WO2013004859A1

WO2013004859A1 - Método de tratamiento de celulas madre mesenquimales y su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas a estrés oxidativo

Info

Publication number: WO2013004859A1
Application number: PCT/ES2011/070489
Authority: WO
Inventors: María Begoña CASTRO; Javier DÍEZ GARCÍA
Original assignee: Histocell S.L.
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2013-01-10
Also published as: CN103687940A; PT2730650T; CA2839106A1; BR112013032659B1; JP2014520521A; KR101811481B1; MX2013014307A; US20140154221A1; MX342200B; DK2730650T3; EP2730650A1; ES2620258T3; JP5908582B2; US9080153B2; EP2730650B1; CA2839106C; BR112013032659A2; AU2011372711A1; KR20140148284A; AU2011372711B2

Abstract

La presente invención se refiere de una parte a un método de tratamiento de células madre mesenquimales, preferentemente de origen adiposo, que comprende fundamentalmente dos etapas, la obtención y aislamiento de células mesenquimales, y en segundo lugar, una etapa de crecimiento y tratamiento específico de las células en un medio de condicionamiento o tratamiento con un agente oxidante. La invención comprende también las células obtenidas de forma directa a través del método y su uso en el tratamiento de enfermedades causadas o asociadas a estrés oxidativo.

Description

MÉTODO DE TRATAMIENTO DE CELULAS MADRE MESENQUIMALES Y SU USO EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS A ESTRÉS OXIDATIVO

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método de tratamiento de células mesenquimales, células obtenidas de forma directa a través del método y su uso en el tratamiento de enfermedades causadas o asociadas a estrés oxidativo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El potencial de las células madre reside en su capacidad para diferenciarse en diferentes tipos celulares y pasar a formar parte de tejidos y órganos. Otro aspecto beneficioso de las células madre es su secreción paracrina de citocinas, interleucinas, factores tróficos y factores de crecimiento. La investigación y los ensayos clínicos actuales están siendo diseñados para determinar el efecto terapéutico de las células madre en diversas patologías, y hay una demanda creciente de terapias basadas en células madre.

Por otra parte, algunas enfermedades degenerativas de los sistemas respiratorio, cardiovascular, inmune, endocrino, sistema nervioso central y periférico, lesión medular, isquemia/reperfusión y enfermedades desmielinizantes, tienen un componente inflamatorio mediado por metabolitos reactivos del oxígeno (MROs) denominado estrés oxidativo. Las especies reactivas del oxígeno, principalmente, el radical anión superóxido (0₂ ^~) y su producto de dismutación H₂0₂, son subproductos de desecho naturales generados en la cadena respiratoria que tiene lugar en las mitocondrias de las células, un fenómeno imprescindible para la vida de la célula debido a su función en la generación de ATP. Por lo tanto, las mitocondrias son los compartimentos de las células de mamífero más activos en procesos de reducción-oxidación (red-ox), realizando más del 90% de la transferencia de electrones con el 0₂ como receptor terminal de electrones. La mayoría de la transferencia de electrones ocurre a través de un circuito central de red-ox que emplea la energía disponible en la oxidación de varios sustratos metabólicos (como piruvato y ácidos grasos) para generar ATP. La regulación de estos procesos es fundamental para la actividad celular ya que las células necesitan generar ATP al mismo tiempo que mantienen una homeostasis apropiada en términos de suministro de aminoácidos no esenciales, eliminación de exceso de aminoácidos, aporte de glucosa y procesamiento de precursores energéticos para un suministro de energía a largo plazo en caso de necesidad. Parte de esta regulación parece ocurrir junto con una generación continua de bajos niveles de MROs y sensores moleculares. Las rutas metabólicas asociadas a esta regulación, aunque están poco definidas, sí se conoce que requieren un ambiente red-ox definido.

En condiciones patológicas de estrés oxidativo excesivo, el colapso del potencial de generación de ATP en las mitocondrias es simultáneo junto con un aumento transitorio en la generación de MROs a través de cadena respiratoria mitocondrial resultando en la liberación de MROs hacia el citosol. Este fenómeno puede ocasionar una liberación de MROs inducido por MROs en las mitocondrias adyacentes. Por tanto, aunque la generación de niveles bajos de MROs es un proceso normal en la mitocondria, la interrupción del flujo de electrones en la cadena respiratoria con una generación excesiva de MROs puede concluir en la senescencia, apoptosis y muerte celular. Go and Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273-1290); Zorov, Juhaszova and Sollott. 2006. Mitochondrial ROS-induced ROS reléase: an update and review. Biochim Biophys Acta 1757 (509-517).

De hecho, estos procesos están, directamente implicados en enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo mitocondrial como la enfermedad del Parkinson, la ataxia de Friedrich, la enfermedad de Huntington y la diabetes. Go y Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273- 1290); Dringen, Gutterer y Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916); Chinta y Andersen, 2008. Redox imbalance in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1362-1367); Cohén, 2000. Oxidative stress, mitochondrial respiration, and Parkinson's disease. Ann N Y Acad Sci 899 (1 12-120); Lodi, Tonon, Calabrese y Schapira, 2006. Friedreich's ataxia: from disease mechanisms to therapeutic interventions. Antioxid Redox Signal 8 (438^143); McGill y Beal, 2006. PGC-1 alpha, a new therapeutic target in Huntington's disease? Cell 127 (465^168); Donath, Ehses, Maedler, Schumann, Ellingsgaard, Eppler y Reinecke, 2005. Mechanisms of beta-cell death in type 2 diabetes. Diabetes 54 (Suppl 2) (S108- S1 13). Los peróxidos, entre ellos el peróxido de hidrógeno (H₂0₂), son algunos de los MROs más reactivos ocasionando estrés oxidativo. El H₂0₂ se forma continuamente a través de diferentes enzimas como superóxido dismutasa, glucosa oxidasa y monoamino oxidasa, y debe ser degradado para prevenir el daño oxidativo. La causa más admitida del efecto citotóxico del H₂0₂ es la generación de radicales hidroxilo a partir de reacciones catalizadas por el hierro que dañan el ADN, proteínas y lípidos de la membrana. El H₂0₂ se comporta como un sustrato "asesino" que a concentraciones elevadas (>100 μΜ) ocasionan una inactivación irreversible de la catalasa. Hyslop, Zhang, Pearson y Phebus, 1995. Measurement of striatal H₂0₂ by microdyalysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H₂0₂ in vitro. Brain Res 671 (181 -186). También, el H₂0₂ ocasiona una depleción intracelular de glutatión (GSH), una molécula detoxificadora capaz de eliminar el H₂0₂, lo cual sugiere que la entrada del peróxido en la célula puede activar uno o más mecanismos tóxicos para las células. Dringen, Pawlowski y Hirriinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Halliwell y Whiteman, 2004. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? British Journal of Pharmacology 142 (231-255); Baud, Greene, Li, Wang, Volpe y Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531- 1540).

Las células sintetizan moléculas antioxidantes y poseen mecanismos para reciclarlas. El GSH es un de las principales moléculas relacionadas con la eliminación de H₂0₂ junto con su forma oxidada GSSG y las enzimas glutatión peroxidasa (GPx), glutatión reductasa (GR), glutaredoxin y el complejo NADPH/NADP+. Diferentes estudios empleando modelos in vitro con cultivos celulares, han demostrado el papel protector fundamental del GSH en las mitocondrias. Durante la apoptosis (muerte celular programada), la oxidación del GSH mitocondrial estimula la depleción de GSH ocasionando un aumento de MROs, lo que sugiere que GSH participa en el control de la generación de MROs en las mitocondrias. Dringen, Pawlowski Hirriinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Dringen, Gutterer Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain. Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916). Otra enzima que participa en la maquinaria de eliminación del peróxido de hidrógeno es la catalasa. La catalasa es una enzima citoplasmática que posee una relevancia considerable cuando se requiere la eliminación de concentraciones elevadas de H₂0₂. Baud, Greene, Li, Wang, Volpe y Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531 -1540).

Por otro lado, existen referencias sobre estudios in vitro que indican que las hMSCs poseen los principales mecanismos enzimáticos y no enzimáticos para detoxificar MROs y para corregir los daños ocasionados por el estrés oxidativo en el proteoma y genoma, garantizando un manejo eficiente de los MROs (Valle-Prieto y Conget, 2010. Human Mesenchymal Stem Cells efficiently manage oxidative stress. Stem Cell Dev 19, 1885- 1893). Si este potencial se mantiene in vivo, las hMSCs podrían también contribuir a limitar el daño tisular ocasionado por los MROs. Algunas estrategias acertadas dirigidas hacia la modificación de la síntesis de enzimas involucradas en la detoxificación de MROs indican que las células madre mesenquimales de médula ósea (BMMSCs) cultivadas en presencia de ascorbato expresan niveles superiores de superoxido dismutasa, catalasa y glutation (Stolzing and Scutt, 2006. Effect of reduced culture temperature on antioxidant defenses of mesenchymal stem cells. Free Radie Biol Med 41 (326-338). Por otra parte, en la referencia Ebert, Ulmer, Zeck, Meissner-Weigl, Schneider, Stopper, Schupp, Kassem y Jacob, 2006. Selenium supplementation restores the antioxidative capacity and prevenís cell damage in bone marrow stromal cells in vitro. Stem Cells 24(1226-1235), se describe el incremento de la capacidad antioxidante basal de dichas BMMSCs, modificando las condiciones de cultivo mediante la suplementación con selenio o la disminución de la temperatura de cultivo celular, respectivamente. Stolzing y Scutt (2006) declaran que la reducción de la temperatura en estas células no afecta a la viabilidad de las BMMSC, pero incrementa su diferenciación. Por el contrario, las células madre obtenidas de forma directa a través del método de tratamiento de la presente invención, células denominadas HC016, no presentan evidencias de diferenciación, manteniendo su fenotipo indiferenciado, además de su viabilidad.

Por otro lado, la suplementación con Selenio llevada a cabo por Ebert et al. demuestran que la adición de 100 nM de selenito sódico al medio de cultivo de las BMMSCs incrementa de forma exclusiva la actividad de enzimas intracelulares dependientes de selenio, como son la glutation peroxidasa (GPx) y la tioredoxín reductasa (TrxRs). Por el contrario, las células HC016 mantienen su viabilidad, capacidad proliferativa y fenotipo indiferenciado, y además, son capaces de activar la expresión de genes que codifican enzimas independientes de selenio, claves para la detoxificación de MROs, como son las superoxido dismutasas (SODs) y catalasa (Cat). Además, las HC016 incrementan los niveles intracelulares de GSH.

En conclusión, a diferencia de las células madre utilizadas en el estado de la técnica, las células HC016 obtenidas directamente del método de tratamiento de la presente invención presentan una serie de ventajas que las hacen especialmente idóneas para actuar ante situaciones de estrés oxidativo. Estas ventajas son fundamentalmente 1 ) la generación intracelular de un pool superior de la molécula detoxificadora GSH, 2) una expresión superior e incrementada de los genes implicados en la expresión de enzimas que catalizan la eliminación de especies reactivas de oxígeno, 3) una nueva conformación de su citoesqueleto y consecuentemente una mayor capacidad de migración hacia zonas dañadas, y 4) una mayor expresión de factores tróficos implicados en los procesos de regeneración tisular. Estos efectos conseguidos por las HC016, aumentan las defensas intracelulares y extracelulares frente a los MROs, sin producir modificaciones en cuanto a su viabilidad y estado de diferenciación.

WO 2010/150094 describe un método para la diferenciación in vitro de células madre mesenquimales en adipocitos y su uso en terapia celular. El método descrito consiste en el cultivo de dichas células en condiciones de hipoxia.

WO2007/030870 proporciona un método para la diferenciación de células madre, en particular células embrionarias humanas (hES cells) en cardiomiocitos y progenitores neurales mediante el cultivo de las células en presencia de un medio de cultivo sin suero, que adicionalmente incluye prostaglandina o una molécula inhibidora de la p38MAPquinasa. En consecuencia existe una importante necesidad en el estado de la técnica de proveer métodos de obtención de células madre mesenquimales con capacidad mejorada o incrementada en el funcionamiento de los mecanismos enzimáticos y no enzimáticos propios de las células para eliminar especies reactivas de oxígeno, y en consecuencia que éstas células puedan ser utilizadas con una mayor efectividad en las terapias celulares de enfermedades asociadas al estrés oxidativo.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere por tanto a un método de tratamiento de células madre mesenquimales, así como el uso de dichas células madre mesenquimales tratadas previamente para el tratamiento de enfermedades asociadas y causadas por el estrés oxidativo.

Las células madre mesenquimales de la presente invención pueden tener distintos orígenes, entre otros, tejido adiposo, médula ósea, cordón umbilical y/o placenta, si bien preferentemente se contempla la realización de la presente invención a partir de células madre mesenquimales obtenidas de tejido adiposo humano, ASC.

A los efectos de la presente invención, se consideran enfermedades asociadas y causadas por estrés oxidativo, o condiciones de evolución degenerativa debido a componentes mediados por especies reactivas de oxígeno a aquellas seleccionadas del grupo que consiste en: periarteritis nodosa, diabetes mellitus, enfermedad granulomatosa crónica, arteriosclerosis, fibrosis pulmonar (enfermedad pulmonar obstructiva crónica, EPOC, fibrosis pulmonar idiopática), síndrome de isquemia reperfusión, Alzheimer, Parkinson, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad intestinal inflamatoria: colitis ulcerosa y enfermedad de Chron, síndrome de distrés respiratorio del adulto, arteriosclerosis, ictus, lesión medular, lesiones en nervios periféricos, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, ataxia de Friedreich, periodontitis, enfermedades de las mucosas, enfermedades y traumatismos que cursan con un componente inflamatorio, úlceras y heridas aguas y crónicas. El ambiente oxidativo presente en estas patologías, induce el mantenimiento e incluso la intensificación de la situación inflamatoria en la zona dañada. Este fenómeno es uno de los factores que dificultan la recuperación del tejido, que no es capaz de responder frente a la gran cantidad de MROs que se producen. Las células madre mesenquimales, tratadas con el método de la presente invención, adquieren una mayor capacidad de sobrevivir en el ambiente oxidativo que se produce en estas situaciones, de forma que incrementan la secreción de factores solubles que intervienen de forma favorable en la recuperación del tejido dañado.

Es por tanto un objeto de la presente invención un método de tratamiento de células madre mesenquimales que comprende la obtención y aislamiento de células madre mesenquimales de un donante y cultivo de las células en un medio de tratamiento determinado.

Es un objeto preferente de la presente invención la aplicación del método de tratamiento anterior a células madre mesenquimales que derivan de tejido adiposo.

Es también un objeto de la presente invención un método para la modificación funcional de células madre mesenquimales, para promover su supervivencia y aumentar la generación de moléculas implicadas en la detoxificación de especies reactivas del oxígeno.

Es también un objeto de la presente invención las células madre mesenquimales obtenidas a través del método de tratamiento de la presente invención que presentan una expresión superior e incrementada de los genes implicados en la detoxificación de especies reactivas de oxígeno, y/o niveles intracelulares superiores de GSH y/o cambios de conformación en el citoesqueleto y/o un aumento en la capacidad de migración celular, en comparación a las células madre mesenquimales no tratadas con el método de precondicionamiento de la invención.

Es también un objeto de la presente invención el uso de las células madre mesenquimales tratadas según la presente invención que presentan niveles intracelulares superiores de GSH, más preferentemente una actividad superior e incrementada en los genes implicados en la eliminación de especies reactivas de oxígeno, seleccionados del grupo que consiste en: SOD1 superoxido dismutasa citoplasmática, SOD2 superoxido dimutasa 2 mitocondrial, SOD3 superoxido dismutasa 3 extracelular, Cat calatasa, GPx glutation peroxidada y GR glutation reductasa, más preferentemente, una diferente conformación del citoesqueleto y una mayor expresión del gen beta-actina, así como del factor de crecimiento IGF-1 , como composiciones/agentes terapéuticos en terapia celular para el tratamiento de enfermedades asociadas y causadas por el estrés oxidativo. En un aspecto de la presente invención, el uso de las células mesenquimales de la presente invención contempla la administración de las células mesenquimales previamente tratadas en una zona adyacente al lugar del daño, y/o en el epicentro de la lesión. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 . Capacidad proliferativa determinada mediante el método MTT, de las ASC, HC016 (A), HOG y HOG tratadas mediante el método de la invención (B), sometidas a un ambiente oxidativo (100 μΜ). Como se puede observar, las células HC016 aumentan significativamente su capacidad proliferativa cuando se someten a condiciones oxidantes, fenómeno que no se produce cuando el mismo tratamiento se aplica a otras células como las HOG. El asterisco indica diferencia estadística significativa según el test t de Student (p<0,05) (Ejemplo 3).

Figura 2. Análisis cinético de los niveles intracelulares de especies reactivas del oxígeno en las células ASC, HC016, HOG y HOG sometidas al tratamiento de la invención. El análisis muestra que las células HC016, son las únicas capaces de disminuir de forma significativa los niveles intracelulares de ROS, sobre todo cuando se exponen a condiciones oxidantes altas. Los asteriscos indican diferencia estadística significativa según el análisis doble de la varianza ANOVA (*, P<0,05; **, P<0,01 ) (Ejemplo 4). Figura 3. Niveles intracelulares de glutation total (GSH_totai) en las células ASC y HC016 (Ejemplo 5). En condiciones normales, no oxidantes, ya se produce un aumento del GSH basal de un 10% en las células HC016 con respecto a las ASC. Figura 4A. Niveles de expresión de genes involucrados en la detoxificación de especies reactivas del oxígeno en las células ASC y HC016 (Ejemplo 6).

Figura 4B. Cuantificación de los niveles de expresión de genes involucrados en la detoxificación de especies reactivas del oxígeno (SOD1 , SOD2, SOD3, Cat, GR, GPx) en las ASC y HC016. El valor está expresado como ratio HC016/ASC (Ejemplo 6).

Figura 5A. Niveles de expresión de genes involucrados en la formación del citoesqueleto (β-Actina) en las células ASC y HC016 (Ejemplo 7).

Figura 5B. Cuantificación de los niveles de expresión de genes involucrados en la formación del citoesqueleto (β-Actina) en las ASC y HC016. El valor está expresado como ratio HC016/ASC (Ejemplo 7).

Figura 5C. Niveles de expresión del factor de crecimiento IGF-I en las células ASC y HC016 (Ejemplo 7).

Figura 5D. Cuantificación de los niveles de expresión del factor de crecimiento IGF-I en las ASC y HC016. El valor está expresado como ratio HC016/AMSC (Ejemplo 7).

Figura 6. Imágenes de microscopía de fluorescencia del inmunomarcaje de la F-actina. Se puede observar el aumento de la presencia de F-actina en las células HC016, con respecto a las ASC, y su distribución en fibras de estrés, lo que indica cambios de conformación del citoesqueleto celular en las HC016 relacionadas con su mayor capacidad de migración y quimiotaxis (Ejemplo 8).

Figura 7. Tasa proliferativa de las células HOG de linaje neural sometidas a estrés oxidativo y la influencia de la aplicación de ACS y HC016 sobre esta tasa (TC). Como se puede observar el co-cultivo de las HOG oxidadas con las ASC y HC016 aumenta su capacidad de supervivencia. Sin embargo, solo el co-cultivo de las HOG con las HC016, es capaz de mantener este efecto protector a las 48 horas de la exposición a las condiciones oxidantes. El asterisco indica diferencia estadística significativa según el test t de Student (p<0,05) (Ejemplo 9).

Figura 8. Imágenes representativas y gráfico de barras cuantitativo, mostrando la capacidad significativamente superior de migración de las HC016 hacia células sometidas a estrés oxidativo, con respecto a las ASC (Ejemplo 10).

Figura 9. Tabla con la evolución de los valores del examen BBB (Basso-Beattie- Bresnahan) hasta 8 semanas de los tres grupos experimentales, ratas lesionadas controles (no tratadas) y tratadas con ASC y con HC016 (Ejemplo 12) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere de una parte a un método de tratamiento de células madre mesenquimales, preferentemente de origen adiposo, es decir obtenidas y/o aisladas a partir de tejido adiposo adulto, y en concreto de origen animal, preferentemente humano. Dicho procedimiento comprende fundamentalmente dos etapas, la obtención y aislamiento de células mesenquimales, y en segundo lugar, una etapa de crecimiento y tratamiento específico de las células en un medio de tratamiento concreto que comprende un agente oxidante. Obtención de células ASC:

A este propósito, el procedimiento comprende en primer lugar la obtención y aislamiento de células madre mesenquimales.

Si bien el origen de las células madre mesenquimales puede seleccionarse del grupo que consiste en tejido adiposo, médula ósea, cordón umbilical y/o placenta, preferentemente se contempla la realización de la presente invención a partir de células madre mesenquimales obtenidas de tejido adiposo humano, ASC.

Así, en una realización preferente de la presente invención, la fracción de células madre mesenquimales del tejido adiposo se extrae de lipoaspirados de tejido adiposo de pacientes humanos sanos bajo anestesia. El lipoaspirado es donado por los pacientes bajo su correspondiente consentimiento informado. Los lipoaspirados se lavan con PBS 1 x y son digeridos con colagenasa tipo I durante 30 minutos a 37°C y después centrifugados para obtener un pellet celular. Este pellet es resuspendido en tampón de lisis de eritrocitos y la suspensión celular purificada se pasa a través de un filtro de 100 μηι y es centrifugado de nuevo. Tras resuspender las células, estas se siembran en frascos de cultivo celular, para proceder a su expansión celular.

Procesos de expansión o subcultivo de las células utilizados a los efectos de la presente invención incluyen la liberación de las células de la superficie de cultivo mediante la utilización por ejemplo de una solución de tripsina/EDTA, la centrifugación de la suspensión celular obtenida, la determinación de la densidad y viabilidad celular y la siembra en nuevas superficies de cultivo celular.

La obtención de células a los efectos de la presente invención sigue la metodología descrita en el estado de la técnica, como por ejemplo,: Yoshimura, Shigeura, Matsumoto, Sato, Takaki, Aiba-Kojima, Sato, Inoue, Nagase, Koshima y Gonda, 2006. Characterization of Freshly Isolated and Cultured Cells Derived From the Fatty and Fluid Portions of Liposuction Aspirates. J Cell Physiol 208(64-76); Almeida, Campa, Alonso- Vale, Lima, Daud y Stocchero, 2008. Fracción vascular estromal de tejido adiposo. Cir.plást. iberolatinoam. 34 (71 -79); Wagner, Wein, Seckinger, Frankhauser, Wirkner, Krause, Blake, Schwager, Eckstein, Ansorge y Ho, 2005. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Experimental Hematology 33 (1402-1416). Proceso de tratamiento de las células. Obtención de células HC016:

Una vez se ha obtenido el número de células adecuado, entre 300.000 - 2.000.000, éstas son sometidas a un tratamiento que comprende poner en contacto las células, con una concentración determinada de agente oxidante siguiendo una pauta específica de tratamiento.

Como agente oxidante se contemplan, por ejemplo, los óxidos y/o peróxidos, entre otros, el peróxido de hidrógeno (H₂0₂), peróxido de calcio (Ca0₂), peróxido de magnesio (Mg0₂), peróxido de zinc (Zn0₂), peróxido de manganeso (Mn0₂), peróxido de plomo (Pb0₂) y óxido nítrico (NO), óxido nitroso (N₂0), ozono (0₃), perborato sódico (NaB0₃), dióxido de selenio (Se0₂), óxido de plata (Ag₂0), sales férricas como el cloruro férrico (FeCI₃), sales de cobre como percarbonato sódico (2Na₂C0₃), permanganatos como el permanganato potásico (K₂Mn₂0₈), dicromatos como el dicromato potásico (K₂Cr₂0₇), sales de litio, sodio y calcio del ácido hipocloroso (HCIO-), clorito sódico (NaCI0₂), ácido dórico (HCI0₃), clorato potásico (KCI0₃), hidróxido de aluminio (Al₂0₃), hidróxido de aluminio coprecipitado con carbonato de magnesio (MgC0₃), trióxido de arsénico (As(OH)₃), peróxido de benzoilo ((C₆H₅CO)₂0₂), hidróxido de calcio (Ca(OH)₂), hidrocloruro de clordiazepóxido, óxido cúprico (CuO), óxidos de hierro, óxido de magnesio (MgO), dióxido de magnesio, hidróxido de magnesio(Mg(OH)₂), hidróxido de potasio (KOH), hidróxido de sodio (NaOH), óxido de titanio (Ti0₂), óxido de zinc (ZnO) y otros agentes oxidantes, preferentemente el peróxido de hidrógeno (H₂0₂) que pertenece al grupo de especies reactivas del oxígeno (en inglés, ROS) y es un producto de desecho de la cadena respiratoria mitocondrial y molécula de señalización en procesos inflamatorios. Un incremento de H₂0₂ por encima de unos niveles tolerables induce la muerte celular. Sin embargo, el presente método de tratamiento contempla la exposición de las células a H₂0₂ de forma controlada, es decir con un patrón y método controlados y a concentraciones determinadas que provocan nuevas funcionalidades y características en las células madre mesenquimales obtenidas de forma directa tras este tratamiento. En concreto, el método de tratamiento utilizado a los fines de la presente invención comprende el cultivo de las células bajo un ambiente oxidativo moderado, siguiendo una pauta de tratamiento determinada.

En términos generales el método de tratamiento comprende dos ciclos consecutivos de tratamiento con un intervalo de 48-72 horas, seguido de un tercer ciclo de precondicionamiento o tratamiento durante 24-48 horas en un soporte experimental.

En concreto dicha pauta de tratamiento comprende las siguientes etapas: a) Primer ciclo: Disposición de las células en una superficie de cultivo y dejar un tiempo de acondicionamiento comprendido entre 4 y 8 horas para que las células de adhieran y adquieran su morfología típica.

b) Adicionar el medio de tratamiento, compuesto por DMEM + 10% SBF y una solución de H₂0₂, hasta alcanzar una concentración final comprendida entre 0,01 y 0,05 mM.

c) Mantener 48-72 horas, en el incubador a 37⁵C y una atmósfera con un 5% de-C0₂. d) Segundo ciclo: Renovar el medio de tratamiento aplicando de nuevo DMEM + 10% SBF y una solución de H₂0₂, hasta alcanzar una concentración final comprendida entre 0,01 y O,05 mM.

e) Incubar estas células 48-72 horas a 37⁵C con un 5% de C0₂.

f Tercer ciclo: Renovar el medio de tratamiento aplicando de nuevo DMEM + 10% SBF y una solución de H₂0₂, hasta alcanzar una concentración final comprendida entre 0,01 y O,05 mM.

g) Incubar estas células 24-48 horas a 37⁵C con un 5% de C0₂. Transcurrido este tiempo de tratamiento, las células han modificado sus características funcionales y morfológicas, siendo a partir de ahora HC016. Los medios de cultivo o crecimiento comprenden los componentes habituales conocidos en el estado de la técnica, son por tanto medios con alto contenido en glucosa, (DMEM, Invitrogen) a un 85-95% del volumen total, con suero bovino fetal en concentraciones de 5 a 15% del volumen total (Biochrom) y 1 % de PSA del volumen total (solución antibiótica-lnvitrogen).

A su vez el medio de tratamiento utilizado en el método de la invención descrito anteriormente comprende un alto contenido en glucosa, (DMEM, Invitrogen) a un 85- 95% del volumen total con suero bovino fetal en concentraciones de 5 a 15% del volumen total (Biochrom) y 1 % de PSA del volumen total (solución antibiótica-lnvitrogen) y peróxido de hidrógeno (H₂0₂) en concentraciones de 0.01 a 0,05 mM, comercializado por Panreac.

Caracterización de las células HCQ16 frente a las ACS no tratadas con la invención

Como consecuencia del método de tratamiento, las células HC016 de la presente invención, han adquirido y presentan una actividad superior e incrementada de los niveles de expresión de determinados genes implicados en la eliminación de especies reactivas del oxígeno, tales como los genes responsables de las siguientes proteínas: SOD1 Superoxido dismutasa 1 citoplasmática, SOD2 superoxido dimutasa 2 mitocondrial, SOD3 superoxido dismutasa 3 extracelular, GPx glutatión peroxidada, GR glutatión reductasa y Cat catalasa, con respecto a las ASC no tratadas con el método.

SOD1 : La enzima superoxido dismutasa 1 es una proteína dimérica que tiene cobre (Cu) y zinc (Zn) como factores. SOD1 se encuentra en el citoplasma celular y cataliza la dismutación del superoxido, producto de la cadena respiratoria y la enzima xantina oxidasa, en oxígeno y peróxido de hidrógeno a través de las siguientes reacciones.

. Cu-Zn^{(n+1 )+}-SOD + 0₂ ^~→ Cu-Zn ⁿ⁺-SOD + 0₂

. Cu-Znⁿ⁺-SOD + 0₂ ^~ + 2H⁺→ Cu-Zn ^{(n+1 )+}-SOD + H₂0₂. SOD2: La enzima superoxido dismutasa 2 es una proteína tetramérica que tiene manganeso (Mn) como factor. SOD2 se encuentra en las mitocondrias de las células y cataliza la dismutación del superoxido, producto de la cadena respiratoria y la enzima xantina oxidasa, en oxígeno y peróxido de hidrógeno a través de las siguientes reacciones. . Mn^{(n+1 )+}-SOD + C½^~→ Mn ⁿ⁺-SOD + 0₂

. Mnⁿ⁺-SOD + C½^~ + 2H⁺→ Mn ^{(n+1 )+}-SOD + H₂0₂.

SOD3: La enzima superóxido dismutasa 3 es una proteína homotetramérica que tiene cobre (Cu) y zinc (Zn) como factores. SOD3 se libera al medio extracelular donde se une a la matriz extracelular a través de heparan sulfato proteoglicano y el colágeno tipo I y cataliza la dismutación del superóxido presente en el medio, en oxígeno y peróxido de hidrógeno a través de las siguientes reacciones.

• Cu-Zn⁽ⁿ⁺¹⁾⁺-SOD + 0₂-→ Cu-Zn ⁿ⁺-SOD + 0₂

• Cu-Znⁿ⁺-SOD + 0₂- + 2H⁺→ Cu-Zn ⁽ⁿ⁺¹⁾⁺-SOD + H₂0₂

Cat: La enzima catalasa es una proteína tetramérica con cuatro cadenas peptídicas y cuatro grupos hemo porfirin (Hierro, Fe) que está presente en los peroxisomas de prácticamente todas las células aerobias como enzima clave en la defensa ante el estrés oxidativo. La catalasa reacciona con el peróxido de hidrógeno y lo convierte en agua. Aunque su mecanismo no se conoce completamente, está descrito que su actividad se lleva a cabo mediante las siguientes reacciones.

• H202 + Fe(lll)-E→ H20 + 0=Fe(IV)-E(.+)

• H202 + 0=Fe(IV)-E(.+)→ H20 + Fe(lll)-E + 02 Chelikani, Fita y Loewen, 2004. Diversity of structures and properties among catalases. Cell Mol Life Sci 61 (192-208).

GPx: La enzima glutation peroxidasa es una de las pocas proteínas conocidas en vertebrados superiores que contienen selenocisteína. GPx se encuentra principalmente en el citoplasma e interviene en la detoxificacion del peróxido de hidrógeno formado por la superóxido dismutasa y monoamino oxidasa catalizando su unión a moléculas de glutatión reducido GSH.

GR: La enzima glutation reductasa es una proteína flavoproteína homodimérica. GR pertenece a la familia piridin nucleótido-disulfito oxidirreductasa clase I. Esta enzima participa en un ciclo fundamental en la defensa antioxidante. Su actividad consiste en reducir el glutatión oxidado (GSSG) a su forma sulfidrilo (GSH), el cual es una molécula principal en la defensa antioxidante.

El aumento de la expresión de los genes implicados en la detoxificación de MROS, ha sido cuantificada con respecto a las mismas células no tratadas, células ASC, confirmando que las células HC016 presentan un aumento en la expresión del gen SOD1 de al menos el 30%, preferentemente el 53%, un aumento en la expresión del gen SOD2 de al menos el 25%, preferentemente el 37%, un aumento en la expresión del gen SOD3 de al menos el 50%, preferentemente el 77% y/o un aumento en la expresión del gen Cat de al menos el 50%, preferentemente el 78%.

El método utilizado para cuantificar la superioridad de expresión de genes respecto a células HC016 con respecto a las ASC, ha sido el siguiente: Realización de lisis celular, extracción y purificación del mRNA de cada grupo experimental empleando la metodología descrita por el sistema comercial de filtros de membrana SuperScript-lll^® First Strand. El mRNA es empleado como molde para generar cDNA mediante la técnica de Retro Transcipción-Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) siguiendo los protocolos y reactivos incluidos en el kit Puré Link™ RNA Micro Kit. Con volúmenes correspondientes del cDNA de cada grupo experimental se realiza una Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR) incluyendo secuencias cebadoras específicAs de fragmentos de DNA localizados en los genes Super Oxido Dismutasa 1 , 2 y 3 (SOD1 -3), Catalasa (Cat), Glutation Peroxidasa (GPx) y Glutation Reductasa (GR). Los productos de la PCR de cada grupo experimental son migrados mediante la técnica de electroforesis y se determina el tamaño y se cuantifica la intensidad de cada banda. El valor resultante se normaliza con el valor de intensidad de un gen constitutivo definido, el Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa GAPDH.

Además se ha podido comprobar que las células HC016 presentan un nivel intracelular superior en GSH de al menos el 8%, preferentemente el 10%, con respecto a las ASC. El método utilizado para cuantificar la superioridad en los niveles de GSH de las células HC016 con respecto a las ASC, ha sido el método enzimático de Tietze, según se detalla a continuación: Los grupos experimentales consisten en dos lotes independientes de hASCs y HC016. Tras el tratamiento, las células son recogidas, sus proteínas son extraídas mediante la incubación de las células con un buffer de lisis y la proteína total en el sobrenadante es cuantificada siguiendo el protocolo y los reactivos suministrados con el kit BioRad DC Protein assay. En otra alícuota del sobrenadante se precipitan las proteínas y el sobrenadante es transferido para la cuantificación del GSH total y GSSG. Las muestras para los ensayos de GSH total y GSSG son procesadas en triplicados en placa de 96 pocilios. Para la medición de GSH, las muestras se incuban con glutation reductasa y seguidamente se mide la absorbancia a 405 nm cada 15 segundos durante 2,5 minutos. Para medir GSSG, las muestras de proteína purificada son pre-tratadas con 2-vinilpiridina, más tarde con glutation reductasa y finalmente se mide la absorbancia a 405 nm cada 15 segundos durante 30 minutos.

Los valores de absorbancia son extrapolados a una recta patrón generada mediante la repetición de los mismos pasos pero en lugar de con muestras de proteínas de las células, con concentraciones conocidas de GSH. Los valores se expresan como nmol/mg de proteína. El glutation total se calcula como:

Adicionalmente las células HC016 se caracterizan por presentar unos niveles intracelulares de MROs inferiores en al menos el 10%, preferentemente el 1 1 %, más preferentemente el 15% en comparación a las ASC.

El método utilizado para cuantificar la superioridad en los niveles intracelulares de MROs las células HC016 con respecto a las ASC, ha sido la cuantificación fluorimétrica con la sonda DCFA, tal y como se describe a continuación: Los grupos experimentales consisten en cuatro poblaciones independientes, una de ASCs, una segunda con HC016, una tercera con células HOG intactas y una cuarta con células HOG cultivadas con el mismo tratamiento que genera las HC016 a partir de ASC. Las células son lavadas con PBS 1 x y después se les añade 2',7'-diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFA) 10 μΜ durante 30 minutos. Posteriormente se elimina el DCFA y se añade medio fresco. Seguidamente, se cultivan en un medio oxidante mediante la adición de H₂0₂ al medio en un gradiente que comprende 0, 0.1 , 0.25, 0.5 y 1 mM e inmediatamente después, se mide la evolución en el tiempo de los niveles intracelulares de ROS con medidas cada 5 minutos y por un total de 60 minutos en un fluorímetro lector de placas. Los gráficos se representan en unidades arbitrarias de intensidad a lo largo del tiempo (minutos).

Adicionalmente las células HC016 tratadas de acuerdo con el método descrito anteriormente presentan una mayor capacidad de migración. Esta propiedad determina que las HC016 puedan acudir de forma más eficiente a la zona del daño tisular e iniciar su acción trófica para proteger a las células dañadas e intervenir en el control del ambiente adverso. Esta significativa mayor capacidad de migración con respecto a las ASC, viene determinada por cambios de conformación que se producen en el citoesqueleto de las HC016, así como un aumento en el tipo de microfilamentos (beta - actina), que se disponen en el borde de expansión de las células, que utilizan proyecciones celulares como forma de movimiento. En este sentido, el análisis de la expresión del gen de la beta-actina indica un incremento en las HC016 del 59%, con respecto a las ASC (Fig.5 A-B). Por otro lado, el inmunomarcaje de la actina polimerizada o F-actina indica cambios morfológicos importantes relacionados con la mayor capacidad de motilidad, como es una mayor formación de fibras de estrés, un elemento indispensable en los procesos de migración. La figura 6 muestra el inmunomarcaje de F-actina. En esta imagen se observa un incremento de la F-actina organizada en fibras de estrés, que es uno de los aspectos críticos en el proceso de migración celular (Mitchison et al., 1996). Además, el experimento realizado expresamente para analizar la capacidad de migración celular mediante la utilización de cámaras de Boyden (Fig. 8, ejemplo 10), muestra que las células HC016 tienen una capacidad de migración 30 veces superior con respecto a las ASC.

Adicionalmente las células HC016, presentan un incremento en la expresión del factor trófico IGF-1 (insulin-like growth factor-1 ) del 64%, con respecto a las ASC (Fig.5 C-D). Estudios previos han evidenciado que IGF-1 interviene de forma relevante en los procesos regenerativos producidos tras un daño. IGF-1 es un potente factor neurotrófico, que se produce por células no neuronales tras un daño en el tejido nervioso, estimulando la regeneración tisular. Promueve la supervivencia neuronal, el crecimiento de neuritas, la proliferación de las células nerviosas, la mielinización y mejora la interacción célula de schwan-axon neuronal (Apel et al., 2010). Además, en otros modelos experimentales, se ha demostrado que la aplicación local de IGF-1 , permite la reparación de músculo esquelético dañado, sin la formación de tejido cicatricial y un mayor reclutamiento de células madre al lugar del daño (Spangenburg E.E. et al., 2010). Por estos motivos, la inducción de la expresión de IGF-1 por parte de las células HC016 puede promover la capacidad regenerativa de las ASC, de forma que se incremente la capacidad de proliferación celular, la recuperación funcional de las células del propio tejido dañado y el reclutamiento de células madre a la zona del daño, para contribuir al proceso de reparación.

El método utilizado para analizar la expresión de genes respecto a células ASC ha sido el siguiente: este análisis comparativo requiere de dos grupos experimentales que consisten en células ASC y células HC016. Una vez el tratamiento se ha completado, cada grupo celular es recogido, lisado, el RNA es extraído y purificado, y es empleado para generar cDNA. La reacción PCR se lleva a cabo con el cDNA incluyendo secuencias cebadoras diseñadas para unirse a fragmentos específicos de DNA de los genes de β-actina y el factor de crecimiento insulínico tipo I, IGF-1 . Los productos de PCR de cada grupo experimental son migrados mediante la técnica de electroforesis y el tamaño y la densidad óptica de cada banda migrada es determinada. El valor de densidad es normalizado con respecto al valor de densidad óptica de un gen constitutivo definido, el GAPDH.

El conjunto de estos datos indica que el tratamiento que genera las células HC016 induce la síntesis de una reserva de maquinaria molecular intra- y extra-celular necesaria para la eliminación de H₂0₂ y controlar el ambiente oxidativo adverso. Las células HC016 poseen mayor capacidad para acudir a la zona del tejido dañado y además, producen una mayor cantidad de factores tróficos que actúan sobre el proceso regenerativo de las células del propio tejido y ayudan a preservar su supervivencia. Uso de las células HC016 en el tratamiento de enfermedades asociadas o derivadas del estrés oxidativo

Tal y como se ha comentado anteriormente, las características de las células HC016 indicadas en el apartado anterior las hacen especialmente indicadas para el tratamiento de enfermedades causadas por estrés oxidativo o condiciones de evolución degenerativa debido a componentes mediados por especies reactivas de oxígeno.

Una de las patologías que afectan al Sistema Nervioso Central y en la que está implicado el estrés oxidativo, ocasionando una evolución degenerativa debido a componentes mediados por especies reactivas de oxígeno, es la lesión medular.

La lesión medular es un daño sobre el tejido nervioso en la que no intervienen patógenos externos ni está inducido por factores genéticos. En el punto de la lesión, las consecuencias inmediatas tras el traumatismo son compresión tisular, hemorragia, edema y, disminución de oxígeno y nutrientes en la zona del impacto (Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin y Cho, 2004. Injury severity and cell death mechanisms: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132; Fehlings y Tator, 1995. The relationships among the severity of spinal cord injury, residual neurological function, axon counts and counts of retrogradely labeled neurons after experimental spinal cord injury. Exp Neurol 132: 220-228). Estos fenómenos biológicos activan dos mecanismos de defensa tisular, la muerte celular programada o apoptosis (Yukawa, Lou, Fukui y Lenke, 2002. Optimal treatment timing to attenuate neuronal apoptosis via Bcl-2 gene transfer in vitro and in vivo. J Neurotrauma 19: 1091 -1 103) y la reacción inmune innata (Carpentier y Palmer, 2009. Immune influence on adult neural stem cell regulation and function. Neuron 64: 79-92) que se extienden a áreas anexas no lesionadas y persisten durante semanas e incluso meses tras la lesión en forma de isquemia e inflamación, denominándose en conjunto, daño secundario (Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin y Cho, 2004. Injury severity and cell death mechanisms: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132).

Estas dos formas de respuesta tisular se expanden a lo largo de la medula espinal y afectan a tejido inicialmente sano, ya que los mecanismos que dispone el tejido nervioso para responder ante sus consecuencias fisiológicas son insuficientes. La expansión se realiza, en gran medida, a través de metabolitos reactivos del oxígeno (MROs) propios de la reacción inmune innata que ocasionan un estrés oxidativo, que en función de su intensidad puede inducir la apoptosis (Liu, Liu, y Wen, 1999. Elevation of hydrogen peroxide after spinal cord injury detected by using the Fenton reaction. Free Rad Biol & Medicine 27: 478-482; Yukawa et al., 2002). De estos, el MRO más abundante es el peróxido de hidrógeno (H₂0₂) que difunde en el medio extracelular que rodea a las células nerviosas y se expande en forma de daño secundario. El H₂0₂ reacciona y degrada las membranas, proteínas y el ADN de las células (Braughler y Hall, 1989. Central Nervous System trauma and stroke. I. Biochemical considerations for oxygen radical formation and lipid peroxidation. Free Radie Biol Med. 6: 289-301 ) y en última instancia, induce en ellas una muerte celular programada o, apoptosis (Yukawa et al., 2002). El H₂0₂ también es un producto de desecho de la actividad normal de las células, por lo que tienen ciertas defensas ante esta molécula (Phillis, 1994. A "radical" view of cerebral ischemic injury. Prog Neurobiol 42: 441-448). Sin embargo, las concentraciones que se generan tras la lesión son superiores a las fisiológicamente tolerables (Hyslop, Zhang, Pearson y Phebus, 1995. Measurement of striatal H₂0₂ by microdialysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H₂0₂ in vitro. Brain Res 671 : 181 -186). De entre las células nerviosas, los oligodendrocitos, células que generan la cubierta de mielina de las fibras nerviosas de las neuronas, son las más vulnerables a los MROs ya que poseen menos defensas ante ellos, y contienen moléculas que los convierten en objetivo principal del daño secundario (Dringen R, Pawlowski P y Hirrlinger J. 2005. Peroxide detoxification by brain cells. J Neurosci Res 79: 157-165). Por tanto, además de la muerte celular inicial tras el traumatismo, el daño oxidativo posterior debido al H₂0₂ ocasiona una desmielinizacion persistente de las fibras nerviosas disminuyendo la conducción de la señal nerviosa a través de éstas (Nashmi R y Fehlings MG. 2001 . Changes in axonal physiology and morphology after chronic compressive injury of the rat thoracic spinal cord. Neuroscience 104: 235-251 ).

Otras enfermedades son aquellas seleccionadas del grupo que consiste en: periarteritis nodosa, diabetes mellitus, enfermedad granulomatosa crónica, arteriosclerosis, fibrosis pulmonar (enfermedad pulmonar obstructiva crónica, EPOC, fibrosis pulmonar idiopática), síndrome de isquemia reperfusión, Alzheimer, Parkinson, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad intestinal inflamatoria: colitis ulcerosa y enfermedad de Chron, síndrome de distrés respiratorio del adulto, arteriosclerosis, ictus, lesión medular, lesiones en nervios periféricos, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, ataxia de Friedreich, periodontitis, enfermedades de las mucosas, enfermedades y traumatismos que cursan con un componente inflamatorio, úlceras y heridas agudas y crónicas.

La administración de las células HC016 a la zona afectada disminuye el nivel de estrés oxidativo originado como consecuencia de la activación de las células del Sistema Inmune durante los procesos inflamatorios.

Adicionalmente, la administración de las células HC016 a la zona afectada disminuye los niveles de estrés oxidativo originados como consecuencia de la producción de MROs tras una hemorragia interna, mejora la secreción paracrina de citocinas, interleucinas, quimiocinas, factores tróficos y factores de crecimiento, aumenta la supervivencia y proliferación de otras células de mamífero, disminuye los niveles de ROS extracelular en la proximidad de las células de mamífero próximas a las HC016 administradas y disminuye los niveles extracelulares de moléculas de señalización pro-inflamatoria como TNF-alfa, IL-1 beta, etc.

De igual forma, las células HC016 presentan una capacidad quimiotáctica muy superior hacia células dañadas por el H₂0₂ extracelular, tal y como queda demostrado en el ejemplo 10 de la presente invención. El uso de las células HC016 contempla la administración de las células mesenquimales previamente tratadas en una zona adyacente al lugar del daño, en vez del epicentro de la lesión, con el objetivo de limitar la irradiación del daño tisular, la extensión de la lesión y la pérdida funcional. El tejido del punto de la lesión sufre una fuerza compresiva intensa que rompe las membranas de las células nerviosas y de las células del sistema vascular. También, como consecuencia de la lesión, puede existir una hemorragia debido a la rotura de arterias y venas, una disgregación de orgánulos, citoplasma y vesículas y membranas celulares que desembocarán en necrosis. Estos eventos son inherentes a la lesión. Más tarde, si estos no se tratan, las moléculas que liberan las células necróticas, junto con las que liberan las células del sistema inmune, expandirán el daño a las áreas adyacentes al lugar de la lesión a través de moléculas de señalización celular como el H₂0₂. La aplicación de esta terapia celular basada en células mesenquimales está diseñada para disminuir o minimizar la expansión del daño tisular. Por tanto, la aplicación de la terapia celular será preferiblemente en un área adyacente al lugar de la lesión.

En otro aspecto de la invención, las células tratadas serán aplicadas utilizando una vía de administración, que les permita llegar directamente al epicentro de la lesión, con el objetivo de metabolizar las especies reactivas del oxígeno presentes en la zona, disminuir el estrés oxidativo y controlar la situación inflamatoria, para evitar la situación de muerte celular masiva en esta zona.

Las vías de administración pueden ser: cualquier vía parenteral (como por ejemplo intraarterial, intravenosa, intralinfática, intraraquídea, epidural, intramedular), subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica (percutánea), intraarticular, intratraqueal, intraalveolar, intratecal, intraocular, conjuntival, intracardiaca, intranasal, vaginal, uretral, cutánea, rectal, sublingual, oral, transmucosa oral. Para ello se contempla la formulación y disposición de las células obtenidas a través del método de la presente invención en los vehículos apropiados y farmacéuticamente aceptados que son ya conocidos para el experto en la materia.

Entre otros se contempla la formulación en una solución, que adicionalmente a las células HC016 contiene entre otros, Ringer-Lactato, Albúmina humana (CSL-Behring), etc. que se dispone en viales de cristal estéril y apirógeno (Sword Scientific) para su administración.

De igual modo, las células HC016 pueden ser incorporadas en biomateriales de origen natural y/o sintético, para la generación de terapias celulares y de ingeniería tisular para tales como hidrogeles, espumas y materiales poliméricos, composites, derivados de fosfato cálcico y materiales metálicos, que permitan una mejor administración de las células a la zona de lesión y una mayor capacidad de supervivencia y funcionalidad de las mismas, según los casos. Tras la administración de las células HC016 al mamífero, las células mesenquimales migran hacia la zona de lesión, donde activan la proliferación de las células adyacentes a la zona de inyección. Preferentemente, estas células adyacentes poseen el mismo fenotipo que las del parénquima en el que se ha realizado la inyección y son células precursoras. Aun más preferentemente, el fenotipo de las células adyacentes coincide con el de las células del parénquima y con el de las células precursoras.

En otro aspecto de la invención, las células mesenquimales HC016 administradas al tejido permanecen en el tejido. Además, la presencia de células mesenquimales administradas en el tejido del paciente, no induce una respuesta inmune contra dichas células mesenquimales administradas.

EJEMPLOS

Ejemplol : Obtención de células mesenquimales de tejido adiposo (ASO

Las células madre mesenquimales de tejido adiposo se aislan a partir de tejido humano siguiendo la metodología descrita en Yoshimura et al., 2006; Almeida et al., 2008; Wagner et al., 2005.

La fracción de células madre mesenquimales del tejido adiposo se extrae de lipoaspirados de tejido adiposo de pacientes sanos bajo anestesia. Los lipoaspirados se lavan con PBS 1 x y son digeridos con colagenasa tipo I durante 30 minutos a 37°C y después centrifugados para obtener un pellet celular. Este pellet es resuspendido en tampón de lisis de eritrocitos y la suspensión celular purificada se hace pasar a través de un filtro de 100 μηι y centrifugado de nuevo. Tras resuspender las células, estas se siembran en soportes de cultivo para la expansión celular. Las células se cultivan como cultivos primarios durante un periodo de 5 días en un medio de crecimiento compuesto de DMEM (Invitrogen) con un 10% de Suero Fetal Bovino (Biochrom) y un 1 % de PSA antibiótico-antimicótico (Invitrogen) en el incubador a 37⁵C y 5% C02. Seguidamente se procede a expandir las células para lo cual es necesario despegar las células de la superficie de cultivo mediante la utilización de una solución de 0,05% tripsina/EDTA, resuspender las células en medio fresco, determinar la densidad y viabilidad celular en la suspensión celular obtenida y sembrar las mismas en una nueva superficie de cultivo celular.

Ejemplo 2: Aplicación del tratamiento de la invención a las células ASC: Obtención de las células HC016

A partir de un subcultivo celular de ASC se obtienen y siembran 350.000 células en un frasco de cultivo T25 con 5ml de medio de crecimiento con la siguiente composición: DMEM (Invitrogen) con un 10% de Suero Fetal Bovino (Biochrom) y un 1 % de PSA antibiótico-antimicótico (Invitrogen) y se introduce el soporte con las células en el incubador a 37⁵C y 5% C02, hasta su adherencia. Primer ciclo: se añade el medio de de tratamiento que contiene la siguiente composición: DMEM (Invitrogen) con un 10% de Suero Fetal Bovino (Biochrom), un 1 % de PSA antibiótico-antimicótico (Invitrogen) y un 0,01 % de H₂0₂ (Panreac) Se incuban estas células en este medio durante 48 horas. Segundo ciclo: Transcurridas estas 48 horas se obtienen las células y se siembran 350.000 células en un segundo frasco de cultivo T25 y se introduce en el incubador 4 horas a 37⁵C y 5% C0₂ hasta su adherencia. Se adiciona el medio de tratamiento y se incuban estas células en este medio durante 48 horas. Tercer ciclo: Transcurridas estas 48 horas se obtienen las células y se siembran 350.000 células en un tercer frasco de cultivo T25 con 5 mi de medio de crecimiento y se introduce en el incubador a 37^°C y 5% C0₂ hasta su adherencia. Se añade el medio de tratamiento y se incuban estas células en este medio durante 48 horas. Transcurridas estas 48 horas, las células ASC tratadas pasan a denominarse HC016.

Ejemplo 3: Análisis comparativo de la proliferación de las células HC016 con respecto a las ASC. Se lleva a cabo el análisis de la proliferación en cuatro grupos celulares experimentales: ASC, células HC016, células HOG intactas y células HOG cultivadas con el mismo tratamiento de la invención, que genera las HC016. Las células HOG, son células humanas procedentes de un oligodendroglioma y son consideradas como un modelo celular de oligodendrocitos (células de la glía envolvente en el sistema nervioso).

Las ASC son cultivadas con la metodología y el medio de crecimiento definido y descrito en el ejemplo 1 para generar la población necesaria para esta experimentación. Un lote del mismo número de células HC016 se genera a partir de ASC según el ejemplo 2. La población de células HOG se genera mediante los mismos métodos y medios que las ASC y el cuarto grupo se genera mediante el cultivo de las células HOG con la misma metodología que da lugar a las HC016.

Una vez preparadas las cuatro poblaciones celulares, las células son sembradas en placas de 96 pocilios con medio de crecimiento hasta que estas quedan adheridas a la base del pocilio. A continuación, las células son cultivadas en ambiente oxidativo, mediante la exposición a 0.1 mM de H₂0₂. Seguidamente, se mide la proliferación mediante los protocolos y reactivos incluidos suministrados en kit de Proliferación Celular MTT a tiempos t=0h, 24h, 48h y 72horas. De acuerdo con el fabricante del kit, este ensayo genera una estimación colorimétrica de la proliferación celular, y por lo tanto, este parámetro es analizado y comparado en las cuatro condiciones experimentales. Los gráficos están representados en unidades arbitrarias de intensidad a lo largo del tiempo (horas).

Resultados

La capacidad proliferativa de las HC016 es superior a la de la población control de ASC a las 72 horas tras los estímulos oxidativos 1 ,23 veces (aumento del 23%)(t-Student test p<0,05; n=3 samples) (Fig. 1 A). Esta propiedad no es compartida por otras células humanas como los Oligodendrocitos HOG (Fig. 1 B). El tratamiento aquí descrito es efectivo en las ASC y no en otros tipos celulares como los oligodendrocitos HOG. Ejemplo 4: Niveles intracelulares de especies reactivas del oxígeno de las células HC016.

Se lleva a cabo el análisis de los niveles intracelulares de especies reactivas del oxígeno, en cuatro grupos celulares experimentales: ASC, células HC016, células HOG intactas y células HOG cultivadas con el mismo tratamiento de la invención, que genera las HC016.

Las cuatro diferentes poblaciones generadas son sembradas en placas de pocilios con medio de crecimiento hasta que estas quedan adheridas. A continuación, las células son brevemente lavadas con PBS 1 x, después este es reemplazado por 100 μΙ de PBS 1 x al que se le ha añadido 2',7'-diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFA) 10 μΜ durante 30 minutos en el incubador. Posteriormente se elimina el DCFA y se añade medio fresco. Seguidamente, las células se cultivan en un medio oxidante mediante la adición de H₂0₂ al medio en un gradiente que comprende 0, 0.1 , 0.25, 0.5 y 1 mM. Inmediatamente después, se mide la evolución en el tiempo de los niveles intracelulares de ROS con medidas cada 5 minutos y por un total de 60 minutos en un fluorímetro lector de placas. Los rangos de las longitudes de onda de excitación/emisión son 485/538 nm.

Los gráficos están representados en unidades arbitrarias de intensidad a lo largo del tiempo (minutos).

Resultados

Transcurridos 55 minutos tras haber sido expuestas a un gradiente de H₂0₂, con las concentraciones 1 mM y 0,5 mM, las células HC016 contienen niveles de MROs intracelulares significativamente menores que las células ASC (1 1 % inferior); two-way ANOVA test P<0,031 y (15% inferior); two-way ANOVA test P<0,039, respectivamente) tras haber sido expuestas a un gradiente de H₂0₂ (Fig. 2). El tratamiento que genera las HC016 a partir de las ASC no induce la misma respuesta en otras células de mamífero como las células oligodendrogliales HOG (Fig. 2). Además, la presencia de niveles intracelulares inferiores de ROS en las células HC016, indica de forma indirecta, que los niveles extracelulares de esta molécula también disminuyen, que las células HC016 tienen una mayor capacidad de eliminar el peróxido de hidrógeno de su entorno, convirtiéndolas en células con una mayor capacidad detoxificante del H₂0₂ en el lugar de aplicación como terapia celular. Ejemplo 5: Niveles intracelulares de glutation total (GSH).

Los grupos experimentales consisten en dos lotes independientes de ASCs y HC016. Las ASC han sido cultivadas con la metodología y los medios descritos anteriormente. Las ASCs han sido extraídas y aisladas del tejido adiposo humano siguiendo los métodos descritos y subcultivadas en medio de crecimiento para obtener la población de células necesaria para esta experimentación. También se genera un lote de HC016 con el mismo número de células con la metodología descrita anteriormente.

Tras el proceso de condicionamiento, las células son recogidas mediante la digestión con 0,05 tripsina/EDTA, sus proteínas son extraídas mediante la incubación de las células con un buffer de lisis (inhibidor de proteasas, EDTA y Tritón X-100 en tampón de fosfato de sodio a pH 7,5) y la proteína total en el sobrenadante es cuantificada siguiendo el protocolo y los reactivos suministrados con el kit BioRad DC Protein assay.

En otra alícuota del sobrenadante se precipitan las proteínas con ácido sulfosalicílico 5% y centrifugación, y los péptidos de bajo peso disueltos en el sobrenadante transferidos para la cuantificación del GSH total y GSSG.

Las muestras para los ensayos de GSH total y GSSG son procesadas en triplicados en placa de 96 pocilios. Para la medición de GSH, las muestras contienen un 5% de proteína purificada, 45% de agua destilada y 50% de buffer de reacción (0,2 M EDTA, DTNB 1 ,2 mg/100 μΙ, 3,6 mg NADPH y 4.5 Unidades de glutation reductasa en tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7,5). Seguidamente se mide la absorbancia a 405 nm cada 15 segundos durante 2,5 minutos. Para medir GSSG, las muestras de proteína purificada son pre-tratadas con 2-vinilpiridina en una relación 96,3%/3,7%; (proteína/reactivo) y son incubadas durante 1 hora a 4^°C. A continuación las muestras se preparan para el análisis combinando un 10% de la muestra pre-tratada, 40% de agua destilada y 50% de buffer de reacción (0,2 M EDTA, DTNB 1 ,2 mg/100 μΙ, 3,6 mg NADPH y 4,5 Unidades de glutation reductasa en tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7,5). Finalmente, se mide la absorbancia a 405 nm cada 15 segundos durante 30 minutos. Los valores de absorbancia son extrapolados a una recta patrón generada mediante la repetición de los mismos pasos pero con concentraciones conocidas de GSH. Los valores se expresan como nmol/mg de proteína. El glutatión total se calcula como

Resultados

Las células HC016 aumentan un 10% su contenido en GSH total comparado con las ASC (Fig. 3). La presencia de niveles superiores de GSH_totai intracelulares en las HC016 confirma la capacidad superior de detoxificacion de estas células, confiriéndoles una resistencia superior ante situación de estrés ambiental o ante incremento de actividad metabólica celular.

Ejemplo 6: Niveles de expresión de genes involucrados en la detoxificación de Metabolitos Reactivos de Oxígeno.

Este análisis comparativo requiere dos grupos experimentales que consisten en células ASC y HC016. Las ASC convencionales son cultivadas con la metodología y medios descritos anteriormente para obtener la población celular necesaria para esta experimentación. Se generó un lote de células HC016 con el mismo número de células mediante la metodología ya descrita en el ejemplo 2.

Una vez que el procedimiento de condicionamiento se ha completado, se recogen las células de cada grupo mediante digestión con 0,05% tripsina/EDTA. Las células son lisadas y se extrae y purifica el mRNA de cada grupo empleando un sistema comercial de filtros de membrana (SuperScript-lll^® First Strand; Invitrogen; Ref. 18080-051 ) que retiene fragmentos de membranas y proteínas celulares. El mRNA es empleado como molde para generar cDNA mediante la técnica de Retro Transcipción-Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) siguiendo los protocolos y reactivos incluidos en el kit comercial (Puré Link™ RNA Micro Kit; Invitrogen; Ref. 91 181 1 ). Volúmenes correspondientes del cDNA de cada grupo experimental son mezclados con volúmenes y concentraciones adecuadas para realizar una Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR) incluyendo secuencias cebadoras diseñadas para unirse a fragmentos específicos de DNA localizados en regiones de exones de los genes Super Oxido Dismutasa 1 , 2 y 3 (SOD1 -3), Catalasa (Cat), Glutation Peroxidasa (GPx) y Glutation Reductasa (GR). Los productos de la PCR de cada grupo experimental son migrados en un gel de agarosa mediante la técnica de electroforesis en un gel de 4% agarosa en 1 x tampón TAE más un volumen de un reactivo comercial que tiñe el DNA a una concentración definida por el fabricante (SYBR Safe DNA gel stain; Invitrogen; Ref. S33102). Los geles son iluminados con luz ultravioleta y se obtiene una imagen digital con la intensidad y localización de las bandas de ADN. La intensidad de cada banda se cuantifica como "densidad óptica" y a este valor se le sustrae el valor de densidad óptica del gel adyacente sin banda y el resultante se normaliza con el valor de densidad óptica de un gen constitutivo definido, el Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa GADPH. Resultados

Los niveles de expresión de genes implicados en metabolismo oxidativo de las células HC016 son diferentes a los de las ASC Fig. 4A. La cuantificación de la expresión de los diferentes genes muestra que en las HC016 el gen SOD1 aumenta un 53% con respecto a las ASC, el gen SOD2 un 37%, el gen SOD3 un 77%, el gen Cat un 78%, el gen GR un 18% y el gen GPx un 6% (Fig. 4B). En cualquier caso, las células HC016 presentan estas defensas antioxidantes intra y extra-celulares con respecto a las ASC (Fig. 4A).

Ejemplo 7: Niveles de expresión de genes y proteínas implicados en citoesqueleto y factores de crecimiento.

Este análisis comparativo requiere dos grupos experimentales que consisten en células ASC cultivadas con los métodos y los medios descritos anteriormente para obtener la población celular necesaria para esta experimentación, y un lote de células HC016 con el mismo número de células que se han generado con la metodología descrita anteriormente. Como en el Ejemplo 6, cuando el proceso de tratamiento se ha completado, cada grupo celular es recogido mediante digestión con tripsina/EDTA, las células son lisadas, el RNA es extraído y purificado, y es empleado para generar cDNA. La reacción PCR se lleva a cabo con el cDNA incluyendo secuencias cebadoras diseñadas para unirse a fragmentos específicos de DNA situados en regiones de exones de los genes β-actina y el factor de crecimiento insulínico tipo I, IGF-1 . Como en el Ejemplo 6, los productos de PCR de cada grupo experimental son migrados en un gel de agarosa mediante la técnica de electroforesis. La densidad óptica de cada banda migrada es medida y a su valor se le sustrae la intensidad del gel y normalizado con respecto al valor de densidad óptica de un gen constitutivo definido, GADPH. Resultados

Los niveles de expresión de los genes relacionados con los componentes del citoesqueleto y factores de crecimiento en las células HC016 son diferentes a los de las ASC Figs. 5A y C. La cuantificacion de la expresión de los diferentes genes muestra que en las HC016 el gen β-Actina aumenta un 59% (Fig. 5B) y el gen IGF-I aumenta un 64%, con respecto a las ASC (Fig. 5D).

Ejemplo 8: Composición v distribución de moléculas del citoesqueleto.

Este análisis comparativo requiere dos grupos experimentales que consisten en células ASC convencionales que son cultivadas con los métodos y los medios descritos anteriormente para obtener la población celular necesaria para esta experimentación, y un lote de células HC016 con el mismo número de células que se han generado con la metodología descrita anteriormente. Las células de ambas poblaciones son sembradas en placas de 24 pocilios con el medio y la metodología descrita anteriormente. Cuando estas células están adheridas, se elimina el medio y se añade PBS 1 x en el pocilio. A continuación se fijan las células añadiendo 4% formaldehído en PBS 1 x durante 12 minutos, son permeabilizadas con 0,1 % Tritón X-100 en PBS 1 x durante 10 minutos a 4°C, lavadas de nuevo en PBS 1 x e incubadas con 100 g/ml de Faloidina-FITC (Sigma-Aldrich; Ref. P5282) en PBS 1 x durante 1 hora a temperatura ambiente (-23 °C). Más tarde, las células son lavadas con PBS 1 x, sus núcleos son teñidos con 10 μg/ml de Hoechst 33258 (Invitrogen; Ref. H1398) y finalmente cubiertas con una fina capa de Fluoromont-G (Southern Biotech; Ref. 0100-01 ) y visualizadas con un microscopio de fluorescencia.

Resultados

El citoesqueleto de las células HC016 tiene más filamentos de F-actina y más densos que las células ASC, organizándose en fibras de estrés. La observación de las células ASC y HC016 al microscopio muestran cualitativamente que las HC016 poseen más filamentos de F-actina y más densos que las ASC (Fig. 6), lo que confiere un citoesqueleto más robusto y más preparado ante una posible remodelación estructural. En el Ejemplo 7 se ha mostrado la cuantificacion de la expresión del gen que codifica los monómeros de F-actina, β-actina (Fig 5A-B). Ambos dos resultados indican el aumento de la síntesis de F-actina, y este último su efecto sobre el citoesqueleto. Ejemplo 9: Capacidad de protección de las células de linaje neural con las células HC016.

Los grupos experimentales consisten en células oligodendrogliales HOG sin ningún tipo de modificación en su proceso normal de cultivo, células HOG cultivadas en un medio oxidativo, células HOG co-cultivadas con ASC en un ambiente oxidativo y células HOG co-cultivadas con HC016 en un ambiente oxidativo.

Las células HOG son células de oligodendroglioma humano consideradas como un modelo experimental de oligodendrocito. Las células HOG tienen capacidad proliferativa y carga genética de oligodendrocito.

Se generan dos poblaciones con mismo número de células de ASC y HC016 con los métodos descritos en el Ejemplo 1 y 2, respectivamente. El día del experimento las células son recogidas mediante digestión con 0,05% tripsina/EDTA para ser incluidas en el sistema de co-cultivo in vitro basado en las cámaras de Boyden incluidas en placas de 24 pocilios (insertos de las placas de transweil) que evitan el contacto físico entre las dos poblaciones celulares. El día del experimento los oligodendrocitos son sembrados y cuando están adheridos al fondo de la placa de 24 pocilios son cultivados en un medio oxidativo (0,5 mi de 0,5 mM H₂0₂ en medio de cultivo). Tras el estímulo oxidativo, el medio es reemplazado por medio de cultivo fresco compuesto por DMEM con 10% suero bovino fetal y antibióticos a 37°C.

En el siguiente paso, se introducen las células en co-cultivo, las células ASC o las HC016 son incluidas en la cámara de Boyden (insertos de las placas de transweil) como corresponde con los grupos experimental descritos anteriormente. La viabilidad de los oligodendrocitos es cuantificado mediante el método de exclusión con azul tripan a las 24 y 48 horas tras el estímulo oxidativo.

Se establece la Tasa de Crecimiento como: % Células Vivas - % Células Muertas. Se calcula la Tasa de Crecimiento con respecto a las HOG no oxidadas como: TC_HOG oxidadas/TChlOG control-

Los valores resultantes se normalizan con respecto a las HOG oxidadas y se representan en % como gráficos de barras.

Resultados

Transcurridas 48 horas tras el estímulo oxidativo sobre las células HOG, las co- cultivadas con células HC016, presentan una tasa de crecimiento normalizada con respecto a las HOG oxidadas un 21 % superior (Fig. 7) que las co-cultivadas con ASC. Si bien a las 24 horas ambos tipos celulares favorecen la viabilidad de las HOG oxidadas en igual medida (Fig. 7), es a medio plazo cuando las HC016 presentan un efecto más duradero sobre las HOG oxidadas. La aplicación de estas células como terapia celular in vitro resulta más beneficiosa sobre la aplicación con respecto a las ASC, puesto que las HC016 permiten mejorar y aumentar en el tiempo, las propiedades protectoras de las ASC sobre otros tipos celulares sometidos a estrés, como se produce en condiciones de daño tisular, en las enfermedades referidas en este documento.

Ejemplo 10: Capacidad de migración de las HC016 hacia la señalización celular originada tras la inflamación/estrés oxidativo.

Los grupos experimentales consisten en células oligodendrogliales control sin ninguna modificación en el procedimiento de cultivo, células oligodendrogliales cultivadas en un ambiente oxidativo, co-cultivo de ASC con células oligodendrogliales en un ambiente oxidativo y co-cultivo de HC016 con células oligodendrogliales en un ambiente oxidativo.

Para analizar la capacidad de migración de las células ASC y HC016, se generó un modelo de estrés oxidativo con células de mamífero (células oligodendrogliales) cuya proliferación y viabilidad es sensible a las condiciones de estrés oxidativo. El modelo de estrés oxidativo consiste en células oligodendrogliales HOG sembradas y adheridas a la base de una placa de 24 pocilios y cultivadas en un ambiente oxidativo (0,5 mi de 0,5 mM H₂0₂ en medio de cultivo). Tras el estímulo oxidativo, el medio se reemplaza con medio de cultivo fresco compuesto de DMEM con 10% suero fetal bovino y antibióticos a 37°C. El siguiente paso consiste en incluir las células ASC o HC016 en co-cultivo mediante la cámara de Boyden (insertos de placa de transweil) como corresponde a los grupos experimentales descritos anteriormente. Transcurridos 24, 48 y 72 horas, los transweil son retirados de la placa, lavados con PBS 1 x durante 10 minutos y fijados con paraformaldehído 4% en PBS 1 x durante 12 minutos. Las células en la superficie superior de la membrana transweil donde se sembraron las células son eliminadas con un bastoncillo de algodón y las células restantes son teñidas con una solución de 0,1 % de cresil violeta durante 1 hora a temperatura ambiente (-23 °C). Seguidamente, las membranas son lavadas con PBS 1 x y finalmente retiradas de los insertos y montadas sobre portaobjetos y cubiertos con una fina capa de medio de montaje DPX (Sigma-Aldrich; Ref. 44581 ) y un cubreobjetos. Las membranas son visualizadas en un microscopio y se adquieren imágenes representativas y se cuenta el número de células por área en cada grupo experimental.

La cuantificación está expresada en número de células migradas por mm². Resultados

Se analizaron un total de 10 campos de 0,57 mm² cada uno (Fig. 8) haciendo un total de 5,7 mm². En esta área, a las 48 y 72 horas, las células HC016 tienen una capacidad migratoria 32,75 veces (3.275%) superior y 20,61 veces (2.061 %) superior (Fig. 8) que las ASC hacia la zona de células dañadas por estrés oxidativo. En definitiva, el tratamiento que genera las HC016 potencia de una manera muy acentuada, y superior a las ASC convencionales, la capacidad quimiotáctica de las células HC016 hacia las células, HOG en este caso, dañadas por el H₂0₂ extracelular. El quimiotactismo que pueden emitir las células HOG tras la aplicación del H₂0₂ puede verse relacionado con fenómenos como el estrés oxidativo y componentes de la inflamación en los que se produzca una liberación de metabolitos reactivos del oxígeno. Ejemplo 1 1 : Preparación de la forma farmacéutica de las células HC016.

Las células HC016 se prepararon según la formulación farmacéutica que da lugar al medicamento de terapia celular, para su aplicación en el modelo animal y determinación de su eficacia: Así, una vez realizado el tratamiento que da lugar a las células HC016, a partir de las ASC, según lo especificado en el ejemplo 2, se llevó a cabo su disposición en viales de cristal apirógeno. Para ello, las células HC016 fueron despegadas del frasco de cultivo mediante la aplicación de una solución de tripsina-EDTA 0.05%, la actividad de la enzima fue neutralizada mediante la adición de SBF (Biochrom) y se llevó a cabo la centrifugación a una velocidad de 400g de la suspensión celular obtenida. Se eliminó el sobrenadante, el pellet celular se resuspendio en suero fisiológico (Grifols) y se llevó a cabo una nueva centrifugación para eliminar cualquier resto de soluciones anteriores. Se descartó el sobrenadante y las células fueron resuspendidas en una solución inyectable (Ringer- Lactato al 95% (Grifols) y 5% de Albúmina humana (CSL-Behring). Se realizó el recuento celular y análisis de la viabilidad mediante un hemocitómetro, y la solución celular fue ajustada a una concentración de 200.000 células/μΙ.

El producto farmacéutico preparado para su aplicación mediante inyección estereotáxica en el modelo animal, está compuesto de: una solución de 50 μΙ de células HC016 viables a una concentración de 200.000 células/μΙ en Ringer-Lactato al 95% (Grifols) y 5% de Albúmina humana (CSL-Behring), dispuesta en viales de cristal estéril y apirógeno (Sword Scientific).

Ejemplo 12: Capacidad de protección y/o rehabilitación funcional motora de una terapia celular basada en la aplicación de HC016 en un modelo animal de lesión medular.

Los grupos experimentales consisten en tres grupos de 10 ratas Sprague-Dawley adultas de 250-300 grs. de peso a las que, bajo anestesia general con isoflurano 3-4% se les realiza una laminectomía a nivel torácico y se expone la medula espinal. Sobre la cara dorsal de la médula espinal se aplica una lesión medular moderada por contusión calibrada y definida mediante una serie de parámetros tales como distancia y peso cargado en un émbolo metálico de diámetro conocido. El primer grupo de 10 animales recibe la lesión medular y no recibe terapia alguna. El segundo grupo de 10 animales recibe la lesión medular y se les aplica una terapia celular basada en ASC. El tercer grupo de 10 animales recibe la lesión medular y se les aplica una terapia celular basada en HC016. Las terapias celulares, ASC y HC016, se aplican 48 horas tras la lesión mediante inyección estereotáxica en 6 puntos de la médula a niveles superiores e inferiores a la lesión. Cada inyección consiste en 1 μΙ de solución salina con 200.000 células, haciendo una dosis total de 1 .200.000 células. Las ratas están en todo momento supervisadas en un animalario y reciben comida y bebida ad libitum. La capacidad de protección y/o rehabilitación funcional motora en cada uno de los grupos viene determinada por un test funcional que tras 1 , 2, 3, 4, 6 y 8 semanas explora la locomoción en campo abierto. Este examen se conoce como escala Basso- Beattie- Bresnahan (BBB score) y es un método fiable y sensible que alcanza una puntuación de 21 y que aporta una medida semicuantitativa de la recuperación a corto, medio y largo plazo (Basso, Beattie y Bresnahan, 1995. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12;1 -21 ).

La cuantificación está expresada como media estadística (±SEM) del valor en la escala BBB de cada grupo experimental en cada tiempo de exploración. Resultados

La aplicación de una terapia celular basada en HC016 tras una lesión medular favorece la recuperación de las habilidades motoras analizadas en el test BBB. De acuerdo con la escala de este test, los valores indican que esta recuperación está al menos un punto por encima de la terapia basada en ASC convencionales en todos los tiempos analizados, 1 , 2, 3, 4, 6 y 8 semanas tras la lesión (Fig. 9). La evolución de recuperación muestra que la terapia con HC016 acorta el tiempo de obtención de la mejor puntuación, obtenida en la octava semana con las HC016.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Método de tratamiento de células madre mesenquimales que comprende la obtención y aislamiento de las células madre mesenquimales y cultivo de las células en un medio de tratamiento, caracterizado por que dicho medio de tratamiento comprende un agente oxidante.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por que las células mesenquimales son aisladas a partir de tejido adiposo, médula ósea, cordón umbilical y/o placenta.

3. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que las células mesenquimales son aisladas a partir de tejido adiposo humano.

4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el agente oxidante es seleccionado del grupo que consiste en: peróxido de hidrógeno (H₂0₂), peróxido de calcio (Ca0₂), peróxido de magnesio (Mg0₂), peróxido de zinc (Zn0₂), peróxido de manganeso (Mn0₂), peróxido de plomo (Pb0₂) y óxido nítrico (NO), óxido nitroso (N₂0), ozono (0₃), perborato sódico (NaB0₃), dióxido de selenio (Se0₂), óxido de plata (Ag₂0), sales férricas como el cloruro férrico (FeCI₃), sales de cobre como percarbonato sódico (2Na₂C0₃), permanganatos como el permanganato potásico (K₂Mn₂0₈), dicromatos como el dicromato potásico (K₂Cr₂0₇), sales de litio, sodio y calcio del ácido hipocloroso (HCIO-), clorito sódico (NaCI0₂), ácido dórico (HCI0₃), clorato potásico (KCI0₃), hidróxido de aluminio (Al₂0₃), hidróxido de aluminio coprecipitado con carbonato de magnesio (MgC0₃), trióxido de arsénico (As(OH)₃), peróxido de benzoilo ((C₆H₅CO)₂0₂), hidróxido de calcio (Ca(OH)₂), hidrocloruro de clordiazepóxido, óxido cúprico (CuO), óxidos de hierro, óxido de magnesio (MgO), dióxido de magnesio, hidróxido de magnesio(Mg(OH)₂), hidróxido de potasio (KOH), hidróxido de sodio (NaOH), óxido de titanio (Ti0₂) y/o óxido de zinc (ZnO).

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho cultivo de las células en un medio de tratamiento comprende dos ciclos consecutivos de tratamiento con un intervalo de 48-72 horas, seguido de un tercer ciclo de precondicionamiento de 24-48 horas en un soporte experimental.

Método de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que dicho cultivo de las células en un medio de tratamiento comprende las siguientes etapas: a) Primer ciclo: Disposición de las células en una superficie de cultivo y dejar un tiempo de acondicionamiento comprendido entre 4 y 8 horas para que las células de adhieran y adquieran su morfología típica.

b) Adicionar el medio de tratamiento hasta alcanzar una concentración final de H₂0₂ comprendida entre 0,01 y 0,05 mM. .

c) Mantener 48-72 horas en el incubador a 37⁵C y una atmósfera con un 5% de-C0₂.

d) Segundo ciclo: Renovar el medio de tratamiento hasta alcanzar otra vez una concentración final de H₂0₂ comprendida entre 0,01 y 0,05 mM.

e) Incubar estas células 48-72 horas a 37⁵C con un 5% de C0₂.

f) Tercer ciclo: Renovar el medio de tratamiento aplicando de nuevo dicho medio hasta alcanzar una vez más una concentración final de H₂0₂ comprendida entre 0,01 y 0,05 mM.

g) Incubar estas células 24-48 horas a 37⁵C con un 5% de C0₂.

Método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que el medio de tratamiento utilizado en las etapas b), d) y f) comprende medio de cultivo celular convencional en concentraciones de 85-95%, suero bovino fetal en concentraciones de 5-15%, antibióticos en concentraciones de 0.5-5% y peróxido de hidrógeno en concentraciones de 0.01 -0.05 mM.

Células madre mesenquimales obtenidas directamente a partir del procedimiento de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizadas por presentar un aumento de la expresión del gen SOD1 de al menos el 30% respecto a células no tratadas ASC, dicho aumento medido mediante PCR.

9. Células madre mesenquimales de acuerdo con la reivindicación 8 caracterizadas por presentar un aumento de la expresión del gen SOD2 de al menos el 25% respecto a células no tratadas ASC, dicho aumento medido mediante PCR.

10. Células madre mesenquimales de acuerdo con la reivindicación 9 caracterizadas por presentar un aumento de la expresión del gen SOD3 de al menos el 50% respecto a células no tratadas ASC, dicho aumento medido mediante PCR.

1 1 . Células madre mesenquimales de acuerdo con la reivindicación 10 caracterizadas por presentar un aumento de la expresión del gen Cat de al menos el 50% respecto a células no tratadas ASC, dicho aumento medido mediante PCR.

12. Células madre mesenquimales de acuerdo con la reivindicación 1 1 caracterizadas por presentar un aumento intracelular de GSH de al menos el 8% respecto a células no tratadas ASC, dicho aumento medido mediante el método enzimático de Tietze.

13. Células madre mesenquimales de acuerdo con la reivindicación 12 caracterizadas por presentar una disminución del nivel intracelular de MROs de al menos el 10% respecto a células no tratadas ASC, dicha disminución medida mediante cuantificación fluorimétrica con la sonda DCFA.

14. Células madre mesenquimales de acuerdo con la reivindicación 13 caracterizadas por presentar un aumento de beta-actina de al menos el 40% respecto a células no tratadas ASC, dicho aumento medido mediante PCR.

15. Células madre mesenquimales de acuerdo con la reivindicación 14 caracterizadas por presentar un aumento de IGF-1 de al menos el 40% respecto a células no tratadas ASC, dicho aumento medido mediante PCR.

16. Uso de las células de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 15 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas y causadas por estrés oxidativo y/o condiciones de evolución degenerativa debido a componentes mediados por especies reactivas de oxígeno.

17. Uso de las células de acuerdo con la reivindicación 16 para el tratamiento de enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en: periarteritis nodosa, diabetes mellitus, enfermedad granulomatosa crónica, arteriosclerosis, ictus, fibrosis pulmonar (enfermedad pulmonar obstructiva crónica, EPOC, fibrosis pulmonar idiopática), síndrome de isquemia reperfusión, Alzheimer, Parkinson, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad intestinal inflamatoria: colitis ulcerosa y enfermedad de Chron, síndrome de distrés respiratorio del adulto, atherosclerosis, lesión medular, lesiones en nervios periféricos, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, ataxia de Friedreich, periodontitis, enfermedades de las mucosas y enfermedades y traumatismos que cursan con un componente inflamatorio, úlceras y heridas agudas y crónicas.