KR100990436B1

KR100990436B1 - 중간엽 줄기세포를 ＤＫＫ-1 또는 ｓＦＲＰ-1을 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR100990436B1
Application number: KR1020090117288A
Authority: KR
Inventors: 임군일
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-11-30
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2010-10-29
Also published as: WO2011065661A2; WO2011065661A3

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 연골세포 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 중간엽 줄기세포를 wnt 신호전달 억제제인 DKK-1 또는 sFRP-1존재 하에서 배양하는 연골세포 분화 유도 방법 및 상기 방법으로 분화된 연골세포를 함유하는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 연골세포로의 분화 방법은, 세포배양 초기의 DKK-1 또는 sFRP-1 처리만으로 중간엽줄기세포의 초기 세포 분화시 다른 세포로의 분화를 막아 연골세포를 보다 쉽게 얻을 수 있게 하는 것이다.

연골세포, DKK-1, sFRP-1

Description

중간엽 줄기세포를 ＤＫＫ-1 또는 ｓＦＲＰ-1을 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법{Chondrogenesis of Mesenchymal Stem Cells using DKK-1 or sFRP-1}

본 발명은 조직공학 또는 세포치료제로서 연골을 제작하는 방법에 관한 것으로, 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

관절 연골은 인체 조직 중 체중의 부하가 가장 큰 조직으로 마모로 인한 손상에 쉽게 노출된다. 관절 연골은 유리 연골(hyaline cartilage)로서 연골세포와 풍부한 세포외기질로 이루어져 있다. 연골세포는 연골 총부피의 10% 미만을 차지하고 있으며, 세포외기질을 합성, 분비하므로 관절 연골의 유지에 중요한 역할을 한다. 노화에 따른 연골세포 수 및 연골세포 대사작용의 감소는 유병률이 높은 노인성 질환인 골관절염의 병인 중의 하나로 생각되고 있다(Bobacz K et al, Ann Rheum Dis, Dec, 63(12), pp.1618-1622, 2004). 또한, 특이하게 관절 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다. 현재의 의학적 방법으로는 관절 연골을 정상적으로 재생할 수 있는 방법이 매우 제한적이다.

자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 최근 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나 연골의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없다는 것, 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다. 이와 같은 문제점을 해결하고 보다 예측 가능하고, 보다 안전한 수술 방법을 개발하고자 하는 노력이 바로 연골의 조직공학적 재생이다(kang et al. Tissue Engineering, 11(3-4), pp.438-447, 2005).

인공연골의 제작에 관한 연구가 이미 외국에서 활발하게 수행 중이며, 유럽에서는 이미 연골세포운반체와 함께 연골세포를 이식하는 치료법이 사용되고 있는 실정이다 (Meyer U et al, Eur Cell Mater, Apr 26(9), pp.39-49, 2005).

줄기세포에서 분화된 연골세포의 조직공학적 관절연골 제작은 중심 요인들인 연골세포화된 줄기세포, 생분해성 지지체가 필수적이고 연골 세포화된 줄기세포는 골수로부터 단일핵 세포를 분리 후 배양하면서 연골세포로 분화를 유도한다. 이상적인 연골세포는 증식능력이 좋아야 하며, 연골세포의 특이 표현형인 콜라젠 타입(collagentype) II를 유지하는 세포이다.

한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell:MSC)는 여러종류의 결합조직의 수선세포(repair cell)로 알려져 있으며, 이들 세포는 중간엽계의 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다. 중간엽 줄기세포를 관절연골의 손상을 치유하는 데 사용하기 위해서는 생체 내 및 실험실 내에서 줄기세포를 직접적으로 연골세포주로 분화시키는 효율적이면서도 잘 정리된 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 이러한 미분화된 중간엽 줄기세포는 복구된 조직의 장기간 동안의 안정성에 대한 정보가 부족 하고, 다른 형태의 세포로 분화하는 경향에 의해서 생체 내에서 이형조직이 형성될 위험이 있기 때문에 그 이용이 제한적이다(De Bari, C et al., Arthritis Rheum, 50:142, 2004).

유전적 재조합을 하지 않거나 미분화된 중간엽 줄기세포를 무릎 관절에 직접 주사하였을 때, 분화되어 연골조직을 복원시키지 못하고, 오히려 종양을 형성하였다는 보고가 있다(Gilbert, JE et al., Am. J. KneeSurg., 11:42, 1998, Noel, D et al., Stem Cells, 22:74, 2004, Butnariu-Ephrat, Metal., Clin. Orthop.Relat., 330:234, 1996).

본 발명의 일 실시예에 따르면, Wnt 신호전달 억제제인 DKK-1 또는 sFRP-1을 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 단계 초기에 처리하여, 효율적으로 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예는 중간엽줄기세포를 배양시작시부터 2 내지 8일간 DKK-1 또는 sFRP-1의 존재 하에서 배양하는 것을 포함하는 연골세포로의 분화 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 일 실시예는 중간엽줄기세포를 배양시작시부터 2 내지 8일간 DKK-1 또는 sFRP-1의 존재 하에서 배양하는 것을 포함하는 연골세포로의 분화 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 함유하는 연골손상 질환 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 일 실시예는 중간엽줄기세포를 배양시작시부터 2 내지 8일간 DKK-1 또는 sFRP-1의 존재 하에서 배양하는 것을 포함하는 연골세포로의 분화 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 일정한 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 계속 배양하는 것을 포함하는 인공관절의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명의 일 실시예는 중간엽줄기세포를 배양시작시부터 2 내지 8일간 DKK-1 또는 sFRP-1의 존재 하에서 배양하는 것을 포함하는 연골세포로의 분화 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 일정한 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 계속 배양 하는 것을 포함하여 제조된 인공관절을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 여러종류의 세포로 분화 가능한 중간엽 줄기세포의 분화 초기에 DKK-1 또는 sFRP-1을 처리함으로써, 연골세포로의 분화를 효율적으로 유도할 수 있다. 이러한 방법으로 제조된 분화된 연골세포는 세포나 조직의 이식을 통한 생물학적인 방법으로 골관절염을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

중간엽 줄기세포로는 윤활막(synovium), 제대혈 또는 지방조직 기원 줄기세포 등의 종류가 있고, 이제 제한되지 않으나, 골수 유래 중간엽 줄기세포를 사용하는 것이 적당하다.

본 발명의 골수로부터 골수기원 중간엽 줄기세포를 분리하기 위해서는 피콜(ficoll)을 이용하여 농도구배 차이를 이용하면 분리하기 용이하다. 분리된 골수기원 중간엽 줄기세포는 2 ~ 5 회, 바람직하게는 3 ~ 4회, 가장 바람직하게는 3 회 계대배양한 것을 연골형성에 사용하는 것이 분화가능한 줄기세포만을 분리한다는 점에서 바람직하다.

본 발명에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법으로는 공지의 3차원 배양방법을 이용할 수 있다. 현재까지 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 3차원 배양방법으로는 펠렛(pellet) 배양과 알지네이트 비드 및 알지네이트 층 배양이 주로 이용되고 있다.

특히, 펠렛 배양은 연골세포의 표현형을 유지시키는데 효과적이고, 원심분리를 통해 쉽게 세포를 응집하여 세포와 세포간의 접합 효과를 유도하여 초기 연골 조직 생성과 비슷한 세포외 환경을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킴에 있어서, DKK-1 또는 sFRP-1존재 하에서 배양하는데, 배양 시작시부터 2일 내지 8일, 3일 내지 7일 처리하는 것이 적당하다.

DKK-1은 간엽줄기세포에서 연골의 분화에 관여하는 Wnt/β-카테닌 신호전달경로의 억제자로, 보조 리셉터인 LRP5/6와 크레멘(Kremen)에 결합하여 Wnt 신호전달경로를 억제한다.

sFRP(secreted frizzled-related protein)-1 은 간엽줄기세포에서 연골의 분화에 관여하는 Wnt/β-카테닌 신호전달경로의 억제자로, Wnt 단백질과 상호작용을 위한 시스틴이 풍부한 도메인을 가지고 있어, Wnt 단백질이 세포막에 있는 프리즐드(Frizzled)라는 수용체나 세포 표면에 있는 보조 리셉터인 LRP5/6과 결합하는 것을 막는다.

Wnt는 지질이 결합된 여러 당단백의 그룹으로서, 세포운명의 결정, 극성, 분화 이동 등 여러 현상에 관여하며 발생에 있어 체간과 사지의 축형성에 중요한 신 호를 보내는 작용을 한다. 태아발생에 있어서 골격의 발생과 형성, 성인에 있어 골격의 재형성에 관여하지만 다른 신호전달체계와의 상호작용관계, 시기와 장소에 따라 상반된 작용을 갖는 복잡한 기전을 가지고 있다.

일반적인 Wnt 신호전달체계는 비교적 간단한데, Wnt가 세포막에 있는 프리즐드(Frizzled)라는 수용체에 결합하면, 이 수용체가 β-카테닌을 분해하는 단백질 복합체에서 axin이라는 보조인자를 유리시켜 세포질내 β-카테닌 농도가 증가되고, β-카테닌이 세포핵내로 들어가 Lef1/Tcf-1이라는 전사인자를 활성화시켜 여러 대상 유전자의 전사를 유도하는 것이다.

이러한 일반적인 Wnt/β-카테닌 신호전달경로는 미분화된 간엽줄기세포에서 골모세포로의 분화를 촉진하고 연골세포로의 분화를 억제하는 자율기전을 구성한다. Wnt가 과잉발현될 경우 골형성의 증가와 연골세포 형성의 억제가 일어나고, 반대로 β-카테닌이 억제될 경우 골모세포분화 대신에 연골세포의 분화가 일어나는 것을 볼 때 β-카테닌의 양이 간엽줄기세포가 골모세포가 될 것인지 연골세포가 될 것인지를 결정한다고 여겨진다.

Wnt/β-카테닌 신호전달체계에서 골형성이 촉진되는 기전으로는 β-카테닌에 의해 활성화되는 Lef1/Tcf-1 전사인자가 골분화에서 가장 중요한 전사인자인 Runx2의 생성을 직접 유도하는 기전이고, 연골형성의 억제는 β-카테닌이 연골형성을 유도하는 전사인자인 SOX-9과 직접 결합하여 불활성화 시키는 기전이다.

Wnt/β-카테닌 신호전달체계에 의한 간엽줄기세포의 세포 분화의 결정은 발생 초기, 짧은 시간내에 강력한 발현에 의하여 결정되는 것으로 알려져 있는 바, DKK-1 또는 sFRP-1을 배양 시작시부터 2일 내지 8일, 3일 내지 7일간 처리하는 것이 좋다. 예를 들어 분리 후 3회 계대배양한 골수기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화하기 위해 3주 배양할 경우, 처음 일주일간만 DKK-1 또는 sFRP-1을 처리하는 것이다. 처리기간이 2일보다 짧으면 Wnt/β-카테닌 신호전달체계의 억제가 효율적으로 일어나지 않고, 처리기간이 8일보다 길면 세포사멸이 일어날 수 있다.

DKK-1 또는 sFRP-1의 양은 50 내지 350ng/ml, 80 내지 320ng/ml, 100 내지 300ng/ml, 150내지 300 ng/ml 이 적당하다.

50ng/ml미만이면 억제효과가 미미하며, 350ng/ml이상이면 불필요한 사용이 된다.

또한, 배양 배지는 인슐린, 덱사메타손, 아스코르베이트 2-포스페이트, L-프롤린 및 소듐 피루베이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 포함하는 것이 좋으며, 각각의 양은 인슐린 0.5 내지 3g/l, 덱사메타손(dexametasone) 10^- ⁶내지 10^-8M, 아스코르베이트 2-포스페이트 10~100mM, L-프롤린 10~100mM 및 소듐 피루베이트 0.5 내지 3mM이 적당하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 방법으로 생산되는 골수기원 중간엽 줄기세포로부터 분화된 연골세포는 연골손상 등을 치료하기 위한 세포대체요법용 세포 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예로 생산된 연골세포를 이용하여 치료할 수 있는 연골손상 질환으로는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 외상에 의한 관절 손상 등이 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 의해 생산된 연골세포를 유효성분으로 하는 치료용 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 관절내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드와 함께 이식될 수도 있으며, 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련인자를 고려하여 투여하는 세포 수를 조절하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 일 실시예는 중간엽줄기세포를 배양시작시부터 2 내지 8일간 DKK-1 또는 sFRP-1의 존재 하에서 배양하는 것을 포함하는 연골세포로의 분화 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 계속 배양하는 것을 포함하는 인공관절의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명의 일 실시예는 중간엽줄기세포를 배양시작시부터 2 내지 8일간 DKK-1 또는 sFRP-1의 존재 하에서 배양하는 것을 포함하는 연골세포로의 분화 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 것을 포함하여 제조된 인공관절을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의해 분화된 연골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 통상의 방법을 사용하여 일정 형태의 인공연골을 얻을 수 있으며, 이를 이용하여 인공관절 또는 귀나 코의 성형에 사용되는 인공연골을 제조할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제조예, 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 제조예 1> 간엽줄기세포 샘플 획득, 세포분리 및 배양

간엽줄기세포 분리에 사용된 골수 샘플은 관절염으로 인해 인공고관절 전치환수를 시행받는 세명의 환자(평균나이: 50세, 37~64세)로부터 획득되었다. 골수로부터 간엽줄기세포를 분리한 후, 증식시켰다. 2회 계대배양한 후, 90% 우태혈청(Gibco BRL, Green Island, NY)과 10% 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 포함하는 냉동보존용 배지에서 세포증식을 중지시켰다. 이후의 실험에서는, 이 세포를 녹이고, 백만개의 세포를 1.2 *10⁴세포/㎠의 밀도로 10% 우태혈청과 1% 항생물질(100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신, 0.25mg/ml 암포테리신 B; Gibco BRL, Green Island, NY)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F- 12 배지(Gibco BRL, Green Island, NY)에 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 접종하여 사용하였다.

< 제조예 2> 펠렛 배양 ( Pellet culture )

연골발생을 유도하기 위해서, in vitro 펠렛 배양을 3회 계대배양 한 2*10⁵ 간엽줄기세포에 대해 준비하였는데, 대조군(비교예 1)에는 1% ITS(인슐린 1g/l), 10^-7 M 덱사메타손(dexamethasone), 50 mM 아스코르베이트 2-포스페이트(ascorbate-2-phosphate), 50 mM L-프롤린, 및 1mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)가 보충된 DMEM/F-12 배지를 사용하였다. 실험군(실시예1 내지 6)의 배지에는 100(실시예 1), 200(실시예 2) 및 300(실시예 3)ng/ml의 DKK-1, 100(실시예 4), 200(실시예 5) 및 300(실시예 6)ng/ml의 sFRP-1을 추가하였다.

3일과 6일 후 분석을 위해 펠렛을 회수하였다. 펠렛 배양을 위해 1ml 세포 부유액을 15ml 폴리프로필렌 원심분리용 튜브에 넣고 원심분리기에 500g 로 5분간 원심분리하였다. 그 후 튜브는 37℃, 5% 이산화탄소 존재하는 인큐베이터에 보관하였다.

<표 1> 각 시험군의 배지조성

	비교예1	실시예1	실시예2	실시예3	실시예4	실시예5	실시예6
DMEM/F-12 배지, ITS, 덱사메타손, 아스코르베이트 2-포스페이트, L-프롤린, 소듐 피루베이트	○	○	○	○	○	○	○
DKK-1의 양(ng/ml)	0	100	200	300	0	0	0
sFRP-1의 양(ng/ml)	0	0	0	0	100	200	300

< 실험예 1> 세포 생존력 변화 검토

세포 생존력 변화를 측정하기 위해, Alamar Blue 분석법이 수행되었다. 이 분석법은 세포 성장으로 인해 생성된 성장배지의 화학적 환원에 반응하여 핑크색 형광 염료 레소루핀(resorufin)으로 변하는 파란색 비형광 염료 레사주린(resazurin)을 이용하여 세포 생존력을 측정하는 것이다.

3회 계대배양한 간엽줄기세포를 5*10⁴세포/30㎕/웰의 밀도로 98개의 평판 웰에 분배하였다. 대조군(비교예 2)은 10% 우태혈청과 1% 항생물질(100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신, 0.25mg/ml 암포테리신 B; Gibco BRL, Green Island, NY)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F-12 배지(Gibco BRL, Green Island, NY)에 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 배양하였다.

다른 실험군(실시예 7 내지 12)은 대조군(비교예 2)의 배지에 100(실시예 7), 200(실시예 8) 및 300(실시예 9)ng/ml의 재조합 DKK-1(R&D Systems, Minneapolis, MN), 100(실시예 10), 200(실시예 11) 및 300(실시예 12)ng/ml의 재조합 sFRP-1(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 추가한 각각의 배지로 처리되었다. 각각의 실험군마다 3번씩 배양하였고, 배지는 3일마다 교체하였다. 배양 후 3일과 6일이 지난 후, 10㎕ Alamar Blue^TM 용액(Biotium, Hayward, CA)을 첨가하였고, 그 후 37℃의 인큐베이터에서 4시간동안 배양하였다.

흡광도는 570과 600nm에서 마이크로리터 평판 리더(microliter plate reader)로 측정하였다. OD₅₇₀-OD₆₀₀을 매 시료마다 측정하였고, 표준곡선을 통해 세포수를 유추하였다. 각각의 실험군별 세포수는 대조군에 의해 분리되었고, 결과는 대 조군 대비 퍼센트로 나타냈다.

<표 2> DKK-1 또는 sFRP-1 처리에 따른 세포 생존력 변화

	대조군(비교예2)	DKK-1 100ng/ml (실시예7)	DKK-1 200ng/ml (실시예8)	DKK-1 300ng/ml (실시예9)	sFRP-1 100ng/ml (실시예10)	sFRP-1 200ng/ml (실시예11)	sFRP-1 300ng/ml (실시예12)
3일 후(%)	100	98.7±1.4	96.1±2.1	93.9±0.7	95.6±2.9	94.5±0.7	97.6±0.9
6일 후(%)	100	97.1±2.2	97.7±2.8	93.1±2.5	97.7±5.5	97.7±8.1	98.9±4.5

세포 생존률은 3일, 6일 배양 후 모두 7%정도 감소된 것으로 나타났으며, 3일배양한 실험군과 6일 배양한 실험군 사이에 주목할만한 차이는 존재하지 않았다. DKK-1 양이 증가함에 따라 세포 생존력도 이에 비례하여 감소하였으며 sFRP-1 양과는 무관하게 세포 생존력의 변화가 나타났다. 그러나 전체 생존력 감소율은 매우 미미한 것으로 나타났다.

< 실험예 2> DNA 정량분석

배양후 3일, 6일이 지난 비교예 2, 실시예 7 내지 실시예 12의 펠렛은 60℃의 파파인(papain) 완충용액에 하룻밤동안 처리되었다. 그 후 DNA량은 Quant-iT^TM dsDNA 분석키트와 큐빗(Qubit) 형광 강도 측정 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 측정하였다.

<표 3> DKK-1 처리에 따른 DNA 함량 변화

	대조군(비교예2)	DKK-1 100ng/ml (실시예7)	DKK-1 200ng/ml (실시예8)	DKK-1 300ng/ml (실시예9)	sFRP-1 100ng/ml (실시예10)	sFRP-1 200ng/ml (실시예11)	sFRP-1 300ng/ml (실시예12)
3일 후	0.321±0.070	0.315±0.106	0.283±0.062	0.279±0.066	0.333±0.039	0.299±0.077	0.300±0.073
6일 후	0.303±0.058	0.370±0.077	0.307±0.116	0.282±0.084	0.316±0.100	0.291±0.098	0.246±0.036

DNA 양은 DKK-1을 300ng/ml 처리하였을 때 대조군에 비해 13% 감소하였고, sFRP-1을 300ng/ml 처리하였을 때는 대조군에 비해 19% 감소하였다. 그러나 100ng/ml를 처리하였을 때는 변화가 없거나 오히려 더욱 증가하였다.

< 실험예 3> RT - PCR 을 통한 β- 카테닌 유전자 발현양 조사

배양 후 3일, 6일이 지난 비교예 1, 실시예 1내지 실시예 6에 대해 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 β-카테닌의 발현 억제정도를 조사하였다.

총 RNA는 표준 구아니딘 이소싸이오시아네이트(guanidine isothiocyanate) Tri-Reagent®(sigma chemical, St. Louis, MO)를 사용하여 분리하였고, Quant-iT^TM RNA 분석키트와 큐빗(Qubit) 형광 강도 측정 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 정량하였다. RT-PCR을 위해 RevertAid^TM H Minus first-strand 합성 시스템(Fermentas, Hanoveer, MD)을 사용하여 총 RNA 1㎍을 올리고(dT)프라이머 0.5㎍와 함께 역전사시켰다. 모든 PCR은 LightCycler 480 system®(Roche)로 수행하였다. 표준 10㎕ 반응은 4.5㎕(10ng) cDNA, 0.5㎕ 100mM 주가닥, 0.5㎕ 100mM 보조가닥 프라이머 및 4.5㎕ LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster Mix (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)로 수행하였다.

온도는 52℃, 프라이머의 서열은 5'-CAAGTGGGTGGTATAGAGG-3', 5'-GCGGGACAAAGGGCAAGA-3'를 사용했다.

글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로나아제(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)에 대한 C_t값이 표준화를 위한 기준으로 사용되었다. 따라서 대조군 대비 표준화가 이루어졌다. 각 환자에게서 체취된 간엽줄기세포당 세번씩 실험을 수행하였다.

도 1에 개시된 바에 따르면, 실험 결과 β-카테닌 유전자 발현은 배양 후 6일째가 배양 후 3일째보다 낮게 나타났으며, DKK-1또는 sFRP-1은 β-카테닌 유전자 발현에는 그다지 큰 영향을 미치지 못함을 알 수 있었다.

< 실험예 4> 웨스턴 블롯을 통한 β- 카테닌 단백질 발현량 조사

6일간 배양한 비교예 1, 실시예 2 및 실시예 5에 대해 β-카테닌(catenin)의 단백질 발현양을 알아보기 위해서 웨스턴 블롯을 통해 이를 분석하였다.

총 단백질을 추출하기 위해서, 세포를 차가운 인산염 완충용액으로 두번 세척하고, 25mM 50㎕ RIPA 완충용액(25mM 트리스-염산, pH7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 에틸렌다이아민테트라아세트산 제외된 단백질 분해효소 억제제)으로 세포증식을 억제시켰다. 용해질을 얼음에 녹이고, 단백질을 침전시키기 위해 12,000g로 10분동안 원심분리시켰다. 단백질 양은 큐빗(Qubit) 분석키트(Qubit fluoromoter; Invitrogen)를 사용하여 당업자 에게 알려진 통상의 방법으로 측정하였다. 단백질 추출물(20g)을 10% SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동시켰다.

분리된 단백질은 Bio Trace^TM NT 니트로셀룰로오스 이동막에 전기영동되었다. 막(Pall Life Science, East Hills, NY)은 0.1% TBS-T(tween-20)를 함유하고 있는 트리스 완충 용액(TBS)으로 세척한 후 2.5% 무지방 가루우유(BioRad, Hercules, CA)를 함유하고 있는 TBS-T를 한시간동안 처리하였다. TBS-T로 막을 세번 세척한 후, TBS-T에 있는 1차 항체를 부가하고 2시간동안 배양하였다. 그 후 TBS-T로 3번 막을 씻고, TBS-T에 있는 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)결합된 2차 항체를 1시간 처리하였고, 막을 씻는 과정을 반복하였다. 세번 세척한 후, 단백질 띠를 화학 발광 웨스턴 블롯 분석 시스템(Amersham, Seoul, Korea)으로 관찰하였다.

결과를 정량화하기 위해, 단백질 띠를 Multi Gauge 소프트웨어(Fujifilm, Tokyo, Japan)으로 디지털화하였고, 내부 대조군으로 쓰인 β-액틴으로 표준화하였다. 1차 항체는 TBS-T/2.5% 무지방 건조우유에 각각 1:1000으로 희석된 쥐의 β-카테닌 단일 클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및 쥐의 안티 β-액틴 항체(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하였다.

이차 항체는 TBS-T/2.5% 무지방 건조우유에 1:2000으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)에 결합된 염소의 토끼, 쥐의 IgG에 대한 항체를 사용하였다.

각 환자에게서 체취된 간엽줄기세포당 세번씩 실험을 수행하였다.

도 2에 개시된 바에 따르면, 실험 결과 β-카테닌 유전자 발현에는 DKK-1및 sFRP-1이 큰 영향을 미치지 못했지만, 단백질 발현양에 있어서는 DKK-1또는 sFRP-1의 처리가 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.

β-카테닌 단백질 발현양은 DKK-1또는 sFRP-1 200ng/ml의 처리에 의해 각각 약 10%, 약 17% 감소되었다.

< 실험예 5> β- 카테닌에 대한 면역 조직화학 염색

배양 후 6일이 지난 비교예 1, 실시예 2 및 실시예 5의 펠렛을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 4시간동안 고정시키고 100% 및 95% 에탄올로 탈수시킨 후, 자일렌(xylene)으로 세척하였다. 그 후 파라핀에 고정시켰다. 그 후 β-카테닌(catenin)의 면역 조직화학(immunohistochemistry) 염색을 수행하였다.

면역 조직화학염색을 위해서 Dakocytomation LSAB2 시스템 HRP 키트(DAKO, Hambrug, Germany)을 사용하였다.

β-카테닌(catenin)을 검출하기 위해서, 이에 항체를 10mM 시트르산 완충용액(pH 6.0)과 함께 마이크로웨이브 오븐을 사용하여 15분간 처리하였다. 그 후 슬라이드를 1x세척 완충용액(DAKO)로 세척하였다. 이어서 퍼옥시다아제가 없는 용액과 5분간 배양하였다. 염소 혈청에 있는 쥐의 사람 β-카테닌에 대한 단일 클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)가 1:50으로 희석되었고, 4℃에서 하루밤동안 대상 부분과 반응시켰다. 1x세척 완충용액(DAKO)으로 3번 세척한 후 양 고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)결합된 2차 항체(DAKO)를 30분동안 처리하였다. 충분히 씻은 후, 대상부분을 기질 완충액과 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine) 색원체(DAKO, 50:1)과 1 내지 30분 반응시키고 고정하였다.

도 3에 개시된 바에 따르면, DKK-1 또는 sFRP-1 200ng/ml의 처리로 인해 β-카테닌의 양이 감소한 것을 알 수 있다.

< 실험예 6> 글루코사미노글리칸 ( Glucosaminoglycan : GAG ) 측정

배양후 3일, 6일이 지난 비교예 1, 실시예 1내지 실시예 6의 펠렛은 GAG의 양을 측정하기 위해 60℃의 파파인(papain) 완충용액에 하룻밤동안 처리된 후 블리스칸(Blyscan) 키트(Biocolor, Carrickfergus, United Kingdom)를 사용하여 측정하였다.

GAG의 양은 소의 기관에서 추출된 콘드로이틴 4-설페이트를 함유하는 표준용액으로 그려진 표준곡선을 통해 유추하였다.

흡광도는 Spectra max plus 348(Molecular Devics, Sunnyvale, CA)를 이용하여 656nm에서 측정하였다. 그 수치를 DNA양으로 나누어서 세포당 글루코사미노글리칸의 양을 측정하였다.

도 4에 개시된 바에 따르면, 배양 후 6일이 지난 세포에서의 GAG 발현양이 3일 후보다 더 높게 나타났고, 300ng/ml의 DKK-1 또는 sFRP-1을 처리한 경우에 효과가 가장 크게 나타났음을 알 수 있다.

< 실험예 7> 사프라닌 -O염색

배양 후 6일이 지난 비교예 1, 실시예 1내지 실시예 6의 펠렛을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 4시간동안 고정시키고 100% 및 95% 에탄올로 탈수시킨 후, 자일렌(xylene)으로 세척하였다. 그 후 파라핀에 고정시켰다. 그 후 프로테오글리칸(proteoglycan)의 사프라닌-O 염색을 수행하였다.

사프라닌-O 염색을 위해서, 견본을 자일렌과 에탄올로 탈파라핀화하였다. 이에 Fast green(FCF) 용액(0.02%)와 수성 사프라닌-O(0.1%)를 5분간 가한 후, 고정시켰다.

도 5를 참조하면, DKK-1또는 sFRP-1의 양에 따라 증가된 색상변화를 확인할 수 있다.

< 실험예 8> COL2A1 과 SOX -9에 대한 RT - PCR

배양 후 지난 비교예 1, 실시예 1내지 실시예 6에 대해 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 COL2A1과 SOX-9 유전자 발현정도를 조사하였다.

실험 방법은 <실험예 3>과 동일하나, COL2A1에 대해서 실험할 때 온도는 55℃, 프라이머의 서열은 5'-CAACATGGAGACTGGCGAGAC-3', 5'ACAGCAGGCGTAGGAAGGTCA-3'를 사용하였고, SOX-9에 대해서 실험할 때는 55℃, 프라이머의 서열은 5'-GGAGCTCGAAACTGACTGGAA-3', 5'-GAGGCGAATTGGAGAGGAGGA-3'를 사용하였다.

결과를 도 6에 나타내었다. DKK-1 COL2A1유전자 발현을 현저하게 증가시켰으며, 효과는 200ng/ml일 때 가장 크게 나타났다.

sFRP-1도 COL2A1 유전자 발현을 현저하게 증가시켰으며, sFRP-1양이 증가함에 따라 효과는 더욱 크게 나타났다.

SOX-9에 대한 유전자 발현은 DKK-1또는 sFRP-1양이 증가함에 따라 같이 증가하였다.

< 실험예 9> COL2A1 과 SOX -9에 대한 웨스턴 블롯 및 면역조직화학 염색

배양 후 6일이 지난 비교예 1, 실시예 2및 실시예 5에 있어서, COL2A1과 SOX-9에 대한 웨스턴 블롯 및 면역조직화학 염색을 수행하였다.

웨스턴 블롯에 대한 실험 방법은 <실험예 4>와 동일하나, COL2A1에 대해 실험시에는 1차 항체로 TBS-T/2.5% 무지방 건조우유에 각각 1:1000으로 희석된 쥐의 닭의 콜라겐 타입 2(COL2A1)에 대한 단일 클론 항체(Chemicon, Temecula, CA)및 쥐의 안티 β-액틴 항체(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하였다.

SOX-9에 대해 실험할때는 1차 항체로 TBS-T/2.5% 무지방 건조우유에 각각 1:2000 및 1:1000으로 희석된 토끼의 SOX-9 복합 클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및 쥐의 안티 β-액틴 항체(Sigma, St. Louis, MO)를 사용하였다.

면역 조직화학을 위해서 Dakocytomation LSAB2 시스템 HRP 키트(DAKO, Hambrug, Germany)을 사용하였다. COL2A1 항원을 복구하기 위해서, 대상부분을 COL2A1 항체로 처리한 후 Pepsin Soluble®(DBS, Pleasanton, CA)를 15분간 37℃에서 처리하였다. SOX-9을 검출하기 위해서, 이에 항체를 10mM 시트르산 완충용액(pH 6.0)과 함께 마이크로웨이브 오븐을 사용하여 15분간 처리하였다. 그 후 슬라이드를 1x세척 완충용액(DAKO)로 세척하였다. 이어서 퍼옥시다아제가 없는 용액과 5분간 배양하였다. 염소 혈청에 있는 쥐의 닭의 콜라겐 타입 2(COL2A1)에 대한 단일 클론 항체(Chemicon, Temecula, CA) 및 토끼의 사람 SOX-9에 대한 복합 클론 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)는 각각 1:100, 1:500으로 희석되었고, 4℃에서 하루밤동안 대상 부분과 반응시켰다. 1x세척 완충용액(DAKO)으로 3번 세척한 후 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)결합된 2차 항체(DAKO)를 30분동안 처리하였다. 충분히 씻은 후, 대상부분을 기질 완충액과 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine) 색원체(DAKO, 50:1)과 1 내지 30분 반응시키고 고정하였다.

웨스턴 블롯 결과를 도7(a)에, 면역조직화학 염색 결과를 도 7(b)에 나타내었다.

도 7(b)를 보면, DKK-1 또는 sFRP-1 200ng/ml의 처리로 인해 COL2A1과 SOX-9의 양이 증가한 것을 볼 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 DKK-1 또는 sFRP-1의 처리에 따른 β-카테닌의 유전자 발현양을 나타내는 그래프이다. (a)가 DKK-1에 의한 것, (b)가 sFRP-1에 의한 것이다.

도 2는 DKK-1 또는 sFRP-1의 처리에 따른 β-카테닌의 단백질 발현양을 나타내는 그래프이다. (a)는 웨스턴 블롯의 결과, (b)는 이를 그래프화 한 것이다.

도 3은 DKK-1 또는 sFRP-1의 처리에 따른 β-카테닌 양을 알아보기 위한 면역 조직화학 염색의 결과 사진이다.

도 4는 DKK-1 또는 sFRP-1의 처리에 따른 GAG의 양을 나타낸 그래프이다. (a)가 DKK-1에 의한 것, (b)가 sFRP-1에 의한 것이다.

도 5는 사프라닌-O염색의 결과 사진이다. (a)가 DKK-1에 의한 것, (b)가 sFRP-1에 의한 것이다.

도 6은 DKK-1의 처리에 따른 연골분화시 필수적인 단백질 유전자 발현의변화를 나타내는 그래프이다. (a)는 COL2A1에 관한 것, (b)는 SOX-9에 관한 것이다.

도 7의 (a)는 COL2A1과 SOX-9에 대한 웨스턴 블롯의 결과, 도7(b)는 면역조직화학 염색 결과 사진이다.

Claims

중간엽줄기세포를 배양시작시부터 2 내지 8일간 DKK-1 또는 sFRP-1 존재 하에서 배양하는 것을 포함하는 연골세포로의 분화 방법.
제 1항에 있어서,

중간엽줄기세포는 골수 유래인 연골세포로의 분화 방법.
제 1항에 있어서,

상기 DKK-1 또는 sFRP-1의 양은 50 내지 350 ng/ml인 연골세포로의 분화방법.
제 1항에 있어서,

배양 배지는 인슐린, 덱사메타손, 아스코르베이트 2-포스페이트, L-프롤린 및 소듐 피루베이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 포함하는 것인 연골세포로의 분화 방법.
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중간엽줄기세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따라 배양하여 연골세포로 분화하는 단계; 및

상기 연골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 단계를 포함하는 인공관절의 제조방법.
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