PL241125B1 - Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania jako środek do pobudzania regeneracji lub gojenia ran - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest kompozycja farmaceutyczna, która zawiera zebularynę i/lub jej farmaceutycznie dopuszczalną sól oraz co najmniej jeden dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i/lub rozcieńczalnik. Przedmiotem zgłoszenia jest też zastosowanie kompozycji określonej powyżej jako środka leczniczego do regeneracji lub leczenia ran wywołanych przez uszkodzenia mechaniczne i/lub chemiczne i/lub termiczne i/lub operacje chirurgiczne. Zgłoszenie obejmuje także sposób pobudzania gojenia ran i ich regeneracji, który obejmuje podanie terapetycznie skutecznej dawki kompozycji farmaceutycznej zdefiniowanej powyżej.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, która zawiera zebularynę do zastosowania medycznego.

Regeneracja to zdolność do odtwarzania uszkodzonych lub utraconych tkanek i organów, co wiąże się z odzyskaniem ich struktury i funkcji. W przypadku powstawania blizny, które jest innym typem odpowiedzi na zranienie, w miejsce uszkodzonych struktur powstaje włóknista tkanka łączna. Zdolności regeneracyjne u ssaków obniżają się wraz z rozwojem organizmu. U dorosłych ssaków zachodzi regeneracja fizjologiczna, jak w przypadku wątroby, naskórka, nabłonka, jelita, ale nie są one zdolne do regeneracji epimorficznej, czyli odtwarzania utraconych narządów.

Obniżenie zdolności do regeneracji i gojenia ran, występowanie ran przewlekłych (Frykberg and Banks 2015) może wiązać się ze stosowaniem radioterapii (Gieringer et al. 2011), chemioterapii (Falcone and Nappi 1984), a także z rozmaitymi stanami chorobowymi, zwłaszcza nowotworami (McCaw 1989, Rybiński et al. 2014), cukrzycą i niedokrwieniem (Brem et al. 2003, Blakytny and Jude 2006).

Bezbliznowe gojenie ran skóry obserwowane u płodów (Podolak-Popinigis et al. 2016) u różnych gatunków ssaków, pełna naprawa uszkodzeń mięśnia sercowego po częściowej resekcji odkryta u noworodków myszy (Porrello et al. 2011) i regeneracja rdzenia kręgowego po całkowitej transekcji u noworodków oposów krótkoogonowych (Fry et al. 2003) to spektakularne przykłady obrazujące olbrzymi potencjał regeneracyjny ssaków, który ulega wyciszeniu u osobników dorosłych.

Metoda wycinania otworów o średnicy 2 mm w środkowej części małżowiny usznej umożliwia trwałe znakowanie myszy laboratoryjnych. Gojenie się tych otworów prowadzi do pewnego zmniejszenia ich średnicy, ale pozostają one do końca życia. W odróżnieniu od przeważającej części szczepów laboratoryjnych, mysz MRL/MpJ wykazuje zdolności do pełnego zamknięcia takich otworów po 30 dniach od uszkodzenia (Clark et al. 1998). Następuje odtworzenie architektury tkanki złożonej obejmujące nie tylko skórę, ale naczynia krwionośne, mięśnie, chrząstkę i nerwy obwodowe (Buckley et al. 2011), które, co więcej, wydaje się wiązać z podwyższoną odpowiedzią regeneracyjną w innych tkankach, w tym w sercu (Leferovich et al. 2001), kikutach palców po amputacji (Chadwick et al. 2007), siatkówce (Xia et al. 2011), rogówce (Ueno et al. 2005), rdzeniu kręgowym (Thuret et al. 2012), ścięgnach (Lalley et al. 2015) i chrząstce stawów (Fitzgerald et al. 2008).

Zjawisko zarastania otworu w małżowinie usznej można uważać zatem za wyznacznik potencjału regeneracyjnego całego organizmu. Regenerację małżowiny usznej można stymulować farmakologicznie u myszy laboratoryjnych, które nie wykazują spontanicznej zdolności do zamykania otworów w uszach.

Zamykanie otworów w uszach myszy po zewnętrznym podaniu GM284, liganda immunofilin przedstawiono w opisie wynalazku US 2009/0093528 A.

W następnych latach opisano stymulację częściowego zamykania otworów wyciętych w małżowinie usznej przy wykorzystaniu inhibitora szlaku Wnt, XAV-939 (Bastakoty et al. 2015) oraz inhibitora hydroksylazy prolilowej, 1,4-DPCA (kwas 4-okso-1H-1,10-fenantrolino-3-karboksylowy (Zhang et al. 2015).

Rozwój organizmu i jego organów zależy od regulacji epigenetycznej. Ponadto, zmiany epigenetyczne determinują indukcję pluripotencji w komórkach somatycznych. Epigenetyczne podstawy potencjału regeneracyjnego (Gornikiewicz et al. 2013, Gornikiewicz et al. 2016, Podolak-Popinigis et al. 2016) i udział mechanizmów epigenetycznych w procesach regeneracji był przedmiotem kilku prac badawczych (Yakushiji et al. 2007, Powell et al. 2013, Sim et al. 2015). Jednak próby użycia czynników epigenetycznych do pobudzenia procesów regeneracyjnych nie zakończyły się znaczącymi sukcesami (Wang et al. 2010, Tan et al. 2015).

Metylacja DNA należy do podstawowych mechanizmów epigenetycznej regulacji ekspresji genów i odgrywa istotną rolę w szeregu procesów biologicznych jak rozwój, organogeneza, starzenie się, różnicowanie i odróżnicowanie. Zaburzenia metylacji DNA najpierw odkryte w nowotworach, znaleziono później w wielu innych chorobach. Generalnie metylacja regionów promotorowych skutkuje wyciszeniem ekspresji genów. Inhibicja metylotransferaz DNA prowadzi do pasywnej demetylacji DNA wraz z kolejnymi rundami replikacyjnymi, co umożliwia aktywację tranksrypcyjną genów wyciszonych przez metylację DNA. Wyciszenie ekspresji genu przez metylację DNA spotyka się w różnych stanach patologicznych, stąd inhibitory metylotransferaz DNA są przedmiotem badań jako potencjalne leki nie tylko w nowotworach, ale też w zaburzeniach immunologicznych i neurodegeneracyjnych.

PL 241 125 B1

Wśród inhibitorów metylotransferaz DNA wyróżnić można inhibitory nukleozydowe i nienukleozydowe. Inhibitory nukleozydowe są analogami naturalnych inhibitorów i są inkorporowane do DNA podczas replikacji. Wiązanie zmodyfikowanych nukleozydów inkorporowanych do DNA przez metylotransferazę DNA skutkuje jej nieodwracalną inhibicją. Aktywność inhibitorów nienukleozydowych nie wymaga inkorporacji do DNA, zatem mogą blokować metylotransferazy DNA w komórkach nie dzielących się. Inhibitory nukleozydowe z kolei mogą po inkorporacji do DNA pozostać w komórkach dłużej niż nienukleozydowe.

5-aza-2’-deoksycytydyna (decytabina) i 5-azacytydyna (azacytydyna) są wykorzystywane w leczeniu zespołów mielodysplastycznych i ostrych białaczek szpikowych. Aktywność przeciwnowotworowa wiązana jest z efektami cytotoksyczności oraz demetylacji DNA, przy czym ten ostatni stymulować różnicowanie komórek.

Zebularyna jest analogiem cytydyny pozbawionym grupy aminowej przy atomie węgla 4 w pierścieniu pirymidynowym. Inhibicja metylotransferaz DNA przez zebularynę wymaga uprzedniej inkorporacji tego nukleozydu do DNA, co z kolei poprzedza złożona aktywacja metaboliczna obejmująca: fosforylację zebularyny do monofosforanu przez kinazę urydynowo-cytydynową, dalszą fosforylację do dwufosforanu przez kinazę monofosforanów nukleozydów i redukcję przez reduktazę rybonukleotydów do dwufosforanu deoksyzebularyny oraz kolejną fosforylację przez kinazę dwufosforanów nukleozydów do trójfosforanu deoksyzebularyny (Ben-Kasus et al. 2005), który jest substratem polimerazy DNA. Zebularyna jest włączana do DNA podczas jego syntezy głównie w miejsce cytydyny i paruje się nieprawidłowo z adeniną (Lee et al. 2004). Zebularyna inkorporowana do łańcucha DNA tworzy stabilny addukt kowalencyjny z metylotransferazą DNA(ale w odróżnieniu od 5-aza-2’deoksy-cytydyny podczas inhibicji nie ulega metylacji). W efekcie dochodzi do obniżenia poziomu metylotransferaz DNA prowadzące do hypometylacji (Cheng et al. 2004). Zebularyna wnika do komórki w drodze transportu aktywnego, ale jednocześnie zachodzić może jej usuwanie za pośrednictwem białek transporterowych (Arimany-Nardi et al. 2014). Powstawaniu trójfosforanu deoksyzebularyny, substratu inkorporowanego do DNA, przeciwdziałają procesy utleniania zebularyny przez cytozolową oksydazę aldehydową mające miejsce głównie w wątrobie oraz inkorporację do RNA, przy czym szacuje się, że inkorporacja do RNA jest siedmiokrotnie wyższa niż do DNA (Ben-Kasus et al. 2005). Ponadto cytydyna może hamować kompetytywnie fosforylację zebularyny (Ben-Kasus et al. 2005).

W odróżnieniu od dwóch stosowanych klinicznie leków epigenetycznych, 5-azacytydyny i 5-aza-2’-deoksy-cytydyny, zebularyna wykazuje wysoką stabilność w wodzie gdzie jej czas półtrwania wynosi 508 h w 37°C, przy pH 7,4 (Cheng et al. 2003) oraz bardzo niską cytotoksyczność tak w hodowlach komórkowych (Ben-Kasus et al. 2005), jak i w modelu zwierzęcym. U myszy traktowanych dawką 400 mg/kg wagi ciała zebularyny podawanej dożylnie przez 78 kolejnych dni (Herranz et al. 2006) nie zaobserwowano efektów toksycznych.

Ograniczenia związane z metaboliczną aktywacją odpowiadają prawdopodobnie za konieczność stosowania wysokich dawek zebularyny (kilkaset mg/kg wagi ciała), ale też jej niską toksyczność. Niską toksyczność zebularyny tłumaczy też fakt, że jej metabolity są substancjami endogennymi Beumer et al. 2006). Poza wymogiem użycia Bardzo wysokich dawek, zastosowanie zebularyny komplikuje jej działanie jako inhibitora syntazy tymidylanowej i deaminazy cytydynowej (Yoo et al. 2008).

Z uwagi na te wady zebularyna, choć wykazuje interesujące właściwości jako potencjalny lek, nie weszła nigdy ani do użycia medycznego, ani nawet do prób klinicznych. Niemniej jednak zebularyna była badana pod kątem zastosowań medycznych, głównie, jako lek przeciwnowotworowy na modelach komórkowych i zwierzęcych (Herranz et al. 2006, Tan et al. 2013, Yang et al. 2013). Wykazano działanie na różne typy nowotworów przy stosowaniu samej zebularyny lub jej użyciu jako senzybilizatora (Andrade et al. 2014).

Wskazywano też na inne możliwe zastosowania medyczne zebularyny. Znaleziono anty-immunogenne działanie zebularyny wywierane prawdopodobnie poprzez indukcję 2,3-deoksygenazy indoleaminowej w śledzionie, co może zostać wykorzystane w leczeniu chorób autoimmunologicznych lub w celu zapobiegania odrzuceniu przeszczepu (Nittby et al. 2013).

Podanie zebularyny bezpośrednio do miejsca uszkodzenia mózgu wywiera efekt neuroprotekcyjny, co obserwowano w modelu udaru wywołanym u szczura (Dock et al. 2015). Ponadto wykazano, że zebularyna stymuluje transdyferencjację mezenchymalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów (Naeem et al. 2013).

Wskutek demetylacji DNA może dojść do reaktywacji wyciszonych genów, w tym genów zdolnych do indukcji pluripotencji lub transdyferencjacji komórek.

PL 241 125 B1

W opisie wynalazku US2011/0076678 A Zebularyna wymieniana jest pośród innych inhibitorów metylotransferaz DNA jako jeden z czynników demetylujących, które indukują pluripotencję, natomiast w opisie wynalazku US 2011/0206644 A zebularyna wymieniana jest pośród innych inhibitorów metylotransferaz DNA jako jeden z czynników demetylujących, które indukują transdyferencjację.

Chociaż rozważano jej wykorzystanie w terapiach komórkowych, zebularyny nie użyto dotąd w celu pobudzania regeneracji w modelu zwierzęcym.

W odniesieniu do podłoża aktywności proregeneracyjnej, rozważyć należy nie tylko demetylację DNA, ale też działanie neuroprotekcyjne, cytotoksyczne w odniesieniu do wybranych typów komórek i immunomodulujące zebularyny. Zebularyna nie jest wyłącznie inhibitorem metylotransferaz DNA, ale też deaminazy cytydynowej i syntazy tymidylanowej.

Zebularyna jest nukleozydowym inhibitorem metylotransferaz DNA jak również deaminazy cytydynowej lub syntazy tymidylanowej znanym także pod następującymi nazwami: pyrimidin-2-one β-D-ribofuranoside, 2(1H)-pyrimidinone riboside, ribosylpyrimidin-2-one, 4-Deoxyuridine, 1-(e-D-Ribofuranosyl)-1,2-dihydropyrimidin-2-one, 2-Pyrimidone-1 -β-D-riboside.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest pierwsze zastosowanie epigenetycznej terapii regeneracyjnej w organizmie ssaka polegające na podaniu kompozycji farmaceutycznej zawierającej zebularynę kwas retinowy lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole oraz co najmniej jeden znany dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub rozcieńczalnik do zastosowania jako środek do pobudzania regeneracji lub gojenia ran wywołanych przez uszkodzenia mechaniczne, chemiczne, termiczne, operacje chirurgiczne lub stany patologiczne.

Kompozycja farmaceutyczna według drugiego wynalazku zawiera zebularynę i kwas retinowy lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole oraz co najmniej jeden znany dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub rozcieńczalnik do zastosowania jako środek leczniczy do regeneracji lub leczenia ran wywołanych przez uszkodzenia mechaniczne lub chemiczne lub termiczne lub radiacyjne lub operacje chirurgiczne lub inne stany patologiczne.

Korzystnie zastosowanie dotyczy odleżyn, ran jako powikłań cukrzycowych lub powikłań choroby tętnic obwodowych.

W tym aspekcie zebularyna jako analog cytydyny może być włączana do nowosyntetyzowanego łańcucha DNA i działa jako inhibitor metylotransferaz DNA.

Istnieją cztery zasady budujące cząsteczkę DNA: cytozyna, guanina, adenina i tymina. Cytozyny wchodzące w skład dinukleotydów CpG mogą być metylowane do 5-metylocytozyny. Takie modyfikacje w regionach promotorowych genu prowadzą często do jego wyciszenia. Po replikacji DNA jedna z jego nici jest zmetylowana (nić macierzysta), a druga niezmetylowana (nić potomna) i taka cząsteczka DNA określana jest jako hemimetylowana. Po zahamowaniu aktywności metylotransferaz DNA, w wyniku replikacji powstaną nici potomne, która pozostaną niezmetylowane, co z czasem prowadzi do biernej demetylacji.

W powiązanym aspekcie, metody i kompozycje przedstawione w niniejszym wynalazku stymulują silnie regenerację tkanki złożonej po zranieniu. Użycie przedmiotowych kompozycji może hamować metylację DNA, jak również modulować działanie systemu immunologicznego podczas wczesnych etapów gojenia rany.

Demetylacja DNA pod wpływem zebularyny może prowadzić do aktywacji wyciszonych genów w tym geny odpowiedzialne za gojenie ran i regenerację, takie jak geny pluripotencji.

Zebularyna może zwiększać wytwarzanie 2,3 dioksygenazy indoleaminowej (IDO), która jest naturalnym czynnikiem immunosupresyjnym.

2,3- dioksygenaza indoleaminowa (IDO) rozkłada grupę indolową tryptofanu i inicjuje wytwarzanie neuroreaktywnych metabolitów regulujących działanie układu odpornościowego, znanych pod ogólną nazwą kynurenin.

Immunosupresyjne działanie IDO można tłumaczyć: (i) głodzeniem tryptofanowym; (ii) bezpośrednim działaniem toksycznym wspomnianych metabolitów(katabolitów), które indukują apoptozę komórek układu odpornościowego; (iii) stymulacją komórek pomocniczych T do immunosupresyjnych komórek regulatorowych.

Zebularyna może wywierać efekt cytotoksyczny na wybrane grupy komórek w rejonie uszkodzenia eliminując w ten sposób komórki odpowiedzialne za szkodliwy stan zapalny oraz wytwarzanie blizny i w ten sposób pobudzając regenerację.

PL 241 125 B1

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych kompozycji i sposobów, które mogłyby być zastosowane do regeneracji tkanek złożonych po uszkodzeniu. Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w istotnym stopniu w niniejszym wynalazku.

Określenia stosowane w niniejszym opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:

Określenie “rana” obejmuje każdy rodzaj uszkodzenia żywej tkanki wywołany przez uderzenie lub ucisk i inne czynniki mechaniczne, oparzenie, odmrożenie, promieniowanie, czynniki chemiczne, niedokrwienie i inne czynniki biologiczne. W szczególności termin “rana” obejmuje uszkodzenia skóry, ale też innych tkanek i organów.

Określenie “gojenie ran” odnosi się do pouszkodzeniowego procesu naprawczego, który obejmuje oczyszczenie obszaru rany z ciał obcych i martwych tkanek i proliferację komórek prowadzącą do odtworzenia ciągłości tkanki bądź to z wytworzeniem blizny lub bez.

Określenie “regeneracja” oznacza proces odtworzenia utraconych tkanek, struktur i przydatków zachodzące spontanicznie lub pod działaniem stymulacji farmakologicznej.

Określenie “tkanka złożona” odnosi się do tkanki zawierającej co najmniej dwa różne współdziałające typy komórek.

Określenie “rana przewlekła” lub “rana niegojąca się” odnosi się do ran, które nie wykazują wyraźnego gojenia w czasie przekraczającym normalne gojenie; typowo rany, które nie goją się w ciągu 3 miesięcy są określane jako przewlekłe. Rany przewlekłe lub rany niegojące się są często związane z niedokrwieniem lub owrzodzeniem u pacjentów cukrzycowych, ale nie są ograniczone do tej grupy.

Określenie „miejsca CpG ” i „CpG” odnoszą się do sekwencji nukleotydowej DNA, gdzie nukleotyd cytozynowy poprzedza nukleotyd guaninowy w orientacji 5' ^ 3.

Określenie „metylotransferaza DNA” lub “DNMT” odnoszą się do białek DNMT1, DNMT3a i DNMT3b. DNMT1 jest zachowawczą metylotransferazą DNA, czyli odpowiedzialną za kopiowanie wzorów metylacyjnych DNA na nić potomną po replikacji, natomiast DNMT3a and DNMT3b znane są jako metylotransferazy DNA „de novo”, które kształtują wzory metylacji DNA we wczesnych etapach rozwoju organizmu.

Określenie “IDO” odnosi się do trzech różnych białek, które mogą przetwarzać tryptofan: IDO-1, IDO-2 i TDO.

W przypadku, gdy zebularyna jest podawana we wczesnej fazie gojenia ran, należy rozumieć, że określenie “faza wczesna” obejmuje odpowiedź immunologiczną bezpośrednio po zranieniu, ale przed etapem remodelingu.

OPIS FIGUR

Figura 1. - przedstawia reprezentatywne fotografie zamykania małżowiny usznej wykonane w 42 dniu po uszkodzeniu u myszy traktowanych zebularyną i kontroli otrzymujących vehiculum.

Otwory w małżowinie usznej myszy, którym podawano zebularynę w postaci zastrzyków dootrzewnowych ulegały niemal całkowitemu zamknięciu w ciągu około 30 dni po uszkodzeniu, podczas gdy u kontroli traktowanych zastrzykami dootrzewnowymi z soli fizjologicznej ulegały one nieznacznemu zmniejszeniu w porównaniu do początkowo wyciętego koła o średnicy 2 mm. Zebularynę podawano 7 razy (1000 mg/kg wagi ciała): w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 1,2, 3, 4, 7 i 10 dni po uszkodzeniu.

Figura 2. - przedstawia wyniki regeneracji małżowiny usznej u 47 myszy traktowanych zebularyną (n = 94 uszy) i 48 myszy kontrolnych (n = 95 uszu) przedstawione jako procent zamknięcia otworu w dniu 42 po uszkodzeniu.

Istotność statystyczną wyników wyznaczono przy użyciu heteroskedastycznego dwuskrzydłowego testu t- Studenta. Różnice o istotności statystycznej p < 0.001 są oznaczone trzema gwiazdkami (***).

Zebularynę podawano 7 razy (1000 mg/kg wagi ciała): w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 1,2, 3, 4, 7 i 10 dni po uszkodzeniu.

Figura 3. - przedstawia przebieg zamykania otworów w małżowinie usznej wyznaczony w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu i w 7, 14, 21,28, 35 oraz 42 dniu po uszkodzeniu u 47 myszy traktowanych zebularyną (n = 94 uszy) i 48 myszy kontrolnych (n = 95 uszu).

Średnia powierzchnia otworów w małżowinie usznej myszy traktowanych zebularyną i kontrolnych była podobna w początkowych dniach po uszkodzeniu. W dniu 14 po uszkodzeniu u zwierząt, które otrzymywały zebularynę, średnia powierzchnia była nieco większa, gdy od dnia 21 odnotowywano,

PL 241 125 B1 że jest wyraźnie mniejsza względem kontroli. Maksymalne zamknięcie otworów w małżowinie usznej obserwowano w dniu 35 po uszkodzeniu.

Zebularynę podawano 7 razy (1000 mg/kg wagi ciała): w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 1,2, 3, 4, 7 i 10 dni po uszkodzeniu.

Istotność statystyczną wyników wyznaczono przy użyciu dwuskrzydłowego testu Manna-Whitneya. Różnice o istotności statystycznej p < 0,001 są oznaczone trzema gwiazdkami (***).

Figura 4. - przedstawia rozkład powierzchni otworów w małżowinie usznej u 47 myszy traktowanych zebularyną (n = 94 uszy) i 48 myszy kontrolnych (n = 95 uszu) w dniu 42 po uszkodzeniu. Każda kropka reprezentuje jedno ucho.

Zebularynę podawano 7 razy (1000 mg/kg wagi ciała): w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 1, 2, 3, 4, 7 i 10 dni po uszkodzeniu. Istotność statystyczną wyników wyznaczono przy użyciu dwuskrzydłowego testu Manna-Whitneya. Różnice o istotności statystycznej p < 0,001 są oznaczone trzema gwiazdkami (***).

Figura 5. - przedstawia efekt dawki zebularyny na regenerację małżowiny usznej u myszy.

Średnią powierzchnię otworów w małżowinie usznej wyznaczono po podaniu zebularyny w dawkach 250, 500 i 1000 mg/kg wagi ciała dla dnia 42 po uszkodzeniu. Zebularynę podawano 7 razy: w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 1,2, 3, 4, 7 i 10 dni po uszkodzeniu.

Istotność statystyczną wyników wyznaczono przy użyciu dwuskrzydłowego testu Manna-Whitneya. Różnice o istotności statystycznej p < 0,001 są oznaczone trzema gwiazdkami (***).

Figura 6. - przedstawia efekt podskórnego i dootrzewnowego podania zebularyny na regenerację małżowiny usznej myszy.

Średnią powierzchnię otworów w małżowinie usznej wyznaczono dla dnia 42 po uszkodzeniu. Zebularynę (1000 mg/kg) podawano 7 razy: w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 1, 2, 3, 4, 7 i 10 dni po uszkodzeniu. Istotność statystyczną wyników wyznaczono przy użyciu dwuskrzydłowego testu Manna-Whitneya. Różnice o istotności statystycznej p < 0,001 są oznaczone trzema gwiazdkami (***).

Figura 7. - przedstawia zmiany ekspresji genów związanych z pluripotencją, rozwojem i cyklem komórkowym obserwowane po podaniu zebularyny w rejonie uszkodzenia i regeneracji.

Względne zmiany ekspresji genów wyznaczono metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym stosując Tbp i Actb jako transkrypty referencyjne. Średnie wartości stosunku ekspresji genu względem genów referencyjnych wyznaczono dla 6 myszy (n = 8 uszu) dla każdego z dni pomiarowych.

Istotność statystyczną wyników wyznaczono przy użyciu dwuskrzydłowego testu Manna-Whitneya. Różnice o istotności statystycznej p < 0.05 są oznaczone gwiazdką (*).

Figura 8. - przedstawia spadek metylacji DNA w rejonie uszkodzenia i regeneracji po podaniu zebularyny.

Średnią zawartość 5-metylocytozyny wyznaczano dla 5 myszy (n = 8 uszu) dla każdego z dni pomiarowych. Istotność statystyczną wyników wyznaczono przy użyciu heteroskedastycznego dwuskrzydłowego testu t- Studenta. Różnice o istotności statystycznej p < 0.001 są oznaczone trzema gwiazdkami (***).

Figura 9. - przedstawia reprezentatywne fotografie przedstawiające całkowite regeneracyjne zamknięcie otworów w uszach myszy pod wpływem synergistycznego działania kwasu retinowego (RA) i zebularyny.

Kompletne zamknięcie otworów w małżowinie usznej u myszy traktowanej zebularyną i kwasem retinowym w postaci iniekcji dootrzewnowych w ciągu 21 dni po uszkodzeniu. Zebularynę (1000 mg/kg wagi ciała) podawano 7 razy: w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 1,2, 3, 4, 7 i 10 dni po uszkodzeniu. Kwas retinowy RA (16 mg/kg wagi ciała) podawano 6 razy: w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 2, 4, 7, 9 i 11 dni po uszkodzeniu. Kontrole, którym podawano vehiculum nie wykazywały znaczącego zamykania otworów, natomiast częściowe zamykanie otworów miało miejsce u myszy traktowanych tylko RA.

Figura 10. - przedstawia synergistyczny efekt działania pro-regeneracyjny zebularyny i kwasu retinowego.

Przebieg zamykania otworów w małżowinie usznej myszy wyznaczono bezpośrednio po uszkodzeniu oraz w dniu 7, 14, 21, 28, 35 i 42 po jego wykonaniu u 12 myszy (n = 24 uszy) traktowanych zebularyną w kombinacji z kwasem retinowym (ZEB+RA), 6 myszy (n = 12 uszu) otrzymujących jedynie kwas retinowy (RA), 6 myszy (n = 12 uszu) otrzymujących kwas 4-keto-retinowy (4-keto-RA) i 12 myszy

PL 241 125 B1 (n = 24 uszy), którym podawano vehiculum (ZEB+RA contrl). Na te wykresy nałożono przebieg zamykania otworów w uszach u myszy traktowanych tylko zebularyną (ZEB, Rysunek 3). Całkowite zamknięcie otworów w uszach odnotowano w dniu 21 po uszkodzeniu jedynie u myszy, którym podawano kombinację zebularyny i kwasu retinowego. Zebularynę (1000 mg/kg wagi ciała) podawano 7 razy: w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 1,2, 3, 4, 7 i 10 dni po uszkodzeniu. Kwas retinowy RA (16 mg/kg wagi ciała) podawano 6 razy: w dniu uszkodzenia bezpośrednio po jego wykonaniu, a następnie 2, 4, 7, 9 i 11 dni po uszkodzeniu.

Figura 11. - przedstawia działanie 5-azacytydyny na zamykanie otworów w małżowinie usznej myszy.

5-azacytydynę (5-azaC) (0,25 mg/kg wagi ciała) podawano 7 razy: w dniu uszkodzenia, bezpośrednio po uszkodzeniu i w 1,2, 3, 4, 7, 10 dniu po uszkodzeniu. Średnią powierzchnię otworu w małżowinie usznej wyznaczono dla dnia 42 po uszkodzeniu. Wyniki porównano z rezultatami otrzymanymi dla myszy traktowanych zebularyną (1000 mg/kg wagi ciała) oraz kontrolami, które otrzymywały sól fizjologiczną według tego samego schematu. Istotność statystyczną wyznaczono przy użyciu dwuskrzydłowego testu Manna-Whitneya. Różnice o istotności statystycznej p < 0,001 są oznaczone trzema gwiazdkami (***).

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia

P r z y k ł a d 1

Wpływ zebularyny na regenerację tkanki złożonej

W celu określenia działania zebularyny na proces regeneracji tkanki złożonej, w środkowej części małżowiny usznej u dwumiesięcznych samic myszy BALB/c wycięto otwory o średnicy 2 mm przy użyciu laboratoryjnego dziurkacza nożyczkowego. Myszy losowo podzielono na dwie grupy po 6 osobników. Myszom z pierwszej grupy podawano dootrzewnowo 7 dawek zebularyny (1000 mg/kg wagi ciała) w soli fizjologicznej (50 mg/ml), w dniu zranienia bezpośrednio po wykonaniu uszkodzenia oraz 1, 2, 3, 4, 7, 10 dni po zranieniu. Myszom z drugiej grupy, kontrolnej, podawano dootrzewnowo sól fizjologiczną.

Uszy fotografowano co 7 dni przez 42 dni, a przebieg zarastania otworu śledzono wyznaczając jego powierzchnię za pomocą komputerowej analizy wykonanych zdjęć. Eksperyment powtórzono ośmiokrotnie. Ogółem eksperyment objął 47 myszy traktowanych zebularyną i 48 myszy kontrolnych, które otrzymywały sól fizjologiczną. O ile u osobników kontrolnych odnotowano nieznaczne zamykanie otworów w małżowinie usznej, podobne do wyników prezentowanych w literaturze, rozległe odtworzenie małżowiny usznej obserwowano u zwierząt traktowanych zebularyną, w postaci szerokich kręgów nowoodtworzonej tkanki otaczającej region uszkodzenia, co jest widoczne na zdjęciach (Fig. 1).

Średnie powierzchnie otworu w małżowinie usznej wyznaczone w dniu 42 po uszkodzeniu wynosiły odpowiednio dla myszy traktowanych zebularyną i kontroli otrzymujących sól fizjologiczną 0,53+/-0,3 i 1,77+/-0,48 mm². Wyniki przedstawiono jako procent zamknięcia rany wynoszący 83,2% i 43,6%, odpowiednio dla myszy traktowanych zebularyną i kontrolnych (Fig. 2). Przebieg postępu procesu regeneracyjnego przedstawia Fig. 3.

Statystycznie lepsze zarastanie otworów w małżowinie usznej u myszy traktowanych zebularyną odnotowywano od dnia 21 po zranieniu, a maksymalne zarastanie obserwowano w dniu 35. Rozkłady powierzchni zarastania małżowiny usznej w 42 dniu po zranieniu przedstawione są w formie diagramów, gdzie każda kropka reprezentuje jedno ucho (Fig. 4). Diagram ten nie tylko pokazuje wariancję biologiczną, ale wyraźnie obrazuje kontrast pomiędzy grupą kontrolną a grupą traktowaną zebularyną, gdzie rozrzut wyników jest wyraźnie mniejszy. W celu oceny czy efekt regeneracyjny zależy od dawki zebularyny, porównano działanie dawek 250, 500 i 1000 mg/kg wagi ciała (Fig. 5). Porównano też efekt dootrzewnowego i podskórnego podania zebularyny na zarastanie małżowiny usznej. Podskórne zastrzyki dały wyraźną odpowiedź, ale zdecydowanie słabszą niż podanie dootrzewnowe (Fig. 6).

P r z y k ł a d 2

Wpływ działania zebularyny na ekspresję genów związanych z pluripotencją i rozwojem organizmu

W celu określenia działania zebularyny na ekspresję genów pluripotencji oraz związanych z rozwojem i cyklem komórkowym, zbadano w rejonie uszkodzenia u myszy traktowanych zebularyną i kontrolnych w dniu 7, 14, 21 i 42 po uszkodzeniu a także w niezranionej małżowinie usznej w dniu 0 poziomy transkryptów dla panelu genów związanych z pluripotencją i rozwojem organizmu obejmującego Cdkn2a, Msx1, Nanog, Sox2, Bdnf, Sox1,Nog i Myt11.

W tym celu, zwierzęta poddano terminacji w odpowiednich punktach czasowych, pobrane tkanki umieszczono w roztworze RNAlater (Qiagen) i przechowywano w temp. -80°C. Pierścienie otaczające

PL 241 125 B1 otwory w małżowinie usznej wycinano przy pomocy 3 mm sztancy biopsyjnej i izolowano z nich RNA przy użyciu zestawu RNeasy (Qiagen). Poziomy wybranych transkryptów wyznaczono przy użyciu metody ilościowego PCR w czasie rzeczywistym przy wykorzystaniu Tbp i Actb jako transkryptów referencyjnych dla sześciu myszy (8 uszu) dla każdego punktu czasowego. Sekwencje nukleotydowe starterów do PCR zestawiono w Tabeli 1. Silny wzrost ekspresji badanych genów obserwowano w dniu 7 po uszkodzeniu u myszy traktowanych zebularyną. Szczególnie spektakularny wzrost ekspresji w porównaniu z myszami kontrolnymi dotyczy genów pluripotencji Nanog i Sox2 (Fig. 7).

P r z y k ł a d 3

Wpływ zebularyny na poziom metylacji cytozyny w genomowym DNA w rejonie uszkodzenia i regeneracji

Metylacja regionów promotorowych jest kluczowym epigenetycznym mechanizmem regulacji ekspresji genów polegającym zwykle na represji. W celu wyznaczenia poziomu demetylacji DNA w tkankach regenerujących się, zawartość 5-metylocytozyny porównano u zwierząt traktowanych zebularyną i w kontrolach. W tym celu pobierano uszy po terminacji zwierząt w dniach 7, 14, 21 i 42 po uszkodzeniu przy pomocy 3 mm sztancy biopsyjnej i wycinano z nich pierścienie tkanki otaczającej otwory w małżowinie usznej. Dodatkowo pobrano próbki małżowiny usznej od myszy nie poddanych uszkodzeniu. Z tak uzyskanych próbek izolowano genomowe DNA przy pomocy zestawu DNeasy (Qiagen). Zawartość 5-metylcytozyny wyznaczano dla próbek 100 ng genomowego DNA przy użyciu zestawu 5-mC DNA ELISA (ZYMO, D5325). Wykazano znaczący spadek metylacji DNA w dniu 7 po zranieniu u zwierząt traktowanych zebularyną (Fig. 8), co pokazuje, że odpowiedzi regeneracyjnej towarzyszy demetylacja DNA w regionie uszkodzenia.

P r z y k ł a d 4

Synergistyczne stymulacja regeneracji przez zebularynę i kwas retinowy (RA)

Podczas gdy kwas retinowy stymuluje ekspresję szeregu genów uczestniczących w procesach rozwojowych, można założyć, że zebularyna, jako czynnik demetylujący odblokowuje metylacyjne wyciszenie genów zachodzące wraz z rozwojem organizmu. Dlatego można przyjąć, że połączenie tych dwóch czynników potęguje odpowiedź regeneracyjną w małżowinie usznej myszy. Efekt połączonego podania zebularyny i kwasu retinowego na zarastanie otworów w małżowinie usznej porównano z rezultatami uzyskanymi po podaniu samego kwasu retinowego lub samej zebularyny.

W celu zbadania połączonego działania zebularyny i kwasu retinowego na proces regeneracji tkanki złożonej, w środkowej części małżowinie usznej dwumiesięcznych samic myszy BALB/c wycięto otwory o średnicy 2 mm przy użyciu laboratoryjnego dziurkacza nożyczkowego.

Myszy losowo podzielono grupy po 6 osobników. Myszom z pierwszej grupy podano dootrzewnowo zebularynę (1000 mg/kg wagi ciała) oraz kwas retinowy (16 mg/kg wagi ciała).

Zebularynę podawano w soli fizjologicznej (50 mg/ml), w dniu zranienia bezpośrednio po jego wykonaniu oraz w 1,2, 3, 4, 7, 10 dni po zranieniu, natomiast RA podawano zawiesinie dimetylosulfotlenku w oleju słonecznikowym w dniu zranienia bezpośrednio po jego wykonaniu oraz w 2, 4, 7, 9 i 11 dniu po zranieniu.

Myszom z drugiej grupy podawano tylko RA (16 mg/k wagi ciała), grupy trzeciej kwas keto-retinowy (4-keto RA, 16 mg/k wagi ciała) - pochodną RA i jego komórkowy metabolit powstający w procesie utleniania RA przez cytochromy. Myszom z grupy czwartej, kontrolnej, tylko vehiculum wg tego samego schematu.

Uszy fotografowano co 7 dni przez 42 dni po uszkodzeniu, a przebieg zarastania otworu śledzono wyznaczając jego powierzchnię za pomocą komputerowej analizy wykonanych zdjęć.

Częściowe zamknięcie otworu w małżowinie usznej odnotowano w grupach otrzymujących tylko RA lub tylko 4-keto RA, natomiast bardzo nieznaczne zarastanie u myszy kontrolnych otrzym ujących vehiculum.

W rezultacie połączonego podania zebularyny i kwasu retinowego nastąpiło całkowite zamknięcie otworów w małżowinie usznej w ciągu 21 dni od uszkodzenia, co pokazano na reprezentatywnych zdjęciach (Fig. 9). Przebieg zamknięcia otworu w małżowinie usznej u zwierząt traktowanych kombinacją RA i zebularyny zestawiono z w ynikami uzyskanymi dla RA, 4-keto-RA, vehiculum i zebularyny (Fig. 10).

P r z y k ł a d 5

Działanie 5-azacytydyny na zarastanie otworów wyciętych w małżowinie usznej myszy

5-azacytydyna, podobnie jak zebularyna jest nukleozydowym inhibitorem metylotransferaz DNA. Efekt podania zebularyny na zamykanie otworu w małżowinie usznej myszy badano wg takiego samego

PL241 125 BI schematu jak dla zebularyny, z tym że użyto znacznie niższej dawki (0,25 mg/kg wagi ciała), gdyż 5-azacytydyna, w odróżnieniu od zebularyny, nie ulega metabolicznej konwersji do urydyny, w wyniku czego wykazuje znacznie wyższą aktywność, ale też i toksyczność.

Porównanie wyników otrzymanych dla 6 myszy, którym podawano dootrzewnowo 5-azacytydynę z rezultatami uzyskanymi uprzednio dla zebularyny i soli fizjologicznej, wskazują że 5-azacytydyna nie stymuluje zamykania, ale, przeciwnie, hamuje normalny fizjologiczny proces zarastania otworów w małżowinie usznej (Fig. 11), jakie jest obserwowane u myszy kontrolnych. Przykład ten pokazuje, że zebularyna jako czynnik pro-regeneracyjny nie może zostać zastąpiona dowolnym inhibitorem metylotransferaz DNA.

Tabela 1

Sekwencje nukleotydowe starterów użytych do badania poziomów wybranych transkryptów metodą PCR w czasie rzeczywistym.

Gen	Primer sensowny	Primer antysensowny
Actb	GGCTGTATTCCCCTCCATCG	CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
Bdftf	ATTAGCGAGTGGGTCACAGC	ATTGCGAGTTCCAGTGCCTT
Cdkn2a	TGTGTACCGCTGGGAACG	GCTCTGCTCTTGGGATTGG
Msxl	TCCCCGCTTCTCCCCGCCC	CGGTTGGTCTTGTGCTTGC
Mytll	CGGAACCCAGACATGGAGGT	CTACAGGCAAGTCCCAGCAA
Nanog	TACCTCAGCCTCCAGCAGAT	CCAGATGCGTTCACCAGATA
Nog	CCAGCACTATCTACACATC	i?1
Soxl	CTTCATGGTGTGGTCCCG	TTGCTGATCTCCGAGTTGTG
Sox2	GGGAGAAAGAAGAGGAGAGAGA	CGATTGTTGTGATTAGTTTTTGGA
Tbp	GAGAGCCACGGACAACTGCG	GGGAACTTCACATCACAGCTC

Literatura cytowana w opisie

Andrade, A. F., et al. (2014). Zebularine induces chemosensitization to methotrexate and efficiently decreases AhR gene methylation in childhood acute lymphoblastic leukemia cells. Anticancer drugs 25(1): 72-81.

Arimany-Nardi, C., et al. (2014). Nucleoside transporters and human organie cation transporter I determine the cellular handling of DNA-methyltransferase inhibitors. British journal of pharmacology 171(16): 3868-3880.

Bastakoty, D., et al. (2015). Inhibition of Wnt/p-catenin pathway promotes regenerative repair of cutaneous and cartilage injury. The FASEB Journal 29(12): 4881-4892.

Ben-Kasus, T., et al. (2005). Metabolie activation of zebularine, a novel DNA methylation inhibitor, in human bladder carcinoma cells. Biochemical pharmacology 70(1): 121-133.

Beumer, J. H., et al. (2006). A mass balance and disposition study of the DNA methyltransferase inhibitor zebularine (NSC 309132) and three of its metabolites in mice. Clinical cancer research 12(19): 5826-5833.

Buckley, G., et al. (2011). Peripheral nerve regeneration in the MRL/Mpj ear wound model. J Anat 218(2): 163-172.

Chadwick, R. B., et al. (2007). Digit tip regrowth and differential gene expression in MRL/Mpj, DBA/2, and C57BL/6 mice. Wound Repair Regen 15(2): 275-284.

Cheng, J. C., et al. (2003). Inhibition of DNA methylation and reactivation of silenced genes by zebularine.Journal of the National Cancer Institute 95(5): 399-409.

Cheng, J. C., et al. (2004). Preferential response of cancer cells to zebularine. Cancer celi 6(2): 151-158.

Clark, L. D., et al. (1998). A new murine model for mammalian wound repair and regeneration. Clin Immunol Immunopathol 88(1): 35-45.

PL 241 125 B1

Dock, H., et al. (2015). DNA methylation inhibitor zebularine confers stroke protection in ischemic rats. Translational stroke research 6(4): 296-300.

Fitzgerald, J., et al. (2008). Evidence for articular cartilage regeneration in MRL/MpJ mice. Osteoarthritis Cartilage 16(11): 1319-1326.

Fry, E. J., et al. (2003). Regeneration of supraspinal axons after complete transection of the thoracic spinal cord in neonatal opossums (Monodelphis domestica). J Comp Neurol 466(3): 422-444.

Gornikiewicz, B., et al. (2016). Changes in gene methylation patterns in neonatal murine hearts: Implications for the regenerative potential. BMC Genomics 17: 231.

Gornikiewicz, B., et al. (2013). Epigenetic basis of regeneration: analysis of genomic DNA methylation profiles in the MRL/MpJ mouse. DNA Res 20(6): 605-621.

Herranz, M., et al. (2006). The novel DNA methylation inhibitor zebularine is effective against the development of murine T-cell lymphoma. Blood 107(3): 1174-1177.

Lalley, A. L., et al. (2015). Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J Orthop Res 33(11): 1693-1703.

Lee, G., et al. (2004). Mutagenicity of the cytidine analog zebularine in Escherichia coli. DNA repair 3(2): 155-161.

Leferovich, J. M., et al. (2001). Heart regeneration in adult MRL mice. Proc Natl Acad Sci U S A 98(17): 9830-9835.

Liu, H., et al. (2007). Low dose Zebularine treatment enhances immunogenicity of tumor cells. Cancer Lett 257(1): 107-115.

Naeem, N., et al. (2013). DNA Methylation Inhibitors, 5-azacytidine and Zebularine Potentiate the T ransdifferentiation of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Cardiomyocytes. Cardiovascular therapeutics 31(4): 201-209.

Nittby, H., et al. (2013). Zebularine induces long-term survival of pancreatic islet allotransplants in streptozotoein treated diabetic rats. PLoS One 8(8): e71981.

Podolak-Popinigis, J., et al. (2016). The methylome and transcriptome of fetal skin: implications for scarless healing. Epigenomics 8(10): 1331-1345.

Porrello, E. R., et al. (2011). Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science 331(6020): 1078-1080.

Powell, C., et al. (2013). Analysis of DNA methylation reveals a partial reprogramming of the Muller glia genome during retina regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 110(49): 19814-19819. Sim, C. B., et al. (2015). Dynamic changes in the cardiac methylome during postnatal development. Faseb j 29(4): 1329-1343.

Tan, S. J., et al. (2015). Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Sci Rep 5: 16333.

Tan, W., et al. (2013). The DNA methyltransferase inhibitor zebularine induces mitochondriamediated apoptosis in gastric cancer cells in vitro and in vivo. Biochemical and biophysical research communications 430(1): 250-255.

Thuret, S., et al. (2012). Enhanced functional recovery in MRL/MpJ mice after spinal cord dorsal hemisection. PLoS One 7(2): e30904.

Ueno, M., et al. (2005). Accelerated wound healing of alkali-burned corneas in MRL mice is associated with a reduced inflammatory signature. Invest Ophthalmol Vis Sci 46(11): 4097-4106. Wang, G., et al. (2010). The effects of DNA methyltransferase inhibitors and histone deacetylase inhibitors on digit regeneration in mice. Regenerative medicine 5(2): 201-220.

Xia, H., et al. (2011). Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in MRL/MpJ mice. Exp Eye Res 93(6): 862-872.

Yakushiji, N., et al. (2007). Correlation between Shh expression and DNA methylation status of the limb-specific Shh enhancer region during limb regeneration in amphibians. Dev Biol 312(1): 171-182.

PL241 125 BI

Yang, P.-M., et al. (2013). Zebularine inhibits tumorigenesis and sternness of colorectal cancer via p53-dependent endoplasmic reticulum stress. Scientific reports 3: 3219.

Yoo, C. B., et al. (2008). Activation of p16 gene silenced by DNA methylation in cancer cells by phosphoramidate derivatives of 2'-deoxyzebularine. Journal of medicinal chemistry 51(23): 7593-7601.

Zhang, Y., et al. (2015). Drug-induced regeneration in adult mice. Sci TransilMed 7(290): 290ra292.

Claims (3)

1. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera zebularynę i kwas retinowy lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole oraz co najmniej jeden znany dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub rozcieńczalnik do zastosowania jako środek do pobudzania regeneracji lub gojenia ran wywołanych przez uszkodzenia mechaniczne, chemiczne, termiczne, operacje chirurgiczne lub stany patologiczne.

2. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera zebularynę i kwas retinowy lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole oraz co najmniej jeden znany dopuszczalny farmaceutycznie nośnik lub rozcieńczalnik do zastosowania jako środek leczniczy do regeneracji lub leczenia ran wywołanych przez uszkodzenia mechaniczne lub chemiczne lub termiczne lub radiacyjne lub operacje chirurgiczne lub inne stany patologiczne.

3. Kompozycja do zastosowania według zastrz. 2, znamienna tym, że dotyczy odleżyn, ran jako powikłań cukrzycowych lub powikłań choroby tętnic obwodowych