KR20120140197A - 정소의 체세포-유래의 다능성 줄기세포, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 발기부전 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 정소의 체세포-유래의 다능성 줄기세포, 더욱 상세하게는 CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내고, 정소의 체세포로부터 유래된, 다능성 성체줄기세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 정소의 체세포-유래의 다능성 줄기세포의 제조방법 및 이를 포함하는 발기부전 치료용 약학 조성물을 제공한다.

Description

정소의 체세포-유래의 다능성 줄기세포, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 발기부전 치료용 약학 조성물{Testicular somatic cell-derived multipotent stem cells, process for the preparation thereof, and pharmaceutical composition for treating erectile dysfunction comprising the same}
본 발명은 신규의 정소의 체세포-유래의 다능성 줄기세포, 더욱 상세하게는 CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내고, 정소의 체세포로부터 유래된, 다능성 성체줄기세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 정소의 체세포-유래의 다능성 줄기세포의 제조방법 및 이를 포함하는 발기부전 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
인간의 성체 조직-특이적 줄기세포는 손상된 조직을 수선 및/또는 교체할 수 있는 능력으로 인하여 임상적 유용성을 가지고 있다. 그러나, 성체줄기세포의 동정은, 적절한 조직-특이적 줄기세포의 결여로 인하여 곤란한 것으로 입증된 바 있다. 성체줄기세포의 임상적 적용을 더욱 제한하는 것은 이들이 배양에 있어서 한정된 수명을 가지며, 또한 특히 인간 배아줄기세포(ESCs)에 비하여 제한적인 분화능을 가지고 있다는 점이다. 현재까지 분리된 성체줄기세포 중, 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)가 가장 잘 특징분석되어 있다. BM-MSCs는 10년 전에 동정되었으며, 중배엽 기원의 다양한 분화된 세포 형태를 야기한다. 그러나, BM-MSCs의 분리는 환자에게 매우 고통스러우며, 일단 분리되더라도 배지 중에서 BM-MSCs를 유지하는 것은 곤란하며, 이는 BM-MSCs가 쉽게 노화에 이르고(통상 8계대에서), 쉽게 분화능을 상실하며, 또한 몇몇의 경우에는 시험관내 배양에서 증식시킨 후 종양형성성(neoplastic)이 되기 때문이다. 줄기세포의 다른 기원은 치수(dental pulp), 와톤 젤리, 양막, 및 지방조직을 포함하지만, 이들 모두 제한된 수명 및 분화능을 가지고 있다.
특이적 줄기세포 마커 중, CD34는 초기 조혈(hematopoietic) 및 혈관-연관(vascular-associated) 조직에서 발견된다. CD34는 116-kD 타입 I 막횡단 당단백질이나: 그 정확한 기능에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 조혈 시스템에서, 표면에 CD34를 발현하는 세포는 사이토카인 또는 성장인자 자극에 의해 증식하고 또한 모든 림프조혈 계통(lymphohematopoietic lineages)으로 분화한다. 따라서, CD34는 림프조혈 줄기/전구 세포 세포군의 동정 및 분리를 돕기 위한 마커로서 사용되어 왔으며; 더욱 최근에는 근육 위성 세포 및 상피 전구세포를 포함한, 다른 조직-특이적 줄기세포를 통정하는데 도움을 주는 마커로서 사용된 바 있다. 최근, CD34-양성 기질 세포는 유방, 난관(fallopian tubes), 갑상선, 직장, 췌장, 자궁경부, 및 정소를 포함한 다양한 기관에 분포되어 있다는 것이 밝혀졌다(Kim J, Seandel M, Falciatori I, et al. CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells. Stem Cells. 2008;26:2516-2522). 지방-유래 기질 세포(adipose-derived stromal cell, ASC) 세포군에서, CD34-양성 세포는 내피세포와의 구조적 및 기능적 상호작용에 의해 혈관 안정성에 중요한 역할을 하는 체류 혈관주위세포(resident pericytes)이다. 다른 연구에서, CD34-양성 세포는 CD34-음성 세포에 비하여 더욱 높은 증식능 및 콜로니-형성능을 나타냈으나, 더욱 낮은 분화능을 나타냈다. 따라서, 저자들은 CD34 발현은 미성숙 상태에서 특정 계통으로의 생리학적 분화 과정에 대하여 역으로 관련된다는 것을 제안하였다(Suga H, Matsumoto D, Eto H, et al. Functional implications of CD34 expression in human adipose-derived stem/progenitor cells. Stem Cells Dev. 2009;18:1201-1210). 그러나, CD73은 그라이코실 포스파티딜 이노시톨((GPI)-연결된 막-결합 당단백질로서, 세포밖 뉴클레오시드 모노포스페이트를 생활성의 뉴클레오시드 중간체로 가수분해한다. 이 항원은 중간엽 줄기세포, B-세포 및 T-세포의 아형(subsets), 및 내피세포를 포함한 대부분의 세포에서 발견된다. 따라서, 이 분자는 상이한 조직들로부터 유래된 MSCs를 동정하기 위한 마커로서 사용되어 왔다. 흥미롭게도, 현재까지 분리된 MSCs의 어느 것도 CD73 및 CD34 모두를 발현하지 않는다.
한편, 포유동물의 정소는 생식세포 및 다양한 종류의 체세포로 구성되어 있다. 특정 마커의 부재로 인하여 조직에서 잠재적인 줄기세포를 동정 및 편재화시키는 것은 곤란하였다. 몇몇의 연구자들은 정원줄기세포(spermatogonial stem cells, SSCs) 및 레이딕 줄기세포(Leydig stem cells)와 같은 단능성(unipotent) 줄기세포를 분리 및 증식시킨 바 있다(Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod. 2003;69:612-616; 및 Ge RS, Dong Q, Sottas CM, et al. In search of rat stem Leydig cells: identification, isolation, and lineage-specific development. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:2719-2724). 또한, 원시 생식세포-유래의(primordial germ cell-derived) 배아줄기세포-유사 세포를 인간 및 마우스로부터 정소 생검(testis biopsies)을 이용하여 생성시킨 바 있다(Conrad S, Renninger M, Hennenlotter J, et al. Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature. 2008;456:344-349; Guan K, Nayernia K, Maier LS, et al. Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Nature. 2006;440:1199-1203; Seandel M, James D, Shmelkov SV, et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 2007;449:346-350; Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Lee J, et al. Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell. 2004;119:1001-1012). 이들 세포는 모든 3배엽 세포로 분화되었으며, NOD-SCID 마우스에 주입하였을 때 종양을 형성하였다(Conrad S, Renninger M, Hennenlotter J, et al. Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature. 2008;456:344-349).
그러나, 정소의 체세포 줄기세포에 대한 연구는 거의 없다. 최근에서야 MSC-유사 세포군이 성체 인간 정소로부터 분리되었으며, 이를 중배엽-계통의 세포로 분화시킴으로써 특성분석되었다(Gonzalez R, Griparic L, Vargas V, et al. A putative mesenchymal stem cells population isolated from adult human testes. Biochem Biophys Res Commun. 2009;385:570-575). 이들 세포는 CD90에 대하여 양성이고 CD34에 대하여 음성이며, 이는 이들이 시험관내에서 제한된 수명을 갖는 정소-유래의 MSCs임을 시사한다. 마우스에서, CD34-양성 기질 세포는 성체 정소 전구 세포의 증식을 효율적으로 뒷받침하였다(Seandel M, James D, Shmelkov SV, et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 2007;449:346-350). 그러나, CD34/CD73-이중-양성 정소 기질 세포가 또다른 체세포 줄기세포의 기원일 수 있는지 여부, 및 만약 그렇다면, 그들의 분화 및 증식능은 어떠한지를 결정하기 위한 연구는 수행된 바 없다.
본 발명자들은 CD34/CD73-이중-양성 세포가 CD34-음성 세포에 비하여 현저하게 우수한 증식능을 나타내며, 또한 지방, 골, 신경, 췌장 계통 등의 세포로의 훨씬 높은 분화능을 나타낸다는 것을 발견하였다. 상기 세포는 NOD-SCID 마우스에서 테라토마를 형성하지 않았으며, 30계대 후에도 정상적인 핵형을 유지함으로써 높은 유전적 안정성을 보유하였다. 이들은 양측성 해면체 신경 분쇄 손상(bilateral cavernous nerve crush injury) 랫트 모델에서 발기부전의 기능적 회복을 촉진하였다. 또한, CD34를 발현하는 세포의 비율은 시험관내에서 세포의 계대 수가 증가함에 따라 감소하며, 세포가 최종적으로 분화됨에 따라 감소한다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 정소의 체세포로부터 유래된, CD34/CD73-이중-양성의 다능성 성체줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 정소의 체세포로부터 유래된, CD34/CD73-이중-양성의 다능성 성체줄기세포의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 정소의 체세포로부터 유래된, CD34/CD73-이중-양성의 다능성 성체줄기세포를 유효성분으로 포함하는 발기부전 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내고, 정소의 체세포로부터 유래된, 다능성 성체줄기세포가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 인체로부터 분리된 인간의 정소 조직으로부터 세정관의 바깥 주위 세포를 분리하고, 계대배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 세포에 대하여, 항-CD34 항체 및 항-CD73 항체를 사용한 분류(sorting)를 수행하여, CD34-양성 및 CD73-양성의 세포를 분리하고, 계대배양하는 단계를 포함하는, CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내는 다능성 성체줄기세포의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내고, 정소의 체세포로부터 유래된, 다능성 성체줄기세포를 유효성분으로서 포함하는, 발기부전 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명에 따라, CD34/CD73-이중-양성의 정소 기질 세포 즉, 정소의 체세포로부터 유래된 다능성 성체줄기세포가 새롭게 분리되었다. 상기 다능성 성체줄기세포는 우수한 증식능을 나타내며(약 평균 67.3±2.1의 세포군 이배화), 또한 지방 세포, 골 세포, 신경 세포, 췌장 세포(예를 들어, 인슐린-분리 세포)를 포함한 3배엽 계통의 세포로의 훨씬 높은 분화능을 나타낸다. 상기 다능성 성체줄기세포는 테라토마를 형성하지 않으며, 30계대 후에도 정상적인 핵형을 유지함으로써 높은 유전적 안정성을 보유한다. 특히, 상기 다능성 성체줄기세포는 양측성 해면체 신경 분쇄 손상(bilateral cavernous nerve crush injury) 랫트 모델에서 발기부전의 기능적 회복을 촉진한다. 따라서, 상기 다능성 성체줄기세포는 발기부전 치료용 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 비-폐색성 무정자증(NOA, A) 및 폐색성 무정자증(OA, B) 환자의 정소에서 CD34과 CD73, αSMA, 및 CD31의 동시-편재화를 나타낸다. DAPI 핵 염색은 청색이며; FITC 염색은 녹색이고; Cy3 염색은 적색이다. 백색 화살표는 CD34, CD73-이중 양성 시그널이다. 개방 화살표머리(open arrowheads)는 αSMA에 대한 시그널이다. 백색 화살표머리는 CD31에 대한 시그널이다.
도 2는 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs), 정소-유래 줄기세포(TSCs), 및 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)에 의한 특이적 마커 발현을 나타낸다. (A)는 인간 TSCs 세포군에서 CD34의 발현을 나타내는 면역세포화학 분석 결과이고(100X), 적색 시그널은 CD34 발현이다. (B)는 BM-MSCs, TSCs, 및 HTSCs에서 CD34 및 CD73 발현을 나타내는 면역세포화학 분석결과이고, DAPI 핵 염색은 청색이다. (C)는 HTSCs에서 만능줄기세포 마커인 OCT4, c-Kit, Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA3 및 SSEA4의 발현을 나타내는 면역세포화학 분석 결과이고; FITC 염색은 녹색이며; Cy3 및 TRITC 염색은 적색이다.
도 3은 다양한 종류의 정소-유래 줄기세포(TSCs)의 형태적 및 증식적 특성을 나타낸다. (A)는 동일한 배양조건하에 유지된 세포들의 형태에 있어서의 차이를 나타내는 위상차 현미경 이미지(phase contrast image)로서(MSC-유사 vs. 노화-유사 형태), 계대 1 및 계대 6에서의 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs), 계대 1 및 계대 13에서의 인간 TSCs, 및 계대 5, 13, 20, 및 27에서의 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의 위상차 이미지이다. (B)는 BM-MSCs, TSCs, 및 HTSCs의 누적 이배수의 비교를 나타낸다.
도 4는 추가 배양 전 및 후에 분류된 세포군의 유세포 분석를 나타낸다. (A)는 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs), 정소-유래 줄기세포(TSCs), 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs), 및 재분류된 HP-TMSCs의 누적 이배수의 비교를 나타낸다. (B)는 HTSCs의 추가 배양 후에, CD34-양성 세포는 감소되었지만, CD73-양성 세포는 풍부하게 유지되었음을 나타낸다. (C)는 배양 동안, HTSCs는 CD34-발현이 점차 없어졌고 CD34 발현을 회복하지 못했으나, CD34-양성 세포의 집단을 MACS에 의해 분류하고 증식시켰을 때, HTSCs의 증식이 더 연장되었음을 나타낸다.
도 5는 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs), 정소-유래 줄기세포(TSCs), 및 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의 중배엽 계통(연골, 지방, 골 세포)으로의 시험관내 분화 능력을 나타낸다. (A)는 3주 동안 연골 분화 후에, 계대 5의 BM-MSC, 계대 3의 TSCs, 계대 5, 13, 20 및 재분류된 계대 20의 HTSCs에서 황산 프로테오글리칸((sulfated proteoglycans)에 대한 알시안 블루 염색(왼쪽 패널)과 동일한 군에서 연골 분화 전후에 분석된 SOX9 (오른쪽 패널의 왼쪽) 및 COMP (오른쪽 패널의 오른쪽)의 유전자 발현을 나타낸다. (B)는 오일 레드 O를 사용한 지방구(lipid droplets)의 염색(왼쪽 패널)과 PPARγ(오른쪽 패널의 왼쪽) 및 C/EBPα(오른쪽 패널의 오른쪽)의 유전자 발현을 나타낸다. (C)는 알리자린 레드 S의 칼슘 축적물(왼쪽 패널)과 골 분화를 평가하기 위한 CBFA I (오른쪽 패널의 왼쪽) 및 COL I (오른쪽 패널의 오른쪽)의 유전자 발현을 나타낸다.
도 6은 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs) 및 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의 인슐린-분비 세포로의 시험관내 분화 능력을 나타낸다. (A, B)는 다양한 분화 조건에서 배양한 후에, 인슐린 및 C-펩타이드 분비에 대한 효소결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorent assay)결과를 나타낸다. (C)는 HTSCs 및 BM-MSCs으로부터 유래된 인슐린 분비 세포간에 인슐린 및 NGN-3 유전자 발현의 비교를 나타낸다.
도 7의 (A)는 랫트에서 손상 부위 가까이의 해면체 신경(cavernous nerve)의 전기자극을 나타내며, 상기 해면체(corpus cavernosum)에 24-게이지 바늘을 사용하여 삽관하였다. 도 7의 (B)는 발기능의 측정결과를 나타내며, 각각 적색, 청색 및 녹색 커브는 신경 자극에 대한 평균 혈압(mean arterial pressure)(MAP), 음경해면체내압(intracavernous pressue) (IAP) 및 ICP/MAP 비율을 각각 나타낸다. 도 7의 (C)는 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs) 및 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의 주입이 손상 그룹에 비하여 ICP/MAP 비율을 증가시켰음을 나타낸다. 도 7의 (D)는 HTSCs (화살표머리)를 시각화하기 위하여 CellTracker (적색 형광) 및 뉴우런 마커(TuJI, 짙은 브라운색)로 염색한 주위신경성 전립선(perineural prostatic) 조직을 나타낸다. 도 7의 (E)는 TuJI (보라색, 화살표) 및 인간 세포-특이적 항체 Stem 121 (녹색, 백색 화살표머리)이다. DAPI 핵 염색은 청색이며; CellTracker는 적색이다(개방 화살표머리).
도 8은 CD34-양성 및 CD73-양성의 정소-유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 과정의 일 예를 나타낸다.
도 9의 (A)는 초기 정소 간질세포에서의 특이적 마커 발현을 나타낸다. 면역세포화학 분석결과는 첫번째 열에서 CD34 (적색, 백색 화살표머리) 및 3β-HSD (녹색, 개방 화살표머리), 두번째 열에서 GFR α1 (적색, 백색 화살표머리) 및 Thy-1 (녹색, 개방 화살표머리), 및 세번째 열에서 αSMA (적색) 및 Desmin (녹색)의 발현을 나타낸다. 도 9의 (B)는 정소 조직 100 mg 당 각 단계에서 분리된 세포 수를 나타낸다. 출발 물질은 0일째에 계수하였고, 부착 세포는 3일째에 계수하였고, CD73-분류 세포는 계대 2에서 계수하였고, CD34-분류 세포는 계대 3에서 계수하였다. 도 9의 (C)는 계대 3 및 계대 8에서의 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)에서의 특이적 마커 발현을 나타낸다. 면역세포화학 분석결과는 CD34 (적색)의 발현 및 GFR α1 혹은 Thy-1 (녹색)의 비-발현을 나타낸다. 도 9의 (D)는 CD34 (적색)의 발현 및 3β-HSD의 비-발현을 나타내는 면역세포화학 분석결과이다. 도 9의 (E)는 CD34 (적색)의 발현 및 Desmin 또는 αSMA의 비-발현을 나타내는 면역세포화학 분석결과이다.
도 10은 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의 유세포 분석 결과를 나타낸다. HTSCs는 HLA-ABC, CD73, CD166, CD44, CD29, CD90, CD105 및 CD34에 대하여 강한 양성이고; CD14, CD133, 및 StroI에서 약한 양성이며; 또한 SSEA3, TRA-1-81, c-Kit, CD31, TRA-1-60, CD140, HLA-DR, CD45 및 SSEA4 항원에 대하여 음성이다. 약어: APC, 알로피코시아닌(allophycocyanin); FITC, 형광 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate); PE, 피코에리쓰린(phycoerythrin).
도 11은 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의 특성을 나타낸다. (A)는 HTSCs가 표시된 계대에서 정상적인 핵형(2n, 46XY)을 가지고 있음을 나타낸다. (B)는 HTSCs에서 만능성 마커(Oct4, NANOG, SOX2) 및 생식세포 마커(VASA)의 RT-PCR 분석결과를 나타낸다.
도 12는 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs) 및 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)에 대한 콜로니 형성 단위 분석(Colony forming unit assay) 결과를 나타낸단. BM-MSCs 및 HTSCs는 조혈 조건에서 콜로니 형성을 나타내지 않지만(B), 비-조혈 조건에서는 콜로니 형성을 나타냈다(A).
도 13의 (A)는 신장(A1-A4) 및 정소(A5-A8)에서 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의 테라토마 형성 분석결과를 나타낸다(100X). 두 조직 모두에서 기형종 형성은 없었다. 도 13의 (B)는 배아줄기세포로부터의 테라토마 형성을 나타낸다(x200). 창자-유사 내피(gut-like epithelium) (내배엽, H-E 염색, B1), 연골 (중배엽, 알시안 블루 염색, B2), 분비성 내피(secretory epithelium) (내배엽, PAS 염색g, B3), 및 근섬유(muscle fibers) (중배엽, 매슨 트리크롬 염색(Masson’s trichrome staining), B4). 도 13의 (C)는 마우스 및 인간 정소 조직에서 특정 인간 세포-특이적 마커(Stem 121) 발현을 나타낸다. 면역세포화학분석은 첫번째 열에서 Stem 121의 비-발현을 나타내나, 두번째 및 세번째 열에서는 발현을 나타낸다.
도 14는 배아줄기세포(ESCs), 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs), 지방-유래(AD)-MSCs, 및 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의 중배엽 계통(지방, 골 및 연골 세포)으로의 시험관내 분화 능력을 나타낸다. (A)는 PPARγ (상부 왼쪽) 및 C/EBPα (상부 오른쪽)의 유전자 발현을 나타내며. (B)는 COL I (중간 왼쪽) 및 CBFA I (중간 오른쪽)의 유전자 발현을 나타내며. (C)는 COMP (하부 왼쪽) 및 SOX9 (하부 오른쪽)의 유전자 발현을 나타낸다.
도 15는 골수-유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs) 및 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의 신경 계통 세포로의 시험관내 분화 능력을 나타낸다. (A)는 네스틴이 BM-MSCs 및 HTSCs로부터 분화된 신경 세포에서 발현되었음을 나타낸다(x200). (B)는 BM-MSCs 및 HTSCs로부터 분화된 신경 세포의 위상차 현미경 사진이다(100X). (C)는 BM-MSCs와 비교하여 유도된 HTSCs에 신경으로 분화시킨 세포에서 GFAP 및 β-튜불린 3의 유전자 발현을 나타낸다.
도 16은 고증식성 정소-유래 줄기세포(HTSCs)의서 중배엽 계통(지방, 골 및 연골 세포)으로의 생체내 분화 능력을 나타낸다. (A, B)는 지방세포로 분화시킨 HTSCs에서 PPARγ 및 C/EBPα의 유전자 및 단백질 발현, 골세포 분화시킨 HTSCs에서 COL I 및 CBFA I의 유전자 및 단백질 발현, 비-유도된 것과 비교하여 연골세포로 분화시킨 HTSCs에서의 COMP 및 SOX9의 유전자 및 단백질 발현을 나타낸다. C 및 D는 특이적 염색 및 특정 마커를 사용한 면역세포화학 분석 결과를 나타낸다
도 17은 CD34를 발현하는 세포의 비율 및 세포의 분화 정도를 분석한 결과이다. CD34를 발현하는 세포의 비율은 계대배양(계대 5, 13, 및 20)에 따라 감소하였으며, 모든 3배엽 게통의 마커 유전자(중배엽 유전자: PPAR, C/EBP, COL I, CBFA I, COMP, 및 SOX9; 내배엽 유전자: Insulin 및 NGN; 및 외배엽 유전자: GFAP 및 β-Tubulin 3)의 발현 수준도 또한 감소하였다.
본 발명은 CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내고, 정소의 체세포로부터 유래된, 다능성 성체줄기세포를 제공한다.
본 발명에 따른 다능성 성체줄기세포는 우수한 증식능을 나타내며(약 평균 67.3±2.1의 세포군 이배화), 또한 지방 세포, 골 세포, 신경 세포, 췌장 세포(예를 들어, 인슐린-분리 세포)를 포함한 3배엽 계통의 세포로의 훨씬 높은 분화능을 나타낸다. 상기 다능성 성체줄기세포는 테라토마를 형성하지 않으며, 30계대 후에도 정상적인 핵형을 유지함으로써 높은 유전적 안정성을 보유한다. 상기 다능성 성체줄기세포에 있어서, 상기 정소의 체세포는 세정관(seminiferous tubles)의 바깥 주위 세포(outer surrounding cells), 바람직하게는 간질세포(interstitial cells)일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 다능성 성체줄기세포의 제조방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 (a) 인체로부터 분리된 인간의 정소 조직으로부터 세정관의 바깥 주위 세포를 분리하고, 계대배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 세포에 대하여, 항-CD34 항체 및 항-CD73 항체를 사용한 분류(sorting)를 수행하여, CD34-양성 및 CD73-양성의 세포를 분리하고, 계대배양하는 단계를 포함하는, CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내는 다능성 성체줄기세포의 제조방법을 제공한다.
인체로부터 분리된 인간의 정소 조직(testis tissue)은 불임 클리닉에서 임상적인 목적으로 통상적으로 채취된 남성의 정소 조직을 말한다. 즉, 불임 남성 환자 예를 들어, 무정자증 환자는 불임 클리닉에서 정자채취-세포질내 정자주입(TESE-ICSI)의 시술을 위하여 정소 조직을 채취하게 되며, 임상적인 사용 후 남아있는 조직은 폐기되게 된다. 본 발명의 제조방법은 상기와 같이 불임 클리닉 등에서 폐기되는, 인체로부터 분리된 남성의 정소 조직을 사용할 수 있다. 상기 정소 조직은 폐색성 또는 비-폐색성 무정자증 환자로부터 체외로 분리된 것일 수 있다.
체외로 분리된 정소 조직, 바람직하게는 RBC 용해 완충액으로 세척된 정소 조직은 효소처리를 통하여 세정관의 바깥 주위 세포, 바람직하게는 세정관의 간질세포를 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 분리는 인체로부터 분리된 인간의 정소 조직을 콜라게나아제, 디스파아제, 또는 이들의 혼합물을 사용한 효소처리에 의해 수행될 수 있다. 상기 효소처리는 약 37℃에서 약 30분 동안 교반함으로써 수행될 수 있다.
얻어진 세정관의 바깥 주위 세포(예를 들어, 간질세포)는 통상의 세포 배양 배지 중에서 계대배양(subculturing)할 수 있으며, 예를 들어, 지지세포 및 혈청을 함유한 배지 중에서 2 내지 4 계대까지, 바람직하게는 3계대까지 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 지지세포는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 혈청을 함유한 배지로는 우태아혈청, 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된, DMEM-F12 (Gibco) 및 Stempro 34(Invitrogen Corporation, Camarillo, CA)의 혼합 배지를 바람직하게 사용할 수 있다. 각각의 계대배양은 예를 들어 80% 콘플루언시(confluency)에 도달하였을 때, 트립신-EDTA 등을 사용하여 단일 세포로 분리하여, 이어지는 계대를 수행할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 단계(a)로부터 얻어진 세포에 대하여, 항-CD34 항체 및 항-CD73 항체를 사용한 분류(sorting)를 수행하여, CD34-양성 및 CD73-양성의 세포를 분리하고, 계대배양하는 단계[즉, 단계(b)]를 포함한다.
상기 분류(sorting)은 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 자기 활성화 세포 분류(magnetic activating-cell sorting)에 의해 수행될 수 있다. 상기 자기 활성화 세포 분류(magnetic activating-cell sorting, MACS)는 특정 마커에 반응하는 세포를 분리해내는 분리방법으로서, 예를 들어 Dynabeads Flowcomp (Invitrogen) 등의 기기를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 자기 활성화 세포 분류는 본 발명자들의 선행 논문인 Lim, J.J., et al. Long-term proliferation and characterization of human spermatogonial stem cells obtained from obstructive and non-obstructive azoospermia under exogenous feeder-free culture conditions. Cell Prolif 43, 405-417 (2010)에 개시된 방법을 이용하여, 항-CD34 항체 및 항-CD73 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 문헌은 전체로서 본 명세서에 포함된다.
단계(b)의 상기 계대배양은 지지세포 및 혈청을 함유한 배지 중에서 7 내지 9 계대까지 바람직하게 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 지지세포는 젤라틴일 수 있으며, 상기 혈청을 함유한 배지는 우태아혈청, 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된, DMEM-F12 (Gibco) 및 Stempro 34(Invitrogen Corporation, Camarillo, CA)의 혼합 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 각각의 계대배양은 예를 들어 80% 콘플루언시(confluency)에 도달하였을 때, 트립신-EDTA 등을 사용하여 단일 세포로 분리하여, 이어지는 계대를 수행할 수 있다.
단계(b)에서 항-CD34 항체 및 항-CD73 항체를 사용한 MACS에 의해 분리된 세포를 장기간 동안 계대배양할 경우, 7 내지 9 계대(약 8계대) 이후에 CD34-양성을 나타내는 줄기세포의 수가 급격하게 감소될 수 있다. 본 발명자들은 7 내지 9 계대(약 8계대) 까지 수행된 세포에 대하여 추가의 분류, 예를 들어 MACS에 의한 분류를 수행할 경우, 더욱 장기간 동안의 계대배양 과정에서도 CD34-양성을 나타내는 줄기세포를 유지할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 일 구현예에서, 상기 7 내지 9 계대까지 수행된 세포에 대하여, 항-CD34 항체를 사용한 분류, 바람직하게는 MACS에 의한 분류[즉, 2차 MACS]를 수행하고, 추가의 계대배양(additional subculturing)을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가의 계대배양은 상기 단계(b)의 계대배양에 추가하여 7 내지 12 계대까지[예를 들어, 단계(b)의 초기 계대배양이 8계대까지 수행되었을 경우, 15 내지 20 계대까지] 수행될 수 있다.
또다른 구현예에서, 상기 추가의 계대배양은 상기 단계(b)의 계대배양에 추가하여 12계대까지 수행하고[예를 들어, 단계(b)의 초기 계대배양이 8계대까지 수행되었을 경우, 20 계대까지 수행하고], 항-CD34 항체를 사용한 분류, 바람직하게는 MACS에 의한 분류[즉, 3차 MACS]를 수행하고, 이어지는 계대배양을 수행할 수도 있다.
본 발명은 또한, CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내고, 정소의 체세포로부터 유래된, 다능성 성체줄기세포를 유효성분으로서 포함하는, 발기부전 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 얻어진 상기 다능성 성체줄기세포를 양측성 해면체 신경 분쇄 손상(bilateral cavernous nerve crush injury, BCNCI) 랫트의 전립선주변(periprostatic)에 국소 투여하였을 때, BCNCI가 회복되는 것을 밝혀냈다. 따라서, 상기 다능성 성체줄기세포는 발기부전의 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 본 발명에 따라 얻어진 CD34-양성 및 CD73-양성의 다능성 성체줄기세포는 테라토마를 형성하지 않으므로, 안전하게 환자에 투여될 수 있다. 또한, 통상 전립선암이 전립선의 생검술(transrectal biopsy), 예를 들어 근치적 전립선 적출술(radical prostatectomy)을 통해 진단될 경우, 얻어진 정소 생검물로부터 본 발명의 제조방법에 따라 자가(autologous) 정소-유래의 줄기세포를 얻을 수 있으므로, 상기 다능성 성체줄기세포는 면역 부적합 등의 안전성 문제없이 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 근치적 전립선 적출술(radical prostatectomy)에 의하여 발생된 발기부전의 치료에 특히 적합하게 적용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 상기한 바와 같이 CD34-양성 및 CD73-양성의 정소의 체세포에서 유래된 다능성 성체줄기세포를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라 통상의 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 CD34-양성 및 CD73-양성의 정소의 체세포에서 유래된 다능성 성체줄기세포의 투여량은 발기부전 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 투여형태, 투여경로 및 기간에 따라 상이하다. 예를 들면, 상기 CD34-양성 및 CD73-양성의 정소의 체세포에서 유래된 다능성 성체줄기세포는 1회 투여시 105 내지 108 cells/ml의 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하거나 설명하기 위한 것으로 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
1. 재료 및 방법
(1) 고증식성의 인간 정소-유래 줄기세포( HTSCs )의 분리 및 배양
정자채취-세포질내 정자주입(TESE-ICSI) 치료를 받은 남성 환자로부터 임상 사용 후에 남아있는 총 25개의 정소 조직을 환자의 동의(informed consent)하에 얻었다. 이 중 10개의 샘플은 계대 1-2 과정에서 세포가 마이코플라스마-오염에 대하여 양성 반응을 보여(MycoAlert® mycoplasma detection kit, Lonza, Rockland, ME) 제외시켰다. 최종적으로, 폐색성(OA, n=2) 또는 비-폐색성(NOA) 무정자 환자(n=13)로부터 얻어진 정소 조직을 본 연구에 사용하였다. 본 연구는 강남 차병원(서울, 대한민국)의 기관윤리위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았다.
전체적인 연구 디자인을 도 8의 플로우 챠트에 요약하였다. 정소 조직을 RBC 용해 완충액(Roche Diagnostics, 바젤, 스위스)을 사용하여 세척하고, 세정관(intact seminiferous tubules)의 간질세포(interstitial cells)를 효소 용액[0.5 mg/ml 콜라게나아제(type IV; Gibco), 0.25mg/ml 디스파아제 II (neutral protease, grade III, Roche)를 함유하는 Hank's balanced salt solution (HBSS, Gibco, Grand Island, NY)] 중에서 37℃에서 30분 동안 교반하여 효소적으로 분리시켰다. 간질세포를 분리하기 위하여, 세정관(seminiferous tubule) 바깥의 주위 세포만을, 가능한 많이 세관(tubule)의 분리를 회피하면서, 효소 분해(enzyme digestion) 및 물리적 교반에 의해 분리하였다. 간질세포의 현탁액을 모으고, 세척한 후, 40 ㎛ 메쉬 (BD, Franklin Lakes, NJ)를 통하여 여과하였다. 이후, 이들을 기초 배양 배지(10% 우태아혈청(FBS, Gibco), 페니실린/스트렙토마이신(1X, Gibco)로 보충된, DMEM-F12 (Gibco) 및 Stempro 34(Invitrogen Corporation, Camarillo, CA)의 50:50 혼합물)에서 0.1% 젤라틴(Gibco)으로 코팅된 배양 플라스크로 옮겨 부착시켜 배양하였다(5.0x105/ml). 7-8일 후에, 80% 콘플루언시(confluency)의 세포를 0.25% 트립신-EDTA (Gibco)로 떼어내고, 계대배양하였다. 계대 2-3 후에, 초기 배양된 세포를 떼어낸 다음, Dynabeads Flowcomp(Invitrogen)으로 분류(sorting)하여 CD73(Santa Cruz Biotechnology)/CD34(Santa Cruz Biotechnology, CA)-이중 양성 세포를 얻었다. 즉, 떼어낸 세포를 CD73 항체 및 바이오틴-컨쥬게이티드 고우트 항-마우스 IgM(biotin-conjugated goat anti-mouse IgM)과 함께 인큐베이션한 후, 스트렙트아비딘-결합된 마그네틱 다이나비드(streptavidin-bound magnetic Dynabead)와 혼합하였다. 분류(sorting) 후, 세포를 유리 완충액(releasing buffer) 중에서 인큐베이션한 후, Dynal MPC-1 magnet로 옮겼다. 유리된 CD73-양성 세포를 모으고, 4-7일 동안 추가 배양한 다음, 떼어내고, 상기한 방법을 사용하여 바이오티닐화된 CD34 항체를 사용하여 2차 분리를 수행하였다. 분류된 CD34-음성/CD73-양성 세포를 TSCs로 칭하였으며, 기초 배양 배지 중에서 0.1% 젤라틴(Gibco)으로 코팅된 배양 플라스크에 옮겨 부착시켜 배양하였다(5.0x105/ml). 또한, 분류된 CD34-양성/CD73-양성 세포는 HTSCs로 칭하였으며, 다시 새로운 배양 플라스크에 옮겨 부착시키고(1,000 세포 /25cm2), 10 내지 14일 동안 기초 배양 배지에서 배양하였다. 배지는 2일에 한번 교체하였다. 각 계대에서 누적 세포군 이배수(cumulative population doubling)는 공식 2X=NH/NI을 사용하여 계산하였으며, 여기서 NI 은 접종된 세포수이고, NH 는 콘플루언스(confluence)(>80%)에서 수확한 세포수이며, X는 집단 이배수이다. 계산된 집단 이배수 증가는 이전의 집단 이배수 값에 더하여, 누적 집단 이배수 값을 얻었다.
(2) 유세포 분석 ( Flow Cytometric Analysis )
계대 2 후에, 80% 콘플루언시를 갖는 HTSCs를 3-4일 간격으로 계대배양하였다. 계대 5에서, HTSCs의 일부를 재현탁시킨 후, 항체와 함께 암소에서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 CD34, CD73, HLA ABC, CD166, CD44, CD29, CD105, CD90, CD31, CD45, HLA DR, TRA-1-60, SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, CD14 (BD), CD133(eBioscience inc, San Diego, CA), c-Kit (Santa Cruz Biotechnology) 및 Stro-1 (Bioregend, San Diego, CA)를 검출하였다. 세포를 세척하고, 500 ㎕ PBS에 현탁하고, 즉시 유세포분석기(FACS Vantage SE System, BD)로 분석하였다. 죽은 세포를 확인하기 위해, HTSCs를 프로피디움 아이오다이드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)와 함께 인큐베이션하였다. 각각의 특이적인 항체에 양성인 세포의 퍼센트를 적절한 동형(isotype) 대조군과 비교하여 계산하였다.
(3) 면역세포화학( Immunocytochemistry )
HTSCs를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고, 4℃에서 보관하였다. 0.1% 트리톤 X-100(Sigma) 중에서의 투과(permeabilization) 및 블로킹 용액(blocking solution)(Dako Cytomation Inc., Carpinteria, CA) 중에서의 블로킹 후에, 블로킹 완충액에 희석시킨 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시켰다. 세포를 블록킹 완충액 중의 2차 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) (1:500, Jakson Immunoresearch, West Grove, PA)를 사용한 염색(counter staining) 및 봉입(mounting)(Dako Cytomation Inc.)을 수행하였다. 사용된 1차 항체는 CD34(1:100, Santa Cruz Biotechnology), CD73(1:100, Santa Cruz Biotechnology), OCT4, c-Kit, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA3, SSEA4(1:100, Chemicon, Thmecula, CA), GFRα1, Thy-1, 3β-HSD, Desmine, αSMC 및 nestin (1:100, Millipore, Billerica, MA)이었다. 2차 항체가 컨쥬게이션된 FITC (1:200, Jakson Immunoresearch), CY3 (1:200, Jakson Immunoresearch) 및 TRITC (1:200, Jakson Immunoresarch)를 사용하였다.
인간 정소에서 CD34 및 CD73의 편재화(localization)을 위하여, 냉동편(cryosections)을 10% 중성 완충 포르말린으로 1시간 동안 고정하였다. 세척 및 블록킹 후, 블로킹 완충액에 희석시킨 1차 항체를 4℃에서 밤새 반응시켰다. 조직들을 블록킹 완충액 중의 2차 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후, DAPI로 염색(counter staining)하고 봉입입하였다. 사용된 1차 항체는 CD34 (1:100, Santa Cruz Biotechnology), CD73 (1:10, Santa Cruz Biotechnology), CD31 (1:50, Abcam, Cambridge, UK), αSMA (1:50, Abcam)이었다. 2차 항체가 컨쥬게이션된 FITC (1:100) 또는 Cy3 (1:100)를 사용하였다.
(4) 핵형분석( Karyotying )
HTSC의 세포유전학적 분석을 위해, 계대 5, 13, 20 및 30에서의 세포를 0.1 ㎍/ml 콜세미드(KaryoMax Colcemid Solution; Gibco)를 함유하는 기초 배양 배지에서 3시간 동안 배양하였다. 이후, 저장성 용액(hypotonic solution)(1% 구연산나트륨 완충액)으로 30분 동안 처리한 다음, 메탄올 및 아세트산(3:1, vol/vol)을 사용하여 고정하였다. 세포를 유리 슬라이드 상에 펴서 건조시키고, 염색체를 G 밴딩(G banding)으로 확인하였다. 각 세포주의 핵형분석을 위해, 20 이상의 중기 염색체를 전문가에 의해 계수하였다.
(5) 실시간- RT - PCR ( Real time - RT - PCR )
제조사의 지침서에 따라, Tri-reagent(Sigma-Aldrich)를 사용하여 RNA를 분리하였다. RNA의 순도는 분광광도계(ND-1000, NanoDdrop, Thermo Scientific, Wilminton, DE)를 사용하여 분석하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)은 Prime script 1st strand cDNA 합성 키트(TakaRa Bio Inc, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하여 수행하였다. 이어지는 PCR 반응은 cDNA, 하기 표1의 프라이머 쌍(primer pairs)와 함께, 계대 5에서의 TSC, 계대 5에서의 HTSCs, hESCs (계대 72에서의 CHA-hES4)(Lee, J.E., et al. Evaluation of 28 human embryonic stem cell lines for use as unrelated donors in stem cell therapy: implications of HLA and ABO genotypes. Cell Transplant 19, 1383-1395 (2010)), 계대 3에서의 BM-MSCs (PT-2501, LONZA, Walkersville, MD), 및 계대 3에서의 지방유래 hMSCs (AD-MSC)(Hwang ST, Kang SW, Lee SJ, et al. The expansion of human ES and iPS cells on porous membranes and proliferating human adipose-derived feeder cells. Biomaterials. 2010;31:8012-8021)로부터 유래된 RNAs을 사용하여 수행하였다.
유전자 서열
번호		 프라이머 서열 크기
(bp)		 어닐링
온도(℃)
b-actin 1 5'-TGA AGT GTG ACG TGG ACA TC-3' 152 58
2 5'-GGA GGA GCA ATG ATC TTG AT-3'
Oct-4 3 5'-AGC GAA CCA GTA TCG AGA AC -3' 140 58
4 5'-TTA CAG AAC CAC ACT CGG AC -3'
NANOG 5 5'-TGA ACC TCA GCT ACA AAC AG-3' 124 59
6 5'-TGG TGG TAG GAA GAG TAA AG-3'
SOX2 7 5'-AGC TAC AGC ATG ATG CAG GA -3' 125 59
8 5'-GGT CAT GGA GTT GTA CTG CA-3'
VASA 9 5'-AGA AAG TAG TGA TAC TCA AGG ACC AA-3' 285 58
10 5'-TGA CAG AGA TTA GCT TCT TCA AAA GT-3'
COL I 11 5'-AGA ACA TCA CCT ACC ACT GC-3' 350 57
12 5'-ATG TCC AAA GGT GCA ATA AT-3'
CBFA 1 13 5'-CCG CAC GAC AAC CGC ACC AT-3' 290 61
14 5'-CGC TCC GGC CCA CAA ATC TC-3'
PPAR γ
 15 5'-TGT CTC ATA ATG CCA TCA GG TTG-3' 250 57
16 5'-GAT AAC GAT GGT GAT TTG TCT GTT-3'
C/EBPa
17 5'-GCA AAC TCA CCG CTC CAA ATG-3' 247 57
18 5'-TTA GGT TCC AAG CCA TCA GGT TTG-3'
COMP 19 5'-AAC GCT GAA AGA TCA CGC TCA C -3' 250 61
20 5'-GGT ACC AAA GAT GAA GCC C-3'
SOX 9 21 5'-TTC ATG AAG AG ACC GAC GA-3' 350 57
22 5'-CAC ACC ATG AAG GCG TTC AT-3'
GFAP 23 5'-CTG GAG GTT GAG AGG GAC AAT CT-3' 317 57
24 5'-TAC TGC GTG CGG ATC TCT TTC-3'
β-tubulin 3
(TUBB3)		 25 5'-GCC AAG TTC TGG GAA GTC AT-3' 209 57
26 5'-GGC CTG AAG AGA TGT CCA AA-3'
NGN3 27 5'-CGT GAA CTC CTT GAA CTG AGC AG-3' 221 61
28 5'-TGG CAC TCC TGG GAC AAA TTT C-3'
Insulin 29 5'-AAC CAA CAC CTG TGC GGC TC -3' 322 59
30 5'-AAG GGC TTT ATT CCA TCT CTC TCG-3'
GAPDH 31 5'-CGC TGA GTA CGT CGT GGA GT-3' 366 61
32 5'-ATG ATG TTC TGG AGA GCC CC-3'
목표 mRNA는 β-액틴에 대하여 상대적으로 정량하였다. 증폭 생성물은 DyNAmo SYBR green qPCR kit (Finnzymes, Espoo, Finland)를 사용하여 DNA Engine 2 형광 검출 시스템(MJ research) 상에서 정량하였다. 4 ㎕ DEPC-처리된 물, 2 ㎕ 정방향 프라이머(5 pmol), 2 ㎕ 역방향 프라이머(2 pmol), 10 ㎕ SYBR green 프리믹스(premix with SYBR green), 및 2 ㎕ cDNA 주형을 함유하는 총 20 ㎕ 용적의 반응 혼합물로 반응을 수행하였다. 72℃ 연장 단계(extension step) 동안 각 싸이클의 마지막에 형광을 측정하였다. 실시간 PCR의 최종 단계에서, 일정한 형광 측정치를 사용하여 온도를 65℃에서 95℃로 0.1℃/s의 속도로 상승시키고, 이어서 30초 동안 40℃로 냉각시켜 멜팅 커브(melting curve)를 생성시켰다. 상대적 유전자 발현은 2-△△CT 방법을 사용하여 정량하였다.
(6) 콜로니 형성 단위분석 ( Colony forming unit assay )
콜로니에 대하여, 세 개의 상이한 농도(2X105, 1X105, 0.5X105 cells/ml)의 HTSCs 및 BM-MSCs를 NH CFU-F 배지(Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 함유하는 배양접시에 접종하였다. 14일째에, 세포를 메탄올로 고정하고, 건조시켰다. 김사 염색 용액(Sigma-Aldrich)으로 염색하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 세척 및 건조 후에, 지름이 1-8mm 사이인 콜로니(20 세포 이상)를 계수하였다.
(7) 면역결핍된 마우스에서 테라토마 형성
종양 성장 분석을 위해, 미분화된 HTSCs를 PBS에 재현탁하고(1x106 세포/20㎕), 면역결핍된 SCID 마우스의 신내막(kidney capsules) 및 정소에 주사하였다. 테라토마 형성을 위한 양성 대조군으로서, 인간 ESCs(CHA-hESC35: hES12012006, Korea Stem Cell Registry, KNIH, 오송, 대한민국)를 면역결핍된 SCID 마우스의 정소에 주사하였다. 종양이 형성되도록 한지 12 내지 16주 후에, 마우스를 치사시켰다. 테라토마 조직을 4% PFA에 놓고, 파라핀에 넣었다. 조직 절편(sections)을 헤마톡실린 및 에오신(시그마)으로 염색하여 조직학적 검사를 하였다. 마우스 조직에서 인간 세포를 확인하기 위하여, HTSC 주사 혹은 주사 없이, SCID 마우스 정소에서 인간-특이적 항체(Stem-121TM, Stem Cells Inc., Cambridge, UK)을 사용하여 면역세포화학분석을 수행하였다.
(8) 지방세포( adipogenic cells ), 골 세포, 연골세포로의 시험관내( in vitro) 분화
HTSCs를 계대 5, 계대 13 및 계대 20에서 수집하였고, 재분류시킨 HTSCs 또한 계대 20에서 수집하였다. 콘트롤로서 계대 72에서의 hESCs 및 계대 3에서의 BM-MSCs를 또한 수집하여 3배엽 세포층으로의 분화능을 분석하였다. 모든 세포를 재현탁하고, 6 웰-배양 플라스크에 다시 도말하였다. 24시간 후에, 미-부착 세포를 배지를 교체하여 제거하고, 부착 세포를 콘플루언스까지 배양하였다. 이후, 상기 세포들을 지방형성, 골형성, 및 연골형성을 위한 배지들(Invitrogen)에서 21일 동안 배양하였다. 지방 분화는 오일 레드 O(Oil Red O)(Sigma-Aldrich)로 염색하여 시각화하였다. 지방형성-특이적 유전자(PPARγ 및 C/EBPα)의 발현은 실시간 RT-PCR에 의해 분석하였다. 골 분화는 알리자린 레드 S(Alizarin Red S)(Sigma-Aldrich)로 염색하여 시각화하였고, 골형성-특이적 유전자(COL I 및 CBFA I) 발현에 의해 분석하였다. 연골 분화는 알시안 블루(Alcian blue)(Sigma-Aldrich)로 염색하여 시각화하였고, 연골형성-특이적 유전자(COMP 및 SOX9) 발현에 의해 분석하였다.
(9) 신경세포( neurogenic cells )로의 시험관내 ( in vitro ) 분화
HTSCs 및 BM-MSCs의 신경 분화(neurogenic differentiation)는 N2 supplement(Gibco), 2mM L-글루타민 (Gibco) 및 페니실린/스트렙토마이신 용액(1X, Gibco)을 함유한 DMEM-F12 배지(Gibco)에서 유도시켰다. 3일 후에, 상기 세포를 고정한 다음, 면역세포화학 분석을 위해 처리하였다. 신경구(neurospheres)와 같은 부유하는 구형 세포(spheric cells)의 형성 후에, 세포(1X106 cells/ml)를 떼어내고; 피브로넥틴(10 ㎍/ml, Sigma)-코팅된 접시상에 다시 도말하고; 2mM L-글루타민, 10ng/ml 상피 성장 인자 (EGF, Invitrogen), 10ng/ml bFGF 및 페니실린/스트렙토마이신 용액으로 보충된 Neural Progenitor Basal Medium(NPBM, Cambrex, One Meadowlands Plaza, NJ)에서 3일 동안 배양하였다. 성장 인자는 매일 가하였다. 마지막 신경 분화의 유도는 0.5 μM 트랜스-레티논산(all-trans-retinoic acid)(Sigma), 1% FBS (Gibco), 5% 말 혈청(horse serum)(Gibco), 1% N2 supplement 및 페니실린/스트렙토마이신 용액으로 보충된 Neurobasal Medium(Gibco)에서 세포를 도말하여 개시시켰다. 세포는 10-14일 동안 분화시켰다. 신경 분화는 현미경하에서 관찰하였고, RT-PCR로 확인하였다.
(10) 인슐린-분비 세포로의 HTSCs 의 시험관내 분화
인슐린 분비 세포로의 분화는 특정 배지(Bcell Bio, Seoul, Korea)(Kang, H.M., et al. Insulin-secreting cells from human eyelid-derived stem cells alleviate type I diabetes in immunocompetent mice. Stem Cells 27, 1999-2008 (2009))의 제조사의 지침서에 따라 유도시켰다. 분화 효율은 배양 배지에 분비된 인슐린 및 C-펩타이드의 측정에 의하여 분석하였다. 즉, 세포를 0.5% BSA를 함유한 저-글루코오스(5.5mM)-DMEM으로 12시간 동안 처리한 다음, 고-글루코오스(25mM)-DMEM으로 2시간 동안 37℃에서 자극하였다. 배지로 방출된 인슐린 및 C-펩타이드의 양은 인간 인슐린 및 C-펩타이드 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트(Mercodia, Winston Salem, NC)를 사용하여 제조사의 지침서에 따라 측정하였다. 분화된 세포에서 인슐린 및 C-펩타이드의 합성은 RT-PCR로 확인하였다.
(11) 지방세포( adipogenic cells ), 골 세포, 연골세포로의 생체내 ( in vivo ) 분화
마우스 취급에 관한 동물 실험은 차의과학대학의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Commitee)의 승인을 받았다. BALB/c 암컷 마우스(6 주령)을 4개의 군으로 나누었다. HTSCs(30 mg)를 함유하는 덱스트란(DEX)-로딩된 마이크로스피어(30 mg)를 12마리의 누드 마우스의 등에 피하로 이식하였다. 그룹 I은 대조군(n=3)으로, DEX-로딩된 마이크로스피어를 암컷 마우스의 등 피하에 주입하였다. 그룹 II(n=3)는 100 ng/ml TGFβ3-코팅된 마이크로스피어를 암컷 마우스의 등 피하에 주입하였다. 그룹 III(n=3)는 100 ng/ml BMP2-코팅된 마이크로스피어를 암컷 마우스의 등 피하에 조심스럽게 주입하였다. 그룹 IV(n=3)는 50 ng/ml IGF 및 bFGF (Invitrogen)-코팅된 마이크로스피어를 암컷 마우스의 등 피하에 주입하였다. 처리 4주 후에, 상기 암컷 마우스들을 마취제(케타민)의 과잉 주입을 통해 치사시키고, 주입된 부위를 포함하는 피부(2 x 2 cm2)를 조심스럽게 절개하여 이어지는 생물학적 검사를 수행하였다. 조직을 수확하고, RT-PCR, 웨스턴 면역블롯팅, 면역세포화학 및 면역조직화학을 수행하여 생체내 분화를 확인하였다.
(12) 양측성 해면체 신경 분쇄 손상( bilateral cavernous nerve crush injury) ( BCNCI ) 랫트 모델로의 HTSCs 의 이식
32마리의 12주령 수컷 스프레그-도울리 랫트를 다음과 같이 무작위로 4 군(군당 8마리)으로 나누었다: 1) 개복만 한 군 (샴 군); 2) 양측성 해면체 신경 분쇄 손상(bilateral cavernous nerve crush injury) (BCNCI) 및 0.1 mol/L 인산완충식염수 점적 (손상 군); 3) BCNCI 및 전립선주변(periprostatic) BM-MSC 점적, 100 ㎕ 멸균 PBS에 현탁시킨 줄기세포 1x107 (BM 군); 및 4) BCNCI 및 전립선주변 HTSC 점적, 100 ㎕ 멸균 PBS에 현탁시킨 줄기세포 1x107 (HTSC group). 주입 전에, 줄기세포 추적을 위해 줄기세포를 Cell TrackerTM CM-Dil (C7000, Invitrogen)로 표지하였다.
이식 후 4주 후에, 손상 부위 가까이에서 해면체 신경 전기자극(3V, 0.2ms, 50s, 20 HZ)에 의해 발기능을 평가하였다(도 7의 (A)). 전신 평균 혈압(mean arterial pressure, MAP) 및 해면체간 압(intracavernosal pressure, ICP)을 기록하고, 전기적으로 분석하였다(Powerlab, ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA, 도 7의 (B)). 그룹들 간의 ICP/MAP 비율을 비교하였다. 발기능 측정 후에, 각 랫트의 전립선 엽(prostate lobes)을 수확하였다. 핵 및 신경 염색(Nuclear and neural staining)은 헤마톡실린 및 네스틴 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 수행하였다. 또한, 각 마우스의 분쇄 손상 부위에서 인간-특이적 항체(Stem-121TM) 및 뉴런-특이적 β-튜블린 클래스 III(TuJI, Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 면역세포화학분석을 수행하였다.
(13) 통계 분석
모든 시험은 적어도 3회 반복하였으며, 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. 그룹들 간의 차이는 ANOVA 테스트로 분석하였다. p 값 < 0.05를 통계학적으로 유의성 있는 것으로 간주하였다. CD34 발현 및 3배엽 계통(lineasge)에 특이적인 유전자의 관련성은 Pearson's coefficient of correlation을 사용하여 분석하였다.
2. 시험결과
(1) 인간 HTSCs 의 분리 및 증식
15명의 기증자의 평균 연령은 36.7±6.7이었다(29세 및 55세 사이). 인간 정소 조직에서, CD34-양성 세포는 세정관(seminiferous tubules) 내에 및 세관들(tubules) 사이에서 주로 분포하였다. CD31의 발현은 단지 혈관에만 편재화되어 있었으며, αSMA는 세관들(tubules)에만 존재하였다 (도 1). 또한, CD34, CD73, CD31, 및 αSMC의 발현 패턴은 OA 및 NOA 환자의 정소에서 매우 유사하였다. 그러나, CD73은, 그 수가 매우 적었으나, 세정관의 기저막(basal lamina)에서는 발현되지 않았다. 또한, CD34/CD31-이중-양성 세포는 정소(testes)에서 관찰되지 않았다. 인간 정소에서 CD34/CD73-이중-양성 세포를 편재화시키기 위하여, 생검된 세정관의 냉동편(cryosections)을 제조하고, CD34 및 CD73 항체로 염색하였다. CD34/CD73-이중-양성 세포는 세정관의 바깥에[간질 세포(interstitial cells) 내에] 편재화되어 넓게 분포하였으나, 소수만이 존재하였다(도 1).
수집된 간질세포를 2-3 계대로 먼저 배양하였다(도 9의 (A)). 시험관내 배양시, 인간 정소의 세정관으로부터 분리된 부착성 세포를 CD73에 의해 분류(sorting)하였다. 이들 세포는 MSC-유사 형태를 가졌으며, CD73 항체를 지속적으로 발현하였으므로, 이들을 정소-유래 줄기세포(testis-derived stem cells, TSCs)로 지칭하였다. TSCs는 두 종의 세포군(CD34-음성 및 CD34-양성)을 포함하였다. CD34-양성 TSCs를 자기 활성화-세포 분류(magnetic activating-cell sorting, MACS)에 의해 분류시키고, 배양 접시 상에 다시 도말하였다. CD73-분류된 TSCs 중 CD34-양성 세포는 매우 소수였기 때문에(도 2의 (A)), CD34-음성 TSCs에 비해 CD34/CD73 공동발현에 대하여 양성인 세포의 수는 매우 적었다[100 mg의 생검 조직 중 대략 1,000 세포(0.02%)]. 또한, 이들 초기의 소수(small number)로 인하여, CD34/CD73-이중 양성 세포는 배양 14일 후에야 80% 콘플루언시에 도달하였으며, 이는 이들 세포의 계대 1(p1)을 나타낸다. 그러나, 일단 이들이 추가적으로 증식되면, CD34/CD73-이중-양성 세포는 높은 증식 활성을 나타내었으며; 따라서 이들을 HTSCs(high proliferative-TSCs, HTSCs)로 지칭하였다. 세포는 3-4일 마다 새로운 배지를 공급하였으며, 계대 26 또는 27까지 MSC-유사 형태를 유지하였다(도 3). 대조적으로, BM-MSCs 및 TSCs는 각각 계대 6 및 계대 13까지 MSC-유사 형태를 유지하였으며, 이후에는 노화된(senescent) 형태를 나타내었다 (세포의 팽대(gross enlargement) 및 편평화(flattening), 도 3의 (A)). 배양 전체에 걸쳐, CD34-음성/CD73-양성 TSCs는 평균 34.3±2.1의 세포군 이배화(population doublings)를 나타냈고, 환자 당 수거된 이들 세포의 총 수는 2.2x1013 세포였다. 대조적으로, HTSCs는 평균 67.3±2.1의 세포군 이배화를 나타냈고, 수거된 총 세포수는 환자당 5.6x1016 세포였다(도 3의 (B)).
(2) HTSCs ( CD34 / CD73 -이중-양성 TSCs)의 특성분석
HTSCs의 특성분석을 위하여, 유세포분석, 면역세포화학, 및 RT-PCR을 수행하였다. 계대 3에서, 다중-색깔(multi-color) 유세포 분석을 다양한 마커들을 사용하여 수행하였다. HTSCs는 CD34 (96.53%±3.5), CD73 (95.65%±1.5), class I major histocompatibility (MHC) 항원 (HLA ABC), CD29, CD44, CD90, CD105, 및 CD166에 대하여 강한 양성이었고; CD14, CD133, 및 StroI에서 약한 양성이었며; 또한 CD31, CD45, HLA DR, TRA-1-60, SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, c-Kit, 및 CD140에 대하여 음성이었다(도 10).
면역세포화학적 분석에 의해, HTSCs는 CD34 및 CD73을 동시에 발현하지만, TSCs 및 BM-MSCs는 CD73만을 발현하고 CD34는 발현하지 않는다는 것이 확인되었다(도 2의 (B)). 또한, 유세포분석 결과로부터, HTSCs는 만능성(pluripotent) 마커인 c-Kit, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA3 및 SSEA4를 발현하지 않았으며, 이들은 또한 OCT4도 발현하지 않았다 (도 2의 (C)).
생식 세포 및 다른 체세포의 오염을 분석하기 위하여, 생식세포 마커(GFR α1 및 Thy-1), 레이딕(Leydig) 세포 마커(3β-HSD), 및 관주 근양 세포(peritubular myoid cell) 마커(Desmin 및 αSMC)를 사용한 면역세포화학에 의해 HTSCs를 분석하였다. 도 9의 (A)에 나타낸 바와 같이, 다양한 체세포를 함유한 초기 배양된 세포 중에 소수의 CD34-양성 세포가 존재하였다. CD73 및 CD34에 의해 분류된 후, 대부분의 세포는 계대 3에서 CD34를 발현하였으나, 생식세포 또는 정소 체세포에 대한 마커를 발현하지 않았다. 분류 후 계대 8(P8) 이후에는, CD34-양성 세포의 수는 유의성 있게 감소하였다. 생식 세포 및 레이딕 세포에 대한 마커는 더이상 검출되지 않았으나, Desmin 및 αSMC 에 대한 시그널이 소수의 CD34-음성 세포에서 다시 나타났다(도 9의 (B)-(D)).
시험관내 장기 증식 과정에서의 HTSCs의 유전적 안정성을 분석하기 위하여, 계대 5, 계대 13, 계대 20 및 계대 30에서 핵형분석을 수행하였으며, 염색체 이상(chromosomal aberrations) 없이 정상적인 이배체 핵형(46, XY)을 지속적으로 나타내었다(도 11의 (A)). 또한, RT-PCR 분석에 의해, 계대 5, 13 또는 20에서 HTSCs가 극히 낮은 수준의 만능성-관련된 OCT4, SOX2, 및 NANOG 유전자를 발현하였으며, 또한 생식세포-특이적인 VASA mRNA을 발현하지 않음이 입증되었다(도 11의 (B)).
HTSCs가 줄기세포의 다른 전형적인 특징을 나타내는지 결정하기 위하여, 분리된 HTSCs에 대하여 콜로니 형성 분석을 수행하였으며, 그 결과를 BM-MSCs와 비교하였다. HTSCs는 전형적인 줄기세포 콜로니를 형성하였고, 콜로니 형성 효율은 BM-MSCs보다 매우 높았다(15.2±2.1% vs. 1.0±0.1, 도 12의 (A)). 그러나, 조혈 세포의 콜로니는 두가지 모두의 줄기세포에 대하여 관찰되지 않았다(도 12의 (B). 종양 형성능을 확인하기 위해, HTSC 세포주를 SCID 마우스의 신피막 및 정소에 주입하였다. 주입 후 12-16주까지, 10마리 마우스에 주입된 HTSC 세포주 어느 것도 종양을 형성하지 않았으나, 주입된 인간 HTSCs(Stem-121TM-양성 세포)의 소수는 정소에 그대로 남아있었다(도 13).
(3) 장기간의 배양 동안 CD34 발현의 변화 및 분류에 의한 세포군( population )-회수
HTSCs의 장기간 배양 동안 CD34-양성 세포의 세포군(population)을 분석하였다. CD34-양성 세포의 세포군은 배양이 지속됨에 따라 점차 감소하였다(도 4의 (B)). HTSCs가 계대 15-20에 도달하였을 때 CD34-양성 세포의 세포군은 거의 없어졌다. 이 시점에서, 세포의 이배수 시간은 증가하였고, 이들의 형태도 변화되었다(도 3의 (A) 및 도 4의 (A)). 계대 8에서, HTSCs를 CD34를 사용하여 MACS에 의해 재분류시킨 다음(재분류된 HTSCs), 이들의 증식을 분석하였다. 도 4의 (C)에 나타낸 바와 같이, 재분류된 HTSC에서 CD34-양성 세포의 세포군은 추가의 8 계대 동안 유지된 다음 감소하였고, 이들은 다시 계대 30까지 증식되었다. 이들 재분류된 HTSCs를 계대 18에서 다시 CD34에 의해 재분류시켰을 때(이중-재분류된 HTSCs), 이들 이중-재분류된 HTSCs의 증식은 p36 까지 유지되었다(이중-재분류된 HTSCs에서 79.8±2.4 이배수(population doubling) 및 1.3X1019 세포; 재분류된 HTSCs에서 81.1±1.5 이배수(population doubling) 및 1.84x1020 세포) (도 4의 (C)).
(4) 연골세포, 지방세포( adipogenic cells ), 골 세포로의 시험관내( in vitro) 분화
HTSCs를 계대 5, 계대 13 및 계대 20에서 수집하였고, 재분류시킨 다음(계대 20; 분류 후 계대 20에서), 이들을 3주 동안 연골세포 분화 배지에서 분화시켰다. 계대 3의 BM-MSCs 및 계대 3의 TSCs를 실험 대조군으로 사용하였다. HTSCs, TSCs 및 BM-MSCs로부터 유도된 것들은, 다당류 생성물의 표지인, 알시안 블루 염색을 나타내었다. 그러나, 연골형성 유전자인 COMP 및 SOX9의 mRNA 수준은 BM-MSCs-유래된 연골세포에 비하여, HTSCs-유래된 연골세포에서 유의성있게 더 높았다(도 5의 (A)). HTSCs에서 COMP 및 SOX9의 발현은 계대배양이 지속될 수록 감소되었지만, 다시 재분류된 HTSCs에서는 유지되었다.
이들의 지방형성능을 시험하기 위하여, HTSCs를 지방형성(adipogenic) 배지 내에서 3주 동안 배양하였다. 계대 3의 BM-MSCs 및 계대 3의 TSCs를 실험 대조군으로 사용하였다. 이 조건하에서, HTSC-유래 지방세포로부터 유도된 것들은 세포간 지방구(intracellular lipid droplets)를 함유하는 지질함유(lipid-laden) 세포의 전형적인 형태를 나타내었으며, 오일 레드 O 염색에 대해 양성이었다. 또한, BM-MSCs 및 초기 계대의 HTSCs로부터 분화된 지방세포는 지방형성 유전자인 PPARγ 및 C/EBPα를 유사하게 발현하였다(도 5의 (B)). 그러나, 이들 수준은 TSCs에서 매우 낮았다. HTSCs에서 PPARγ 및 C/EBPα의 유전자 발현 수준은 지속적인 배양에 따라 점차 감소되었지만, 재분류된 HTSCs를 분화시켰을 때 유지되었다.
HTSCs, TSCs 및 BM-MSCs를 또한 골형성 배지에서 3주 동안 배양하였다. 이 조건하에서, 모든 HTSCs 및 BM-MSCs로부터 유도된 것은, 칼슘 생성물의 표지인 알리자린 레드 S 염색에 대해 양성이었다. 또한, 두 종류의 세포 모두 골세포 마커 유전자인 COL I 및 CBFA I의 유사한 발현 수준을 나타내었다(도 5의 (C)). 그러나, 염색의 강도 및 골세포 유전자 발현은 TSCs에서는 낮았다.
(5) 연골세포, 지방세포, 골 세포로의 분화 후 다양한 줄기세포의 유전자 발현 프로파일
ESCs, BM-MSCs, 지방-유래 hMSCs (AD-MSC), TSCs, 및 HTSCs의 분화능 비교분석을 연골화, 지방세포화, 및 골세포화와 관련된 특이적 유전자의 상대적인 발현 수준을 측정함으로써 수행하였다 (도 14). HTSCs의 연골분화능은 BM-MSCs, AD-MSCs 및 TSCs에 비해 유의성있게 더 높았으며 (p≤0.001), ESCs만큼은 좋지 않았다. HTSCs의 지방형성능은 ESCs 및 BM-MSCs와 비교할만하였으나, AD-MSCs 및 TSCs에 비하여 매우 우수하였다.
(6) 신경세포로의 시험관내 분화
계대 5, 계대 13 및 계대 20에서의 HTSCs, 및 계대 20에서 재분류된 HTSCs, 및 계대 3에서의 BM-MSCs를 신경원성 단계 I 배지에서 3일 동안 배양하였다. 이 단계의 마지막에서, HTSCs 및 BM-MSCs로부터 유래된 일부는 항-네스틴 항체로 양성으로 염색되었다(도 15의 (A)). 이들 네스틴-양성 세포를 신경원성 단계 II 배지에서 3일 동안 다시 배양하였을 때, HTSCs 및 BM-MSCs로부터 유래된 것들의 형태는 양극 형태(bipolar form) 특성의 신경으로 변화되었다. 또한, GFAP 및 β-튜불린 3의 신경 세포-특이적 유전자의 발현이 HTSCs 및 BM-MSCs로부터의 상기 양극 세포에서 관찰되었다(도 15의 (B)).
(7) 인슐린-분비 세포로의 시험관내 분화
HTSCs, 재분류된 HTSCs, 및 BM-MSCs의 중배엽 계통 다능성(mesodermal lineage multipotencies)을 또한 인슐린-분비 세포로 시험관내에서 분화시킴으로써 측정하였다. 인슐린-생성 배지(insulinogenic media)에서 배양한 후, 인슐린-분비 활성, 특히 세포의 글루코오즈-의존성 분비를 저(5.5mM) 또는 고(25mM) 농도의 글루코오즈로 세포를 자극하여 분석하였다. 세포를 분화유도시키지 않았을 때, 글루코오즈 자극에 반응하여 배지로 방출된 인슐린 및 C-펩타이드의 양은 모든 HTSCs (계대 5, 계대 13, 계대 20, 및 재분류된 계대 20) 및 BM-MSCs (계대 3)에서 유사하였다. 동일한 세포를 분화 배지에서 배양한 후, 세포에 의하여 방출된 인슐린 및 C-펩타이드는 고-글루코오즈 자극에 의하여 현저하게 증가되었다. 고-글루코오즈으로 자극하였을 때, 계대 5 및 계대 13에서의 HTSCs는 계대 3에서의 BM-MSCs와 유사한 양의 인슐린 및 C-펩타이드를 분비하였다. 계대 20에서, HTSCs는 인슐린 및 C-펩타이드를 분비하는 능력의 감소를 나타내었으나, 계대 8에서 CD34로 재분류하였을 때 이들 감소를 구조하여 이들 세포가 계대 20에서 높은 인슐린 및 C-펩타이드 방출을 유지하도록 할 수 있었다 (도 6의 (A) 및 (B)). 또한, 췌장 베타-세포 마커 유전자인 인슐린 및 NGN3는 인슐린생성(insulinogenic) 분화배지에서 배양된 HTSCs 및 BM-MSCs 모두에서 명확히 발현되었으나, 비-분화된 세포에서는 발현되지 않았다(도 6의 (C)).
(8) 지방세포, 골 세포, 연골세포로의 생체내 ( in vivo ) 분화
성장 인자를 함유한 마이크로스피어와 혼합된 HTSCs를 4군으로 나누어, 10마리 누드 BALB/c 암컷 마우스의 등에 피하 이식하였다. PPARγ, C/EBPα, CBFA I, COL I, SOX 9 및 COL II를 포함한, 분화-관련 유전자의 발현을 RT-PCR에 의해 검출하였다. 지방, 골, 및 연골 세포의 유전자 특징이 특이적인 성장인자-함유 마이크로스피어로 이식된 분화 HTSCs에서 높게 발현되었다(도 16의 (A)).
웨스턴 블롯 분석은 이들 마우스의 혈청에서 대응하는 단백질의 존재를 나타내었다(도 16의 (B)). 또한, 특이적 염색 또는 특정 마커를 사용한 면역세포화학 분석은 생체내 및 시험관내 모두에서 HTSCs의 지방, 골, 연골 분화를 확인해 주었다(도 16의 (C) 및 (D))
(9) 이식된 HTSCs 로부터 양측성 해면체 신경 분쇄 손상( bilateral cavernous nerve crush injury ) ( BCNCI )의 기능 회복
임상적으로 관련된 세포-기반 치료에 있어서, HTSCs의 사용가능성을 확인하기 위하여, 랫트에서 양측성 해면체 신경 분쇄 손상 모델을 사용하였다. HTSCs 또는 BM-MSCs를, 양측에 해면체 신경을 손상시킨 랫트의 전립선주변(periprostatically) 주사하였다. 분쇄 손상 부위의 기능 회복, 전신 평균 동맥 혈압(systemic mean arterial pressure, MAP) 및 음경해면체내압(intracavernosal pressure, ICP)을 평가하여 HTSCs의 치료 효능을 BM-MSCs와 비교하였다(도 7의 (A) 및 (B)). 평균 ICP/MAP 비율은 샴 그룹(0.70 ± 0.02)과 비교했을 때 손상 그룹(0.20 ± 0.01)에서 유의성 있게 더 낮았다(p<0.001)(표 2, 도 7의 (C)). BM-MSCs 또는 HTSCs의 전립선주변 주입은 손상군에 비하여 ICP/MAP 비율의 유의성있는 증가를 나타내었다(p < 0.001). 해면체신경의 말단 부위를 자극함에 따라, 발기 반응의 부분적인 회복이 BM-MSC 군(0.44 ± 0.05) 및 HTSC 군(0.44 ± 0.07) 모두에서 나타났지만, 두 군 사이에 유의성 있는 차이는 없었다. 처리된 동물의 전립선에서, 인간 유래의 세포가 CellTrackerTM CM-DiI로 검출되었으며(적색). TuJi(신경)-양성인 것으로 밝혀졌으며, 이는 주입된 HTSCs가 랫트의 해면체 신경 주위에 혼입되었으며 신경 세포로 분화되었음을 나타낸다(도 7의 (D)). 또한, 분쇄 손상 분위에서의 Stem-121TM (FITC, 녹색, 화살표머리(arrowhead)) 및 TuJI (Cy5, 자주색, 화살표)-이중-양성 세포 및 몇몇의 CellTrackerTM CM-DiI (적색, 개방 화살표머리(open arrow heads))가 관찰된다는 것을 또한 확인하였다. 따라서, 이는 주입된 HTSCs가 뉴우런으로 분화 및 혼입될 수 있음을 나타낸다 (도 7의 (E)).
군 손상 BM-MSC HTSC 샴(sham) p 값
MAP (cm-H2O) 136.6±4.1 142±5.8 135.2±3.9 135.6±3.2 0.675
ICP (cm-H2O) 27.2±3.3 60.2±6.3 58.6±11.5 86.7±2.6 0.001
ICP/MAP 비율 0.20±0.014 0.44±0.048 0.44±0.073 0.70±0.019 < 0.001
(10) CD34 발현과 세포 분화와의 상관관계
CD34를 발현하는 세포의 비율과 세포의 분화정도를 분석하였다. CD34를 발현하는 세포의 비율이 이어지는 계대배양(계대 5, 계대 13, 및 계대 20) 과정에서 감소됨에 따라, 3배엽 계통의 세포(3 germ layer lineage cells)의 마커 유전자 발현 수준도 감소되었다. 중배엽(mesodermal) 유전자: PPARγ, C/EBPα, COL I, CBFA I, COMP, 및 SOX9; 내배엽(endodermal) 유전자: 인슐린 및 NGN; 및 외배엽(ectodermal) 유전자: GFAP 및 β-Tubulin 3의 발현은 유의성있게 낮게 발현되었다(도 17).
3. 고찰
본 연구에서, 본 발명자들은 인간 정소 조직으로부터, HTSCs를 분리하고 특징분석하였다. 정소의 마우스 다능성 정원줄기세포(spermatogonial stem cells, SSCs)에 관한 Kanatsu-Shinohara 등의 보고(Kanatsu-Shinohara M, Inoue K, Lee J, et al. Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell. 2004;119:1001-1012) 이래로, 많은 연구가 인간의 대응세포(counterparts)를 분리, 특징분석, 및 증식시키는데 촛점을 두어 왔다(Conrad S, Renninger M, Hennenlotter J, et al. Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature. 2008;456:344-349; Kossack N, Meneses J, Shefi S, et al. Isolation and characterization of pluripotent human spermatogonial stem cell-derived cells. Stem Cells. 2009;27:138-149; Golestaneh N, Kokkinaki M, Pant D, et al. Pluripotent stem cells derived from adult human testes. Stem Cells Dev. 2009;18:1115-1126; Mizrak SC, Chikhovskaya JV, Sadri-Ardekani H, et al. Embryonic stem cell-like cells derived from adult human testis. Hum Reprod. 2010;25:158-167). 이들 분리된 인간 세포는 SSCs로부터 유래되는 것으로 생각되나, 이들의 정확한 기원(origins)에 대해서는 논쟁(controversial)이 존재한다(onrad S, Renninger M, Hennenlotter J, et al. Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature. 2008;456:344-349; Tapia N, Arauzo-Bravo MJ, Ko K, et al. Concise review: challenging the pluripotency of human testis-derived ESC-like cells. Stem Cells. 2011;29:1165-1169; Chikhovskaya JV, Jonker MJ, Meissner A, et al. Human testis-derived embryonic stem cell-like cells are not pluripotent, but possess potential of mesenchymal progenitors. Hum Reprod. 2012;27:210-221). 전체적으로, 기존의 연구로부터 얻어진 모든 정소 줄기 세포는 정소의 생식세포(testicular germ cells)로부터 유래된 것으로, 체세포로부터 유래된 것이 아니다. 이들 세포는 ESC-유사 콜로니 형태를 가지고 있으며, 줄기세포성 유전자 발현의 측면에서 인간의 HTSCs와 상이한 특성을 갖는다. HTSCs가 인간 정소의 MSC-유사 세포 및 BM-MSCs와 유사한 형태와 특성을 나타내지만, HTSCs는 초기에 CD34 및 CD73을 모두 발현한다는 점에서 다른 공지의 MSCs 또는 MSC-유사 세포와 상이하며, 이는 CD73, CD90, 및 CD105의 막 항원은 존재하지만 다른 세포 마커 유전자(CD34 및 CD45)의 발현은 결여하는 특성을 갖는 MSCs의 종래의 정의와 상반된다. 따라서, HTSCs는 인간의 정소 체세포 유래의 신규의 줄기세포/전구세포이다. 즉, CD34/CD73-이중-양성 세포는 생체내에 거의 존재하지 않으며(도 1), 이들은 초기 CD73-분류된 TSC 세포 군 중 0.03%만을 구성한다(도 2의 (A)). 또한, CD34/CD73-이중-양성 세포가 정소에는 없으며 또한 세정관의 기저층에서 CD73이 발현되지 않는다는 발견(도 1)에 의해, 본 발명자들은 CD34/CD73-이중-양성 세포(HTSCs)가 간질세포(interstitial cells)에 존재하며, 또한 간질세포에 대한 중간엽(mesenchymal) 혹은 전구(precursor) 세포일 수 있음을 가정하였다.
CD34는 조혈 줄기세포의 표지 마커(hall marker)로 간주되었으나, CD34는 실제적으로 다양한 비-조혈 조직 및 세포, 예를 들어 혈관내피세포 및 연 조직 신생물(soft tissue neoplasm)에서 발현된다. 인간 지방-유래 줄기세포에서, CD34 발현이 검출되었으나, 배양 시간에 따라 감소되며, 이는 증식능, 분화능, 및 세포의 미성숙 또는 줄기세포성에 관련될 수 있다. CD73이 다양한 MSCs에서 지속적으로 발현되므로, 인간 정소의 생검 샘플로부터 재생능(regenerative potential)을 갖는 줄기세포를 분리하기 위하여, 본 발명자들은 CD34와 함께, CD73을 추가의 선별마커로서 선택하였다.
CD34/CD73-이중-양성 HTSCs는 CD34-음성/CD73-양성 TSCs에 비하여 높은 증식능을 나타내었다. 극히 소량의 HTSCs를 23-32 계대 이상의 배양 후에 매우 많은 양의 세포군으로 증식시킬 수 있었다. 이러한 세포의 증식 및 분화능은 이들의 CD34 수준과 강한 관련성이 있었다. 도 17에 나타낸 바와 같이, CD34 발현은 세포의 분화 상태와 역으로 관련성이 있었다. 세포가 특정 세포 형태로 분화됨에 따라, CD34 발현은 감소되었으며, 이는 CD34가 이러한 종류의 줄기세포의 줄기세포성/미성숙성(stemness/juvenility) 마커임을 나타낸다. 또한, 상기한 지방-유래 줄기세포와 유사하게, CD34-양성 세포인 HTSCs의 비율 및 이들의 증식능은 연속적인 계대 배양과 함께 감소한다는 것이 밝혀졌다. 대조적으로, CD73의 발현은 배양 시간에 의해 영향을 받지 않았으며; 30계대 이상을 통하여 지속적으로 높은 발현을 나타내었다 (도 4의 (B)). CD34의 재분류(resorting)는 배양의 증식능을 확대시켰으며 또한 분화능을 향상시켰다. CD34의 재분류는 CD34-/CD73+ 세포를 제거하며, CD34+/CD73+ 세포를 남겨놓는다. 특정 세포 형태로의 HTSCs의 분화는 CD34의 저발현을 야기하고, 장기간의 배양은 통상 노화 및 분화를 야기하기 때문에, 정소 기질 세포 상의 CD34 발현의 정도는 젊고 건강한 줄기세포에 대한 유용한 선별 마커일 수 있다. 또한, CD34 발현과 세포의 줄기세포성 및 수명 사이의 밀접한 연관성 때문에, 정소 기질 세포 상에서의 CD34의 과발현 또는 연장시킨 발현이 세포의 수명 및 유연성(plasticity)을 증가시킬 수 있는지 여부는 중요할 수 있다.
HTSCs는 MSCs와 공통된 특징을 가졌으나, ESCs와는 상이하였다(도 2의 (C)). 본 발명자들은 다양한 종류의 줄기세포: ESCs, BM-MSCs (계대 3), TSCs (계대 5) 및 HTSCs (계대 5)의 분화능을 직접 비교하였다. 시험관내 및 생체내 분화 연구에서, HTSCs를 BM-MSCs와 비교할만한 방법으로 지방, 골, 연골 세포로 분화시킬 수 있었다(도 5 및 도 14). HTSCs는 특정 프로토콜을 적용하였을 때, 신경세포 및 인슐린-분비 세포로 분화시킬 수 있었다(도 15 및 도 6).
생체 내 세포 이식 연구에서, 미분화된 HTSCs는 양측성 해면체 신경 분쇄 손상(bilateral cavernous nerve crush injury)의 회복에 기여하였으며, 또한 초기 세포 주입 4주 후에 손상된 랫트 모델의 혈류 회복에 기여하였다(도 7). 전립선암에 대한 근치적 전립선 적출술(radical prostatectomy)은, 전립선 후측면을 따라 있는 신경혈관 묶음(해면체 신경)의 손상에 의해 자주 발기 부전을 야기한다. 본 발명자들은 분쇄 손상 부위 주위에 HTSCs 또는 BM-MSCs의 전립선주변 주입이 발기 기능을 개선한다는 것을 발견하였다. 실제로, 본 발명자들은 이들 랫트의 해면체 신경의 내부에서 외인성 HTSC-유래 뉴우런을 발견하였으며(도 7의 (E)) 또한 혈압의 기능적인 개선을 관찰하였다. 본 연구에서, HTSC 주입 후에, 손상 부위 주변의 몇몇의 뉴우런(TuJI-양성 세포)는 또한 인간 세포 전-염색 마커(CellTrackerTM CM-DiI) 및 인간-특이적 항체에 대하여 양성이었으며, 이는 주입된 HTSCs가 이식 후 뉴우런 세포로 분화하는 능력을 가짐을 나타낸다(도 7의 (D) 및 (E)). 따라서, 환자가 전립선암으로 진단될 경우, 상기 방법은 향후 발기부전의 치료를 위한 정소 생검으로부터, 자가유래의 줄기 세포(HTSCs)를 얻고, 증식시키고, 또한 저장하기 위하여 사용될 수 있다.
정소는 생식세포뿐만 아니라 상이한 종류의 배양-유도된 만능성(pluripotent) 줄기세포를 함유한다. 상기 배양-유도된 줄기세포는 심각한 윤리적 문제를 야기함이 없이 환자-특이적 세포치료제로 사용될 수 있으나, 줄기세포주 확립 효율이 매우 낮고, 또한 분리된 세포주는 인간에서 잘 특성분석되어 있지 않다(Ko K, Arauzo-Bravo MJ, Tapia N, et al. Human adult germline stem cells in question. Nature. 2010;465:E1; discussion E3). 또한, 정원 생식세포(spermatogonial germ cells)를 사용하여 확립된 줄기세포주는 NOD-SCID 마우스에 주입한 후 종양을 형성하므로(Seandel M, James D, Shmelkov SV, et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 2007;449:346-350), 인간의 약제로 임상에서의 사용이 의문시된다. 본 연구에서, 본 발명자들은 특정 배양 조건(defined culture conditions) 및 간단하고 고효율의 MACS 시스템(100% 분리율)을 사용하여 정상적(폐색성 무정자 2) 및 비정상적 정소 생리(배엽 세포 없는, 비-폐색성 무정자 13)를 갖는 공여자로부터 다능성 줄기세포주를 확립하였다. 일반적으로, 인간의 성체줄기세포는 제한된 횟수로 증식될 수 있고, 분리 및 시험관내 증식후에는 신속히 노화 단계(senescence phase)로 들어간다. 또한, 인간의 성체줄기세포는 시험관내 증식과정에서 높은 염색체 이상을 나타낸다. 본 연구에서, 시험된 세포주는 모두 면역결핍 마우스에서 종양을 형성하지 않았고, 염색체 상태(chromosomal integrity)도 계대 30까지 유지되었으며, 이는 이들 세포주가 인간 배아줄기세포에 대하여 안전한 대체물임을 나타낸다. 또한, 두 종류의 남성 공여자로부터 분리된 HTSCs 사이에, 분화효율에 있어 차이점이 없었기 때문에, 상기 방법은 모든 남성에게 적용될 수 있다.
4. 결론
본 발명자들은 인간 정소 기질 세포에서 CD34/CD73 공동 발현이 증식능, 분화능, 및 미성숙성 혹은 줄기세포성과 밀접하게 연관된다는 것을 발견하였다. 따라서, CD34 및 CD73은 간단한 정소 생검으로부터 고증식성의 성체줄기세포를 얻기 위한 초기 선별마커로서 사용될 수 있다. 이들 세포는, 인간 ESCs의 사용과 관련한 문제인 종형 형성 혹은 윤리적 논란 없이 환자-특이적 세포-기반 치료에 사용될 수 있다. 또한, 이들의 높은 증식 능력으로 인하여, 이들 CD34/CD73-동시 발현 HTSCs는 다수의 세포를 필요로 하는 치료에 특히 유용하다.
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Claims (15)

  1. CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내고, 정소의 체세포로부터 유래된, 다능성 성체줄기세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 정소의 체세포가 세정관(seminiferous tubles)의 바깥 주위 세포(outer surrounding cells)인 것을 특징으로 하는 다능성 성체줄기세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 세정관의 바깥 주위 세포가 간질세포(interstitial cells)인 것을 특징으로 하는 다능성 성체줄기세포.
  4. (a) 인체로부터 분리된 인간의 정소 조직으로부터 세정관의 바깥 주위 세포를 분리하고, 계대배양하는 단계; 및
    (b) 단계(a)로부터 얻어진 세포에 대하여, 항-CD34 항체 및 항-CD73 항체를 사용한 분류(sorting)를 수행하여, CD34-양성 및 CD73-양성의 세포를 분리하고, 계대배양하는 단계
    를 포함하는, CD34 및 CD73 모두에 대하여 양성 면역 반응을 나타내는 다능성 성체줄기세포의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세정관의 바깥 주위 세포가 간질세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제4항에 있어서, 단계(a)의 상기 분리가 인체로부터 분리된 인간의 정소 조직을 콜라게나아제, 디스파아제, 또는 이들의 혼합물을 사용한 효소로 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제4항에 있어서, 단계(a)의 상기 계대배양이 지지세포 및 혈청을 함유한 배지 중에서 2 내지 4 계대까지 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 분류가 자기 활성화 세포 분류(magnetic activating-cell sorting)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제4항에 있어서, 단계(b)의 상기 계대배양이 지지세포 및 혈청을 함유한 배지 중에서 7 내지 9 계대까지 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 7 내지 9 계대까지 수행된 세포에 대하여, 항-CD34 항체를 사용한 분류를 수행하고, 추가의 계대배양(additional subculturing)을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 추가의 계대배양이 상기 단계(b)의 계대배양에 추가하여 7 내지 12 계대까지 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 추가의 계대배양이 상기 단계(b)의 계대배양에 추가하여 12계대까지 수행하고, 항-CD34 항체를 사용한 분류를 수행하고, 이어지는 계대배양을 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 다능성 성체줄기세포를 유효성분으로서 포함하는, 발기부전 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 다능성 성체줄기세포가 제4항에 따른 제조방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 발기부전이 근치적 전립선 적출술(radical prostatectomy)에 의하여 발생된 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
KR1020120061629A 2011-06-15 2012-06-08 정소의 체세포-유래의 다능성 줄기세포, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 발기부전 치료용 약학 조성물 KR101429110B1 (ko)

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