ES2613965T3 - Extractos celulares - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de fabricación de extractos de huevos de anfibio o pez que comprende: a) proporcionar huevos seleccionados entre el grupo que consiste en huevos de anfibio y pez; b) procesar dichos huevos para proporcionar una fracción citoplasmática de dichos huevos; c) tratar dicha fracción citoplasmática para impedir el crecimiento de bacterias por calentamiento de dicho extracto a una temperatura de 50 ºC a 90 ºC durante un periodo de tiempo superior a un minuto.

Description

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En el contexto de ciertas realizaciones, "adherirse a la piel" significa pegar o sujetar con o como si estuviera con cualquiera de diversos adhesivos, tales como, pegamento, pasta o mucílago.

Un "lípido" significa cualquiera de un grupo de compuestos orgánicos, incluyendo las grasas, aceites, ceras, esteroles y triglicéridos que son insolubles en agua pero solubles en disolventes orgánicos no polares y son oleosos al tacto. Las clases principales de lípidos incluyen los ácidos grasos, los lípidos derivados de glicerol (incluyendo las grasas y aceites y los fosfolípidos), los lípidos derivados de esfingosina (incluyendo las ceramidas, cerebrósidos, gangliósidos y esfingomielinas), los esteroides y sus derivados, los terpenos y sus derivados, ciertos compuestos aromáticos y alcoholes de cadena larga y ceras. En los organismos vivos, los lípidos sirven como base de las membranas celulares y como forma de almacenamiento de combustible. A menudo los lípidos se encuentran conjugados con proteínas o carbohidratos, y las sustancias resultantes se conocen como lipoproteínas y lipopolisacáridos. Las vitaminas liposolubles se pueden clasificar como lípidos. Los liposomas son vesículas esféricas formadas mezclando lípidos con agua o soluciones acuosas. Se han encontrado aplicaciones en la administración oral de algunos fármacos (por ejemplo, insulina y algunos fármacos contra el cáncer), ya que conservan su integridad hasta que se descomponen por las lipasas en el estómago y el intestino delgado.

En el contexto de cierta realización, una "capa de gel nutriente" significa un gel que comprende sustancias contenidas por lo general en un medio de crecimiento.

En el contexto de ciertas realizaciones, "célula especializada" de un sujeto significa que la célula tiene marcadores inmunoidentificativos característicos, de tal manera que la diferenciación de estas células y la exposición a tejidos de los sujetos se puede realizar en condiciones tales que el sistema inmunológico no genere anticuerpos para las células diferenciadas. Por ejemplo, cuando los glóbulos rojos que llevan uno o ambos antígenos A o B están expuestos a los anticuerpos correspondientes, se aglutinan; es decir, se agrupan. Las personas normalmente tienen anticuerpos contra esos antígenos de glóbulos rojos de los que carecen. Por lo tanto, los glóbulos rojos especializados del sujeto podrían ser los del tipo sanguíneo apropiado. La causa del rechazo al trasplante es el reconocimiento de antígenos de MHC extraños por parte de los linfocitos T y la activación de esos linfocitos T para convertirse en linfocitos T citotóxicos o auxiliares efectores. La activación de los linfocitos T se produce en el caso de los injertos vascularizados de células nucleadas que expresan alelos de MHC de la Clase I de Emparejamiento de MHC (especialmente HLA-B) y HLA-DR de la Clase II es más importante para el trasplante satisfactorio que el emparejamiento con otros antígenos de MHC; y el emparejamiento con MHC es más importante que el emparejamiento con antígenos de histocompatibilidad menores. Por lo tanto, las células presentadoras de MHC especializadas del sujeto podrían ser aquellas que presenten alelos de MHC coincidentes.

El término "gestionar", cuando se usa en relación con una enfermedad o afección, significa proporcionar efectos beneficiosos a un sujeto al que se le está administrando un agente profiláctico o terapéutico, que no da como resultado a una cura de la enfermedad.

En ciertas realizaciones, a un sujeto se le administran uno o más agentes profilácticos o terapéuticos para gestionar una enfermedad con el fin de impedir la evolución o empeoramiento de la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, los términos "impedir" y "que impide" incluyen impedir la recurrencia, propagación o inicio. No se pretende que la presente invención se limite a impedir completamente. En algunas realizaciones, el inicio se retrasa, o se reduce la gravedad de la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratar" y "que trata" no se limitan al caso en el que el sujeto (por ejemplo, el paciente) se cura y se erradica la enfermedad. En su lugar, la presente invención también contempla un tratamiento que simplemente reduce los síntomas y/o retrasa la evolución de la enfermedad.

En el contexto de ciertas realizaciones, una "capa impermeable" significa un material o tejido que es sustancialmente impermeable al agua o una capa de un agente de sellado con el fin de impedir una penetración sustancial por el agua.

Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo de transporte" incluye sustancias capaces de ayudar a la penetración de piel intacta o células de la piel u otras células somáticas. La expresión "vehículo de transporte" se usa como sinónimo con la expresión "agentes permeabilizantes". Tales vehículos de transporte incluyen, pero no se limitan a: fosfolípidos, palmitilmiristiratos, DMSO, suspensiones o matriz de polímero o de quitosano, liposomas, péptidos Trojan, péptidos Chariot, pequeñas vesículas elásticas, microesferas (vectores funcionalizados obtenidos a partir de materiales derivados naturales como colágeno, glicosaminoglicanos, sulfato de condroitina, quitosano o polisacáridos), nanopartículas (transporta sustancias lipofílicas y aumenta la biodisponibilidad del material encapsulado en la piel), perlas y esponjas esféricas cargadas previamente, vesículas uni y/o multilamelares (estabilizan los contenidos de extractos en la base de crema y ayudan en el transporte en la piel), fluido de película molecular de retinol (película de monocapa uniforme fina que facilita la transferencia de agentes activos a través del estrato córneo), poliacrilonitrilo (polímeros que comprenden un sistema de liberación controlada que sincroniza la liberación de un principio activo junto con una fragancia como un marcador sensorial que expresa la eficacia del producto), beta-glucano (fibra de avena que ayuda en la penetración de la piel, (Redmond, Int. Journ. Cosmetic science 2005), propilenglicol (como vehículo de fármaco, que funciona mejor con una crema/loción basada en aceite

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La función nuclear somática se puede alterar usando extractos nucleares y citoplásmicos porque los extractos proporcionan los componentes reguladores necesarios. Los extractos de las extremidades de tritón regeneradores estimulan la reentrada del ciclo celular y la regulación negativa de los marcadores miogénicos en los miotubos diferenciados. Los teratocarcinomas son un tipo particular de tumores de células germinales que contienen células madre no diferenciadas y derivados diferenciados que pueden incluir capas germinales de endodermo, mesodermo y ectodermo. Las células de carcinoma no diferenciadas se pueden cultivar para dar lugar a líneas de ECC. Las ECC forman teratocarcinomas malignos cuando se trasplantan a sitios ectópicos; sin embargo, algunas líneas de ECC también pueden contribuir a los tejidos del feto en desarrollo cuando se introducen en un blastocisto.

Las células NCCIT no diferenciadas de teratocarcinoma humano se pueden establecer a partir de un tumor mediastínico mixto de células germinales. La NCCIT está en una etapa intermedia entre un seminoma (un precursor de tumores de células germinales) y un carcinoma embrionario. La NCCIT es una línea celular pluripotente en el desarrollo que se puede diferenciar en derivados de las tres capas germinales embrionarias y de los linajes celulares extraembrionarios, un extracto de células somáticas no diferenciadas puede provocar la desdiferenciación en una línea celular somática. Véase Taranger y col., "Induction of Dedifferentiation, Genome-wide Transcriptional Programming, and Epigenetic Reprogramming by Extracts of Carcinoma and Embryonic Stem Cells" MoI. Biol. Cell. (2005).

Las células madre se pueden establecer en el tejido dañado. Véase y col., "Transplantation of cardiac-committed mouse embryonic stem cells to infarcted sheep myocardium: a preclinical study" Lancet, 366 (9490): 1005-12 (2005); Goldman "Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system" Nat Biotechnol. 23 (7): 86271 (2005); Leri y col., "Repair of the damaged heart" Kidney Int. 68(5):1962 (2005); Levy y col., "Embryonic and adult stem cells as a source for cell therapy in Parkinson’s disease" J Mol Neurosci. 24 (3): 353-86 (2004); Jack y col., "Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction" J Urol. 174 (5): 2041-5 (2005); Kitmaura y col., Establishment of renal stem/progenitor-like cell line from S3 segment of proximal tubules in adult rat kidney, Kidney Int. 68 (5): 1966 (2005).

La divulgación se refiere a extractos que son capaces de estimular el sistema inmunitario para ayudar en la cicatrización. Por ejemplo, los extractos pueden contener fibrógeno y proteínas de choque térmico. Estos componentes celulares endógenos son señales de alarma expresadas por lo general en células con dificultades o heridas. Se unen a los receptores de tipo Toll (TLR) en células presentadoras de antígenos (APC) y ponen al sistema inmunológico en alerta de un área dañada. Véase Matzinger "The Danger Model: A Renewed Sense of Self’ Science 296: 301-305 (2002).

La divulgación se refiere a la estimulación de células madre existentes en la piel, tales como las células madre que se encuentran en y alrededor de los folículos pilosos para duplicarse y/o diferenciarse en células epiteliales o neuronas. La nestina, un marcador de las células progenitoras neurales, se expresa en las células de la protuberancia del folículo piloso y se comportan como células madre, diferenciándose para formar gran parte del folículo piloso durante cada ciclo de crecimiento del cabello. El folículo piloso es dinámico, entre ciclos de crecimiento (anágeno), regresión (catágeno) y reposo (telógeno) a lo largo de la vida. Las células madre localizadas en el área del bulto del folículo piloso dan lugar a las estructuras del folículo durante cada fase anágena. Las células madre localizadas en la protuberancia folículo piloso pueden generar todos los tipos de células epiteliales dentro del folículo intacto y el pelo durante el ciclo normal del folículo piloso. Las células de la protuberancia del folículo piloso se diferencian en células de la matriz del folículo piloso, células basales de la glándula sebácea y epidermis. Como respuesta a la formación de heridas, algunas células madre salen de la protuberancia, migran y proliferan para repoblar el infundíbulo y la epidermis. Las células madre pluripotentes adultas de la dermis cutánea, denominadas precursores derivados de la piel (SKP), pueden proliferar y diferenciarse para producir neuronas, glía, células del músculo liso y adipocitos. Las células madre pluripotentes de la cresta neuronal están presentes en las papilas dérmicas de los folículos pilosos de los mamíferos adultos. Véase Amoh y col., " Multipotent nestin-positive, keratinnegative hair-follicle bulge stem cells can form neurons" Proc. Natl. Acad. Sci. USA." 12; 102 (15): 5530-4 (2005).

La médula ósea contiene tres poblaciones de células madre: células madre hematopoyéticas, células del estromal y células progenitoras endoteliales. Las células madre de la médula ósea, las células madre hematopoyéticas (HSC), son responsables de la formación de todos los tipos de células sanguíneas en el cuerpo. En ocasiones, las células obtenidas de la médula ósea se clasifican usando un panel de marcadores de superficie en poblaciones de células madre hematopoyéticas o células del estroma de la médula ósea. Las HSC pueden estar altamente purificadas o parcialmente purificadas, dependiendo de las condiciones usadas. Otra forma de separar la población de células de médula ósea es por fraccionamiento para producir células que se adhieren a un sustrato de crecimiento (células del estroma) o no se adhieren (células hematopoyéticas). Las células madre mesenquimales de la médula ósea también dan origen a estos tejidos y constituyen la misma población de células que las células del estroma de la médula ósea. Las células progenitoras que se diferencian en células endoteliales, un tipo de célula que alinea los vasos sanguíneos, se pueden aislar de la sangre circulante. Los pericitos están relacionados con las células del estroma de la médula ósea.

Las combinaciones de marcadores de superficie se usan para identificar, aislar y purificar las HSC obtenidas a partir de médula ósea y sangre. Las HSC no diferenciadas y las células progenitoras hematopoyéticas expresan c-kit,

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CD34 y H-2K. Estas células normalmente carecen del linaje Lin, o lo expresan a niveles muy bajos (Lin-/bajo). Las células del estroma BM tienen varias características que las distinguen de las HSC. Los dos tipos de células se pueden separar in vitro. Cuando la médula ósea se disocia, la mezcla de células que contiene se siembra a baja densidad, las células del estroma se adhieren a la superficie de la placa de cultivo y las HSC no lo hacen. Dadas las condiciones in vitro específicas, las células del estroma BM forman colonias de una sola célula denominada unidad F formadora de colonias (CFU-F). A continuación, estas colonias se pueden diferenciar como adipocitos o estroma de mielo soporte, un ensayo clonal que indica la naturaleza de célula madre de las células del estroma. A diferencia de las HSC, que no se dividen in vitro (o solo proliferan en un grado limitado), las células del estroma BM pueden proliferar hasta 35 duplicaciones de población in vitro. Las células madre endoteliales son CD34+ (un marcador para las HSC), y expresan el factor de transcripción GAT A-2 véase Kocher, y col., "Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function", Nat. Med. 7, 430-436 (2001).

La presente divulgación contempla el uso de cualquier tipo de célula incluyendo células madre de cualquier organismo pluricelular en cualquier reino de especies, tanto eucariotas incluyendo animales, plantas, protistas, hongos como procariotas incluyendo los reinos arqueobacterias y eubacterias. Los organismos pluricelulares contienen células madre totipotentes, multipotentes, pluripotentes y unipotentes capaces de dividir y reponer tejidos y células que componen el organismo. Las células madre están bien documentadas en animales mamíferos, pero están presentes en todos los animales, por ejemplo, insectos. Las moscas de la fruta adultas tienen las mismas células madre que controlan la regulación de la célula en su intestino al igual que los seres humanos. Los sistemas digestivos de vertebrados e invertebrados muestran amplias similitudes en su desarrollo, composición celular y control genético. El intestino medio de Drosophila es típico: los enterocitos constituyen la mayor parte de la monocapa del epitelio intestinal, pero se entremezclan con células enteroendocrinas productoras de hormonas. Las células intestinales humanas (y de ratón) son repuestas continuamente por las células madre, cuya mala regulación puede ser la base de algunas enfermedades digestivas comunes y cáncer. Por el contrario, las células madre no se han descrito en los intestinos de las moscas, y se ha pensado que las células intestinales de Drosophila son relativamente estables. Mediante el etiquetado de linaje se ha mostrado que las células del intestino delgado posterior de Drosophila adultas se reponen continuamente por una población distintiva de células madre intestinales (ISC). (Benjamin Ohlstein y Allan Spradling, The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells, Nature Online, 7 de diciembre de 2005).

Además de las células madre de animales, las plantas también contienen células madre. Las células madre en los tallos de las plantas y los meristemas de las raíces se mantienen a lo largo de la vida de la planta y producen células hijas somáticas que forman el cuerpo de la planta. Las células madre de plantas también se pueden obtener a partir de células somáticas in vivo e in vitro. (Plants stem cells: divergent pathways and common themes in shoots and roots. Byrne ME, Kidner CA, Martienssen RA. Curr Opin Genet Dev. Octubre de 2003;13 (5): 551-7.) Las células de los animales y organismos se mueven, realizan divisiones celulares que sirven para regenerar y mantener tejidos y poblaciones de células circulantes, crecen de manera simultáneamente repetitiva, contienen una línea germinal reservada que se interrumpe momentáneamente en la embriogénesis, tienen una tolerancia baja a las anomalías genéticas, producen embriones complejos e incompletos y esencialmente no presentan propagación sexual y no tienen pared celular. Las plantas responden por ajuste fisiológico, sus divisiones celulares contribuyen a la formación de novo de órganos en todo momento hasta la senescencia, el crecimiento de la planta es en serio, repetitivo y plástico, las plantas no tienen línea germinal reservada, son más tolerantes a las anomalías genéticas, sus embriones son sencillos y completos y las células de las plantas son totipotentes. Se contemplan células madre de plantas y semillas (gametos de plantas) para su uso en la presente invención. Contrariamente a la rareza de las células totipotentes en los animales, casi todas las células formadas por un hongo pueden funcionar como una "célula madre". Los cuerpos fructíferos multicelulares de los hongos basidiomicetos consisten en el mismo tipo de hifas filamentosas que forman la fase de alimentación, o micelio, del organismo, y la diferenciación celular visible es casi inexistente (Money NP. Mushroom stem cells. Bioessays. Octubre de 2002; 24 (10): 949-52).

La descripción se organiza en las siguientes secciones: B. Extractos de células madre adultas; C. Extractos de células sanguíneas del cordón umbilical; D. Extractos de células, huevos y embriones no mamíferos; E. Procedimientos para preparar extractos; F. Inhibidores epigenéticos; G. Mayo se inicia de procedimientos de administración tópica; H. Otros procedimientos de administración; I. Componentes adicionales para extractos; J. Perfiles de composición; K. Aplicación tópica; L. Usos terapéuticos; M. Aplicaciones de células completas; N. Terapia ex vivo e in vivo.

B. Extractos de células madre adultas

Se describen composiciones que comprenden células madre adultas o extractos preparados a partir de células madre adultas. Las células o extractos se formulan para aplicación tópica como se describe con más detalle a continuación. La célula madre adulta es una célula no diferenciada (no especializada) que se encuentra en un tejido diferenciado (especializado); se puede renovar y llegar a especializarse especializado para producir tipos de células especializadas del tejido a partir del que se originó. Estas células precursoras existen dentro de los tejidos diferenciados del adulto de todos los organismos pluricelulares en los reinos animal, vegetal, protista y hongos como una comunidad de células dispersadas a través del tejido. Las células precursoras obtenidas a partir de adultos se pueden dividir en tres categorías basándose en su potencial de diferenciación. Estas tres categorías de células

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precursoras son células madre similares a epiblastos, células madre de linaje de capa germinal y células progenitoras. Se han aislado células precursoras de una amplia diversidad de tejidos, que incluyen, pero no se limitan a, músculo esquelético, dermis, grasa, músculo cardiaco, tejido de granulación, periostio, pericondrio, cerebro, meninges, vainas nerviosas, ligamentos, médula ósea, tráquea, pulmones, esófago, estómago, hígado, intestinos, bazo, páncreas, riñón, vejiga urinaria y testículos. Las células precursoras se pueden liberar desde los compartimentos del tejido conectivo a través del cuerpo por interrupción mecánica y/o digestión enzimática y se han aislado a partir de, pero no limitándose a, ratones, ratas y seres humanos recién nacidos, adolescentes y geriátricos y conejos, perros, cabras, ovejas y cerdos adultos.

La primera categoría de células precursoras, células madre similares a epiblastos (ELSC), consiste en una célula madre que formará células de los tres linajes de la capa germinal embrionaria. Las células madre de ratas adultas y células madre de humanos adultos se pueden liberar de los compartimentos de tejido conectivo en todo el cuerpo por interrupción mecánica y/o digestión enzimática. Las células madre de cualquiera de ratas adultas o seres humanos adultos se pueden congelar preferentemente de forma lenta y almacenar a -80 ºC ± 5 ºC usando un 7,5 % de dimetilsulfóxido ultrapuro. La descongelación rápida de las células madre de ambas especies desde el estado congelado a temperatura ambiente proporcionar tasas de recuperación que superan un 98 %. Estas células en el estado no diferenciado expresan el gen Oct-3/4 que es característico de las células madre embrionarias. Las ELSC no se diferencian de forma espontánea en un medio sin suero que carece de agentes de progresión, agentes de proliferación, agentes de inducción de linaje y/o factores inhibidores, tales como factor inhibidor de la leucemia humana recombinante (LIF), factor de inhibición de la leucemia murina recombinante (ESGRO), o factor antidiferenciación humano recombinante (ADF). Las células madre embrionarias se diferencian de forma espontánea en estas condiciones. Por el contrario, las ELSC obtenidas a partir de ambas especies permanecen quiescentes a menos que actúen sobre agentes proliferativos y/o inductores y/o entorno específicos.

Las ELSC proliferan para formar múltiples capas confluentes de células in vitro en presencia de agentes de proliferación tales como factores de crecimiento obtenidos a partir de plaquetas y responden a agentes de inducción de linaje. Las ELSC responden al factor de crecimiento de hepatocitos formando células que pertenecen al linaje endodérmico. Las líneas celulares han expresado marcadores fenotípicos para muchos tipos separados de células de origen ectodérmico, mesodérmico y endodérmico cuando se exponen a agentes de inducción generales y específicos.

La segunda categoría de células precursoras consiste en tres células madre separadas. Cada una de las células forma células de un linaje específico de la capa germinal embrionaria (células madre ectodérmicas, células madre mesodérmicas y células madre endodérmicas). Cuando se exponen a agentes inductivos generales y específicos, las células madre ectodérmicas de linaje de capa germinal se pueden diferenciar, por ejemplo, en células progenitoras neuronales, neuronas, ganglios, oligodendrocitos, astrocitos, vesículas sinápticas, células gliales radiales y queratinocitos.

La tercera categoría de células precursoras presentes en tejidos adultos está compuesta por una multitud de células progenitoras pluripotentes, tripotentes, bipotentes y unipotentes. En los tejidos sólidos estas células se encuentran cerca de sus respectivos tipos de células diferenciadas. Por lo general, las células progenitoras no muestran marcadores de expresión fenotípica para las ELSC pluripotentes, tales como antígeno 4 embrionario específico de estadio, antígeno 1 embrionario específico de estadio, o antígeno 1 embrionario específico de estadio o molécula 1 de adhesión celular al antígeno carcinoembrionario. De forma similar, las células progenitoras por lo general no presentan marcadores de expresión fenotípica para células madre de linaje de la capa germinal, tales como nestina para células del linaje ectodérmico o fetoproteína para células del linaje endodérmico.

Una célula progenitora puede ser multipotente, teniendo la capacidad de formar múltiples tipos celulares. Una célula precursora de origen ectodérmico que reside en la adenohipófisis y denominada célula progenitora adenohipofisaria es un ejemplo de una célula progenitora multipotente. Esta célula formará gonadótrofos, somatótrofos, tirótrofos, corticotróficos y mamótrofos. Las células progenitoras para linajes celulares particulares tienen perfiles únicos de grupo de superficie celular de marcadores de diferenciación (CD) y perfiles únicos de marcadores de expresión de diferenciación fenotípica. Por lo general, las células progenitoras no se diferencian de forma espontánea en medio definido sin suero en ausencia de un agente de diferenciación, tal como LIF o ADF. Por lo tanto, a diferencia de las células madre embrionarias que se diferencian de forma espontánea en estas condiciones, las células progenitoras permanecen quiescentes a menos que actúen sobre agentes proliferativos (tales como el factor de crecimiento obtenido de plaquetas) y/o agentes progresivos (tales como insulina, factor I de crecimiento de tipo insulínico o factor II de crecimiento de tipo insulínico).

Las células progenitoras pueden regular su comportamiento de acuerdo con las demandas cambiantes, de modo que después del trasplante se activan desde la quiescencia hasta la proliferación y generan tanto nuevas células satélite como cantidades sustanciales de nuevas células diferenciadas. Por ejemplo, las unidades contráctiles del músculo son miofibras, células sincitiales alargadas que contienen cada una muchos cientos de mionúcleos postmitoticos. Las células satélite residen por debajo de la lámina basal de miofibras y funcionan como precursores miogénicos durante la regeneración muscular. Como respuesta a la lesión muscular, las células satélite se activan, proliferan y se diferencian, durante lo cual se fusionan en conjunto para reparar o reemplazar las miofibras dañadas. Cuando las células satélite se eliminan de sus miofibras mediante un procedimiento de valoración física no

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Además, en otros casos, los huevos se suspenden en tampón de lisis celular como se ha descrito anteriormente. Los huevos se lisan por homogeneización usando un mortero y mano de vidrio Dounce (Kontes, tipo A o B). El lisado se sedimenta y se trata como se ha descrito anteriormente.

Se proporcionan composiciones, preparadas a partir de fuentes naturales como las que se han descrito anteriormente o a partir de materiales de fuente artificial, o una combinación de los mismos. En algunos casos, los extractos se caracterizan por tener una osmolaridad de aproximadamente 330 a 440, preferentemente de aproximadamente 350 mOsm. En algunos casos, los extractos tienen un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,7, preferentemente un pH de aproximadamente 6,5 -7,0. En algunos casos, los extractos tienen un contenido de proteína de aproximadamente 100 a 250 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 160 a 190 mg/ml, y lo más preferentemente aproximadamente 120 mg/ml. En algunos casos, las composiciones tienen un contenido de agua de aproximadamente un 20 a un 90 tanto por ciento en peso/peso (p/p) de agua, preferentemente de aproximadamente un 37 a un 79 % en p/p de agua. En algunos casos, los extractos tienen una densidad de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 1,4 g/ml, preferentemente de aproximadamente 1,1 g/ml. En algunos casos, las composiciones comprenden oligoelementos que incluyen, pero no se limitan a, calcio, fósforo, cinc, cobre y hierro. En algunos casos, las composiciones comprenden vitaminas, que incluyen, pero no se limitan a, vitaminas A, E, riboflavina, niacina, B6, pantotenato cálcico y B12. En algunos casos, la presente divulgación proporciona una composición de huevas frescas que comprende: de un 2,7 a un 3,4 % de proteína; de un 3 a un 5 % de carbohidratos; de un 1,0 a un 1,7 % de grasas en forma de fosfolípidos, y de un 0,01 a un 0,05 % de minerales en huevas frescas, deberían ser menos grasas y proteínas totales más elevadas en el extracto), de un 37 a un 79 por ciento en peso de agua. En algunos casos, los extractos comprenden además una fracción lipídica. En algunos casos, la fracción lipídica comprende de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 80 % de ácidos grasos insaturados. En otros casos, las composiciones comprenden fosfolípidos, incluyendo fosfatidil colinas (lecitinas) o fosfatidil etanolamina (cefalinas), y en menor grado fosfatos de inositol, cerebrósidos y esfingomielinas. En algunos casos, la fracción lipídica es de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 % o un 5 % de la composición total, mientras que en otros casos, las composiciones están sustancialmente libres o libres de lípidos.

En algunos casos, los extractos artificiales se complementan con 1) agua, 2) cualquier tipo de proteína (BSA, albúmina, vitelogenina, mezclas de aminoácidos, etc.), 3) vitaminas y minerales como se ha descrito anteriormente, 4) sales u osmoles para crear una osmolaridad de aproximadamente 350 mOsm, 5) glicerol u otros agentes para aumentar la viscosidad, 6) 6) lípidos tales como lecitinas, cefalinas y otros fosfolípidos, 7) carbohidratos, 8) factores de crecimiento tales como FGF, EGF e IGF, 9) y quimioatractores tales como SLC/6Ckine/Exodus2/TCA4 y CKbeta-11/MIP-3beta/ELC, 10) ácido o base para ajustar el pH a 6,2 -7,2, y 11) conservantes tales como metil parabeno, propil parabeno, BHA o BHT.

En algunos casos, los huevos o extractos se tratan para impedir el crecimiento bacteriano. Se contempla el uso de una diversidad de procedimientos. En algunos casos, se combinan los siguientes procedimientos. En algunos casos, los huevos no fertilizados o fertilizados (por ejemplo, huevos de peces o anfibios) se tratan antes de la homogeneización con un agente bactericida o bacteriostático. Los agentes preferentes incluyen, pero no se limitan a, agentes que contienen yodo tales como betadine, bufodine y povidona yodada, y otros agentes tales como novasán, hipoclorito sódico, bacitracina, sulfato de polimixina B, compuestos que contienen plata, tales como sulfadiazina de plata y nitrato de plata, acetato de mafenida, nistatina, gentamicina, neomicina. En otros casos, los extractos se tratan después de la homogeneización para evitar el crecimiento bacteriano. En algunos casos, los extractos, tales como los extractos celulares o la fracción citoplasmática, se tratan por calentamiento. En algunos casos, los extractos se calientan a aproximadamente 37, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 grados Celsius durante aproximadamente 30 segundos o 1, 2, 5, 10, 20, 30, 60 o 120 minutos.

En algunos casos, los huevos o extractos se filtran, preferentemente a través de filtros de 0,22 o 0,45 µm para eliminar las bacterias. En algunos casos, antes o después del filtrado, los extractos se tratan mediante centrifugación adicional (15 min -2 horas) después de calentar el extracto a 56 ºC para centrifugar cualquier bacteria presente.

En otros casos, los huevos se lavan en un agente que contiene azufre (por ejemplo, polisulfuro cálcico o tiosulfato cálcico (azufre de cal) antes de su preparación. En algunos casos, se añade azufre a los extractos para eliminar las bacterias. En otros casos, se añade peróxido de benzoílo a los extractos. En algunos casos, los huevos se lavan en un 0,001 % a aproximadamente un 0,2 % en peso de un clorito metálico y ácido suficiente para ajustar el pH de la solución de aproximadamente 2,2 a aproximadamente 4,5 para eliminar las bacterias. En otros casos, los huevos y/o extracto se colocan en un tambor de vacío y se mezclan con una solución natural que contiene sal, vitamina C o ácido cítrico y agua para eliminar las bacterias. En algunas realizaciones, los huevos y/o el extracto se agitan, se somete una agitación vorticial, se sonican, se agitan o se remueven con agua salada o tampón líquido para desplazar las bacterias y el filtro de vacío del líquido para eliminar las bacterias. Será posible comprobar el contenido bacteriano en el líquido y en los huevos tratados para el control de calidad. En algunos casos, la electroforesis de los huevos y/o extracto se usa para eliminar las bacterias. Se contempla que tales procedimientos usen las influencias de la doble capa eléctrica, intensidad del campo eléctrico, gradiente de densidad eléctrica, pH de la solución tampón, fuerza iónica de la solución tampón, etapa de crecimiento de las bacterias y agente tensioactivo aniónico después de movilidad electroforética de algunas especies de bacterias.

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proteína asociada a atrofia dentatorrubro palidoluisiana, una proteína microbiana (por ejemplo, proteína de unión a maltosa, transportador de ABC, glutatión S transferasa, tiorredoxina, β-lactamasa), proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja o derivados o fragmentos activos o variantes genéticas de cualquiera de los péptidos enumerados anteriormente.

Los ejemplos de compuestos orgánicos pequeños incluyen, pero no se limitan a, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (el AINE se puede seleccionar, por ejemplo, entre las siguientes categorías: (por ejemplo, derivados del ácido propiónico, derivados del ácido acético, derivados del ácido fenámico, derivados del ácido bifenilcarboxílico y oxicams)); fármacos antiinflamatorios esteroideos, incluyendo hidrocortisona y similares; fármacos antihistamínicos (por ejemplo, clorfeniramina, triprolidina); fármacos antitusivos (por ejemplo, dextrometorfano, codeína, carmifeno y carbetapentano); fármacos antipruriginosos (por ejemplo, metidilizina y trimeprizina); fármacos anticolinérgicos (por ejemplo, escopolamina, atropina, homatropina, levodopa); fármacos antieméticos y antináuseas (por ejemplo, ciclizina, meclizina, clorpromazina, buclizina); fármacos anorexicos (por ejemplo, benfetamina, fentermina, clorfentermina, fenfluramina); fármacos estimulantes del sistema central (por ejemplo, anfetamina, metanfetamina, dextroanfetamina y metilfenidato); minoxidil; fármacos antiarrítmicos (por ejemplo, propanolol, procainamida, disopirramina, quinidina, encainida); fármacos bloqueadores P-adrenérgicos (por ejemplo, metoprolol, acebutolol, betaxolol, labetalol y timolol); fármacos cardiotónicos (por ejemplo, milrinona, amrinona y dobutamina); fármacos antihipertensivos (por ejemplo, enalapril, clonidina, hidralazina, minoxidil, guanadrel, guanetidina); fármacos diuréticos (por ejemplo, amilorida e hidroclorotiazida); fármacos vasodilatadores (por ejemplo, diltazem, amiodarona, isosuprina, nilidrina, tolazolina y verapamilo); fármacos vasoconstrictores (por ejemplo, dihidroergotamina, ergotamina y metilsergida); fármacos antiulcerosos (por ejemplo, ranitidina y cimetidina); fármacos anestésicos (por ejemplo, lidocaína, bupivacaína, clorprocaína, dibucaína); fármacos antidepresivos (por ejemplo, imipramina, desipramina, amitriptilina, nortriptilina); inhibidores de PDE5 tales como Viagra® o Cialis®; fármacos tranquilizantes y sedantes (por ejemplo, clordiazepóxido, benacitizina, benzquinamida, flurazapam, hidroxizina, loxapina y promazina); fármacos antipsicóticos (por ejemplo, clorproxixeno, flufenazina, haloperidol, molindona, tioridazina y trifluoperazina); fármacos antimicrobianos (fármacos antibacterianos, antifúngicos, antiprotozoarios y antivirales).

Los fármacos antimicrobianos que son preferentes para su incorporación en la presente composición incluyen, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de fármacos de β-lactama, fármacos de quinolona, ciprofloxacina, norfloxacina, tetraciclina, eritromicina, amikacina, triclosán, doxiciclina, capreomicina, clorhexidina, clortetraciclina, oxitetraciclina, clindamicina, etambutol, isotionato de hexamidina, metronidazol; pentamidina, gentamicina, kanamicina, lineomicina, metaciclina, metenamina, minociclina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina, tobramicina, miconazol, y amanfadina.

Otros restos de fármaco de uso en la práctica de la presente divulgación incluyen fármacos antineoplásicos (por ejemplo, antiandrógenos (por ejemplo, leuprolida o flutamida), agentes citocidas (por ejemplo, adriamicina, doxorubicina, taxol, ciclofosfamida, busulfán, cis-platino, a-2-interferón), antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno), antimetabolitos (por ejemplo, fluorouracilo, metotrexato, mercaptopurina, tioguanina).

Las composiciones también pueden comprender hormonas (por ejemplo, medroxiprogesterona, estradiol, leuprolida, megestrol, octreótido o somatostatina); fármacos relajantes musculares (por ejemplo, cinamidina, ciclobenzaprina, flavoxato, orfenadrina, papaverina, mebeverina, idaverina, ritodrina, desfenoxilato, dantroleno y azumoleno); fármacos antiespasmódicos; fármacos activos en los huesos (por ejemplo, compuestos de fármaco de difosfonato y fosfonoalquilfosfinato); fármacos moduladores endocrinos (por ejemplo, anticonceptivos (por ejemplo, etinodiol, etinil estradiol, noretindrona, mestranol, desogestrel, medroxiprogesterona), moduladores de la diabetes (por ejemplo, gliburida o clorpropamida), anabolizantes, tales como testolcatona o estanozolol, andrógenos (por ejemplo, metiltestosterona, testosterona o fluoximesterona), antidiuréticos (por ejemplo, desmopresina) y calcitoninas).

En la presente divulgación también se usan estrógenos (por ejemplo, dietilestilbestrol), glucocorticoides (por ejemplo, triamcinolona, betametasona, etc.) y progenstógenos, tales como la noretindrona, etinodiol, noretindrona, levonorgestrel; agentes tiroideos (por ejemplo, liotironina o levotiroxina) o agentes antitiroideos (por ejemplo, metimazol); fármacos antihiperprolactinémicos (por ejemplo, cabergolina); supresores hormonales (por ejemplo, danazol o goserelina), oxitócicos (por ejemplo, metilergonovina u oxitocina) y también se pueden usar prostaglandinas, tales como mioprostol, alprostadil o dinoprostona.

Otros compuestos activos útiles incluyen fármacos inmunomoduladores (por ejemplo, antihistamínicos, estabilizantes de mastocitos, tales como lodoxamida y/o cromolina, esteroides (por ejemplo, triamcinolona, beclometazona, cortisona, dexametasona, prednisolona, metilprednisolona, beclometasona, o clobetasol), antagonistas de la histamina H2 (por ejemplo, famotidina, cimetidina, ranitidina), inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina, ciclosporina), etc. También se usan grupos con actividad antiinflamatoria, tales como sulindac, etodolac, ketoprofeno y ketorolac. Otros fármacos de uso en conjunto con la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia.

En algunos casos, los componentes del extracto pueden actuar como quimiotaxantes. Las células madre mesenquimales y los fibrocitos circulan en el torrente sanguíneo y en caso de herida en la piel penetran en el área de la herida en la que se pueden diferenciar a células de la piel tales como fibroblastos, queratinocitos, pericitos,

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la concentración deseada.

Las cremas son emulsiones de aceite/agua. Éstas consisten en una fase oleosa (fase interna), que por lo general comprende aceites no volátiles, hidrocarburos y similares, tales como ceras, vaselina, aceite mineral y similares, y una fase acuosa (fase continua), que comprende agua y cualquier sustancia soluble en agua, tales como sales añadidas. Las dos fases se estabilizan mediante el uso de un agente emulgente, por ejemplo, un agente tensioactivo, tal como laurilsulfato sódico; coloides hidrófilos, tales como arcillas coloidales de goma arábiga, veegum y similares. Después de la formación de la emulsión, el principio activo (por ejemplo, extracto de huevo de salmón o extracto de células madre) se añade de forma habitual en una cantidad para conseguir la concentración deseada.

Los geles comprenden una base seleccionada entre una base oleaginosa, agua o una base de suspensiónemulsión. A la base se le añade un agente gelificante que forma una matriz en la base, aumentando su viscosidad. Los ejemplos de agentes gelificantes son hidroxipropil celulosa, polímeros de ácido acrílico y similares. De forma habitual, el principio activo (IGF-II) se añade a la formulación a la concentración deseada en un punto anterior a la adición del agente gelificante.

La cantidad de extracto incorporada en la formulación de la presente divulgación no es crítica; la concentración solamente debería estar en un intervalo suficiente como para permitir la aplicación rápida de la formulación a la zona de la herida en una cantidad que proporcione la cantidad deseada de extracto.

La cantidad habitual de formulación a aplicar dependerá de la concentración del principio activo en la formulación. En algunos casos, se determina la cantidad de proteína en el extracto. A continuación, una cantidad específica del extracto se incluye en el vehículo farmacéuticamente aceptable basándose en la cantidad de proteína. Por lo general, la formulación se aplicará a la herida en una cantidad que proporcione de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 µg de proteína por cm2 de piel. Preferentemente, la cantidad aplicada de proteína estará en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 µg/cm2, más preferentemente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 µg/cm2. En otras realizaciones, se añade un volumen específico de extracto al vehículo farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, en algunos casos, las composiciones de la presente divulgación comprenden, en una base volumen/volumen (volumen de extracto y volumen de vehículo farmacéuticamente aceptable), por ejemplo, de aproximadamente un 0,001 a un 50 % de extracto, de aproximadamente un 0,01 a un 50 % de extracto, de aproximadamente un 0,1 a un 50 % de extracto, de aproximadamente un 0,001 a un 10 % de extracto, de aproximadamente un 0,01 a un 10 % de extracto, de aproximadamente un 0,1 a un 10 % de extracto, de aproximadamente un 0,001 a un 5 % de extracto, de aproximadamente un 0,01 a un 5 % de extracto, de aproximadamente un 0,1 a un 5 % de extracto, de aproximadamente un 0,001 a un 4 % de extracto, de aproximadamente un 0,01 a un 4 % de extracto, de aproximadamente un 0,1 a un 4 % de extracto, de aproximadamente un 0,001 a un 2 % de extracto, de aproximadamente un 0,01 a un 2 % de extracto, de aproximadamente un 0,1 a un 2 % de extracto, de aproximadamente un 0,001 a un 1 % de extracto, de aproximadamente un 0,01 a un 1 % de extracto, de aproximadamente un 0,1 a un 1 % de extracto.

Si fuera necesario se puede formular con aditivos usados comúnmente en las ciencias farmacéuticas, tales como tensioactivos, aceites y grasas, alcoholes polihídricos, alcoholes inferiores, agentes espesantes, absorbentes de UV, agentes dispersantes de luz, conservantes, antioxidantes, antibióticos, agentes quelantes, reguladores de pH, agentes aromatizantes, pigmentos y agua.

Los ejemplos de tensioactivos incluyen polioxietileno (denominados en lo sucesivo en el presente documento éteres de alquilo ramificado-POE tales como POE-alcohol octildodecílico y POE 2-alcohol deciltetradecílico, alquil éteres-POE, tales como éter de POE-alcohol oleílico y éter de POE-alcohol cetílico, ésteres de sorbitán tales como monooleato de sorbitán, monoisoestearato de sorbitán y monolaurato de sorbitán, ésteres de POE-sorbitán, tales como POE-monooleato de sorbitán, POE-monoisoestearato de sorbitán y POE-monolaurato de sorbitán, ésteres de ácidos grasos de glicerol tales como monooleato de glicerilo, monoestearato de glicerilo y monomiristato de glicerilo, ésteres de POE-ácido graso de glicerol tales como POE-monooleato de glicerilo, POE-monoestearato de glicerilo y POE-monomiristato de glicerilo, éster de POE-dihidrocolesterol, POE-aceite de ricino endurecido, ésteres de POEácido graso de aceite de ricino endurecido tales como, éteres de POE-alquilarilo tales como éter de POE-octilfenol, ésteres de glicerol tales como monoisoestearato de glicerol y monomiristato de glicerol, éteres de POE-glicerol tales como POE-monoisoestearato de glicerol y POE-monomiristato de glicerol, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol tales como monoestearato de diglicerilo, decaestearato de decaglicerilo, decaisoestearato de decaglicerilo y diisoestearato de diglicerilo y otros tensioactivos no iónicos; sales de potasio, sales de sodio, sales de dietanolamina, sales de trietanolamina, sales de aminoácidos y otras sales de ácidos grasos superiores tales como ácido mirístico, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido behénico, ácido isoesteárico y ácido oleico, las sales alcalinas superiores de ácidos éter carboxílicos, sales de N-acilaminoácidos, N-acilsalconatos, alquilsulfonatos superiores y otros tensioactivos aniónicos; sales de alquilamina, poliamina, ácidos grasos de aminoalcohol, resina de silicona orgánica, sales de amonio cuaternario y alquilo y otros tensioactivos catiónicos; y lecitina, derivados de betaína y otros tensioactivos anfóteros.

Los ejemplos de aceites y grasas incluyen aceites y grasas vegetales tales como aceite de ricino, aceite de oliva, aceite de cacao, aceite de camelia, aceite de coco, cera de madera, aceite de yoyoba, aceite de semilla de uva y

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cicatrización de heridas/regeneración celular. Los ejemplos de genes regulados con el extracto son; proteínas de matriz celular extra tales como colágeno I y III, fibronectina y elastina; enzimas tales como metaloproteinasas de matriz; factores de crecimiento tales como factor de crecimiento obtenido a partir de plaquetas (PDGF), factor beta de crecimiento transformante (TGF-β, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), interleuquinas (IL), el marcador de diferenciación celular de músculo liso actina y quimioquinas tales como el ligando (CXCL) de quimioquina (motivo C-X-C).

Los ejemplos de regulación genética en fibroblastos de piel humanos (hSF) después de tratamiento con extracto se proporcionan en la Tabla 1.

Tabla 1

COL11A1

49 negativa colágeno, tipo XI, alfa 1 [Homo sapiens]

COL12A1

5,2 positiva colágeno, tipo XII, alfa 1 [Homo sapiens]

COL13A1

6,8 positiva colágeno, tipo XIII, alfa 1 [Homo sapiens]

COL14A1

17,8 positiva colágeno, tipo XIV, alfa 1 [Homo sapiens]

COL15A1

25,4 positiva colágeno, tipo XV, alfa 1 [Homo sapiens]

COL16A1

45 positiva oollagen, tipo XVI, alfa 1 [Homo sapiens]

COL17A1

132,4 negativa colágeno, tipo XVII, alfa 1 [Homo sapiens]

COL18A1

31,8 negativa colágeno, tipo XVIII, alfa 1 [Homo sapiens]

COL19A1

96,3 negativa colágeno, typeXIX, alfa 1 [Homo sapiens]

COL1A1

303,9 positiva colágeno, tipo I, alfa 1 [Homo sapiens]

COL1A2

20,1 positiva colágeno, tipo I, alfa 2 [Homo sapiens]

COL20A1

53,1 negativa colágeno, tipo XX, alfa 1 [Homo sapiens]

COL21A1

83,5 negativa colágeno, tipo XXI, alfa 1 [Homo sapiens]

COL22A1

4,4 negativa colágeno, tipo XXII, alfa 1 [Homo sapiens]

COL23A1

21,3 negativa colágeno, tipo XXIII, alfa 1 [Homo sapiens]

COL25A1

4 negativa colágeno, tipo XXV, alfa 1 [Homo sapiens]

COL3A1

207 positiva colágeno, tipo III, alfa 1 [Homo sapiens]

COL4A1

8,9 negativa colágeno, tipo IV, alfa 1 [Homo sapiens]

COL4A4

7,4 negativa colágeno, tipo IV, alfa 4 [Homo sapiens]

COL4A5

6,4 negativa colágeno, tipo IV, alfa 5 [Homo sapiens]

COL4A6

91,6 negativa colágeno, tipo IV, alfa 6 [Homo sapiens]

COL5A1

193,7 positiva colágeno, tipo V, alfa 1 [Homo sapiens]

COL5A3

13,8 negativa colágeno, tipo V, alfa 3 [Homo sapiens]

COL6A1

17,6 positiva colágeno, tipo VI, alfa 1 [Homo sapiens]

COL6A2

6,1 negativa colágeno, tipo VI, alfa 2 [Homo sapiens]

COL6A3

35,9 positiva colágeno, tipo VI, alfa 3 [Homo sapiens]

COL8A1

9,2 positiva colágeno, tipo VIII, alfa 1 [Homo sapiens]

COL8A2

5,1 negativa colágeno, tipo VIII, alfa 2 [Homo sapiens]

COL9A1

28,2 negativa colágeno, tipo IX, alfa 1 [Homo sapiens]

COL9A2

15,6 negativa colágeno, tipo IX, alfa 2 [Homo sapiens]

COL9A3

13,7 negativa colágeno, tipo IX, alfa 3 [Homo sapiens]

COLQ

22,7 negativa subunidad de cola similar a colágeno de acetilcolinesterasa asimétrica [Homo sapiens]

ELN

130,9 negativa elastina [Homo sapiens]

FN1

4,7 positiva fibronectina 1 [Homo sapiens]

43

(continuación)

HABP2

4,4 negativa proteína 2 de unión a hialuronano [Homo sapiens]

HABP4

8 positiva proteína 4 de unión a hialuronano [Homo sapiens]

HAS2

4,9 positiva hialuronano sintasa 2 [Homo sapiens]

HYAL1

4,1 negativa hialuronoglucosaminidasa 1 [Homo sapiens]

HYAL3

3,5 positiva hialuronoglucosaminidasa 3 [Homo sapiens]

HYAL4

25,6 negativa hialuronoglucosaminidasa 4 [Homo sapiens]

ACTA2

20,4 positiva actina, alfa 2, músculo liso, aorta [Homo sapiens]

EGF

No enumerado Factor de crecimiento epidérmico (beta-urogastrona) [Homo sapiens]

TGFB1

19,7 negativa factor de crecimiento transformante, beta 1 [Homo sapiens]

TGFB1/1

9,1 positiva factor de crecimiento transformante, beta 1 [Homo sapiens]

TGFBI

107,1 positiva factor de crecimiento transformante, beta-inducido, 68 kDa [Homo sapiens]

TGFBR2

20,9 positiva factor de crecimiento transformante, beta receptor II (70/80 kDa) [Homo sapiens]

TGFBR3

50,5 positiva factor de crecimiento transformante, beta receptor III [Homo sapiens]

TGIF1

20,8 positiva homeocaja 1 del factor inducido por TGFB [Homo sapiens]

VEGFA VEGFB VEGFC

95,9 82 11,6 negativa positiva positiva factor A de crecimiento endotelial vascular [Homo sapiens] factor B de crecimiento endotelial vascular [Homo sapiens] factor C de crecimiento endotelial vascular [Homo sapiens]

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PDGFD

19,3 positiva factor D de crecimiento derivado de plaquetas [Homo sapiens]

PDGFRA

64,1 positiva receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, polipéptido alfa [Homo sapiens]

PDGFRB

66,9 positiva receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, polipéptido beta [Homo sapiens]

IL1B IL1R1

20,7 3,5 negativa positiva interleuquina 1, beta [Homo sapiens] receptor de interleuquina 1, tipo I [Homo sapiens]

MMP14

3,6 negativa metalopeptidasa 14 de matriz (insertada en membrana) [Homo sapiens]

MMP16

15 negativa metalopeptidasa 16 de matriz (insertada en membrana) [Homo sapiens]

MMP17

6,5 negativa metalopeptidasa 17 de matriz (insertada en membrana) [Homo sapiens]

MMP19

3,6 negativa metalopeptidasa 19 de matriz [Homo sapiens]

metalopeptidasa 2 de matriz (gelatinasa A, 72 kDa, gelatinasa, colagenasa

MMP2

4,1 positiva de tipo IV de 72 kDa) [Homo sapiens]

MMP20

8,4 negativa metalopeptidasa 20 de matriz [Homo sapiens]

MMP23A

9 negativa metalopeptidasa 23A de matriz (pseudogén) [Homo sapiens]

MMP25

11,4 negativa metalopeptidasa 25 de matriz [Homo sapiens]

MMP28

3,1 negativa metalopeptidasa 28 de matriz [Homo sapiens]

44 5

10

15

20

25

30

35

(continuación)

TNF

No enumerado Factor de necrosis tumoral (superfamilia de TNF, miembro 2) [Homo sapiens]

IFNG IL12A IL12B IL18 IL23A CXCL1 CXCL10

No enumerado No enumerado 55,3 39,6 No enumerado No enumerado No enumerado negativa positiva interferón, gamma [Homo sapiens] interleuquina 12A (factor 1 estimulante de linfocitos citolíticos naturales, factor 1 de maduración de linfocitos citotóxicos, p35) [Homo sapiens] interleuquina 12B (factor 2 estimulante de linfocitos citolíticos naturales, factor 2 de maduración de linfocitos citotóxicos, p40) [Homo sapiens] interleuquina 18 (factor inductor de interferón gamma) [Homo sapiens] interleuquina 23, subunidad alfa p19 [Homo sapiens] ligando 1 de quimioquina (motivo C-X-C) (actividad estimulante del crecimiento de melanoma, alfa) [Homo sapiens] ligando 10 de quimioquina (motivo C-X-C) [Homo sapiens]

Ejemplo 8

Reprogramación de células con extractos de huevo o embrión de pez

El tipo celular de elección (por ejemplo, células 293T humanas y células madre adiposas (sometidas a ensayo con ASC)) se cosecha, se mantiene en hielo, y se lava dos veces en HBSS enfriado con hielo. De aproximadamente

100.000 a 500.000 células se sedimentan mediante centrifugación (300 g, 4 ºC durante 10 minutos). Las células se pueden permeabilizar con estreptolisina-O (SLO) por incubación durante 50 minutos en un baño de agua a 37 ºC antes de la reprogramación, sin embargo, no es necesario para la reprogramación de efectos de extractos de huevo

o embrión de pez. Después de incubación con SLO, las células se lavan en HBSS enfriado con hielo, se centrifugan y el exceso de líquido se retira a partir del sedimento. Las células se vuelven a suspender en 100 ul de extracto por

100.000 células y se incuban durante 1 hora a 37 ºC en un baño con agua. Se siembran aproximadamente 100.000 en pocillos con medio completo de elección. Si se ha realizado permeablización con SLO, las células se cultivan en medio con CaCl2 2 mM durante 2 horas después de la reprogramación para volver a sellar las membranas celulares. El medio se debería cambiar 2-12 horas después de la reprogramación. Para evaluar el alcance de la permeabilización con SLO, usar microscopía epifluorescencia para células incubadas durante 50 min en 0 o 100 ng/ml de SLO con 50 ug/ml de dextrano conjugado con rojo Alexia (10.000 Mr o 70.000 Mr de dextrano) para verificar la permeabilización y el nuevo sellado celular.

Las células se cultivan en pocillos hasta que la proliferación permite la división a recipientes más grandes. Las células separadas. Las células se dividen según sea apropiado por el tipo celular, pero no se les permite que lleguen a ser confluentes. Los sedimentos para análisis genético se deberían recoger semanalmente y la morfología se debería evaluar mediante microscopía a de contraste de fase en cada pasaje. Las células se pueden cultivar siempre y cuando se desee, pero para evaluar la duración de los efectos de reprogramación, sugiere un mínimo de 40 días.

Además, las células se pueden reprogramar mediante incubación en medios potenciados con extractos de huevo o embrión de pez. Las células se reprograman mediante la adición de un 0,4 % de extracto a medio completo normal (10 % de FCS) o s medio de privación de alimento (0,5 % de FCS). Las células de elección se cultivan hasta una confluencia de un 50 %, y el medio normal se sustituye con medio completo o medio de privación de alimento que contiene un 0,4 % de extracto. Las células se dividen según sea apropiado con medio que contenga extracto. El medio recién preparado con extractos se debería añadir a las células al menos dos veces a la semana si se separan menos de dos veces a la semana. Los sedimentos para análisis genético se deberían recoger semanalmente y la morfología se debería evaluar mediante microscopía a de contraste de fase en cada pasaje. Las células se pueden cultivar siempre y cuando se desee, pero para evaluar la duración de los efectos de reprogramación, sugiere un mínimo de 40 días.

Después de seguir los protocolos que se han enumerado anteriormente, las células reprogramadas con extractos de huevo de pez o de embrión de pez cebra, o cultivadas en medios con extractos añadidos, se cosechan y el ARN se aísla. Las células 293T reprogramadas o normales se incubaron en cualquiera de medio completo (RPMI-1640 con

45

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(continuación)

REPROGRAMACIÓN DE ASC

DÍA OCT4 NANOG SOX2

18

2,25 1,91 ND

35

1,27 0,12 ND

Tabla 5

REPROGRAMACIONES DE CÉLULAS 293T

DÍA OCT4 NANOG SOX2

Reprogramación A1, medio normal

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imagen43

11 24,99 382,08 2,73

imagen44

25 2,77 19,54 7,01

imagen45

34 20,5 228,13 1,44

imagen46

42 1,31 0,82 3,27

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293T

DÍA OCT4 NANOG SOX2

Reprogramación A2, medio con un 0,4 % de extracto

11

0,92 5,92 0,93

25

0,9 0,76 0,99

34

1,34 123,61 1,84

42

8,14 2,69 6,55

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293T

DÍA OCT4 NANOG SOX2

Reprogramación B1, medio normal

27

2,22 2,74 1,69

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293T

DÍA OCT4 NANOG SOX2

Reprogramación, B2, medio con un 0,4 % de extracto

27

2,51 3,28 1,80

Reprogramación C1, medio normal

5

0,41 0,53 1,84

11

0,61 0,56 1,73

20

8,65 14,83 1,89

28

125,70 18,03 84,69

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293T

DÍA OCT4 NANOG SOX2

49

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Tabla 6

Calcular n.º de divisiones celulares:

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Número de células (Ne) = Número inicial de células (No)12^ número de divisiones (g)

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g = (log Ne -log No)/0,301

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imagen90 imagen91 imagen92 24 h 41 h 68 h

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60314-24 060313 -0 imagen94 imagen95 min/generación (T(horas) x 60)/g =

g = 24H

log Ne log No imagen96 imagen97 imagen98 Min/gen = imagen99

2,3704

517000 100000 imagen100 293norm imagen101 607,4923 768,2811 693,4967

2,018123

405000 100000 imagen102 293Tnorm+LE 713,5343 824,4037 922,3786

1,613692

306000 100000 imagen103 293Tnorm+ZE 892,3634 824,9083 689,2529

2,208113

462000 100000 imagen104 293Tpriv 652,1406 1072,826 1695,597

2,170141

450000 100000 imagen105 293Tpriv+LE 663,5513 989,671 669,0016

2,3704

517000 100000 imagen106 293Tpriv+ZE 607,4923 1252,756 1228,08

imagen107

imagen108 imagen109 imagen110 imagen111 imagen112 imagen113 imagen114

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60315-41 060313 -0 imagen116 imagen117 imagen118 imagen119 imagen120

g = (log Ne -log No)/0,301

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g = 41H

log Ne log No imagen127 imagen128 imagen129 imagen130 imagen131 imagen132

3,201953

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2,983975

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2,98215

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2,485675

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g = 68H

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5,883229

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4,423347

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Las biopsias en el brazo derecho (superior e inferior) se usaron como controles (no tratados), mientras que las biopsias en el brazo izquierdo se trataron 1x al día con cualquiera de LEX32 (herida en el brazo superior) o crema de Elisabeth Arden durante 8 horas (herida en el brazo inferior). Las heridas de la biopsia se cubrieron con apósitos los primeros 8 días hasta la formación de costras. Los apósitos se cambiaban 1x al día, en el momento de la aplicación

5 de la crema LEX/8 horas. Después de la formación de la costra, la herida se mantenía sin cubrir, y LEX se aplicaba a la herida diariamente hasta el día 28. Las fotografías de cada heridas y cicatrices se tomaron diariamente con una cámara digital y una regla milimétrica mantenida acerca de la herida para comparar los tamaños de la herida durante el proceso de cicatrización.

Para este estudio se usó LEX del lote 32. El lote se fabricó a partir de huevos de trucha y sin bacterias. QC estaba

10 dentro del intervalo normal del producto LEX habitual. El extracto se almacenó a -20 ºC y los tubos de 1,5 ml se descongelaron el día 1, día 5, día 10 y el día 20. Una pequeña cantidad de LEX se aplicó con la punta en q directamente a la herida, y el tubo descongelado se almacenó a número 4 ºC hasta 10 días. No se desarrolló olor, y no había signos de infección o crecimiento bacteriano en LEX ni en la herida.

Sumario de resultados:

15 Tabla 16

Día

Herida tratada con LEX Herida de control positivo tratada con crema durante 8 horas Control no tratado

0

3 mm de biopsia tomados 3 mm de biopsia tomados 3 mm de biopsia tomados

3

Herida seca Herida abierta húmeda Herida abierta húmeda

5

Herida seca, costra fina, visiblemente mejor contraída/más pequeña que los controles Herida seca con costra. Mismo tamaño que el control no tratado. Color más rojo que el control. Herida seca con costra. Mismo tamaño que con crema durante 8 horas.

13

Herida de 2/3 del tamaño de la herida de control, de color menos rojo y con una costra más pequeña Cicatrización de color rojo alrededor de los bordes, costra grande Cicatrización de color rojo alrededor de los bordes, mismo tamaño que con crema durante 8 horas, costra más pequeña

18

Reepitelialización. Sin costra, cicatriz de color rosa claro con parámetros uniformes Costra, bordes hinchados de color rojo Costra, bordes de color rojo

21

Cicatriz aplanada y de color rosa claro Reepitelialización. Sin costra, cicatriz de color rojo, menos uniforme hinchada que el control con LEX y no tratado Reepitelialización. Sin costra, escamas de color blanco secas bajo la cicatriz, bordes de color rojo

28

Remodelación de la cicatriz. Cicatriz visiblemente más pequeña con menos engrosamiento en la parte media Remodelación de la cicatriz. Cicatriz roja y engrosándose en la parte media. Hinchazón palpable. Remodelación de la cicatriz. Cicatriz roja, bordes no uniformes, engrosándose en la parte media.

Discusión: Los resultados presentados en el formato de la tabla anterior indican que la aplicación diaria de LEX puro al 100 % acelera y mejora la curación de la herida en muchos parámetros. La crema durante 8 horas (control positivo) no era mejor, o ligeramente peor, que en el caso sin tratar en la mayoría de los parámetros:

20 Secado más rápido de la herida. La herida tratada con LEX estaba seca (ningún fluido extracelular exudando de la herida) en el día 4, un día completo antes de las otras 2 heridas. Esto se puede deber parcialmente a que el LEX por sí mismo seca y forma una membrana seca, que protege la herida. También se formó una costra seca completa primero entre las 3 heridas. Reepitelialización más rápida. La herida tratada con LEX perdió la costra (definido como reepitelialización) 3

25 días antes que la herida sin tratar o la herida tratada con crema durante 8 horas 8 (día 18 en comparación con el día 21). Reducción de la inflamación. Durante todo el proceso de cicatrización, la herida tratada con LEX estaba menos roja, menos hinchada y parecía menos inflamada que la herida no tratada, y en particular mejor en estos aspectos que la herida tratada con crema durante 8 horas, que estaba hinchada, roja y pruriginosa antes de la

30 reepitelización completa. El menor enrojecimiento de la herida tratada con LEX era particularmente visible desde el día 5-23. El LEX fluido aplicado a la herida contiene una alta concentración de proteínas y también sales

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