PT2730650T

PT2730650T - Método para o processamento de células estaminais mesenquimatosas e utilização das mesmas no tratamento de doenças associadas ao stress oxidativo

Info

Publication number: PT2730650T
Application number: PT117647941T
Authority: PT
Inventors: Begoña Castro María; Díez García Javier
Original assignee: Histocell Sl
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2017-03-23
Also published as: MX2013014307A; DK2730650T3; AU2011372711A1; US20140154221A1; CA2839106A1; AU2011372711B2; JP2014520521A; US9080153B2; KR20140148284A; CN103687940B; JP5908582B2; ES2620258T3; CA2839106C; BR112013032659A2; EP2730650B1; BR112013032659B1; MX342200B; EP2730650A1; WO2013004859A1; KR101811481B1

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODO PARA O PROCESSAMENTO DE CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMATOSAS E UTILIZAÇÃO DAS MESMAS NO TRATAMENTO DE DOENÇAS ASSOCIADAS AO STRESS

OXIDATIVO

ASPETO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de tratamento para células estaminais mesenquimatosas, células diretamente obtidas através deste método e à sua utilização no cuidado de doenças causadas por, ou relacionadas com, stress oxidativo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 potencial das células estaminais baseia-se na sua capacidade de diferenciação em tipos celulares definidos e integração em tecidos e órgãos correspondentes. Outra caracteristica vantajosa das células estaminais consiste na sua libertação parácrina de citocinas, interleucinas, fatores tróficos e fatores de crescimento.

Investigação e ensaios clínicos atuais têm sido desenhados para avaliar o efeito terapêutico das células estaminais em várias patologias e existe uma demanda crescente de terapêuticas baseadas em células estaminais.

Determinadas doenças degenerativas do sistema respiratório, sistema cardiovascular, sistema imunitário, sistema/função endócrinos, sistemas nervosos central e periférico, lesão da medula espinal, lesão por isquemia/reperfusão e doenças desmielinizantes têm um componente inflamatório mediado por espécies reativas de oxigénio (ROS) nomeado stress oxidativo.

As espécies reativas de oxigénio, principalmente o radical anião superóxido (02“) e o seu produto de dismutação H202, são subprodutos residuais naturais nas mitocôndrias das células onde ocorre a cadeia respiratória, um fenómeno vital para a vida celular devido à sua função na geração da molécula de energia (ATP).

As mitocôndrias são o compartimento com maior atividade redox das células de mamífero, sendo responsável por mais de 90 % da transferência de eletrões para ο O2 como o aceitador de eletrões terminal. A transferência de eletrões predominante ocorre através de um circuito redox central que utiliza a energia potencial disponível a partir da oxidação de vários substratos metabólicos (por exemplo, piruvato, ácidos gordos) para gerar ATP. A regulação deste processo é central para a função celular uma vez que as células devem produzir ATP ao mesmo tempo que mantêm uma homeostasia apropriada em termos de fornecimento de aminoácidos não essenciais, eliminação de excesso de aminoácidos, fornecimento de glucose e interconversão de precursores energéticos para permitir um fornecimento de energia a longo prazo perante uma ingestão alimentar variável e intermitente. Parte da regulação parece ocorrer através de uma baixa taxa contínua de geração de ROS e sensores moleculares. Sabe-se que o conjunto de circuitos redox associado para esta regulação, embora esteja pouco definido, requer um ambiente redox especializado.

Sob um stress oxidativo excessivo, o colapso simultâneo do potencial de geração de ATP das mitocôndrias e um aumento transitório na geração de ROS pela cadeia de transferência de eletrões, podem resultar na libertação mitocondrial de ROS para o citosol. Isto pode desencadear uma "libertação de ROS induzida por ROS" em mitocôndrias vizinhas. Consequentemente, embora uma taxa baixa de geração de ROS seja um processo normal nas mitocôndrias, a interrupção do fluxo de eletrões com uma geração excessiva de ROS pode resultar em senescência, apoptose e morte celular. Go e Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273-1290); Zorov, Juhaszova e Sollott. 2006. Mitochondrial ROS-induced ROS release: an update and review. Biochim Biophys Acta 1757 (509-517).

Com efeito, estes processos são diretamente relevantes para as doenças relacionadas com o stress oxidativo mitocondrial como a doença de Parkinson, ataxia de Friedrich, doença de Huntington e diabetes. Go e Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273-1290); Dringen, Gutterer e Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain. Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916);

Chinta e Andersen, 2008. Redox imbalance in Parkinson's disease. Bio-chimica et Biophysica Acta 1780 (1362-1367); Cohen, 2000. Oxidative stress, mitochondrial respiration, and Parkinson's disease. Ann N Y Acad Sci 899 (112-120); Lodi, Tonon, Calabrese e Schapira, 2006. Friedreich's ataxia: from disease mechanisms to therapeutic interventions. Antioxid Redox Signal 8 (438-443); McGill e Beal, 2006. PGC-lalpha, a new therapeutic target in Huntington's disease? Cell 127 (465-468); Donath, Ehses, Maedler, Schumann, Ellingsgaard, Eppler e Reinecke, 2005. Mechanisms of beta-cell death in type 2 diabetes. Diabetes 54 (Suppl 2) (S108-S113).

Os peróxidos, incluindo peróxido de hidrogénio (H2O2) , são uma das espécies reativas de oxigénio (ROS) principais que levam ao stress oxidativo. H2O2 é continuamente gerado por várias enzimas (incluindo superóxido dismutase, glucose oxidase, e monoamina oxidase) e deve ser degradado para impedir o dano oxidativo. Acredita-se que o efeito citotóxico de H2O2 seja causado por radicais de hidroxilo gerados a partir de reações catalisadas por hidroxilo, causando dano subsequente ao ADN, proteínas e lípidos da membrana. Ο H2O2 atua como um "substrato suicida" a concentrações elevadas (>100 μΜ), conduzindo a uma inativação irreversível da catalase. Hyslop, Zhang, Pearson e Phebus, 1995. Measurement of striatal H202 by micro-dyalysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H202 in vitro. Brain Res 671 (181-186) . Ο H2O2 provoca o esgotamento de glutationa intracelular, uma molécula que remove H2O2 da célula, sugerindo que ο H2O2 entra nas células e, portanto, pode desencadear uma ou mais vias tóxicas nas células. Dringen, Pawlowski e Hirrlinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Halliwell e Whiteman, 2004. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? British Journal of Pharmacology 142 (231-255); Baud, Greene, Li, Wang, Volpe e Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531-1540) .

As células também sintetizam moléculas antioxidativas e têm mecanismos para reciclá-las. A glutationa (GSH) é uma das principais proteínas envolvidas na maquinaria antioxidante que elimina ο H2O2, juntamente com a sua forma oxidada GSSG e enzimas relacionadas qlutationa peroxidase (GPx), qlutationa redutase (GR) , qlutaredoxina e NADPH/NADP+. Uma variedade de estudos que utilizam modelos de culturas celulares apoiam o papel crucial desempenhado pelo GSH nas mitocôndrias como um efeito protetor na morte celular apoptótica. Na apoptose, a morte celular proqramada, a oxidação de GSH/GSSH mitocondrial estimula o esqotamento de GSH resultando em ROS aumentadas, suqerindo um papel para GSH no controlo da qeração mitocondrial de ROS. Dringen, Pawlowski e Hirrlinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Dringen, Gutterer e Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain. Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916) .

Outra enzima na maquinaria antioxidante que elimina o peróxido de hidrogénio é a catalase. A catalase é uma enzima citoplasmática que é de especial relevância quando é necessária a eliminação de H2O2 em elevadas concentrações. Baud, Greene, Li, Wang, Volpe e Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531-1540).

Também foi avaliado que as hMSCs possuem os principais mecanismos enzimáticos e não enzimáticos para destoxificar as espécies reativas e para corrigir o dano oxidativo do proteoma e genoma que asseguram a gestão eficaz de ROS. Valle-Prieto e Conget, 2010. Human Mesenchymal Stem Cells efficiently manage oxidative stress. Stem Cell Dev 19 (1885-1893) . Se este potencial for mantido in vivo, As hMSCs também poderiam contribuir para a regeneração dos tecidos limitando o dano tecidual induzido por ROS.

Algumas tentativas bem-sucedidas para modificar a síntese de enzimas envolvidas na eliminação de ROS descrevem que as células do estroma da medula óssea humana cultivadas na presença de ascorbato expressam níveis mais elevados de superóxido dismutase, catalase e glutationa (Stolzing e Scutt, 2006. Effect of reduced culture temperature on antioxidant defenses of mesenchymal stem cells. Free Radic Biol Med 41(326-338). Além disso, no artigo, Ebert, Ulmer, Zeck, Meissner-Weigl, Schneider, Stopper, Schupp, Kassem e Jacob, 2006.

Selenium supplementation restores the antioxidative capacity and prevents cell damage in bone marrow stromal cells in vitro. Stem Cells 24(1226-1235), os autores descrevem a regulação positiva da capacidade antioxidante basal de BMMSCs através da modificação das condições de cultura celular com suplementação de selénio ou redução da temperatura. Stolzing e Scutt (2006) publicaram que a redução da temperatura nestas BMMSC não afeta a sua viabilidade mas que aumenta a sua diferenciação. Por outro lado, células estaminais obtidas diretamente a partir do método de tratamento da presente invenção, células designadas HC016, não mostram qualquer evidência de diferenciação, mantendo o seu fenótipo indiferenciado e também a sua viabilidade.

Além disso, Ebert et al., 2006 demonstram que a suplementação de selénio do meio de cultura de BMMSC com selenito de sódio a 100 nM aumenta exclusivamente a atividade de enzimas intracelulares dependentes de selénio, como glutationa peroxidase (GPx) e tioredoxina redutase (TrxRs). Por outro lado, as células HC016 mantêm a sua viabilidade, capacidade proliferativa e fenótipo indiferenciado, e também ativam genes que codificam enzimas independentes de selénio que são chave para a destoxificação de ROS, como superóxido dismutases (SODs) e catalase (Cat), fundamentais para a destoxif icação de ROS. Além disso, As células HC016 têm níveis aumentados de GSH.

Em conclusão, as células HC016 obtidas diretamente com o método de tratamento descrito na presente invenção mostram uma série de vantagens em relação às células estaminais utilizadas no estado da técnica, o que torna as células HC016 especialmente adequadas para atuar em condições de stress oxidativo. Estas vantagens são principalmente 1) geração de um agrupamento intracelular superior da molécula destoxificante GSH, 2) uma expressão superior e aumentada de genes que codificam enzimas envolvidas na eliminação de espécies reativas de oxigénio, 3) uma nova conformação de citoesqueleto e portanto, e consequentemente, uma capacidade de migração mais elevada para as áreas danificadas e 4) uma expressão mais elevada de fatores de crescimento relacionados com processos de regeneração de tecidos.

Estes efeitos adquiridos pelas células HC016, aumentam as suas defesas intracelulares e extracelulares contra ROS, sem gerar qualquer modificação em relação à sua viabilidade e estado de diferenciação. 0 documento WO 2010/150094 descreve um método para a diferenciação in vitro de células estaminais mesenquimatosas em adipócitos e à sua utilização como uma terapêutica celular. O método descrito consiste na cultura dessas células em condições de hipoxia. O documento W02007/030870 proporciona um método para a diferenciação de células estaminais, mais precisamente, células a partir de embriões humanos (células hES), em cardiomiócitos e progenitores neurais através da cultura de células hES num meio sem soro, que adicionalmente contém prostaglandina ou uma molécula de inibição de p38MAP quinase.

Como uma consequência, no estado da técnica existe uma necessidade importante de gerar métodos para obter células estaminais mesenquimatosas com mecanismos enzimáticos e não enzimáticos próprios melhorados ou aumentados focados na eliminação de espécies reativas de oxigénio, e como uma consequência, geram células que poderiam ser mais eficazmente utilizadas em terapêuticas celulares para doenças associadas ao stress oxidativo.

OBJETO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de tratamento para tecido adiposo derivado a partir de células estaminais mesenquimatosas e também à utilização destas células previamente tratadas no cuidado de doenças causadas por, ou relacionadas com, stress oxidativo.

As células estaminais da presente invenção, podem ser obtidas a partir de diferentes origens, entre outras, tecido adiposo, medula óssea, cordão umbilical e/ou placenta, mas preferivelmente, a presente invenção é gerada a partir de células estaminais mesenquimatosas derivadas de tecido adiposo humano, ASC.

Num aspeto da presente invenção, doenças consideradas como estando associadas a, e sendo causadas por, stress oxidativo, ou condições de stress degenerativo devido a componentes mediados por espécies reativas de oxigénio, são aquelas selecionadas a partir do grupo que consiste em: periartrite, diabetes mellitus, doenças granulomatosas crónicas, arteriosclerose, fibrose pulmonar (doença pulmonar obstrutiva crónica, DPOC, fibrose pulmonar idiopática), sindrome de isquemia/reperfusão, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistémico, doença inflamatória intestinal: colite ulcerativa e doença de Crohn, sindrome de dificuldade respiratória do adulto, acidente vascular cerebral, lesão da medula espinal, lesão de nervo periférico, sindrome lateral amiotrófica, doença de Huntington, esclerose múltipla, ataxia de Friedreich, periodontite, doenças da mucosa, doenças e lesões que coexistem com um componente inflamatório, úlceras e feridas agudas e crónicas. 0 ambiente oxidante presente nestas patologias, induz a manutenção e mesmo intensificação do processo inflamatório na área danificada. Este fenómeno é um dos fatores que prejudica a regeneração tecidual, que não é capaz de recuperar devido à elevada quantidade de ROS que é produzida. As células estaminais mesenquimatosas tratadas com o método da presente invenção adquirem uma capacidade mais elevada de sobrevivência no ambiente oxidante produzido nas patologias listadas anteriormente. Este facto produz um aumento na disponibilidade de fatores solúveis a partir de células vivas que promovem a recuperação do tecido danificado.

Como tal, um aspeto da presente invenção é um método de tratamento para células estaminais mesenquimatosas que inclui a obtenção e isolamento de células estaminais mesenquimatosas a partir de um dador humano e a cultura destas células num meio de tratamento definido.

Um aspeto preferencial da presente invenção é a aplicação do método de tratamento anterior para células estaminais mesenquimatosas obtidas a partir de tecido adiposo.

Também é um aspeto da presente invenção um método para a modificação funcional de células estaminais mesenquimatosas, para promover a sua sobrevivência e aumentar a sua capacidade de produzir moléculas envolvidas na destoxificação de espécies reativas de oxigénio.

Outro aspeto da presente invenção refere-se a células estaminais mesenquimatosas obtidas com o método de tratamento da presente invenção que têm uma expressão superior e aumentada de genes envolvidos na destoxificação das espécies reativas de oxigénio, e/ou níveis intracelulares superiores de GSH e/ou alterações conformacionais de citoesqueleto e/ou um aumento na sua capacidade de migração celular, em comparação com células estaminais não tratadas com o método de pré-condicionamento da invenção.

Outro aspeto da presente invenção refere-se à utilização de células estaminais mesenquimatosas tratadas de acordo com a presente invenção que têm níveis intracelulares superiores de GSH, mais preferivelmente, uma expressão superior e aumentada de genes envolvidos na eliminação de espécies reativas de oxigénio, selecionadas a partir do grupo que consiste em: superóxido dismutase citoplasmática S0D1, superóxido dismutase mitocondrial 2 S0D2, superóxido dismutase extracelular 3 S0D3, catalase Cat, glutationa peroxidase GPx e glutationa redutase GR, mais preferivelmente, uma conformação de citoesqueleto diferente e uma expressão superior do gene que codifica beta-actina, e também o fator de crescimento IGF-1, como formulações/reagente terapêuticos na terapêutica celular para o cuidado de doenças causadas por, ou relacionadas com, stress oxidativo.

A presente invenção também se refere à utilização de células mesenquimatosas da presente invenção, administradas numa área adjacente ao tecido danificado, e/ou no epicentro da lesão. DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Capacidade proliferativa medida pelo método MTT de ASC, HC016 (A), HOG e HOG tratadas com o método da invenção (B) e submetidas a stress com um ambiente oxidante (100 μΜ). Pode ser observado que as células HC016 têm um aumento significativo da proliferação celular quando são submetidas a stress num ambiente oxidativo. Este efeito não ocorre quando o mesmo tratamento é aplicado a outros tipos celulares mamíferos como células HOG. 0 asterisco indica p<0,05 num teste t-Student. (Exemplo 3).

Figura 2. Análise cinética de níveis intracelulares de espécies reativas de oxigénio em ASC, HC016, HOG e HOG tratadas com o método da invenção. Esta análise mostra que apenas as células HC016 diminuem significativamente os níveis intracelulares de ROS, principalmente quando são expostas a elevadas concentrações de stress oxidativo. Os asteriscos indicam diferença estatisticamente significativa de acordo com um teste ANOVA de dois fatores (*, P<0,05; **, P<0,01) (exemplo 4).

Figura 3. Níveis intracelulares de glutationa total (GSHtotai) em células ASC e HC016 (Exemplo 5). Em condições de controlo, não submetidas a stress, o tratamento induz um aumento de 10 % nos níveis basais de GSH em HC016 em relação a ASC.

Figura 4A. Níveis de expressão de genes envolvidos na destoxificação de espécies reativas de oxigénio em células ASC e HC016 (Exemplo 6).

Figura 4B. Quantificação da expressão de genes envolvidos na destoxificação de espécies reativas de oxigénio (SODl, SOD2, SOD3, Cat, GR, GPx) em células ASC e HC016. Os valores são expressos como razão de HC016/ASC (Exemplo 6). Figura 5A. Níveis de expressão de genes envolvidos na composição do citoesqueleto (β-Actina) em células ASC e HC016 (Exemplo 7).

Figura 5B. Quantificação da expressão de genes envolvidos na composição do citoesqueleto (β-Actina) em células ASC e HC016 (Exemplo 7). O valor é expresso como razão de HC016/ASC (Exemplo 7) .

Figura 5C. Níveis de expressão do gene que codifica o fator de crescimento IGF-I nas células ASC e HC016 (Exemplo 7). Figura 5D. Quantificação da expressão do gene que codifica o fator de crescimento IGF-I nas células ASC e HC016 (Exemplo 7). O valor é expresso como razão de HC016/ASC (Exemplo 7).

Figura 6. Imagens de microscopia de fluorescência da imunocoloração de F-actina. Pode ser observado um aumento na presença de F-actina nas células HC016, em relação a ASC, e a sua distribuição em fibras de stress, o que significa que as alterações conformacionais do citoesqueleto em HC0156 se relacionaram com as suas capacidades quimiotática e de migração superiores (Exemplo 8) .

Figura 7. Taxa de crescimento de células HOG de linhagem neural depois de insulto de stress oxidativo e efeito da aplicação de ASC e HC016 nesta taxa de crescimento. A cocultura de células HOG submetidas a stress com um ambiente oxidante juntamente com ASC e HC016 aumenta a sobrevivência das células HOG.

No entanto, apenas a cocultura com HC016 sustenta este efeito protetor 48 horas depois da exposição de células HOG ao ambiente oxidativo. 0 asterisco indica uma diferença estatisticamente significativa de acordo com um teste t-Student (p<0,05) (Exemplo 9) .

Figura 8. Imagens representativas e gráficos de barras quantitativos que mostram a capacidade de migração superior significativa das células HC016, em relação às células ASC, em direção a células que sofrem de um insulto de stress oxidativo (Exemplo 10).

Figura 9. Quadro da evolução da pontuação BBB (Basso-Beattie-Bresnahan) de três grupos experimentais de ratos com uma lesão na medula espinal que consistem em, ratos não tratados, tratados com ASC e tratados com HC016 (Exemplo 12).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se num aspeto a um método de tratamento para células estaminais mesenquimatosas, preferivelmente a partir do tecido adiposo, significando obtido e/ou isolado a partir de tecido adiposo adulto e mais precisamente de origem animal, preferivelmente de um ser humano. Este procedimento requer principalmente duas etapas definidas, em primeiro lugar, obtenção e isolamento de células estaminais mesenquimatosas, e segundo, um período de crescimento e tratamento específico de células num meio de tratamento definido que inclui um agente oxidativo.

Aquisição de células ASC:

Em relação a esta etapa, o procedimento inclui primeiramente a aquisição e isolamento das células estaminais mesenquimatosas. A origem das células estaminais mesenquimatosas pode ser selecionada a partir de um grupo que consiste em tecido adiposo, medula óssea, cordão umbilical e/ou placenta, preferivelmente, a presente invenção é gerada a partir de células estaminais mesenquimatosas derivadas de tecido adiposo humano, ASC.

Como tal, preferivelmente, na presente invenção, a fração de células estaminais mesenquimatosas derivadas de tecido adiposo é extraída a partir de lipoaspirados a partir de pacientes humanos saudáveis sob anestesia. 0 lipoaspirado é doado por pacientes depois do consentimento informado. Os lipoaspirados são depois lavados com lx PBS e digeridos com colagenase tipo I durante 30 minutos a 37 °C e posteriormente centrifugados para obter um pélete celular. Este pélete é ressupenso em tampão de lise de eritrócitos e a suspensão celular purificada é filtrada através de uma malha de nylon de 100 pm e centrifugada novamente. Depois da ressuspensão das células, estas são semeadas em frascos de cultura, para proceder com a expansão da colónia celular.

Os processos de expansão ou subcultura da colónia celular que são utilizados na presente invenção incluem destacamento de células de recipientes de cultura, através de incubação com uma solução de tripsina/EDTA, centrifugação da suspensão celular recolhida, determinação da densidade e viabilidade celular e sementeira dessas células em novos recipientes de cultura celular. A recolha celular na presente invenção segue a metodologia descrita no estado da técnica, conforme indicado nas publicações: Yoshimura, Shigeura, Matsumoto, Sato, Takaki, Aiba-Kojima, Sato, Inoue, Nagase, Koshima e Gonda, 2006. Characterization of Freshly Isolated and Cultured Cells Derived From the Fatty and Fluid Portions of Liposuction Aspirates. J Cell Physiol 208(64-76); Almeida, Campa, Alonso-Vale, Lima, Daud e Stocchero, 2008. Fracción vascular estromal de tejido adiposo. Cir.plást. iberolatinoam. 34 (71-79);

Wagner, Wein, Seckinger, Frankhauser, Wirkner, Krause, Blake,

Schwager, Eckstein, Ansorge e Ho, 2005. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Experimental Hematology 33 (1402-1416). Método de tratamento celular. Aquisição de células HC016:

Uma vez obtido o número de células apropriado, entre 300.000 -2.000.000, estas são processadas com um tratamento que requer as células em contacto com uma concentração definida de um agente oxidante depois de períodos de tratamento específicos.

Agentes oxidativos são considerados, por exemplo, óxidos e/ou peróxidos, entre outros, peróxido de hidrogénio (H2O2), peróxido de cálcio (CaCh) , peróxido de magnésio (MgCh) , peróxido de zinco (ZnCh) , peróxido de manganésio (MnCh) , peróxido de chumbo (PbCh) , óxido nítrico (NO), óxido nitroso (N20), ozono (O3) , perborato de sódio (NaBOs) , dióxido de selénio (SeCU) , óxido de prata (Ag20) , sais férricos como cloreto férrico (FeCls) , sais de cobre como hidróxido cúprico (CuOH, Cu(OH)2), percarbonatos como percarbonato de sódio (2Na2<303) , permanganatos como permanganato de potássio (fbM^Os) , dicromatos como dicromato de potássio (K2Cr207) , sais de lítio, sódio e cálcio de ácido hipocloroso (HC10-), clorito de sódio (NaC102) , ácido clórico (HC103) , clorato de potássio (KC103) , hidróxido de alumínio (AI2O3) , hidróxido de alumínio coprecipitado com carbonato de magnésio (MgCCh) , trióxido de arsénico (As(OH)3) , peróxido de benzoílo ((C6H5CO)2O2) , hidróxido de cálcio (Ca(OH)2), cloridrato de clordiazepóxido, ácido cúprico (CuO), óxido de ferro, óxido de magnésio (MgO), dióxido de magnésio, hidróxido de magnésio (Mg(OH)2), hidróxido de potássio (KOH), hidróxido de sódio (NaOH), óxido de titânio (T1O2) , óxido de zinco (ZnO) e outros agentes oxidantes, preferivelmente peróxido de hidrogénio (H2O2) que pertence ao grupo de espécies reativas de oxigénio (ROS) que é um produto residual da cadeia respiratória mitocondrial e uma molécula de sinalização nos processos inflamatórios. Um aumento de H2O2 acima de determinados valores de tolerância induz a morte celular. No entanto, o presente método de tratamento inclui a cultura de células com H2O2 de uma forma controlada; isto significa com períodos e metodologia controlados e com concentrações definidas que desencadeiam novas funcionalidades e características nas células estaminais mesenquimatosas diretamente obtidas com este tratamento.

Mais precisamente, o método de tratamento desenvolvido na presente invenção inclui cultivar as células num meio oxidativo moderado, seguindo períodos de tratamento definidos.

Em termos gerais, o método de tratamento inclui dois ciclos consecutivos de tratamento dentro de um intervalo de tempo de 48-72 horas, seguido por um terceiro ciclo de tratamento de 24-48 horas no recipiente experimental.

Em detalhe, o período de tratamento inclui as seguintes etapas: a) Primeiro ciclo: Semear células num recipiente de cultura e esperar durante o período de adaptação das células entre 4 a 8 horas para permitir que as células se adiram e adquiram a sua morfologia típica. b) Adicionar o meio de tratamento, composto por DMEM mais FBS a 10 % e uma solução de H2O2, até se atingir uma concentração final no intervalo de 0,01 e 0,05 mM. c) Manter 48-72 horas na incubadora a 37 °C e numa atmosfera de 5 % C02. d) Segundo ciclo: Renovar o meio de tratamento substituindo-o com DMEM mais FBS a 10 % e uma solução de H2O2, até se atingir uma concentração final no intervalo de 0,01 e 0,05 mM. e) Incubar estas células durante 48-72 horas a 37 °C e numa atmosfera de 5 % CO2. f) Terceiro ciclo: Renovar o meio de tratamento substituindo-o com DMEM mais FBS a 10 % e uma solução de H2O2, até se atingir uma concentração final no intervalo de 0,01 e 0,05 mM. g) Incubar estas células durante 48-72 horas a 37 °C e numa atmosfera de 5 % C02.

Depois deste período de tratamento, as células modificaram as suas características funcionais e morfológicas. A partir deste ponto, o acrónimo HC016 é agora implementado para estas células. Células estaminais mesenquimatosas derivadas de tecido adiposo pré-condicionadas diretamente obtidas a partir do método da presente invenção são caracterizadas no sentido em que estas células estaminais mesenquimatosas mantêm o seu fenótipo indiferenciado, apresentam um citoesqueleto onde os microfilamentos estão organizados em fibras de stress, apresentam um aumento da expressão do gene S0D1 de pelo menos 30 % em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR, apresentam um aumento da expressão do gene SOD2 de pelo menos 25% em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR, apresentam um aumento da expressão do gene SOD3 de pelo menos 50 % em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR, e apresentam um aumento da expressão do gene Cat de pelo menos 50 % em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR.

Meios de cultura ou crescimento incluem os componentes habituais conhecidos no estado da técnica, estes são como tal, meios com uma elevada concentração de glucose (DMEM, Invitrogen) a 85-95 % do volume total, com soro bovino fetal a concentrações de 5-15 % do volume total (Biochrom) e uma solução antibiótica de PSA a uma concentração de 1 % do volume total (Invitrogen).

Igualmente, o meio de tratamento utilizado no método da invenção descrito anteriormente inclui uma concentração elevada de glucose (DMEM, Invitrogen) a 85-95 % do volume total, com soro bovino fetal a concentrações de 5-15 % do volume final (Biochrom) , uma solução antibiótica de PSA a uma concentração de 1 % do volume total (Invitrogen) e peróxido de hidrogénio (H2O2) a concentrações entre 0,01 a 0,05 mM do volume total (Panreac).

Caracterização de células HC016 em comparação com ASC não tratadas com o método da invenção

Como uma consequência do método de tratamento da invenção, as células HC016 da presente invenção adquiriram e apresentam níveis superiores e melhorados de expressão de genes definidos envolvidos na eliminação de espécies reativas de oxigénio, como os genes que codificam as seguintes proteínas: superóxido dismutase 1 citoplasmática SODl, superóxido dismutase 2 mitocondrial SOD2, superóxido dismutase 3 extracelular SOD3, glutationa peroxidase GPx, glutationa redutase GR e catalase Cat, em comparação com ASC não tratadas com o método da invenção. SODl: A enzima superóxido dismutase 1 é uma proteína dimérica que contém cobre (Cu) e Zinco (Zn) como cofatores. SODl encontra-se no citoplasma celular e catalisa a dismutação do superóxido, um produto da cadeia respiratória e a enzima xantina oxidase, em oxigénio e peróxido de hidrogénio através das seguintes reações. • Cu-Zn(n+1) +-SOD + 02" - Cu-Znn+-SOD + 02 • Cu-Znn+-SOD + 02" + 2H+ -> Cu-Zn (n+1)+-SOD + H202 S0D2: A enzima superóxido dismutase 2 é uma proteína tetramérica que contém manganésio (Mn) como cofator. S0D2 encontra-se nas mitocôndrias das células e catalisa a dismutação do superóxido, um produto da cadeia respiratória e a enzima xantina oxidase, em oxigénio e peróxido de hidrogénio através das seguintes reações. • Mn(n+1)+-SOD + 02" - Mn n+-SOD + 02 • Mnn+-SOD + 02" + 2H+ - Mn(n+1) +-SOD + H202 S0D3: A enzima superóxido dismutase 3 é uma proteína homotetramérica que contém cobre (Cu) e Zinco (Zn) como cofatores. S0D3 é libertada para o meio extracelular onde se liga à matriz extracelular através de proteoglicano de sulfato de heparano e colagénio tipo I para catalisar a dismutação de superóxido presente no meio, gerando oxigénio e peróxido de hidrogénio através da seguinte reação. • Cu-Zn(n+1) +-SOD + 02" - Cu-Znn+-SOD + 02 • Cu-Znn+-SOD + 02" + 2H+ - Cu-Zn (n+1)+-SOD + H202

Cat: A enzima catalase é uma proteína tetramérica com quatro cadeias peptídicas e quatro grupos heme de porfirina (Ferro, Fe) que está presente nos peroxissomas da maioria das células aeróbicas como uma enzima chave na defesa contra o stress oxidativo. A catalase reage com o peróxido de hidrogénio e converte-o em água. Embora os seus mecanismos não sejam completamente entendidos, a sua atividade foi descrita de acordo com as seguintes reações. • H202 + Fe (III)-E - H20 + 0=Fe (IV)-E ( .+) • H202 + 0=Fe (IV)-E ( .+) - H20 + Fe (III)-E + 02

Chelikani, Fita e Loewen, 2004. Diversity of structures and properties among catalases. Cell Mol Life Sci 61(192-208). GPx : A enzima glutationa peroxidase é uma das proteínas pequenas conhecidas nos vertebrados superiores que contém selenocisteína. A GPx é principalmente encontrada no citoplasma e participa na destoxificação do peróxido de hidrogénio gerado pela superóxido dismutase e monoamino oxidase através da catalisação da ligação de H2O2 a moléculas de glutationa reduzida (GSH). GR: A enzima glutationa redutase é uma flavoproteína homodimérica. A GR pertence à família da piridina-nucleótido dissulfureto oxidoredutase classe I. Esta enzima participa num ciclo fundamental da defesa antioxidante. A sua atividade consiste na redução de glutationa oxidada (GSSG) para a sua forma sulfidrilo (GSH) , que é uma molécula chave na defesa antioxidante.

0 aumento da expressão de genes envolvidos na destoxificação de ROS foi quantificado em relação às células ASC não tratadas, confirmando que as células HC016 apresentam um aumento na expressão do gene S0D1 de, pelo menos, 30 %, preferivelmente 53 %, um aumento na expressão do gene SOD2 de, pelo menos, 25 %, preferivelmente 37 %, um aumento na expressão do gene SOD3 de, pelo menos, 50%, preferivelmente 77 % e/ou um aumento na expressão do gene Cat de, pelo menos, 50 %, preferivelmente 78 %. A metodologia utilizada para quantificar a expressão superior dos genes de HC016 em relação a ASC, foi a seguinte: Lise celular, extração de ARNm e purificação de cada grupo experimental seguindo o protocolo incluído e descrito no kit comercial de filtros de membrana SuperScript-III® First Strand. Um volume de ARNm serve como um molde para gerar ADNc com a Reação em Cadeia da Polimerase e Transcriptase Reversa (RT-PCR) seguindo os reagentes e protocolos incluídos no Pure Link™ RNA Micro Kit. Os volumes correspondentes de ADNc de cada grupo experimental são processados com a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) incluindo iniciadores específicos que localizam fragmentos de ADN presentes nos genes que codificam a Superóxido Dismutase 1, 2 e 3 (SODl-3), Catalase (Cat), Glutationa Peroxidase (GPx) e Glutationa Redutase (GR). Os produtos de PCR de cada grupo experimental são migrados por eletroforese e o tamanho do fragmento amplificado é determinado e a intensidade de cada banda é quantificada. O valor resultante é normalizado com o valor da intensidade de um gene constitutivo definido,

Gliceraldeído-3-Fosfato desidrogenase, GAPDH.

Além disso, foi demonstrado que as células HC016 têm um nível superior de GSH intracelular de pelo menos 8 %, preferivelmente 10 %, em relação às células ASC. O método utilizado para quantificar o nível superior de GSH nas células HC016 em relação a ASC foi o método enzimático de Tietze, como descrito abaixo: Os grupos experimentais são dois lotes independentes de células, ASC e HC016. Depois do tratamento, as células são recolhidas, as suas proteínas são extraídas através da incubação das células em tampão de Use e a proteína total no sobrenadante é quantificada seguindo o protocolo e reagentes fornecidos com o kit de ensaio BioRad DC Protein. Numa alíquota diferente do sobrenadante, as proteínas são precipitadas e o sobrenadante é transferido para quantificação de GSSG e GSH total. As amostras para os ensaios de GSSG e GSH total são processadas em triplicados numa placa de 96 poços. Para a medição de GSH, as amostras são incubadas com glutationa redutase e depois disto a absorvância a 405 nm é medida a cada 15 segundos durante 2,5 minutos. Para a medição de GSSG, proteínas da amostra purificadas são tratadas previamente com 2-vinilpiridina, posteriormente com glutationa redutase e finalmente a absorvância a 405 nm é medida a cada 15 segundos durante 30 minutos.

Os valores de absorvância são extrapolados para uma curva padrão gerada por repetição destas etapas previamente descritas, mas em vez de utilizar amostras de proteína celular, utilizando concentrações conhecidas de GSH. Os valores são expressos como nmol/mg de proteína. A glutationa total é calculada como: GSHtotai=GSHreduzida + 2GSSGOXidada

Adicionalmente, as células HC016 são caracterizadas por apresentarem níveis inferiores de ROS intracelulares em pelo menos 10 %, preferivelmente 11 %, mais preferivelmente 15 % em comparação com ASC. O método selecionado para quantificar a superioridade dos níveis de ROS intracelulares de HC016 em relação a ASC foi uma quantificação fluorimétrica à base de sonda DCFA: Os grupos experimentais consistem em quatro populações independentes, uma de ASCs, uma segunda de HC016, uma terceira de células HOG intactas e uma quarta de HOG cultivadas com o mesmo tratamento que gera HC016 a partir de ASC. As células são lavadas com PBS lx e depois diacetato de 2',1'-diclorodihidrofluoresceína a 10 μΜ é adicionado durante 30 minutos. Mais tarde, o DCFA é removido por lavagem e novo meio é adicionado. Posteriormente, as células são cultivadas com um meio oxidante através da adição de H202 ao meio num gradiente de concentração de 0, 0,1, 0,25, 0,5 e 1 mM e imediatamente depois disto, é medida a evolução dos niveis de ROS intracelulares a cada 5 minutos e durante um total de 60 minutos num leitor de placas fluorimétrico. Os gráficos são representados como unidades de intensidade de fluorescência arbitrárias ao longo do tempo (minutos).

Adicionalmente, células HC016 tratadas de acordo com o método da presente invenção, mostram uma capacidade de migração superior. Esta propriedade determina que HC016 podem aceder de forma mais eficiente à área tecidual danificada e iniciar a sua ação trófica para proteger células danificadas e influenciar o controlo de um ambiente adverso. Esta capacidade de migração significativamente elevada em relação a ASC, é determinada por alterações conformacionais que ocorrem no citoesqueleto de HC016 e também por um aumento no tipo de microfilamentos (beta-actina) organizados no limite de expansão celular. Estas projeções da membrana celular são o substrato físico para o movimento celular durante a migração. Neste ponto, a análise de expressão do gene de beta-actina mostra um aumento de HC016 de 59 % em relação a ASC (Fig. 5A-B) . Além disso, a imunocoloração de F-actina ou actina polimerizada indica alterações morfológicas relevantes relacionadas com uma capacidade de motilidade mais alta, tal como a formação de fibras de stress, um elemento fundamental nos eventos de migração. A Figura 6 mostra a imunocoloração de F-actina disposta em fibras de stress, que é um dos aspetos críticos no processo de migração celular (Mitchison et al., 1996) . Igualmente, a experiência realizada exclusivamente para analisar a capacidade de migração celular através de câmaras de Boyden (Fig. 8, exemplo 10), mostra que as células HC016 têm uma capacidade de migração 30 vezes mais elevada em relação a ASC.

Adicionalmente, as células HC016, apresentam um aumento da expressão génica do fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) de 64 % em relação a ASC (Fig. 5C-D) . Estudos anteriores mostraram que intermediários de IGF-1 relevantes nos processos regenerativos ocorreram após um dano. IGF-1 é um potente fator neurotrófico produzido por células não neuronais depois de um dano realizado no tecido nervoso, estimulando a regeneração tecidual. IGF-1 promove a sobrevivência neuronal, o crescimento dos neuritos, a proliferação de células nervosas, a mielinização e melhora a interação entre axónios e células de Schwann (Apel et al., 2010). Além disso, noutros modelos experimentais, foi provado que a aplicação local de IGF-1 permite a reparação do músculo esquelético danificado sem formação de tecido cicatricial e um maior recrutamento de células estaminais para a área danificada (Spangenburg et al., 2010). Devido a estas razões, a indução da expressão de IGF-1 nas células HC016 pode promover a capacidade regenerativa de ASC, de tal modo que aumenta a capacidade de proliferação celular, a recuperação funcional de células teciduais danificadas e o recrutamento de células estaminais para a área danificada contribuindo para o processo de recuperação. O método selecionado para analisar a expressão génica em relação a ASC foi o seguinte: Esta análise comparativa requer dois grupos experimentais que consistem em células ASC e HC016. Assim que o método de tratamento se conclui, cada grupo celular é recolhido, lisado e o ARN é extraído e purificado, e é processado para obter ADNc. A reação de PCR é realizada incluindo iniciadores específicos que localizam fragmentos de ADN presentes nos genes que codificam β-actina e fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) . Os produtos de PCR de cada grupo experimental são migrados por eletroforese e o tamanho do fragmento amplificado é determinado e a intensidade de cada banda é quantificada. O valor resultante é normalizado com o valor da intensidade de um gene constitutivo definido, GAPDH.

Este conjunto de dados indica que o método de tratamento que gera HC016 induz a síntese de um "agrupamento" de maquinaria molecular intra e extracelular necessária para a eliminação de H2O2 e para o controlo de um ambiente oxidante adverso. As células HC016 têm uma capacidade de migração mais elevada para chegar à área de tecido danificado e além disso produzem uma quantidade mais elevada de fatores tróficos que exercem o seu efeito sobre os processos regenerativos das células do tecido danificado e sustentam a sua sobrevivência. A utilização de células HC016 no tratamento de doenças associadas ao, ou que resultam de, stress oxidativo.

Conforme discutido acima, as caracteristicas das células HC016 indicadas na secção anterior tornam-nas especialmente adequadas para o tratamento de doenças causadas por stress oxidativo ou condições degenerativas de evolução devido a componentes mediados por espécies reativas de oxigénio.

Uma das patologias que afeta o sistema nervoso central e que está envolvida no stress oxidativo, que resulta em alterações degenerativas devido a componentes mediados por espécies reativas de oxigénio, é a lesão da medula espinal.

Uma lesão da medula espinal constitui um dano do tecido nervoso no qual não estão envolvidos agentes patogénicos e não é induzido por fatores externos ou genéticos. No local da lesão, as consequências imediatas do trauma são a compressão do tecido, hemorragia, edema, esgotamento de oxigénio e nutrientes na zona de impacto (Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin e Cho, 2004. Injury severity and cell death mechanisms: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132; Fehlings e Tator, 1995) . The relationships among the severity of spinal cord injury, residual neurological function, axon counts and counts of retrogradely labeled neurons after experimental spinal cord injury. Exp Neurol 132: 220-228). Estes fenómenos biológicos induzem dois mecanismos de defesa celular: morte celular programada ou apoptose (Yukawa, Lou, Fukui e Lenke, 2002. Optimal treatment timing to attenuate neuronal apoptosis via Bcl-2 gene transfer in vitro and in vivo. J Neurotrauma 19: 1091-1103) e a reação imunitária inata (Carpentier e Palmer, 2009. Immune influence on adult neural stem cell regulation and function. Neuron 64: 79-92) que se estendem a áreas circundantes não danificadas e persistem durante semanas ou mesmo meses depois da lesão em termos de isquemia e inflamação do tecido, por outras palavras, produzindo um dano secundário (Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin e Cho, 2004. Injury severity and cell death mechanisms: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132).

Estes dois tipos de resposta tecidual são expandidos ao longo da medula espinal e afetam a tecido inicialmente saudável, uma vez que os mecanismos disponíveis para que o tecido nervoso responda contra as suas consequências fisiológicas são insuficientes. A expansão é levada a cabo grandemente através de metabolitos reativos de oxigénio (MROs) característicos da reação imunitária inata que causam stress oxidativo e, dependendo da sua intensidade, podem induzir a apoptose (Liu, Liu e Wen, 1999. Elevation of hydrogen peroxide after spinal cord injury detected by using the Fenton reaction. Free Rad Biol & Medicine 27: 478-482; Yukawa et al., 2002) . Destes, o MRO mais abundante é o peróxido de hidrogénio (H2O2) , que se difunde para o ambiente extracelular que rodeia as células nervosas e se dispersa sob a forma de dano secundário. Ο H2O2 reage e degrada membranas, proteínas e o ADN das células (Braughler e Hall, 1989. Central Nervous System trauma and stroke. I. Biochemical considerations for oxygen radical formation and lipid peroxidation. Free Radio Biol Med. 6: 289-301) e em último caso induzem-nos à morte celular programada ou apoptose (Yukawa et al., 2002). Ο H2O2 também é um produto residual das células normais, portanto elas têm algumas defesas contra esta molécula (Phillis, 1994. A "radical" view of cerebral ischemic injury. Prog Neurobiol 42: 441-448). No entanto, os níveis de H2O2 que são gerados depois da lesão são mais elevados do que aqueles fisiologicamente toleráveis (Hyslop, Zhang, Pearson e Phebus, 1995. Measurement of striatal H202 by microdialysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H202 in vitro. Brain Res 671: 181-186). Entre as células nervosas, os oligodendrocitos, células que geram a bainha de mielina que cobre o axónio dos neurónios são mais vulneráveis aos MROs porque têm menos defesas contra eles e contêm moléculas que os tornam em alvos de dano secundário (Dringen R, Pawlowski P e Hirrlinger J. 2005. Peroxide detoxification by brain cells. J Neurosci Res 79: 157-165) . Como tal, além da morte celular inicial depois da lesão, o dano oxidativo devido a H2O2 subsequente causa uma desmielinização persistente das fibras nervosas, que reduz a condução do sinal nervoso através das mesmas (Nashmi R e Fehlings MG. 2001. Changes in axonal physiology and morphology after chronic compressive injury of the rat thoracic spinal cord. Neuroscience 104: 235-251) .

Outras doenças são aquelas selecionadas a partir do grupo que consiste em periarterite nodosa, diabetes mellitus, doença granulomatosa crónica, arteriosclerose, acidente vascular cerebral, fibrose pulmonar (doença pulmonar obstrutiva crónica, DPOC, fibrose pulmonar idiopática), síndrome de isquemia-reperfusão, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, artrite reumatoide, lúpus eritematoso, doença inflamatória do intestino: colite ulcerativa e doença de Chron, síndrome de dificuldade respiratória do adulto, aterosclerose, lesão da medula espinal, lesão de nervo periférico, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington ataxia de Friedreich, periodontite, doenças e distúrbios das mucosas e lesões que ocorrem com um componente de inflamação, úlceras e feridas agudas e crónicas. A administração de células HC016 à área afetada diminui o nível de stress oxidativo causado como um resultado da ativação de células imunitárias durante os processos inflamatórios.

Adicionalmente, a administração de células HC016 à área afetada reduz os níveis de stress oxidativo que surgem como um resultado da produção de MROs depois de hemorragia interna, melhora a secreção de citocinas parácrinas, interleucinas, quimiocinas, fatores tróficos e fatores de crescimento, aumenta a sobrevivência e proliferação de outras células de mamífero, diminui os níveis de MROs extracelulares na vizinhança de células de mamífero próximas a células HC016 administradas e diminui os níveis extracelulares de moléculas de sinalização como TNF-alfa, IL-1 beta pró-inflamatórios, etc.

Além disso, as células HC016 têm uma capacidade quimiotática significativamente mais alta em relação a células danificadas por H2O2 extracelular, como demonstrado no Exemplo 10 da presente invenção. A utilização de células HC016 inclui a administração de células mesenquimatosas previamente tratadas numa área adjacente ao local do dano, em vez de no epicentro da lesão, de modo a limitar a irradiação do dano tecidual, a extensão da lesão e a perda funcional. 0 tecido na lesão sofre uma força compressiva grave que rompe as membranas das células nervosas e células do sistema vascular. Igualmente, como resultado da lesão, poderia ocorrer hemorragia devido à rutura de artérias e veias, um transtorno dos organelos, citoplasma, vesículas e membrana celular, factos que conduzirão à necrose tecidual. Estes eventos são inerentes à lesão. Posteriormente, se estes não foram resolvidos, as moléculas libertadas pelas células necróticas, juntamente com outras moléculas libertadas também por células do sistema imunitário, expandem o dano a áreas adjacentes à lesão através de moléculas de sinalização celular como H2O2. A aplicação desta terapêutica baseada em células mesenquimatosas está desenhada para reduzir ou minimizar a disseminação do dano tecidual. Como tal, a aplicação da terapêutica celular irá ser, preferivelmente, numa área adjacente ao epicentro da lesão.

Noutro aspeto da invenção, as células tratadas serão aplicadas utilizando uma via de administração que lhes permitirá chegar diretamente ao epicentro da lesão, de modo a metabolizar as espécies reativas de oxigénio na área, reduzir o stress oxidativo e controlar o estado inflamatório, para evitar uma situação de morte celular massiva nesta área.

As vias de administração podem ser, qualquer via parentérica (como intra-arterial, intravenosa, intralinfática, intra-espinhal, epidural, intramedular), subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica (percutânea), intra-articular, intratraqueal, intra-alveolar, intratecal, intraocular, conjuntival, intracardiaca, intranasal, vaginal, uretral, cutânea, retal, sublingual, oral, oral transmucosa. Para levar a cabo estas aplicações, as células obtidas pelo método da presente invenção são formuladas nos veículos farmaceuticamente aceitáveis apropriados que já são conhecidos pelos peritos na especialidade, dependendo da via.

Entre outros, a formulação proporciona uma solução que, além de células HC016 contém, entre outros, Lactato de Ringer, albumina humana (CSL-Behring), etc, que se dispõem para administração em frascos de vidro estéreis e não pirogénicos (Sword Scientific).

De forma semelhante, as células HC016 podem ser incorporadas em biomateriais de origem natural e/ou sintética, para a geração de terapêuticas de engenharia celular e de tecidos tais como hidrogéis, espumas e materiais poliméricos, compósitos, derivados de fosfato de cálcio e materiais metálicos, que permitem uma melhor gestão das células para o local de lesão e aumentam a sobrevivência e funcionalidade das mesmas, conforme apropriado.

Depois da administração das células HC016 a mamíferos, as células mesenquimatosas migram em direção ao local de lesão, onde ativam a proliferação de células adjacentes ao local de injeção. Preferivelmente, estas células têm o mesmo fenótipo adjacente ao parênquima ao qual a injeção foi aplicada e são células precursoras. Ainda mais preferivelmente, o fenótipo celular corresponde ao das células parenquimatosas adjacentes e das células precursoras.

Noutro aspeto da invenção, as células HC016 mesenquimatosas administradas permanecem no tecido. Adicionalmente, a presença de células mesenquimatosas administradas ao tecido do paciente não induz uma resposta imunitária contra aquelas células mesenquimatosas administradas.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Obtenção de células mesenquimatosas a partir de tecido adiposo (ASC) Células estaminais mesenquimatosas a partir de tecido adiposo são isoladas a partir de tecido humano seguindo a metodologia descrita por Yoshimura et al., 2006, Almeida et al., 2008, Wagneret et al., 2005. A fração de células estaminais mesenquimatosas a partir de tecido adiposo é obtida a partir de lipoaspirados de pacientes saudáveis sob anestesia. O lipoaspirado é lavado com PBS lx e digerido com colagenase tipo I durante 30 minutos a 37 °C e depois centrifugado para obter um pélete celular. Este pélete é ressupenso em tampão de lise de eritrócitos e a suspensão celular purificada é passada através de um filtro de 100 pm e centrifugada novamente. Depois da ressuspensão das células, estas são semeadas em meios de cultura para expansão celular.

As células são cultivadas como culturas primárias durante um período de 5 dias num meio de crescimento composto por DMEM (Invitrogen) com soro bovino fetal a 10 % (Biochrom) e antibiótico-antimicótico PSA 1 % (Invitrogen), na incubadora a 37 °C e 5 % C02.

Consecutivamente, as células são expandidas guando adguirem confluência. Para este processo as células são destacadas a partir da superfície de cultura utilizando uma solução a 0,05 % de tripsina/EDTA, centrifugadas e ressuspensas em meio novo. A densidade e viabilidade celular é determinada na suspensão celular obtida e as células são semeadas numa nova superfície de cultura.

Exemplo 2. Aplicação do tratamento da invenção a células ASC: Obtenção das células HC016 350.000 células ASC subcultivadas são semeadas num frasco de cultura T25 com 5 ml de meio de crescimento com a seguinte composição: DMEM (Invitrogen) com soro bovino fetal a 10 % (Biochrom) e antibiótico-antimicótico PSA a 1 % (Invitrogen) e incubadas a 37 °C e 5 % C02, até à sua adesão.

Primeiro ciclo: adicionar o meio de tratamento que contém a seguinte composição: DMEM (Invitrogen) com soro bovino fetal a 10 % (Biochrom), antibiótico-antimicótico PSA a 1 % (Invitrogen) e H202 a 0,01 % (Panreac) . Estas células são incubadas neste meio durante 48 horas.

Segundo ciclo: depois de 48 horas as células são obtidas e novamente 350.000 células são semeadas num segundo frasco de cultura T25 e incubadas durante 4 horas a 37 °C e 5 % C02 até à sua adesão. Consecutivamente, o meio de tratamento é adicionado e as células são incubadas durante 48 horas.

Terceiro ciclo: depois destas 48 horas as células são obtidas e novamente 350.000 células são semeadas num segundo frasco de cultura T25 e incubadas durante 4 horas a 37 °C e 5 % C02 até à sua adesão. Consecutivamente, o meio de tratamento é adicionado e as células são incubadas durante 48 horas.

Depois destas 48 horas, as células ASC tratadas são renomeadas HC016.

Exemplo 3. Análise comparativa da proliferação celular de células HC016 em relação a ASC. A análise da proliferação celular é realizada nos seguintes quatro grupos experimentais: ASC, HC016, células HOG intactas e células HOG cultivadas com o tratamento da invenção que gera HC016.

As células HOG são células humanas a partir de um oligodendroglioma considerado como um modelo oligodendroglial experimental de linhagem neural. As células HOG são cultivadas não diferenciadas com capacidade proliferativa e antecedentes genéticos oligodendrogliais. ASCs são cultivadas com a metodologia e o meio de crescimento definido e descrito no Exemplo 1 para gerar a população celular para esta experiência. Um lote do mesmo número de células HC016 foi gerado de acordo com o Exemplo 2. Populações de células HOG foram geradas através dos métodos para ASC e HC016 de acordo com o Exemplo 1 e Exemplo 2, respetivamente.

Uma vez preparadas as quatro populações celulares, as células são semeadas em placas de 96 poços com meio de crescimento até estarem aderidas ao poço. Posteriormente, as células são cultivadas num ambiente oxidante através de exposição a H2O2 a 0, 1 mM. A proliferação foi medida seguindo os protocolos e reagentes do método de MTT de proliferação celular em momentos diferentes: 0, 24, 48 e 72 horas. De acordo com o fabricante do kit, este teste produz uma estimativa colorimétrica da proliferação celular e, portanto, este parâmetro é analisado e comparado com os quatro tipos celulares.

As figuras são representadas em unidades arbitrárias de intensidade de fluorescência ao longo do tempo (horas).

Resultados A capacidade proliferativa de HC016 é 1,23 vezes mais elevada do que a da população de controlo de ASC a 72 horas depois do estímulo oxidativo (aumento de 23 %) (teste-t de Student p<0, 05; n=3 amostras) (Fig. IA) . Este efeito não é partilhado pelas outras células humanas, os oligodendrocitos HOG (Fig. 1B) . O tratamento da presente invenção é eficaz em ASC mas não foi eficaz noutros tipos celulares como oligodendrocitos HOG.

Exemplo 4. Níveis de espécies reativas de oxigénio em células HC016. A análise dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigénio é realizada em quatro grupos celulares experimentais: ASC, HC016, células HOG intactas e células HOG cultivadas com o tratamento da invenção que gera as HC016.

Uma vez preparadas as quatro populações celulares, as células são semeadas em placas de poços com meio de crescimento até estarem aderidas ao poço. Posteriormente, as células foram brevemente lavadas com lx PBS, depois o PBS é substituído por 100 μΐ de lx PBS com a sonda diacetato de 2', 7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFA) 10 μΜ e as células incubadas durante 30 minutos. O DCFA foi subsequentemente removido e meio novo foi adicionado. Posteriormente, as células foram cultivadas num meio com H2O2 a diferentes concentrações: 0, 0,1, 0,25, 0,5 e 1 mM. Um curso de tempo de níveis de MROs é medido cada 5 minutos durante um total de 60 minutos num leitor de placas fluorimétrico. Os intervalos de comprimentos de onda de excitação/emissão são 485/538 nm.

As figuras são representadas em unidades arbitrárias de intensidade de fluorescência ao longo do tempo (minutos).

Resultados 55 minutos depois de serem expostas a um gradiente de H2O2, as células HC016 contêm níveis significativamente mais baixos de MROs intracelulares com H2O2 a 1 mM e 0,5 mM, em relação a ASC (11 % inferiores) , teste ANOVA de dois fatores P<0, 031 e (15 % inferiores) , teste ANOVA de dois fatores (P<0,039, respetivamente) (Fig. 2). O tratamento que gera HC016 a partir de ASC não induz a mesma resposta noutras células de mamífero como células oligodendrogliais HOG (Fig. 2) . Adicionalmente, a presença de níveis intracelulares mais baixos de ROS nas células HC016, indica indiretamente que os níveis extracelulares desta molécula também se reduzem de modo que as células HC016 têm uma maior capacidade de remover o peróxido de hidrogénio do ambiente, tornando as células com uma maior capacidade de destoxificação de H2O2 no local da aplicação como terapêutica celular.

Exemplo 5. Níveis intracelulares de glutationa total (GSH).

Os grupos experimentais consistem em dois lotes separados de ASCs e HC016. As ASC foram cultivadas com a metodologia e os meios descritos anteriormente. As ASCs foram extraídas e isoladas a partir de tecido adiposo humano utilizando os métodos descritos e subcultivadas em meio de crescimento até que foi obtida a população celular necessária para esta experiência. Foi também gerado um lote de células HC016 com o mesmo número de células, com a metodologia da invenção.

Depois da etapa de condicionamento celular, as células são recolhidas por digestão com tripsina/EDTA 0,05, as proteínas são extraídas através de incubação das células com um tampão de lise (inibidor de protease, EDTA e Triton X-100 em tampão de fosfato de sódio a pH 7,5) e a proteína total no sobrenadante é quantificada seguindo o protocolo e reagentes fornecidos pelo kit de ensaio de proteínas BioRad DC.

Noutra alíquota do sobrenadante, a proteínas são precipitadas com ácido sulfosalicílico a 5 % e centrifugadas, e os péptidos de massa baixa dissolvidos no sobrenadante transferidos para os ensaios de GSSG e GSH total.

As amostras para os ensaios GSSG e GSH total são processadas em triplicados numa placa de 96 poços. Para a medição de GSH, as amostras contêm 5 % de amostra de proteína purificada, 45 % de água destilada e 50 % de tampão de reação (EDTA a 0,2 M, DTNB 1,2 mg/100 μΐ, 3,6 mg NADPH e 4,5 unidades de glutationa redutase em tampão de fosfato de sódio a 0,1 M a pH 7,5). Posteriormente, a absorvância a 405 nm é medida a cada 15 segundos durante 2,5 minutos. Para a medição de GSSG, as amostras de proteína purificada são previamente tratadas com 2-vinilpiridina numa relação de 96,3 %/3,7 % (proteína/reagente) e são incubadas durante 1 hora a 4 °C.

Posteriormente, as amostras para análise são preparadas contendo 10 % da amostra tratada previamente, 40 % de água destilada e 50 % de tampão de reação (EDTA a 0,2 M, DTNB 1,2 mg/100 μΐ, 3,6 mg NADPH e 4,5 unidades de glutationa redutase em tampão de fosfato de sódio a 0,1 M a pH 7,5) . Posteriormente, a absorvância a 405 nm é medida a cada 15 segundos durante 30 minutos.

Os valores da absorvância são extrapolados para um ajuste linear padrão gerado pela repetição das mesmas etapas com concentrações conhecidas de GSH. Os valores são expressos como nmol/mg de proteína. A GSH total é calculada como GSH + 2GSSG.

Resultados

As células HC016 mostram um maior teor basal em GSH total em relação a ASC (Figura 3) (10 % superior). A presença destes níveis mais elevados de GSH total intracelular nas células HC016 confirma também a maior capacidade de destoxificação de agentes tóxicos destas células, conferindo uma maior resistência frente ao stress ambiental ou ao aumento da atividade metabólica celular.

Exemplo 6. Níveis de expressão dos genes envolvidos na destoxif icação das espécies de metabolitos reativos.

Esta análise comparativa exigiu dois grupos experimentais que consistem de células ASC e HC016. As células ASC convencionais são cultivadas com a metodologia e o meio descritos acima para obter a população celular necessária para esta experiência. Um lote de número celular semelhante de HC016 é gerado aplicando o método descrito no exemplo 2 .

Uma vez terminado o procedimento de condicionamento, cada grupo celular é recolhido a partir do recipiente de cultura celular por digestão de tripsina/EDTA. As células são lisadas e o ARNm total de cada grupo experimental é separadamente extraído e purificado usando um sistema de filtros de membrana comercialmente disponível que retém os fragmentos e proteínas da membrana celular. O ARNm eluído é convertido em ADNc por uma Reação em Cadeia da Polimerase e Transcriptase Reversa (RT-PCR) seguindo um protocolo estabelecido e reagentes incluídos num kit comercial (Pure Link™ RNA Micro Kit; Invitrogen; Ref. 911811) . Os volumes correspondentes do ADNc obtido de cada grupo experimental são misturados com os volumes e concentrações adequados para realizar a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) incluindo sequências de iniciadores personalizados que se ligam aos fragmentos de ADNc específicos localizados nas regiões de exão do gene de Superóxido Dismutase 1, 2 e 3, Catalase, Glutationa Peroxidase e Glutationa Redutase. Os produtos de PCR de cada grupo experimental são migrados num gel de agarose pela técnica de eletroforese (agarose a 4 % em tampão lx TAE) mais um volume de concentração definida de reagente comercial de coloração de ADN (SYBR Safe DN gel stain; Invitrogen; S33102). Os géis são transiluminados com luz UV e é obtida a densidade ótica através de um sistema de imagem digital para medir a densidade ótica de cada banda migrada. 0 valor da densidade ótica de cada banda de cada grupo experimental e cada gene selecionado tem subtração de fundo e é normalizado para o valor da densidade ótica de uma expressão génica constitutiva definida.

Resultados

Os níveis de expressão dos genes envolvidos no metabolismo oxidativo de células HC016 são diferentes das ASC (Fig. 4A) . A quantificação da expressão dos diferentes genes mostra que as células HC016 apresentam um aumento de 53 % do gene S0D1 quando comparado a ASC, 37 % do gene S0D2, 77 % do S0D3, 78 % do gene Cat, 18 % do gene GR e 6 % do gene GPx (Fig. 4B) . Estes resultados permitem concluir que as células HC016 apresentam uma melhoria nas defesas antioxidantes intra e extracelulares em relação às ASC (Fig. 4A).

Exemplo 7. Níveis de expressão dos genes e proteínas envolvidos no citoesqueleto e na secreção dos fatores de crescimento.

Esta análise comparativa exigiu dois grupos experimentais que consistem de células ASC convencionais que são cultivadas com a metodologia e o meio descritos acima para obter a população celular necessária para esta experiência e um lote de número de células semelhantes de HC016 que é gerado pela metodologia descrita no exemplo 2. Como no exemplo 6, quando termina o procedimento de condicionamento, cada grupo celular é recolhido por digestão com tripsina/EDTA, as células são lisadas, o ARNm total é separadamente extraído e purificado e o ARNm é convertido em ADNc. A PCR é realizada com o ADNc incluindo sequências de iniciadores personalizados que se ligam a fragmentos de ADNc específicos localizados nas regiões de exão do gene de β-actina e IGF-1. Como no Exemplo 6, os produtos de PCR de cada grupo experimental são migrados num gel de agarose pela técnica de eletroforese. A densidade ótica de cada banda migrada é medida e ao seu valor é subtraído o fundo e é normalizado para o valor da densidade ótica de uma expressão génica constitutiva, GADPH.

Resultados

Os níveis de expressão dos genes associados aos componentes citoesqueléticos e aos fatores de crescimento nas células HC016 quando comparados com ASC (Fig. 5A e C) . A quantificação da expressão dos diferentes genes mostra que as células HC016 apresentam um aumento de 59 % do gene de β-actina (Fig. 5B) e um aumento de 64 % do gene IGF-1 em comparação a ASC (Fig. 5D).

Exemplo 8. Composição e disposição das moléculas citoesqueléticas.

Esta análise comparativa exigiu dois grupos experimentais que consistem novamente de células ASC convencionais que são cultivadas com a metodologia e o meio descritos acima para obter a população celular necessária para esta experiência e um lote de número de células semelhantes de HC016 que é gerado pela metodologia descrita no exemplo 2.

As células de ambas as populações são semeadas em placas de 24 poços com o meio e a metodologia descritos acima. Uma vez que as células se aderem, o meio é removido e as células brevemente lavadas com PBS lx. Depois, as células são fixadas com formaldeído a 4 % em PBS lx durante 12 minutos, permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1 % em PBS lx durante 10 minutos a 4 °C, lavadas novamente em PBS lx e incubadas com 100 yg/ml de Phalloidin-FITC (Sigma-Aldrich; Ref. P5282) em PBS lx durante 1 hora à temperatura ambiente (~23 °C). Posteriormente, as células foram extensivamente lavadas com PBS lx, os núcleos corados com Hoescht 33258 (Invitrogen; Ref. H1398) e finalmente cobertas com uma fina camada de Fluoromont-G (Southern Biotech; Ref. 0100-01) e visualizadas num microscópio de fluorescência.

Resultados O citoesqueleto das células HC016 tem mais filamentos de F-actina e são mais espessos que nas células ASC, e são organizados em fibras de stress. A observação das células ASC e HC016 sob o microscópio mostra qualitativamente que as células HC016 têm mais filamentos de F-actina e são mais espessos que nas ASC (Fig. 6) o que proporciona um citoesqueleto mais robusto e mais preparado para uma possível remodelação estrutural. No Exemplo 7 é mostrada a quantificação da expressão do gene que codificam os monómeros F-actina e β-actina, (Fig. 5A-B). Os dois resultados indicam a síntese aumentada de F-actina, e este último resultado, indica o efeito sobre o citoesqueleto celular.

Exemplo 9. Capacidade de proteção das células de linhagem neural pelas células HC016.

Os grupos experimentais consistem de células HOG oligodendrogliais de controlo sem qualquer modificação no procedimento de cultura normal, células HOG cultivadas num ambiente oxidante, cocultura de células ASC com HOG num ambiente oxidante e cocultura de células HC016 com células HOG num ambiente oxidante.

As células HOG são células de oligodendroglioma humanas consideradas como um modelo experimental oligodendroglial de linhagem neural. As células HOG são cultivadas sem diferenciação com capacidade proliferativa e antecedentes genéticos oligodendrogliais.

As populações com números celulares semelhantes de células ASC e HC016 são geradas com os métodos descritos no Exemplo 1 e 2. No dia da experiência, as células são colhidas por digestão com tripsina/EDTA 0,05 antes de serem incluídas no sistema de cocultura in vitro com base nas câmaras de Boyden inseridas em placas de 24 poços (insertos de câmaras transpoços) que evitam o contacto físico entre duas populações celulares.

No dia da experiência, os oligodendrocitos são colocados em placas e aderidos ao fundo das placas de 24 poços e cultivados num ambiente oxidante durante 1 hora através da adição de 0,5 ml de 0,5 mM de H2O2 em meio de cultura. Depois do insulto tóxico, o meio é substituído por meio de cultura novo e a cultura é feita num meio composto por DMEM contendo soro bovino fetal a 10 % e antibióticos a 37 °C.

Na próxima etapa, nas situações de cocultura, células ASC ou HC016 foram incluídas semeadas numa câmara de Boyden (insertos de câmaras transpoços) como corresponde aos grupos experimentais explicados acima.

Até um período de 24 e 48 h, a viabilidade oligodendroglial é quantificada pelo método de exclusão de azul tripano. A taxa de crescimento (GR) das células vivas é calculada como: % de células vivas - % de células mortas. A taxa de crescimento de HOG oxidadas em relação a HOG normais é calculada como: GR H0GOXidadas/GR HOGcontrolo ·

Os valores resultantes são normalizados em relação a HOG oxidadas e são representados como percentagens em gráficos de barras.

Resultados

Após 48 horas de estimulação oxidativa em células HOG, as células em cocultura com células HC016, têm uma taxa de crescimento normalizado em relação às HOG oxidadas que é 21 % superior (Fig. 7) em relação às células HOG em cocultura com ASC. Enquanto às 24 h ambos os tipos celulares promovem a viabilidade das HOG oxidadas (Fig. 7) de forma semelhante, no meio-termo as células HC016 têm um efeito mais duradouro nas HOG oxidadas. Por essa razão, a aplicação destas células como terapêutica celular in vitro apresenta mais benefícios em comparação com a terapêutica de ASC convencionais, já que as células HC016 apresentam uma melhoria e um aumento do efeito ao longo do tempo, em relação com as ASC, em comparação com os outros tipos celulares sob condições de stress, como ocorre no dano tecidual nas doenças mencionadas neste documento.

Exemplo 10. Capacidade de migração de células HC016 para as células de sinalização de inflamação/stress oxidativo.

Os grupos experimentais consistem de células oligodendrogliais de controlo sem qualquer modificação no procedimento de cultura normal, células oligodendrogliais cultivadas num ambiente oxidativo, cocultura de ASC com células oligodendrogliais cultivadas num ambiente oxidante e cocultura de células HC016 com células oligodendrogliais cultivadas num ambiente oxidante.

Para analisar a capacidade de migração de células ASC e HC016, é gerado um modelo de stress oxidativo com células de mamífero de teste (células oligodendrogliais) cuja proliferação e viabilidade é sensível às condições de stress oxidativo. 0 modelo de stress oxidativo consiste de células HOG oligodendrogliais colocadas em placas e aderidas ao fundo de uma placa de 24 poços e cultivadas num ambiente oxidante durante 1 hora através da adição de 0,5 ml de H2O2 a 0,5 mM ao meio de cultura. Após o insulto tóxico, o meio é substituído por meio de cultura novo e é feita a cultura com um meio composto de DMEM contendo soro bovino fetal a 10 % e antibióticos a 37 °C.

Numa próxima etapa, nas situações de cocultura, as células ASC ou HC016 foram incubadas e semeadas numa câmara de Boyden (insertos de câmara transpoços) como corresponde aos grupos experimentais explicados acima.

Até um período de 24, 48 e 72 horas, os insertos transpoços são lavados em PBS lx e fixados com formaldeído a 4 % em PBS lx durante 12 minutos. As células na superfície superior da membrana transpoços são removidas com um cotonete de algodão e as células remanescentes são coradas com uma solução a 0,1 % de cresil violeta durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois, são totalmente lavadas em PBS lx e finalmente cortadas dos insertos, montadas planas sobre placas de vidro cobertas com uma fina camada de meio de montagem DPX (Sigma-Aldrich; Ref. 44581) e visualizadas ao microscópio. As membranas são observadas ao microscópio, sendo obtidas imagens representativas de cada situação e o número de células por área é contado diretamente para cada grupo experimental. A quantificação é expressa em número migrado de células por mm2.

Resultados

Analisou-se um total de 10 campos de 0,57 mm2 cada (Fig. 8) com um total de 5,7 mm2. Nesta área, às 48 e 72 horas, as células HC016 têm uma capacidade de migração 32,75 vezes (3,275 %) e 20,61 vezes (2,061 %) maior (Fig. 8) em relação às ASC na direção da área de células danificadas pelo stress oxidativo. Em conclusão, o tratamento com as células HC016 gera uma capacidade quimiotática significativamente mais robusta e superior na direção de células HOG danificadas pelo H2O2 extracelular, em relação às ASC. 0 efeito quimiotático que podem exercer sobre as células HOG após a aplicação de H2O2 pode estar relacionada com fenómenos como o stress oxidativo e a indução de componentes de inflamação que ocorre após uma libertação dos metabolitos reativos de oxigénio.

Exemplo 11. Fabrico da composição farmacêutica de células HC016.

As células HC016 foram preparadas de acordo com a formulação farmacêutica que conduz ao produto medicinal para terapêutica celular, para a sua utilização no modelo animal e determinação da sua eficácia:

Assim, uma vez realizado o tratamento para obter as células HC016 das ASC, como especificado no Exemplo 2, as células são colocadas em frascos de vidro não pirogénicos.

Para esta finalidade, as células HC016 são destacadas do frasco de cultura pela aplicação de uma solução de tripsina-EDTA 0,05 %, a atividade enzimática é neutralizada pela adição de FBS (Biochrom), e a centrifugação a 400g é realizada para a obtenção da suspensão celular. O sobrenadante é removido, o pélete celular ressuspenso em solução salina (Grifols) e é realizada uma nova centrifugação para a remoção de todos os vestígios das soluções anteriores. O sobrenadante é descartado e as células são ressuspensas numa solução injetável (Lactato de Ringer a 95 % (Grifols) e albumina humana a 5 % (CSL-Behring). Realizou-se a contagem celular e a análise de viabilidade utilizando um hemocitómetro, e a solução celular foi ajustada até uma concentração de 200.000 células/μΐ. A formulação farmacêutica para a injeção estereotáxica no modelo animal é composta de: uma solução de 50 μΐ de células HC016 viáveis numa concentração de 200.000 células/μΐ em Lactato de Ringer a 95 % (Grifols) e albumina humana a 5 % (CSL-Behring), colocada em frascos de vidro, estéril e não pirogénica (Sword Scientific) . Exemplo 12. Capacidade de proteção e/ou reabilitação motora funcional de uma terapêutica celular com base na aplicação de células HC016 num modelo animal de lesão medular.

Os grupos experimentais consistem de três grupos de 10 ratos Sprague-Dawley adultos com 250-300 gramas de peso. A estes animais, sob anestesia geral com isoflurano a 3-4 %, foi realizada uma laminectomia a nível torácico, de maneira que a coluna vertebral ficasse exposta. Na coluna vertebral dorsal foi aplicada uma lesão medular moderada por meio de uma contusão calibrada e definida através de um conjunto de parâmetros como a distância e o peso carregado sobre um pistão metálico de diâmetro conhecido. 0 primeiro grupo de 10 animais recebeu uma lesão e nenhuma terapia. O segundo grupo de 10 animais recebeu uma lesão e foi tratado com terapêutica celular baseada em ASC. O terceiro grupo de 10 animais recebeu a lesão e foi tratado com terapêutica celular baseada em HC016. As terapêuticas celulares, ASC e HC016, são aplicadas 48 horas após a lesão por injeção estereotáxica em 6 pontos nos níveis espinhais acima e abaixo da lesão. Cada injeção consiste de 1 ml de solução salina contendo 200.000 células, perfazendo uma dose total de 1.200.000 células por animal. Os ratos são sempre supervisionados numa instalação para animais e recebem alimentação e bebida ad libitum. A capacidade de proteção e/ou de reabilitação funcional motora em cada grupo é determinada por um teste funcional após 1, 2, 3, 4, 6 e 8 semanas explorando a locomoção em campo aberto. Esse teste é conhecido como Basso-Beattie-Bresnahan (classificação BBB) , sendo um método fiável e sensível que obtém uma pontuação de 21 e proporciona uma medida semiquantitativa da recuperação a curto, médio e longo prazo (Basso, Beattie e Bresnahan , 1995. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21). A quantificação é expressa como média estatística do valor da escala BBB de cada grupo experimental em cada momento da exploração.

Resultados A aplicação da terapêutica baseada em células HC016 após a lesão medular promove a recuperação das habilidades motoras testadas no teste BBB. De acordo com a escala deste teste, os valores indicam que esta recuperação está pelo menos um ponto acima da terapêutica convencional baseada em ASC em todos os momentos examinados, 1, 2, 3, 4, 6 e 8 semanas após a lesão (Fig. 9). A evolução da recuperação mostra que a terapêutica com as células HC016 encurta o tempo para a obtenção da melhor pontuação obtida na oitava semana com células HC016.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

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Lisboa, 16 de março de 2017

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um método de pré-condicionamento de células estaminais mesenquimatosas derivadas a partir de tecido adiposo, que compreende cultivar as células estaminais mesenquimatosas obtidas e isoladas num meio de tratamento que compreende H2O2 como aqente de oxidação, caracterizado por a dita cultura das células num meio de tratamento compreender as sequintes etapas: a) primeiro ciclo: semear as células numa superfície de cultura e permitir um tempo de condicionamento compreendido entre 4 e 8 horas para que as células se adiram e adquiram a sua morfoloqia típica; b) adicionar o meio de tratamento até atingir uma concentração de H2O2 final compreendida entre 0,01 - 0,05 mM; c) manter durante 48-72 horas dentro da incubadora a 37 °C e uma atmosfera de 5 % de CO2; d) segundo ciclo: renovar o meio de tratamento até alcançar novamente uma concentração de H2O2 final compreendida entre 0,01 - 0,05 mM; e) incubar estas células durante 48-72 horas a 37 °C com 5 % de C02; f) terceiro ciclo: renovar o meio de tratamento aplicando novamente o dito meio até alcançar uma vez mais uma concentração de H2O2 final compreendida entre 0,01 - 0,05 mM; g) incubar estas células durante 24-48 horas a 37 °C com 5 % de C02.
2. O método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por as células mesenquimatosas serem isoladas a partir de tecido adiposo humano.
3. O método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio de tratamento utilizado nas etapas b), d) e f) compreender meio de cultura celular convencional a 85-95 %, soro bovino fetal a 5-15 %, antibióticos a 0,5-5 % e peróxido de hidrogénio a 0,01-0,05 mM.
4. Células estaminais mesenquimatosas derivadas a partir de tecido adiposo pré-condicionadas obtidas diretamente a partir do método de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizadas por estas células estaminais mesenquimatosas manterem o seu fenótipo não diferenciado, apresentarem um citoesqueleto onde os microfilamentos estão organizados em fibras de stress, apresentarem um aumento da expressão do gene S0D1 de pelo menos 30 % em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR, apresentarem um aumento da expressão do gene SOD2 de pelo menos 25 % em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR, apresentarem um aumento da expressão do gene SOD3 de pelo menos 50 % em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR, e apresentarem um aumento da expressão do gene Cat de pelo menos 50 % em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR.
5. As células estaminais mesenquimatosas derivadas a partir de tecido adiposo pré-condicionadas de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas por as células apresentarem um aumento intracelular de GSH de pelo menos 8 % em relação a ASC não tratadas, medido pelo método enzimático de Tietze.
6. As células estaminais mesenquimatosas derivadas a partir de tecido adiposo pré-condicionadas de acordo com a reivindicação 5, caracterizadas por as células apresentarem uma diminuição intracelular de MROs de pelo menos 10 % em relação a ASC não tratadas, medida pelo método quantitativo fluorimétrico com sonda DCFA.
7. As células estaminais mesenquimatosas derivadas a partir de tecido adiposo pré-condicionadas de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas por as células apresentarem um aumento de beta-actina de pelo menos 40 % em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR.
8. As células estaminais mesenquimatosas derivadas a partir de tecido adiposo pré-condicionadas de acordo com a reivindicação 7, caracterizadas por as células apresentarem um aumento de IGF-1 de pelo menos 40 % em relação a ASC não tratadas, medido por método de PCR.
9. As células estaminais mesenquimatosas derivadas a partir de tecido adiposo pré-condicionadas de acordo com as reivindicações 5-8 para utilização no tratamento de doenças relacionada com, ou causadas por, stress oxidativo.
10. As células estaminais mesenquimatosas derivadas de tecido adiposo pré-condicionadas para utilização de acordo com a reivindicação 9 no tratamento de doenças selecionadas a partir do grupo que consiste em: periarterite nodosa, diabetes mellitus, doença granulomatosa crónica, arteriosclerose, acidente vascular cerebral, fibrose pulmonar (doença pulmonar obstrutiva crónica, DPOC, fibrose pulmonar idiopática), sindrome de isquemia-reperfusão, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistémico, doença inflamatória do intestino: colite ulcerativa e doença de Chron, sindrome de dificuldade respiratória do adulto, aterosclerose, lesão da medula espinal, lesão de nervo periférico, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, ataxia de Friedreich, periodontite, doenças e distúrbios das mucosas e lesões que ocorrem com um componente de inflamação, úlceras e feridas agudas e crónicas.