衰。

4.根据权利要求3所述的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，其特征在于：所述间充质干细胞早衰是指细胞丧失增殖能力，SA-β-Gal染色阳性率≥80%，细胞周期停滞在G0/G1期比率≥80%。

5.根据权利要求4所述的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，其特征在于：用CCK-8检测褪黑素对早衰间充质干细胞增殖能力的影响。

6.根据权利要求4所述的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，其特征在于：用SA-β-Gal染色检测分析褪黑素作用于早衰间充质干细胞后SA-β-Gal染色阳性率的变化。

7.根据权利要求4所述的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，其特征在于：用流式细胞术检测分析褪黑素作用于早衰间充质干细胞后细胞周期的变化。

8.根据权利要求4所述的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，其特征在于：用钙结节茜素红染色，钙结节定量检测分析褪黑素对早衰间充质干细胞成骨分化能力的影响。

9.根据权利要求1所述的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，其特征在于所述的药物通过静脉途径或口腔途径进行给药。

10.根据权利要求1所述的褪黑素在制备预防间充质干细胞早衰药物中的应用，其特征在于所述的药物的制剂形式包括液体制剂、颗粒剂、缓释剂、冲击、片剂或胶囊。