KR20140148284A - 중간엽 줄기세포 처리방법 및 산화적 스트레스 관련 질병 치료에의 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 주로 두 단계, 첫번째로 중간엽 줄기세포의 획득 및 분리, 두번째로 산화제를 가지는 조건 또는 치료 배지에서 세포의 성장 및 특이 치료 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포, 바람직하기는 지방 근원의 치료방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의하여 직접적으로 얻어진 세포 및 산화적 스트레스에 의해 야기되거나 관련되는 질환을 치료하는데 상기 세포의 사용을 포함한다.
Description
본 발명은 중간엽 줄기세포를 위한 치료방법, 이 방법을 통해서 직접적으로 얻어지는 세포 및 산화적 스트레스에 의해 일어나거나 관련된 질병의 치료에의 용도에 관한 것이다.
줄기세포의 잠재력은 정의된 세포 유형을 구분하고 해당 조직 및 장기로 통합시키기 위한 그들의 능력에 의존한다. 줄기세포의 또 다른 유익한 특징은 사이토카인, 인터루킨, 영양 (throphic) 인자 및 성자 인자의 파라크린 방출이다.
현재 연구 및 임상 시험은 대부분의 병리학에서 줄기세포의 치료 효과를 증명하기 위해 고안되었고, 줄기세포-기반 요법에 대한 요구가 증가하고 있다.
호흡기, 심혈관계, 면역계, 내분비계/기능, 중추 및 말초 신경계, 척수외상, 허혈/재관류 손상 및 탈수 질환의 특정한 퇴행성 질환은 산화적 스트레스로 명명되는 활성 산소종 (ROS)에 의해 매개되는 염증성 성분을 가진다.
활성 산소 종, 주로 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 (O2 -) 및 그의 불변화 산물인 H2O2는 호흡 연쇄가 가담하는 세포의 미토콘드리아의 자연 폐기물 부산물이고, 에너지 분자 (ATP)생성에 대한 그의 기능으로 인해 세포 수명을 위해 필요한 현상이다.
미토콘드리아는 말단 전자 수용체로서 O2로의 전자 이동의 90% 이상을 차지하는 포유동물 세포의 대부분의 산화환원-활성 구획 (compartment)이다. 뚜렷한 전자 방출은 ATP를 생성시키기 위해 다양한 대사 기질 (예를 들어, 피루빈산염, 지방산)의 산화로부터 이용가능한 위치 에너지를 사용하는 중추 산화환원 회로 (circuit)를 통해 발생한다. 본 방법의 조절은 비-필수 아미노산의 공급의 관점에서 적절한 항상성을 유지하고, 과잉 아미노산을 제거하고, 글루코오스를 공급하고 에너지 전구체를 상호변환하여 다양한 및 간헐적 식품 섭취의 면에서 장기간의 에너지 공급을 허용하도록 하는 동시에 세포는 ATP를 생성해야 하기 때문에 세포 기능에 중요하다. 조절의 일부는 ROS 생성 및 분자 센서의 지속적인 낮은 비율을 통해 발생하는 것으로 보인다. 정의된 것은 적지만 조절에 대한 관련된 산화환원 회로는 전문적인 산화환원 환경을 필요로 하는 것으로 알려져 있다.
과잉 산화적 스트레스 하에서, 미토콘드리아 ATP-생성 잠재성의 자극성 출동 및 전자 전이 연쇄에 의한 ROS 생성에서의 일시적 증가는 시토졸로 ROS의 미토콘드리아 방출을 일으킬 수 있다. 이것은 인접한 미토콘드리아에서 "ROS-유도 ROS 방출"을 유발할 수 있다. 따라서 낮은 비율의 ROS 생성이 미토콘드리아에서 정상적인 방법일지라도 과잉 ROS 생성과의 전자 흐름의 방해는 노화, 세포소멸 및 세포 사멸을 일으킬 수 있다. Go and Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273-1290); Zorov , Juhaszova and Sollott. 2006. Mitochondria ROS-induced ROS release: an update and review. Biochim Biophys Acta 1757 (509-517).
분명히 이들 방법은 파키슨병, 프리드라이히 운동실조, 헌팅턴 질환 및 당뇨병 등의 미토콘드리아 산화적 스트레스-관련 질병과 직접적으로 관련이 있다. Go and Jones, 2008. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1273-1290); Dringen, Gutterer and Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain. Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916); Chinta and Andersen, 2008. Redox imbalance in Parkinson's disease. Biochimica et Biophysica Acta 1780 (1362-1367); Cohen, 2000. Oxidative stress, mitochondrial respiration, and Parkinson's disease. Ann N Y Acad Sci 899 (112-120); Lodi, Tonon, Calabrese and Schapira, 2006. Friedreich's ataxia: from disease mechanisms to therapeutic interventions. Antioxid Redox Signal 8 (438-443); McGill and Beal, 2006. PGC-1alpha, a new therapeutic target in Huntington's disease? Cell 127 (465-468); Donath, Ehses, Maedler, Schumann, Ellingsgaard, Eppler and Reinecke, 2005. Mechanisms of beta-cell death in type 2 diabetes. Diabetes 54 (Suppl 2) (S108-S113).
과산화수소 (H2O2)를 포함하는 퍼옥사이드은 산화성 스트레스를 발생시키는 주요 활성 산소종 (ROS)중 하나이다. H2O2는 (수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소, 글루코오스 산화효소, 및 모노아민 산화효소를 포함하는) 수개의 효소에 의해 지속적으로 생성되고 그리고 저하시켜 산화성 손상을 방지해야 한다. H2O2의 세포독성 효과는 DNA, 단백질 및 막 지질에 대한 추후 손상을 야기시키면서 철 촉매화된 반응으로부터 발생되는 히드록실 라디칼에 의해 야기되는 것으로 사료된다. H2O2는 고농도 (>100 μM)에서 "사멸 기질"로서 작용을 하여 카탈라아제 (catalase)의 비가역적인 불활성을 일으킨다. Hyslop, Zhang, Pearson y Phebus, 1995. 레트 (rat)에서 전체적 전뇌 허혈 및 재관류를 따르는 미소투석법에 의한 선조 H202의 측정: 인 비트로 (in vitro) H2O2의 세포독성과의 가능성 있는 관계. Brain Res 671 (181-186). H2O2는 H2O2가 세포에 진입하고 따라서 세포로부터 하나 이상의 독성 경로를 움직임에 따라 설정할 수 있는 것을 제안하면서 세포내 글루타티온 소모, 세포에서 H2O2를 제거시키는 분자를 야기시킨다. Dringen, Pawlowski and Hirrlinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Halliwell and Whiteman, 2004. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? British Journal of Pharmacology 142 (231-255); Baud, Greene, Li, Wang, Volpe and Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531-1540).
또한 세포는 항산화 분자를 합성하고 그들을 순환시키는 메커니즘을 가진다. 글루타티온 (GSH)은 그의 산화된 형태인 GSSG 및 관련된 효소 글루타티온 과산화효소 (GPx), 글루타티온 환원효소 (GR), 글루타레독신 및 NADPH/NADP+와 함께 H2O2를 제거시키는 항산화 구조 (machinery)에 관여하는 주요 단백질 중의 하나이다. 세포 배양 모델을 이용한 다양한 연구는 적절한 세포사멸에서 보호 효과로서 미토콘드리아에서 GSH에 의해 중요한 역할을 한다는 것을 지지한다. 세포소멸에서, 미토콘드리아 GSH/GSSG의 예상 세포사멸, 산화는 미토콘드리아 ROS 생성을 조절에 있어서 GSH에 대한 역할을 나타내면서 증가된 ROS을 일으키는 GSH 고갈을 자극시킨다. Dringen, Pawlowski and Hirrlinger, 2005. Peroxide Detoxification by Brain Cells. J Neurosci Res 79(157-165); Dringen, Gutterer and Hirrlinger, 2000. Glutathione metabolism in brain. Metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem 267 (4912-4916).
과산화수소를 제거시키는 산화방지제 구조에서 또 다른 효소는 카탈라아제이다. 카탈라아제는 고농도의 H2O2의 세정이 필요한 경우 특별한 관련성이 있는 세포질 효소이다. Baud, Greene, Li, Wang, Volpe y Rosenberg, 2004. Glutathione Peroxidase-Catalase Cooperativity Is Required for Resistance to Hydrogen Peroxide by Mature Rat Oligodendrocytes. J Neurosci 24(1531-1540).
또한 hMSC가 활성종을 해독시키고 ROS의 효과적 관리를 보장하는 단백질 유전 정보 및 게놈의 산화 손상을 해결하기 위해 주요 효소 및 비-효소 메커니즘을 가진다는 것을 증명하였다. Valle-Prieto and Conget, 2010. 인간 중간엽 줄기세포는 산화적 스트레스를 효과적으로 관리한다. Stem Cell Dev 19 (1885-1893). 인 비보 (in vivo)에서 이 가능성이 유지되는 경우, hMCS는 또한 ROS-유도 조직손상을 제한하는 조직 재생산에 기여할 수 있다.
ROS의 제거에 관여하는 효소의 합성을 변형하기 위한 몇가지 성공적인 시도는 아스코르브산염의 존재하에 배양된 인간 골수 기질 세포가 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소, 카탈라아제 및 글루타티온의 높은 수준을 발현시킨다는 것을 나타낸다 (Stolzing and Scutt, 2006. Effect of reduced culture temperature on antioxidant defenses of mesenchymal stem cells. Free Radic Biol Med 41(326-338). 또한, in the article, Ebert, Ulmer, Zeck, Meissner-Weigl, Schneider, Stopper, Schupp, Kassem and Jacob, 2006. 셀레늄 보충은 산화방지제 능력을 저장시키고 인 비트로 골수 기질 세포에서 세포 손상을 방지한다. 줄기세포 24(1226-1235)의 저자는 세포 배양 조건을 셀레늄 보충 또는 온도 감소로 변형시켜 BMMSC의 기본 산화방지제 능력의 상항-조절을 기재한다. Stolzing 및 Scutt (2006)는 이들 BMMSC의 온도 감소가 그들의 생종능력에 영향을 미치지 않지만 그들의 분화를 증가시킨다는 것을 공개하였다. 한편 HC016으로 지칭되는 세포인, 본 발명의 치료방법을 통해 직접적으로 얻어지는 줄기세포는 그들의 분화되지 않은 표현형, 및 또한 그들의 생존능력을 유지하면서 분화의 어떠한 증거도 나타내지 않는다.
또한, 2006년 Ebert 등은 100 nM 소듐 셀레나이트를 가지는 BMMSC의 배양 배지의 셀레늄 보충이 글루타티온 과산화효소 (GPx) 및 la 티오레독신 환원효소 (TrxRs)로서 세포내 셀레늄-의존 효소의 활성을 독점적으로 증가시킨 다는 것을 나타낸다. 한편 HC016 세포는 그들의 생존능력, 유익한 능력 및 분화되지 않은 표현형, 및 또한 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 (SODs) 및 카탈라아제 (Cat), ROS 해독에 대한 근본 등의 ROS 해독에 대한 중요한 셀레늄-비의존적 효소를 코딩하는 활성 유전자를 유지한다.
결론적으로, 본 발명에 기재된 치료방법을 사용해 직접적으로 얻어지는 HC016 세포는 최근에 사용되는 줄기세포에 관한 일련의 이점을 나타내고, 산화적 스트레스 상태에서 작용하도록 특별히 맞춰진 HC016 세포가 되게 한다. 이들 이점은 주로 1) 해독 분자 GSH의 우수한 세포내 풀 (pool)의 생성, 2) 활성 산소종 제거에 관여하는 효소를 코딩시키는 유전자의 우수하고 증가된 발현, 3) 새로운 세포골격 형태 및 따라서 결과적으로 손상된 영역에 대한 높은 이동능력, 및 4) 조직 재생산 방법에 관련된 성자 인자의 높은 발현이다.
HC016 세포에 의해 획득한 이들 효과는 그들의 생존능력 및 분화 상태에 관하여 어느 변형을 발생시키지 않고 ROS에 대한 그들의 세포내 및 세포외 방어를 증가시킨다.
WO 2010/150094는 지방세포로의 인 비트로 중간엽 줄기세포의 분화방법 및 세포 치료로서의 그의 용도를 기재한다. 기재된 본 방법은 저산소 상태에서 이들 세포를 배양시키는 것으로 이루어진다.
WO2007/030870은 줄기세포 분화 방법을 제공하고, 더욱 정확하게는 세포는 무혈청 배지에서 hES 세포를 배양시켜 심근 및 신경 전구로 인간 배아 (hES 세포)의 세포이고, 프로스타글란딘 또는 분자를 억제시키는 p38MAP 키나아제를 추가적으로 함유한다.
결과적으로, 활성 산소종의 제거에 초점을 맞춘 향상되거나 증가된 그들의 효소적 및 비-효소적 메커니즘을 사용해 중간엽 줄기세포를 획득하는 방법을 생성하고, 결과적으로 질병과 관련된 산화적 스트레스를 위한 세포 치료에서 더욱 효과적으로 사용될 수 있는 세포를 생성시키는 최신의 중요한 수요가 있다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 치료방법 및, 또한 산화적 스트레스에 의해 야기되거나 관련된 질환의 치료에 사전에 치료된 이들 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 줄기세포는 많은 것들 중에서 지방 조직, 골수, 탯줄 및/또는 태반의 서로 다른 소스로부터 얻을 수 있지만 바람직하기는, 본 발명은 인간 지방 조직-유래된 중간엽 줄기세포, ASC로부터 발생된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 질병은 활성 산소종에 의해 매개되는 성분으로 인해 산화적 스트레스, 또는 퇴행성 스트레스의 조건과 관련되고 그에 의해 야기된다고 사료되는 질환은: 관절주위염, 진성 당뇨병, 만성 육아종성, 동맥경화증, 섬유증 (만성 폐쇄성 폐질환, COPD, 특발성 폐섬유증), 허혈/재관류 증후군, 알츠하이머병, 파키슨병, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 염증성 장 질병: 궤양성 대장염 및 크론병, 성인 호흡 곤란 증후군, 뇌졸중, 척수외상, 말초 신경 손상, 근위축성 측색 경화증, 헌팅턴 질환, 다발성 경화증, 프리드라이히 운동실조, 치주염, 점막 질환, 염증성 성분, 급성 및 만성 궤양 및 상처로 공존하는 질환 및 부상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환이다.
이들 병리에 존재하는 산화 환경은 손상된 영역에서 염증성 방법의 유지 및 심지어 강화를 유발한다. 이 현상은 조직 재생산을 손상시키는 요소 중의 하나이고, 이것은 생산된 ROS의 많은 양으로 인해 회복될 수 없다. 본 발명의 방법으로 치료되는 중간엽 줄기세포는 상기 기재된 병리학에서 제조되는 산화 환경에서 높은 생존 능력을 획득한다. 이 사실은 손상된 조직의 회복을 촉진시키는 생세포로부터 가용성 인자 이용가능성의 증가를 일으킨다.
그러므로 본 발명의 하나의 양태는 인간 공여체 (donor)부터 중간엽 줄기세포의 획득 및 분리와 정의한 치료배지에서 이들 세포의 배양을 포함하는 중간엽 줄기세포의 치료방법이다.
본 발명의 우선적인 양태는 지방 조직으로부터 획득한 중간엽 줄기세포에 대한 이전의 치료방법의 적용이다.
또한 본 발명의 하나의 양태는 중간엽 줄기세포의 생존을 촉진시키는 활성 산소종의 해독이 포함된 생성 분자의 생성능력을 증가시키기 위한 중간엽 줄기세포의 기능적 변형을 위한 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 전치료방법으로 비-치료된 중간엽 줄기세포와 비교할 때 활성 산소종의 해독에 포함된 유전자의 우수하고 증가된 발현, 및/또는 GSH의 우수한 세포내 수준 및/또는 세포구조 배열 변화 및/또는 세포 이동 능력에서의 증가를 가지는 본 발명의 치료방법으로 획득된 중간엽 줄기세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 산화적 스트레스에 의해 야기되거나 관련된 질병의 관리를 위한 세포 치료에서 치료적 제제/시약으로서 GSH의 우수한 세포내 수준, 더욱 바람직하기는 SOD1 세포질 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소, SOD2 미토콘드리아 수퍼옥사이드 불균등효소 2, SOD3 세포외 수퍼옥사이드 불균등효소 3, Cat 카탈라아제, GPx 글루타티온 과산화효소 y GR 글루타티온 환원효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 활성 산소종의 제거에 포함된 유전자의 우수하고 증가된 발현, 더욱 바람직하기는 다른 세포골격 형태 및 베타-액틴을 코딩시키는 유전자의 우수한 발현, 그리고 또한 성장 인자 IGF-1를 가지는 본 발명에 따른 치료된 중간엽 줄기세포의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 손상된 조직에 근접한 영역, 및/또는 병변의 진원지에 투여되는 본 발명의 중간엽 세포의 용도에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 발명 (B)으로 치료되고 산화환경(100 μM)으로 스트레스받은 ASC, HC016 (A), HOG의 MTT 방법에 의해 측정된 증식 능력을 나타낸 도표이다. HC016 세포가 산화 환경에서 스트레스를 받을 경우 세포 증식에서 상당히 증가한다는 것을 관찰할 수 있다. 이 효과는 동일한 치료가 HOG 세포와 같은 다른 포유류 세포 유형에 적용될 경우 발생하지 않는다. 별표는 t-student test에서 p<0.05을 나타낸다 (실시예 3).
도 2는 본 발명의 방법으로 치료된 ASC, HC016, HOG 및 HOG에서 활성 산소종의 세포내 수준의 동력학적 분석 도표이다. 본 분석은 주로 고농도의 산화적 스트레스에 노출된 경우 HC016 세포만이 세포내 ROS 수준을 상당히 감소시킨다는 것을 보여주고 있다. 별표는 두가지-방법 ANOVA 시험 (*, P<0.05; **, P<0.01)에 따른 상당한 통계학적 차이를 나타낸다 (실시예 4).
도 3은 ASC 및 HC016 세포에서 총 글루타티온 (GSHtotal)의 세포내 수준 도표이다. 대조 조건에서 비-스트레스에서, 치료는 ASC에 대하여 HC016 기저 GSH 수준에서 10% 증가를 유발한다.
도 4A는 ASC 및 HC016 세포에서 활성 산소종의 해독에 포함된 유전자의 발현 수준 도표이다 (실시예 6).
도 4B는 ASC 및 HC016 세포에서 활성 산소종 (SOD1, SOD2, SOD3, Cat, GR, GPx)의 해독에 관여하는 유전자 발현의 정량 도표이다. 값들은 HC016/ASC 비율로 표시하였다 (실시예 6).
도 5A는 ASC 및 HC016 세포에서 세포골격 조성물 (ß-액틴)에 관여하는 유전자 발현 수준 도표이다 (실시예 7).
도 5B는 ASC 및 HC016 세포에서 세포골격 조성물 (ß-액틴)에 관여하는 유전자 발현의 정량 도표이다 (실시예 7). 값들은 비율 HC016/ASC의 비율로 표시하였다 (실시예 7).
도 5C는 ASC 및 HC016 세포에서 성장 인자 IGF-I를 위한 유전자 코딩의 발현 수준 도표이다(실시예 7).
도 5D는 ASC 및 HC016 세포에서 성장 인자 IGF-I을 위한 유전자 코딩의 발현 정량 도표이다 (실시예 7). 값들은 HC016/ASC 비율로 나타낸다 (실시예 7).
도 6은 F-액틴 면역염색법의 형광 현미경 검사 이미지이다. ASC와 관련하여 HC016 세포에서 F-액틴의 존재의 증가, 및 스트레스 섬유의 그의 분포가 관찰될 수 있고, 이것은 그들의 우수한 이동 및 화학주성 능력과 관련된 HC016의 세포골격 형태적 변화를 의미한다 (실시예 8).
도 7은 산화적 스트레스 주입 후의 신경 계통 HOG 세포 성장율 및 이 성장율에 대한 ASC 및 HC016 적용 효과이다. ASC 및 HC016과 함께 산화 환경으로 스트레스되는 HC016 세포의 공-배양은 HOG 세포 생존을 증가시킨다. 그럼에도 불구하고 HC016와의 공-배양만이 HOG 세포의 산화 환경으로의 노출 후 48시간에 보호효과를 지속시킨다. 별표는 t-student test (p<0.05)에 따른 상당한 통계학적 차이를 나타낸다 (실시예 9).
도 8은 ASC 세포에 관하여 산화적 스트레스 주입으로 고통받는 세포에 대하여 HC016 세포의 상당히 우수한 이동 능력을 나타내는 대표 이미지 몇 정량 막대 그래프이다 (실시예 10).
도 9는 ASC로 치료되고 그리고 HC016으로 치료되는 비-치료 레트로 이루어진 척수외상을 가지는 레트의 3가지 실험군의 BBC 점수 (Basso-Beattie-Bresnahen)의 진전 표이다 (실시예 12).
도 2는 본 발명의 방법으로 치료된 ASC, HC016, HOG 및 HOG에서 활성 산소종의 세포내 수준의 동력학적 분석 도표이다. 본 분석은 주로 고농도의 산화적 스트레스에 노출된 경우 HC016 세포만이 세포내 ROS 수준을 상당히 감소시킨다는 것을 보여주고 있다. 별표는 두가지-방법 ANOVA 시험 (*, P<0.05; **, P<0.01)에 따른 상당한 통계학적 차이를 나타낸다 (실시예 4).
도 3은 ASC 및 HC016 세포에서 총 글루타티온 (GSHtotal)의 세포내 수준 도표이다. 대조 조건에서 비-스트레스에서, 치료는 ASC에 대하여 HC016 기저 GSH 수준에서 10% 증가를 유발한다.
도 4A는 ASC 및 HC016 세포에서 활성 산소종의 해독에 포함된 유전자의 발현 수준 도표이다 (실시예 6).
도 4B는 ASC 및 HC016 세포에서 활성 산소종 (SOD1, SOD2, SOD3, Cat, GR, GPx)의 해독에 관여하는 유전자 발현의 정량 도표이다. 값들은 HC016/ASC 비율로 표시하였다 (실시예 6).
도 5A는 ASC 및 HC016 세포에서 세포골격 조성물 (ß-액틴)에 관여하는 유전자 발현 수준 도표이다 (실시예 7).
도 5B는 ASC 및 HC016 세포에서 세포골격 조성물 (ß-액틴)에 관여하는 유전자 발현의 정량 도표이다 (실시예 7). 값들은 비율 HC016/ASC의 비율로 표시하였다 (실시예 7).
도 5C는 ASC 및 HC016 세포에서 성장 인자 IGF-I를 위한 유전자 코딩의 발현 수준 도표이다(실시예 7).
도 5D는 ASC 및 HC016 세포에서 성장 인자 IGF-I을 위한 유전자 코딩의 발현 정량 도표이다 (실시예 7). 값들은 HC016/ASC 비율로 나타낸다 (실시예 7).
도 6은 F-액틴 면역염색법의 형광 현미경 검사 이미지이다. ASC와 관련하여 HC016 세포에서 F-액틴의 존재의 증가, 및 스트레스 섬유의 그의 분포가 관찰될 수 있고, 이것은 그들의 우수한 이동 및 화학주성 능력과 관련된 HC016의 세포골격 형태적 변화를 의미한다 (실시예 8).
도 7은 산화적 스트레스 주입 후의 신경 계통 HOG 세포 성장율 및 이 성장율에 대한 ASC 및 HC016 적용 효과이다. ASC 및 HC016과 함께 산화 환경으로 스트레스되는 HC016 세포의 공-배양은 HOG 세포 생존을 증가시킨다. 그럼에도 불구하고 HC016와의 공-배양만이 HOG 세포의 산화 환경으로의 노출 후 48시간에 보호효과를 지속시킨다. 별표는 t-student test (p<0.05)에 따른 상당한 통계학적 차이를 나타낸다 (실시예 9).
도 8은 ASC 세포에 관하여 산화적 스트레스 주입으로 고통받는 세포에 대하여 HC016 세포의 상당히 우수한 이동 능력을 나타내는 대표 이미지 몇 정량 막대 그래프이다 (실시예 10).
도 9는 ASC로 치료되고 그리고 HC016으로 치료되는 비-치료 레트로 이루어진 척수외상을 가지는 레트의 3가지 실험군의 BBC 점수 (Basso-Beattie-Bresnahen)의 진전 표이다 (실시예 12).
본 발명의 하나의 양태는 비람직하기는 성인 지방 조직으로부터 획득 및/또는 분리된 것을 의미하는 지방 조직으로부터, 더욱 정확하게는 동물 근원 (origin)으로부터, 바람직하기는 인간으로부터의 중간엽 줄기세포의 치료 방법에 관한 것이다. 이 과정은 주로 두가지 정의된 단계, 첫번째로 중간엽 줄기세포의 획득 및 분리단계, 두번째로 산화제를 포함하는 정의된 치료 배지에서 세포의 성장 기간 및 특이 치료단계를 필요로 한다.
ASC 세포의 획득:
이 단계와 관련하여 상기 과정은 중간엽 줄기세포의 획득 및 분리를 첫번째로 포함한다.
중간엽 줄기세포의 근원은 지방 조직, 골수, 탯줄 및/또는 태반으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하기는 본 발명은 인간 지방 조직-유래된 중간엽 줄기세포, ASC으로부터 발생한다.
그러므로 우선적으로 본 발명에서 지방 조직-유래된 중간엽 줄기세포의 단편 (fraction)은 마취 하에서 건강한 인간 환자의 지질 흡인물로부터 추출된다. 지질 흡인물은 해당하는 사전 동의 후에 환자에 의해 기증된다. 이후에 지질 흡인물은 1 x PBS로 세척되고 37℃에서 30분동안 교원질 분해효소 유형 I로 분해된 후 세포 펠렛을 얻기 위해 원심분리된다. 펠렛은 적혈구 완충 용균액에서 재현탁되고 정제된 세포 현탁액은 100 ㎛ 나일론 메시를 통해 여과되고 다시 원심분리된다. 세포를 재현탁시킨 후, 이들은 배양 플라스크에서 접종되어 세포군체 증식 (expansion)이 진행된다.
본 발명에서 사용되는 세포 군체 증식 또는 2차배양 과정은 트립신/EDTA 용액과의 배양에 의한 배양 용기로부터 세포의 분리, 수집된 세포 현탁액의 원심분리를 포함하여 새로운 세포 배양 용기에서 세포 밀도 및 생존능력을 측정하고 이들 세포를 접종하기 위한 것이다.
본 발명에서 세포 수집은 공보: Yoshimura, Shigeura, Matsumoto, Sato, Takaki, Aiba-Kojima, Sato, Inoue, Nagase, Koshima y Gonda, 2006. Characterization of Freshly Isolated and Cultured Cells Derived From the Fatty and Fluid Portions of Liposuction Aspirates. J Cell Physiol 208(64-76); Almeida, Campa, Alonso-Vale, Lima, Daud y Stocchero, 2008. Fraccion vascular estromal de tejido adiposo. Cir.plast. iberolatinoam. 34 (71-79); Wagner, Wein, Seckinger, Frankhauser, Wirkner, Krause, Blake, Schwager, Eckstein, Ansorge y Ho, 2005. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Experimental Hematology 33 (1402-1416)에 나타낸 바와 같이 최신으로 기재된 방법론을 따른다.
세포 치료방법. HC016 세포의 획득:
300,000 - 2,000,000 사이의 적절한 세포수가 일단 얻어지면 세포를 특정 치료 기간동안 정의된 농도의 산화제와 접촉이 요구되는 치료가 진행된다.
산화제는 예를 들어 산화물 및/또는 퍼옥사이드, 그 중에서도 과산화수소 (H2O2), 과산화칼슘 (CaO2), 과산화마그네슘 (MgO2), 과산화아연 (ZnO2), 과산화망간 (MnO2), 과산화납 (PbO2), 산화질소 (NO), 아산화질소 (N2O), 오존 (O3), 과붕산나트륨 (NaBO3), 이산화셀레늄 (SeO2), 산화은 (Ag2O), 염화제2철 (FeCl3)과 같은 철염, 수산화구리 (CuOH, Cu(OH)2)와 같은 구리염, 과탄산나트륨 (2Na2CO3)과 같은 구리염, 과망간산칼륨 (K2Mn2O8)과 같은 과망간산염, 중크롬산칼륨 (K2Cr2O7)과 같은 중크롬산염, 차아염소산 (HClO-)의 리튬, 나트륨 및 칼슘염, 아염소산나트륨 (NaClO2), 염소산 (HClO3), 염소산칼륨 (KClO3), 수산화알루미늄 (Al2O3), 탄산마그네슘 (MgCO3)으로 공침된 수산화알루미늄, 3산화비소 (As(OH)3), 과산화벤조일 (C6H5CO)2O2), 수산화칼슘 (Ca(OH)2), 클로로디아제폭사이드염산염, 산화제2구리 (CuO), 산화철, 산화마그네슘 (MgO), 이산화마그네슘, 수산화마그네슘 (Mg(OH)2), 수산화칼륨 (KOH), 수산화나트륨 (NaOH), 산화티타늄 (TiO2), 산화아연 (ZnO) 및 다른 산화 방지제, 바람직하게는 염증성 과정에서 미토콘드리아 호흡 연쇄 및 신호전달 분자의 폐기물인 활성 산소종 (ROS)의 그룹에 속하는 과산화수소 (H2O2)등이 고려된다. 허용값 이상으로 H2O2을 증가하는 것은 세포사멸을 유발한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 치료방법은 제어된 방식으로 H2O2로 세포의 배양을 포함하고; 이것은 조절된 기간 및 방법론 그리고 본 치료로 직접적으로 얻어지는 중간엽 줄기세포의 새로운 기능과 특성을 유발하는 정의된 농도를 의미한다.
보다 구체적으로는, 본 발명에서 개발된 치료방법은 적절한 산화 환경에서의 세포배양, 다음에 치료기간의 한정을 포함한다. 통상적인 기간에서 치료방법은 48-72 시간 간격 내에서 두번의 연속 치료 주기와 이어서 실험 용기에서의 24-48 시간의 3차 치료주기를 포함한다.
상세히, 치료 기간은 다음의 방법을 포함한다:
a) 1차주기: 배양 용기에 세포를 접종시키고 4 내지 8시간 사이의 세포 적응기를 기다려서 세포가 그들의 통상적인 형태를 고수하고 획득하도록 허용한다.
b) 0.01 내지 0.05 mM의 범위의 최종 농도에 도달하기까지 DMEM 플러스 10% FBS 및 H2O2 용액에 의해 구성되는 치료 배지를 첨가한다.
c) 37℃ 및 5% CO2 분위기 중에서 인큐베이터에서 48-72 시간을 유지한다.
d) 2차주기: 0.01 내지 0.05 mM의 범위의 최종 농도에 도달하기까지 DMEM 플러스 10% FBS 및 H2O2 용액으로 대체하여 치료 배지를 갱신시킨다.
e) 37℃및 5% CO2 분위기 중에서 이들 세포를 48-72 시간 동안 배양시킨다.
f) 3차주기: 0.01 및 0.05 mM의 범위의 최종 농도에 도달하기까지 DMEM 플러스 10% FBS 및 H2O2 용액으로 대체하여 치료 배지를 갱신시킨다.
g) 37℃ 및 5% CO2 분위기 중에서 이들 세포를 48-72 시간 동안 배양시킨다.
치료 기간 후에 세포는 그들의 기능적 및 형태학적 특징을 변형하였다. 상기 관점에서 HC016 약어는 이들 세포를 위해 구현된다.
배양 또는 성장 배지는 최신의 성분으로 알려진 통상적인 것을 포함하고 그러므로 이들은 총 부피의 85-95%의 높은 글루코오스 농도 (DMEM, Invitrogen)를 가지고, 총 부피의 5-15%의 농도의 소태아혈청 (Biochrom)을 가지고 총 부피의 농도 1%의 항생제 용액 PSA (Invitrogen)을 가지는 배지다.
또한 앞에서 기재한 본 발명의 방법에 사용되는 치료배지는 총 부피의 5-15% 농도의 소태아혈청 (Biochrom)을 가지는 총 부피의 85-95%의 높은 글루코오스 농도 (DMEM, Invitrogen), 총 부피의 1% 농도의 항생제 용액 PSA (Invitrogen) 및 총 부피의 0.01 내지 0.05 mM 사이의 농도의 과산화수소 (H2O2) (Panreac)를 포함한다.
본 발명의 방법을 사용하여 비-치료되는 ASC와 비교한 HC016 세포의 특징.
본 발명의 치료방법의 결과로서, 본 발명의 HC016 세포가 획득되고, 본 발명의 방법을 사용하여 비-치료되는 ASC와 비교해서 세포질 SOD1 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 1, 미토콘드리아 SOD2 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 2, 세포외 SOD3, 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 3, GPx 글루타티온 퍼옥사이드, GR 글루타티온 환원효소 및 Cat 카탈라아제의 단백질을 코딩하는 유전자와 같은 활성 산소종의 제거에 관여하는 정의된 유전자의 우수하고 향상된 발현 수준을 나타내었다.
SOD1: 초퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 1은 공동-인자로서 구리 (Cu) 및 아연 (Zn)을 함유하는 이합체 단백질이다. SOD1은 세포 세포질에 있고 다음의 반응을 통하여 산소 및 과산화수소에서 수퍼옥사이드, 호흡 연쇄의 산물 및 효소 크산틴의 불변화를 촉진시킨다.
Cu-Zn(n+1)+-SOD+O2 -→ Cu-Znn+-SOD+O2
Cu-Znn+-SOD+O2 -+2H+→ Cu-Zn(n+1)+-SOD+H2O2
SOD2: 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 2는 공동-인자로서 망간 (Mn)을 함유하는 4분자체의 단백질이다. SOD2는 세포 미토콘드리아에서 국한되고 다음의 반응을 통하여 산소 및 과산화수소에서 수퍼옥사이드, 호흡 연쇄의 생성물 및 효소 크산틴 산화제의 불변화를 촉진시킨다.
Mn(n+1)+-SOD + O2 - → Mnn+-SOD + O2
Mnn+-SOD + O2 - + 2H+ → Mn(n+1)+-SOD + H2O2
SOD3: 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 3은 공동-인자로서 구리 (Cu) 및 아연 (Zn)을 함유하는 호모테트라머 단백질이다. SOD3는 다음의 반응을 통하여 산소 및 과산화수소를 발생시키는 배지에 존재하는 수퍼옥사이드의 불변화를 촉진시키기 위해 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 콜라겐 유형 I을 통하여 세포외 매트릭스에 결합하는 세포외 배지에 방출된다.
Cu-Zn(n+1)+-SOD + O2 - → Cu-Znn+-SOD + O2
Cu-Znn+-SOD + O2 - + 2H+ → Cu-Zn(n+1)+-SOD + H2O2
Cat: 효소 촉매는 산화적 스트레스 방어에서 중요한 효소로서 대부분의 모든 호기성 세포의 퍼옥시좀에 존재하는 4개의 펩티드 연쇄 및 4개의 포리프린 헤마틴 그룹 (Iron, 철)을 가지는 4분자체 단백질이다. 카탈라아제는 과산화수소와 반응하고 그것을 물로 변환시킨다. 그의 메커니즘이 완전히 이해되지 않더라도 그의 활성은 다음의 반응에 따라 기재되었다.
H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E(.+)
H2O2 + O=Fe(IV)-E(.+) →H2O + Fe(III)-E + O2
Chelikani, Fita y Loewen, 2004. Diversity of structures and properties among catalases. Cell Mol Life Sci 61(192-208).
GPx: 효소 글루타티온 과산화효소는 셀레노시스테인을 함유하는 우수한 척추동물로 알려진 작은 단백질 중의 하나이다. GPx는 세포질에서 주로 발견되고 수퍼옥사이드 불균등화 효소에 의해 발생되는 과산화수소 및 환원된 글루타티온 (GSH)의 분자에 결합하는 H2O2를 촉매화하여 모노아미노 산화효소에 가담한다.
GR: 효소 글루타티온 환원효소는 호모다이머 황색단백질이다. GR은 군 피리딘 뉴클레오티드-디설파이트 산화환원효소 군 I에 속한다. 이 효소는 산화방지제 방어의 기본 주기에 가담한다. 그의 활성은 설프히드릴 형태 (GSM)로 산화된 글루타티온 (GSSH)을 감소시키는 것으로 이루어지고, 이것은 산화방지제 방어에서 중요한 분자이다.
ROS의 해독에 관여하는 유전자 발현의 증가는 비-치료된 ASC 세포와 관련하여 정량하였고, 이것은 HC016 세포가 30% 이상, 바람직하기는 53%의 SOD1 유전자 발현의 증가, 25% 이상의, 바람직하기는 37%의 SOD2 유전자 발현의 증가, 50% 이상, 바람직하기는 77%의 SOD3 유전자 발현의 증가 및/또는 50% 이상의, 바람직하기는 78%의 Cat 유전자 발현의 증가를 제공하는 것을 확인한다.
ASC와 관련하여 HC016의 유전자의 우수한 발현을 정량화하기 위해 사용되는 방법론은 다음: 첨자 (SuperScript)-III첫번째 가닥 막 필터 상업용 키트에 포함되고 기재되는 것을 따르는 각 실험군의 세포 용균, mRNA 추출 및 정제이다. mRNA의 부피는 Pure Link TM RNA Micro Kit에 포함되는 시약 및 프로토콜을 따르는 역전사-폴리머라아제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용하여 cDNA를 발생시키는 주형으로서 작용한다. 각 실험군의 cDNA의 해당 부피는 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 1,2 y 3 (SOD1-3), 카탈라아제 (Cat), 글루타티온 퍼옥사이드 (GPx) y 글루타티온 환원효소 (GR)을 코딩시키는 유전자에 존재하는 DNA 단편을 국소화하는 특이 프라이머를 포함하는 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)이 진행된다. 각 실험군의 PCR 산물은 전기영동에 의해 이동되고 그리고 증폭된 단편의 크기가 측정되고 각 결합의 강도가 정량화된다. 결과값은 정의된 구성요소 정보, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소, GADPH의 값으로 정규화된다.
더욱 HC016 세포가 ASC 세포와 관련하여 8% 이상, 바람직하기는 10%의 세포내 GSH의 우수한 수준을 가지는 것을 나타내었다. ASC와 관련하여 HC016 세포에서 GSH의 우수한 수준울 정량화하는데 사용되는 방법은 아래 기재된 바와 같이 티체 (Tietze) 효소 방법이고: 실험군은 두가지 별개의 세포 배치, ASC 및 HC016이다. 치료 후에 세포는 수집되고, 상청액에서 용균 완충액 및 총 단백질에서 세포를 배양시켜 추출되는 그들의 단백질은 BioRad DC 단백질 분석 키트가 제공되는 프로토콜 및 시약으로 정량화된다. 상청액의 다른 부분 표본 (aliquot)에서 단백질은 침전되고 상청액은 총 GSH 및 GSS 정량을 위해 이동된다. 총 GSH 및 GSSG 분석용 샘플은 96 웰 (well)-플레이트에서 세번 진행된다. GSH 측정의 경우, 샘플은 글루타티온 환원효소로 배양되고 450 nm의 흡광도는 이후에서는 2.5분 동안 매 15초마다 측정된다. GSSG 측정동안, 정제된 샘플 단백질은 2-비닐피리디나로 전치료되고, 이후에 글루타티온 환원효소로 치료되고 결과적으로 405 nm에서 최종 흡광도는 30분동안 매 15초마다 측정된다.
흡광도 값은 공지의 GSH 농도를 사용하여 세포 단백질 샘플을 사용하는 대신에 이전에 기재된 단계의 반복에 의해 발생되는 표준 곡선이 측정된다. 값은 단백질의 nmol/mg로서 표현된다. 총 글루타티온은 GSHtotal=GSHreduced+2GSSGoxidized으로 계산된다.
추가적으로, HC016 세포는 ASC와 비교했을 때 10% 이상, 바람직하기는 11%, 더욱 바람직하기는 15%에서 세포내 ROS의 낮은 수준을 제공하는 것을 특징으로 한다.
ASC와 관련하여 HC016 세포내 ROS 수준에서 우월성을 정량화하기 위해 선별된 방법은 DCFA 프로브-기재 형광 정량이었다: 실험군은 4가지 독립 개체, ASC로부터 HC016을 발생시키는 동일한 치료로 배양되는 ASC 중의 하나, HC016의 두번째, 손상되지 않은 HOG 세포 중 세번째, HOG의 중 네번째로 이루어진다. 세포는 PBS 1x로 세척되고 그 후 30분동안 2'7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트 (DCFA) 10μM을 첨가하였다. 이후에 DCFA가 세척되고 새로운 배지가 첨가된다. 이후에 세포는 0, 0.1, 0.25, 0.5 및 1 mM의 농도 기울기에서 배지에 H2O2를 첨가함에 의해 산화 배지로 배양되고 그리고 바로 직후에, 세포내 ROS 수준 진전은 5분마다 그리고 형광 플레이트 리더에서 총 60분동안 측정된다. 그래프는 시간 (분)에 따른 강도의 임의의 형광 단위로서 나타난다.
추가적으로 본 발명의 방법에 따라 치료된 HC016 세포는 우수한 이동 능력을 나타낸다. 이 특성은 HC016이 손상된 조직 영역에 더욱 효과적으로 접근하고 그리고 그들의 영양 활동을 초기화하여 손상된 세포를 보호하고 그리고 불리한 환경의 조절에 영향을 미칠수 있는 것을 결정한다. ASC와 관련하여 상당히 높은 이동 능력은 HC016의 세포골격에서 발생하는 형태 변화에 의해 일어나고, 또한 세포 증식 경계에서 구성되는 마이크로필라멘트 (베타-액틴)의 유형의 증가를 결정한다. 이들 막 추정은 이동 동안 세포 이동에 대한 물리적 기질이다. 이 점에서, 베타-액틴 유전자 발현 분석은 ASC와 관련하여 59%의 HC016의 증가를 나타낸다 (도 5 A-B). 또한 중합된 액틴 또는 F-액틴 면역염색법은 이동 경우에 스트레스 섬유의 형성, 근본 요소로서 높은 이동 능력과 관련된 형태학적 변화를 나타낸다. 도 6은 스트레스 섬유에 배열된 F-액틴의 면역염색법을 나타내고, 이것은 세포 이동 과정에서 중요한 면 중의 하나이다 (1996년 Mitchison 등). 또한 Boyden 챔버 (도 8, 실시예 10)에 의하여 세포 이동 능력을 분석하기 위해 독점적으로 수행되는 실험은 HC016 세포가 ASC와 관련하여 30-폴드 (fold)의 높은 이동 능력을 가진다는 것을 나타낸다.
추가적으로 HC016 세포는 ASC와 관련하여 64%의 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1) 유전자 발현 증가를 나타낸다. 이전의 연구는 IGF-1이 손상 후에 발생한 재생 방법과 관련하여 매개한다는 것을 나타내었다. IGF-1은 조직 재생산을 자극시키는 신경 조직의 손상 후에 비-뉴런의 세포에 의해 제조되는 강한 신경영양성 인자이다. IGF-1은 뉴런 생존, 신경돌기 성장, 신경 세포 증식, 수초를 촉진하고 그리고 축색돌기-Schwann 세포 상호작용을 향상시킨다 (2010년 Apel 등). 또한 다른 실험 모델에서, IGF-1의 일부 적용은 손상된 영역으로 줄기세포의 반흔 조직 형성 및 높은 보충 없이 손상된 골격근 치유를 허용하는 것을 증명하였다. 이들 이유로 인해 HC016 세포에서 IGF-1 발현 도입은 그것이 증가하는 방식으로 ASC 재생산 능력, 세포 증식 능력, 손상된 조직 세포의 기능적 회복 및 손상된 영역으로의 줄기세포의 보완이 회복 방법에 기여하도록 촉진할 수 있다.
ASC와 관련하여 유전자 발현을 분석하기 위해 선택되는 방법은 다음과 같다: 비교 분석은 ASC 및 HC016 세포로 이루어진 두가지 실험군을 필요로 한다. 치료방법이 완성되면, 각 세포 그룹은 수집되고, 용균되고 그리고 RNA는 추출되고 정제되며, 진행되어 cDNA를 획득한다. PCR 반응은 β-액틴 및 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1)을 코딩시키는 유전자에 존재하는 DNA 단편을 국소화시키는 특이 프라이머를 포함하여 수행된다. 각 실험군의 PCR 산물은 전기이동에 의해 이동되고 증식된 단편의 크기는 결정되고 각 결합의 강도는 정량화된다. 결과값은 정의된 구성요소 정보, GAPDH의 강도값으로 정규화된다.
데이터 세트는 HC016을 발생시키는 치료방법이 H2O2의 제거에 필요한 세포내 및 세포외 분자 구조의 "풀 (pool)"의 합성 및 불리한 산화 환경의 제어를 유도한다는 것을 나타낸다. HC016 세포는 손상된 조직 영역에 도달하는 높은 이동 능력을 가지고 또한 손상된 조직의 세포의 재생산 방법에 관한 효과를 발휘하고 그들의 생존을 유지하는 영양 인자의 높은 양을 생산한다.
산화적 스트레스와 관련되거나 그로부터 기인하는 질병의 치료에서 HC016 세포의 용도
상기 기재된 바와 같이, 이전 구역에 나타난 HC016 세포의 특징은 활성 산소종에 의해 매개되는 성분으로 인해 진화의 산화적 스트레스 또는 퇴행성 조건에 의해 야기되는 질병의 치료에 특히 적합하다.
중치신경계에 영향을 미치는 병리학 중의 하나는 산화적 스트레스와 관련되고, 활성 산소종에 의해 매개되는 성분으로 인한 퇴행성 변화를 야기시키고 이것은 척수외상이다.
척수외상은 병리학에 관여하지 않고 외부 유전적 요인에 의해서도 유발되지 않는 신경 조직의 손상으로 구성된다. 손상의 관점에서 외상의 일시적 결과는 충격 영역에서 조직 압착, 출혈, 부종, 산소 고갈 및 영양분이다 (Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin 및 Cho, 2004. 주입 심각성 및 세포사멸 메커니즘: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132; Fehlings y Tator, 1995). The relationships among the severity of spinal cord injury, residual neurological function, axon counts and counts of retrogradely labeled neurons after experimental spinal cord injury. Exp Neurol 132: 220-228). These biological phenomena induce two cellular defense mechanisms: programmed cell death or apoptosis (Yukawa, Lou, Fukui y Lenke, 2002. Optimal treatment timing to attenuate neuronal apoptosis via Bcl-2 gene transfer in vitro and in vivo. J Neurotrauma 19: 1091-1103) and the innate immune reaction (Carpentier y Palmer, 2009. Immune influence on adult neural stem cell regulation and function. Neuron 64: 79-92) that extend to undamaged surrounding areas and persist for weeks or even months after the injury in terms of tissue ischemia and inflammation, in other words, producing a secondary damage (Lu, Liang, Chen, Chen, Hsu, Liliang, Lin y Cho, 2004. Injury severity and cell death mechanisms: Effects of concomitant hypovolemic hypotension on spinal cord ischemia-reperfusion in rats. Exp Neurol 185: 120-132).
이들 두가지 유형의 조직 반응은 생리학적 결과에 반응하는 신경 조직에 대하여 이용가능한 메커니즘이 불충분하기 때문에 척수를 따라 확장되고 그리고 초기에 건강한 조직에 영향을 미친다.
증식은 활성 산소 대사물 (MROs)을 통해 광범위하게 수행되고 산화적 스트레스 및 그의 강도에 따라 야기시키는 선천 면역 반응의 특징은 세포소멸을 유발할 수 있다 (Liu, Liu, 및 Wen, 1999. Elevation of hydrogen peroxide after spinal cord injury detected by using the Fenton reaction. Free Rad Biol & Medicine 27: 478-482; Yukawa et al., 2002). 이들 중에서 대부분의 풍부한 MRO는 과산화수소 (H2O2)이고 신경 세포를 둘러싸고 이차 손상의 형태로 확산되는 세포외 환경으로 분산된다. H202는 막, 단백질 및 세포의 DNA와 반응하고 그리고 저하시키고 (Braughler 및 Hall, 1989. Central Nervous System trauma and stroke.I. Biochemical considerations for oxygen radical formation and lipid peroxidation. Free Radic Biol Med. 6: 289-301) 그리고 궁극적으로 예정 세포사 또는 지방조직이 되게 유도시킨다 (2002년 Yukawa 등). H2O2는 또한 정상 세포의 폐기물이기 때문에 그들은 분자에 대한 방어를 가진다 (Phillis, 1994. A "radical" view of cerebral ischemic injury. Prog Neurobiol 42: 441-448). 그러나 손상 후에 발생되는 H2O2의 수준은 생리학적으로 통상적인 것보다 더 높다 (Hyslop, Zhang, Pearson 및 Phebus, 1995. Measurement of striatal H2O2 by microdialysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: Correlation with the cytotoxic potential of H2O2 in vitro. Brain Res 671: 181-186). 신경세포 중에서, 뉴런의 축색돌기를 감싸는 미엘린 쉬트를 발생시키는 희돌기교세포, 세포는 그들에 대하여 더 적은 방어를 가지고 그들을 이차 손상의 표적으로 변환시키는 분자를 함유하기 때문에 MRO에 더욱 취약하다 (Dringen R, Pawlowski P y Hirrlinger J. 2005. Peroxide detoxification by brain cells. J Neurosci Res 79: 157-165). 그러므로 손상 후 초기 세포사멸 이외에, 연속 H2O2로 인한 산화 손상은 신경 섬유의 지속적인 탈수를 야기시키고, 그들을 통한 신경 신호의 수행을 감소시킨다 (Nashmi R y Fehlings MG. 2001. Changes in axonal physiology and morphology after chronic compressive injury of the rat thoracic spinal cord. Neuroscience 104: 235-251).
다른 질병은 결정성 동맥주위염, 진성 당뇨병, 만성 육아종증, 동맥경화증, 뇌졸중, 섬유증 (만성 폐쇄성 폐질환, COPD, 특발성 폐섬유증), 허혈-재관류 증후군, 알츠하이머병, 파키슨병, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 염증성 장 질병: 궤양성 대장염 및 크론병, 성인 호흡 곤란 증후군, 죽상동맥경화증, 척수외상, 말초 신경 손상, 근위축성 측색 경화증, 헌팅턴 질환, 프리드라이히 운동실조, 치주염, 점막 질환 및 염증성 성분, 급성 및 만성 궤양 및 상처로 발생되는 질환 및 부상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들이다.
환부로 HC016 세포의 투여는 염증 과정 동안 면역 세포의 활성의 결과로서 야기되는 산화적 스트레스의 수준을 저하시킨다.
추가적으로 환부로 HC016 세포의 투여는 뇌출혈 후에 MRO의 제조의 결과로서 일어나는 산화적 스트레스의 수준을 감소시키고, 파라크린 사이토카인, 인터루킨, 케모카인, 영양 인자 및 성장 인자의 분비를 향상시키고, 다른 포유동물 세포의 생존과 증식을 증가시키며, 투여된 HC016 세포와 유사한 포유동물 세포의 인근에서 외부 MRO의 수준을 감소시키고 전염증성 TNF-알파, 1L-1 베타 등과 같은 신호전달 분자의 세포외 수준을 감소시킨다.
또한 HC016 세포는 본 발명의 실시예 10에서 나타낸 바와 같이 세포외 H2O2에 의하여 손상된 세포에 대한 상당히 높은 화학주성 능력을 가진다.
HC016 세포의 용도는 조직 손상의 발광, 손상 및 기능적 손실의 범위를 제한하기 위해 손상의 진원지보다는 손상된 부위에 인접한 영역에서 이전에 치료된 간엽 세포의 투여를 포함한다.
손상 조직은 신경 세포 및 혈관계의 세포의 막을 파괴하는 심한 압축력으로 고통받는다. 또한 손상의 결과로서 동맥과 정맥 파열, 세포 기관 의 장애, 소낭 및 세포막, 조직 괴사를 일으키는 인자가 될 수 있다. 이들 경우는 병변에 고유하다. 이후에 이들이 해결되지 않으면 면역 체계 세포에 의해 또한 방출되는 다른 분자와 함께 괴사 세포에 의해 방출되는 분자는 H2O2와 같은 세포 신호전달 분자를 통하여 인접한 영역에 손상을 가하도록 확장된다. 중간엽 세포 기반 치료의 적용은 조직 손상의 확장을 감소시키거나 최소화하기 위해 고안된다. 그러므로 세포 치료의 적용은 바람직하기는 손상의 진원지에 인접한 영역일 것이다.
본 발명의 또 다른 양태에서 치료된 세포는 투여 경로를 이용하여 적용되어 영역에 활성 산소종을 대사작용하기 위해 손상의 진원지에 직접 도달하도록 허용하고, 영역에 다량 세포사멸의 상황을 방지하기 위해 산화적 스트레스를 감소시키고 염증성 상태를 조절하도록 한다.
투여 경로는 (동맥내, 정맥내, 림프관내, 척수내, 경막외 마취제, 골수내)와 같은 비경구령로, 피하, 근육내, 내부복막, 경피 (percurtaneous), 관절내, 기관내, 폐포내, 척추강내, 안구내, 결막, 심장내, 비장내, 질의, 요도의, 피부의, 직장의, 설하, 경구, 경구 점막 관통일 수 있다. 이들 적용을 수행하기 위해 본 발명의 방법에 의해 획득한 세포는 경로에 따라 본 분야의 당업자에게 이미 알려진 약제학적으로 허용가능한 운반체에서 적절히 제조된다.
다른 것들 중에서, 제제는 유리 바이얼, 살균 및 비 발열성의 (Sword Scientific)에서 투여를 위해 배치되는 세포 HC016 이외에도 Ringer-Lactate, 인간 알부민 (CSL-Behring)등을 함유하는 용액을 제공한다.
유사하게 HC016 세포는 히드로겔, 폼 및 중합체 재료, 복합체, 인산칼슘 유도체 및 금속 재료와 같은 세포 및 조직 공학 치료의 생성을 위해 자연 근원 및/또는 합성의 생체적합물질로 통합될 수 있고, 이것은 손상 부위로 세포의 더 우수한 관리를 가능하게 하고 적절한 세포의 생존 및 기능을 증가시킨다.
포유동물로 HC016 세포 투여 후 그들이 주입 부위에 인접한 세포의 증식을 활성화시키는 경우에 중간엽 세포는 손상 부위를 향해 이동한다. 바람직하게는 이들 세포는 주입이 적용되고 그리고 전구체 세포인 유조직에 인접한 동일한 표현형을 가진다. 더욱 더 바람직하게는, 세포 표현형은 유조직 세포 및 전구체 세포에 인접한 것과 일치한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 투여된 중간엽 HC016 세포는 조직에 남아있다. 또한 환자의 조직에 투여되는 중간엽 세포의 존재는 중간엽 세포에 투여되는 것에 대하여 면역 반응을 유도하지 않는다.
실시예
실시예 1. 지방 조직 (ASC)로부터 중간엽 세포의 획득
지방 조직으로부터의 중간엽 줄기세포는 2006년 Yoshimura 등, 2008년, Almeida 등, 2005년, Wagneret 등에 의해 기재되는 방법론을 따르는 인간 조직으로부터 분리시킨다.
지방조직으로부터 중간엽 줄기세포의 부분은 마취 하에서 건강한 환자의 지질흡인물로부터 획득한다. 지질흡인물을 PBS 1X로 세척하고 37℃에서 30분동안 교원질 분해효소 I로 분해시킨 후 세포 펠렛을 얻기 위해 원심분리시킨다. 본 펠렛을 적혈구 용균 완충액으로 재현탁하고 정제된 세포 현탁액을 100 μm 필터를 통해 통과하고 다시 원심분리시킨다. 세포를 재현탁시킨 후 이들은 세포 확장을 위해 배양 배지에서 접종하였다.
세포를 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에서 10% 소태아혈청 (Biochrom) 및 1% 항생제-항진균 PSA (Invitregen)을 사용해 DMEM (Invitrogen)으로 구성되는 성장 배지에서 5일동안 주요 배양으로서 배양시킨다.
연속적으로 세포는 반합류점 (semiconfluence)을 획득한 경우 증식한다. 이 과정에서 세포는 0.05% 트립신/EDTA의 용액을 사용하여 배양 표면으로부터 분리시키고, 신선 배지에서 원심분리하고 재현탁시킨다. 세포 밀도 및 생존능력을 획득한 세포 현탁액에서 측정하고 새로운 세포 배양 표면에서 접종한다.
실시예 2. 세포 ASC에 대한 본 발명의 치료의 적용: 세포 HC016 획득
350,000의 2차배양된 ASC 세포는 다음의 조성물: 10% 소태아혈청 (Biochrom)을 사용하는 DMEM (Invitrogen) 및 1% PSA 항생제-항진균 (Invitrogen)을 사용해 5 mL의 성장 배지를 가지는 T25 배양 플라스크에서 접종하고 유지할 때까지 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다.
1차주기: 다음의 조성물: 10% 소태아혈청 (Biochrom), 1% 항생제-항진균 PSA (Invitrogen) 및 0.01% H2O2 (Panreac)을 사용하는 DMEM (Invitrogel)을 함유하는 치료 배지를 첨가한다. 이들 세포를 48시간 동안 배지에서 배양하였다.
2차주기: 48시간 후에 세포를 획득하고 다시 350,000 세포를 두번째 T25 배양 플라스크로 접종하고 유지할 때까지 37℃ 및 5% CO2에서 4시간동안 배양시켰다. 연속적으로 치료 배지를 첨가하고 세포를 48시간 동안 배양하였다.
3차주기: 48시간 후에 세포를 획득하고 다시 350,000 세포를 두번째 T25 배양 플라스크로 접종시키고 유지할 때까지 37℃ 및 5% CO2에서 배양시켰다. 연속적으로 치료 배지를 첨가하고 세포를 48시간 동안 배양하였다.
48시간 후에, ASC 치료된 세포는 HC016로 명칭이 변경된다.
실시예 3. ASC와 관련하여 HC016 세포의 세포 증식에 관한 비교 분석
세포 증식 분석을 다음의 4가지 실험군: HC016을 발생시키는 본 발명의 치료를 사용하여 배양되는 ASC, HC016, 손상되지 않은 HOG세포 및 HOG 세포에서 수행한다.
HOG 세포는 신경 선형의 실험적 희돌기교세포 모델로서 간주되는 희돌기교세포로부터의 인간 세포이다. HOG 세포는 증식 능력 및 희돌기교세포의 유전전 배경으로 미분화되어 배양된다.
ASC는 본 실험을 위해 세포 개체를 발생시키기 위해 방법론 및 실시예 1에서 정의하고 기재된 성장 배지로 배양하였다. 동일한 수의 HC016 세포의 배치를 실시예 2에 따라 발생시켰다. HOG 세포 개체를 각각 실시예 1 및 실시예 2에 따라 ASC 및 HC016에 대한 방법에 의해 생성하였다.
4개의 세포 개체가 준비되면 세포를 그들이 세포벽에 부착될 때까지 96 웰 플레이트에서 성장 배지로 접종시킨다. 이후에 세포는 0.1 mM H2O2의 노출에 의해 산화 환경에서 성장한다. 증식은 다른 시간: 0, 24, 48 및 72 시간에서 프로토콜 및 세포 증식 MTT 방법의 시약을 따라 측정하였다. 키트 제조업체에 따르면 본 시험은 세포 증식의 측색 추정을 제조하고, 그러므로 매개변수를 4가지 세포 유형에서 분석하고 비교한다.
수준은 시간 (시간)에 따라 형광 강도의 임의의 단위에서 나타난다.
결과
HC016의 증식 능력은 산화 자극 (23% 증가) (학생 t-시험 p<0.05; n=3 샘플)후 72시간에 ASC의 조절 개체보다 1.23배 더 높다 (도 1A). 효과는 다른 인간 세포, HOG 희돌기교세포에 의해 공유되지 않는다 (도 1B). 본 발명의 치료는 ASC에 효과적이지만 HOG 희돌기교세포와 같은 다른 세포 유형에 효과적일 수 없다.
실시예 4. HC016 세포에서 세포내 활성 산소종의 수준
활성 산소종의 세포내 수준 분석을 4가지 세포 실험군: HC016을 발생시키는 본 발명의 치료로 배양되는 ASC, HC016, 손상되지 않은 HOG세포 및 HOG 세포에서 수행한다.
4가지 세포 개체가 준비되면 세포를 그들이 벽에 부착될 때까지 웰 플레이트에서 성장 배지로 접종시킨다. 이후에 세포를 1xPBS로 간단히 세척하였고 이후에 PBS는 프로브 2', 7'-디클로로디히드로발광 디아세테이트 (DCFA) 10 μM을 사용해 100 μl의 1xPBS에 의해 대체된다. 이후에 DCFA를 제거시키고 신선 배지를 첨가한다. 이후에 세포를 다른 농도: 0, 0.1, 0.25, 0.5 및 1 mM에서 H2O2를 가지는 배지에서 배양시켰다. MRO 수준의 시간 경과는 형광 플레이트 리더에서 총 60분동안 5분마다 측정한다. 자극/방출의 파장 범위는 485/538 mm이다.
수준은 시간 (분)에 따라 형광 강도의 임의의 단위로 나타난다.
결과
H2O2의 변화가 노출된 후 55분에, HC016 세포는 ASC (11% 미만), 각각 두가지 방법 ANOVA 테스트 P <0.031 및 (15% 미만), 두가지 방법 ANOVA 테스트 (P<0.039)에 관하여 1 mM 및 0.5 mM의 H2O2을 가지는 세포내 MRO의 상당히 낮은 수준을 함유한다 (도 2). ASC로부터 HC016을 발생시키는 치료는 HOG 희돌기교세포와 같은 다른 포유류 세포에서 동일한 반응을 유도하지 않는다 (도 2). 또한 HC016 세포에서 ROS의 더 낮은 세포내 수준의 존재는 이 분자의 세포의 수준이 감소하여 HC016 세포는 환경으로부터 과산화수소를 제거시키는 더 높은 능력을 가지고, 세포가 세포 치료와 같은 적용의 부위에서 더 큰 H2O2의 해독 능력을 가지게 하는 것을 간접적으로 나타낸다.
실시예 5. 세포내 총 글루타티온 (GSH)의 수준
실험군은 ASC 및 HC016의 두가지 별개의 배치로 이루어진다. ASC를 방법론 및 상기 기재된 배지로 배양하였다. ASC는 기재된 방법을 사용하여 인간 지방 조직으로부터 추출하고 분리하였고 필요한 세포 개체가 본 실험에서 얻어질 때까지 성장 배지에서 2차배양하였다. 또한 HC016 세포의 배치를 본 발명의 방법론을 사용하여 세포의 동일한 수로 생성하였다.
세포 조건 단계 후에 세포는 0.05 트립신/EDTA로 분해함에 의해 수집하고, 단백질은 세포를 용균 완충액 (pH 7.5에서 인산나트륨 완충액에서 단백질 분해효소 억제제, EDTA 및 트리톤 X-100)으로 배양시켜 추출하고 그리고 상청액의 총 단백질은 BioRad DC 단백질 분석 키트에 의해 제공되는 프로토콜 및 시약에 따라 정량화한다.
상청액의 또 다른 부분 표본에서 단백질은 5% 설포사리틸산으로 침전시키고 원심분리하고, 상청액에서 용해된 낮은 질량의 펩티드는 총 GSH 및 GSSG 분석에서 이동하였다.
총 GSH 및 GSSG 분석용 샘플은 96-웰 플레이트에서 세번 진행한다. GSH 측정의 경우 샘플은 5%의 정제된 단백질 샘플, 45%의 증류수 및 50%의 반응 완충액 (0.2 M EDTA, DTNB 1.2 mg/100 lμ, 3.6 mg NADPH 및 pH 7.5에서 인산나트륨 완충액 0.1 M에서 글루타티온 환원효소의 4.5 단위). 이후에 405 nm에서 흡광도는 2.5분 동안 매 15초마다 측정한다. GSSG 측정의 경우 정제된 단백질 샘플은 96.3%/3.7% (단백질/시약)에 관하여 2-비닐피리딘으로 전치료하고 4℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후에 분석용 샘플은 10%의 전치료된 샘플, 40%의 증류수 및 50%의 반응 완충액 (pH 7.5에서 인산나트륨 완충액 0.1 M에서 0.2 M EDTA, DTNB 1.2 mg/100 μl3.6 mg NADPH 및 글루타티온 환원효소 단위)을 함유하여 제조한다. 이후에, 405 nm에서 흡광도는 30분동안 매 15초마다 측정한다.
흡광도값은 공지의 GSH 농도를 사용하는 동일한 단계를 반복함에 의해 생성되는 표준 선형 피트로 추정한다. 값은 단백질의 nmol/mg로 표현한다. 총 GSH는 GSH + 2GSSG로 계산한다.
결과
HC016 세포를 ASC (10% 초과)와 관련하여 총 GSH에서 높은 기초 함량을 나타낸다 (도 3). HC016 세포에서 세포내 총 GSH의 이들 높은 수준의 존재는 또한 유독물질의 이들 세포의 높은 해독 능력을 확인하고, 환경적 스트레스 또는 세포 대사물질 활성 증가에 대한 높은 저항성을 제공한다.
실시예 6. 대사물질 활성 종 해독에 관여하는 유전자 발현의 수준
비교 분석은 ASC 및 HC016 세포로 이루어진 두가지 실험군을 필요로 한다. 통상적인 ASC는 본 실험을 위해 필요한 세포 개체를 얻기 위해 방법론 및 상기 기재된 배지를 사용하여 배양한다. HC016의 유사한 세포수의 배치는 실시예 2에 기재된 방법을 적용하여 생성한다.
조건 절차가 완료되면 각 세포군은 트립신/EDTA 분해에 의해 세포 배양 용기로부터 수집된다. 세포가 용균되고 각 실험군의 총 mRNA는 세포 막 단편 및 단백질을 보유하는 상업적으로 이용가능한 막 여과 시스템을 사용하여 별도로 추출하고 정제한다. 용출된 mRNA는 상업적 키트 (Pure LinkTM RNA Micro Kit; Invitrogen; Ref. 911811)에 포함되는 제조된 프로토콜 및 시약을 따라 역전사-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 cDNA로 변환한다. 각 실험군의 얻어진 cDNA의 해당 부피는 수퍼옥사이드 디스뮤타제 효소 1,2 및 3, 카탈라아제, 글루타티온 퍼옥사이드 및 글루타티온 환원효소의 유전자의 엑손 영역에 국소화된 특이 cDNA 단편에 결합하는 맞춤-제작된 프라이머 서열을 포함하는 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하기 위해 맞춘 부피 및 농도로 혼합한다. 각 실험군의 PCR 생성물은 전기이동 기술 (1x TAE 완충액의 % 아가로스)에 더하여 DNA 가닥 시약의 정의된 농도의 부피에 의하여 아가로스 겔에서 이동한다 (SYBR Safe DN gel stain; Invitrogen; S33102). 겔은 UV 빛으로 투과시키고 그리고 디지틸 이미지 시스템에 의한 광학적 밀도는 각 이동된 밴드의 광학적 밀도를 측정하기 위해 획득한다. 각 실험군의 각 밴드의 각 선택된 밀도 값은 정의된 구성요소인 유전자 발현의 광학적 밀도값에 대하여 빼고 정규화한다.
결과
HC016 세포의 산화 대사에 관여하는 유전자의 발현 수준은 ASC와 다르다 (도 4A). 다른 유전자 발현의 정량은 HC016 세포가 ASC에 대하여, 37%의 SOD2 유전자, 77%의 SOD3, 78%의 Cat 유전자, 18%의 GR 유전자 및 6%의 GPx 유전자와 비교했을 때 SOD1 유전자의 53% 증가를 제공하는 것을 나타낸다. 이들 결과는 HC016 세포가 ASC와 관련하여 세포내 및 세포외 산화방지제 방어의 개선을 제공하는 것으로 결론짓는다.
실시예 7. 세포골격, 및 성장 인자 분비에 관여하는 유전자 및 단백질 발현 수준
실험을 위해 필요한 세포 개체를 얻기 위해 상기 기재된 방법론 및 배지로 배양된 통상적인 ASC, 및 실시예 2에 기재된 방법론에 의해 생성된 HC016의 유사한 세포수의 배치로 이루어진 두가지 실험군을 필요로 한다. 실시예 6에서와 같이 조건 과정이 완료된 경우 각 세포군은 트립신/EDTA 분해에 의해 수집되고, 세포는 용균되고, 총 mRNA는 별도로 추출하고 정제되며 mRNA는 cDNA로 변환한다. PCR은 ß-액틴 및 IGF-1의 유전자의 엑손 영역에 국소화된 특이 cDNA 단편에 결합하는 맞춤-제작된 프라이머 서열을 포함하여 cDNA 단편을 사용하여 수행한다. 실시예 6에서와 같이 각 실험군의 PCR 제품은 전기이동 기술에 의한 아가로스 겔에서 이동한다. 각 이동된 밴드의 광학적 밀도를 측정하고 그 값은 정의된 구성요소인 유전자 발현, GADPH의 광학 밀도 값을 빼고 정규화한다.
결과
HC016에서 세포골격 성분 및 성장인자와 관련된 유전자의 발현 수준 (도 5A 및 C). 다른 유전자 발현의 정량은 HC016 세포가 ASC와 비교할 경우 ß-액틴 유전자 (도 5B)의 59% 증가 및 IGF-I 유전자의 64% 증가를 제공하는 것을 나타낸다.
실시예 8. 세포골격 분자의 조성물 및 배열
본 실험을 위해 필요한 세포 개체를 얻기 위해 방법론 및 상기 기재된 배지로 배양된 통상적인 ASC, 및 실시예 2에서 기재된 방법론에 의해 발생되는 HC016의 유사한 세포수의 배치로 이루어진 두가지 실험군을 필요로 한다.
두가지 개체의 세포를 상기 기재된 배지 및 방법론을 사용하여 24-웰 플레이트에서 접종하였다. 세포가 고정되면 배지를 제거시키고 세포를 PBS 1x로 간단히 세척한다. 이후에 세포를 12분동안 PBX 1x에서 4% 포름알데히드로 유지시키고, 4℃에서 10분동안 PBS 1x에서 트리톤 X-100의 0.1%로 투과시키고 PBS 1x에서 다시 세척하고 상온 (23℃)에서 1시간동안 PBS 1x에서 팔로이딘-FITC (Sigma-Aldrich; Ref. P5282)의 100 μg/ml로 배양하였다. 그후 세포를 nuclei strained with Hoescht 33258 (Introvigen; RefH1398) PBS 1x로 광범위하게 세척하고 그리고 Fluoromont-G (Southern Biotech; Ref.0100-01)의 얇은 층으로 결과적으로 덮이고, 그리고 형광 현미경으로 시각화하였다.
결과
HC016 세포의 세포골격은 F-액틴 필라멘트를 가지고 그들은 ASC 세포보다 두껍고 스트레스 섬유로 구성된다. 현미경 하에서 ASC 및 HC016 세포의 관찰은 HC016 세포가 더 많은 F-액틴 필라멘트를 가지고 ASC보다 두꺼운 것을 질적으로 나타내고 이것은 가능한 구조적 리모델링에 대해 더욱 견고한 세포골격 및 또한 준비를 제공한다. 실시예 7은 F-액틴 및 β-액틴 단량체를 인코딩하는 유전자 발현의 정량을 나타낸다. 두가지 결과는 F-액틴의 증가된 합성, 및 후자의 결과는 세포골격에 대한 효과를 나타낸다.
실시예 9. HC016 세포에 의한 신경 계통 세포의 보호 능력
실험군은 일반적인 배양 과정에서 어느 변형 없이 조절 희돌기교세포 HOG 세포, 산화 환경에서 배양된 HOG 세포, 산화 환경에서 ASC를 HOG 세포와 공배양 및 산화 환경에서 HC016 세포를 HOG 세포와 배양으로 이루어진다.
HOG 세포는 신경 계통의 실험적 희돌기교세포 모델로서 간주되는 인간 희돌기교세포 세포다. HOG 세포는 증식 능력 및 희돌기교세포 유전적 배경을 사용하여 미분화된 상태로 배양한다.
ASC와 HC016 세포와 유사한 개체는 실시예 1 및 2에 기재된 방법을 사용해 생성한다. 실험일에 세포는 두가지 세포 개체 사이에 물리적 접촉을 방지하는 24-웰 플레이트에 삽입되는 (트랜스웰 챔버의 주입) Boyden 챔버에 근거하는 인 비트로 공-배양 시스템에 포함되기 전에 0.05 트립신/EDTA 분해에 의해 수집된다.
실험일에 희돌기교세포는 24-웰 플레이트의 하단에 놓고 부착하고 배양 배지에서 0.5 mM의 H2O2의 0.5 mL을 첨가함에 의해 1시간동안 산화 환경에서 배양한다. 독성 주입 후에, 배지는 신선 배양 배지에 의해 대체되고 37℃에서 10% 소태아혈청 및 항체를 함유하는 DMEM에 의해 구성되는 배지에서 배양한다.
다음 단계에서 공배양 상황에서 ASC 또는 HC016 세포는 상기 설명된 실험군에 상응하는 바와 같이 Boyden 챔버 (트랜스웰 챔버의 주입)에 접종된 것을 포함한다.
24 내지 48시간의 기간까지, 희돌기교세포 생존능력은 tripan 청색 제거 방법에 의해 정량화한다.
생세포의 성장율 (GR)은 :%생세포-%사멸세포로서 계산한다. 정상 HOG에 관하여 산화된 HOG의 성장율은 GRoxidized HOG/GRcontrolHOG로서 계산한다.
결과값을 산화된 HOG와 관련하여 정규화하고 막대 그래프에서 백분율로 나타난다.
결과
HOG 세포에 대한 산화성 자극의 48시간 후에, HC016 세포와 공배양된 세포는 21%보다 높은 산화된 HOG (도 7)과 관련하여, ASC로 공배양된 HOG세포와 관련하여 정규화된 성장율을 가진다. 24시간에서 두가지 세포 유형이 비슷한 방식으로 산화된 HOG의 생존 능력을 촉진시키는 동안 배지 조건에서 HC016 세포는 산화된 HOG의 더욱 지속하는 효과를 가진다 (도 7). 이 이유 때문에, 인 비트로 세포 치료로서 이들 세포의 적용은 본 문헌에 나타나는 질병의 조직 손상이 발생하는 것과 같이 스트레스 조건 하에서 다른 세포 유형 대한 ASC와 관련한 시간에 따른 효과의 향상과 증가가 일어나게 하므로 통상적인 ASC 치료에 관하여 더 많은 이점을 제공한다.
실시예 10. 염증성/산화적 스트레스 신호전달 세포에 대한 HC016 세포의 이동 능력
실험군은 정상 배양 과정에서 어느 변형 없이 제어 희돌기교세포, 산화 환경에서 배양된 희돌기교세포, ASC와 산화 환경에서 배양된 희돌기교세포와의 공배양 및 HC016 세포와 산화 환경에서 배양된 희돌기교세포와의 공배양으로 이루어진다.
ASC 및 HC016 세포의 이동 능력을 분석하기 위해 산화적 스트레스 모델은 증식 및 생존능력이 산화적 스트레스 조건하에서 민감한 테스트 포유류 세포 (희돌기교세포)를 사용해 발생한다. 산화적 스트레스 모델은 배지를 배양시키기 위해 24-웰 플레이트의 하단에 위치하고 부착되고 그리고 0.5 mL의 0.5 mM의 H2O2을 첨가함에 의해 1시간 동안 산화 환경에서 배양된 희돌기교세포 HOG 세포로 이루어진다. 독성 주입 후에, 배지는 신선 배양 배지로 대체하고 37℃에서 10% 소태아혈청 및 항체를 함유하는 DMEM으로 구성되는 배지로 배양한다.
다음 단계에서 공배양 조건에서 ASC 또는 HC016 세포는 상기 설명된 실험군에 상응하는 것으로서 Boyden 챔버 (트랜스웰 챔버의 주입)가 접종한 것을 포함한다.
24, 48 및 72시간의 기간까지 트랜스웰 주입은 PBS 1x로 세척하고 그리고 12분동안 PBX 1X에서 4%의 포름알데히드로 고정시킨다. 트랜스웰 막의 상부 표면위의 세포를 Q-팁의 면봉으로 제거시키고 남아있는 셀은 상온에서 1시간동안 크레실 바이올렛의 0.1% 용액으로 유지하였다. 그후에 PBS 1X에서 완전히 세척하고 결과적으로 주입으로부터 절단시키고, DPX 상승 배지의 얇은 층으로 덮인 유리 슬라이드 위에 평평하게 설치하고 (Sigma-Aldrich; Ref. 44581)그리고 현미경 하에서 시각화하였다. 막은 현미경 하에서 관찰하고, 각 상황의 대표 이미지를 얻고 면적 당 세포수는 각 실험군마다 직접적으로 계산한다.
정량은 mm2당 이동한 세포수로 표현된다.
결과
총 5.7 mm2에 대해 0.57 mm2 (도 2)의 총 10 필드를 분석하였다. 이 영역에서 48 및 72 시간에서, HC016 세포는 산화적 스트레스에 의한 손상된 세포 영역에 대해 ASC와 관련된 이동 능력이 32.75배 (3.275%) 및 20.61 배 (2061%)로 높다. 결론적으로 HC016 세포치료는 ASC와 관련하여 세포외 H2O2에 의해 손상되는 HOG 세포에 대하여 상당히 강하고 우수한 화학주성 능력을 발생한다. H2O2의 적용 후에 HOG 세포를 발휘시킬 수 있는 화학주성 효과는 산화적 스트레스와 같은 현상 및 활성 산소 대사물질의 방출 후에 발생하는 염증의 성분과 관련될 수 있다.
실시예 11. HC016T 세포 약제학적 조성물 제조.
HC016 세포를 동물 모델에서의 그의 용도 및 효능의 측정에 대한 세포 치료 임상 제품을 유발하는 약제학적 제제에 따라 제조하였다.
그러므로 실시예 2에서 구체화된 바와 같이 ASC로부터 HC016 세포를 얻기 위해 치료를 수행하면 세포는 비-발열성 유리 바이얼에 배치한다.
본 목적을 위해, HC016 세포는 0.05% 트립신-EDTA의 용액을 적용함에 의해 배양 플라스크로부터 분리시키고, 효소 활성은 FBS (Biochrom)을 첨가함에 의해 중화시키고, 400g에서의 원심분리는 세포 현탁액 획득을 위해 수행한다. 상청액을 제거시키고, 염분 (Grifols)에 재현탁시킨 세포 펠렛 및 신규 원심분리를 이전 용액의 흔적을 제거시키기 위해 수행한다. 상청액을 버리고 세포를 주입가능한 용액 (Ringer-락테이트 95% (Grifols) 및 5%의 인간 알부민 (CSH-Behring)에서 재현탁한다. 세포수측정기구를 사용해 세포수 및 생존 분석을 수행하였고, 세포 용액을 200,000 세포/μl의 농도로 조정하였다.
동물 모델에서 점위 주입에 대한 약제학적 제제는: 유리 바이얼에 위치하고, 살균적 그리고 비-발열성 (Sword Scienfific)인 95%의 Ringer-락테이트 (Grifols) 및 5% 인간 알부민 (CSL-Behring)에서 200,000 세포/μl의 농도에서 HC016 생존 세포의 50μl의 용액으로 이루어진다.
실시예 12. 척수외상의 동물 모델에서 HC016 세포의 적용을 근거로 하는 세포치료의 보호능력 및/또는 기능적 모터 부흥.
실험군은 250-300 중량의 10명 성인의 Sprague-Dawley 레트의 세가지 그룹으로 이루어진다. 3-4%의 이소푸란을 사용한 전신 마취 하에서 이들 동물에게 추궁절제를 흉부 수준에서 수행하였으므로 척수가 노출된다. 등의 척수에서 적절한 척수외상은 공지의 직경의 금속 플런저로 로딩된 거리 및 무게와 같은 매개변수 세트에 의해 측정하고 좌상을 정의함에 의해 정의된다. 제 1그룹의 10마리의 동물은 손상을 입었고 치료가 전혀 없엇다. 제 2그룹의 10마리의 동물은 손상을 입었고 ASC-기반 세포 치료로 치료하였다. 제 3그룹의 10마리의 동물은 손상을 입었고 HC-16-기반 세포 치료로 치료하였다. 세포 치료인 ASC 및 HC016은 상기 척추 수준 및 아래 손상 하에서 6 지점에서 정위방법 주입에 의한 손상 후 48시간에 적용하였다. 각 주입은 동물마다 1,200,000 세포의 총 투여량을 제공하면서 200,000 세포를 함유하는 1ml의 살린으로 이루어진다. 레트를 동물 시설에서 항상 통제하고 음식을 제공하고 임의로 섭취하게 하였다. 각 그룹에서 보호 및/또는 기능적 모터 부흥 능력은 개방된 분야에서 이동을 추구하는 1, 2, 3, 4 ,6 및 8주후에 기능적 테스트에 의해 측정한다. 테스트는 Basso-Beattie-Bresnahan (BBB score)로 알려져 있고 21점을 달성하는 신뢰할 수 있고 감각적인 방법이고 중간 및 긴 시간에서 짧은 시간 내에 회복의 반정량적 측정을 제공한다 (Basso, Beattie and Bresnahan, 1995. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21).
정량은 연구의 매시간에서 각 실험군의 BBB scale 값의 통계학적 평균으로서 나타난다.
결과
척수외상 후에 HC016 세포-기반 치료의 적용은 BBB 테스트에서 테스트한 모터 스킬의 회복을 촉진시킨다. 테스트의 규모에 따르면 값은 회복이 손상 후 1, 2, 3, 4, 6 및 8주에서 검사되어 항상 ASC에 근거하는 종래의 치료 중 하나 이상의 점인 것을 나타낸다. 회복 진전은 HC016 세포 치료가 HC016 세포를 사용해 8번째 주에서 획득한 최고점을 얻기 위해 시간을 단축시키는 것을 나타낸다.
Claims (17)
- 중간엽 줄기세포를 획득하고 분리시키는 단계 및 치료 배지에서 세포를 배양하는 단계로 이루어진, 중간엽 줄기세포의 치료방법에서, 상기 치료 배지는 산화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 중간엽 세포는 지방 조직, 골수, 탯줄 및/또는 태반으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
- 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 중간엽 세포는 인간 지방 조직으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
- 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 산화제는 과산화수소 (H2O2), 과산화칼슘 (CaO2), 과산화마그네슘 (MgO2), 과산화아연 (ZnO2), 과산화망간 (MnO2), 과산화납 (PbO2) 및 산화질소 (NO), 아산화질소 (N2O), 오존 (O3), 과붕산나트륨 (NaBO3), 이산화셀레늄 (SeO2), 산화은 (Ag2O), 염화제2철 (FeCl3)과 같은 철염, 과탄산나트륨 (2Na2CO3)과 같은 구리염, 과망간산칼륨 (K2Mn2O8)과 같은 과망간산염, 중크롬산칼륨 (K2Cr2O7)과 같은 중크롬산염, 차아염소산 (HClO-)의 리튬, 나트륨 및 칼슘염, 아염소산나트륨 (NaClO2), 염소산 (HClO3), 염소산칼륨 (KClO3), 수산화알루미늄 (Al2O3), 탄산마그네슘 (MgCO3)으로 공침된 수산화알루미늄, 3산화비소 (As(OH)3), 과산화벤조일 (C6H5CO)2O2), 수산화칼슘 (Ca(OH)2), 클로로디아제폭사이드염산염, 산화제2구리 (CuO), 산화철, 산화마그네슘 (MgO), 이산화마그네슘, 수산화 마그네슘 (Mg(OH)2), 수산화칼륨 (KOH), 수산화나트륨 (NaOH), 산화티타늄 (TiO2) 및/또는 산화아연 (ZnO)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
- 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료 배지에서 세포의 배양은 실험적 지지체 중에서 48-72 시간의 두번의 연속 치료 주기에 이어서 24-48 시간동안 3차 전-조건 주기를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
- 제 5항에 있어서, 치료 배지에서 세포의 배양은:
a) 1차주기: 배양 표면에 세포를 접종하고 상기 세포에 대해 4와 8시간 사이동안 조건 시간을 허용하여 그들의 통상적인 형태로 접착시켜서 획득하는 단계;
b) 0.01와 0.05 mM 사이의 최종 H2O2 농도에 도달할 때까지 상기 치료 배지를 첨가하는 단계;
c) 37℃ 및 5% CO2 분위기의 인큐베이터 내부에서 48-72 시간 동안 유지시키는 단계;
d) 2차주기: 0.01와 0.05 mM 사이의 최종 H2O2 농도에 다시 도달할 때까지 치료 배지를 갱신하는 단계;
e) 이들 세포를 37℃에서 48-72 시간동안 5% CO2로 배양하는 단계;
f) 3차주기: 한번 더 0.01와 0.05 mM 사이의 최종 H2O2 농도에 도달할 때까지 상기 배지를 다시 적용시켜 치료 배지를 갱신하는 단계;
g) 이들 세포를 37℃에서 24-48 시간동안 5% CO2로 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료방법. - 제 6항에 있어서, 단계 b), d) 및 f)에 사용되는 상기 치료 배지는 85-95%의 통상적인 세포 배양 배지, 5-15%의 소아태혈청, 0.5-5%의 항생 물질 및 0.01-0.05 mM의 과산화수소를 포함하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
- 세포가 PCR 방법에 의해 측정되는 비치료 (non treated) ASC와 관련하여 적어도 30%의 SOD1 유전자 발현의 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로부터 직접적으로 얻어지는 중간엽 줄기세포.
- 제 8항에 있어서, 상기 세포가 PCR 방법에 의해 측정되는 비치료 ASC와 관련하여 적어도 25%의 SOD2 유전자 발현의 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
- 제 9항에 있어서, 상기 세포가 PCR 방법에 의해 측정되는 비치료 ASC와 관련하여 적어도 50%의 SOD3 유전자 발현의 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
- 제 10항에 있어서, 상기 세포가 PCR 방법에 의해 측정되는 비치료 ASC와 관련하여 적어도 50%의 Cat 유전자 발현의 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
- 제 11항에 있어서, 상기 세포가 티체 (Tietze) 효소 방법에 의해 측정되는 비치료 ASC와 관련하여 적어도 8%의 GSH의 세포내 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
- 제 12항에 있어서, 상기 세포가 DCFA 프로브를 사용하는 형광 정량 방법에 의해 측정되는 비치료 ASC와 관련하여 적어도 10%의 MROs의 세포내 수준의 감소를 나타내는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
- 제 13항에 있어서, 상기 세포가 PCR 방법에 의해 측정되는 비치료 ASC와 관련하여 적어도 40%의 베타-액틴의 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
- 제 14항에 있어서, 상기 세포가 PCR 방법에 의해 측정되는 비치료 ASC와 관련하여 적어도 40% IGF-1의 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포.
- 산화적 스트레스와 관련되거나 야기되는 질환 및/또는 산소 활성 종-매개 화합물로 인한 퇴행성 진화 조건의 치료를 위한 약제로 제조하기 위한 제 8항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 따른 세포의 용도.
- 결정성 동맥위주염, 진성 당뇨병, 만성 육아종성, 동맥경화증, 뇌졸중, 섬유증 (만성 폐쇄성 폐질환, COPD, 특발성 폐섬유증), 허혈-재관류 증후군, 알츠하이머병, 파키슨병, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 염증성 장 질병: 궤양성 대장염 및 크론병, 성인 호흡 곤란 증후군, 죽상동맥경화증, 척수외상, 말초 신경 손상, 근위축성 측색 경화증, 헌팅턴 질환, 프리드라이히 운동실조, 치주염, 점막 질환 및 염증성 성분, 급성 및 만성 궤양 및 상처로 발생되는 질환 및 부상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한 제 16항에 있어서의 세포의 용도.
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