TWI732787B - 經溫度調控刺激之多胜肽組成物的製備方法 - Google Patents

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本發明提供一種多胜肽組成物的製備方法，其包含以下步驟：(1)齊備類纖維母細胞且培養於培養基中；(2)以溫度調控刺激培養該類纖維母細胞並歷經一時間培養；以及(3)洗滌該步驟(2)的類纖維母細胞後，添加無血清培養基進行一時間培養，獲得一上清液，該上清液即含有多胜肽組成物。藉由本發明的製備方法所製備而得的多胜肽組成物能有效抑制發炎反應中周邊血淋巴細胞所分泌IFN-γ、TNF-α的含量，以及能抑制脂漏性皮膚炎引起之發炎反應。

Description

經溫度調控刺激之多胜肽組成物的製備方法
本發明係涉及一種多胜肽組成物的製備方法，特別是以溫度調控刺激培養類纖維母細胞，而獲得多胜肽組成物的方法。
血液中不同成分可用於醫學中不同領域加以使用。近代醫學中發現，當血液經離心後，即分離為上層血漿層、中層棕黃層(buffy coat)和下層紅血球層，而該黃濁層係由血小板、幹細胞和淋巴細胞所組成。
周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)係指白血球中所有是單核的細胞，主要包括淋巴球(lymphocyte)及單核球(monocytes)。其中淋巴球又可以再分成T細胞、B細胞及自然殺手細胞(natural killer cell, NK cell)等。其中單核球是人體免疫系統中的一種白血球，從骨髓與脾臟產生。單核球經過刺激後，會分化為巨噬細胞(macrophage)與樹突狀細胞(dendritic cell)；例如當有發炎反應的信息出現，單核球會聚集到受感染的組織，並分化出巨噬細胞和樹突狀細胞產生免疫反應。
目前對於發炎反應的治療，尤其是對於致病機轉較不明確的發炎反應如脂漏性皮膚炎、玫瑰斑與濕疹等，目前的處理方式只能採取施予類固醇藥物於產生發炎反應的皮膚，來控制症狀避免更為嚴重。然而長期使用下來仍有許多副作用，輕者皮膚變薄、傷口不易癒合，嚴重者可能對類固醇的劑量需求越來越高、甚至導致肝臟損害。
有鑑於此，如何發展出能有效抑制發炎反應，同時取得更為天然的組成物，現有技術實有待改善的必要。
為了克服現有技術之缺點，本發明的目的在於提供一種經溫度調控刺激之多胜肽組成物的製備方法，使多胜肽組成物成抑制發炎反應的症狀。
為達到上述之發明目的，本發明提供一種多胜肽組成物的製備方法，其包含以下步驟：(1) 齊備類纖維母細胞(fibroblast like cells)且培養於培養基中；(2) 以溫度調控刺激培養該類纖維母細胞並歷經一時間培養；以及(3) 洗滌該步驟(2)的類纖維母細胞後，添加無血清培養基進行一時間培養，獲得一上清液，該上清液即含有多胜肽組成物。
較佳的，所述之步驟(2)中溫度調控係以25ºC至45ºC刺激培養該類纖維母細胞。
更佳的，所述之步驟(2)係以39ºC至42ºC刺激培養該類纖維母細胞。
更佳的，所述之步驟(2)係以39ºC刺激培養該類纖維母細胞。
較佳的，所述之步驟(2)中，時間為2小時至96小時。
更佳的，所述之步驟(2)係以39ºC刺激培養該類纖維母細胞的時間為24小時。
較佳的，所述之步驟(3)中，培養的溫度為25ºC至45ºC。
更佳的，所述之步驟(3)中，培養的溫度為39ºC。
較佳的，所述之步驟(3)中，時間為8小時至288小時。
更佳的，所述之步驟(3)中，時間為72小時。
更佳的，所述之步驟(3)中，時間為72小時且培養的溫度為39ºC。
本發明所述之多胜肽組成物包含，但不限於抗發炎胜肽、促發炎胜肽、免疫調節胜肽及生長因子。
本發明所述之「抗發炎胜肽」包含，但不限於介白質4 (interleukin 4, IL-4)、IL-6、IL-10及血管生成素(angiogenin, ANG)。
本發明所述之「促發炎胜肽」包含，但不限於干擾素-γ (interferon gamma, IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor alpha, TNF-α) 及顆粒狀細胞-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)。
本發明所述之「免疫調節胜肽」並未直接參與抗發炎反應或促發炎反應，而是以間接方式調控免疫，例如：ICAM-1與T細胞的活化有關。免疫調節胜肽包含，但不限於細胞間附著分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、IL-12p70及肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)。
本發明所述之「生長因子」包含，但不限於鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)以及纖維母細胞生長因子-7 (fibroblast growth factor-7, FGF-7)。
本發明的優點在於本發明之製備方法，藉由經溫度調控刺激培養類纖維母細胞所獲得的多胜肽組成物，能有效抑制發炎反應中周邊血淋巴細胞所分泌IFN-γ、TNF-α的含量；同時亦能抑制脂漏性皮膚炎所引起之發炎反應。
以下配合圖式及本發明之較佳實施例，進一步闡述本發明為達成目的所採取的技術手段。
製備例1 製備周邊血淋巴細胞混合液
(1) 含抗凝劑之人類全血以400轉(g)離心5分鐘，取出中間含單核的細胞(mononuclear cell)之棕黃層(buffy coat)。
(2) 將同體積之磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline, PBS)加入棕黃層混合均勻成為細胞液。
(3) 取1.5倍細胞液體積的Ficoll-paque (購自GE Healthcare Life Sciences, Ficoll-Paque PLUS, 17-1440-02)至乾淨的離心管內。將細胞液緩慢加到Ficoll-paque的界面上，不可破壞界面，並進行以400 g離心35分鐘。
(4) 移除上清液，取中間單核的細胞至新離心管內，並以取得單核細胞體積之三倍量的PBS進行清洗，再以200 g離心10分鐘，以上清洗步驟重複兩次。
(5) 移除上清液後留下沉澱的單核的細胞，並加入10毫升(mL)含體積百分比10%胎牛血清之洛斯維派克紀念研究所-1640 (Roswell park memorial institute, RPMI-1640)培養基回溶。
(6) 將回溶後的單核的細胞懸浮液加入10公分細胞培養盤，靜置於37°C、5%二氧化碳(CO2 )中1小時後，取出未貼附的單核的細胞(主要為混合的淋巴球)，以200 g離心10分鐘。
(7) 移除上清液，加入含體積百分比10%胎牛血清及體積百分比1%青黴素-鏈黴素-兩性黴素B溶液(penicillin-streptomycin-amphotericin B, PSA)之RPMI-1640培養基回溶沉澱的單核的細胞，得到周邊血淋巴細胞混合液，並以剛果藍(trypan blue)計數細胞數。
製備例2 製備多胜肽組成物
(1) 於10平方公分培養盤中種植2×105 至5×105 的類纖維母細胞，待細胞生長至80%滿度時，以PBS清洗2次。
(2) 此處分為兩組，分別為A組及B組：
A組：將10 mL含體積百分比1% PSA之RPMI-1640添加至類纖維母細胞，並於37°C、5% CO2 培養箱中培養24小時；
B組：將10 mL含1% PSA之RPMI-1640添加至類纖維母細胞，並於39°C、5% CO2 培養箱中培養24小時；
(3) 以上兩組分別以PBS清洗2次後，添加8 mL含1% PSA之RPMI-1640。A組於37°C、5% CO2 培養箱中培養8小時至288小時，較佳為72小時；B組則同樣於39°C、5% CO2 培養箱中培養8小時至288小時，較佳為24小時。
(4) 以上兩組分別收集上清液放入15 mL離心管中，以400 g離心10分鐘。
(5) 以上兩組分別收集上清液放入15 mL離心管中，其中各上清液即含有多胜肽組成物，可於-80°C中保存。
實施例1 分析不同條件下多胜肽組成物的含量
將製備例2中A組及B組的上清液進行分析，如圖1所示，A組及B組皆可分析出抗發炎反應胜肽IL-4、IL-6、IL-10以及ANG，並以無給予任何刺激的A組經由半定量方式作為相對含量的基準。相較於A組的IL-4含量，B組IL-4含量增加64%；相較於A組的IL-6含量，B組的IL-6含量增加26%；相較於A組的IL-10含量，B組的IL-10含量增加13%；相較於A組的ANG含量，B組的ANG含量減少4%。因此以39ºC處理的B組，能夠收集到最多的抗發炎反應胜肽IL-4、IL-6以及IL-10。
請參閱圖2所示，A組及B組皆可分析出促發炎反應胜肽IL-1β、IL-16、IFN-γ、TNF-α以及GM-CSF，並以無給予任何刺激的A組經由半定量方式作為相對含量的基準。相較於A組的IL-1β含量，B組的IL-1β增加54%；相較於A組的IL-16含量，B組的IL-16增加77%；相較於A組的IFN-γ含量，B組的IFN-γ含量增加48%；相較於A組的TNF-α含量，B組的TNF-α增加21%；相較於A組的GM-CSF含量，B組的GM-CSF減少4%。因此以39ºC處理的B組，能夠收集到最多的促發炎反應胜肽IL-1β、IL-16、IFN-γ、以及TNF-α。
請參閱圖3所示，A組及B組皆可分析出免疫調節胜肽ICAM-1、IL-12p70以及HGF，並以無給予任何刺激的A組經由半定量方式作為相對含量的基準。相較於A組的ICAM-1含量，B組的ICAM-1增加27%；相較於A組的IL-12p70含量，B組的IL-12p70增加74%；相較於A組的HGF含量，B組的HGF減少6%。因此以39ºC處理的B組，能夠收集到最多的免疫調節胜肽ICAM-1以及IL-12p70。
請參閱圖4所示，A組及B組皆可分析出生長因子bFGF及FGF-7，並以無給予任何刺激的A組經由半定量方式作為相對含量的基準。相較於A組的bFGF含量，B組的bFGF增加54%；相較於A組的FGF-7含量，B組的FGF-7增加20%。因此以39ºC處理的B組，能夠收集到最多的生長因子bFGF及FGF-7。 表1、各組多胜肽組成物含量
Figure 105132008-A0304-0001
如上表1所示，各組的多胜肽組成物皆含有14種，且各組多胜肽組成物的含量大多有所不同。其中A組GM-CSF的含量些微多於B組GM-CSF的含量，經四捨五入後皆為0.8 ng/mL。
實施例2 周邊血淋巴細胞模擬發炎反應下施予多胜肽組成物
(1) 配製以下三組測試條件，並分別添加1 mL至24孔培養盤中，每測試條件二重覆：
控制組：取自製備例1步驟(7)所獲得之周邊血淋巴細胞混合液(其內具有培養基RPMI-1640、10%胎牛血清、1% PSA以及2×105 cells/mL周邊血淋巴細胞)，並添加5 mg/L 植物血球凝集素；
第1組：取製備例2中步驟(5)的A組上清液(含有多胜肽組成物)，並依序添加使其含有10%胎牛血清、2×105 cells/mL周邊血淋巴細胞混合液(取自製備例1步驟7)以及5 mg/L 植物血球凝集素；
第2組：取製備例2中步驟(5)的B組上清液(含有多胜肽組成物)，並依序添加使其含有10%胎牛血清、2×105 cells/mL周邊血淋巴細胞混合液(取自製備例1步驟7)以及5 mg/L 植物血球凝集素。
(2) 將24孔培養盤置入37°C、5% CO2 培養箱中培養，並於72小時後收集上清液。
(3) 步驟(2)的上清液以每孔100微升(μL/well)加入免疫酵素測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)的96孔反應盤中，並添加IFN-γ或及TNF-α抗體於4°C中反應作用一晚(overnight)。
(4) 以300 μL/well緩衝液清洗反應孔4次後，在ELISA的96孔反應盤中加入100 μL/well的生物素化抗體(biotinylated antibody)，並室溫反應作用1小時。
(5) 以300 μL/well緩衝液清洗反應孔4次後，在ELISA的96孔反應盤中加入100 μL/well的鏈抗生物素蛋白溶液(streptavidin solution)，並室溫反應作用45分鐘。
(6) 在ELISA的96孔反應盤中加入100 μL/well的酶作用物試劑[TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) one-step substrate reagent]，室溫中避光反應作用30分鐘。
(7) 在ELISA的96孔反應盤中加入50 μL/well的中止試劑(stop solution)。
(8) 以機器分析偵測450奈米(nm)波長的吸光值，並計算分析步驟(2)中各組上清液IFN-γ以及TNF-α的濃度。
請參閱圖5所示，控制組上清液中IFN-γ的含量高達1335 pg/mL，顯示經過植物血球凝集素刺激之後模擬出發炎反應；然而無論是第1組或第2組，各組上清液中IFN-γ的含量分別下降至267 pg/mL及166 pg/mL，其中又以第2組抑制IFN-γ效果最好。因此，經39ºC刺激人類類纖維母細胞所獲得的多胜肽組成物能有效抑制發炎反應中周邊血淋巴細胞所分泌IFN-γ的含量。
請參閱圖6所示，控制組上清液中TNF-α的含量高達1891 pg/mL，顯示經過植物血球凝集素刺激之後模擬出發炎反應；然而無論是第1組或第2組，各組上清液中TNF-α的含量分別下降至877 pg/mL及709 pg/mL，其中又以第2組為所能抑制TNF-α含量最多的組別。因此，經39ºC刺激人類類纖維母細胞所獲得的多胜肽組成物能有效抑制發炎反應中周邊血淋巴細胞所分泌TNF-α的含量。
實施例3 脂漏性皮膚炎測試
取製備例2步驟(5) B組含有多胜肽組成物的上清液，每天以塗抹方式使用一次，一次1 mL，共使用2個月。
請參閱圖7及圖8所示，圖7為使用前患者額頭鄰接髮際線之處，有大片的紅腫發炎，為脂漏性皮膚炎典型的症狀之一；經過施予製備例2步驟(5) B組含有多胜肽組成物的上清液2個月後，如圖8所示，原本紅腫發炎處顯著縮小範圍，除呈現較淺的紅色外，原本因發炎而腫起的厚度也變薄。因此，本發明B組之多胜肽組成物有助於抑制脂漏性皮膚炎之發炎反應的症狀。
根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。
無
圖1為本發明之各組多胜肽組成物之IL-4、IL-6、IL-10及ANG相對含量之柱狀圖。 圖2為本發明之各組多胜肽組成物之IL-1β、IL-16、IFN-γ、TNF-α及GM-CSF相對含量之柱狀圖。 圖3為本發明之各組多胜肽組成物之ICAM-1、IL-12p70及HGF相對含量之柱狀圖。 圖4為本發明之各組多胜肽組成物之bFGF及FGF-7相對含量之柱狀圖。 圖5為本發明之控制組、第1組及第2組之周邊血淋巴細胞之IFN-γ含量之柱狀圖；皮克/毫升(pg/mL)。 圖6為本發明之控制組、第1組及第2組之周邊血淋巴細胞之TNF-α含量之柱狀圖；皮克/毫升(pg/mL)。 圖7為本發明之多胜肽組成物使用前，脂漏性皮膚炎患者額頭鄰接髮際線之處的照片。 圖8為本發明製備例2步驟(5) B組之多胜肽組成物使用2個月後，脂漏性皮膚炎患者額頭鄰接髮際線之處的照片。
無

Claims (5)

  1. 一種多胜肽組成物的製備方法，其包含以下步驟：(1)齊備類纖維母細胞且培養於培養基中；(2)以25℃至45℃的溫度調控刺激培養該類纖維母細胞並歷經2小時至96小時培養；以及，(3)洗滌該步驟(2)的類纖維母細胞後，添加無血清培養基進行培養，培養溫度為25℃至45℃，培養時間為8小時至288小時，獲得一上清液，該上清液即含有多胜肽組成物；其中步驟(2)、(3)的溫度不為37℃。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該步驟(2)係以39℃至42℃刺激培養該類纖維母細胞。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該步驟(2)係以39℃刺激培養該類纖維母細胞。
  4. 如請求項1所述之方法，其中該步驟(2)係以39℃刺激培養該類纖維母細胞的時間為24小時。
  5. 如請求項1所述之方法，其中該步驟(3)中，該培養時間為72小時且該培養溫度為39℃。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102256608A (zh) * 2008-12-18 2011-11-23 阿波科学有限公司 含有血单核细胞培养物的上清液的药物制剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102256608A (zh) * 2008-12-18 2011-11-23 阿波科学有限公司 含有血单核细胞培养物的上清液的药物制剂

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hanna Bessler and Meir Djaldetti, "High Temperature Affects Cytokine Release by Human Peripheral Blood Mononuclear Cells", Int J Immunol Immunother.2015 May; 2:2.
KAREN D. FAIRCHILD et al., "Effects of Hypothermia and Hyperthermia on Cytokine Production by Cultured Human Mononuclear Phagocytes from Adults and Newborns", J Interferon Cytokine Res. 2000 Dec;20(12):1049-55.
KAREN D. FAIRCHILD et al., "Effects of Hypothermia and Hyperthermia on Cytokine Production by Cultured Human Mononuclear Phagocytes from Adults and Newborns", J Interferon Cytokine Res. 2000 Dec;20(12):1049-55. Stefan Russwurm et al., "Direct influence of mild hypothermia on cytokine expression and release in cultures of human peripheral blood mononuclear cells", J Interferon Cytokine Res. 2002 Feb;22(2):215-21. Hanna Bessler and Meir Djaldetti, "High Temperature Affects Cytokine Release by Human Peripheral Blood Mononuclear Cells", Int J Immunol Immunother.2015 May; 2:2. *
Stefan Russwurm et al., "Direct influence of mild hypothermia on cytokine expression and release in cultures of human peripheral blood mononuclear cells", J Interferon Cytokine Res. 2002 Feb;22(2):215-21.

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