WO2018215684A1 - Medios de cultivo con lisados plaquetarios - Google Patents

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Monica SANTOS GONZALEZ
Isabel María LOMAS ROMERO
Beatriz FERNANDEZ MUÑOZ
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    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
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Definitions

  • the present invention is within the field of molecular biology, Medicine and Pharmacy, and refers to a composition that can be used as a culture medium to improve cell cultures, cryopreservation and cell vitrification processes, defrosting of cells, as well as for the preparation of medicines for regenerative medicine and tissue engineering.
  • the culture medium supplement used during the cultivation of animal and human cells is an essential point for the correct progression of cell lines.
  • the use of fetal bovine serum as a supplement to the culture medium requires compliance with standards authorized by the Regulatory Agencies in order to control the product and mitigate the risk of contamination by animal adventitious agents (prions, viruses, etc.).
  • fetal bovine serum as a supplement to the culture medium
  • cell culture in the presence of these sera causes the acquisition of animal antigens by cells transplanted in the patient can cause rejection, so the acquisition of such antigens may not be ruled out.
  • Platelet derivatives have been proposed as substitutes for FBS for the ex vivo expansion of different cell types, so the product proposed here is a safe and effective alternative for use during the cultivation of different cell types.
  • a damage in the skin initiates a cascade of events including inflammation, the formation of new tissue and its remodeling, which eventually leads to a partial reconstruction of the wound area.
  • the repair process is initiated immediately after damage by releasing several growth factors, cytokines and low molecular weight components from the serum. of damaged blood vessels and platelet degranulation.
  • the alteration of the blood vessels also allows the formation of blood clots that in addition to providing a barrier that prevents the invasion of microorganisms, serves as an extracellular matrix for the deposition of cells and reservoir of growth factors required during the repair periods.
  • Fibroblasts (resident cell type of connective tissue) deposit a large number of molecules in the extracellular matrix such as glycoproteins, glycosaminoglycans (GAGs), proteoglycans, elastin, collagen and fibronectin, which they use to migrate through the wound.
  • GAGs glycosaminoglycans
  • proteoglycans elastin
  • collagen elastin
  • fibronectin fibronectin
  • fibrin and fibronectin are linked together forming a clot that serves as a structural support until the collagen is deposited and in turn, growth factors and fibronectin stimulate proliferation, migration to the wound bed and the production of molecules extracellular by fibroblasts.
  • PDGFs-platelet-derived growth factors PDGFs-platelet-derived growth factors
  • FGFs-fibroblast growth factors fibroblast growth factor
  • cryoprotectants during the freezing process is crucial to preserve cellular integrity. So far there is a wide variety of solutions on the market that improve the cryopreservation process at that level, maintaining cell viability and recoverability; However, none is final. As it can happen during the culture, the use of compounds of animal origin used in solutions destined to the cryopreservation of cells and / or tissues for the later manufacture of medicines of advanced therapies, requires the fulfillment of standards authorized by the Regulatory Agencies with In order to guarantee a quality product.
  • FIG. 1 Proliferation rates (a) (b) and viability (c) of cultured fibroblasts with culture media supplemented with different Experimental platelets used.
  • FIG. 1 Cellular morphology and confluence observed on fibroblasts cultured with media supplemented with different Experimental platelet used versus commercial platelet lysate. All cells maintained a fusiform and fibroblastic morphology along the cell passages after being cultured with each of the experimental solutions (solutions 1, 2, 3 and 4), not appreciating significant differences in size between them and the commercial solution. Cells reached confluence faster (4 or day after cell seeding) when cultured with solutions 2 and 3, which is indicative of the culture medium supplemented with these solutions appears to improve recoverability of cells after a process Defrosting Pictures taken on fibroblasts in culture in the 4th day after cell seeding (4x optical microscope).
  • FIG. 3 Identification of specific markers of fibroblasts by immunocytochemistry.
  • the expression of fibronectin, CD13, Vimentin, E-Cadherin and pancytokeratin on 4 batches of fibroblasts in pass 5 (1501-F, 1501-FT01, 1502-FT02, 1503-FT03) cultured with a medium supplemented with Solution 2 was analyzed. (platelet lysate enriched with 40% Plasma + 60% Unfiltered Composol Solution).
  • fibroblasts were positive for fibronectin, CD13 and Vimentin (specific markers of fibroblasts) and negative for E-Cadherin and Pancytokeratin (specific markers of epithelial cells that do not express fibroblasts).
  • FIG. 4 Identification and quantification of Type I Collagen.
  • FIG. 1 Cell karyotype.
  • the karyotype of 4 batches of cultured fibroblasts along 7 cell passages was analyzed with a medium supplemented with 5% of solution 2 (platelet lysate enriched with 40% Plasma + 60% Unfiltered Composol Solution) obtaining a normal genetic profile
  • the image shows the cytogenetic report of one of the analyzed samples.
  • FIG. 6 Cell viability of fibroblasts immersed in non-nanostructured Fibrin-Agarose (F-A) matrices. The average of the viability percentages is shown after the counting of three random fields carried out on non-nanostructured agarose fibrin matrices (NE) in which solution 2 was not used (platelet lysate enriched with 40% of Plasma + 60% of Compost solution unfiltered) in its preparation against matrices of nanostructured agarose fibrin (NE) in which solution 2 was used during its preparation.
  • NE non-nanostructured agarose fibrin matrices
  • FIG. 7 a) Cellular viability of fibroblasts immersed in nanostructured Fibrin-Agarose (AF) matrices after being cryopreserved with different cryopreservation solutions. The average of the data obtained after counting three random fields made on fibrin agarose matrices with fibroblasts manufactured with solution 2 (platelet lysate enriched with 40% Plasma + 60% Unfiltered Composol Solution), nanostructured is shown. and subsequently cryopreserved in the presence of three different cryopreservation solutions: Solution A (DMEM 70% + FBS 20% + DMSO 10%), Solution B (40% Solution 2 + Albumin 2.5% + DMSO 10%) and Solution C (CryostorTM CS10 ).
  • Solution A DMEM 70% + FBS 20% + DMSO 10%
  • Solution B 40% Solution 2 + Albumin 2.5% + DMSO 10%
  • Solution C (CryostorTM CS10 ).
  • FIG. 8 Images of histological sections made on matrices of fibrin agarose with cryopreserved fibroblasts in the presence of different solutions. Cryopreservation of agarose fibrin matrices was performed with fibroblasts made with a proportion of platelet lysate enriched with 40% Plasma + 60% Unfiltered Composol Solution (solution 2), nanostructured and subsequently cryopreserved in the presence of three solutions of different cryopreservation: Solution A (DMEM 70% + FBS 20% + DMSO 10%), Solution B (40% Solution 2 + Albumin 2.5% + DMSO 10%) and Solution C (CryostorTM CS10).
  • Solution A DMEM 70% + FBS 20% + DMSO 10%
  • Solution B 40% Solution 2 + Albumin 2.5% + DMSO 10%
  • Solution C (CryostorTM CS10).
  • Figure 9 Average number of cells accumulated per cell pass in each condition tested. The results of the average number of cells accumulated in each of the 3 experimental fibroblast lines, grown to a total, are shown of 7 cell passes (codes 160805, 160825 and 160902). After analyzing the data, it was observed that the best yields were obtained after culturing the cells with the culture medium supplemented with solutions 5 and 6, obtaining very significant differences (*** p ⁇ 0.005) when the cells supplemented with lysate of both solutions 15% were compared with solution 2 at 5%. On the other hand, no statistically significant differences of solutions 5 and 6 were obtained from each other. The figure shows the statistically significant differences of all the solutions analyzed with respect to the 2 to 5% solution, being (*** p ⁇ 0.005), (** p ⁇ 0.01) and (* p ⁇ 0.05).
  • FIG. 10 Cell doubling times. The results of the average doubling time obtained in the experimental fibroblast lines, grown up to a total of 7 cell passes (codes 160805, 160825 and 160902) are shown, without taking into account the data of fibroblasts cultured with 10 FBS %. It was observed that solutions 5 and 6 at 10% and 15% showed a shorter cell doubling time when compared to the solution currently used (solution 2 to 5%), which translates to a higher cell doubling rate. Statistically significant differences with respect to the 2 to 5% solution are shown, being (*** p ⁇ 0.005), (** p ⁇ 0.01) and (* p ⁇ 0.05).
  • FIG. 11 Accumulated Cell Duplications. The results of the average of accumulated duplications obtained in the experimental fibroblast lines, grown up to a total of 7 cell passes (codes 160805, 160825 and 160902) are shown. It was observed that in no case exceeded 15 accumulated cell duplications. Statistically significant differences are shown with respect to the 2 to 5% solution being (*** p ⁇ 0.005), (** pO.01) and (* p ⁇ 0.05).
  • FIG. 12 Trend of cells with different culture media used at different concentrations.
  • FIG. 13 Defrosted and seeded fibroblasts with the different media to be tested at different concentrations and up to a pass 3 (images obtained with the 10x optical microscope).
  • a and B It was observed that fibroblasts cultured with platelet lysate, both with the lysate manufactured according to the current GMP process (Condition 2) and with those manufactured under different experimental conditions (conditions 5, 6 and 7) and used at different concentrations ( 5, 10 and 15%), have a different phenotype than the fibroblasts cultured with FBS, apparently smaller cells than the latter.
  • Figure 14 Results after fibroblast culture with platelet lysate obtained after two or three freeze / thaw cycles.
  • the number of fibroblasts obtained during 5 cell passes was very similar for both solutions, with a minimum difference of approximately 43,000 cells between them, being higher in fibroblasts cultured with the medium. supplemented with solution 8.
  • the number of cell duplications per day calculated over the 5 cell passes was very similar between both conditions ( Figure 15. b), obtaining values of 1, 10 in solution 6 vs 1 , 08 in solution 8, which indicates that the growth dynamics were very similar.
  • the number of cells obtained in each pass ( Figure 15.c) remained the same between both conditions and decreased in the same proportion as successive passes were made.
  • FIG. 15 Activity tests on culture of 3 batches of Platelet Used obtained after three freeze / thaw cycles (Solution 8). Three replicates of platelet lysate solution 8 (lots: 171 107-b, 171 107-c and 171 120) were manufactured to check the degree of reproducibility of the process. After obtaining the solutions, cells from a common batch of fibroblasts (1501-FP06 in Pass 9) were seeded in parallel to the same cell density using each of the replicas obtained from solution 8 and compared with cells cultured with the Solution 6 (control). The number of cells obtained with each solution was analyzed after 4 days in culture. As shown in the figure, no significant differences were observed in the number of cells obtained with the different replicates of solution 8 (171 107-b, 171107-c and 171 120), nor of these with solution 6.
  • Figure 17 Identity and power markers analyzed on fibroblasts cultured under conditions 6 and 8.
  • the phenotype of the cultured fibroblasts up to passage 6 was analyzed with solutions 6 and 8, analyzing the markers CD44 (+), CD13 ( +), CD324 (-) and HLA-DR (-) by flow cytometry ( Figure 18.a) and Collagen Type I (+) by immunofluorescence techniques (Figure 18.b). No differences were observed in the expression of any of the markers analyzed between both conditions.
  • the product proposed here contains moderate levels of PDGF and other factors sufficient to provide an adequate growth rate during in vitro fibroblast culture.
  • Other products present in the market contain much higher levels of PDGF, which could be counterproductive for the cultivation of certain cell types for the treatment of wounds of various kinds.
  • a first aspect of the invention relates to a composition, hereafter referred to as a composition of the invention, comprising Human Platelet Use (hPL) and Plasma AB.
  • hPL Human Platelet Use
  • Plasma AB Plasma AB
  • composition of the invention is obtained by a manufacturing process consisting of 60% of human platelet lysate (hPL) obtained from leucodepleted platelets of group 0 in Composol Solution whose final concentration is 1 x 10 9 platelets / ml of Total mixture and supplemented with 40% of Plasma AB.
  • hPL human platelet lysate
  • the composition of the invention is filtered.
  • the composition of the invention is not filtered. Therefore, in a preferred embodiment of this aspect of the invention, the initial starting concentration of platelets for platelet lysate is the between 1x10 8 - 5x10 9 platelets / ml, and preferably 0.5-1.5 x10 9 platelets / ml and more preferably 1 x 10 9 platelets / ml.
  • the proportion of hPL and AB plasma is 90% hPL and 10% AB plasma, preferably 80% hPL and 20% AB plasma, and more preferably, 60%. hPL and 40% of Plasma AB.
  • the proportion of hPL and AB plasma is 98% hPL and 3% AB plasma. It is possible to use 100% hPL, since it has been seen to maintain the functionality, but it is better when a proportion of AB plasma is added.
  • the human platelet lysate (hPL) has been obtained from transfusion plasma of group AB, and more preferably from plasmaféseris of group AB.
  • the hPL can be generated from the buffy coat, platelet-rich plasma (PRP), or platelet concentrates derived from apheresis.
  • PRP platelet-rich plasma
  • the human platelet lysate (hPL) has been obtained from leucodepleted platelets, and more preferably from leucodepleted platelets of group 0.
  • composition of the invention is obtained by a process comprising: a) generating a fresh platelet concentrate, b) supplementary with AB plasma, and c) lysing the platelets.
  • stage (a) of generating a platelet concentrate and stage (b) of supplements with AB plasma are optional.
  • platelet lysate when supplemented with plasma is more effective. Therefore, in a more preferred embodiment of the invention the composition of the invention is obtained by a process comprising: a) supplementary with AB plasma, and b) lyse platelets.
  • the method comprises:
  • step II the centrifugation of step II) is performed at 2500g for 10 minutes at room temperature (22 ° C).
  • step IV is performed at -80 ° C for at least 12 hours.
  • the one or thawing step IV) is carried out at 36 ° C for 2-5 hours.
  • step IV In another preferred embodiment the 2 or freezing of step IV) is performed at -80 ° C for at least 12 hours. In another preferred embodiment the 2 or defrosting of step IV) is performed at 36 ° C for 2-5 hours.
  • centrifugation of the platelet lysate from step VI) is performed at 4000g for 30 min. In another preferred embodiment the centrifugation of the platelet lysate from step VI) is performed at a temperature of 22 ° C,
  • the centrifugation of the platelet lysate from step VII) is performed at 4000g for 15 min.
  • the centrifugation of the platelet lysate from step VII) is performed at a temperature of 22 ° C,
  • the preservation of the platelet lysate from step VIII) is performed below -80 ° C.
  • centrifugation temperature of steps IV and I IV is 4 ° C.
  • the centrifugation temperature of steps VI and VII is 4 ° C.
  • NCF Correct Manufacturing Standards
  • Centrifugation platelet lysate between 3300g and 4300 g for 25 and 50 minutes or between 2 and 25 ° C, preferably at 4000g for 30 min at 4 ° C and removal of debris
  • the method of obtaining additionally comprises a step ⁇ ) (between stage I and II), to eliminate the possible remains of group 0 plasma from the starting platelet bags and platelet concentration by a centrifugation process, preferably at 2000g for 20 minutes, at room temperature (22 ° C).
  • a second aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition, hereinafter referred to as the pharmaceutical composition of the invention, which comprises the composition of the invention.
  • the pharmaceutical composition of the invention further comprises another active ingredient.
  • a third aspect of the invention relates to a culture medium, hereinafter culture medium of the invention, comprising the composition of the invention or the pharmaceutical composition of the invention.
  • a fourth aspect of the invention relates to an artificial tissue, hereinafter artificial tissue of the invention, comprising the composition of the invention, the pharmaceutical composition of the invention or the culture medium of the invention and further comprising at least a cell.
  • the cells can be of any cell line, such as, but not limited to, epithelial cells, neurons, fibroblasts, adipocytes, osteoblasts, hepatocytes, basal cells, odontoblasts, pneumocytes, myocytes, or endothelial cells. They can also be stem cells, preferably mesenchymal stem cells. They can also be induced pluripotent stem cells (iPSs). Preferably they are fibroblasts.
  • the cell is a mesenchymal stem cell, and more preferably a mesenchymal stem cell from the umbilical cord.
  • the use of the product as a supplement to the culture medium maintains the viability and increases, or at least matches, the growth rates of different cell types after being compared with other supplements normally used such as bovine fetal serum or commercial platelet lysates.
  • the culture medium of the invention has been suitable for fibroblasts and mesenchymal stem cells.
  • composition of the invention maintains the expression of cell markers in the tested lines and even in some cases increases the expression of specific markers after being compared with media supplemented with other additives. as fetal bovine serum and commercial platelet lysate.
  • composition of the invention could be used as a supplement to the culture medium of different cell lines, improving the growth rates of animal and human cells, as well as favoring the expression of cell markers involved in important routes.
  • a fifth aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention, the composition of the invention or the culture medium of the invention for cell culture.
  • the cells are stem cells, and even more preferably mesenchymal stem cells.
  • the cells are induced pluripotent cells.
  • the cells are fibroblasts.
  • composition of the invention obtained is a product free of plasma antibodies and cellular antigens, whose presence could affect the culture of different cell lines and the application of these in patients as a drug in cell therapy.
  • the cultures are "xeno-free".
  • the authors of the present invention have demonstrated that the composition of the invention as a supplement to the culture medium maintains the recoverability (number of cells recovered) after thawing and planting of cells when compared with media supplemented with other commercial platelet lysates.
  • composition of the invention could be used as a supplement to the culture medium used during defrosting and subsequent sowing of different cell lines, maintaining and possibly improving cell recoverability (number of cells obtained days after planting).
  • composition of the invention can be used as a component part of a cryopreservation solution that maintains viability and in most cases increases the recovery of cells at the time of thawing, as well as the integrity of artificial tissues. when compared with other solutions used for cryopreservation of cells and / or tissues.
  • the cells are embedded in a biological matrix.
  • a sixth aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention, the composition of the invention or the culture medium of the invention in a cell cryopreservation process.
  • a seventh aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention, the composition of the invention or the culture medium of the invention in a cell vitrification process.
  • An eighth aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention, the composition of the invention or the culture medium of the invention for the recovery of cells subjected to freezing.
  • the cells undergoing cryopreservation or vitrification are stem cells.
  • the cells undergoing cryopreservation or vitrification are mesenchymal stem cells.
  • the cells undergoing cryopreservation or vitrification are pluripotent stem cells. induced (iPSs).
  • the cells undergoing cryopreservation or vitrification are fibroblasts.
  • the cells and / or embryos are non-human mammalian cells or non-human embryos.
  • the cell culture has a therapeutic or diagnostic purpose for the embryo itself
  • the cells and / or the embryos are of human mammal.
  • the pharmaceutical composition of the invention, or the culture medium of the invention can be used in preimplantation genetic diagnosis.
  • composition of the invention is a product free of plasma antibodies and cellular antigens that could prevent possible rejection in patients if it is used as a product of cell therapy.
  • composition of the invention has been validated under Correct Manufacturing Standards and inspected with satisfactory results by the AEMPS (Spanish Agency for Medicines and Health Products). In addition, it is "Xeno-free”: it has no animal products. This is an advantage over other solutions available in the market, showing a useful tool for the manufacture of medicines of advanced therapies since it does not contain animal products that can cause cross contamination with adventitious agents of non-human origin and rejection in the patient.
  • somatic cell therapy means the use of living, autologous, allogeneic or xenogenic somatic cells, whose biological characteristics have been substantially altered as a result of their manipulation, to obtain a therapeutic, diagnostic or preventive effect, by metabolic, pharmacological means or immunological
  • somatic cell therapy drugs are, for example, but not limited to: cells manipulated to modify their immunological, metabolic or other functional properties in qualitative or quantitative aspects; classified cells, selected and manipulated, which are subsequently subjected to a manufacturing process in order to obtain the finished product; cells manipulated and combined with non-cellular components (for example, matrices or biological or inert medical devices) that exert the intended action in principle on the finished product; autologous cell derivatives expressed ex vivo (in vitro) under specific culture conditions; or cells genetically modified or subjected to another type of manipulation to express homologous or non-homologous functional properties previously not expressed.
  • non-cellular components for example, matrices or biological or inert medical devices
  • an eleventh aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention, the pharmaceutical composition of the invention, the culture medium of the invention and / or the artificial tissue of the invention, in the manufacture of a medicament. to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged tissue or organ, or alternatively, to the composition, the pharmaceutical composition of the invention, to the culture medium of the invention, to increase, restore or replace partially or totally the functional activity of a diseased or damaged tissue or organ.
  • composition of the invention preferably together with suitable cells, It can be used to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged tissue or organ.
  • the cells can be of any cell line, such as, but not limited to, epithelial cells, neurons, fibroblasts, adipocytes, osteoblasts, hepatocytes, basal cells, odontoblasts, pneumocytes, myocytes, or endothelial cells.
  • They can also be stem cells, preferably mesenchymal stem cells. They can also be induced pluripotent stem cells. Preferably they are fibroblasts.
  • the tissue or organ may be internal, such as, but not limited to, the urethra or bladder, or external, such as, but not limited to, the cornea or the skin.
  • the damaged tissue or organ is selected from the list comprising: skin, bladder, urethra, cornea, mucosa, conjunctiva, abdominal wall, conjunctiva, eardrum, pharynx, larynx, intestine, intestine, peritoneum, ligament, tendon, bone, meninge or vagina.
  • the tissue or organ may be diseased or damaged as a result of a dysfunction, an injury or a disease, for example, but not limited to, an infectious, inflammatory, genetic or degenerative disease; physical damage such as trauma or surgical intervention, chemical damage or interruption of blood flow.
  • a preferred embodiment of this aspect relates to the use of the composition of the invention, the pharmaceutical composition of the invention, or the culture medium of the invention, and / or the artificial tissue of the invention to partially increase, restore or replace or Fully functional activity of a skin.
  • a more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged skin as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the list comprising: a wound, an ulcer, a burn, a benign or malignant neoplasm, an infection, a bruise, a trauma, a caustication or a congenital malformation.
  • a preferred embodiment of this aspect relates to the use of the composition of the invention, the pharmaceutical composition of the invention, or the culture medium of the invention and / or the artificial tissue of the invention to increase, restore or replace partially or totally the functional activity of a bladder.
  • a more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged bladder as a result of a dysfunction, injury or disease selected from the list.
  • a preferred embodiment of this aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a urethra.
  • a more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged urethra as a result of a dysfunction, injury or disease selected from the list comprising: a benign or malignant neoplasia, an infection, a trauma, a congenital malformation (such as, but not limited to, a hysspadias or an epispadias) or a stenosis.
  • a preferred embodiment of this aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a cornea.
  • a more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged cornea as a result of a dysfunction, injury or disease selected from the list comprising: a corneal ulcer, a keratoconus, a keratoglobus, a descematocele, a trauma, a caustication, an immibic insufficiency, an atrophic keratitis, a corneal dystrophy, a primary or secondary keratopathy, an infection, a leucoma, a bullous keratopathy, an endothelial failure corneal or a benign or malignant neoplasm.
  • a preferred embodiment of this aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament for partially or totally increasing, restoring or replacing the functional activity of a mucosa, preferably of an oral mucosa.
  • An even more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged oral mucosa as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the list that It includes: a wound, an ulcer, a burn, a benign or malignant neoplasm, an infection, a bruise, a trauma, a caustication, a congenital malformation, a loss of substance or a periodontal disease.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the composition, the pharmaceutical composition of the invention, the culture medium of the invention, in the preparation of a medicament for the treatment or diagnosis of an embryonic disease, or alternatively, to the composition, the pharmaceutical composition of the invention, or to the culture medium of the invention for use in the treatment or diagnosis of an embryonic disease. More preferably, it refers to the use of the composition, the pharmaceutical composition of the invention, the culture medium of the invention, in the preparation of a medicament for preimplantation genetic diagnosis, or alternatively to the composition, the pharmaceutical composition of the invention. , the culture medium of the invention, for use in preimplantation genetic diagnosis.
  • the term "medication”, as used herein, refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in man and animals. In the context of the present invention it refers to the composition, pharmaceutical composition or culture medium of the invention, which has a therapeutic or diagnostic objective that are applied to the embryo and which are useful to it.
  • Pluripotent stem cells are undifferentiated, immature and self-renewing cells capable of differentiating into cells that constitute tissues derived from any of the three embryonic layers, the ectoderm, the endoderm and the mesoderm, which will give rise to the tissues and structures known in the superior animals.
  • Mammals belong to Superuk Eukaryota, (Metazoa / Fungi group), Metazoa Kingdom, Phylum Chordata, Subphylum Craniata, Mammalia Class.
  • the organisms of the species Homo sapiens belong to Superuk Eukaryota, (Metazoa / Fungi group), Metazoa Kingdom, Phylum Chordata, Subphylum Craniata, Mammalia Class, Primates Order, Hominidae Family and Genus Homo.
  • the cells are mammalian, such as primates, sheep, goats, pigs, cattle, horses.
  • the present invention is also applicable in other species, such as, but not limited to, in bony or osteotic fish (Osteichthye), such as Salmoniform fish.
  • Man is a human mammal that belongs to the species Homo sapiens.
  • the term cell also includes oocytes or oocytes.
  • the term "oocyte or oocyte” refers to a female germ cell that is in the process of becoming a mature ovum.
  • cryopreservation is the process in which cells or tissues are frozen at very low temperatures, usually between -80 ° C and -196 ° C (the boiling point of liquid nitrogen) to decrease the vital functions of a cell or a cell. organism and be able to keep it in living conditions suspended for a long time. At these temperatures, any biological activity, including the biochemical reactions that would result in the death of a cell, are effectively stopped.
  • One of the main problems of cryopreservation is the formation of ice crystals during the freezing of water. These crystals are formed both outside and inside the cell and it is the intracellular crystals that, acting as blades, cut the internal structures of the cell, especially the membranes.
  • Both cells including oocytes, and embryos can undergo a cryopreservation process.
  • the cells or embryos have been previously cryopreserved.
  • the oocyte is the most sensitive material to cryopreservation. This fact is probably due to the fact that his metaphase plate is very sensitive. The oocytes survive little and badly to freezing, the gestation rate per defrosting cycle being only 10%.
  • the cells or embryos have previously undergone a vitrification process.
  • embryo as used in the context of the present invention is intended to include in its scope of application the various stages of embryo development, including the blastocyst phase as well as the anterior morula phase.
  • blastocyst the various stages of embryo development, including the blastocyst phase as well as the anterior morula phase.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention for the expansion of stem cells.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention for the maintenance of stem cells in undifferentiated form.
  • the term "embryonic body” refers to aggregates derived from pluripotent stem cells in the process of differentiation. The cultivation of these embryonic bodies under different conditions gives rise to the different types of undifferentiated cells. The formation of these embryonic bodies is carried out by any technique described in the state of the art and known to the person skilled in the art.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention for the cultivation of embryonic bodies.
  • Block I Use of the invention as a supplement to the cell culture medium
  • Solution 1 Fresh platelets ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Defrosting 36 ° C ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Defrosting 36 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 30 min. at room temperature ⁇ Centrifugation 4000g 15 min. at room temperature ⁇ Conservation -80 ° C.
  • Solution 2 Fresh platelets diluted in 60% Composol solution and 40% plasma AB (1x10 9 platelets / ml) ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Thawing 36 ° C ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Thawing 36 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 30 min. at room temperature ⁇ Centrifugation 4000g 15 min. at room temperature ⁇ Conservation -80 ° C.
  • Solution 3 Fresh platelets diluted in 60% Composol solution and 40% plasma AB (1x10 9 platelets / ml) ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Thawing 36 ° C ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Thawing 36 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 30 min. at room temperature ⁇ Centrifugation 4000g 15 min. at room temperature ⁇ Filtration 0.48 ⁇ ⁇ Conservation -80 ° C.
  • Solution 5 Fresh platelets supplemented with 20% AB Plasma (plasmapheresis) ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Defrosting 36 ° C ⁇ Freezing - 80 ° C ⁇ Defrosting. 36 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 30 minutes at 4 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 15 minutes at 4 ° C ⁇ Conservation -80 ° C.
  • Solution 6 Fresh platelets not supplemented ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Thawing 36 ° C ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Thawing 36 ° C ⁇ supplement with 20% of Plasma AB (plasmapheresis) ⁇ Centrifugation 4000g 30 minutes at 4 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 15 minutes at 4 ° C ⁇ Conservation -80 ° C.
  • Solution 7 Fresh platelets not supplemented ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Thawing 36 ° C ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Thawing 36 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 30 minutes at 4 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 15 minutes at 4 ° C ⁇ Conservation - 80 ° C
  • Solution 8 Fresh platelets not supplemented ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Defrosting 36 ° C ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Defrosting 36 ° C ⁇ Freezing -80 ° C ⁇ Defrosting 4 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 30 minutes at 4 ° C ⁇ Centrifugation 4000g 15 minutes at 4 ° C ⁇ Conservation -80 ° C. 2. Cell cultures
  • DMEM DMEM supplemented with 10% FBS, non-essential amino acids (NEAA) (0.1 mM), GlutaMax CTS (2mM) and Gentamicin ⁇ 20vg / m ⁇ ).
  • DMEM fetal calf serum
  • NEAA 0.1 mM
  • GlutaMax CTS 2mM
  • DMEM supmented with 5% of Solution 8 solution obtained according to section 1
  • NEAA 0.1 mM
  • GlutaMax CTS 2mM
  • Gentamicin ⁇ ⁇ The same culture conditions were maintained throughout the entire assay, applying the cell pass to all cultures at once after reaching at least one of them 90-100% cell confluence. After the survey, the cells were seeded again at a density of 3000 cells / cm 2 using the same conditions to reach a maximum of 7-8 cell passes.
  • Figure 1.a Figure 9, Figure 15 and Figure 16; of growth dynamics (cell duplications): Figure 1.b, Figure 10, Figure 11 and Figure 15; of cell viability: Figure 1.c, of the morphology of cultured fibroblasts: Figure 2, Figure 13 and Figure 14; as well as the tendency of cultures along cell passages in the presence of different solutions used at different concentrations: Figure 12.
  • Block II Use of the invention as an integral part of cellularized biological matrices
  • Block III Use of the invention as an integral part of a solution for the cryopreservation of cells and / or tissues.
  • Solution A 70% DMEM + 20% FBS + 10% DMSO.
  • Solution B 40% of Solution 2 (platelet lysate enriched with 40% Plasma + 60% Unfiltered Composol Solution) + 2.5% Human albumin + 10% DMSO.
  • the matrices were nanostructured following the methodology described in patent application WO / 2011/023843 (process consisting of dehydration of the tissue until reaching 10% water) and independently included in freezer bags at The solutions to be tested were added. Subsequently, the bags with the matrices were quickly heat sealed and subjected to a progressive cryopreservation process that consisted of keeping the sheets for 30 minutes at 4 ° C, then 24 hours at -20 ° C, then 48 hours at -80 ° C and at least 24 hours at -196 ° C before being defrosted again (Rodr ⁇ guez MA, López-López MT, Duran JD, Alaminos M, Campos A, Rodr ⁇ guez IA Cryopreservation of an artificial human oral mucosa stroma.

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Abstract

La presente invención se refiere a una composición que comprende lisado plaquetario humano y plasma, la composición farmacéutica y los medios de cultivo que lo comprenden, y sus usos para mejorar los cultivos celulares, los procesos de criopreservación y de vitrificación celular, la descongelación de células, así como para la elaboración de medicamentos para medicina regenerativa e ingeniería tisular.

Description

Medios de cultivo con Usados plaquetarios
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular, la Medicina y la Farmacia, y se refiere a una composición que puede emplearse como medio de cultivo para mejorar los cultivos celulares, los procesos de criopreservación y de vitrificación celular, la descongelación de células, así como para la elaboración de medicamentos para medicina regenerativa e ingeniería tisular.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El suplemento del medio de cultivo empleado durante el cultivo de células animales y humanas es un punto esencial para la correcta progresión de las líneas celulares. El uso de suero fetal bovino como suplemento del medio de cultivo, requiere del cumplimiento de estándares autorizados por las Agencias Regulatorias con el fin de controlar el producto y mitigar el riesgo de contaminación por agentes adventicios animales (priones, virus, etc.). Además, se ha demostrado que el cultivo celular en presencia de estos sueros provoca la adquisición de antígenos animales por parte de las células que trasplantadas en el paciente pueden provocar rechazo, por lo que podría no descartarse la adquisición de dichos antígenos. Los derivados de plaquetas han sido propuestos como sustitutos del FBS para la expansión ex vivo de diferentes tipos celulares, por lo que el producto aquí propuesto resulta ser una alternativa segura y eficaz para el empleo durante el cultivo de diferentes tipos celulares.
Las condiciones de cultivo in vitro pueden influenciar significativamente el desarrollo celular, determinando cambios responsables de su mayor o menor calidad, viabilidad, etc. Así, está ampliamente descrito el efecto que tienen los factores de crecimiento plaquetario y las citoquinas sobre la proliferación celular, la quimiotaxis, la diferenciación celular, regeneración y angiogénesis sobre diferentes tipos celulares in vitro.
En el caso de la piel, un daño en la misma inicia una cascada de eventos incluyendo la inflamación, la formación de nuevo tejido y su remodelación, lo cual finalmente conduce a una reconstrucción parcial del área de la herida. El proceso de reparación es iniciado inmediatamente tras el daño mediante la liberación de varios factores de crecimiento, citoquinas y componentes de bajo peso molecular procedentes del suero de los vasos sanguíneos dañados y de la desgranulación plaquetaria. La alteración de los vasos sanguíneos también permite la formación de coágulos sanguíneos que además de proporcionar una barrera que evita la invasión de microorganismos, sirve como matriz extracelular para la deposición de células y reservorio de factores de crecimiento requeridos durante los períodos de reparación.
Los fibroblastos (tipo celular residente del tejido conectivo) depositan un gran número de moléculas en la matriz extracelular como glicoproteínas, glicosaminoglicanos (GAGs), proteoglicanos, elastina, colágeno y fibronectina, que emplean para migrar a través de la herida. Está ampliamente descrita la importancia que tienen ciertas proteínas como la fibronectina en las fases iniciales que tienen lugar durante los procesos de cicatrización de heridas, concretamente durante la fase inflamatoria y la fase proliferativa (Stadelmann WK et al.1998). En dichos estadios, fibrina y fibronectina se enlazan formando un coágulo que sirve de soporte estructural hasta que se deposita el colágeno y a su vez, los factores de crecimiento y la fibronectina estimulan la proliferación, la migración al lecho de la herida y la producción de moléculas extracelulares por los fibroblastos.
Además de la importancia que tiene la interacción célula-célula y célula-matriz, todos los estados del proceso de reparación están controlados por una amplia variedad de factores de crecimiento y citoquinas. Muchos estudios han demostrado el efecto beneficioso de factores como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFs- platelet-derived growth factors) o el factor de crecimiento fibroblástico (FGFs- fibroblast growth factors) sobre los procesos de curación en pacientes con diferentes desordenes durante la curación de heridas. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) demostró ser el primer factor de crecimiento que proporcionaba un efecto quimiotáctico a las células que migran al interior de las heridas, tales como neutrófilos, macrófagos y fibroblastos. Además, mejora la proliferación de fibroblastos y su producción de matriz extracelular, estimula la contracción de fibroblastos e induce a las células a mostrar un fenotipo miofibroblástico (Clark RA. Regulation of fibroplasia in cutaneous wound repair. Am J Med Sci. 1993 Jul;306(1):42-8.; Heldin CH1 , Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor. Physiol Rev. 1999 Oct; 79(4): 1283-316) desempeñando por tanto un papel crucial durante la curación de heridas. Por otro lado, un incremento de PDGF podría estar involucrado en la patogénesis de cicatrices hipertróficas y queloides debido a su potencial efecto sobre la proliferación de fibroblastos y sobre la producción de matriz extracelular (Haisa M1 , Okochi H,. Elevated levéis of PDGF alpha receptors in keloid fibroblasts contribute to an enhanced response to PDGF.1994 Oct;103(4):560-3.) La criopreservación de células y tejidos animales y humanos es un proceso muy delicado que incluye varias etapas que afectan a las células a diferentes niveles. Está descrito que una de las etapas más críticas durante el proceso de congelación celular se relaciona directamente con la formación de cristales tanto intra- como extracelulares, que dañan las membranas plasmáticas en muchos casos de manera irreversible hasta el punto de romper la célula. El uso de crioprotectores durante el proceso de congelación es determinante para preservar la integridad celular. Hasta el momento existe una amplia variedad de soluciones en el mercado que mejoran el proceso de criopreservación a dicho nivel, manteniendo la viabilidad y recuperabilidad celular; sin embargo, ninguna es definitiva. Al igual que puede ocurrir durante el cultivo, el uso de compuestos de origen animal empleados en soluciones destinadas a la criopreservación de células y/o tejidos para la posterior fabricación de medicamentos de terapias avanzadas, requiere del cumplimiento de estándares autorizados por las Agencias Regulatorias con el fin de garantizar un producto de calidad.
En el estado del arte existen ya varios lisados plaquetarios: Human platelet lysate (Macopharma). Human Platelet Lysate, Frozen, Pooled (Zen-Bio) Human Platelet Lysate (StemCell Thechnologies) - Human Platelet Lysate, Fibrinogen-Depleted (StemCell Thechnologies)
- CRUX RUFA Media Supplement (TrinovaBiochem)
- PLTMax Human Platelet Lysate (Merck Millipore)
- GMP PLUS™ Cell Culture Supplement (Compass Biomedicals) Stemulate (CookMedical)
Sin embargo, no todos los lisados plaquetarios funcionan de la misma manera, ni son adecuados. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Tasas de proliferación (a)(b) y viabilidad (c) de fibroblastos cultivados con medios de cultivo suplementados con diferentes Usados plaquetarios experimentales. Se muestra la media del número de células (a), la media de las duplicaciones celulares/día (b) y la media de los datos de viabilidad celular obtenidos (c) al final del proceso de expansión de fibroblastos (3 pases) en los distintos medios de cultivo: DMEM suplementado con un 10% de Suero fetal bovino (FBS), DMEM suplementado con lisado plaquetario comercial, DMEM suplementado con un 5% de diferentes soluciones de lisado plaquetario ensayados, tales como lisado plaquetario sin suplemento de plasma y preparado en solución de Composol (Solución 1), lisado plaquetario con suplemento de plasma (40%) + Solución de Composol (60%) y sin filtrar (Solución 2), lisado plaquetario con suplemento de plasma (40%) + Solución de Composol (60%) y filtrado (Solución 3) y lisado plaquetario con suplemento de plasma (20%) y preparado en tampón fosfato salino (80%) (Solución 4). Tras analizar los datos se observó que, comparado con el Gold Standard (medio DMEM suplementado con 10% de FBS), los mejores rendimientos observados en cuanto a la media del número de células levantadas por pase (Figura 1.a), así como la media del número de duplicaciones celulares calculadas por día (Figura 1.b) se obtuvieron en fibroblastos cultivados en presencia de medio suplementado con las Soluciones 2 y 3, siendo la Solución 2 (lisado plaquetario con suplemento de plasma (40%) + Solución de Composol (60%) sin filtrar) la que mostró resultados más equiparables al Gold Standard. A su vez, dichas soluciones experimentales mostraron mejores resultados que la solución comercial empleada en el ensayo (Solución 1). Por otro lado, no se observaron diferencias significativas en cuanto a los datos de viabilidad celular (%) realizada mediante tinción con azul tripánentre los diferentes medios ensayados, encontrando en todos los casos valores próximos al 100% (Figura 1.c). Se muestran los resultados de la media de datos obtenidos tras el cultivo de las células a lo largo de tres pases celulares (n=3) donde *p<0.05, **p<0.01 y ***p<0.001 P-valor procedente de Test ANOVA.
Figura 2. Morfología celular y confluencia observada sobre fibroblastos cultivados con medios suplementados con diferentes Usados plaquetarios experimentales frente a lisado plaquetario comercial. Todas las células mantuvieron una morfología fusiforme y fibroblástica a lo largo de los pases celulares tras ser cultivadas con cada uno de las soluciones experimentales (soluciones 1 , 2, 3 y 4), no apreciándose diferencias significativas de tamaño entre ellas y la solución comercial. Las células alcanzaron confluencia más rápidamente (al 4o día tras la siembra celular) cuando fueron cultivadas con las soluciones 2 y 3, lo cual es indicativo de que el medio de cultivo suplementado con dichas soluciones parece mejorar la recuperabilidad de las células tras un proceso de descongelación. Imágenes tomadas sobre fibroblastos en cultivo en el 4o día tras la siembra celular (microscopio óptico 4x).
Figura 3. Identificación de marcadores específicos de fibroblastos mediante inmunocitoquímica. Se analizó la expresión de fibronectina, CD13, Vimentina, E- Cadherina y pancitoqueratina sobre 4 lotes de fibroblastos en pase 5 (1501-F, 1501- FT01 , 1502-FT02, 1503-FT03) cultivados con un medio suplementado con la Solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar). En todos los lotes analizados los fibroblastos fueron positivos para fibronectina, CD13 y Vimentina (marcadores específicos de fibroblastos) y negativos para E-Cadherina y Pancitoqueratina (marcadores específicos de células epiteliales y que no expresan los fibroblastos).
Figura 4. Identificación y cuantificación de Colágeno Tipo I. a) Se analizó la expresión de Colágeno tipo I sobre fibroblastos cultivados a lo largo de 5 pases celulares con diferentes medios suplementados: 10% de FBS, 5% de la Solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) y 5% de lisado plaquetario comercial. Se observó que los fibroblastos cultivados con lisado plaquetario, ya fuese lisado plaquetario comercial o la solución 2, parecían mostrar mayor expresión de Colágeno Tipo I al ser comparados con el cultivo suplementado con FBS. A su vez, se observó un incremento de la expresión del marcador a lo largo de los pases celulares (pase 2 y pase 5) al ser comparados con el pase 1 dentro de la misma condición. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio de fluorescencia y cada imagen tomada fue sometida a la mínima intensidad de exposición. b) Se analizó de nuevo la expresión de Colágeno tipo I en dos lotes diferentes de fibroblastos cultivados a lo largo de 8 pases celulares con 10% de FBS vs 5% de la Solución 2. Tras la cuantificación de la proteína mediante citometría de flujo, se observó que la media de intensidad de fluorescencia obtenida en los dos lotes analizados era mayor en las muestras cultivadas con la solución 2 al 5% al compararse con las muestras cultivadas en presencia de FBS al 10%. Estos resultados nos indican que ambos medios de cultivo mantienen la expresión de Colágeno Tipo I, aunque los fibroblastos cultivados con la solución 2 al 5% parecen expresar algo más de la proteína que cuando son cultivados con FBS al 10%. La imagen muestra las diferencias de intensidad de fluorescencia de uno de los lotes de fibroblastos analizados.
Figura 5. Cariotipo celular. Se analizó el cariotipo de 4 lotes de fibroblastos cultivados a lo largo de 7 pases celulares con un medio suplementado con un 5% de la solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) obteniéndose un perfil genético normal. La imagen muestra el informe citogenético de una de las muestras analizadas.
Figura 6. Viabilidad celular de fibroblastos inmersos en matrices de Fibrina- Agarosa (F-A) no nanoestructuradas. Se muestra la media de los porcentajes de viabilidad tras el contaje de tres campos aleatorios realizados sobre matrices de fibrina agarosa sin nanoestructurar (NE) en las que no se empleó la solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) en su elaboración frente a matrices de fibrina agarosa sin nanoestructurar (NE) en las cuales se empleó la solución 2 durante su elaboración. La viabilidad celular se analizó mediante tinción con calceína/homodímero de etidio (Uve Dead Viability/Cytotoxicity Kit) y se mantuvo en ambos casos próxima al 100%, no mostrando efectos negativos para las células la presencia de lisado plaquetario en la mezcla.
Figura 7. a) Viabilidad celular de fibroblastos inmersos en matrices de Fibrina- Agarosa (F-A) nanoestructuradas (NE) tras ser criopreservadas con diferentes soluciones de criopreservación. Se muestra la media de los datos obtenidos tras el contaje de tres campos aleatorios realizados sobre matrices de fibrina agarosa con fibroblastos fabricadas con la solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar), nanoestructuradas y posteriormente criopreservadas en presencia de tres soluciones de criopreservación diferentes: Solución A (DMEM 70% + FBS 20% + DMSO 10%), Solución B (40% Solución 2 + Albúmina 2.5% + DMSO 10%) y Solución C (CryostorTM CS10). Se muestran los porcentajes de viabilidad mediante tinción con calceína/homodímero de etidio (Uve Dead Viability/Cytotoxicity Kit) obtenidos en matrices antes de ser criopreservadas y tras su criopreservación en las distintas soluciones a t=0 y t=1 hora tras descongelación. A pesar de que no se obtuvieron cambios significativos excepto en un caso (matriz F-A solución criopreservación A t=1 vs matriz F-A solución criopreservación C t=1), se observó que la solución B mantenía estable la viabilidad a t=0 y a t=1 hora tras la descongelación al ser comparada con la solución A. Se muestran los resultados de la media de datos obtenidos (n=3) donde *p<0.05. P-valor procedente de Test ANOVA. b) Se muestran imágenes de matrices de fibrina agarosa con fibroblastos antes y después de su criopreservación empleando la solución B, que han sido teñidas con calceína/homodímero de etidio (Uve Dead Viability/Cytotoxicity Kit) para el análisis de la viabilidad celular. Se muestran en verde las células vivas y en rojo las células muertas sobre matrices antes de congelar, a t=0 tras la descongelación (b) y a t=1 tras la descongelación (c), observándose un incremento de la viabilidad en el t=1 con respecto al t=0.
Figura 8. Imágenes de cortes histológicos realizados sobre matrices de fibrina agarosa con fibroblastos criopreservadas en presencia de diferentes soluciones. Se llevó a cabo la criopreservación de matrices de fibrina agarosa con fibroblastos fabricadas con una proporción de lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar (solución 2), nanoestructuradas y posteriormente criopreservadas en presencia de tres soluciones de criopreservación diferentes: Solución A (DMEM 70% + FBS 20% + DMSO 10%), Solución B (40% Solución 2 + Albúmina 2.5% + DMSO 10%) y Solución C (CryostorTM CS10). Tras la descongelación de las matrices, estas fueron fijadas con paraformaldehido al 4% y posteriormente sometidas a un protocolo de tinción para su análisis histológico. Se observó que la solución B fue la mejor que preservaba la estructura del tejido original seguida de la solución C, siendo la solución A la peor que preservó la estructura en el tejido artificial tras el proceso de criopreservación.
Figura 9. Media del n° de células acumuladas por pase celular en cada condición ensayada. Se muestran los resultados de la media del número de células acumuladas en cada una de las 3 líneas experimentales de fibroblastos, cultivados hasta un total de 7 pases celulares (códigos 160805, 160825 y 160902). Tras analizar los datos se observó que los mejores rendimientos se obtenían tras cultivar las células con el medio de cultivo suplementado con las soluciones 5 y 6, obteniéndose diferencias muy significativas (*** p<0.005) cuando las células suplementadas con lisado de ambas soluciones al 15% fueron comparadas con la solución 2 al 5%. Por otro lado, no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas de las soluciones 5 y 6 entre sí. La figura muestra las diferencias estadísticamente significativas de todas las soluciones analizadas respecto a la solución 2 al 5%, siendo (*** p<0.005), (** p<0.01) y (*p<0.05).
Figura 10. Tiempos de duplicación celular. Se muestran los resultados de la media del tiempo de duplicación obtenido en las líneas experimentales de fibroblastos, cultivados hasta un total de 7 pases celulares (códigos 160805, 160825 y 160902), sin tener en cuenta los datos de los fibroblastos cultivados con FBS al 10%. Se observó que las soluciones 5 y 6 al 10% y al 15% mostraban un menor tiempo de duplicación celular al ser comparadas con la solución empleada actualmente (solución 2 al 5%), lo cual se traduce a una mayor velocidad de duplicación celular. Se muestran las diferencias estadísticamente significativas respecto a la solución 2 al 5%, siendo (*** p<0.005), (** p<0.01) y (*p<0.05).
Figura 11. Duplicaciones Celulares Acumuladas. Se muestran los resultados de la media de duplicaciones acumuladas obtenidas en las líneas experimentales de fibroblastos, cultivados hasta un total de 7 pases celulares (códigos 160805, 160825 y 160902). Se observó que en ningún caso superaron las 15 duplicaciones celulares acumuladas. Se muestran las diferencias estadísticamente significativas respecto a la solución 2 al 5% siendo (*** p<0.005), (** pO.01) y (*p<0.05).
Figura 12. Tendencia de las células con diferentes medios de cultivo empleado a diferentes concentraciones. La figura muestra la media del número de células obtenidas por pase con cada uno de los medios incluidos en el ensayo (suero fetal bovino al 10% y distintas condiciones de lisado plaquetario humano al 5, 10 y 15%) en los tres lotes de fibroblastos (n=3). Aunque se observan diferencias entre las tres líneas de fibroblastos, se comprobó que el número de células tendía a disminuir a lo largo de los diferentes pases celulares cuando las células eran cultivadas con lisado plaquetario a cualquiera de las concentraciones ensayadas (5, 10 y 15%). Por el contrario, el número de células se mantuvo más homogéneo a lo largo de los pases cuando las células fueron cultivadas en presencia de FBS 10%.
Figura 13. Fibroblastos descongelados y sembrados con los diferentes medios a testar a diferentes concentraciones y hasta un pase 3 (imágenes obtenidas al microscopio óptico al 10x). A y B) Se observó que los fibroblastos cultivados con lisado plaquetario, tanto con el lisado fabricado acorde al proceso actual GMP (Condición 2) como con los fabricados bajo diferentes condiciones experimentales (condiciones 5, 6 y 7) y empleados a diferentes concentraciones (5, 10 y 15%), presentan un fenotipo diferente al que presentan los fibroblastos cultivados con FBS, siendo aparentemente células más pequeñas que estos últimos. C) Se observa que las células cultivadas con cualquiera de las condiciones experimentales de lisado plaquetario (condiciones 5, 6 y 7) al 15%, comparadas con las células cultivadas con las mismas condiciones de lisado plaquetario al 5% o con FBS 10%, daban lugar a células que presentaban una distribución más errática, así como presencia de Clusters o agregados en algunas zonas se la superficie del cultivo.
Figura 14. Resultados tras el cultivo de fibroblastos con lisado plaquetario obtenido tras dos o tres ciclos de congelación/descongelación. Como se observa en la figura 15.a), el número de fibroblastos obtenidos a lo largo de 5 pases celulares fue muy semejante para ambas soluciones, observándose una diferencia mínima de aproximadamente 43.000 células entre ambas, siendo superior en los fibroblastos cultivados con el medio suplementado con la solución 8. A su vez, el número de duplicaciones celulares por día calculadas a lo largo de los 5 pases celulares fue muy semejante entre ambas condiciones (figura 15. b), obteniéndose valores de 1 , 10 en solución 6 vs 1 ,08 en solución 8, lo cual nos indica que la dinámica de crecimiento era muy similar. A su vez, el número de células obtenidas en cada pase (figura 15.c) se mantuvo igual entre ambas condiciones y disminuyó en la misma proporción conforme se realizaron los sucesivos pases. Concretamente, el ratio de disminución entre el pase 1 y el pase 6 (n° células obtenidas en pase 1/n° células obtenido en pase 6) fue de 3,5 veces con la solución 6 vs 3,3 veces con la solución 8, lo cual podría estar asociado al agotamiento de los factores en el medio de cultivo que había sido completado al inicio de la prueba. Finalmente, tras calcular el número de células acumuladas a lo largo de los 5 pases para ambos cultivos (figura 15.d) observamos que éste fue también muy semejante, obteniéndose 5.214.050 de células acumuladas con la solución 6 vs 5.431.700 de células acumuladas con la solución 8.
Figura 15. Pruebas de actividad en cultivo de 3 lotes de Usado plaquetario obtenido tras tres ciclos de congelación/descongelación (Solución 8). Se fabricaron tres réplicas la solución 8 de lisado plaquetario (lotes: 171 107-b, 171 107-c y 171 120) para comprobar el grado de reproducibilidad del proceso. Tras la obtención de las soluciones, células de un lote común de fibroblastos (1501-FP06 en Pase 9) se sembraron en paralelo a la misma densidad celular empleando cada una de las réplicas obtenidas de la solución 8 y fueron comparadas con células cultivadas con la Solución 6 (control). Se analizó el número de células obtenidas con cada solución tras 4 días en cultivo. Como se muestra en la figura, no se observaron diferencias significativas en el número de células obtenidas con las diferentes réplicas de la solución 8 (171 107-b, 171107-c y 171 120), ni tampoco de estas con la solución 6.
Figura 16. Marcadores de identidad y potencia analizados en los lotes de fibroblastos 120614 (a) y 120717 (b) cultivados con las soluciones 2 y 6. Se llevó a cabo un análisis mediante inmunofluorescencia de los siguientes marcadores de identidad y potencia sobre dos lotes de fibroblastos cultivados a lo largo de 5 pases celulares: Colágeno tipo I (+), Fibronectina (+), Vimentina (+), CD13 (+), Pancitoqueratina (-) y E-Cadherina (-). Como se obsera en ambos lotes analizados, los fibroblastos expresaron Colágeno tipo I , Fibronectina, Vimentina y CD13, bajo todas las condiciones de cultivo analizadas (soluciones 2 y 6) a las diferentes concentraciones ensayadas (5% y 15%), y no expresaron Pancitoqueratina ni E- Cadherina. Por otro lado, no se observaron diferencias de expresión de los marcadores ni entre las diferentes soluciones ni a los diferentes porcentajes.
Figura 17. Marcadores de identidad y potencia analizados sobre fibroblastos cultivados bajo las condiciones 6 y 8. Se analizó el fenotipo de los fibroblastos cultivados hasta el pase 6 con las soluciones 6 y 8, analizándose para ello los marcadores CD44 (+), CD13 (+), CD324 (-) y HLA-DR (-) mediante citometría de flujo (Figura 18.a) y Colágeno Tipo I (+) mediante técnicas de inmunofluorescencia (Figura 18.b). No se observaron diferencias en la expresión de ninguno de los marcadores analizados entre ambas condiciones. Figura 18. Resultados tras el test de cariotipo realizados a fibroblastos cultivados con tres lotes diferentes de la solución 8 al 5%: 171107-b (a), 171107-c (b) y 171120 (c). Como se observa en la figura, los cariotipos obtenidos fueron normales en todos los casos, por lo que puede concluirse que el medio de cultivo suplementado con la solución 8 no generan inestabilidad genética a lo largo los pases testados.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los autores de la presente invención han desarrollado una composición que promueve el crecimiento celular, mantiene el fenotipo celular favoreciendo la expresión de ciertos marcadores y favorece la criopreservación de las células o tejidos promoviendo la recuperación de las mismas tras su descongelación.
Además, el producto aquí propuesto contiene niveles moderados de PDGF y otros factores suficientes para proporcionar una tasa de crecimiento adecuado durante el cultivo in vitro de fibroblastos. Otros productos presentes en el mercado contienen niveles de PDGF muy superiores, lo cual podría ser contraproducente para el cultivo de ciertos tipos celulares destinados al tratamiento de heridas de diversa índole.
COMPOSICIÓN Y MEDIO DE CULTIVO DE LA INVENCIÓN
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende Usado plaquetario humano (hPL) y Plasma AB.
La composición de la invención se obtiene mediante un proceso de fabricación que consiste en un 60% de Lisado plaquetario humano (hPL) obtenido a partir de plaquetas leucodeplecionadas de grupo 0 en Solución de Composol cuya concentración final supone 1 x 109 plaquetas/ml de mezcla total y suplementado con un 40% de Plasma AB.
Tras la obtención de la composición de la invención esta podría ser filtrada. Por tanto, en una realización preferida, la composición de la invención es filtrada. En otra realización preferida, la composición de la invención no es filtrada. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, la concentración inicial de plaquetas de partida para obtener el lisado plaquetario es de entre 1x108- 5x109 plaquetas/ml, y preferiblemente de 0.5-1.5 x 109 plaquetas/ml y más preferiblemente de 1 x 109 plaquetas/ml. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la proporción de hPL y de plasma AB es de 90% hPL y 10% de plasma AB, preferiblemente de 80% hPL y 20% de plasma AB, y más preferiblemente, de 60% hPL y 40% de Plasma AB. En otra realización preferida, la proporción de hPL y de plasma AB es de 98% hPL y 3% de plasma AB. Es posible emplear hPL al 100%, ya que se ah visto que mantiene la funcionalidad, pero es mejor cuando se añade una proporción de plasma AB.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención el lisado plaquetario humano (hPL) se ha obtenido a partir de plasma transfusional del grupo AB, y más preferiblemente de plasmaféseris del grupo AB.
El hPL se puede generar a partir del buffy coat, plasma enriquecido en plaquetas (platelet-rich plasma (PRP)), o concentrados de plaquetas derivados de aféresis.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención el lisado plaquetario humano (hPL) se ha obtenido a partir de plaquetas leucodeplecionadas, y más preferiblemente de plaquetas leucodeplecionadas del grupo 0.
En otra realización preferida de este aspecto la composición de la invención se obtiene por un procedimiento que comprende: a) generar un concentrado de plaquetas frescas, b) suplementarias con plasma AB, y c) lisar las plaquetas.
Tanto la etapa (a) de generar un concentrado de plaquetas como la etapa (b) de suplementarias con plasma AB son opcionales. Así, el lisado de las plaquetas cuando están suplementadas con plasma es más efectivo. Por tanto, en una realización más preferida de la invención la composición de la invención se obtiene por un procedimiento que comprende: a) suplementarias con plasma AB, y b) lisar las plaquetas. En otra realización preferida, el procedimiento comprende:
I) Obtener una mezcla de Plaquetas frescas leucodeplecionadas de grupo 0,
II) Eliminar los posibles restos de plasma de grupo 0 procedentes de las bolsas de plaquetas de partida y concentración de plaquetas mediante un proceso de centrifugación, preferiblemente a 2000g durante 20 minutos, más preferible a 2500g durante 10 minutos a temperatura ambiente (22°C).
III) Obtención de 1x109plaquetas/ml diluidas en 60% Solución de Composol y 40% plasma AB o plasmaféresis de grupo AB.
IV) 1o Congelación del concentrado de plaquetas preferiblemente a -40°C durante al menos 6 horas, más preferiblemente a -80°C durante al menos 12 horas y descongelación a 34°C durante 2-8 horas, preferiblemente a 36°C durante 2-5 horas.
V) 2o Congelación del concentrado de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, preferiblemente a -80°C durante al menos 12 horas y 2o descongelación a 34°C durante 2-8 horas, preferiblemente a 36°C durante 2-5 horas.
VI) Centrifugación del lisado plaquetario a 3500g durante 45 min., más preferiblemente 4000g durante 30 min. a temperatura ambiente (20-25°C), más preferiblemente a 22°C y eliminación de restos
VII) Centrifugación del lisado plaquetario a 3500g durante 25 min., preferiblemente a 4000g durante 15 min. a temperatura ambiente (20- 25°C), más preferiblemente a 22°C y eliminación de restos.
VIII) Conservación del lisado plaquetario entre -20°C y -80°C, más preferiblemente por debajo de -80°C.
Preferiblemente la centrifugación del paso II) de realiza a 2500g durante 10 minutos a temperatura ambiente (22°C).
En otra realización preferida la 1o congelación del paso IV) se realiza a -80°C durante al menos 12 horas.
En otra realización preferida la 1o descongelación del paso IV) se realiza a 36°C durante 2-5 horas.
En otra realización preferida la 2o congelación del paso IV) se realiza a -80°C durante al menos 12 horas. En otra realización preferida la 2o descongelación del paso IV) se realiza a 36°C durante 2-5 horas.
En otra realización preferida la centrifugación del lisado plaquetario del paso VI) se realiza a 4000g durante 30 min. En otra realización preferida la centrifugación del lisado plaquetario del paso VI) se realiza a una temperatura de 22°C,
En otra realización preferida la centrifugación del lisado plaquetario del paso VII) se realiza a 4000g durante 15 min.
En otra realización preferida la centrifugación del lisado plaquetario del paso VII) se realiza a una temperatura de 22°C,
En otra realización preferida la conservación del lisado plaquetario del paso VIII) se realiza por debajo de -80°C.
En otra realización preferida la temperatura de centrifugación de los pasos IV y I IV es de 4°C.
En otra realización aún más preferida, la temperatura de centrifugación de los pasos VI y VII es de 4°C.
El proceso se realiza bajo Normas de Correcta Fabricación (NCF) y conlleva una secuencia que consiste en la generación de un concentrado de plaquetas preferiblemente frescas suplementadas con plasma que posteriormente se lisan para generar una solución final de lisado plaquetario enriquecido.
En otra realización más preferida el procedimiento comprende:
I) Obtener una mezcla de plaquetas frescas leucodeplecionadas de grupo 0,
II) 1o Congelación de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, preferiblemente durante al menos 12 horas, y descongelación entre 33°C y 37°C, más preferiblemente a 36°C durante 2-8 horas, preferiblemente durante 5 horas.
III) 2o Congelación de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, preferiblemente durante al menos 12 horas, y descongelación entre 33°C y 37°C, más preferiblemente a 36°C durante 2-8 horas, preferiblemente durante 5 horas. IV) 3o Congelación de plaquetas y descongelación progresiva entre 10 y 30 horas a al menos 2°C, y preferiblemente durante aproximadamente 24 horas a 4°C.
IV) Centrifugación del lisado plaquetario entre 3300g y 4300 g durante 25 y 50 minutos y entre 2o y 25° C, preferiblemente a 4000g durante 30 min, a 4°C y eliminación de restos
V) Centrifugación del lisado plaquetario entre 3300g y 4300 g durante 10 - 40 minutos y entre 2o y 25° C, preferiblemente a 4000g durante 15 min., a 4°C y eliminación de restos.
Más preferiblemente el procedimiento de obtención adicionalmente comprende una etapa Γ) (entre la etapa I y II), para eliminar los posibles restos de plasma de grupo 0 procedentes de las bolsas de plaquetas de partida y concentración de plaquetas mediante un proceso de centrifugación, preferiblemente a 2000g durante 20 minutos, a temperatura ambiente (22°C).
13. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde el procedimiento de obtención adicionalmente comprende una etapa III ') (entre la etapa III y IV), de tercera congelación del concentrado de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, y una 3a descongelación que se hace de manera progresiva entre 2°C y 10°C durante 10 a 30 horas, y preferiblemente entre 16 - 24 horas.
Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende la composición de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo. Un tercer aspecto de la invención se refiere a un medio de cultivo, de ahora en adelante medio de cultivo de la invención, que comprende la composición de la invención o la composición farmacéutica de la invención.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un tejido artificial, de ahora en adelante tejido artificial de la invención, que comprende la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención o el medio de cultivo de la invención y además comprende al menos una célula. Las células pueden ser de cualquier estirpe celular, como por ejemplo, pero sin limitarnos, células epiteliales, neuronas, fibroblastos, adipocitos, osteoblastos, hepatocitos, células básales, odontoblastos, neumocitos, miocitos, o células endoteliales. También pueden ser células madre, preferiblemente células madre mesenquimales. También pueden ser células madre pluripotentes inducidas (iPSs). Preferiblemente son fibroblastos. En otra realización preferida la célula es una célula madre mesenquimal, y más preferiblemente una célula madre mesenquimal procedente de cordón umbilical.
USO DE LAS COMPOSICIONES Y DEL MEDIO DE CULTIVO DE LA INVENCIÓN
El uso del producto como suplemento del medio de cultivo mantiene la viabilidad e incrementa, o al menos iguala, las tasas de crecimiento de diferentes tipos celulares tras compararse con otros suplementos normalmente empleados como el suero fetal bovino o lisados plaquetarios comerciales. Preferiblemente el medio de cultivo de la invención ha resultado idóneo para fibroblastos y células madre mesenquimales.
Además, los autores de la presente invención han demostrado que el uso de la composición de la invención mantiene la expresión de los marcadores celulares en las líneas testadas e incluso en algunos casos incrementa la expresión de marcadores específicos tras ser comparados con medios suplementados con otros aditivos como suero fetal bovino y lisado plaquetario comercial.
Es decir, la composición de la invención podría utilizarse como un suplemento del medio de cultivo de diferentes líneas celulares, mejorando las tasas de crecimiento de células animales y humanas, así como favoreciendo la expresión de marcadores celulares implicados en rutas importantes.
Por tanto, un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición de la invención o el medio de cultivo de la invención para el cultivo de células. En una realización preferida de este aspecto las células son células madre, y aún más preferiblemente células madre mesenquimales. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las células son células pluripotentes inducidas.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las células son fibroblastos.
La composición de la invención obtenida es un producto libre de anticuerpos plasmáticos y antígenos celulares, cuya presencia podrían afectar el cultivo de las diferentes líneas celulares y la aplicación de estas en pacientes como medicamento en terapia celular.
En una realización preferida de este aspecto de la invención los cultivos son "xeno- free". Los autores de la presente invención han demostrado que la composición de la invención como suplemento del medio de cultivo mantiene la recuperabilidad (n° de células recuperadas) tras la descongelación y siembra de células al ser comparadas con medios suplementados con otros lisados plaquetarios comerciales.
Así pues, la composición de la invención podría utilizarse como un suplemento del medio de cultivo empleado durante la descongelación y posterior siembra de diferentes líneas celulares, manteniendo y posiblemente mejorando la recuperabilidad celular (n° de células obtenidas días después tras la siembra).
También han demostrado que la composición de la invención puede emplearse como parte componente de una solución de criopreservación que mantiene la viabilidad e incrementa en la mayoría de los casos la recuperación de las células en el momento de la descongelación, así como la integridad de tejidos artificiales al ser comparada con otras soluciones empleadas para la criopreservación de células y/o tejidos.
Preferiblemente las células se encuentran embebidas en una matriz biológica.
Por tanto, un sexto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición de la invención o el medio de cultivo de la invención en un procedimiento de criopreservación celular.
Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición de la invención o el medio de cultivo de la invención en un procedimiento de vitrificación celular. Un octavo aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición de la invención o el medio de cultivo de la invención para la recuperación de las células sometidas a congelación.
Preferiblemente, las células sometidas a criopreservación o vitrificación son células madre. En otra realización preferida, las células sometidas a criopreservación o vitrificación son células madre mesenquimales. En otra realización preferida, las células sometidas a criopreservación o vitrificación son células madre pluripotentes inducidas (iPSs). En otra realización preferida, las células sometidas a criopreservación o vitrificación son fibroblastos.
Únicamente y en el caso particular de no utilizar embriones humanos o células pluripotentes con fines industriales o comerciales en el entorno de la Unión Europea, aún más preferiblemente, las células y/o los embriones son células de mamífero no humano o embriones no humanos.
Sin embargo, en el caso particular de que el cultivo de las células tenga una finalidad terapéutica o de diagnóstico para el propio embrión, las células y/o los embriones son de mamífero humano. Así, por ejemplo, la composición farmacéutica de la invención, o el medio de cultivo de la invención puede emplearse en el diagnóstico genético preimplantacional.
USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN
La composición de la invención es un producto libre de anticuerpos plasmáticos y antígenos celulares que podría evitar un posible rechazo en pacientes en el caso de ser usado como producto de terapia celular.
El proceso de fabricación de la composición de la invención ha sido validado bajo Normas de Correcta Fabricación e inspeccionado con resultados satisfactorios por la AEMPS (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios). Además, es "Xeno-free": no tiene ningún producto animal. Esto supone una ventaja respecto a otras soluciones disponibles en el mercado, mostrándose una herramienta útil para la fabricación de medicamentos de terapias avanzadas ya que no contiene productos animales que pueden provocar contaminación cruzada con agentes adventicios de origen no humano y rechazo en el paciente.
Por tanto, un noveno aspecto se refiere al uso de la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, el medio de cultivo de la invención y/o el tejido artificial de la invención, en la elaboración de un medicamento, o alternativamente, a la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, al medio de cultivo de la invención y/o el tejido artificial de la invención, para su uso como medicamento. Debido a la composición del producto y a las propiedades regenerativas y cicatrizantes que este presenta, el producto podría emplearse también como medicamento en medicina regenerativa o como solución empleada con fines estéticos. Así pues, un décimo aspecto de la invención se refiere a la composición, la composición farmacéutica de la invención, al medio de cultivo de la invención y/o el tejido artificial de la invención, para su uso como cosmético.
Preferiblemente dicho medicamento es un medicamento de terapia celular somática. Se entiende por "terapia celular somática" la utilización de células somáticas vivas, autólogas, alogénicas o xenogénicas, cuyas características biológicas han sido alteradas sustancialmente como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen la acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades funcionales homologas o no homologas anteriormente no expresadas. El uso del producto de la invención como suplemento durante el cultivo parece incrementar la expresión de algunos marcadores específicos de fibroblastos como el colágeno tipo I que está estrechamente relacionado con los procesos de remodelación y cicatrización de heridas. Esto puede suponer una ventaja frente otros productos empleados durante el cultivo de determinados tipos celulares con fines terapéuticos. Así pues, un undécimo aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, del medio de cultivo de la invención y/o del tejido artificial de la invención, en la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado, o alternativamente, a la composición, la composición farmacéutica de la invención, al medio de cultivo de la invención, para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado.
La composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, o el medio de cultivo de la invención, preferiblemente junto con las células adecuadas, puede emplearse para para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado.
Las células pueden ser de cualquier estirpe celular, como por ejemplo, pero sin limitarnos, células epiteliales, neuronas, fibroblastos, adipocitos, osteoblastos, hepatocitos, células básales, odontoblastos, neumocitos, miocitos, o células endoteliales. También pueden ser células madre, preferiblemente células madre mesenquimales. También pueden ser células madre pluripotentes inducidas. Preferiblemente son fibroblastos.
El tejido o el órgano pueden ser internos como, por ejemplo, pero sin limitarse, la uretra o la vejiga, o externos como, por ejemplo, pero sin limitarse, la córnea o la piel. En una realización preferida, el tejido o el órgano dañado se seleccionan de la lista que comprende: piel, vejiga, uretra, córnea, mucosa, conjuntiva, pared abdominal, conjuntiva, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendón, hueso, meninge o vagina. El tejido o el órgano pueden estar enfermos o dañados como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad, por ejemplo, pero sin limitarse, una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genética o degenerativa; un daño físico como un traumatismo o una intervención quirúrgica, un daño químico o una interrupción del flujo sanguíneo.
Una realización preferida de este aspecto se refiere al uso de la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, o del medio de cultivo de la invención, y/o el tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una piel. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una piel enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación o una malformación congénita.
Una realización preferida de este aspecto se refiere al uso de la composición de la invención, la composición farmacéutica de la invención, o del medio de cultivo de la invención y/o el tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una vejiga. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una vejiga enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, una extrofia vesical, una extrofia de cloaca o una microvejiga), una vejiga neurógena, una incontinencia urinaria, una disfunción vesical, una infección o una litiasis vesical. Una realización preferida de este aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una uretra. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una uretra enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, un hispospadias o un epispadias) o una estenosis.
Una realización preferida de esteaspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una córnea. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una córnea enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una úlcera corneal, un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una causticación, una insuficiencia I ímibica, una queratitis atrófica, una distrofia corneal, una queratopatía primaria o secundaria, una infección , un leucoma, una queratopatía bullosa, un fallo endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.
Una realización preferida de este aspecto se refiere al uso del tejido artificial de la invención para la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una mucosa, preferiblemente de una mucosa oral. Una realización aún más preferida se refiere al uso del tejido artificial de la invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de una mucosa oral enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia ben igna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación, una malformación congénita, una pérdida de sustancia o una enfermedad periodontal.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición, la composición farmacéutica de la invención, el medio de cultivo de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad embrionaria, o alternativamente, a la composición, la composición farmacéutica de la invención, o al medio de cultivo de la invención para su uso en el tratamiento o el diagnóstico de una enfermedad embrionaria. Más preferiblemente, se refiere al uso de la composición, la composición farmacéutica de la invención, el medio de cultivo de la invención, en la elaboración de un medicamento para el diagnóstico genético preimplantacional, o alternativamente a la composición, la composición farmacéutica de la invención, el medio de cultivo de la invención, para su uso en el diagnóstico genético preimplantacional.
Definiciones: El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere a la composición, composición farmacéutica o medio de cultivo de la invención, que tiene un objetivo terapéutico o de diagnóstico que se aplican al embrión y que le son útiles.
Las células madre pluripotentes son células indiferenciadas, inmaduras y con capacidad de autorrenovación capaces de diferenciarse a células que constituyen tejidos derivados de cualquiera de las tres capas embrionarias, el ectodermo, el endodermo y el mesodermo, que darán lugar a los tejidos y estructuras conocidas en los animales superiores.
Los mamíferos pertenecen al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Metazoa, Phylum Chordata, Subphylum Craniata, Clase Mammalia.
Los organismos de la especie Homo sapiens pertenecen al Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino Metazoa, Phylum Chordata, Subphylum Craniata, Clase Mammalia, Orden Primates, Familia Hominidae y Género Homo.
En otra realización preferida, pero no limitante, las células son de mamífero, como por ejemplo, primates, ovinos, caprinos, porcinos, bovinos, equinos. Sin embargo, la presente invención también es de aplicación en otras especies, como por ejemplo, pero sin limitarnos, en peces óseos u osteictios (Osteichthye), como por ejemplo los peces del orden Salmoniformes.
El hombre es un mamífero humano que pertenece a la especie Homo sapiens. En esta memoria, el término célula incluye también a los ovocitos u oocitos. El término "ovocito u oocito" se refiere a una célula germinal femenina que está en proceso de convertirse en un óvulo maduro.
La "criopreservación" es el proceso en el cual células o tejidos son congelados a muy bajas temperaturas, generalmente entre -80 °C y -196 °C (el punto de ebullición del nitrógeno líquido) para disminuir las funciones vitales de una célula o un organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. A esas temperaturas, cualquier actividad biológica, incluidas las reacciones bioquímicas que producirían la muerte de una célula, quedan efectivamente detenidas. Uno de los principales problemas de la criopreservación es la formación de cristales de hielo durante la congelación del agua. Estos cristales se forman tanto fuera como dentro de la célula y son los cristales intracelulares los que comportándose como cuchillas cortan las estructuras internas de la célula, especialmente las membranas.
Tanto las células, incluyendo los ovocitos, como los embriones pueden ser sometidos a un proceso de criopreservación. Así, preferentemente, las células o embriones han sido previamente criopreservados.
Los ovocitos es el material más sensible a la criopreservación. Este hecho se debe probablemente a que su placa metafásica es muy sensible. Los ovocitos sobreviven poco y mal a la congelación, siendo la tasa de gestación por ciclo de descongelación sólo del 10%.
Por tanto, en otra realización preferida las células o embriones han sido previamente sometidos a un proceso de vitrificación.
El término "embrión" como se usa en el contexto de la presente invención está destinado a incluir en su ámbito de aplicación de las diversas etapas de desarrollo del embrión, incluyendo la fase de blastocisto como así como la fase de mórula anterior. En ocasiones en todo el texto los términos "embrión" y "blastocisto" se utilizan indistintamente, pero a partir de la descripción proporcionada será evidente para los expertos en la técnica lo que se entiende por estos términos y su alcance.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la expansión de células madre. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para el mantenimiento de las células madre en forma indiferenciada. El término "cuerpo embrionario" hace referencia a los agregados derivados de células madre pluripotentes en proceso de diferenciación. El cultivo de estos cuerpos embrionarios bajo diferentes condiciones da lugar a los diversos tipos de células indiferenciadas. La formación de estos cuerpos embrionarios se realiza por cualquier técnica descrita en el estado de la técnica y que conoce el experto en la materia.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para el cultivo de cuerpos embrionarios.
A menos que el contexto requiera otra cosa claramente, a lo largo la descripción y las reivindicaciones, las palabras 'comprenden', 'comprende', y similares, se han de interpretar en un sentido inclusivo en oposición a un sentido exclusivo o exhaustiva; es decir, en el sentido de "incluye, pero no limita a ".
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Bloque I. Uso de la invención como suplemento del medio de cultivo celular
1. Obtención de diferentes preparados de lisado plaquetario
Se llevó a cabo la preparación de diferentes soluciones de lisado plaquetario a partir de 10 Buffy Coat del grupo 0 que fueron mezclados previamente. Tras ello se generaron las siguientes soluciones:
• Solución 1 : Plaquetas frescas→ Congelación -80°C→ Descongelación 36°C→ Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 min. a temperatura ambiente→ Centrifugación 4000g 15 min. a temperatura ambiente→ Conservación -80°C. Solución 2: Plaquetas frescas diluidas en 60% Solución de Composol y 40% plasma AB (1x109 plaquetas/ml)→ Congelación -80°C→ Descongelación 36°C→ Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 min. a temperatura ambiente→ Centrifugación 4000g 15 min. a temperatura ambiente→ Conservación -80°C.
Solución 3: Plaquetas frescas diluidas en 60% Solución de Composol y 40% plasma AB (1x109 plaquetas/ml)→ Congelación -80°C→ Descongelación 36°C→ Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 min. a temperatura ambiente→ Centrifugación 4000g 15 min. a temperatura ambiente→ Filtración 0.48μηι→ Conservación -80°C.
Solución 4: Plaquetas frescas diluidas en 80% Solución Salina Fosfatada + 20% plasma (1x109 plaquetas/ml) → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 min. a temperatura ambiente→ Centrifugación 4000g 15 min. a temperatura ambiente→ Conservación -80°C.
Solución 5: Plaquetas frescas suplementadas con 20% de Plasma AB (plasmaféresis)→ Congelación -80°C→ Descongelación 36°C→ Congelación - 80°C → Descong. 36°C → Centrifugación 4000g 30minutos a 4°C → Centrifugación 4000g 15minutos a 4°C→ Conservación -80°C.
Solución 6: Plaquetas frescas no suplementadas → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → suplemento con 20 % de Plasma AB (plasmaféresis)→ Centrifugación 4000g 30 minutos a 4°C→ Centrifugación 4000g 15 minutos a 4°C→ Conservación -80°C.
Solución 7: Plaquetas frescas no suplementadas → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Centrifugación 4000g 30 minutos a 4°C→ Centrifugación 4000g 15 minutos a 4°C → Conservación -80°C.
Solución 8: Plaquetas frescas no suplementadas → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C → Descongelación 36°C → Congelación -80°C→ Descongelación 4°C→ Centrifugación 4000g 30 minutos a 4°C→ Centrifugación 4000g 15 minutos a 4°C→ Conservación -80°C. 2. Cultivos celulares
Se llevaron a cabo varios ensayos in vitro para analizar el efecto que tiene sobre el cultivo de fibroblastos el empleo de diferentes suplementos, entre ellos, las soluciones obtenidas en el punto anterior (soluciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8) así como otros suplementos normalmente empleados como el Suero fetal bovino (FBS o Fetal Bovine Serum) o Usado plaquetario Humano comercial. Para ello, fibroblastos dérmicos obtenidos mediante técnicas de explantes y procedentes de pases tempranos fueron descongelados y sembrados a una densidad de 4000 cel/cm2 en presencia de un medio DMEM suplementado con 10% de FBS. Tras mantenerse las células al menos 48 horas en cultivo, estas se levantaron y se sembraron de nuevo a razón de 3000 cel/cm2 empleando para ello las condiciones indicadas a continuación:
1. DMEM suplementado con 10% FBS, aminoácidos no esenciales (NEAA) (0,1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina {20vg/m\).
2. DMEM suplementado con 5% Lisado Plaquetario Humano comercial (Cook Medical), NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΛηΙ).
3. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 1 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0,1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).
4. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 2 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).
5. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 3 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).
6. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 4 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).
7. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 5 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).
8. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 6 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).
9. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 7 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΑηΙ).
10. DMEM sup ementado con 5% de la Solución 8 (solución obtenida acorde al apartado 1) NEAA (0, 1 mM), GlutaMax CTS (2mM) y Gentamicina ^ΟμςΛηΙ). Se mantuvieron las mismas condiciones de cultivo a lo largo de todo el ensayo, aplicando el pase celular a todos los cultivos a la vez tras alcanzar al menos uno de ellos el 90-100% de confluencia celular. Tras el levantamiento, las células se sembraban de nuevo a una densidad de 3000 cel/cm2 empleando las mismas condiciones hasta alcanzar un máximo de 7-8 pases celulares. Finalizado el ensayo, se llevó a cabo un análisis de los rendimientos celulares obtenidos: Figura 1.a, Figura 9, Figura 15 y Figura 16; de la dinámica de crecimiento (duplicaciones celulares): Figura 1.b, Figura 10, Figura 11 y Figura 15; de la viabilidad celular: Figura 1.c, de la morfología de los fibroblastos cultivados: Figura 2, Figura 13 y Figura 14; así como de la tendencia de los cultivos a lo largo de los pases celulares en presencia de diferentes soluciones empleadas a diferentes concentraciones: Figura 12.
El cálculo del número de duplicaciones celulares se realizó acorde a la siguiente fórmula:
Log N - Log No
Duplicaciones celulares =
P Log 2
Donde N = n° final de células obtenidas tras el pase celular y No = n° inicial de células sembradas al inicio del pase celular.
Se calcularon en cada caso el n° de duplicaciones celulares obtenidas en cada pase celular, así como las duplicaciones celulares acumuladas a lo largo de todo el experimento.
3. Expresión de marcadores celulares
Se analizó la expresión de marcadores específicos de fibroblastos cultivados hasta un pase 5 con un medio de cultivo DMEM suplementado con un 5% de la solución 2 descrita en el apartado 1 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar). Se analizó la expresión de Fibronectina, CD13, Vimentina, Pancitoqueratina y E-Cadherina (Figura 3) mediante técnicas de inmunocitoquímica.
En una segunda tanda de experimentos se analizó la expresión de Colágeno tipo I sobre fibroblastos cultivados hasta pase 5 con diferentes suplementos en el medio: DMEM suplementado con 5% de lisado plaquetario comercial, DMEM suplementado con 5% de la solución 2 descrita en el apartado 1 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) y DMEM suplementado con 10% de FBS. Para ello se emplearon técnicas de inmunocitoquímica (Figura 4.a) y citometría de flujo (Figura 4.b).
En una tercera tanda de experimentos se analizó la expresión de Colágeno tipo I (+), Fibronectina (+), Vimentina (+), CD13 (+), Pancitoqueratina (-) y E-Cadherina (-) mediante test de inmunofluorescencia sobre fibroblastos cultivados a lo largo de 5 pases celulares con la solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) y la solución 6 (lisado plaquetario enriquecido post-congelación con un 20% de Plasma), ambas empleadas al 5% y al 15% (Figuras 16.A y 16.B). En una cuarta etapa de experimentos se analizó la expresión de CD44 (+), CD13 (+), CD324 (-) y HLA-DR (-) mediante citometría de flujo (Figura 17.a) y Colágeno Tipo I (+) mediante técnicas de inmunofluorescencia (Figura 17.b).
4. Cariotipo celular
Se analizaron los perfiles genéticos mediante técnicas de cariotipado sobre muestras representativas de fibroblastos cultivados con medio DMEM suplementado con un 5% de la solución 2 descrita en el apartado 1 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) hasta alcanzar un pase 7 o tras acumular al menos 16.5 duplicaciones celulares (Figura 5).
Adicionalmente se analizó el cariotipo de fibroblastos cultivados hasta superar 16.5 duplicaciones acumuladas cultivados con un 5% de la solución 8 (Figura 18 a, b y c).
Bloque II. Uso de la invención como parte integrante de matrices biológicas celularizadas
1. Generación de matrices celulares con lisado plaquetario Se analizó el efecto que tenía la presencia de lisado plaquetario durante la fabricación de una matriz biológica celularizada fabricada siguiendo la metodología descrita en la solicitud de patente WO/201 1/023843. Para ello, se fabricaron dos matrices biológicas con fibroblastos: una añadiendo la solución 2 de la presente invención en la mezcla y otra sin añadirla, y posteriormente se tiñeron con calceina/homodímero de etidio (Live Dead Viability/Cytotoxicity Kif) para analizar la viabilidad de las células incluidas en la matriz (Figura 6). 2. Empleo de matrices celulares para el tratamiento de grandes quemados como medicamento de uso compasivo
Se llevó a cabo la fabricación de dos lotes de matrices biológicas celularizadas siguiendo la metodología descrita en la solicitud la patente WO/2011/023843y fabricadas bajo Normas de Correcta Fabricación para el posterior tratamiento de dos pacientes de uso compasivo que presentaron, en el peor de los casos, un 70% de espesor total de piel quemada. Para ello, fibroblastos dérmicos obtenidos por digestión enzimática con Colagenasa fueron aislados y expandidos con medio DMEM suplementado con un 5% de la Solución 2 de la presente invención hasta obtener un Banco Celular Maestro (BCM) y posteriormente un Banco Celular de Trabajo (BCT). La obtención de las matrices biológicas se llevó a cabo acorde a la patente, empleando fibroblastos procedentes del BCT, obteniendo finalmente un medicamento (denominado "producto terminado") que cumplió con todos los criterios de calidad establecidos para su liberación y uso en pacientes. Ninguno de los pacientes tratados mostró ningún síntoma de rechazo al medicamento, observándose indicios de repitalización de la herida unas semanas tras el tratamiento.
Bloque III. Uso de la invención como parte integrante de una solución para la criopreservación de células y/o tejidos.
1. Obtención de diferentes soluciones de criopreservación
Se realizaron las siguientes mezclas, manteniéndose en todo momento refrigeradas hasta su uso: Solución A: 70 % DMEM + 20% FBS + 10% DMSO.
Solución B: 40% de la Solución 2 (lisado plaquetario enriquecido con un 40% de Plasma + 60% de Solución de Composol sin filtrar) + 2,5 % Albúmina humana + 10% DMSO.
2. Criopreservación de tejidos artificiales
Se llevó a cabo la generación de matrices biológicas celularizadas siguiendo la metodología descrita en la solicitud de patente WO/201 1/023843 con el fin de ver el efecto que tienen las diferentes soluciones de criopreservación definidas anteriormente (soluciones A y B) frente a una solución comercial (solución C=CryostorTM CS10) durante la criopreservación de tejidos artificiales.
Tras la generación de las matrices, estas fueron nanoestructuradas siguiendo la metodología descrita en la solicitud de patente WO/2011/023843 (proceso que consiste en la deshidratación del tejido hasta alcanzar un 10% de agua) e incluidas independientemente en bolsas de congelación a las que se añadió las soluciones a testar. Posteriormente, las bolsas con las matrices fueron rápidamente termoselladas y sometidas a un proceso progresivo de criopreservación que consistió en mantener las láminas durante 30 minutos a 4°C, posteriormente 24 horas a -20°C, tras ello 48 horas a -80°C y al menos 24 horas a -196°C antes de ser descongeladas de nuevo (Rodríguez MA, López-López MT, Duran JD, Alaminos M, Campos A, Rodríguez IA Cryopreservation of an artificial human oral mucosa stroma. A viability and rheological study Cryobiology. 2013 Dec;67(3):355-62). La descongelación de las matrices se llevó a cabo rápidamente a 37°C y tras lo cual se tiñeron con calceina/etidio homodymer (Live Dead Viability/Cytotoxicity Kit) para analizar la viabilidad de las células inmersas en las matrices (Figura 7).
3. Análisis Histológicos
Muestras representativas de las matrices fabricadas en el punto anterior criopreservadas con las tres soluciones a testar (soluciones A, B y C) fueron fijadas tras la descongelación con paraformaldehido al 4% y sometidas a un proceso de tinción para su posterior análisis histológico (Figura 8).

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Una composición que comprende lisado plaquetario humano (hPL) y Plasma AB.
2. - La composición según la reivindicación anterior, donde el lisado plaquetario humano (hPL) es obtenido a partir de plaquetas leucodeplecionadas de grupo 0 en solución de composol.
3. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la concentración final de plaquetas en el lisado plaquetario es de entre 1x108- 5x109 plaquetas/ml.
4. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la concentración final de plaquetas en el lisado plaquetario es de entre 0.5-1.5x109 plaquetas/ml.
5. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la concentración final de plaquetas en el lisado plaquetario es de aproximadamente 1x109 plaquetas/ml.
6.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la proporción de hPL y de plasma AB es de 90% hPL y 10% de plasma AB.
7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la proporción de hPL y de plasma AB es de 80% hPL y 20% de plasma AB
8. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la proporción de hPL y de plasma AB es de 60% hPL y 40% de Plasma AB.
9. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que se obtiene por un procedimiento que comprende: a) suplementarias con plasma AB, y b) lisar las plaquetas.
10.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que se obtiene por un procedimiento que comprende: a') generar un concentrado de plaquetas frescas, b) suplementarias con plasma AB, y c) lisar las plaquetas.
1 1.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, que se obtiene por un procedimiento que comprende:
I) Obtener una mezcla de plaquetas frescas leucodeplecionadas de grupo 0,
II) 1o Congelación de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, y descongelación entre 33°C y 37°C durante 2-8 horas,
III) 2o Congelación de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, y 2o descongelación entre 33°C y 37°C, durante 2-8 horas,
IV) Centrifugación del lisado plaquetario entre 3300g y 4000 g durante 25 - 50 minutos y entre 2o - 25° C, y eliminación de restos
V) Centrifugación del lisado plaquetario entre 3300g y 4000 g durante 10 - 50 minutos y entre 2o - 25° C, preferiblemente a 3500g durante 25 min., a temperatura ambiente (20-25°C), y eliminación de restos.
VI) Conservación del lisado plaquetario entre -20°C y -80°C.
12. La composición según la reivindicación 1 1 , donde el procedimiento de obtención adicionalmente comprende una etapa Γ) (entre la etapa I y II), de centrifugación, preferiblemente a 2000g durante 20 minutos, a 22°C.
13. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde el procedimiento de obtención adicionalmente comprende una etapa (ΙΙΓ) (entre la etapa III y IV), de tercera congelación del concentrado de plaquetas a -40°C durante al menos 6 horas, y una 3a descongelación que se hace de manera progresiva entre 2°C y 10°C durante 10 - 30 horas, y preferiblemente entre 16 - 24 horas.
14. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde la congelación de los pasos (II), (III), y/o (ΙΙΓ) se realiza durante 12 horas.
15. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-14, donde la descongelación de los pasos (II) y/o (III) se realiza a 36°C durante 5 horas.
16. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-15, donde la descongelación del paso (III ') se realiza a 4°C durante 24 horas.
17. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-16, donde la centrifugación del lisado plaquetario del paso (IV) se realiza a 3500g durante 45 min, a temperatura ambiente (20-25°C)
18. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-17, donde la centrifugación del lisado plaquetario del paso (V) se realiza a 3500g durante 25 min, a temperatura ambiente (20-25°C).
19. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 1-18 donde la conservación del lisado plaquetario del paso VI) se realiza por debajo de -80°C.
20. - Una composición farmacéutica que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-19.
21.- La composición farmacéutica según la reivindicación 20, que además comprende otro principio activo.
22.- Un medio de cultivo que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, o una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20-21.
23.- Un tejido artificial que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20-21 , o un medio de cultivo según la reivindicación 22, y al menos una célula.
24. - El tejido artificial según la reivindicación 23, donde la célula se selecciona de entre células epiteliales, neuronas, fibroblastos, adipocitos, osteoblastos, hepatocitos, células básales, odontoblastos, neumocitos, miocitos, células endoteliales, células madre, o cualquiera de sus combinaciones.
25. - El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 23 - 24, donde la célula es una célula madre.
26.- El tejido artificial según la reivindicación 25, donde la célula madre es una célula madre mesenquimal.
27. - El tejido artificial según la reivindicación 25, donde la célula madre es una célula madre pluripotente inducida.
28. - El tejido artificial según cualquiera de las reivindicaciones 23 - 24, donde la célula es un fibroblasto.
29. - Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20-21 , o del medio de cultivo según la reivindicación 22, para el cultivo de células.
30. - El uso de la composición, la composición farmacéutica o del medio de cultivo según la reivindicación 29, donde las células son células madre.
31. - El uso de la composición, la composición farmacéutica o del medio de cultivo según la reivindicación 29, donde las células son fibroblastos.
32. - Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20-21 , o del medio de cultivo según la reivindicación 22, en un procedimiento de criopreservación celular.
33. - Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20-21 , o del medio de cultivo según la reivindicación 22, en un procedimiento de vitrificación celular.
34. - Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20-21 , o del medio de cultivo según la reivindicación 22, para la recuperación de las células sometidas a congelación.
35. - Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20-21 , del medio de cultivo según la reivindicación 22, o del tejido según cualquiera de las reivindicaciones 23-28, en la elaboración de un medicamento.
36. - Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20-21 , del medio de cultivo según la reivindicación 22, o del tejido según cualquiera de las reivindicaciones 23-28, como cosmético.
37. - Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-24, de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25-26, o del medio de cultivo según la reivindicación 27, o del tejido según cualquiera de las reivindicaciones 28-33, en la elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado
38. - El uso de la composición, de la composición farmacéutica, del medio de cultivo, o del tejido artificial según la reivindicación 37, donde el tejido u órgano enfermo o dañado se seleccionan de la lista que consiste en: piel, vejiga, uretra, córnea, mucosa, conjuntiva, pared abdominal, conjuntiva, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendón, hueso, meninge, vagina, o cualquiera de sus combinaciones.
39. - El uso de la composición, de la composición farmacéutica, del medio de cultivo o del tejido artificial según la reivindicación 37, donde el tejido o un órgano enfermo o dañado es la piel.
40. - El uso de la composición, de la composición farmacéutica, del medio de cultivo o del tejido artificial según la reivindicación 39, donde la piel está enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que consiste en: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación o una malformación congénita.
41.- El uso de la composición, de la composición farmacéutica, del medio de cultivo o del tejido artificial según la reivindicación 37, donde la vejiga está enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita, una vejiga neurógena, una incontinencia urinaria, una disfunción vesical, una infección o una litiasis vesical.
42. - El uso de la composición, de la composición farmacéutica, del medio de cultivo o del tejido artificial según la reivindicación 37, donde la uretra está enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita o una estenosis.
43. - El uso de la composición, de la composición farmacéutica, del medio de cultivo o del tejido artificial según la reivindicación 37, donde la córnea está enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una úlcera corneal, un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, ,un traumatismo, una causticación, una insuficiencia límibica, una queratitis atrófica, una distrofia corneal, una queratopatía primaria o secundaria, una infección, un leucoma, una queratopatía bullosa, un fallo endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.
44. - El uso de la composición, de la composición farmacéutica, del medio de cultivo o del tejido artificial según la reivindicación 37, donde la mucosa está dañada o enferma como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de la lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación, una malformación congénita, una pérdida de sustancia o una enfermedad periodontal.
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