JP2015165772A - オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＣＳＫ９遺伝子を標的としたより低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏するオリゴヌクレオチドを提供する。
【解決手段】糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドであって、該糖修飾ヌクレオシドが、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得、該ヒトＰＣＳＫ９遺伝子が、特定の塩基配列、またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである、オリゴヌクレオチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、オリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤に関する。

ＬＤＬ受容体の遺伝子に変異を有する家族性高コレステロール血症は、５００人に１人（国内で２５万人）の割合で発症する疾患であり、遺伝性代謝疾患の中で頻度が最も高い。患者の血清総コレステロール値は２３０〜５００ｍｇ／ｄＬを示し（健常者：２００ｍｇ／ｄＬ以下）、皮膚および腱の黄色腫、若年性動脈硬化症による冠動脈疾患などの症状がみられる。患者の平均寿命は男性で５４歳、女性で６９歳と全人口の平均寿命を大きく下回る。代表的な治療法としては、ＬＤＬアフェレーシス治療が挙げられるが、この治療法は患者に多大な負担を強いる。薬物療法としては、スタチンの投与が挙げられるが、家族性高コレステロール血症に対しては、スタチンは十分な効果を示さない。

一方、高脂血症は、癌に次ぐ死因の心筋梗塞や脳卒中の原因となる生活習慣病である。

これらの高コレステロール血症（脂質代謝異常症）に対する治療開発において、最近では、ＬＤＬ（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙリポタンパク質）受容体の代謝を調節しているＰＣＳＫ９遺伝子を標的とした戦略が注目されている。ＬＤＬ受容体を分解するＰＣＳＫ９の遺伝子発現を抑制することにより、ＬＤＬ受容体の発現量が上昇し、ＬＤＬの細胞内への取り込みや代謝を促進させることによって血中ＬＤＬ濃度を低下させる狙いがある。核酸医薬の一手法であるアンチセンス法を利用した治療実験も進められている。

特許文献１には、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とした種々の４’，２’−架橋型糖修飾ヌクレオシドを含有する脂質異常症治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている。しかしながら、より低い用量でより高い治療効果を奏するオリゴヌクレオチドが求められている。

国際公開第２０１２／０２９８７０

S. Obikaら、Tetrahedron Lett.、1997年、第38巻、p. 8735-8738 S. Obikaら、Tetrahedron Lett.、1998年、第39巻、p. 5401-5404 S. K. Singhら、Chem. Commun.、1998年、第4巻、p. 455-456 A. A. Koshkinら、Tetrahedron、1998年、第54巻、p. 3607-3630 S. Obikaら、Bioorg. Med. Chem.、2001年、第9巻、p. 1001-1011 S. M. A. Rahmanら、Angew. Chem. Int. Ed.、2007年、第46巻、p. 4306-4309 S. M. A. Rahmanら、Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids、2007年、第26巻、p. 1625-1628 K. Miyashitaら、Chem. Commun.、2007年、第36巻、p. 3765-3767 S. M. A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.、2008年、第130巻、p. 4886-4896

本発明は、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的としたより低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏するオリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために、ＰＣＳＫ９遺伝子の特定の領域を標的配列とすることによって、４’，２’−架橋型糖修飾オリゴヌクレオシドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドがより低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏することを見出し、本発明を完成させた。

本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドであって、該糖修飾ヌクレオシドが、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、そして該オリゴヌクレオチドが、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得、該ヒトＰＣＳＫ９遺伝子が、以下の塩基配列：配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２０で示される塩基配列；配列番号２６で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３０で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号４２で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５２で示される塩基配列；配列番号５７で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号５９で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号９４で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１１７で示される塩基配列；配列番号１１８で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである。

１つの実施態様では、上記ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、以下の塩基配列：配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである。

１つの実施態様では、上記ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、以下の塩基配列：配列番号２８で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである。

１つの実施態様では、上記架橋構造は、−ＣＨ_２−Ｏ−、−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＲ^１−Ｏ−、−（ＣＨ_２）_２−ＮＲ^１−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲ^１−、−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^１−、−（ＣＨ_２）_２−ＣＯ−ＮＲ^１−、−ＣＯ−ＮＲ^１−Ｘ−、または−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^１−Ｘ−で表され、ここで、Ｒ^１は、水素原子；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；を表し、そしてＸは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。

１つの実施態様では、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、１０〜２５塩基である。

本発明のヒトＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤は、上記オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する。

本発明の脂質異常症治療剤および予防剤は、上記オリゴヌクレオチドを有効成分として含有する。

本発明によれば、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的としたより低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏するオリゴヌクレオチドを提供することができる。

オリゴヌクレオチド（５ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５０ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（０．４、２または１０ｎＭ）で処理したＮＭｕｌｉ細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチド（５または５０ｎＭ）で処理したＨｕＨ７細胞のＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチドを投与したマウスの肝臓でのＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 オリゴヌクレオチドを投与したマウスの血清ＡＬＴ（ＧＰＴ）値および血清ＡＳＴ（ＧＯＴ）値を示すグラフである。

まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、またはｎ−ヘキシル基をいう。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基、炭素数３〜７の任意の環状アルキル基および炭素数３〜７のこれらの組み合わせを包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基などが挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられ、炭素数３〜７のこれらの組み合わせとしては、メチルシクロペンチル基、メチルシクロヘキシル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基、炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基および炭素数２〜７のこれらの組み合わせを包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられ、炭素数２〜７のこれらの組み合わせとしては、メチルシクロブテニル基、メチルシクロペンテニル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の任意の芳香族炭化水素または環構造を構成する１以上の炭素原子が同種または異種のヘテロ原子（窒素原子、酸素原子、または硫黄原子）で置換された炭素数３〜１２の任意の複素芳香族化合物を包含する。炭化水素のみで構成された炭素数６〜１２の芳香族炭化水素としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして環構造にヘテロ原子を含む炭素数３〜１２の任意の複素芳香族化合物としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。

本明細書において、用語「ヌクレオシド」とは、核酸塩基および糖を含むグリコシルアミンをいう。ヌクレオシドとしては、天然に存在するヌクレオシド、無塩基ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ならびに、擬似塩基および／または糖基を有するヌクレオシドが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において、用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドとリン酸とで構成される化合物であって、ヌクレオシドの糖部分とリン酸とがエステル結合を形成している化合物をいう。

本明細書において、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位に水素を有するヌクレオチドをいう。

本明細書において、用語「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸をいう。

本明細書において、用語「リボヌクレオチド」は、ヌクレオチドの糖部分の２’位にヒドロキシを有するヌクレオチドをいう。

本明細書において、用語「リボ核酸（ＲＮＡ）」は、リボヌクレオチドを含む核酸をいう。

本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものいう。例えば、糖部分が修飾された糖修飾ヌクレオシドが挙げられる。

本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」がリン酸ジエステル結合で２〜５０個結合した「オリゴヌクレオチド」をいう。「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体も含む。そのような誘導体としては、例えば、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられる。

以下、本発明について詳述する。

本発明のオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に少なくとも１つ含む。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。２つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。

本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡが化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を変更する。例えば、標的核酸に対する親和性を高め、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を高め、オリゴヌクレオチドの薬物動態または組織分布を変更する。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得る。

ここで、「結合し得る」とは、異なる複数の１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が、核酸塩基の相補性により２本鎖以上の鎖の核酸を形成し得ることをいう。好適には、２本鎖の核酸を形成し得ることをいう。２本鎖以上の鎖の核酸の融解温度（Ｔ_ｍ）は特に限定されない。例えば、２本鎖核酸を形成する異なる２つの１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸は、２本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有する必要はない。

ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、配列番号１で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ_１７４９３６；コーディング領域、２０７９塩基）を含み、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする。ＰＣＳＫ９遺伝子はＬＤＬ受容体の分解に関与する。

本発明のオリゴヌクレオチドが結合し得るヒトＰＣＳＫ９遺伝子の領域としては、好適には次の塩基配列：配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２０で示される塩基配列；配列番号２６で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３０で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号４２で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５２で示される塩基配列；配列番号５７で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号５９で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号９４で示される塩基配列；配列番号１１７で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１１８で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなる領域である。

より好適には次の塩基配列：配列番号２８で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなる領域である。

さらに好適には次の塩基配列：配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなる領域である。

本発明のオリゴヌクレオチドが結合し得るヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、好適には、上記塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである。

本発明のオリゴヌクレオチドが含む糖修飾ヌクレオシドは、同一のヌクレオシド内の４’位と２’位との間に架橋構造を有する。

上記架橋構造の１つは、−ＣＨ_２−Ｏ−、または−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−で表される。このような架橋構造を、以下、「ＢＮＡ」という場合がある。

ＢＮＡとしては、例えば、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）、β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’）、エチレンオキシ（４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＮＡヌクレオシド（モノマー）は、例えば、オリゴＤＮＡ合成用アミダイト体として、非特許文献１〜５に記載の方法により合成することができる。

上記架橋構造の他の１つは、−ＣＨ_２−ＮＲ^１−Ｏ−、または−（ＣＨ_２）_２−ＮＲ^１−Ｏ−で表され、
ここで、Ｒ^１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基を表す。このような架橋構造を、以下、「ＮＣ」という場合がある。

ＮＣとしては、例えば、オキシアミノ（４’−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−２’）、Ｎ−メチルオキシアミノ（４’−ＣＨ_２−ＮＣＨ_３−Ｏ−２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＣヌクレオシド（モノマー）は、例えば、オリゴＤＮＡ合成用アミダイト体として、非特許文献６〜９に記載の方法により合成することができる。

上記架橋構造の他の１つは、−ＣＯ−ＮＲ^１−、−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^１−、−（ＣＨ_２）_２−ＣＯ−ＮＲ^１−、−ＣＯ−ＮＲ^１−Ｘ−、または−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^１−Ｘ−で表され、
ここで、Ｒ^１は、水素原子；
分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；を表し、そして
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す。このような架橋構造を、以下、「ＣＯＮ」という場合がある。

ＣＯＮとしては、例えば、無置換アミド（４’−ＣＯ−ＮＨ−２’）、Ｎ−メチルアミド（４’−ＣＯ−ＮＣＨ_３−２’）、アセトアミド（４’−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＨ−２’）、Ｎ−メチルアセトアミド（４’−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＣＨ_３−２’）、Ｎ−オキシアセトアミド（４’−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＨ−Ｏ−２’）、Ｎ−メチル−Ｎ−オキシアセトアミド（４’−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＣＨ_３−Ｏ−２’）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＯＮヌクレオシド（モノマー）は、例えば、オリゴＤＮＡ合成用アミダイト体として、特許文献１に記載の方法により合成することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、同一のヌクレオシド内の４’位と２’位との間に上記架橋構造「ＢＮＡ」、「ＮＣ」または「ＣＯＮ」のいずれか１つを有する糖修飾ヌクレオシドを少なくとも１種類含む。

本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは、特に限定されないが、好適には１０〜２５塩基である。より好適には１０〜１６塩基である。

本発明のオリゴヌクレオチドの５’−末端または３’−末端の構造は、特に限定されない。例えば、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナンスリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび色素からなる群より選択される１つが結合している。好適には５’−末端または３’−末端にコレステロールが結合している。コレステロールの結合により、オリゴヌクレオチドの生体内安定性の向上や標的臓器である肝臓への取り込み向上が期待できる。５’−末端または３’−末端にコレステロールを結合させる方法は、特に限定されない。例えば、コレステロールをアミダイト体として導入する方法、オリゴヌクレオチド合成の固相担体として導入する方法、オリゴヌクレオチドを合成した後にコンジュゲート化する方法が挙げられる。

糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、上述のように、同一のヌクレオシド内の４’位と２’位との間の架橋構造により固定されているため、各種ヌクレアーゼにより分解されにくく、生体に投与されると、長時間生体内に存在することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス核酸として、ヒトＰＣＳＫ９のｍＲＮＡと結合して、ヒトＰＣＳＫ９の遺伝子発現を抑制し得る。すなわち、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤としての効果を奏する。ヒトＰＣＳＫ９の遺伝子発現が抑制されると、ＬＤＬ受容体タンパク質の発現量が上昇し、ＬＤＬの細胞内への取り込みや代謝が促進されることによって血中ＬＤＬ濃度が低下し得る。すなわち、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤は、例えば、血中ＬＤＬ濃度を低減させるための医薬として利用でき、あるいは、例えば、血中ＬＤＬ濃度が病態に及ぼす影響を調べるための試薬として利用できる。このようにして、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤としての効果を奏し、この結果、血中ＬＤＬ低減剤としての効果、および家族性高コレステロール血症や高脂血症などの高コレステロール血症（脂質異常症）の治療剤および予防剤としての効果を奏する。特に、より低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏する。

本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する脂質異常症治療剤および予防剤は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤をさらに含有し得、例えば、非経口投与製剤とすることができる。または、当該技術分野において通常用いられる医薬用担体をさらに含有し得、例えば、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤とすることができる。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでない。

（実施例１）オリゴヌクレオチドの合成
非特許文献１〜５に記載の方法によりＢＮＡモノマー（アミダイト体）を合成した。これをオリゴＤＮＡ合成用モノマー体として用いて、ＤＮＡ合成機により、表１−１〜表１−３に記載のオリゴヌクレオチド（マウスＰＣＳＫ９遺伝子の塩基配列からなるＢＮＡ−ヌクレオシドを含むＢＮＡ−オリゴヌクレオチド、ｉｎ ｖｉｖｏグレード、必要に応じて１〜１００ｍｇ）を合成した。なお、表１−１〜表１−３において、ＰＳ骨格とは、リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換された構造（リン酸基に対応する基をホスホロチオエート基という）をいう。また、本明細書において、オリゴヌクレオチドのリン酸基がすべてホスホロチオエート基に置き換わったオリゴヌクレオチドを特にＳ−オリゴヌクレオチドという。表１−１〜表１−３に記載のオリゴヌクレオチドは、すべてＳ−オリゴヌクレオチドである。

次いで、合成したオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ精製、凍結乾燥処理に供した。得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確認した。

（実施例２）オリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果１
マウス肝臓細胞株ＮＭｕｌｉの細胞を１．５×１０^５個／ウェルとなるように１２ウェルプレートに播き、５％ＣＯ_２下３７℃にて２４時間培養した。実施例１で合成した各オリゴヌクレオチドを最終濃度５または５０ｎＭとなるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて各ウェルに添加した（トランスフェクション）。４時間後に培地を交換し、さらに２０時間後に細胞を回収し、細胞からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。

Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＨｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＩＤ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＴＭ）リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によりリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量も同時に定量し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量をＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ発現レベルとして評価した。トランスフェクション操作を行わなかった細胞をコントロールとして用いた。結果を図１および２に示す。

なお、用いたプライマーは、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）であり、Ａｓｓａｙ ＩＤは、以下のとおりであった：
マウスＰＣＳＫ９定量用：Ｍｍ０１２６３６１０＿ｍ１およびＭｍ００４６３７３８＿ｍ１
マウスＧＡＰＤＨ定量用：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｍ１

図１および２から明らかなように、特定の標的領域に対するオリゴヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチド１６（標的配列：配列番号１８）、オリゴヌクレオチド１８（標的配列：配列番号２０）、オリゴヌクレオチド２４（標的配列：配列番号２６）、オリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド２８（標的配列：配列番号３０）、オリゴヌクレオチド２９（標的配列：配列番号３１）、オリゴヌクレオチド４０（標的配列：配列番号４２）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド４９（標的配列：配列番号５１）、オリゴヌクレオチド５０（標的配列：配列番号５２）、オリゴヌクレオチド５５（標的配列：配列番号５７）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）、オリゴヌクレオチド５７（標的配列：配列番号５９）、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）、オリゴヌクレオチド９２（標的配列：配列番号９４）、オリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）、オリゴヌクレオチド１１５（標的配列：配列番号１１７）およびオリゴヌクレオチド１１６（標的配列：配列番号１１８）はＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現レベルを著しく低下させた。

（実施例３）オリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果２
実施例１で合成したオリゴヌクレオチドのうち、特定のオリゴヌクレオチドを用いたこと、および各ウェルに添加した各オリゴヌクレオチドの最終濃度として、５または５０ｎＭに代えて０．４、２または１０ｎＭとしたこと以外は実施例２と同様にして、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を調べた。結果を図３に示す。

図３から明らかなように、特に、オリゴヌクレオチド１６（標的配列：配列番号１８）、オリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド２９（標的配列：配列番号３１）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド４９（標的配列：配列番号５１）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）、およびオリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）は濃度依存的にＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの発現レベルを著しく低下させた。

（実施例４）オリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果３
実施例１で合成したオリゴヌクレオチドのうち、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子とマウスＰＣＳＫ９遺伝子とで共通する塩基配列からなる標的配列に対するオリゴヌクレオチドを用いたこと、およびマウス肝臓細胞株ＮＭｕｌｉの細胞に代えてヒト肝臓細胞株ＨｕＨ７の細胞を用いたこと以外は実施例２と同様にして、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を調べた。結果を図４に示す。

なお、用いたプライマーは、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）であり、Ａｓｓａｙ ＩＤは、以下のとおりであった：
ヒトＰＣＳＫ９定量用：Ｈｓ００５４５３９９＿ｍ１
ヒトＧＡＰＤＨ定量用：Ｈｓ０２７５８９９７＿ｇ１

図４から明らかなように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果は、マウス細胞とヒト細胞とでほぼ同様の傾向を示した。特に、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）およびオリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）は、マウス細胞、ヒト細胞ともに高い発現抑制効果を示した。一方で、オリゴヌクレオチド７１（標的配列：配列番号７３）のように、マウス細胞ではあまり発現抑制効果を示さなかったのに対しヒト細胞では高い発現抑制効果を示した例もあった。

（実施例５）オリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果
実施例３および４において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を示した、オリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）、およびオリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）を被験動物に投与し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を調べた。

被験動物として８週齢のマウスＣ５７ＢＬ６／Ｊ（オス：日本エスエルシー株式会社）を各投与群で例数４匹となるように準備した。１週間後、尾静脈より各オリゴヌクレオチドを１０ｍｇ／ｋｇの投与量で単回投与した。

４日後に各マウスを屠殺し、各マウスから肝臓と全血を採取した。肝臓は、ＰＢＳで洗浄した後、細切し、液体窒素で瞬間凍結した後、−８０℃にて保存した。凍結肝臓の切片を１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ Ｒｅｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内でホモジナイズし、クロロホルム２００μＬを加えた後、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心した。上清２２０μＬをイソプロパノール４００μＬに添加して転倒混和し、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心した後、イソプロパノールを除去した。次いで、７５％エタノール８００μＬを加えた後、１３，２００ｒｐｍ、４℃にて５分間遠心した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを含む沈殿をＲＮａｓｅフリー水（Ｗａｔｅｒ，ＤＥＰＣ ｔｒｅａｔｅｄ，ＲＮａｓｅ ｔｅｓｔｅｄ；ナカライテスク株式会社）８０μＬに溶解した。抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡを分光光度計で定量し、ＲＮＡの長さをアガロースゲル電気泳動で確認した。

Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ１０μｇからＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡおよびＦａｓｔ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、ＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量も同時に定量し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するＰＣＳＫ９のｍＲＮＡ量を評価した。結果を図５に示す。

なお、用いたプライマーは、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）であり、Ａｓｓａｙ ＩＤは以下のとおりであった：
マウスＰＣＳＫ９定量用：Ｍｍ００４６３７３８＿ｍ１
マウスＧＡＰＤＨ定量用：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｍ１

次いで、採取した全血を室温にて２０分間静置した後、５０００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心して血清を分離した。それぞれの血清について、トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いてＡＳＴ値およびＡＬＴ値を定量し、肝毒性を調べた。結果を図６に示す。

図５から明らかなように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの高いＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を示したオリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）、およびオリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）はいずれもｉｎ ｖｉｖｏでの高いＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を示した。

一方、図６から明らかなように、オリゴヌクレオチド８７（標的配列：配列番号８９）を投与したマウスには、著しい肝毒性が認められた。

以上より、オリゴヌクレオチド２６（標的配列：配列番号２８）、オリゴヌクレオチド４８（標的配列：配列番号５０）、オリゴヌクレオチド５６（標的配列：配列番号５８）およびオリゴヌクレオチド９８（標的配列：配列番号１００）は、肝毒性を示すことなく、ｉｎ ｖｉｖｏでの著しいＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制効果を示すことがわかった。

本発明によれば、ヒトＰＣＳＫ９のｍＲＮＡと結合して、ヒトＰＣＳＫ９の遺伝子発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドを提供することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤としての効果を奏し、この結果、血中ＬＤＬ低減剤としての効果、および家族性高コレステロール血症や高脂血症などの高コレステロール血症（脂質異常症）の治療剤および予防剤としての効果を奏する。特に、より低い用量でより高い脂質異常症治療効果を奏する。

Claims (7)

1. 糖修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドであって、
   該糖修飾ヌクレオシドが、４’位と２’位との間に架橋構造を有し、そして
   該オリゴヌクレオチドが、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子と結合し得、
   該ヒトＰＣＳＫ９遺伝子が、以下の塩基配列：
   配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２０で示される塩基配列；配列番号２６で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３０で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号４２で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５２で示される塩基配列；配列番号５７で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号５９で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号９４で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；配列番号１１７で示される塩基配列；配列番号１１８で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである、オリゴヌクレオチド。
2. 前記ヒトＰＣＳＫ９遺伝子が、以下の塩基配列：
   配列番号１８で示される塩基配列；配列番号２８で示される塩基配列；配列番号３１で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５１で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 前記ヒトＰＣＳＫ９遺伝子が、以下の塩基配列：
   配列番号２８で示される塩基配列；配列番号５０で示される塩基配列；配列番号５８で示される塩基配列；配列番号８９で示される塩基配列；配列番号１００で示される塩基配列；またはこれらに相補的な塩基配列のいずれかを含む塩基配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 前記架橋構造が、−ＣＨ_２−Ｏ−、−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＲ^１−Ｏ−、−（ＣＨ_２）_２−ＮＲ^１−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲ^１−、−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^１−、−（ＣＨ_２）_２−ＣＯ−ＮＲ^１−、−ＣＯ−ＮＲ^１−Ｘ−、または−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^１−Ｘ−で表され、
   ここで、Ｒ^１は、水素原子；
   分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；
   分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基；
   水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基；
   または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；を表し、そして
   Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基を表す、請求項１から３のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 前記オリゴヌクレオチドの塩基配列の長さが、１０〜２５塩基である、請求項１から４のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 請求項１から５のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子発現抑制剤。
7. 請求項１から５のいずれかの項に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する、脂質異常症治療剤および予防剤。

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