KR20220028557A

KR20220028557A - 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20220028557A
Application number: KR1020200109701A
Authority: KR
Inventors: 김영실
Original assignee: 주식회사 티스템; 김영실
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2022-03-08

Abstract

본 발명은 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물에 관한 것으로, 그 구성은 지방줄기세포에서 유래된 무막줄기세포추출물을 0.5 내지 2.5μg/mL의 농도로 사용하는 것을 특징으로 한다.

Description

무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물{COMPOSITION OF MEMBRANE FREE STEM CELL FOR IMPROVNG OXIDATIVE STRESS}

본 발명은 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 지방세포에서 분리된 줄기세포에서 추출된 추출물을 이용하여 신장에서의 산화적 스트레스로 인한 손상에 따른 세포 보호 및 이를 개선할 수 있는 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물에 관한 것이다.

인체는 생명을 유지하는데 필요한 에너지를 얻기 위하여 호흡과정을 통해 끊임없이 산소를 대사하며, 이 과정에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생산한다. 산화질소(nitric oxide, NO)로부터 파생된 질소화합물을 통칭하는 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)은 염증반응 시 발생하며, 유인된 대식세포와 호중구의 면역반응의 일환으로 산화질소 합성효소(NO synthase)에 의해 다량 생성된다. 활성산소종(ROS)과 활성질소종(RNS)를 포함하는 자유라디칼(free radical)는 분자구조적으로 매우 불안정하기 때문에 지질, 단백질, DNA와 같은 고분자의 세포성분과 반응하여 지질 산화, 단백질 분해, DNA 변성 등을 일으켜 세포의 손상을 초래한다. 인체는 이러한 자유라디칼(free radical)로부터 정상 세포를 보호하기 위해 항산화 효소 체계를 통해 자유라디칼(free radical)을 반응성이 작은 물질로 환원하지만, 자유라디칼(free radical)이 과다하게 생성되거나 생체 내 항산화 효소 체계의 활성이 저해되어 이들 간의 균형이 깨어질 경우 산화적 스트레스가 발생하여 세포의 손상 및 손실을 초래하며, 노화를 비롯한 고혈압, 동맥경화와 같은 다양한 질환의 발병으로 이어질 수 있다.

한편, 신장은 체내에서 활발히 대사하는 조직으로 산화적 인산화를 통해 ATP를 생산하는 호기성 호흡이 활발히 일어나며, 조직을 구성하는 지질 성분 중 긴 사슬 다분자 지방산(long-chain polyunsaturated fatty acid)이 풍부한 것으로 알려져 있어 산화적 스트레스로 인한 세포 손상의 위험이 높은 기관이다. 신장 근위 세뇨관 세포(renal proximal tubule cell)는 체내에서 여과된 물질의 재흡수 등 중요한 역할을 담당하고 있으며, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산 산화효소(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase)의 isoform인 nephrox가 신장 근위 세뇨관 세포에서 ROS를 생성하는 주요 효소로 알려져 있다. 이에, 산화적 스트레스의 개선을 통한 신장 보호 효과를 확인하기 위해 신장 근위 세뇨관 상피 세포인 LLC-PK₁ 세포가 이용되고 있다.

신장의 피질부위에 위치한 근위 세뇨관 세포가 산화적 스트레스에 노출될 경우 급·만성 신독성 및 신기능부전 등의 질병을 야기할 수 있으므로, 산화적 스트레스 개선을 위한 개발이 지속적으로 요구되고 있다. 따라서, 본 발명자들은 줄기세포(stem cell)를 이용하여 추출된 무막줄기세포추출물을 통한 산화적 스트레스 개선 효과를 확인하고자 한다.

줄기세포(stem cell)는 인체의 장기, 피부 및 뼈 연골 등을 구성하는 세포들은 세포사멸과 세포생성을 통해 체내 항상성을 유지하기 위해, 세포의 생성을 새롭게 유도하는 세포를 말한다. 줄기세포의 일종인 성체줄기세포(adult stem cell)는 골수, 제대혈 및 지방조직 등에서 채취할 수 있다. 그러나, 성체줄기세포를 바로 주입하는 형식은 면역거부 반응 등의 이유로 본인의 것으로 제한되는 한계가 있다. 이에, 줄기세포를 주입하는 대신 줄기세포 배양액을 이용하는 방법이 제시되고 있다.

구체적으로, 대한민국 등록특허 제10-1811481호와 같이, 중간엽 줄기세포를 이용한 산화적 스트레스 관련 질병 치료에 대해 개시되어 있다. 하지만, 이와 같은 줄기세포 배양액에는 소혈청이나 항생제와 같이 세포 배양시 필요한 기타 첨가제가 함유되어 있어 유효성분의 함유량이 적다. 또한, 기타 첨가제가 첨가된 배양액이 주입되는 경우 원하는 기능이나 효능 이외에 원하지 않는 부정적인 효과가 나타날 수 있으므로, 이에 대한 개선이 필요한 실정이다.

(특허번호 0001) 대한민국 등록특허 제10-1811481호

상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 무막줄기세포추출물을 이용하여 신장 근위 세뇨관 상피세포인 LLC-PK₁ 세포에서의 산화적 스트레스 개선 효과를 확인하고, 이를 통해 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포로부터 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있고, 불순물로 인한 부작용을 방지하여 산화적 스트레스 개선 효과를 높일 수 있는, 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물을 제공하는 것일 수 있다.

상기 과제를 이루기 위해 본 발명인 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물은, 지방줄기세포에서 유래된 무막줄기세포추출물을 0.5 내지 2.5μg/mL의 농도로 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물은 지방조직에서 지방줄기세포를 분리하여 정제한 후, 37℃에서, 5%의 CO₂ 조건의 인큐베이터(incubator)에서 초기배양 후, 계대배양을 6 내지 10회 반복하고, 배지를 제거한 후, 줄기세포의 세포막을 제거한 후 추출물을 획득하여 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물은 신장 근위 세뇨관 상피세포인 LLC-PK₁ 세포에 산화적 스트레스 유도를 위하여 SIN-1 처리시 LLC-PK₁ 세포가 손상되는 것을 억제하고, LLC-PK₁ 세포의 생존율을 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물은 LLC-PK₁ 세포에서 SIN-1으로 유도된 염증 및 세포사멸을 조절할 수 있다.

아울러, 본 발명의 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물을 염증 관련 단백질인 유도성 산화 질소 합성 효소(inducible nitric oxide synthase)와 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2)에 처리시 염증 관련 단백질의 발현을 감소시킬 수 있으며, 염증 관련 발현을 조절하도록 기능할 수 있다.

또한, 본 발명의 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물은 세포사멸 관련된 단백질인 B-cell lymphoma-2-associated X protein/B-cell lymphoma-2 비율과 cleaved caspase-3 및 cleaved-poly(ADP-ribose) polymeras의 단백질 발현을 감소시킬 수 있다.

이에, 본 발명의 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물은 항산화, 염증 및 세포사멸 단백질을 조절함으로써 산화적 스트레스에 대한 보호 효과 및 개선 효과를 가지며, 항산화 기능성 소재로 적극 활용될 수 있다.

다만, 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들을 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 본 발명의 무막줄기세포추출물을 농도별로 처리하여 HO-1, TrxR1 및 NQO1의 단백질 발현 정도를 측정한 것을 나타낸 그래프와 이미지.
도 2는 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 300 μM SIN-1을 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 본 발명의 무막줄기세포추출물을 처리하여 LLC-PK₁ 세포의 세포 생존율을 측정한 것을 나타낸 그래프.
도 3은 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 300 μM SIN-1을 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 각각의 시료에 농도를 달리한 무막줄기세포추출물을 처리하여 염증 관련 단백질인 COX-2, IL-1β 및 IL-6의 발현을 측정한 것을 나타낸 그래프와 이미지.
도 4는 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 300 μM SIN-1을 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 각각의 시료에 농도를 달리한 무막줄기세포추출물을 처리하여 세포 사멸 억제인자인 Bax, Bcl-2 및 β-actin 단백질 발현을 측정한 것을 나타낸 그래프와 이미지.
도 5는 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 300 μM SIN-1을 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 각각의 시료에 농도를 달리한 무막줄기세포추출물을 처리하여 세포 사멸 관련 단백질인 Cleaved caspase-9, Cleaved caspase-3, Cleaved PARP 및 β-actin 발현을 측정한 것을 나타낸 그래프와 이미지.

이하, 본 발명에 의한 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물의 바람직한 실시예가 첨부된 도면을 참고하여 상세하게 설명한다.

도 1은 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 각각의 시료에 농도를 달리한 무막줄기세포추출물을 처리하여 HO-1, TrxR1 및 NQO1의 단백질 발현 정도를 측정한 것을 나타낸 그래프와 이미지이며, 도 2는 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 300μM SIN-1을 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 각각의 시료에 농도를 달리한 무막줄기세포추출물을 처리하여 LLC-PK₁ 세포의 생존율을 측정한 것을 나타낸 그래프이고, 도 3은 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 300μM SIN-1을 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 각각의 시료에 농도를 달리한 무막줄기세포추출물을 처리하여 염증 관련 단백질인 COX-2, IL-1β 및 IL-6의 발현을 측정한 것을 나타낸 그래프와 이미지이며, 도 4는 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 300μM SIN-1을 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 각각의 시료에 농도를 달리한 무막줄기세포추출물을 처리하여 세포 사멸 억제인자인 Bax, Bcl-2 및 β-actin 단백질 발현을 측정한 것을 나타낸 그래프와 이미지이고, 도 5는 신장 근위 세뇨관 세포인 LLC-PK₁ 세포에 300μM SIN-1을 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 각각의 시료에 농도를 달리한 무막줄기세포추출물을 처리하여 세포 사멸 관련 단백질인 Cleaved caspase-9, Cleaved caspase-3 및 Cleaved PARP 및 β-actin 발현을 측정한 것을 나타낸 그래프와 이미지이다.

본 발명의 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물은 지방줄기세포에서 유래된 무막줄기세포추출물을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물은, 0.5 내지 2.5μg/mL의 농도로 사용하는 것 일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물은 지방줄기세포에서 유래된 무막줄기세포추출물을 2.5μg/mL의 농도로 사용하는 것일 수 있다.

본 발명의 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물에 무막줄기세포추출물을 0.5μg/mL 미만으로 포함되는 경우, 무막줄기세포추출물의 유효성분이 충분하지 않아 산화적 스트레스 개선 효과가 저하될 수 있다. 또한, 본 발명의 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물에 무막줄기세포추출물을 2.5μg/mL를 초과하여 포함되는 경우, LLC-PK₁세포에서 무막줄기세포추출물의 독성이 높아져 세포생존율이 낮아질 수 있고, LLC-PK₁세포의 활성이 떨어질 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물은, 지방조직에서 지방줄기세포를 분리하여 정제한 후, 37℃에서, 5%의 CO₂ 조건의 인큐베이터(incubator)에서 초기배양 후, 계대배양을 6 내지 10회 반복하고, 배지를 제거한 후, 줄기세포의 세포막을 제거한 후 추출물을 획득하여 사용하는 것일 수 있다.

계대배양은 주기적으로 새로운 배지에 이식시키는 세포증식의 한 방법이다. 구체적으로, 대상세포를 새로운 배지에 이식시킴에 따라 균주를 보존하고 세포의 대를 이어가는 방식으로 대상세포를 배양 및 증식시킬 수 있다. 즉, 배지가 담긴 플레이트에 줄기세포가 성장하여 80 내지 90%의 밀도를 가지면 플레이트에서 줄기세포를 일부 수득하여 다른 배지가 담긴 플레이트로 옮겨서 다시 줄기세포의 성장이 이루어지게 한다. 또한, 초대배양을 할 때, 혈액을 제거하지 않았을 경우 계대배양을 하면서 상기 혈액을 제거할 수 있다.

본 발명의 무막줄기세포는 상기 계대배양 후 배양된 줄기세포의 세포막을 제거하여 세포막이 없는 줄기세포를 의미하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명인 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물의 세포 보호 효과 확인 및 산화적 스트레스에 따른 손상 개선을 위한 실험에 대하여 상세하게 설명한다.

구체적으로, 신장 근위 세뇨관 세포는 자유라디칼(free radical)로 인한 산화적 스트레스에 민감한 세포로 알려져 있다. 신장 근위 세뇨관 상피 세포인 LLC-PK₁ 세포에 H₂O₂를 처리하여 산화적 스트레스를 유도했을 때, 세포막의 지질 산화 및 세포질 내 Ca²⁺ 이온의 비정상적인 증가가 세포에 비가역적으로 손상을 일으킨다. 또한 산화적 스트레스로 인해 ion gradient가 붕괴되어 ATP 결핍과 Na⁺-K⁺-ATPase의 불활성화를 유도하며 이는 포도당 및 인산 수송의 저해로 이어져 세포 손상을 유도한다. LLC-PK₁ 세포에서 hydroxyl radical을 비롯한 산소 대사물은 endonuclease를 활성화시켜 DNA를 분절하여 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 따라서 산화적 스트레스에 의한 세포 손상 연구에 널리 이용되는 세포주인 LLC-PK₁ 세포에 SIN-1으로 산화적 스트레스를 유도한 후 무막줄기세포추출물의 세포 보호 효과를 확인하여 항산화제로서 무막줄기세포추출물의 이용 가능성을 알아보고자 하였다.

1. 실험재료

Dulbecco's modified eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin streptomycin, trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 WelGENE(Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다. 3-Morpholinosydnonimine(SIN-1)은 Santa Cruz Biotech.(Santa Cruz, CA), 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,3-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma Chemical Co.(St Louis, MO, USA)사 제품을 구매하여 사용하였다. 1차 항체와 2차 항체는 Cell Signaling Tech.(Beverly, MA, USA)와 Santa Cruz Biotech.(Santa Cruz, CA)에서 구매하였다. Enhanced chemiluminescence(ECL) solution는 BioRad(Hercules, CA, USA)에서 구입하였다.

2. 무막줄기세포추출물 제조

본 시험에 사용된 무막줄기세포추출물은 본 출원인이 직접 제조하여 사용하였다. 구체적으로, 무막줄기세포추출물은 줄기세포 성분 추출물로, 인체지방조직에서 줄기세포를 분리, 배양한 후 세포막을 제거하여 획득하였다. 원재료인 지방조직은 혈액검사를 통해 이상이 없는 20대 여성 중 BMI 25 내지 29.9에 해당하는 사람을 대상으로 지방공여동의서를 받고 확보하였다. 시행한 혈액검사 항목은 B형간염바이러스, C형간염바이러스, 인체면역결핍바이러스, 인체T림프영양성바이러스, 파보바이러스B19, 사이토메가로바이러스, 앱스타인바바이러스 및 매독크레포네마 등이다. 최종제인 무막줄기세포는 Good Laboratory Practice 인정기관에서 안전성 검사를 완료하여 독성이 없는 물질임을 확인하였다. 위의 과정을 거쳐 획득한 지방조직에서 지방줄기세포를 분리하여 정제한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 incubator에서 초기배양을 실시하였으며, 세포가 자란 정도를 확인한 후 계대배양을 6 내지 10회 반복하였다. 배지를 제거하고 줄기세포를 일정량 수득하여 초음파 등의 물리적 방법을 사용하여 세포막을 벗기고, 필터 등의 방법을 이용하여 세포막 조각을 제거하여 무막줄기세포추출물을 획득하였다. 수용액 상태의 무막줄기세포추출물은 동결건조하여 파우더 제형으로 만든 후 5±2℃에서 보관하였다.

3. 세포 배양

실험에 사용된 LLC-PK₁ 세포는 ATCC (Manassas, USA)사에서 구매하여 실험에 사용하였다. LLC-PK₁ 세포는 5% FBS, 100 units/mL penicillin streptomycin가 함유된 DMEM을 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양된 세포는 1 내지 2일에 한 번씩 배양액을 교체하면서 배양하여 80 내지 90% confluence 상태에서 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4)으로 세포를 세척한 후, 0.05% trypsin과 0.02% EDTA 혼합액으로 부착된 세포를 분리하여 1,000 rpm에서 3분간 원심분리 한 후 현탁하여 사용하였다.

4. 세포 생존율 측정

LLC-PK₁ 세포에서의 무막줄기세포추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 세포 생존율을 MTT assay에 의해 측정하였다.

LLC-PK₁ 세포는 80% confluence 상태가 되면 24-well plate에 5Х10⁴ cells/mL로 seeding하였다. 세포가 confluence 상태가 되었을 때 시료별로 무막줄기세포추출물의 농도를 0.5, 1, 2.5, 5, 10 및 15 μg/mL으로 구분하여 각각 처리하여 72시간 배양한 뒤, 5mg/mL의 MTT solution을 각 well에 주입한 후 37℃에서 4시간 동안 재배양하였다. 배양이 완료되면 formazan 결정을 DMSO에 녹여 30분간 실온에서 방치하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

5. SIN-1(300μM) 처리를 통한 산화적 스트레스 유발 후의 세포 생존율 측정(MTT Assay)

LLC-PK₁ 세포에 SIN-1(300μM) 처리를 통한 산화적 스트레스 유발 후, 무막줄기세포추출물의 세포생존율 조절 효과를 확인하기 위하여 세포 생존율을 MTT assay에 의해 측정하였다.

LLC-PK₁ 세포는 90-100% confluence 상태가 되면 96-well plate에 각각 1Х10⁴ cells/mL로 seeding하여 실험에 사용하였다. LLC-PK₁ 세포는 seeding 후 37℃에서 2시간 배양시켜 세포가 잘 부착되면 SIN-1(300μM)를 첨가하여 24시간 배양하였다. Generator로 산화적 스트레스 유발 후, 무막줄기세포추출물(0.5, 1, 2.5μg/mL)을 처리하여 24시간 배양한 뒤 5 mg/mL의 MTT solution을 각 well에 처리하였다. 37℃에서 4시간 동안 재배양한 후, 생성된 formazan 결정을 DMSO에 녹여 30분간 실온에서 방치 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

6. 세포 내 발현 단백질 분석(Western blot analysis)

무막줄기세포추출물을 처리한 세포의 단백질 발현을 확인하기 위해 Western blot analysis을 이용하여 측정하였다.

배양한 세포에 RIPA buffer를 첨가한 후 4℃, 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하고 상층액을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다. 각각의 시료를 8-10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel에서 전기영동하여 membrane에 transfer하였다. 단백질이 부착된 membrane은 5% skim milk로 상온에서 50분 blocking한 다음, 1차 항체를 4℃에서 overnight하며 반응시킨 후, PBS-T로 세척하고 2차 항체와 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 PBS-T로 세척 후 ECL solution과 반응시켜 chemilium inescence image system(Davinch-Chemi^TM)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.

7. 통계분석

모든 실험 결과는 3회 반복 실험하여 평균±표준편차로 나타냈다. 모든 실험 결과는 mean±standard deviation(SD)로 나타냈다. 통계 프로그램은 Statistical Package for the Social Sciences(SPSS)를 이용하여 분석하였으며, analysis of variance(ANOVA) test 및 Duncan's multiple range test를 이용하여 P<0.05 수준에서 각 군의 유의성을 검정하였다.

8. 3T3-L1 preadipocyte에서 무막줄기세포추출물의 세포생존에 미치는 영향

LLC-PK₁ 세포에서 무막줄기세포추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 0.5 내지 15μg/mL 농도에서 MTT asssy를 이용하여 세포 독성 여부를 검토하였다. 그 결과, 하기 표 1와 같은 세포 생존율을 나타냈다. 구체적으로, 0.5, 1 및 2.5μg/mL의 무막줄기세포추출물은 LLC-PK₁ 세포의 생존률에 크게 영향을 미치지 않았으나, 5, 10 및 15μg/mL의 무막줄기세포추출물은 LLC-PK₁ 세포 생존률을 유의적으로 감소시켰다. 따라서 이후 실험에서는 무막줄기세포추출물 0.5, 1, 2.5μg/mL를 실험 농도로 설정하였다.

Treatment(μg/mL)	Cell viability(%)
0	100.00±2.02
0.5	86.05±8.44
1	88.08±6.85
2.5	93.10±2.59
5	79.31±3.36
10	72.14±2.12
15	64.93±2.23

8. 항산화 관련 단백질 발현 조절 실험 결과

체내에 산화적 스트레스가 발생할 경우, ROS에 대한 방어효소의 발현을 조절하는 전사인자인 nuclear factor E2-related factor 2(Nrf-2)가 heme- oxygenase-1(HO-1), thioredoxin reductase 1(TrxR1), NADPH quinine oxidoreductase-1(NQO1)과 같은 항산화 단백질의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 세포를 보호한다. HO-1은 세포 내의 heme을 billiverdin과 일산화탄소로 분해하며, 이들은 항산화 및 항염증 작용을 통해 산화적 스트레스를 감소시킨다. TrxR1와 NQO1은 산화환원 반응을 통해 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다.

도 1을 참조하면, LLC-PK₁ 세포에 무막줄기세포추출물을 농도별로 처리하여 HO-1, TrxR1 및 NQO1의 단백질 발현을 측정한 결과, 무막줄기세포추출물을 처리하였을 때 이들 단백질 발현이 증가하였으며, HO-1과 TrxR1의 단백질 발현이 농도유의적으로 증가함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 무막줄기세포추출물은 항산화 효과가 있는 단백질의 발현을 증가시킴으로써, 자유라디칼(free radical)로 유도되는 세포의 산화적 스트레스를 보호할 것으로 사료된다.

9. 세포 생존율 조절 실험 결과

ROS는 동맥경화를 비롯한 혈관 질환의 병리적 매개 물질로 작용하며, RNS 중 NO는 과도하게 생성될 경우 혈관확장, 염증반응을 유발하여 조직에 손상을 일으킨다. NO가 O₂ ^- 와 반응하여 생성되는 ONOO^-는 O₂ ^-와 NO와 비교했을 때 그 반응성이 크게 증가하여 강한 조직 파괴력을 나타낸다. LLC-PK₁ 세포에 300 μM SIN-1을 24시간 동안 처리하여 ONOO^-의 생성을 유도한 후, 무막줄기세포추출물을 처리하여 신장 근위 세뇨관 세포에서 산화적 스트레스에 대한 무막줄기세포추출물의 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 2와 같이, normal군 100% 대비 SIN-1을 단독으로 처리한 control군에서 58.84%로 세포 생존율이 감소하였다. 반면, 무막줄기세포추출물을 처리하였을 때, 2.5μg/mL의 농도에서 64.43% 로 세포 생존율이 증가하였으며 control군에 비해 통계적으로 유의미한 차이를 나타내었으므로 ONOO^- 로 인한 산화적 손상에 대한 무막줄기세포추출물의 보호 효과를 확인하였다.

10. 염증 관련 단백질 발현 조절

산화적 스트레스와 염증반응은 서로 긴밀히 연결되어 있다. 예를 들어 세포 내에서 ROS는 염증매개인자, 전염증성 사이토카인 및 케모카인 등의 발현을 조절하는 nuclear factor

B(NF-

B)를 활성화시키며, 이에 따라 백혈구 및 resident cell의 활성화가 촉진되어 염증반응을 유발한다. 염증매개인자인 inducible nitric oxide synthase(iNOS)는 L-arginine으로부터 NO를 다량 생성하며, cyclooxygenase-2(COX-2) 아라키돈산을 prostaglandin H2로 전환하여 prostaglandin E2와 prostacyclin 등의 생성을 촉진한다. Interleukin (IL)-1

와 IL-6는 전염증성 사이토카인으로 혈관 내막 세포의 기능 변화를 유도하여 혈관 내로 염증세포의 침투를 용이하게 한다.

도 3을 참조하면, LLC-PK1 세포에 300 μM SIN-1을 처리하여 ONOO^-의 발생을 유도한 후 무막줄기세포추출물을 처리하여 염증 관련 단백질 발현을 측정한 결과, normal군과 비교하여 control군에서 iNOS, COX-2, IL-1

, IL-6의 단백질 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.

반면, 무막줄기세포추출물을 처리하였을 때, COX-2, iNOS의 단백질 발현이 효과적으로 감소하였으며, IL-1β과 IL-6의 단백질 발현에는 영향을 미치지 못하였다. 이러한 결과는 무막줄기세포추출물이 염증매개인자인 COX-2와 iNOS의 조절을 통해 염증반응을 감소시킬 수 있을 것으로 기대되지만, COX-2의 활성화를 유도하여 염증반응을 일으키거나 COX-2가 활성화됨으로써 생성되는 전염증성 사이토카인인 IL-1β과 IL-6에 대한 무막줄기세포추출물의 조절 메커니즘에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

11. 세포사멸 관련 단백질 발현 조절 실험결과

신장 세뇨관 상피 세포의 세포사멸은 저산소성 손상에 의해 현저히 나타나며, 이는 산화적 스트레스로 인한 endonuclease의 활성화로 인해 유도될 수 있다. 세포사멸에 관여하는 Bcl-2 family는 및 세포사멸 촉진인자인 Bax, Bak, Bid와 세포사멸 억제인자인 Bcl-2, Bcl-xl 및 Bcl-b 등으로 구성되어 있다. 이들 세포사멸 촉진인자와 억제인자 간의 균형이 깨어질 경우, 미토콘드리아 내부에서 세포질로 cytochrome C가 방출되어 세포사멸을 유도하는 caspase cascade를 활성화한다.

도 4를 참조하면, Normal군과 비교하여 300μM SIN-1을 처리한 control 군에서 Bax/Bcl-2의 단백질 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 한편, 무막줄기세포추출물을 처리하였을 경우, Bax/Bcl-2의 단백질 발현이 유의적으로 감소하였다.

또한, Caspase는 protease의 일종으로, 정상세포에서 pro-enzyme의 형태로 존재하며 세포사멸과 관련된 신호에 의해 활성화되면 표적 단백질을 분해한다. 세포질로 방출된 cytochrome C에 의해 pro-caspase-9와 pro-caspase-3은 활성형인 cleaved caspase-9와 cleaved caspase-3로 절단되며, 이는 세포 내에서 poly ADP-ribose polymerase (PARP)를 절단하여 세포사멸을 유도한다.

도 5를 참조하면, LLC-PK₁ 세포에 300μM SIN-1으로 산화적 스트레스를 유도한 후 무막줄기세포추출물을 처리하여 세포사멸 관련 단백질 발현을 측정한 결과, normal군에 비해 control군에서 cleaved caspase-9, cleaved caspase-3, cleaved PARP의 단백질 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.

무막줄기세포추출물을 처리하였을 때 cleaved caspase-9의 단백질 발현에서는 유의미한 효과를 확인하지 못하였으나 cleaved caspase-3의 단백질 발현을 유의적으로 감소시켰으며, control 군과 비교하여 0.5와 1μg/mL 농도에서 cleaved PARP의 단백질 발현을 유의적으로 감소시켰다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 무막줄기세포추출물에는 줄기세포에서 유래된 측분비인자(paracrine factor)가 포함된 것일 수 있다.

구체적으로, 지방 유래 줄기세포는 사이토카인을 비롯한 paracrine factor를 분비하여 면역시스템 조절을 비롯한 다양한 기능을 수행한다. 이전 연구에 따르면 지방 유래 줄기 세포에서 분비된 paracrine factors는 주름 개선, 상처 치유, 모발 성장과 같은 약리학적 작용을 나타냈다. Lee et al.의 "Exosomes from adipose-derived stem cells ameliorate Huntington's disease phenotypes in an in vitro model"에 따르면, 인체지방 유래 줄기세포에서 분비된 exosome은 Huntington's disease의 in vitro모델에서 mitochondrial dysfunction과 세포사멸을 감소시켰다고 보고하였다.

또한, 지방 유래 줄기세포에서 분비되는 insulin-like growth factor (IGF)를 unilateral ureteral obstruction 마우스 모델에 경구투여 했을 때, IGF가 ERK/MAPK pathway를 활성화시켜 신장 세뇨관 상피 세포를 보호하였다.

즉, 본 발명과 이들 결과를 바탕으로 산화적 스트레스를 유도한 신장 세뇨관 상피세포에서 인체지방 유래 줄기세포로부터 유효성분을 추출한 무막줄기세포추출물의 보호 효과는 줄기세포에서 분비된 paracrine factor에 의한 것으로 볼 수 있다.

상기와 같이, 본 발명의 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물은 LLC-PK1 세포에서 항산화 단백질인 HO-1, TrxR1 및 NQO1의 발현을 촉진시켰으며, SIN-1에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대하여 세포생존율을 58.84%에서 64.43%까지 증가시켰다. 이러한 무막줄기세포추출물의 보호 효과에 대한 메커니즘을 살펴본 결과, 염증매개인자인 COX-2, iNOS와 세포사멸 관련 단백질인 Bax, Bcl-2, cleaved caspase 3, cleaved PARP의 발현을 조절함으로써 나타나는 것으로 사료된다. 따라서 무막줄기세포추출물은 항산화, 염증 및 세포 사멸 단백질을 조절함으로써 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 가지는 것일 수 있다.

이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

지방줄기세포에서 유래된 무막줄기세포추출물을 0.5 내지 2.5μg/mL의 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 무막줄기세포추출물은,
지방조직에서 지방줄기세포를 분리하여 정제한 후, 37℃에서, 5%의 CO₂ 조건의 인큐베이터(incubator)에서 초기배양 후, 계대배양을 6 내지 10회 반복하고, 배지를 제거한 후, 줄기세포의 세포막을 제거한 후 추출물을 획득하는 것을 특징으로 하는 무막줄기세포추출물의 산화적 스트레스 개선용 조성물.