CN103687940B - 用于间充质干细胞的处理方法及其在氧化应激相关疾病治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明首先涉及一种处理优选地来自脂肪来源的间充质干细胞的方法，主要包括两个步骤，即，制备和分离间充质干细胞，接着使细胞在含有氧化剂的调理或处理介质中进行生长和特定处理一段时期。本发明还包括直接通过所述方法获得的细胞及其在治疗由氧化应激引起的或与其相关的疾病中的用途。

Description

用于间充质干细胞的处理方法及其在氧化应激相关疾病治疗中的 应用
技术领域
本发明涉及一种用于间充质干细胞的治疗方法，由该方法直接获得的细胞及其在治疗由氧化应激引起的或与其相关的疾病中的用途。
背景技术
干细胞的潜能依靠其在限定的细胞类型中分化和整合到相应组织和器官中的能力。干细胞的另一个有益的特征是其旁分泌释放细胞因子、白细胞介素、营养因子和生长因子。
当前研究和临床试验的目的是用来探究干细胞在一些病理学中的治疗效果，并且对于基于干细胞治疗存在日益增长的需要。
呼吸系统、心血管系统、免疫系统、内分泌系统/功能、中枢和周围神经系统的一些退行性疾病，脊髓损伤，缺血/再灌注损伤和脱髓鞘疾病都具有活性氧类(ROS)介导的炎性成分，称为氧化应激。
活性氧类，主要是过氧阴离子基团(O2 -)及其歧化产物H2O2，其为细胞线粒体参与呼吸链的天然废物副产物，呼吸链是一种由于其在能量分子(ATP)生成中的功能而对细胞寿命至关重要的现象。
线粒体是哺乳动物细胞的最主要的氧化还原-活性代谢区，超过90%的电子传递至呈最终电子受体O2上。主要的电子传递经由中央氧化还原循环发生，所述中央氧化还原循环使用从各种代谢底物(例如丙酮酸盐、脂肪酸)的氧化获得的势能产生ATP。该过程的调节对细胞功能很重要，因为在提供非必需氨基酸、消除过量的氨基酸、提供葡萄糖和面对可变的和间歇性的进食时能够长期提供能量的互变能量前体，细胞必须产生ATP，而同时保持合适的内环境稳定。部分调控似乎经由持续低的ROS生成速率和和分子传感器而发生。对于该调控的相关氧化还原循环，尽管缺乏界定，但是已知其需要特定的氧化还原环境。
在过度的氧化应激下，同时发生的线粒体ATP-生成潜能的破坏和电子传递链引起的ROS生成的瞬时增加可引起线粒体将ROS释放到细胞溶质。这可触发相邻线粒体中“ROS-诱发的ROS释放”。因此，虽然低的ROS生成速率是线粒体中的正常过程，但是过度的ROS生成对电子流的破坏可引起衰老、细胞凋亡和细胞死亡。Go和Jones,2008.Redox compartmentalization in eukaryotic cells.Biochimicaet Biophysica Acta1780(1273–1290);Zorov,Juhaszova和Sollott.2006.Mitochondrial ROS-induced ROS release:an update and review.BiochimBiophys Acta1757(509–517)。
实际上，这些过程与线粒体氧化应激-相关疾病比如帕金森症、弗里德希氏共济失调、亨廷顿病和糖尿病直接相关。Go和Jones,2008.Redox compartmentalization in eukaryotic cells.Biochimica et BiophysicaActa1780(1273–1290);Dringen,Gutterer和Hirrlinger,2000.Glutathione metabolism in brain.Metabolic interaction between astrocytesand neurons in the defense against reactive oxygen species.Eur J Biochem267(4912-4916);Chinta和Andersen,2008.Redox imbalance inParkinson's disease.Biochimica et Biophysica Acta1780(1362–1367);Cohen,2000.Oxidative stress,mitochondrial respiration,and Parkinson'sdisease.Ann N Y Acad Sci899(112–120);Lodi,Tonon,Calabrese和Schapira,2006.Friedreich's ataxia:from disease mechanisms totherapeutic interventions.Antioxid Redox Signal8(438–443);McGill和Beal,2006.PGC-1alpha,a new therapeutic target in Huntington's disease?Cell127(465–468);Donath,Ehses,Maedler,Schumann,Ellingsgaard,Eppler和Reinecke,2005.Mechanisms of beta-cell death in type2diabetes.Diabetes54(Suppl2)(S108–S113)。
过氧化物，包括过氧化氢(H2O2)，是导致氧化应激的主要活性氧类(ROS)之一。H2O2是由一些酶(包括过氧化物歧化酶、葡萄糖氧化酶和单胺氧化酶)连续产生的，为了防止氧化性损伤其必须被降解。H2O2的细胞毒性作用被认为是由铁催化反应产生的羟基自由基引起的，其引起对DNA、蛋白质和膜脂的继发性破坏。H2O2在高浓度(>100μM)下充当“自杀底物”，引起过氧化氢酶不可逆地灭活。Hyslop,Zhang,Pearson&Phebus,1995.Measurement of striatal H2O2bymicrodyalysis following global forebrain ischemia and reperfusion in therat:Correlation with the cytotoxic potential of H2O2in vitro.Brain Res671(181-186).H2O2引起细胞内谷胱甘肽，一种从细胞中消除H2O2的分子，的耗尽，表明H2O2进入细胞，因此可在细胞中启动一个或多个毒性通路。Dringen,Pawlowski和Hirrlinger,2005.PeroxideDetoxification by Brain Cells.J Neurosci Res79(157–165);Halliwell和Whiteman,2004.Measuring reactive species and oxidative damage in vivoand in cell culture:how should you do it and what do the results mean?British Journal of Pharmacology142(231–255);Baud,Greene,Li,Wang,Volpe和Rosenberg,2004.Glutathione Peroxidase–Catalase CooperativityIs Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature RatOligodendrocytes.J Neurosci24(1531–1540)。
细胞也合成抗氧化分子，并具有使其重复利用的机制。谷胱甘肽(GSH)是参与消除H2O2的抗氧化机构的主要蛋白质之一，谷胱甘肽与氧化形式GSSG及相关酶谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷氧还蛋白和乳醛还原酶/葡萄糖1-脱氢酶(NADPH/NADP+)一起起作用。使用细胞培养模型的各种研究都支持线粒体中的GSH所起的关键作用，如在细胞凋亡性细胞死亡中的保护作用。在细胞凋亡性、编程性细胞死亡中，线粒体GSH/GSSG的氧化刺激GSH耗尽，导致ROS增加，表明GSH在控制线粒体ROS生成中的作用。Dringen,Pawlowski和Hirrlinger,2005.PeroxideDetoxification by Brain Cells.J Neurosci Res79(157–165);Dringen,Gutterer和Hirrlinger,2000.Glutathione metabolism in brain.Metabolicinteraction between astrocytes and neurons in the defense against reactiveoxygen species.Eur J Biochem267(4912-4916)。
在消除过氧化氢的抗氧化机制中的另一种酶是过氧化氢酶。当需要清除高浓度的H2O2时，过氧化氢酶是一种特别相关的胞质酶。Baud,Greene,Li,Wang,Volpe&Rosenberg,2004.GlutathionePeroxidase–Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to HydrogenPeroxide by Mature Rat Oligodendrocytes.J Neurosci24(1531–1540)。
还被探明的是人类骨髓间充质干细胞控制使活性物种解毒和纠正蛋白质组和基因组的氧化性损害的主要酶的和非酶的机制，所述蛋白质组和基因组确保能有效地控制ROS。Valle-Prieto和Conget,2010.Human Mesenchymal Stem Cells efficiently manage oxidative stress.StemCell Dev19(1885-1893)。如果在体内保持该潜能，人类骨髓间充质干细胞也可有助于组织再生，抑制ROS-诱发的组织损伤。
用于修饰参与消除ROS的酶合成的一些成功的尝试描述了在抗坏血酸的存在下培养的人骨髓基质细胞表达较高水平的过氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽(Stolzing and Scutt,2006.Effect of reducedculture temperature on antioxidant defenses of mesenchymal stem cells.Free Radic Biol Med41(326-338)。而且，在论文Ebert,Ulmer,Zeck,Meissner-Weigl,Schneider,Stopper,Schupp,Kassem和Jacob,2006.Selenium supplementation restores the antioxidative capacity and preventscell damage in bone marrow stromal cells in vitro.Stem Cells24(1226-1235)中，作者描述了通过补充硒或降低温度调整细胞培养条件来上调骨髓基质细胞的基础抗氧化能力。Stolzing和Scutt(2006)公开了在这些骨髓基质细胞中温度降低不会影响它们的生存力，但是会增加它们的分化。另一方面，通过本发明的处理方法直接获得的干细胞，称为HC016的细胞，没有显示出分化的任何证据，保持其未分化表型及其生存力。
此外，Ebert等人，2006年证实了用100nM的亚硒酸钠对骨髓基质细胞的培养基补充硒唯一地增加细胞内硒-依赖性酶如谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和硫氧还蛋白还原酶(TrxRs)的活性。另一方面，HC016细胞保持其生存力、增殖能力和未分化表型，以及活化编码ROS解毒的关键硒-非依赖性酶的基因，所述硒-非依赖性酶如过氧化物歧化酶(SODs)和过氧化氢酶(Cat)，其对ROS解毒很重要。而且，HC016细胞提高了GSH的水平。
最后，用本发明描述的处理方法直接得到的HC016细胞相对于目前技术水准使用的干细胞显示出一系列优点，其使HC016细胞特别适于在氧化应激条件下起作用。这些优点主要是1)产生较多的解毒分子GSH的细胞内池，2)较高且增加的编码参与活性氧类消除的酶的基因的表达，3)新的细胞骨架结构，因此，朝向受损区域的迁移能力必然更高，和4)更高的与组织再生过程相关的生长因子的表达。
得自HC016细胞的这些作用增加了其细胞内和细胞外抗ROS防御，而不会对其生存力和分化状态产生任何修饰。
WO2010/150094描述了一种间充质干细胞在体外分化成脂肪细胞的方法及其作为细胞治疗的用途。所描述的方法包括在缺氧状态下培养那些细胞。
WO2007/030870提供了一种用于干细胞分化的方法，更具体而言，来自人胚胎的细胞(人类胚胎干细胞(hES))分化成心肌细胞和神经祖细胞的方法，其包括在不含血清的培养基中培养hES细胞，所述培养基还包含前列腺素或p38MAP激酶抑制分子。
因此，目前技术水准迫切需要产生用于获得具有改善的或增加的自身酶的和非酶的机制的间充质干细胞的方法，所述机制集中于消除活性氧类，因此，产生在氧化应激相关疾病的细胞治疗中可更有效的细胞。
发明目的
本发明涉及一种处理间充质干细胞的方法，以及这些预先处理的细胞在治疗由氧化应激引起的或与其相关的疾病中的用途。
本发明的干细胞可以得自不同的来源，其中包括脂肪组织、骨髓、脐带和/或胎盘，但是优选地，本发明是由源自人脂肪组织的间充质干细胞(ASC)产生的。
在本发明的一个方面，认为与氧化应激有关和由其引起的疾病或由于活性氧类介导的组分引起的退行性应激的病症是选自下述的那些：关节周炎、糖尿病、慢性肉芽肿疾病、动脉硬化、肺纤维化(慢性阻塞性肺病、COPD、特发性肺纤维化)、缺血/再灌注综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肠炎性疾病：溃疡性结肠炎和克隆氏病、成人呼吸窘迫综合征、中风、脊髓损伤、周围神经损伤、肌萎缩性脊髓侧索综合征、亨廷顿氏疾病、多发性硬化症、弗里德希氏共济失调、牙周炎、粘膜疾病、与炎症组分共存的疾病和损伤、急性和慢性溃疡及创伤。
这些病理中存在的氧化环境引起受损区域中炎性过程的维持和甚至加剧。该现象是损害组织再生的因素之一，由于产生大量的ROS引起组织再生损害不能得到恢复。用本发明的方法处理的间充质干细胞在上述病理中产生的氧化环境中获得了较高的存活能力。这一事实产生来自活细胞可利用的可溶性因子增加，其促进受损组织恢复。
因此，本发明的一个方面是间充质干细胞的处理方法，其包括从人供体获得和分离间充质干细胞，并在限定的处理培养基中培养这些细胞。
本发明的一个优选的方面是上述从脂肪组织获得的间充质干细胞的处理方法的应用。
本发明的还一个方面是一种用于间充质干细胞的功能修饰的方法，以促进其存活和提高其产生参与活性氧类解毒的分子的能力。
本发明的另一个方面涉及由本发明的处理方法获得的间充质干细胞，与未采用本发明的预处理方法处理的间充质干细胞相比，其具有较高且增加的参与活性氧类解毒的基因的表达，和/或较高的细胞内GSH水平和/或细胞骨架结构变化，和/或增加的其细胞迁移能力。
本发明的另一个方面涉及根据本发明处理的间充质干细胞作为在治疗由氧化应激引起的或与其相关的疾病的细胞治疗中的治疗组分/试剂的用途，所述间充质干细胞具有较高的细胞内GSH水平，更优选地，具有较多且增加的参与活性氧类消除的基因的表达，选自∶SOD1细胞质过氧化物歧化酶、SOD2线粒体过氧化物歧化酶2、SOD3细胞外过氧化物歧化酶3、Cat过氧化氢酶、GPx谷胱甘肽过氧化物酶和GR谷胱甘肽还原酶，更优选地，具有不同细胞骨架结构和较多的编码β-肌动蛋白以及生长因子IGF-1的基因的表达。
本发明还涉及本发明的间充质细胞施用于受损组织邻近的区域和/或损伤中心的用途。
附图说明
图1.通过MTT方法测量且受到氧化环境(100mM)应激的ASC，HC016(A)，HOG和本发明的方法处理的HOG(B)的增殖能力。可以观察到当受到氧化环境应激时，HC016细胞具有的细胞增殖显著增加。当对其它哺乳动物的细胞类型如HOG细胞应用相同处理时，不会出现该作用。星号指示在t检验中p<0,05(实施例3)。
图2.在ASC，HC016,HOG和本发明的方法处理的HOG中，细胞内活性氧类水平的动力学分析。该分析表明仅仅HC016细胞显著地降低细胞内ROS水平，主要在当其暴露于高浓度的氧化应激时。星号指示根据双向方差分析的统计学显著性差异(*,P<0,05;**,P<0,01)(实施例4)。
图3.在ASC和HC016细胞中总谷胱甘肽(GSH总)的细胞内水平(实施例5)。在非应激的对照条件下，该处理诱发HC016基础GSH水平比ASC提高10%。
图4A.在ASC和HC016细胞中参与活性氧类解毒的基因的表达水平(实施例6)。
图4B.在ASC和HC016细胞中参与活性氧类解毒的基因(SOD1、SOD2、SOD3、Cat、GR、GPx)的表达的定量。值表示为HC016/ASC的比例(实施例6)。
图5A.在ASC和HC016细胞中参与细胞骨架组成的基因(β-肌动蛋白)的表达水平(实施例7)。
图5B.在ASC和HC016细胞中参与细胞骨架组成的基因(β-肌动蛋白)的表达的定量(实施例7)。值表示为比例HC016/ASC(实施例7)。图5C.在ASC和HC016细胞中编码生长因子IGF-I的基因的表达水平(实施例7)。
图5D.在ASC和HC016细胞中编码生长因子IGF-I的基因的表达的定量(实施例7)。值表示为比例HC016/ASC(实施例7)。
图6.免疫染色中F-肌动蛋白的荧光显微镜图像。可以观察到相对于ASC，HC016细胞中存在的F-肌动蛋白及其在应力纤维中的分布增加，其意味着HC016的细胞骨架结构变化与其迁移和趋化能力较高有关(实施例8)。
图7.在氧化应激攻击之后神经谱系HOG细胞的生长速率，及应用ASC和HC016对该生长速率的影响。受氧化环境应激的HOG细胞与ASC和HC016一起的共培养提高了HOG细胞存活率。然后，在将HOG细胞暴露于氧化环境之后，仅与HC016共培养延缓该保护效应48小时。星号指示根据t-检验的显著统计学差异(p<0,05)(实施例9)。
图8.显示相对于ASC细胞而言，HC016细胞朝向遭受氧化应激攻击的细胞的显著较高迁移能力的代表性图和定量柱形图(实施例10)。图9.三个具有脊髓损伤的大鼠的实验组(非处理的大鼠、用ASC处理的大鼠和用HC016处理的大鼠)的BBB得分(Basso-Beattie-Bresnahan)的变化的表。
发明详述
在一个方面，本发明涉及一种处理间充质干细胞的方法，所述间充质干细胞优选地来自脂肪组织，指由成年动物的脂肪组织获得和/或分离而得的，更具体地来自动物来源，优选人类。该方法主要需要两个限定的步骤，第一步，获得和分离间充质干细胞，和第二步，细胞在包括氧化剂的限定的处理培养基中进行生长和特定处理一段时期。
ASC细胞的获取：
关于该步骤，所述方法包括首先获取和分离间充质干细胞。
间充质干细胞的来源可以选自：脂肪组织、骨髓、脐带和/或胎盘，优选地，本发明是源自人脂肪组织的间充质干细胞（ASC）。
因此，优选地，在本发明中，源自脂肪组织的间充质干细胞的部分是从处于麻醉下的健康人患者的脂肪组织中提取的。所述脂肪组织提取物是由患者在签署知情同意书之后捐献的。然后，将脂肪组织提取物用1x PBS洗涤，并在37℃下用I型胶原酶消化30分钟，接着离心，获得细胞团块。将该团块再悬浮在红细胞裂解缓冲液中，经由100μm尼龙网过滤提纯的细胞悬浮液，并再次离心。在再悬浮所述细胞之后，将这些细胞接种在培养瓶中，继续进行细胞集落扩增。
在本发明中使用的细胞集落扩增或继代培养方法包括从培养容器中分离细胞，用胰蛋白酶/EDTA溶液孵育，离心所收获的细胞悬浮液，测定细胞密度和生存力，并将这些细胞接种到新的细胞培养容器中。
在本发明中的细胞收获是基于现有技术中描述的方法，如下述出版物中指出的：Yoshimura,Shigeura,Matsumoto,Sato,Takaki,Aiba-Kojima,Sato,Inoue,Nagase,Koshima&Gonda,2006.Characterization ofFreshly Isolated and Cultured Cells Derived From the Fatty and FluidPortions of Liposuction Aspirates.J Cell Physiol208(64–76);Almeida,Campa,Alonso-Vale,Lima,Daud&Stocchero,2008.Fracción vascularestromal de tejido adiposo.Cir.plást.iberolatinoam.34(71-79);Wagner,Wein,Seckinger,Frankhauser,Wirkner,Krause,Blake,Schwager,Eckstein,Ansorge and Ho,2005.Comparative characteristics ofmesenchymal stem cells from human bone marrow,adipose tissue,andumbilical cord blood.Experimental Hematology33(1402–1416)。
细胞处理方法。HC016细胞的获取∶
一旦获得合适的细胞数量在300.000-2.000.000之间，对这些细胞进行如下处理：需要按照特定处理周期，使细胞接触定义浓度的氧化剂。
氧化剂为例如氧化物和/或过氧化物，其中包括过氧化氢(H2O2)、过氧化钙(CaO2)、过氧化镁(MgO2)、过氧化锌(ZnO2)、二氧化锰(MnO2)、过氧化铅(PbO2)和一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)、臭氧(O3)、过硼酸钠(NaBO3)、二氧化硒(SeO2)、氧化银(Ag2O)、铁盐比如氯化铁(FeCl3)、铜盐比如氢氧化铜(CuOH、Cu(OH)2)、过碳酸盐比如过碳酸钠(2Na2CO3)、高锰酸盐比如高锰酸钾(K2Mn2O8)、重铬酸盐比如重铬酸钾(K2Cr2O7)、次氯酸(HClO-)的锂盐、次氯酸钠盐和次氯酸钙盐、亚氯酸钠(NaClO2)、氯酸(HClO3)、氯酸钾(KClO3)、氢氧化铝(Al2O3)、与碳酸镁(MgCO3)共沉淀的氢氧化铝、三氧化二砷(As(OH)3)、过氧化苯甲酰((C6H5CO)2O2)、氢氧化钙(Ca(OH)2)、盐酸氯氮卓、铜酸(CuO)、铁氧化物、氧化镁(MgO)、二氧化镁、氢氧化镁(Mg(OH)2)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钠(NaOH)、氧化钛(TiO2)、氧化锌(ZnO)及其它氧化剂，优选属于活性氧类(ROS)组的过氧化氢(H2O2)，所述活性氧类是线粒体呼吸链的废产物和炎性过程的信号分子。H2O2增加高于某一耐受值会诱发细胞死亡。然而，本发明的处理方法包括以受控方式用H2O2培养细胞；这意味着具有受控的时期和方法及限定的浓度，其能够在直接由该处理得到的间充质干细胞中触发新的功能和特征。
更具体而言，在本发明中研究的处理方法包括按照限定的处理周期，在中等氧化环境中培养细胞。一般而言，所述处理方法包括在试验性容器中两个连续处理周期，间隔48-72小时，接着是24-48小时的第三个处理周期。
详细地，所述处理周期包括下述步骤∶
a)第一周期：将细胞接种在培养基容器中，并等待4至8小时的细胞适应期，以使细胞粘附和获得其典型的形态学。
b)加入其由DMEM加10%FBS和H2O2溶液（直到达到最终浓度的范围为0.01至0.05mM）组成的处理介质。
c)在37℃和5%CO2气氛的孵育箱内保持48-72小时。
d)第二周期∶通过用DMEM加10%FBS和H2O2溶液(直到达到最终浓度的范围为0,01至0,05mM)替代来更换所述处理介质。
e)在37℃和5%CO2气氛下，孵育这些细胞48-72小时。
f)第三周期∶通过用DMEM加10%FBS和H2O2溶液(直到达到最终浓度的范围为0.01至0.05mM)替代来更换所述处理介质。
g)在37℃和5%CO2气氛下，孵育这些细胞48-72小时。
在该处理周期之后，细胞的功能和形态学特征得到修饰。从此开始，缩写HC016指代这些细胞。
培养基或生长介质包括目前技术水准中常见的已知组分，因此，这些培养基含有总体积的85-95%的高浓度葡萄糖(DMEM,Invitrogen)，浓度为总体积的5-15%的胎牛血清(Biochrom)和浓度为总体积的1%的抗生素溶液PSA(Invitrogen)。
而且，在上述本发明的方法中使用的处理介质包括总体积的85-95%的高浓度葡萄糖(DMEM,Invitrogen)、浓度为总体积的5-15%的胎牛血清(Biochrom)、浓度为总体积的1%的抗生素溶液PSA(Invitrogen)和浓度为总体积的0.01至0.05mM的过氧化氢(H2O2)(Panreac)。
相对于没有用本发明方法处理的ASC表征HC016细胞作为本发明的处理方法的结果，与未用本发明的方法处理的ASC相比，本发明的HC016细胞已经获得和显示了较高且提高的参与活性氧类消除的所定义基因的表达，比如编码下述蛋白质的基因∶SOD1过氧化物歧化酶1细胞质蛋白质、SOD2过氧化物歧化酶2线粒体蛋白质、SOD3过氧化物歧化酶3细胞外蛋白质、GPx谷胱甘肽过氧化物酶、GR谷胱甘肽还原酶和Cat过氧化氢酶。
SOD1：过氧化物歧化酶1是一种包含铜(Cu)和锌(Zn)作为辅因子的二聚蛋白质。SOD1位于细胞的细胞质内，催化过氧化物(呼吸链和黄嘌呤氧化酶的产物)的歧化反应，经由下述反应产生氧气和过氧化氢：
·Cu-Zn(n+1)+-SOD+O2 -→Cu-Zn n+-SOD+O2
·Cu-Znn+-SOD+O2 -+2H+→Cu-Zn(n+1)+-SOD+H2O2
SOD2：过氧化物歧化酶2是一种包含锰(Mn)作为辅因子的四聚蛋白质。SOD2位于细胞的线粒体内，催化过氧化物(呼吸链和黄嘌呤氧化酶的产物)的歧化反应，经由下述反应，产生氧气和过氧化氢：
·Mn(n+1)+-SOD+O2 -→Mn n+-SOD+O2
·Mnn+-SOD+O2 -+2H+→Mn(n+1)+-SOD+H2O2
SOD3：过氧化物歧化酶3是包含铜(Cu)和锌(Zn)作为辅因子的均四聚物蛋白质。SOD3释放到细胞外介质中，其中其经由硫酸乙酰肝素蛋白多糖和I型胶原蛋白结合细胞外基质，以催化介质中存在的过氧化物的歧化反应，经由下述反应产生氧气和过氧化氢。
·Cu-Zn(n+1)+-SOD+O2 -→Cu-Zn n+-SOD+O2
·Cu-Znn+-SOD+O2 -+2H+→Cu-Zn(n+1)+-SOD+H2O2
Cat：过氧化氢酶是一种具有四个肽链和四个卟啉血红素基团(铁，Fe)的四聚物蛋白质，其作为氧化应激的防御中的关键酶存在于几乎所有需氧细胞的过氧化物酶体中。过氧化氢酶与过氧化氢反应，将其转化成水。尽管其反应机理没有被完全理解，但是已经按照下述反应描述了其活性。
·H2O2+Fe(III)-E→H2O+O=Fe(IV)-E(.+)
·H2O2+O=Fe(IV)-E(.+)→H2O+Fe(III)-E+O2
Chelikani,Fita&Loewen,2004.Diversity of structures and propertiesamong catalases.Cell Mol Life Sci61(192–208)。
GPx:谷胱甘肽过氧化物酶是高级脊椎动物中已知的小蛋白质的一种，其包含硒代半胱氨酸。GPx主要存在于细胞质中，通过催化H2O2结合还原的谷胱甘肽(GSH)分子参与到过氧化物歧化酶和单胺氧化酶所产生的过氧化氢的解毒。
GR:谷胱甘肽还原酶是一种均二聚黄素蛋白。GR属于I类吡啶核苷酸-二亚硫酸酯氧化还原酶家族。该酶参与抗氧剂防御的基本循环。其活性包括将氧化的谷胱甘肽(GSSG)还原为其巯基形式(GSH)，所述其巯基形式为抗氧剂防御中的关键分子。
已经相对于未处理的ASC细胞定量了参与ROS解毒的基因表达增加，证实HC016细胞呈现SOD1基因的表达增加至少30%、更优53%，SOD2基因的表达增加至少25%、更优37%，SOD3基因的表达增加至少50%、更优77%，和/或Cat基因的表达增加至少50%、更优78%。
定量HC016相对于ASC而言具有基因的更高表达的方法如下：按照在First Strand膜滤器市售试剂盒中包括和描述的方案，进行每个实验组的细胞裂解，mRNA萃取和提纯。按照PureLinkTMRNA微试剂盒中包括的试剂和方案，大量的mRNA充当采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)产生cDNA的模板。采用聚合酶链反应(PCR)处理对应量的每个实验组的cDNA，所述聚合酶链反应包括特定引物，该引物定位编码过氧化物歧化酶1、2和3(SOD1-3)、过氧化氢酶(Cat)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽还原酶(GR)的基因中的DNA片段。每个实验组的PCR产物通过电泳迁移，测定扩增片段的尺寸，并定量各个条带的强度。用定义的组成型基因磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的强度值，将得到的值标准化。
而且，已经证实相对于ASC细胞，HC016细胞具有的细胞内GSH的水平至少高8%，优选10%。用于定量相对于ASC而言HC016细胞中GSH的较高水平的方法为Tietze的酶法，如下所述∶实验组为两个独立批次的细胞，ASC和HC016。在处理之后，收获细胞，通过在裂解缓冲液孵育细胞萃取其蛋白质，按照BioRad DC蛋白分析试剂盒提供的方案和试剂定量上清液中的总蛋白质。在不同等分试样的上清液中，沉淀出蛋白质，并转移该上清液进行总GSH和GSSG的定量。在96孔板中，处理用于总GSH和GSSG分析的样品，一式三份。对于GSH测量，用谷胱甘肽还原酶孵育样品，此后，在2,5分钟期间每15秒测量在405nm的吸光度。对于GSSG测量，用2-乙烯基吡啶预处理提纯的样品蛋白质，随后用谷胱甘肽还原酶处理，最后在30分钟期间，每15秒测量在405nm的吸光度。
将吸光度值外推至如下产生的标准曲线：通过重复这些之前描述的步骤，但是使用已知的GSH浓度代替使用细胞蛋白质样品。值表示为nmol/mg的蛋白质。如下计算总谷胱甘肽∶GSH总=GSH还原的+2GSSG氧化的
另外，HC016细胞的特征在于与ASC相比，存在的细胞内ROS水平低于至少10%，优选11%，更优选15%。
选择定量相对于ASC而言HC016细胞内ROS水平较高的方法为基于DCFA探针的荧光定量：实验组包括四个独立的群，一个是ASC，第二个是HC016，第三个是完整的HOG细胞，第四个是用与由ASC产生HC016的相同处理培养的HOG。用PBS1x洗涤细胞，然后经30分钟加入2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFA)10μM。随后，洗除DCFA，加入新介质。然后，用氧化剂介质(向所述培养基中加入浓度梯度为0、0.1、0.25、0.5和1mM的H2O2)培养细胞，就在此后，以荧光计平板读数器，每5分钟测量细胞内ROS水平的变化，总共测量60分钟。图表表示为随时间(分钟)的任意荧光强度单位。
另外，根据本发明的方法处理的HC016细胞显示出较高的迁移能力。该性质确定了HC016可以更有效地进入受损的组织区域，并引发其营养作用，以保护受损细胞和影响不利环境的控制。通过在HC016的细胞骨架中出现的结构变化，以及在细胞扩增边缘有组织的微丝(β-肌动蛋白)的类型增加，确定相对于ASC而言该显著较高的迁移能力。这些细胞膜突出物是迁移期间细胞运动的物理基质。此时，β-肌动蛋白基因表达分析显示HC016相对于ASC增加59%(图5A-B)。而且，聚合的肌动蛋白或F-肌动蛋白免疫染色表明随着应力纤维(迁移事件的一个基本要素)的形成，与较高的运动能力有关的相关形态变化。图6显示排列在应力纤维中的F-肌动蛋白的免疫染色，其为细胞迁移过程中的关键方面之一(Mitchison等人,1996)。而且，仅仅利用博伊登(Boyden)室进行分析细胞迁移能力的实验(图8，实施例10)表明HC016细胞具有相对于ASC而言高30倍的迁移能力。
另外，相对于ASC，HC016细胞呈现类胰岛素生长因子-1(IGF-1)基因表达提高64%(图5C-D)。之前的研究已经表明IGF-1中间体与损伤后出现的再生过程相关。IGF-1是一种神经组织受损后非神经元细胞产生的刺激组织再生的有效神经营养因子。IGF-1促进神经元存活、轴突生长、神经细胞增殖、髓鞘形成和改善轴突-雪旺(Schwan)细胞的相互作用(Apel等人,2010)。而且，在其它试验性模型中，已经探究了IGF-1的局部应用，能够修复受损的骨骼肌而不会形成瘢痕组织和干细胞向受损区域的较高的募集(Spangenburg等人,2010)。因为这些理由，在HC016细胞中诱导的IGF-1可以促进ASC再生能力，如此其增强细胞增殖能力、受损组织细胞的功能恢复和干细胞向受损区域的募集，以有助于恢复过程。
用于分析相对于ASC的基因表达的方法如下：该比较分析需要包括ASC和HC016细胞的两个实验组。一旦处理方法已经完成，则收获各个细胞组，裂解，萃取RNA并提纯，处理以获得cDNA。进行包括特定引物的PCR反应，所述引物定位编码β-肌动蛋白和类胰岛素生长因子-1(IGF-1)的基因中的DNA片段。通过电泳迁移每个实验组的PCR产物，测定扩增片段的尺寸，并定量各个条带的强度。用定义的组成型基因GAPDH的强度值，将得到的值标准化。
该数据集表明产生HC016的处理方法诱导合成用于消除H2O2的和控制不利氧化环境所需的细胞内和细胞外分子机构的“池”。HC016细胞具有较高的迁移能力，能到达受损的组织区域，以及产生较高量的营养因子，该因子对受损组织细胞的再生过程和延长起存活发挥其作用。
HCO16细胞在治疗与氧化应激有关的或由其导致的疾病中的用途
如上讨论的，在上述部分中指出的HC016细胞的特征使其特别适用于治疗由氧化应激引起的疾病或由于活性氧类介导的组分演变的退化性病症。
一种影响中枢神经系统且参与氧化应激、导致由活性氧类介导的组分引起的退行性病变的病理，是脊髓损伤。
脊髓损伤是一种神经组织损伤，其中病原体没有参与，且既不是外部因素也不是遗传因素诱发的。在损伤的位点，创伤的直接后果是受影响区域的组织压迫、出血、水肿、缺氧和滋养(Lu,Liang,Chen,Chen,Hsu,Liliang,Lin&Cho,2004.Injury severity and cell deathmechanisms:Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinalcord ischemia-reperfusion in rats.Exp Neurol185:120–132;Fehlings&Tator,1995).The relationships among the severity of spinal cord injury,residual neurological function,axon counts and counts of retrogradelylabeled neurons after experimental spinal cord injury.Exp Neurol132:220–228)。这些生命现象诱导两种细胞防御机制：编程性细胞死亡或细胞凋亡(Yukawa,Lou,Fukui&Lenke,2002.Optimal treatment timingto attenuate neuronal apoptosis via Bcl-2gene transfer in vitro and in vivo.J Neurotrauma19:1091-1103)和天然免疫反应(Carpentier&Palmer,2009.Immune influence on adult neural stem cell regulation and function.Neuron64:79-92)，其扩展至未受损的周围区域，且在损伤之后组织缺血和炎症持续数周或者甚至数月，换言之，产生继发性损伤(Lu,Liang,Chen,Chen,Hsu,Liliang,Lin&Cho,2004.Injury severity and celldeath mechanisms:Effects of concomitant hypovolemic hypotension onspinal cord ischemia-reperfusion in rats.Exp Neurol185:120–132)。
这两类组织应答沿着脊髓扩展，影响最初的健康组织，这是因为神经组织获得的机制不足以响应抵抗其生理后果。所述扩展主要经由作为天然免疫反应特征的活性氧代谢物(MRO)进行，所述活性氧代谢物可引起氧化应激且根据其强度可诱导细胞凋亡(Liu,Liu,&Wen,1999.Elevation of hydrogen peroxide after spinal cord injury detected byusing the Fenton reaction.Free Rad Biol&Medicine27:478-482;Yukawa等人,2002)。其中，最大量的活性氧代谢物是过氧化氢(H2O2)，其扩散进入围绕神经细胞的细胞外环境，以继发性损伤形式扩散。H2O2与细胞的膜、蛋白质和DNA发生反应且将其降解(Braughler&Hall,1989.Central Nervous System trauma and stroke.I.Biochemicalconsiderations for oxygen radical formation and lipid peroxidation.FreeRadic Biol Med.6:289–301)，最终诱导其编程性细胞死亡或细胞凋亡(Yukawa等人,2002)。H2O2也是正常细胞的一种废产物，因此正常细胞针对该分子具有一些防御(Phillis,1994.A“radical”view of cerebralischemic injury.Prog Neurobiol42:441–448)。然而，在损伤之后产生的H2O2的水平高于生理耐受的水平(Hyslop,Zhang,Pearson&Phebus,1995.Measurement of striatal H2O2by microdialysis following globalforebrain ischemia and reperfusion in the rat:Correlation with the cytotoxicpotential of H2O2in vitro.Brain Res671:181-186)。在神经细胞中，少突胶质细胞-产生覆盖神经元轴突的髓鞘的细胞，更易受活性氧代谢物攻击，因为它们针对活性氧代谢物具有较少的防御，且包含使其转化成继发性损伤的靶点的分子(Dringen R,Pawlowski P&Hirrlinger J.2005.Peroxide detoxification by brain cells.J Neurosci Res79:157–165)。因此，除了损伤之后的最初细胞死亡之外，由于随后的H2O2引起的氧化性损伤导致神经纤维持续脱髓鞘，其减少了经由神经纤维进行的神经信号传导(Nashmi R&Fehlings MG.2001.Changes in axonalphysiology and morphology after chronic compressive injury of the ratthoracic spinal cord.Neuroscience104:235-251)。
其它疾病选自结节性动脉周围炎、糖尿病、慢性肉芽肿性疾病、动脉硬化、中风、肺纤维化(慢性阻塞性肺病、COPD、特发性肺纤维化)、局部缺血-再灌注综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、炎性肠病：溃疡性结肠炎和克隆氏病、成人的呼吸窘迫综合征、动脉粥样硬化、脊髓损伤、周围神经损伤、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、弗里德希氏共济失调、牙周炎、粘膜疾病、及伴随炎性成分的疾病和损伤、急性和慢性溃疡及创伤。
向受影响的区域施用HC016细胞降低了作为炎性过程期间免疫细胞活化的结果所引起的氧化应激的水平。
另外，向受影响的区域施用HC016细胞降低了作为内出血后活性氧代谢物产生的结果所升高的氧化应激的水平，改善了旁分泌细胞因子、白细胞介素、趋化因子、营养因子和生长因子的分泌，提高了其它哺乳动物细胞的存活和增殖，降低了靠近施用HC016细胞的哺乳动物细胞附近细胞外活性氧代谢物的水平，且降低了信号分子比如促炎症反应TNF-α、IL-1β等的细胞外水平。
此外，HC016细胞具有朝向细胞外H2O2损伤的细胞的显著较高的趋化能力，如本发明的实施例10中证实的。
使用HC016细胞包括在接近损伤部位的区域而不是在损伤中心施用预先处理的间充质细胞，以便限制组织损伤的扩散、损伤的范围和功能丧失。
损伤的组织经受重度压力，其使神经细胞和血管系统细胞的膜破裂。而且，作为损伤的结果，可由于动脉和静脉破裂而出血，细胞器、细胞质、囊和细胞膜的破裂，这些事实将导致组织坏死。这些事件是损伤所固有的。随后，如果这些事件得不到解决，坏死细胞释放的分子与免疫系统细胞所释放的其它分子一起经由信号分子比如H2O2使所述损伤扩展至损伤邻近区域。应用该基于间充质细胞的治疗目的是减少组织损伤的扩散或使其最小化。因此，细胞治疗优选地应用在损伤中心的邻近区域。
在本发明的另一个方面，受处理的细胞将使用施用途径来应用，所述施用途径能够使其直接到达损伤中心，以便代谢该区域的活性氧类、降低氧化应激和控制炎性状态，从而避免该区域中大量细胞死亡的情况。
施用途径可以是任何非肠道途径(比如动脉内、静脉内、淋巴内、椎管内、硬膜外、髓内)、皮下、肌内、腹膜内、透皮(经皮)、关节内、气管内、肺泡内、鞘内、眼内、结膜、心内、鼻内、阴道、尿道、皮肤、直肠、舌下、口服、经口粘膜。为了实施这些应用，根据施用途径，将通过本发明的方法获得的细胞配制在本领域技术人员已知的合适可药用载体中。
其中包括提供溶液的剂型，所述溶液中除了包括细胞HC016之外，还包括林格氏乳酸盐溶液、人白蛋白(CSL-Behring)等，其配置在无菌且无热原的玻璃小瓶(Sword Scientific)中施用。
类似地，HC016细胞可以并入用于产生细胞和组织工程治疗的天然来源和/或合成的生物材料中，所述生物材料比如水凝胶、泡沫和聚合材料、复合物、磷酸钙衍生物和金属材料，其能够更好地处理损伤部位的细胞，且提高细胞的存活和功能，视情况而定。
在将HC016细胞施用至哺乳动物之后，间充质细胞向损伤部位迁移，其中它们活化邻近于注射部位的细胞的增殖。优选地，这些细胞具有与其中已经应用注射剂的邻近软组织相同的表型，并且为前体细胞。甚至更优选地，所述细胞表型与邻近软组织细胞和前体细胞的表型匹配。
在本发明的另一个方面，施用的间充质HC016细胞保留在组织中。此外，患者组织中施用的间充质细胞的存在不会诱导针对施用的间充质细胞的免疫应答。
实施例
实施例1.从脂肪组织获得间充质细胞(ASC)
来自脂肪组织的间充质干细胞是按照Yoshimura等人,2006,Almeida等人,2008,Wagner等人,2005，描述的方法，从人类组织中分离的。
来自脂肪的间充质干细胞的部分是从麻醉下的健康患者的脂肪组织获得。将该脂肪组织用PBS1x洗涤，在37℃下用I型胶原酶消化30分钟，然后离心，得到细胞团块。将该团块再悬浮在红细胞裂解缓冲液中，使提纯的细胞悬浮液穿过100μm过滤器，并再次离心。在使所述细胞再悬浮之后，将其接种在培养基中进行细胞扩增。
在37℃和5%CO2的孵育箱中，在由DMEM(Invitrogen)与10%胎牛血清(Biochrom)和1%抗生素-抗真菌的PSA(Invitrogen)组成的生长介质中培养所述细胞5天的时间，作为原代培养物。
连续地，当获得半融合时细胞扩增。为此，使用0.05%胰蛋白酶/EDTA的溶液从培养物表面分离细胞，离心，并再悬浮在新鲜的介质中。在获得的细胞悬浮液中测定细胞密度和生存力，并接种在新鲜的细胞培养基表面。
实施例2.细胞ASC接受本发明的处理∶获得细胞HC016
将350,000个继代培养的ASC细胞接种在具有5ml生长介质的T25培养瓶中，所述生长介质具有下述组成：DMEM(Invitrogen)与10%胎牛血清(Biochrom)和1%PSA抗生素-抗真菌的(Invitrogen)，并且在37℃和5%CO2下孵育，直到其粘附。
第一周期∶加入包含下述组成的处理介质∶DMEM(Invitrogel)与10%胎牛血清(Biochrom)、1%抗生素-抗真菌的PSA(Invitrogen)和0.01%H2O2(Panreac)。将这些细胞在该介质中孵育48小时。
第二周期：在48小时之后，获得细胞，并再将350,000个细胞接种在第二个T25培养瓶中，在37℃和5%CO2下孵育4小时，直到其粘附。连续地，加入处理介质，并孵育细胞48小时。
第三周期：在48小时之后，获得细胞，并再将350,000个细胞接种在第二个T25培养瓶中，在37℃和5%CO2下孵育4小时，直到其粘附。连续地，加入处理培养基，并孵育细胞48小时。
在48小时之后，ASC处理的细胞重命名为HC016。
实施例3.HC016细胞相对于ASC的细胞增殖的比较分析
在下述四个试验组中进行细胞增殖的分析：ASC、HC016、完整HOG细胞和用产生HC016的本发明的处理培养的HOG细胞。
HOG细胞是来自少突神经胶质瘤的人类细胞，其被认为是神经谱系的试验性少突神经胶质模型。培养未分化的HOG细胞，其具有增殖能力和少突神经胶质的遗传背景。
按照实施例1中定义和描述的方法和生长介质培养ASC，产生用于该实验的细胞群。根据实施例2产生一批相同数量的HC016细胞。分别通过根据实施例1和实施例2用于ASC和HC016的方法产生HOG细胞群。
一旦制备了四个细胞群，将细胞接种在具有生长介质的96孔板中，直到它们粘附到孔上。然后，使细胞在暴露于0.1mM H2O2的氧化环境中生长。在不同的时间：0、24、48和72小时，按照CellProliferation MTT方法的方案和试剂测量增殖。根据试剂盒的制造商，该试验产生细胞增殖的比色测定，因此，分析并比较四个细胞类型的该参数。
附图以随时间(小时)的任意荧光强度单位表示。
结果
在氧化刺激之后72小时，HC016的增殖能力比对照ASC群高1.23倍(提高23%)(t检验p<0.05；n=3个样品)(图1A)。其它人类细胞HOG少突胶质细胞不具有该效果(图1B)。本发明的处理在ASC中有效，但是在其它细胞类型比如HOG少突胶质细胞中无效。
实施例4.HC016细胞中细胞内活性氧类的水平
在四个试验细胞组中进行细胞内活性氧类水平的分析：ASC、HC016、完整的HOG细胞和用产生HC016的本发明的处理培养的HOG细胞。
一旦制备了四个细胞群，将细胞接种在具有生长介质的各孔板中，直到它们粘附孔。然后，用1x PBS简单地洗涤细胞，然后用含有探针2',7'-二氯二氢荧光素双醋酸盐(DCFA)10μM的100μl的1xPBS代替所述PBS，并孵育细胞30分钟。接着，除去DCFA，加入新鲜的介质。然后，在包含不同浓度∶0、0.1、0.25、0.5和1mM的H2O2的介质中培养所述细胞。在荧光计平板读数器上，每5分钟测量活性氧代谢物水平的时间过程，总共测量60分钟。激发/发射的波长范围为485/538nm。
附图以随时间(分钟)的任意荧光强度单位表示。
结果
在暴露于梯度的H2O2，含有1mM和0.5mM的H2O2，之后55分钟，相对于ASC，HC016细胞包含显著较低水平的细胞内活性氧代谢物，(低11%)，双向方差分析检验P<0.031和，(低15%)，双向方差分析检验(P<0.039，分别地)(图2)。由ASC产生HC016的处理并没有在其它哺乳动物细胞如HOG少突神经胶质的细胞中诱导相同的反应(图2)。另外，在HC016细胞中存在较低的细胞内ROS水平，间接地表明，也降低了ROS分子的细胞外水平，因此HC016细胞具有更大的从环境除去过氧化氢的能力，使得在应用比如细胞治疗的部位细胞具有较高的H2O2解毒能力。
实施例5.细胞内总谷胱甘肽(GSH)的水平
实验组包括两个单独批次的ASC和HC016。采用上述的方法和培养基培养ASC。使用所描述的方法从人脂肪组织萃取和分离ASC，并在生长介质中继代培养，直到获得用于该实验所需的细胞群。而且，用本发明的方法以相同量的细胞产生一批HC016细胞。
在细胞处理步骤之后，通过用0.05胰蛋白酶/EDTA消化来收集细胞，通过用裂解缓冲液(磷酸钠缓冲液中的蛋白酶抑制剂，EDTA和Triton X-100，pH7.5)孵育所述细胞来萃取蛋白质，按照BioRad DC蛋白质分析试剂盒提供的方案和试剂定量上清液中的总蛋白质。
在另一等分试样的上清液中，用5%的磺基水杨酸沉淀蛋白质，并离心，将溶于上清液中少量的肽转移用于总GSH和GSSG分析。
在96-孔板中处理用于总GSH和GSSG分析的样品，一式三份。对于GSH测量，样品包含5%提纯的蛋白质样品、45%的蒸馏水和50%的反应缓冲液(在0.1M磷酸钠缓冲液中的0.2M EDTA、DTNB1.2mg/100μl、3.6mg NADPH和4.5单位的谷胱甘肽还原酶，pH7.5)。然后，在2.5分钟期间，每15秒测量在405nm的吸光度。对于GSSG测量，用2-乙烯基吡啶以比例96.3%/3.7%(蛋白质/试剂)预处理提纯的蛋白质样品，并在4℃孵育1小时。接着，制备包含10%的预处理样品、40%蒸馏水和50%的反应缓冲液(在0.1M的磷酸钠缓冲液中0.2M EDTA、DTNB1.2mg100μl、3.6mg NADPH和4.5单位的谷胱甘肽还原酶，pH7.5)的分析用样品。然后，在30分钟期间，每15秒测量在405nm的吸光度。
将吸光度值外推至通过用已知的GSH浓度重复同样的步骤产生的标准直线拟合。值表示为蛋白质的nmol/mg。总GSH计算为GSH+2GSSG。
结果
相对于ASC，HC016细胞显示出较高的总GSH的基础含量(图3)(高10%)。在HC016细胞中，这些较高水平的细胞内总GSH的存在也证实这些细胞对毒性剂的解毒能力较高，赋予对环境应激或细胞代谢活动增加的较高抗性。
实施例6.参与代谢物活性物种解毒的基因的表达水平
该比较分析需要两个实验组：包括ASC和HC016细胞。用上述的方法和培养基培养常规ASC，获得该实验所需要的细胞群。应用实施例2中描述的方法产生一批类似细胞数量的HC016。
一旦完成处理过程，通过胰蛋白酶/EDTA消化从细胞培养容器中收获各个细胞组。裂解细胞，分别萃取每个实验组的全部mRNA，并使用市售可获得的保留细胞膜片段和蛋白质的膜滤器系统提纯。按照市售试剂盒(Pure LinkTM RNA Micro Kit;Invitrogen;Ref.911811)中包括的确定方案和试剂，通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)将洗脱的mRNA转化为cDNA。将相应体积的每个实验组获得的cDNA混合，体积和浓度适于进行包括专门设计的引物序列的聚合酶链反应(PCR)，所述引物序列结合定位于以下基因的外显子区域的特异性cDNA片段，过氧化物歧化酶1、2和3、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的基因。通过电泳技术(在4%琼脂糖的1xTAE缓冲液中)加大量定义浓度的市售DNA染色剂(SYBR Safe DN凝胶染色剂；Invitrogen；S33102)，使每个实验组的PCR产物在琼脂糖凝胶中迁移。用UV光透照凝胶，通过数字图像系统获得光密度，以测量各个迁移带的光密度。将每个实验组和各个所选基因的各个条带的光密度值减去本底，并标准化为定义的组成型基因表达的光密度值。
结果
参与HC016细胞的氧化代谢的基因的表达水平与ASC的不同(图4A)。不同基因表达定量表明与ASC相比，HC016细胞呈现SOD1基因增加53%、SOD2基因增加37%、SOD3增加77%、Cat基因增加78%、GR基因增加18%和GPx基因增加6%(图4B)。这些结果使我们得出结论：相对于ASC，HC016细胞增强了细胞内和细胞外抗氧剂的防御(图4A)。
实施例7.参与细胞骨架和生长因子分泌的基因和蛋白质的表达水 平
该比较分析需要两个实验组：包括常规ASC，将其用上述方法和培养基进行培养以获得该实验所需要的细胞群，和一批类似细胞数量的HC016，其由实施例2中描述的方法产生。如实施例6，当完成处理过程时，通过胰蛋白酶/EDTA消化收获各个细胞组，裂解细胞，分别萃取全部mRNA，提纯，并将mRNA转化为cDNA。用包括专门设计的引物序列的的cDNA进行PCR，所述引物序列结合定位在β-肌动蛋白和IGF-1的基因的外显子区域的特异性cDNA片段。如实施例6，通过电泳技术，使每个实验组的PCR产物在琼脂糖凝胶中迁移。测量各个迁移带的光密度，并将其值减去本底，并标准化为定义的组成型基因GADPH表达的光密度值。
结果
当与ASC相比时，基因的表达水平与HC016细胞中细胞骨架的组分和生长因子有关(图5A和C)。不同基因表达的定量表明，与ASC相比，HC016细胞呈现β-肌动蛋白基因增加59%(图5B)，IGF-I基因增加64%(图5D)。
实施例8.细胞骨架分子的组成和排列
该比较分析需要两个实验组：也包括常规ASC，将其用上述方法和介质进行培养以获得该实验所需要的细胞群，和一批类似细胞数量的HC016，其由实施例2中描述的方法产生。
使用上述介质和方法，将两个群的细胞都接种在24-孔板上。一旦细胞粘附，除去介质，并用PBS1x简单洗涤。然后，将细胞用在PBS1x中的4%甲醛固定12分钟，在4℃下用在PBS1x中的0.1%的Triton X-100透化处理10分钟，再次在PBS1x中洗涤，并在室温下（≈23℃）用在PBS1x中的100μg/ml的Phalloidin-FITC(Sigma-Aldrich；Ref.P5282)孵育1小时。然后，用PBS1x充分洗涤细胞，用Hoescht33258(Invitrogen；Ref.H1398)染色细胞核，最后用Fluoromont-G薄层(Southern Biotech;Ref.010001)盖住，在荧光显微镜下视检。
结果
HC016细胞的细胞骨架比ASC细胞具有更多的F-肌纤蛋白丝且更厚，并将其在应力纤维中被组织。在显微镜下ASC和HC016细胞的观察结果定性地显示出HC016细胞比ASC具有更多的F-肌纤蛋白丝且更厚(图6)，其得到更坚固的细胞骨架，且更易于准备可能的结构重建。实施例7定量地显示出编码F-肌动蛋白和β-肌动蛋白单体的基因的表达(图5A-B)。这两个结果都表明F-肌动蛋白的合成增加，后一结果作用于所述细胞的细胞骨架。
实施例9.HC016细胞对神经谱系细胞的保护能力
实验组包括在正常培养过程中没有任何修饰的对照少突神经胶质HOG细胞，在氧化剂环境中培养的HOG细胞，在氧化剂环境中ASC与HOG细胞的共培养物，和在氧化剂环境中HC016细胞与HOG细胞的共培养物。
HOG细胞是人类少突神经胶质瘤细胞，其被认为是神经谱系的试验性少突神经胶质的模型。HOG细胞是被培养的未分化，具有增殖能力和少突神经胶质的遗传背景。
用实施例1和2中描述的方法产生具有类似细胞数量的ASC和HC016细胞的群。在实验当天，通过0,05的胰蛋白酶/EDTA消化收获细胞，之后加入基于在24-孔板中插入的博伊登室(插入转膜腔(transwell chamber))的体外共培养系统中，避免两个细胞群之间的物理接触。
在试验当天，将少突胶质细胞铺板，粘附至24-孔板的底部，通过向培养基中加入0.5ml的0.5mM H2O2在氧化环境中培养1小时。在毒性攻击之后，将培养基用新鲜的培养基代替，并在37℃下由包含10%胎牛血清和抗生素的DMEM组成的培养基中培养。
在接下来的步骤中，在共培养情况下，将ASC或HC016细胞接种在对应于如上说明的实验组的博伊登室(插入转膜腔)中。
直到24和48小时，通过台盼蓝排除法定量少突神经胶质的生存力。
如下计算活细胞的生长速率(GR)：%活细胞-%死细胞。如下计算氧化的HOG相对于正常HOG的生长速率∶GR氧化的HOG/GR对照的HOG
将得到的值相对于氧化的HOG标准化，并在柱形图中以百分数表示。
结果
在对HOG细胞氧化刺激48小时之后，将所述细胞与HC016细胞共培养，其具有氧化的HOG的标准化的生长速率相对于与ASC共培养的HOG细胞的高21%(图7)。虽然在24小时，两个细胞类型均以相同的方式促进氧化的HOG的生存力，在中期，HC016细胞具有对氧化的HOG更持久的作用。为此，这些细胞作为体外细胞治疗的应用相对于常规ASC治疗存在更多益处，因为HC016细胞能够随时间推移改善和增加所述作用，与ASC相关，对如在本说明书所述疾病的组织损伤中出现的应力下的其它细胞类型具有作用。
实施例10.HC016细胞朝向炎性/氧化应激信号细胞的迁移能力
实验组包括在正常培养过程中没有任何修饰的对照少突神经胶质细胞，在氧化剂环境中培养的HOG细胞，在氧化剂环境中培养的ASC与少突神经胶质细胞的共培养物，和在氧化剂环境中培养的HC016细胞与少突神经胶质细胞的共培养物。
为了分析ASC和HC016细胞的迁移能力，用增殖和生存力对氧化应激条件敏感的试验哺乳动物细胞(少突神经胶质细胞)产生氧化应激模型。所述氧化应激模型包括少突神经胶质HOG细胞，其铺板并粘附至24-孔板的底部，通过向培养基中加入0,5ml的0,5mM H2O2在氧化环境中培养1小时。与毒性攻击之后，将培养基用新鲜的培养基代替，并与37℃下由包含10%胎牛血清和抗生素的DMEM组成的培养基中培养。
在接下来的步骤中，在共培养情况下，将ASC或HC016细胞接种在对应于如上说明的实验组的博伊登室(插入转膜腔)中。
直到24、48和72小时的时期，将转膜插入物在1x中洗涤，并用在PBS1x中的4%甲醛固定12分钟。用Q-tip棉签擦除转膜的上表面的细胞，在室温下，将其余细胞用0.1%的甲酚紫溶液染色。然后，在PBS1x中充分洗涤，最后从膜切下，平面固定在载玻片上，用DPX封固剂介质(Sigma-Aldrich；Ref.44581)的薄层盖住，并在显微镜下视检。在显微镜下观察所述膜，获得各个位置的代表性图像，对于每个实验组直接计数每一区域的细胞数。
定量表示为每mm2的细胞迁移数。
结果
我们分析了总共10个区域，各自0.57mm2(图8)，总共5.7mm2。在该区域中，在48和72小时，HC016细胞具有朝向氧化应激损伤细胞的区域的迁移能力为相对于ASC高32.75倍(3,275%)和20.61倍(2061%)(图8)。总之，相对于ASC，HC016细胞处理产生朝向细胞外H2O2损伤的HOG细胞显著更强和较高的趋化能力。可施加于应用H2O2后的HOG细胞的趋化作用可能与现象比如氧化应激和活性氧代谢物释放后出现的炎性组分的诱导相关。
实施例11.HC016细胞药物组合物的制备
根据产生用于动物模型中使用的细胞治疗医学产品的药物制剂制备HC016细胞，并测定其功效。
因此，一旦进行处理以从ASC获得HC016细胞，如实施例2中所述的，则将细胞配置在无热原玻璃小瓶中。
为此目的，通过应用0.05%胰蛋白酶-EDTA的溶液从培养瓶分离出HC016细胞，加入FBS(Biochrom)中和酶活性，并以400g进行离心，获得细胞悬浮液。除去上清液，将细胞团块再悬浮在盐水(Grifols)中，进行新的离心以除去任何痕量的上述溶液。弃去上清液，将细胞再悬浮在可注射的溶液(林格氏乳酸盐溶液95%(Grifols)和5%人白蛋白(CSL-Behring))中。我们使用血细胞计数器进行细胞计数和生存力分析，并将细胞溶液调整至浓度为200,000个细胞/μl。
用于在动物模型中立体定位注射的药物制剂由下述组成：50μl在95%的林格氏乳酸盐溶液(Grifols)和5%人白蛋白(CSL-Behring)中浓度为200,000个cells/μl的HC016活细胞，放置于无菌且无热原的玻璃小瓶(Sword Scientific)中。
实施例12.基于在脊髓损伤动物模型中应用HC016细胞的细胞治 疗的保护和/或功能性运动康复的能力
实验组包括三组10只体重250-300克的成年Sprague-Dawley大鼠。在用异氟烷3-4%的全身麻醉下，对这些动物进行胸廓水平的椎板切除术，如此暴露脊髓。在背侧脊髓上，通过用由一组参数比如距离和负载在已知直径的金属塞上的重量校准和定义的挫伤来应用中度脊髓损伤。第一组10只动物接受损伤，根本没有治疗。第二组10只动物接受损伤且用基于ASC的细胞治疗处理。第三组10只动物接受损伤且用基于HC016的细胞治疗处理。在损伤之后48小时，通过在损伤上下脊柱水平的6个点立体定位注射应用细胞治疗ASC和HC016。每次注射包括1ml包含200,000个细胞的盐水，使每只动物的总剂量为1,200,000个细胞。大鼠被全时监控在动物设备中，随意获取饮食。在开放场地的探索性运动1、2、3、4、6和8周之后，通过功能试验测定各组中保护和/或功能的运动康复的能力。该试验被称为Basso-Beattie-Bresnahan(BBB得分)，是一种21分且提供短期、中期和长期康复的半定量测量的可靠且灵敏的方法(Basso,Beattie和Bresnahan,1995.A sensitive and reliable locomotor rating scale for openfield testing in rats.J Neurotrauma12,1-21)。
定量表示为每次探索时每个实验组的BBB量表值的统计学意义。
结果
在BBB试验中，在脊髓损伤之后应用基于HC016细胞的治疗促进了测试的运动技能的康复。根据该测试的量表，所得值表明在所检查的所有时间：损伤后1、2、3、4、6和8周，该康复高于基于ASC的常规治疗至少一个点(图9)。康复的进展表明HC016细胞治疗缩短了获得最佳得分的时间，采用HC016细胞在第八周获得最佳得分。

Claims (16)

1.一种处理间充质干细胞的方法，其包括获得和分离间充质干细胞，并在包括氧化剂的处理介质中培养所述细胞，其特征在于所述在处理介质中培养所述细胞包括下述步骤∶
a)第一周期∶将细胞接种在介质表面，并且使该细胞进行4至8小时的处理时间，包括端值，以粘附和获得其典型的形态学；
b)加入处理介质，直到最终H2O2浓度达到0,01-0,05mM；
c)在37℃和5％CO2气氛的孵育箱内保持48-72小时；
d)第二周期∶更新所述处理介质，直到最终H2O2浓度再次达到0,01-0,05mM；
e)在37℃与5％CO2下，孵育这些细胞48-72小时；
f)第三周期∶通过再次应用所述介质更新所述处理介质，直到最终H2O2浓度再一次达到0,01-0,05mM；
g)在37℃与5％CO2下，孵育这些细胞24-48小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述间充质干细胞是从脂肪组织、骨髓、脐带和/或胎盘分离出来的。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述间充质干细胞是从人类脂肪组织分离出来的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤b)、d)和f)中使用的处理介质包括85-95％的常规细胞介质、5-15％的胎牛血清、0.5-5％的抗生素溶液PSA和0.01-0.05mM的过氧化氢。
5.根据权利要求1所述的方法直接获得的间充质干细胞，其特征在于通过PCR方法测量，相对于未处理的ASC，所述细胞呈现SOD1基因表达增加至少30％。
6.根据权利要求5所述的间充质干细胞，其特征在于通过PCR方法测量，相对于未处理的ASC，所述细胞呈现SOD2基因表达增加至少25％。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞，其特征在于通过PCR方法测量，相对于未处理的ASC，所述细胞呈现SOD3基因表达增加至少50％。
8.根据权利要求7所述的间充质干细胞，其特征在于通过PCR方法测量，相对于未处理的ASC，所述细胞呈现Cat基因表达增加至少50％。
9.根据权利要求8所述的间充质干细胞，其特征在于通过Tietze酶法测量，相对于未处理的ASC，所述细胞呈现细胞内GSH增加至少8％。
10.根据权利要求9所述的间充质干细胞，其特征在于通过采用DCFA探针的荧光定量法测量，相对于未处理的ASC，所述细胞呈现细胞内活性氧代谢物的水平降低至少10％。
11.根据权利要求10所述的间充质干细胞，其特征在于通过PCR方法测量，相对于未处理的ASC，所述细胞呈现β-肌动蛋白增加至少40％。
12.根据权利要求11所述的间充质干细胞，其特征在于通过PCR方法测量，相对于未处理的ASC，所述细胞呈现IGF-1增加至少40％。
13.根据权利要求5-12所述的细胞在制备用于治疗与氧化应激相关的或由其引起的疾病和/或由活性氧类-介导的化合物引起的退行性进展病症的药物中的用途。
14.根据权利要求13所述的所述细胞的用途，用于治疗选自下述的疾病：结节性动脉周围炎、糖尿病、慢性肉芽肿性疾病、动脉硬化、中风、肺纤维化、缺血再灌注综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、炎性肠病、成人呼吸窘迫综合征、脊髓损伤、周围神经损伤、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、弗里德希氏共济失调、牙周炎、粘膜疾病及伴随炎性成分的疾病和损伤、急性和慢性溃疡、创伤。
15.根据权利要求13所述的所述细胞的用途，用于治疗选自下述的疾病：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、克隆病和动脉粥样硬化。
16.根据权利要求14所述的所述细胞的用途，用于治疗慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化。
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