KR20180044760A - 케노데옥시콜산을 이용한 줄기세포 증식능 향상 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid)을 포함하는 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 유전자 조작이나 바이러스 벡터 등을 사용하지 않으면서 배양환경 조절이라는 간편하고도 안전한 방법을 통하여, 차세대 고효율 줄기세포를 대량 생산할 수 있다.

Description

케노데옥시콜산을 이용한 줄기세포 증식능 향상 방법{Methods for improving proliferation of stem cell using chenodeoxycholic acid}

본 발명은, 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid)을 포함하는 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포는 그 다분화능과 함께, 조직의 재생, 치료 및 면역 반응에 관여하는 세포로 알려져 있어, 이와 같은 특성을 이용하여 제대혈, 골수 등으로부터 중간엽 줄기세포를 분리배양하여 다양한 질환의 치료제로 개발하고자 하는 노력이 있어왔으나, 줄기세포를 계대배양함에 따라 노화가 진행되며 세포 분화가 일어나므로 줄기세포능(stemness)을 잃게 되는 문제가 있다.

즉, 윤리적인 문제가 없는 성체줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발을 위해서는, 세포의 줄기세포능을 유지하면서 효과적으로 증식시킬 수 있는 방법을 확립하는 것이 필수적이나, 성체줄기세포는 증식율이 낮고, 쉽게 노화되어 한 조직에서 얻을 수 있는 세포의 수가 한정적이라는 한계가 있다.

이러한 문제를 해결하여 줄기세포 효율을 증진시키기 위한 방안으로서, 바이러스 벡터를 이용한 유전자 조작이나 특정 단백질 과발현이 제안되어 왔으나 이는 안정성 문제로 인하여 임상 적용에는 한계가 있는 바, 1세대 줄기세포 연구를 통해 특정질환 치료를 위한 임상적용 가능성은 검증되었으나 낮은 효율과 효과기전 규명이 미흡하고 안전성 확보 또한 해결되지 않고 있다.

이와 관련하여, 최근 분화세포(differentiated cell)에 비하여 배아줄기세포(ESC)와 유도만능줄기세포(iPS)에서 해당(glycolysis) 대사과정이 증가하고 산화적 인산화(oxidative phosphorylation) 대사과정이 감소되어 있음이 보고됨으로써, 대사과정을 조절하는 리프로그래밍(reprogramming)을 통해 줄기세포의 줄기세포능(stemness) 유지 및 세포 노화억제를 통한 고효율 줄기세포 개발 가능성이 제시되고 있으나, 이에 대한 분자생물학적 기전은 거의 밝혀지지 않았으며, 아직 효율적인 조절기술은 개발되지 못하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자는 줄기세포의 노화를 억제하고 세포 생존 및 증식율을 향상시킬 수 있는 방법에 대하여 예의 연구한 결과, 종래 담석용해제로 알려져 있는 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid)이 줄기세포를 효과적으로 증식시킬 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은, 케노데옥시콜산을 포함하는, 줄기세포 생존/증식 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, 케노데옥시콜산을 포함하는, 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 케노데옥시콜산은 배지에 1∼100μM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예로서, 상기 배지는 10% 소태아혈청(FBS) 및 50 ug/ml 젠타마이신이 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media) 배지인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 증식 향상방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어진, 증식능이 향상된 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면, 유전자 조작이나 바이러스 벡터 등을 사용하지 않으면서 배양환경 조절이라는 간편하고도 안전한 방법을 통하여, 차세대 고효율 줄기세포를 대량 생산할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 줄기세포의 대사 과정을 선택적으로 조절할 수 있는 분자생물학적 기전, 대사조절 마커를 규명함으로써 고효율 줄기세포 개발에 대한 새로운 방법론을 제시할 수 있다.

도 1은, 줄기세포에 케노데옥시콜산을 처리시 줄기세포 증식효율에 미치는 영향을 확인한 BrdU 어세이 결과이다.
도 2는, 줄기세포에 케노데옥시콜산을 처리시 줄기세포 증식효율에 미치는 영향을 확인한 ATP 어세이 결과이다.

본 발명은, 케노데옥시콜산을 포함하는, 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물을 제공한다.

종래, 케노데옥시콜산((R)-((3R,5S,7R,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-dihydroxy-10,13-dimethylhexadecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic acid)은 일차성 담즙산으로서 담즙염을 콜레스테롤로 전환하는 효소를 억제하는 담석용해제로서의 치료 용도가 알려져 있었으나, 본 발명에서는 케노데옥시콜산의 줄기세포능 향상 용도를 최초로 발견하였다.

[chenodeoxycholic acid]

본 발명에서 배지에 포함되는 케노데옥시콜산의 농도에 제한은 없으며, 예를 들면 1∼100uM의 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 10uM인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 세포 배양에 이용되는 배지에 제한은 없으며, 예를 들면 10% 소태아혈청(FBS) 및 50 ug/ml 젠타마이신이 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media) 배지인 것이 바람직하다.

본 발명에서 '줄기세포'란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서, '제대-유래 줄기세포(Wharton's Jelly-derived stem cells)'라 함은 제대로부터 분리된 줄기세포를 모두 포함하며, 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리(Wharton's Jelly)로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다.

본 발명에서, '태반-유래 줄기세포(placenta-derived stem cells)'라 함은 태반으로부터 분리된 줄기세포를 모두 포함하며, 바람직하게는 체외로 분리된 인간의 태반으로부터 분리된 4종류의 줄기세포, 즉 (1) 양막 상피세포(human amniotic epithelial cells, hAEC), (2) 양막에서 유래한 중간엽 줄기세포(human amniotic mesenchymal stromal cells 또는 human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSC), 3) 융모막 중간엽 줄기세포(human chorionic mesenchymal stromal cells 또는 human chorionic mesenchymal stem cells, hCMSC), 및 (4) 융모 영양막 세포(human chorionic trophoblastic cells, hCTC)를 포함한다.

중간엽줄기세포의 분리는 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시된 방법으로 분리될 수 있다.

본 발명에서 줄기세포 증식 향상이란, 세포노화가 억제되고 세포증식능 및 단백질 항상성이 향상됨으로서 줄기세포 특성이 유지되는 의미를 포함하며, 이에 의해 줄기세포 마커인 Nanog, Oct4 또는 KLF4 유전자 등의 발현이 증가될 수 있다. 이들 유전자는 배아줄기세포에서 많이 발현하는 줄기세포의 전분화능, 즉 줄기세포 특성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 유전자로 알려져 있다.

또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 증식 향상방법, 및 이에 의해 얻어진 증식능이 향상된 줄기세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 포함하는, 다양한 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 인간 제대 중간엽 줄기세포의 준비

인간 제대 중간엽 줄기세포는 삼성서울병원의 IRB (IRB# 2015-09-023-003)에 의해 승인된 기준에 따라 탯줄을 확보한 후, 다음의 방법으로 중간엽 줄기세포를 분리하였다.

우선, 3-4cm의 탯줄 조직을 잘게 자르고, 세포 외 기질을 분해하기 위해 콜라게나아제 용액 (Gibco, USA)을 60-90분 동안 처리한 후, 0.25% 트립신 (Gibco, USA)을 넣고 30분 동안 37℃에서 분해시켰다. 이후, 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS) (Biowest, USA)을 넣고 1000×g에서 10분 동안 원심 분리하여 세포를 얻고, MEM 배지(Minimum Essential Media) (Gibco, USA)에 10% FBS와 50 ug/ml 젠타마이신 (Gibco, USA)이 첨가된 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 환경에서 세포를 배양하여, passage 5 또는 6의 중간엽 줄기세포를 실험에 사용하였다.

실시예 2. 중간엽 줄기세포 증식 향상 확인

인간 제대 중간엽 줄기세포(1×10⁴ 세포)를 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 케노데옥시콜산(10 μM)를 처리하고 72시간 후에 하기의 세포증식 분석을 수행하였다.

2-1. BrdU cell proliferation assay

세포증식의 정도는 세포의 DNA 합성시에 결합되는 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)를 이용한 BrdU cell proliferation assay kit(Cell Signaling Technology, USA)로 분석하였다. 구체적으로는, BrdU를 세포에 첨가하고 24시간 동안 반응시킨 후 세포를 고정하고 DNA를 변성시킨 다음, Anti-BrdU 항체를 처리하고, HRP(horse-radish peroxidase)가 연결된 2차 항체를 사용하여 TMB(Tetramethylbenzidine) 기질과 반응시키고, ELISA reader로 450nm에서 흡광도 수치를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 케노데옥시콜산 처리군은 미처리 대조군에 비하여 중간엽 줄기세포의 증식률을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

2-2. ATP cell proliferation assay

살아있는 세포 내의 ATP 수준은 일정하게 유지되며, 생존하고 있는 세포의 수를 직접적으로 반영하므로, ATP 수준은 세포 증식을 측정하기 위한 방법으로 사용된다. 본 실시예에서는 ATP 측정을 위하여 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation, USA)를 이용하였으며, 발광도의 측정은 mithras LB-943 plate luminometer (Berthold Technologies, Germany)에서 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 케노데옥시콜산 처리군은 미처리 대조군에 비하여 중간엽 줄기세포의 증식률을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (9)

1. 케노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid)을 포함하는, 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 케노데옥시콜산은 배지에 1∼100μM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 배지는 10% 소태아혈청(FBS) 및 50 ug/ml 젠타마이신이 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media) 배지인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
6. 제 1 항의 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 증식 향상방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 증식 향상방법.
8. 제 1 항의 방법에 의해 얻어진, 증식능이 향상된 줄기세포.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포.

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