RU2533253C2 - Фармацевтический препарат, включающий надосадочную жидкость культуры мононуклеарных клеток крови - Google Patents
Фармацевтический препарат, включающий надосадочную жидкость культуры мононуклеарных клеток крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2533253C2 RU2533253C2 RU2011129676/15A RU2011129676A RU2533253C2 RU 2533253 C2 RU2533253 C2 RU 2533253C2 RU 2011129676/15 A RU2011129676/15 A RU 2011129676/15A RU 2011129676 A RU2011129676 A RU 2011129676A RU 2533253 C2 RU2533253 C2 RU 2533253C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- pbmcs
- pbmc
- medium
- skin
- Prior art date
Links
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 title description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 148
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 35
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims abstract description 34
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims abstract description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 24
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 77
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 36
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 22
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 14
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 14
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 11
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 claims description 7
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 6
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 claims description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 claims description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 3
- 239000006072 paste Substances 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims description 2
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 claims description 2
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 claims description 2
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000865 liniment Substances 0.000 claims description 2
- 229940040145 liniment Drugs 0.000 claims description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 231100000075 skin burn Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 claims description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 230000035876 healing Effects 0.000 abstract description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 29
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 23
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 23
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 16
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 12
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 10
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 9
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 9
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 9
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 9
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 9
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 9
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 9
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 9
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 9
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 4
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 4
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 4
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 4
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 208000030613 peripheral artery disease Diseases 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 206010058558 Hypoperfusion Diseases 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108010090374 matriderm Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005541 ACE inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 206010012665 Diabetic gangrene Diseases 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 230000010337 G2 phase Effects 0.000 description 1
- 206010061431 Glial scar Diseases 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 206010070511 Hypoxic-ischaemic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010022657 Intestinal infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000006 Nitroglycerin Substances 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005764 Peripheral Arterial Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 208000006193 Pulmonary infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000006311 Pyoderma Diseases 0.000 description 1
- 208000003782 Raynaud disease Diseases 0.000 description 1
- 208000012322 Raynaud phenomenon Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010039793 Seborrhoeic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 206010043540 Thromboangiitis obliterans Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 206010047163 Vasospasm Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- RNLQIBCLLYYYFJ-UHFFFAOYSA-N amrinone Chemical compound N1C(=O)C(N)=CC(C=2C=CN=CC=2)=C1 RNLQIBCLLYYYFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002105 amrinone Drugs 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003524 antilipemic agent Substances 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 229940097320 beta blocking agent Drugs 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-RNFDNDRNSA-N cesium-137 Chemical compound [137Cs] TVFDJXOCXUVLDH-RNFDNDRNSA-N 0.000 description 1
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 229940030606 diuretics Drugs 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003711 glyceryl trinitrate Drugs 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000007898 magnetic cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000007575 pulmonary infarction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 201000004700 rosacea Diseases 0.000 description 1
- 208000008742 seborrheic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009092 tissue dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Abstract
Изобретение относится к фармацевтическому препарату наружного применения для лечения воспалительных кожных патологий, предпочтительно кожной патологии, связанной с ишемией. Указанный препарат содержит надосадочную жидкость физиологического раствора, получаемую при культивировании по меньшей мере в течение 1 часа мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или их субпопуляции в физиологическом растворе, свободном от веществ, способствующих пролиферации РВМС и активирующих РВМС, в условиях, вызывающих стресс у клеток. Также изобретение относится к способу приготовления и применению данного препарата. Заявленное изобретение способствует облегчению симптомов воспалительных кожных патологий и процессу заживления. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 18 ил., 5 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к фармацевтическому препарату для лечения внутренних воспалительных кожных патологий, предпочтительно внутренних кожных патологий, связанных с ишемией.
Уровень техники
Гипоксия, состояние кислородного голодания, может наступить при повреждении легких или снижении тока крови. Ишемия, снижение кровотока, может быть вызвана закупоркой артерии или вены кровяным сгустком (тромб) или любым инородным циркулирующим в крови материалом (эмбол) или сосудистым нарушением, таким как атеросклероз. Снижение кровотока может наступить внезапно и продолжаться в течение короткого времени (острая ишемия) или может начинаться медленно и продолжаться в течение длительного времени или проявляться частыми рецидивами (хроническая ишемия). Острая ишемия зачастую связана с регионарным необратимым некрозом ткани (инфаркт), тогда как хроническая ишемия обычно связана с кратковременным гипоксическим поражением ткани. Однако если снижение перфузии является длительным или тяжелым, хроническая ишемия может ассоциироваться с инфарктом. Инфаркты обычно имеют место в селезенке, почках, легких, головном мозге и сердце, вызывая такие нарушения, как интестинальный инфаркт, легочный инфаркт, ишемический инсульт и инфаркт миокарда.
Патологические изменения при ишемических заболеваниях зависят от продолжительности и тяжести ишемии и от продолжительности жизни больного. Некроз может проявиться в пределах инфаркта в течение первых 24 часов, и острая воспалительная реакция развивается в жизнеспособных соседних с участком инфаркта тканях с миграцией лейкоцитов в участок омертвевшей ткани. В последующие дни происходит постепенное разрушение и удаление клеток в пределах инфаркта за счет фагоцитоза и замены коллагеновым или глиальным рубцом.
Гипоперфузия или инфаркт в одном органе часто отрицательно влияет на другие органы. Например, ишемия легкого, вызванная, например, легочной эмболией, негативно влияет не только на легкое, но также приводит сердце и другие органы, такие как головной мозг, в состояние гипоксического стресса. Инфаркт миокарда, который зачастую предполагает блокирование коронарной артерии из-за тромбоза, спазмов сосудов стенок артерии или вирусной инфекции сердца, может привести к застойной сердечной недостаточности и системной гипотензии. Вторичные осложнения, такие как глобальная ишемическая энцефалопатия, могут развиваться, если остановка сердечной деятельности затягивается при длительной гипоперфузии. Церебральная ишемия, наиболее часто вызываемая закупоркой сосудов из-за атеросклероза, может находиться в интервале тяжести заболевания от преходящих нарушений мозгового кровообращения (TIA) до церебрального инфаркта или инсульта. Хотя симптомы TIA являются временными и обратимыми, TIA имеют тенденцию рецидивировать и за ними часто следует инсульт.
Заболевания, связанные с закупоркой артерии, включают заболевание коронарной артерии, которое может привести к инфаркту миокарда, и заболевание периферийной артерии, которое может влиять на брюшную аорту, ее основные ответвления и артерии ног. Заболевания периферийной артерии включают болезнь Бюргера, болезнь Рейно и акроцианоз. Хотя заболевание периферийной артерии обычно вызывается атеросклерозом, другими основными причинами являются, например, диабет и тому подобное. Осложнения, связанные с заболеванием периферийной артерии, включают тяжелые судороги ног, стенокардию, аномальный сердечный ритм, сердечную недостаточность, сердечный приступ, инсульт и почечную недостаточность.
Ишемические и гипоксические нарушения являются основной причиной заболеваемости и смертности. Сердечнососудистые заболевания ответственны за 30% смертельных случаев во всем мире. Среди различных сердечнососудистых заболеваний ишемическая болезнь сердца и цереброваскулярные заболевания служат причиной приблизительно 17% смертельных случаев.
В настоящее время лечение ишемических и гипоксических нарушений сосредоточено на ослаблении симптомов и лечении причинных нарушений. Например, лечение инфаркта миокарда включает нитроглицерин и анальгетики для борьбы с болью и смягчения нагрузки на сердце. Другие медикаменты, в том числе дигоксин, диуретики, амринон, β-блокаторы, агенты, снижающие уровень липидов, и ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, используются для стабилизации состояния, но ни одно из таких лечений не ориентировано непосредственно на поражение ткани, вызванное ишемией и гипоксией.
Раскрытие изобретения
Из-за недостаточности современного лечения остается потребность в способах, которые эффективны при лечении состояний, связанных с гипоксией. Также существует потребность в способах, которые эффективны для предупреждении поражения ткани, вызванного ишемией, которая возникает, например, из-за атеросклероза, диабета и легочных заболеваний.
Состояния, связанные с ишемией и гипоксией, обычно сопровождаются воспалением. Следовательно, необходимы средства и способы, которые также уменьшают воспаление.
Так, цель настоящего изобретения заключается в предоставлении средств, позволяющих эффективно лечить воспалительные состояния, предпочтительно состояния, связанные с ишемией.
Настоящее изобретение относится к фармацевтическому препарату наружного применения для лечения воспалительных кожных патологий, предпочтительно кожной патологии, связанной с ишемией, содержащему надосадочную жидкость физиологического раствора, получаемую при культивировании мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или их субпопуляции в физиологическом растворе, свободном от веществ, способствующих пролиферации РВМС и активирующих РВМС, по меньшей мере в течение 1 часа.
Было обнаружено, что введение фармацевтического препарата согласно определению выше пациенту, страдающему воспалительной кожной патологией, предпочтительно кожной патологией, связанной с ишемией, приводит к облегчению соответствующих симптомов и процессу заживления.
Фармацевтический препарат по настоящему изобретению включает надосадочную жидкость культивированных РВМС или их субпопуляции. При культивировании РВМС эти клетки экспрессируют и выделяют вещества типа цитокинов, которые отличаются от веществ, экспрессируемых и выделяемых активированными РВМС. Это означает, что секретом РВМС по настоящему изобретению отличается от секретома активированных РВМС. В клетках по настоящему изобретению происходит выработка секретома, включающего вещества, не являющиеся клеточно-поверхностными. Поэтому удивительно то, что надосадочную жидкость РВМС, которые не контактировали с веществами, активирующими РВМС, такими как ФГА или липополисахариды, можно применять для лечения воспалительных кожных патологий, это показывает, что секретом этих клеток содержит вещества, поддерживающие лечение упомянутых патологий. Более конкретно, для лечения ишемических кожных патологий подходит надосадочная жидкость.
Надосадочную жидкость РВМС по настоящему изобретению получают культивированием их в физиологическом растворе, который не содержит веществ, способствующих пролиферации РВМС и активирующих РВМС.При этом РВМС инкубируют в физиологическом растворе по меньшей мере в течение 1 часа. Это минимальное время культивирования необходимо для того, чтобы позволить РВМС выделить цитокины и другие вещества, обладающие целительными свойствами.
Часть препарата из РВМС по настоящему изобретению можно получить из цельной крови способами, известными специалистам в этой области, такими как градиент фиколла, гипотонический лизис и тому подобными. Эти способы хорошо известны специалистам.
РВМС фармацевтического препарата можно получить из пула доноров или от того же пациента, для лечения которого будет применяться этот препарат.
Физиологический раствор, из которого получают надосадочную жидкость, содержит по меньшей мере 500, предпочтительно по меньшей мере 1000, более предпочтительно по меньшей мере 105, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 106 клеток на мл раствора или на единицу дозирования.
Термин «физиологический раствор», использованный здесь, означает жидкий раствор, в котором культивируют РВМС до их применения в фармацевтическом препарате по настоящему изобретению.
Термин «физиологический раствор» также означает раствор, который не приводит к гибели РВМС в течение одного часа, предпочтительно в течение 30 мин. Если число жизнеспособных РВМС снижается в растворе на 75%, предпочтительно на 90% в течение одного часа, предпочтительно в течение 30 мин, раствор не считается «физиологическим раствором» согласно определению в данном документе. «Физиологический раствор» не приводит к спонтанному лизису РВМС при их контакте с упомянутым раствором.
В этом контексте этап «культивирования» или «выращивания в питательной среде» включает или состоит из этапа «инкубирования», этапа, во время которого клетки контактируют с раствором в течение определенного времени (по меньшей мере 1 часа, предпочтительно по меньшей мере 4 часов, более предпочтительно по меньшей мере 8 часов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 12 часов) в условиях, которые обычно используются для культивирования РВМС.
Термин «кожная патология, связанная с ишемией», в контексте настоящего изобретения может использоваться как взаимозаменяемый с термином «ишемическая кожная патология» и означает любое состояние, болезнь или нарушение, при котором участки тела человека или животного лишены поступления кислорода в достаточном количестве, в результате чего возникает повреждение или дисфункция ткани. Патологическое состояние может характеризоваться уменьшением или прекращением притока крови в коже или в ее части, что может быть обусловлено сужением или закупоркой кровеносного сосуда. Такие патологии здесь собирательно называют термином «ишемия» или «кожной патологией, связанной с ишемией». Например, при болезнях сердца, термин ишемия зачастую используют для описания сердечной мышцы, которая не получает достаточного количества обогащенной кислородом крови по причине сужения или закупорки коронарных артерий. Симптомы ишемии зависят от органа, который является «ишемическим». В случае с сердцем ишемия зачастую приводит к стенокардии. В случае с мозгом ишемия может привести к инсульту. Состояния ишемии сопровождаются воспалением.
Неограничивающие примеры кожных патологий, связанных с воспалением, в частности с ишемией, включают раны, хронические раны, диабетические раны, наружные кожные язвы, псориаз и тому подобное.
Невзирая на вышесказанное, патологическое состояние в контексте изобретения может характеризоваться повреждением или дисфункцией эндотелиальных клеток, то есть раной. Неограничивающими примерами ран, которые можно лечить применением препарата по настоящему изобретению, являются хронические раны, диабетические раны, язвы, ожоги, воспалительные кожные заболевания и болезни кишечника.
Используемый здесь «физиологический раствор» предпочтительно является раствором, проявляющим осмотическое давление, которое не приводит к разрушению РВМС или их субпопуляций, и его можно напрямую вводить пациенту.
Термин «свободный от веществ, способствующих пролиферации РВМС и активирующих РВМС», означает физиологический раствор, который не содержит веществ, активирующих РВМС и вызывающих пролиферацию РВМС или их субпопуляций. Эти вещества включают ФГА, липополисахариды и тому подобное.
По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения воспалительное кожное заболевание выбирают из группы, включающей воспаление, вызванное гипоксией воспаление и аутоиммунное заболевание, предпочтительно псориаз, акне, розацеа, гангренозную пиодермию, дерматит, атопическое кожное заболевание, контактный дерматит, себорейный дерматит, узловатую эритему, инфекционные болезни кожи, вызываемые бактериальной, вирусной, грибковой, паразитической инфекцией, ужалением, укусами, и крапивницу, и кожные патологии, связанные с ишемией. В частности, предпочтительными кожными патологиями являются кожные патологии, связанные с ишемией.
По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения кожную патологию, связанную с ишемией, выбирают из группы, включающей раны, тканевую ишемию, хронические раны, диабетические раны, наружные кожные язвы, ожоги кожи, кожные лоскуты в пластической хирургии и регенерацию тканей после стоматологической имплантации.
Субпопуляцией мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) предпочтительно являются T-клетки, B-клетки или NK-клетки. Очевидно, можно также применять сочетания этих клеток: T-клетки и B-клетки; T-клетки и NK-клетки; B-клетки и NK-клетки; T-клетки, B-клетки и NK-клетки. Способы получения и выделения упомянутых клеток известны.
Неожиданно обнаружилось, что РВМС по настоящему изобретению можно культивировать в любом типе раствора при условии, что упомянутый раствор не содержит веществ, которые фармацевтически неприемлемы, приводят к немедленной гибели РВМС (согласно описанию выше), активируют РВМС и стимулируют пролиферацию РВМС. Поэтому раствор, который будет использоваться, по меньшей мере должен проявлять осмотические свойства, не приводящие к лизису РВМС.Физиологическим раствором предпочтительно является физиологический раствор соли, предпочтительно физиологический раствор NaCl, цельная кровь, фракция крови, предпочтительно сыворотка, или среда для культуры клеток.
Среду для культуры клеток предпочтительно выбирают из группы, включающей среду RPMI, среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM), среду X-vivo и среду Ultraculture.
По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения клетки по настоящему изобретению культивируют в условиях, вызывающих стресс.
Используемый здесь термин «в условиях, вызывающих стресс», означает условия культивирования, приводящие к тому, что клетки оказываются в состоянии стресса. Условия, вызывающие стресс у клеток, помимо прочих включают нагрев, химикаты, облучение, гипоксию, осмотическое давление и тому подобное.
Дополнительный стресс у клеток по настоящему изобретению приводит к дальнейшему увеличению экспрессии и секреции веществ, целительных при лечении воспалительных кожных патологий, в частности кожных патологий, связанных с ишемией.
По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения условия, вызывающие стресс, включают гипоксию, озон, нагрев (например, более, чем на 2°C, предпочтительно более чем на 5°C, более предпочтительно более чем на 10°C, выше оптимальной температуры культивации РВМС, более конкретно, 37°C), облучение (например, УФ-облучение, гамма-облучение), химикаты, осмотическое давление (например, осмотические условия, которые по меньшей мере на 10% превышают осмотические условия, обычно имеющие место в биологической жидкости, более конкретно, в крови) или их комбинацию.
Если для создания стресса у РВМС по настоящему изобретению используется облучение, клетки предпочтительно облучают дозой по меньшей мере 10 Гр, более предпочтительно по меньшей мере 20 Гр, наиболее предпочтительно по меньшей мере 40 Гр, при этом в качестве источника Cs-137 предпочтительно применяют цезий.
По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения неактивированные РВМС или их субпопуляцию культивируют в среде по меньшей мере в течение 4 часов, предпочтительно по меньшей мере в течение 6 часов, наиболее предпочтительно по меньшей мере в течение 12 часов.
Фармацевтический препарат по настоящему изобретению предназначен для наружного применения. Следовательно, упомянутый препарат предпочтительно имеет форму геля, предпочтительно гидрогеля, мази, кожного пластыря, фармацевтически приемлемой матрицы, предпочтительно на матрице из коллагена/эластина (см., например, Haslik W et al. J Plast Reconst Aesth Surg (2008): "Management of full-thickness skin defects in the hand and wrist region: first long-term experiences with the dermal matrix Matriderm" («Лечение дефектов всей толщи кожи в зоне кисти и запястья: первый долговременный опыт применения кожной матрицы Matriderm»)), пасты, крема, порошка, линимента или лосьона.
Фармацевтический препарат по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как растворители, стабилизаторы, носители и тому подобное. В зависимости от лекарственной формы препарат по настоящему изобретению содержит соответствующие ингредиенты. Способы приготовления препарата хорошо известны специалистам в этой области.
Для увеличения срока хранения препарата по настоящему изобретению раствор a) или надосадочную жидкость b) лиофилизируют. Способы лиофилизации таких препаратов хорошо известны специалистам в этой области.
Перед использованием лиофилизированный препарат можно ввести в контакт с водой или с водным раствором, содержащим буферы, стабилизаторы, соли и тому подобное.
Другой аспект настоящего изобретения касается применения препарата согласно определению выше для изготовления лекарственного средства для лечения воспалительных кожных патологий, более конкретно кожной патологии, связанной с ишемией.
Еще один аспект настоящего изобретения касается способа приготовления фармацевтического препарата наружного применения, раскрываемого в настоящем документе, включающего этапы:
a) получения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или их субпопуляции,
b) культивирования клеток, полученных на этапе a), в физиологическом растворе, свободном от веществ, способствующих пролиферации РВМС и активирующих РВМС по меньшей мере в течение 1 часа,
c) отделения надосадочной жидкости, полученной на этапе b), и
d) приготовления фармацевтического препарата с использованием надосадочной жидкости, полученной на этапе c).
Препарат по настоящему изобретению можно получить инкубированием или культивированием РВМС в физиологическом растворе по меньшей мере в течение 1 часа, предпочтительно по меньшей мере в течение 4 часов, более предпочтительно по меньшей мере в течение 8 часов, наиболее предпочтительно по меньшей мере в течение 12 час. Во время этого этапа РМВС начинают синтезировать и выделять вещества, полезные при лечении воспалительных состояний. До, после и в течение этапа культивирования клетки не активируют добавлением веществ, активирующих РВМС, таких как ФГА или липополисахариды. После этапа культивирования клетки и/или надосадочную жидкость культуры отделяют для последующего использования при приготовлении окончательного фармацевтического препарата. В соответствии с обсуждением выше фармацевтический препарат может содержать культивированные РВМС, надосадочную жидкость культуры, в которой инкубировали упомянутые клетки или одновременно культивированные РВМС и культуральную среду.
По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения клетки подвергают воздействию условий, вызывающих стресс, до или во время этапа b), причем упомянутые условия, вызывающие стресс, включают гипоксию, озон, нагрев, облучение, химикаты, осмотическое давление (например, вызванное добавлением соли, в частности, NaCl, для создания более высокого осмотического давления, чем осмотическое давление крови), сдвиг рН (например, изменение рН добавлением кислот или гидроокисей для придания рН значения в диапазоне от 6,5 до 7,2 или от 7,5 до 8,0) или их комбинацию.
По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения клетки облучают до или в течение этапа b) дозой по меньшей мере 10 Гр, предпочтительно по меньшей мере 20 Гр, более предпочтительно по меньшей мере 40 Гр, озоном, повышенной температурой или УФ-облучением.
Еще один аспект настоящего изобретения касается препарата, получаемого способом, описанным выше.
Еще один аспект настоящего изобретения касается способа лечение воспалительных кожных патологий, более конкретно, кожных патологий, связанных с ишемией, введением нуждающемуся в нем пациенту соответствующего количества фармацевтического препарата по настоящему изобретению.
Ниже настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими фигурами и примерами, но не будет ограничиваться ими.
На фигуре 1 показано влияние надосадочной жидкости (SN), происходящей из культуры мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) на миграцию клеток у первичных кератиноцитов человека (KC) и фибробластов кожи (FB).
КС и FB были выращены, соответственно, в среде для роста KC и среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки). После достижения конфлюентности монослой клеток соскребали кончиком пипетки и затем культивировали с SN, происходящей от РВМС, в течение 16 часов. Мы смогли выявить лишь небольшой эффект SN, происходящей от живых РВМС (LL) на КС, тогда как SN, происходящая от апоптотических РВМС (АРО), в значительной степени стимулировала миграцию KC. Напротив, обе SN (LL и АРО) в значительной степени стимулировали миграцию клеток у фибробластов кожи FB.
На фигуре 2 показано влияние SN, происходящей от РВМС на ход клеточного цикла KC и FB.
Пролиферирующие KC и FB культивировали в SN, происходящей от РВМС. После 24 часов клетки инкубировали с 5-бромдезоксиуридином в течение 2 часов и затем обработали согласно указаниям в инструкции по применению (набор для флуоресцентной сортировки клеток в зависимости от стадии цикла с помощью 5-бромдезоксиуридина в проточной кювете, BD Biosciences). Как показано на фигуре 2, стимулирование FB с использованием SN, происходящей от РВМС, приводило к сокращению пролиферирующей популяции клеток, сопровождающемуся увеличением числа клеток в фазе G2/M. Напротив, было обнаружено значительное увеличение числа пролиферирующих КС при применении обеих SN: LL и АРО. Однако эффект от SN, происходящей от апоптотических клеток, был менее выражен в случае с KC.
На фигуре 3 показано, что SN, происходящая от РВМС, заметно усиливает заживление раны in vivo.
Кремы, содержащие SN, происходящую либо от LL (фиг.3a, b), либо от АРО (фиг.3b) РВМС, наносили на раны от пункционной биопсии размером 6 мм на спине мышей В6/129 сразу после нанесения раны. Через 8 дней после нанесения раны мышей забивали и проводили анализ ран окрашиванием гематоксилином-эозином. Как показано на фигурах 3a и 3b обе SN значительно ускоряли заживление ран как в дермальных, так и в эпидермальных слоях кожи.
На фигуре 4 показано, что SN, происходящая от РВМС, заметно усиливает заживление раны in vivo.
Измеряли размер раны в течение первых 5 дней после нанесения раны, пока не сформировалась корочка. Как показано на фигуре 4, было обнаружено, что закрытие раны после обработки кремами, содержащими надосадочную жидкость, происходящую от РВМС, происходило гораздо быстрее по сравнению только с одним кремом в течение всех 5 дней. Тогда как размер раны несколько увеличивался в течение первых 2 дней при обработке только кремом, раны, обработанные надосадочной жидкостью, происходящей от РВМС, начинали затягиваться в течение первых 24 часов после нанесения ран и обработки кремом.
На фигуре 5 показано усиление ангиогенеза в ранах мышей in vivo после обработки SN, происходящей от РВМС.
Иммуногистохимическим исследованием фактора VIII (фиг.5а) и CD31 (фиг.5b), которые оба являются маркерами кровеносных сосудов, было обнаружено массивное увеличение CD31-положительных клеток в ранах, обработанных SN, по сравнению с контролем, указывающее на усиление ангиогенеза, что могло способствовать ускорению заживления ран. Напротив, увеличения числа пролиферирующих клеток в этот момент времени согласно анализу окрашиванием Ki67 обнаружено не было (фиг.5а).
На фигуре 6а показано, что ни нестимулированные жизнеспособные РВМС, ни IA-РВМС не выделяют основной происходящий от моноцитов провоспалительный цитокин TNF-α. (Значимость обозначена следующим образом: * p=0,05, ** p=0,001; n=8).
На фигуре 6b показана сильная индукция секреции провоспалительного интерферона-γ после активации по сравнению с нестимулированными РВМС. (Значимость обозначена следующим образом: * p=0,05, ** p=0,001; n=8).
На фигуре 7a показаны сводные результаты проточно-цитометрического анализа. Были определены РВМС, дающие сигнал выше порогового значения для Т-клеток, и была оценена экспрессия маркеров активации CD69 и CD25. (Значимость обозначена следующим образом: * p=0,05, ** p=0,001; n =4).
На фигуре 7b показан репрезентативный анализ результатов флуоресцентной сортировки активированных РВМС (либо ФГА, либо CD3 mAb). Дискриминационное окно показывает % положительных клеток.
На фигуре 8 показана высокая скорость пролиферации по результатам измерений включения 3[H]-тимидина стимулированных РВМС по сравнению с жизнеспособными РВМС, культивированными в растворе RPMI без стимуляции.
На фигуре 9 показано ингибирование ответа Т-клеток секретома РВМС при анализе пролиферации T-клеток.
На фигуре 10 показаны результаты экспериментов по стимуляции анти-CD3 и ФГА, проведенных с РВМС.
На фигуре 11 показана пролиферация РВМС при стимуляции анти-CD3, ФГА и смешанными лимфоцитами.
На фигуре 12 показан уровень аннексина V и PI-позитивность надосадочной жидкости CD4+ клеток, инкубированных с надосадочной жидкостью РВМС.
На фигуре 13 показано ингибирование позитивной регуляции CD25 и CD69 в CD4+ клетках надосадочной жидкостью РВМС.
На фигуре 14 показано, что обработка анти-IL-10 и TGF-β агентами не приводит к увеличению скорости пролиферации CD4+ клеток.
Примеры
Пример 1. Надосадочная жидкость культуры мононуклеарных клеток периферической крови заметно ускоряет заживление ран.
Незаживающие кожные язвы зачастую не поддаются общепринятому лечению. При предварительных исследованиях было обнаружено, что применение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) вместе с основным фактором роста фибробластов, по-видимому, является полезным лечением диабетической гангрены. В настоящем примере исследовали, будет ли надосадочная жидкость культуры РВМС (облученных или необлученных) достаточной для стимулирования ускоренного заживления ран на модели мышей. Кроме того, было проанализировано воздействие этой надосадочной жидкости на первичные фибробласты кожи (FB), кератиноциты (KC) и эндотелиальные клетки (EC) человека.
Инкубированием FB и КС с надосадочной жидкостью, происходящей от РВМС, было обнаружено, что надосадочная жидкость как необлученных, так и облученных клеток в значительной степени стимулировала миграцию FB, при том, что она не оказывала влияния на пролиферацию FB. Напротив, было показано, что обе надосадочные жидкости влияли на КС в плане их способности к миграции и пролиферации. Однако эффект надосадочной жидкости, происходящей от облученных клеток, был более выраженным. Поскольку надосадочная жидкость, происходящая от РВМС, стимулировала механизмы миграции и пролиферации in vitro, было проведено дальнейшее изучение того, способны ли эти надосадочные жидкости также стимулировать заживление ран in vivo. Поэтому были приготовлены кремы, содержащие происходящую от РВМС надосадочную жидкость, и наносили их на раны от пункционной биопсии размером 6 мм на спине мышей В6/129 сразу после нанесения раны. Измеряли размер раны в течение следующих 4-5 дней, пока не сформировалась корочка. Удивительным образом было обнаружено, что закрытие раны после обработки кремами, содержащими надосадочную жидкость, происходящую от РВМС, происходило гораздо быстрее по сравнению только с одним кремом в течение всех 5 дней. Примечательно, что тогда как размер раны несколько увеличивался в течение первых 2 дней при обработке только кремом, раны, обработанные надосадочной жидкостью, происходящей от РВМС, начинали затягиваться в течение первых 24 часов после нанесения ран и обработки кремом. Через 8-10 дней после нанесения раны мышей забивали и проводили анализ ран окрашиванием гематоксилином-эозином и иммуногистохимическим исследованием CD31, который является маркером кровеносных сосудов. Окрашивание гематоксилином-эозином выявило, что заживление ран как в дермальных, так и в эпидермальных слоях кожи значительно ускорялось в присутствии кремов с происходящей от РВМС надосадочной жидкостью. Кроме того, отмечалось массивное увеличение CD31-положительных клеток в этих ранах, указывающее на усиление ангиогенеза, что могло способствовать ускорению заживления ран.
Таким образом, было показано, что происходящая от РВМС надосадочная жидкость приводила к ускорению заживления ран у мышей in vivo, и что эти надосадочные жидкости также стимулировали пролиферацию и миграцию у клеток человека in vitro. Лекарственная форма кремов, содержащих происходящую от РВМС надосадочную жидкость, может обладать большими преимуществами при лечении незаживающих наружных язв кожи (см. фиг.1-5).
Пример 2. Мононуклеауные клетки периферической крови (РВМС) в покое демонстрируют невысокий уровень маркеров активации и сниженную выработку воспалительного иитокина.
Активированные мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и их надосадочная жидкость (SN) предположительно благоприятно влияют на регенерацию ран (Holzinger С et al. Eur J Vase Surg. 1994 May; 8(3): 351-6). В примерах 1 и 2 могло быть показано, что неактивированные РВМС и происходящая от них SN оказывают благоприятное воздействие при экспериментальном остром инфаркте миокарда (AMI) и на модели ран. Поскольку отсутствие активации РВМС надо было проверить экспериментально, было проведено исследование того, приводит ли культивирование РВМС к увеличению количества маркеров активации T-клеток (CD69, CD25) или увеличению секреции воспалительного цитокина (активация моноцитов=TNFα, активация Т-клеток=INFγ). В контрольном эксперименте культивируемые T-клетки включали стимуляцией CD3 mAb или фитогемагглютинином (ФГА).[
Методы и результаты
У здоровых волонтеров отбирали венозную кровь в пробирки с ЭДТА. После разделения в градиенте плотности Фиколла-Гипака РВМС собирали и разделяли на жизнеспособные и облученные апоптотические клетки (IA-PBMC). Для получения апоптотических клеток РВМС облучали дозой 60 Гр (цезий-137). Для проточного цитометрического анализа 500.000 РВМС культивировали в 200 мкл среды, свободной от сыворотки. Клетки стимулировали ФГА (7 мкг/мл) или CD3-mAb (10 мкг/мл) или оставляли нестимулированными. После 24 часов инкубации клетки промывали, окрашивали для выявления CD3, CD69 и CD25 (R&D System) и оценивали на предмет маркеров поверхностной активации с помощью FC500 (Coulter). Для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) РВМС культивировали в течение ночи при плотности 2,5×106 клеток/мл при стимуляции ФГА или CD3 или без стимуляции. После 24 часов надосадочную жидкость отбирали и замораживали при -20°C. Были приобретены выпускаемые в продажу наборы для иммуноферментного анализа (ELISA) для TNF-α (R&D) и INF-γ (Bender). Коротко говоря, пластины MaxiSorp покрывали антителами к TNF-α и INF-γ выдерживали в течение ночи. Через 24 часа пластины промывали, и в каждую лунку вносили пробы в двух повторностях. После инкубирования и добавления идентифицирующего антитела и стрептавидина-HRP, в каждую лунку был добавлен субстрат ТМБ. После развития цвета ферментную реакцию останавливали добавлением серной кислоты. Показатели оптической плотности считывали по спектрофотометру для прочтения планшетов Wallac Victor3.
Результаты.
Флуоресцентная сортировка клеток: T-клетки, стимулированные CD3 и ФГА демонстрировали позитивную регуляцию маркеров активации CD69 и CD25 после 24 часов инкубации. Нестимулированные и апоптотические клетки экспрессировали лишь небольшое количество CD69 и CD25 (фиг.6а (репрезентативная проба, фиг.6b, гистограмма, n=4). Статистическая значимость обозначена звездочкой (xx р<0,001, x р<0,05). Иммуноферментный анализ: Тогда как в происходящей от нестимулированных РВМС надосадочной жидкости не были обнаружены ни TNF-α, ни INF-γ, в надосадочной жидкости от РВМС, стимулированных ФГА или CD3, обнаружен высокий уровень этих цитокинов согласно результатам иммуноферментного анализа (звездочка ** р<0,001, * р<0,05, n=8). Эти результаты явно указывают на иную модель секреции воспалительных цитокинов по сравнению с нестимулированными РВМС.
Заключение.
Эти данные указывают на то, что «нестимулированные РВМС» проявляли отчетливо иной фенотип (маркер активации, секреция цитокинов) по сравнению со стимулированными РВМС (ФГА и CD3 mAb).
На фигуре 6а показано, что ни нестимулированные жизнеспособные РВМС, ни IA-РВМС не выделяют основной происходящий от моноцитов провоспалительный цитокин TNF-α. (Значимость обозначена следующим образом: * р=0,05, ** р=0,001; n=8).
На фигуре 6b продемонстрирована сильная индукция секреции провоспалительного интерферона-γ после активации по сравнению с нестимулированными РВМС.(Значимость обозначена следующим образом: * р=0,05, ** р=0,001; n=8).
На фигуре 7а показаны сводные результаты проточно-цитометрического анализа. Были определены РВМС, дающие сигнал выше порогового значения для T-клеток, и была оценена экспрессия маркеров активации CD69 и CD25. (Значимость обозначена следующим образом: * p=0,05, ** p=0,001; n=4).
На фигуре 7b показан репрезентативный анализ результатов флуоресцентной сортировки активированных РВМС (либо ФГА, либо CD3 mAb). Дискриминационное окно показывает % положительных клеток.
Пример 3. Пролиферативная активность РВМС, культивируемых в физиологическом растворе.
Цель этого примера заключалась в том, чтобы доказать, что РВМС не обладают пролиферативной активностью по результатам сравнения данных иммунного анализа, в котором используется специфическое (CD3), неспецифическое (лектин, ФГА) и аллогенное включение T-клеток (реакция смешанной культуры лимфоцитов, СКЛ) в исследованиях с 2-дневным (CD3, ФГА) и 5-дневным (СКЛ) стимулированием.
Материалы и методы
РВМС из крови молодых здоровых волонтеров отделяли центрифугированием в градиенте плотности Фиколла и повторно суспендировали в среде RPMI (Gibco, США), содержащей 0,2% сульфата гентамицина (Сигма Кемикал (Sigma Chemical Со), США), 1% L-глутамина (Сигма (Sigma), США) из расчета 1*105 клеток на 200 мкл. Клетки-респондеры стимулировали МоАЬ к CD3 (10 мкг/мл, BD, Нью-Джерси, США) или ФГА (7 мкл/мл, Сигма Кемикал (Sigma Chemical Со), США) или облученными аллогенными РВМС в соотношении 1:1 (в случае СКЛ-реакции). Пластинки инкубировали в течение 48 часов или 5 дней и затем подвергали «облучению» в течение 18 часов 3[H]-тимидином (3,7*104 Бк/лунку; Амершам Фармация Биотех (Amersham Pharmacia Biotech), Швеция).
Клетки собирали и измеряли включение 3[H]-тимидина в жидкостном сцинтилляционном счетчике.
Результаты.
Стимулированные РВМС демонстрировали высокую скорость пролиферации по результатам измерения включения 3[H]-тимидина по сравнению с жизнеспособными РВМС, культивированными в среде RPMI без стимуляции (фиг.8). Этот эффект отмечался при добавлении стимуляторов, специфических для T-клеток (ФГА, CD3), а также в исследованиях, в которых пролиферация включалась антиген-представляющими клетками (СКЛ).
Заключение.
Эта серия экспериментов указывает на то, что жизнеспособные РВМС, выдержанные в культуре в течение до 5 дней, не пролиферируют, тогда как РВМС, стимулированные различными способами, демонстрировали выраженный пролиферативный ответ. Был сделан вывод о том, что культура РВМС без стимуляции не приводит к возникновению пролиферативного ответа.
Пример 4. Секретом отделенных РВМС при хранении в условиях стерильной культуры обладает неоангиогенными свойствами.
Поскольку in vivo неоангиогенез и воспаление тесно взаимосвязаны, было исследовано, оказывают ли эти секретомы РВМС также анти-пролиферативное действие на T-клетки и, следовательно, мешают ли они воспалительной иммунной реакции.
Материалы и методы
Секретомы были получены при инкубировании РВМС (2,5*106/мл) от молодых здоровых волонтеров, отделенные центрифугированием в градиенте плотности Фиколла, в течение 24 часов в среде RPMI (Джибко (Gibco), Калифорния, США), содержащей 0,2% сульфата гентамицина (Сигма Кемикал (Sigma Chemical Со), США) и 1% L-глутамина (Сигма (Sigma), США). Надосадочную жидкость отделяли от клеточной фракции и хранили при -80°C. Для исследования пролиферации аллогенные РВМС повторно суспендировали из расчета 1*105 клеток на 200 мкл среды RPMI после отделения. Клетки-респондеры стимулировали MoAb к CD3 (10 мкг/мл, BD, США) или ФГА (7 мкл/мл, Сигма Кемикал (Sigma Chemical Со), США). Добавляли надосадочную жидкость в различных разведениях. Пластинки инкубировали в течение 48 часов и затем подвергали «облучению» в течение 18 часов 3[H]-тимидином (3,7*104 Бк/лунку; Амершам Фармация Биотех (Amersham Pharmacia Biotech), Швеция). Клетки собирали и измеряли включение 3[H]-тимидина в жидкостном сцинтилляционном счетчике.
Результаты.
Секретомы аллогенных РВМС продемонстрировали значительное снижение скорости пролиферации, замеренной включением [H]-тимидина при сравнении с положительным контролем (фиг.9). Этот эффект зависел от дозы и отмечался как при анти-CD3 обработке, так и при стимуляции ФГА.
Вывод.
Эта серия экспериментов косвенно указывает на то, что секретомы, полученные от жизнеспособных РВМС, выдержанных в культуре в течение 24 часов, проявляли значительное анти-пролиферативное действие in vitro. Эти данные указывают на то, что надосадочная жидкость, происходящая от РВМС, или в лиофилизированной форме может использоваться в качестве потенциального состава терапевтического средства для лечения болезней человека, связанных с воспалением, вызванным гипоксией, или других гипервоспалительных заболеваний (например, аутоиммунных болезней, воспалительных кожных патологий).
Пример 5. Паракринные факторы, выделяемые мононуклеарными клетками периферической крови, обладают иммуносупрессивными свойствами.
В примере 1 было продемонстрировано противовоспалительное действие секретома РВМС на модели животных с острым инфарктом миокарда (AMI). В этом примере показано, что применение секретома РВМС после вызывания AMI замедляет воспалительные поражения сердечной мышцы массивной негативной регуляцией иммунного ответа.
На основании этих данных было исследовано возможное иммуносупрессивное действие секретома в экспериментах in vitro. Ключевую роль в подготовке иммунного ответа играют CD4+ клетки, поскольку они являются главными в помощи других лейкоцитов (например, макрофагов, В-клеток, цитотоксических T-клеток) в иммунологических процессах.
Материалы и методы
Получение секретома РВМС
РВМС от здоровых волонтеров отделяли центрифугированием в градиенте плотности Фиколла. Клетки повторно суспендировали в среде Ultra Culture (Лонза (Lonza), Базель, Швейцария) из расчета 1*106 клеток /мл (sup liv). Для получения секретома от апоптотических РВМС апоптоз вызывали облучением дозой 60 Гр (sup АРА). Клетки инкубировали в течение 24 часов в увлажненной атмосфере (5% CO2, 37°C, относительная влажность 95%). Надосадочную жидкость собирали и проводили диализ с пределом отсечения 3,5 кДа (Спектрум Лабораториз (Spectrum laboratories), Бреда, Нидерланды) против 50 мМ раствора ацетата аммония в течение ночи при 4°C. После этого надосадочную жидкость фильтровали через стерильный фильтр и лиофилизировали. Лиофилизированные секретомы хранили при -80°C и для каждого эксперимента готовили свежую повторную суспензию. Случайно отбирали пробы секретомов для определения уровня рН.
Отделение клеток CD4+
CD4+ клетки отделяли элиминацией Т клеток, не относящихся к CD4+ клеткам, с помощью системы гранул для магнитной сортировки клеток MACS (Милтений (Miltenyi), Бергиш-Гладбах, Германия). Клетки готовили заново и сразу же использовали для каждого эксперимента.
Измерение апоптоза
Апаптоз выявляли методом проточной цитометрии с использованием выпускаемого в продажу набора аннексии V/PI (BD, Нью-Джерси, США). Апоптоз определяли по положительному окрашиванию аннексином, поздний апоптоз - по PI-позитивности.
Эксперименты с пролиферацией
РВМС или очищенные CD4+ клетки разводили в Ultra Culture с добавлением 0,2% сульфата гентамицина (Сигма (Sigma), Сент-Луис, Миссури, США), 0,5% β-меркаптоэтанола (Сигма (Sigma), Сент-Луис, Миссури, США) и 1% GlutaMAX-I (Инвитроген (Invitrogen), Карлсбад, Калифорния, США) из расчета 1*105/лунку в плашке на 96-лунок с круглым дном. Клетки стимулировали ФГА (7 мкг/мл, Сигма (Sigma), США) или CD3 (10 мкг/мл, BD, Нью-Джерси, США), IL-2 (10 ед/мл, BD, США) или соотношением 1:1 аллогенных облученных (60 Гр) РВМС для СКЛ. Клетки инкубировали в течение 48 часов или 5 дней (СКЛ) с различными концентрациями секретома РВМС, IL-10 или TGF-β. Затем клетки «облучали» в течение 18 часов 3[Н]-тимидином (3,7*104 Бк/лунку; Амершам Фармация Биотех (Amersham Pharmacia Biotech), Уппсала, Швеция). Клетки собирали и замеряли включение 3[H]-тимидина в жидкостном сцинтилляционном счетчике.
Маркеры активации
Очищенные CD4+ клетки симулировали анти-CD3 (10 мкг/мл) и соинкубировали с секретомом РВМС в различных концентрациях. Клетки окрашивали для выявления CD69 и CD25 в соответствии со стандартной процедурой окрашивания при проточной цитометрии и анализировали с помощью проточного цитометра FC500 (Бекман Коултер (Beckman Coulter), Фуллертон, Калифорния, США).
Результаты.
В предварительных экспериментах проводили тестирование антипролиферативных свойств надосадочной жидкости РВМС жизнеспособных клеток (sup liv). В экспериментах со стимуляцией анти-СD3 и ФГА скорость пролиферации была значительно снижена при добавлении секретома (n=10).
На основании этих данных оценивали эффект секретома РВМС на компартмент клеток T-хелперов, поскольку эти клетки играют главную роль в запуске и поддержании иммунного ответа. По аналогии с фигурой 10, CD4+ клетки высокой степени очистки теряли свою пролиферативную способность при добавлении секретома. Этот феномен наблюдали для надосадочной жидкости как живых, так и апоптотических, облученных РВМС (фиг.11, n=5).
Следующий этап заключался в определении возможного воздействия секретома на жизнеспособность клетки. Поэтому CD4+ клетки в покое инкубировали с надосадочной жидкостью и оценивали уровень аннексина V и PI-позитивность. Надосадочная жидкость как от живых, так и от апоптотических РВМС демонстрировала заметное про-апоптотическое действие (фиг.12, n=5).
Для исследования того, способны ли секретомы РВМС подавлять активацию CD4+ клеток, оценивали уровень маркеров активации T-клеток CD25 и CD69 после стимуляции CD4+ клеток анти-СЭЗ. Позитивная регуляция обоих маркеров существенно и дозозависимо подавлялась секретомом РВМС (фиг.13, n=5).
В последней серии экспериментов изучали эффект иммуносупрессивных цитокинов IL-10 и TGF-β при добавлении нейтрализующих антител. Было установлено, что ни IL-10, ни TGF-β не отвечали за антипролиферативное воздействие наших секретомов РВМС, поскольку нейтрализация этих цитокинов не приводила к увеличению скорости пролиферации (фиг.14, n=5).
Заключение
Эти эксперименты впервые свидетельствуют о том, что секретом РВМС обладает иммуносупрессивными признаками in vitro. Было показано, что надосадочная жидкость a) снижает скорость пролиферации в экспериментах по стимуляции анти-СD3, ФГА и СКЛ, b) обладает свойствами вызывать апоптоз и подавляет активацию CD4+клеток при запуске Т-клеточного ответа.
Claims (20)
1. Фармацевтический препарат наружного применения для лечения воспалительных кожных патологий, предпочтительно кожной патологии, связанной с ишемией, содержащий надосадочную жидкость физиологического раствора, получаемую при культивировании по меньшей мере в течение 1 часа мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или их субпопуляции в физиологическом растворе, свободном от веществ, способствующих пролиферации РВМС и активирующих РВМС, в условиях, вызывающих стресс у клеток.
2. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что упомянутую патологию выбирают из группы, включающей раны, тканевую ишемию, хронические раны, диабетические раны, наружные кожные язвы, ожоги кожи, кожные лоскуты в пластической хирургии и регенерацию тканей после стоматологической имплантации.
3. Препарат по п.1 или 2, характеризующийся тем, что субпопуляция мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) представляет собой Т-клетки, В-клетки или NK-клетки.
4. Препарат по п.1 или 2, характеризующийся тем, что физиологическим раствором является физиологический раствор соли, предпочтительно физиологический раствор NaCl, цельная кровь, фракция крови, предпочтительно сыворотка, или среда для культуры клеток.
5. Препарат по п.3, характеризующийся тем, что физиологическим раствором является физиологический раствор соли, предпочтительно физиологический раствор NaCl, цельная кровь, фракция крови, предпочтительно сыворотка, или среда для культуры клеток.
6. Препарат по п.4, характеризующийся тем, что среду для культуры клеток выбирают из группы, включающей среду RPMI, среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM), среду X-vivo и среду Ultraculture.
7. Препарат по п.5, характеризующийся тем, что среду для культуры клеток выбирают из группы, включающей среду RPMI, среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко (DMEM), среду X-vivo и среду Ultraculture.
8. Препарат по любому из пп.1, 2, 5, 6 или 7, характеризующийся тем, что условия, вызывающие стресс, включают гипоксию, озон, нагрев, облучение, химикаты, осмотическое давление, сдвиг pH или их комбинацию.
9. Препарат по п.3, характеризующийся тем, что условия, вызывающие стресс, включают гипоксию, озон, нагрев, облучение, химикаты, осмотическое давление, сдвиг pH или их комбинацию.
10. Препарат по п.4, характеризующийся тем, что условия, вызывающие стресс, включают гипоксию, озон, нагрев, облучение, химикаты, осмотическое давление, сдвиг pH или их комбинацию.
11. Препарат по п.8, характеризующийся тем, что условия, вызывающие стресс, включают гипоксию, озон, нагрев, облучение, химикаты, осмотическое давление, сдвиг pH или их комбинацию.
12. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что РВМС или их субпопуляцию подвергают стрессу при культивировании дозой, по меньшей мере, 10 Гр, предпочтительно, по меньшей мере, 20 Гр, более предпочтительно, по меньшей мере, 40 Гр, озоном, повышенной температурой или УФ-облучением.
13. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что упомянутый препарат предпочтительно имеет форму геля, предпочтительно гидрогеля, мази, кожного пластыря, фармацевтически приемлемой матрицы, предпочтительно на матрице из коллагена/эластина, пасты, крема, порошка, линимента или лосьона.
14. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что надосадочная жидкость лиофилизирована.
15. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что РВМС или их субпопуляцию культивируют в упомянутом растворе, по меньшей мере, в течение 4 часов, предпочтительно, по меньшей мере, в течение 6 часов, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в течение 12 часов.
16. Применение препарата по любому из пп.1-15 для изготовления лекарственного средства для лечения воспалительных кожных патологий, предпочтительно кожной патологии, связанной с ишемией.
17. Способ приготовления фармацевтического препарата наружного применения, по любому из пп.1-15, включающий этапы:
a) получения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или их субпопуляции,
b) культивирования по меньшей мере в течение 1 часа клеток, полученных на этапе а), в физиологическом растворе, свободном от веществ, способствующих пролиферации РВМС и активирующих РВМС,
c) отделения надосадочной жидкости, полученной на этапе b), и
d) приготовления фармацевтического препарата с использованием надосадочной жидкости, полученной на этапе с).
a) получения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или их субпопуляции,
b) культивирования по меньшей мере в течение 1 часа клеток, полученных на этапе а), в физиологическом растворе, свободном от веществ, способствующих пролиферации РВМС и активирующих РВМС,
c) отделения надосадочной жидкости, полученной на этапе b), и
d) приготовления фармацевтического препарата с использованием надосадочной жидкости, полученной на этапе с).
18. Способ по п.17, характеризующийся тем, что клетки подвергают воздействию условий, вызывающих стресс, до или во время этапа b), причем упомянутые условия, вызывающие стресс, включают гипоксию, озон, нагрев, облучение, химикаты, осмотическое давление, сдвиг pH или их комбинацию.
19. Способ по п.17 или 18, характеризующийся тем, что клетки облучают до или в течение этапа b) дозой по меньшей мере 10 Гр, предпочтительно по меньшей мере 20 Гр, более предпочтительно по меньшей мере 40 Гр, озоном, повышенной температурой или УФ-облучением.
20. Препарат для лечения воспалительных кожных патологий, получаемый способом по любому из пп.17 или 18.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08450198.0 | 2008-12-18 | ||
| EP08450198A EP2198873A1 (en) | 2008-12-18 | 2008-12-18 | Pharmaceutical preparation comprising supernatant of blood mononuclear cell culture |
| PCT/EP2009/067534 WO2010079086A1 (en) | 2008-12-18 | 2009-12-18 | Pharmaceutical preparation comprising supernatant of blood mononuclear cell culture |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011129676A RU2011129676A (ru) | 2013-01-27 |
| RU2533253C2 true RU2533253C2 (ru) | 2014-11-20 |
Family
ID=40478351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011129676/15A RU2533253C2 (ru) | 2008-12-18 | 2009-12-18 | Фармацевтический препарат, включающий надосадочную жидкость культуры мононуклеарных клеток крови |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11235003B2 (ru) |
| EP (2) | EP2198873A1 (ru) |
| JP (1) | JP5869343B2 (ru) |
| CN (1) | CN102256608B (ru) |
| AU (1) | AU2009336668B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0922174A2 (ru) |
| CA (1) | CA2746862C (ru) |
| ES (1) | ES2429518T3 (ru) |
| NZ (1) | NZ593364A (ru) |
| PL (1) | PL2379085T3 (ru) |
| RU (1) | RU2533253C2 (ru) |
| WO (1) | WO2010079086A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201104349B (ru) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2010220132B2 (en) * | 2009-03-05 | 2013-10-10 | Macrocure, Ltd. | Activated leukocyte composition |
| JPWO2015046627A1 (ja) * | 2013-09-30 | 2017-03-09 | 国立大学法人九州大学 | 創傷治癒促進剤 |
| KR102215667B1 (ko) * | 2016-05-30 | 2021-02-16 | 주식회사 젬백스앤카엘 | 말초혈액 유래 단핵세포 및 혈소판 농축 혈장을 포함하는 피부재생 및 노화방지용 조성물 및 이를 이용한 피부 재생 방법 |
| TWI732787B (zh) * | 2016-10-04 | 2021-07-11 | 訊聯生物科技股份有限公司 | 經溫度調控刺激之多胜肽組成物的製備方法 |
| EP3305306A1 (en) * | 2016-10-04 | 2018-04-11 | Dr. Sarah Prinzessin von Isenburg | Compositions comprising adjustable concentrations of growth factors derived from blood serum and clot hypoxia-conditioned medium and methods of their production |
| CN106265738A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-01-04 | 上海鸣大生物科技有限公司 | 一种用于治疗病原体感染性皮肤病的外用药物及其制备方法和应用 |
| CN106344612A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-01-25 | 上海鸣大生物科技有限公司 | 一种用于治疗自身免疫性皮肤病的外用药物及其制备方法和应用 |
| CN106265737A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-01-04 | 上海鸣大生物科技有限公司 | 一种用于治疗皮肤附属器及瘙痒性皮肤病的外用药物及其制备方法和应用 |
| CN106389467A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-02-15 | 上海鸣大生物科技有限公司 | 一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物及其制备方法和应用 |
| CN106344613A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-01-25 | 上海鸣大生物科技有限公司 | 一种nk细胞原液在制备治疗皮肤病药物中的应用 |
| CN106491645A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-03-15 | 上海鸣大生物科技有限公司 | 一种用于治疗物理性皮肤病及动物性皮肤病的外用药物及其制备方法和应用 |
| KR102311057B1 (ko) * | 2017-12-14 | 2021-10-08 | (주)녹십자웰빙 | 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물 및 약학 조성물 |
| KR102014467B1 (ko) * | 2017-12-14 | 2019-08-26 | (주)녹십자웰빙 | 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물 및 약학 조성물 |
| CN108042567A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-05-18 | 广州金塞迩中西医结合医院有限公司 | 用于软骨修复的生物组合制剂及其应用 |
| EP3502692A1 (en) * | 2017-12-20 | 2019-06-26 | Aposcience AG | Potency assay for secretomes |
| KR102216710B1 (ko) * | 2019-03-27 | 2021-02-17 | 신지섭 | Nk세포배양배지용 첨가조성물, 상기 첨가조성물을 이용한 nk세포배양방법 및 상기 배양방법으로 얻어진 피부트러블개선용 화장료조성물 |
| EP3962493A2 (en) | 2019-05-03 | 2022-03-09 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor |
| EP3842064A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-30 | Aposcience AG | Composition for treating or preventing an allergy or allergic reaction |
| CN111334472A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-06-26 | 郑州鲲鹏健康科技有限公司 | Pbmc体外3d胶原蛋白水凝胶培养基及其制备方法 |
| CN111773249A (zh) * | 2020-07-31 | 2020-10-16 | 上海鸣大生物科技有限公司 | 一种组合物及其制备方法 |
| US20240058279A1 (en) | 2020-12-21 | 2024-02-22 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Use of cell turnover factors for increasing tissue regeneration |
| EP4074320A1 (en) | 2021-04-13 | 2022-10-19 | Aposcience AG | Treatment of skin scars |
| EP4197547A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-21 | Aposcience AG | Composition for treating or preventing vasculitis and diseases associated with vasculitis |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2295963C1 (ru) * | 2005-10-18 | 2007-03-27 | Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие "Тринита" | Способ получения иммуностимулятора |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6399372B1 (en) * | 1998-03-30 | 2002-06-04 | I.D.M. Immuno-Designed | Monocyte derived cells with immunostimulating properties, their preparation and uses |
| US6372494B1 (en) * | 1999-05-14 | 2002-04-16 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Methods of making conditioned cell culture medium compositions |
| EP1507543A4 (en) * | 2002-05-09 | 2006-07-26 | Cambridgemed Inc | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF WOOD WITH BLOOD PLASMA OR SERUM |
| US20070110737A1 (en) * | 2003-12-29 | 2007-05-17 | Allan Mishra | Compositions and method for decreasing the appearance of skin wrinkles |
| EP1737949B1 (en) * | 2004-03-09 | 2010-09-15 | Absorber AB | Endothelial progenitor cells and methods of use thereof |
| US20060004189A1 (en) * | 2004-07-02 | 2006-01-05 | James Gandy | Compositions for treating wounds and processes for their preparation |
| BRPI0613357A2 (pt) * | 2005-06-24 | 2017-02-21 | Agah Ramtin | peptídeo, segmento amino- e/ou carboxila truncado do peptídeo, sequência de nucleotídeos, vetor de expressão, célula hospedeira, proteína de fusão, preparação farmaceuticamente pura, composição, método para estabilização da placa aterosclerótica e redução da ocorrência de eventos de ruptura de placa, método de redução de inflamação e de deposição de lipídeo e aumento de deposição de colágeno e elastina dentro da lesão intima, método de ativação de tgf-b1 e/ou desativação de mmm-9 e método para a modulação da atividade de tgf-b1 e/ou mmm-9 |
| BRPI0709763A2 (pt) * | 2006-05-03 | 2011-10-04 | Therakos Inc | métodos de condicionamento de estresse e de monitoramento da eficácia de condicionamento, estojo para condução de um ensaio e microdisposição ou gene chip |
| WO2010038232A1 (en) * | 2008-10-05 | 2010-04-08 | Hymie Friedlander | Extract from conditioned medium cultured by regenerative cells |
| EP2201954A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-06-30 | Aposcience AG | Pharmaceutical preparation |
-
2008
- 2008-12-18 EP EP08450198A patent/EP2198873A1/en not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-12-18 EP EP09795769.0A patent/EP2379085B1/en active Active
- 2009-12-18 JP JP2011541477A patent/JP5869343B2/ja active Active
- 2009-12-18 PL PL09795769T patent/PL2379085T3/pl unknown
- 2009-12-18 NZ NZ593364A patent/NZ593364A/xx unknown
- 2009-12-18 WO PCT/EP2009/067534 patent/WO2010079086A1/en active Application Filing
- 2009-12-18 US US13/140,097 patent/US11235003B2/en active Active
- 2009-12-18 BR BRPI0922174A patent/BRPI0922174A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-12-18 CA CA2746862A patent/CA2746862C/en active Active
- 2009-12-18 AU AU2009336668A patent/AU2009336668B2/en active Active
- 2009-12-18 RU RU2011129676/15A patent/RU2533253C2/ru active
- 2009-12-18 ES ES09795769T patent/ES2429518T3/es active Active
- 2009-12-18 CN CN2009801513863A patent/CN102256608B/zh active Active
-
2011
- 2011-06-10 ZA ZA2011/04349A patent/ZA201104349B/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2295963C1 (ru) * | 2005-10-18 | 2007-03-27 | Закрытое акционерное общество Научно-производственное предприятие "Тринита" | Способ получения иммуностимулятора |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GERALD E. et.al. Keratinocyte growth regulation by the products of immune cells // J.exp.med., 1988, vol.168, pages 1395-1402. * |
| NEUBER K. et al. Cytokine-mediated effects of peripheral blood mononuclear cells from patients with atopic eczema on keratinocytes (HaCaT) in a new coculture system, The British jornal of dermatology, 1995, 133(5), p.750-760. OLSSON S. et al. Low concentrations of cytokines produced by allergen-stimulated peripheral blood mononuclear cells have potent effects on nasal polyp-derived fibroblasts, Clinical and experimental immunology, 2003, 132(2), p.254-260. ROSLONIEC EF JR. et al. Induction of T-cell proliferation and enhancement of NK activity by supernatants from Con A-stimulated human peripheral blood mononuclear cells: a new lymphokine, Cellular imunology, 1986, 99(1), p.170-181 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2198873A1 (en) | 2010-06-23 |
| ZA201104349B (en) | 2012-02-29 |
| US20120045418A1 (en) | 2012-02-23 |
| ES2429518T3 (es) | 2013-11-15 |
| AU2009336668B2 (en) | 2014-05-08 |
| WO2010079086A1 (en) | 2010-07-15 |
| PL2379085T3 (pl) | 2014-01-31 |
| CN102256608B (zh) | 2013-12-04 |
| CA2746862C (en) | 2017-08-29 |
| JP2012512842A (ja) | 2012-06-07 |
| JP5869343B2 (ja) | 2016-02-24 |
| BRPI0922174A2 (pt) | 2015-12-29 |
| EP2379085B1 (en) | 2013-07-10 |
| US11235003B2 (en) | 2022-02-01 |
| CA2746862A1 (en) | 2010-07-15 |
| EP2379085A1 (en) | 2011-10-26 |
| RU2011129676A (ru) | 2013-01-27 |
| CN102256608A (zh) | 2011-11-23 |
| AU2009336668A1 (en) | 2011-07-07 |
| NZ593364A (en) | 2012-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2533253C2 (ru) | Фармацевтический препарат, включающий надосадочную жидкость культуры мононуклеарных клеток крови | |
| Wang et al. | The initiation of oxidative stress and therapeutic strategies in wound healing | |
| Asai et al. | Topical simvastatin accelerates wound healing in diabetes by enhancing angiogenesis and lymphangiogenesis | |
| US20200254019A1 (en) | Pharmaceutical preparation | |
| Chen et al. | Ischemia postconditioning and mesenchymal stem cells engraftment synergistically attenuate ischemia reperfusion-induced lung injury in rats | |
| AU2017328913B2 (en) | Macrophage-based therapy for use in the treatment of liver injury | |
| Schaun et al. | Cell therapy in ischemic heart disease: interventions that modulate cardiac regeneration | |
| JP2013528230A (ja) | ノーオプション重症虚血肢（ｃｌｉ）を処置するための組成物および方法 | |
| Dolati et al. | Mesenchymal stem cell and bone marrow mononuclear cell therapy for cardiomyopathy: from bench to bedside | |
| US20220118020A1 (en) | Pharmaceutical preparation comprising supernatant of blood mononuclear cell culture and method of use | |
| WO2018200606A1 (en) | Enriched cellular compositions and therapeutic use | |
| TWI823085B (zh) | 嗜中性白血球活化調節劑 | |
| Sabetkam et al. | Impact of mummy substance on proliferation and migration of human Wharton's jelly-derived stem cells and fibroblasts in an in vitro culture system. | |
| Hassanpour et al. | Autophagy stimulation delayed biological aging and decreased cardiac differentiation in rabbit mesenchymal stem cells | |
| Han et al. | Mesenchymal stromal cells and alpha-1 antitrypsin have a strong synergy in modulating inflammation and its resolution | |
| US20160175364A1 (en) | Trophoblast derived microparticles for treating ischemic tissue and wounds | |
| Sareen | Immunogenicity of bone marrow derived allogeneic mesenchymal stem cells | |
| Shuster-Hyman | Biodistribution and Fate of Intravenously-Delivered First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells in a Murine Model of Systemic Inflammation | |
| EP3342856A1 (en) | Peripheral blood mononucleate cells formulations subjected to hypoxia | |
| Burckart | Insights into the mechanisms of wound repair and the role of TP508 in tissue regeneration | |
| Mäkelä | Bone marrow-derived stem cell therapy in acute myocardial infarction: an experimental porcine model | |
| Wijnmaalen | The role of endothelial progenitor cells in atherosclerosis |