BR112020013238A2 - composição e método para formular células do epitélio pigmentar da retina bem como uso da dita composição para tratar uma condição retiniana - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a composições de terapia com células do epitélio pigmentar da retina (EPR) prontas para administrar para o tratamento de doenças e lesões degenerativas da retina. Também é apresentado um método de formulação de células do EPR humanas para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento e de formulação de composições de terapia com células do EPR para criopreservação e administração da composição criopreservada a um indivíduo subsequente ao descongelamento. Em outro aspecto, a composição RTA pode ser formulada como uma composição de descongelamento e injeção (TAI), em que a composição é administrada por injeção subsequente ao descongelamento.

Description

“COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA FORMULAR CÉLULAS DO EPITÉLIO PIGMENTAR DA RETINA BEM COMO USO DA DITA COMPOSIÇÃO PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO RETINIANA” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001]Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/612.210 depositado em 29 de dezembro de 2017, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada de células pigmentadas derivadas de neuroepitélio que se depositam na membrana de Bruch entre os segmentos externos dos fotorreceptores (POS) e a vasculatura da coroide. À monocamada EPR é crucial para a função e a saúde dos fotorreceptores. Disfunção, lesão e perda de células do epitélio pigmentar da retina (EPR) são características proeminentes de certas doenças e distúrbios oculares, tal como degeneração macular relacionada à idade (DMRI), degenerações maculares hereditárias incluindo a doença de Best (a forma inicial de distrofia macular viteliforme), e subtipos de retinite pigmentosa (RP). O transplante de EPR (e fotorreceptores) na retina daqueles afetados por essas doenças pode ser usado como terapia de substituição celular em doenças da retina onde o EPR se degenerou.

[003]O EPR humano fetal e adulto tem sido utilizado como fonte doadora para transplante alogênico. No entanto, problemas práticos na obtenção de suprimento suficiente de tecidos e as preocupações éticas com relação ao uso de tecidos de fetos abortados limitam o uso generalizado dessas fontes doadoras. Dadas as limitações no suprimento de enxertos de EPR de adultos e fetos, o potencial de fontes doadoras alternativas foi estudado.

[0O04]As células-tronco pluripotentes humanas fornecem vantagens significativas como uma fonte de células do EPR para transplante. Seu potencial de uma fonte doadora ilimitada de células do EPR. De fato, foi demonstrado que células- tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) podem diferenciar-se em células do EPR in vitro, atenuar a degeneração da retina e preservar a função visual após o implante subrretiniano. Portanto, os nESCs podem ser uma fonte ilimitada para a produção de células do EPR para terapia celular.

[005]No entanto, a maioria dos tratamentos baseados em células é geralmente preservada congelada em uma criossolução que não é compatível com a administração direta no corpo, criando um problema prático para uso clínico. As células devem ser transplantadas poucas horas após serem descongeladas, ou podem começar a perder viabilidade e qualidade. Além disso, as células devem ser preparadas antes da administração em instalações certificadas, que podem não estar próximas de sítios clínicos, hospitais ou outras instalações de tratamento. Finalmente, a dose de tratamento de cada indivíduo deve ser liberada por um técnico qualificado, uma vez que a preparação da formulação final é considerada parte do processo de produção de terapia celular.

[0O6]A presente descrição aborda essas e outras deficiências no campo da medicina regenerativa e terapia celular de EPR.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007]EmM um aspecto, são apresentadas composições de terapia celular de epitélio pigmentar da retina (EPR) prontas para administrar (RTA) para o tratamento de doenças e lesões degenerativas da retina. Também é apresentado um método de formulação de células do EPR humanas para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento e de formulação de composições de terapia celular de EPR para criopreservação e administração da composição criopreservada a um indivíduo subsequente ao descongelamento. Em outro aspecto, a composição RTA pode ser formulada como uma composição de descongelamento e injeção (TAI),

em que a composição é administrada por injeção após o descongelamento.

[008]Em outros aspectos, são apresentados métodos para um ou mais de, retardar a progressão da doença degenerativa da retina, retardar a progressão da degeneração macular relacionada à idade (DMRI) e / ou atrofia geográfica (AG), prevenir a doença degenerativa da retina, prevenir a DMRI, prevenir a AG, restaurar o epitélio pigmentar da retina (EPR), aumentar o EPR, substituir o EPR ou tratar defeitos do EPR, em um indivíduo, administrando ao indivíduo uma composição que compreende células do EPR e um meio de criopreservação biocompatível pronto para administrar.

[009]O meio de criopreservação aqui descrito pode compreender cerca de 2% de DMSO, 5% de DMSO, entre cerca de 1% e cerca de 15% de DMSO ou entre cerca de 0,5% e cerca de 7% de DMSO, ou entre cerca de 1,5% e cerca de 6,5% de DMSO, ou entre cerca de 1,5% e cerca de 3% de DMSO, ou entre cerca de 4% e cerca de 6% de DMSO.

[010]Em alguns aspectos, o meio de criopreservação compreende: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2-etanossulfônico))), e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO)).

[011]Em outros aspectos, a doença degenerativa da retina compreende um ou mais de: disfunção do EPR, disfunção de fotorreceptores, acúmulo de lipofuscina, formação de drusas, ou inflamação.

[012]A doença degenerativa da retina pode ser selecionada a partir de pelo menos uma de retinite pigmentar, amaurose congênita de Leber, degeneração macular hereditária ou adquirida, degeneração macular relacionada à idade (DMRI), doença de Best, descolamento de retina, atrofia girata, coroideremia, distrofia padrão, distrofias de EPR, doença de Stargardt, dano no EPR e na retina causado por qualquer lesão fótica, laser, infecção, radiação, lesão neovascular ou traumática. Além disso, a DMRI pode compreender atrofia geográfica (AG).

[013]Em outro aspecto, os defeitos do EPR resultam de um ou mais de: idade avançada, tabagismo, peso corporal não saudável, baixa ingestão de antioxidantes, ou distúrbios cardiovasculares. Em ainda outro aspecto, os defeitos do EPR resultam de uma anomalia congênita.

[014]Em alguns aspectos, é descrito um método para restaurar a visão em um indivíduo em necessidade de tratamento, incluindo: administrar ao indivíduo uma composição que compreende: adenosina, dextrano-40, ácido lactobiônico, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L- glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), água, e células do epitélio pigmentar da retina (EPR).

[015]Em outros aspectos, é descrito um método para restaurar a visão em um indivíduo em necessidade de tratamento, incluindo: administrar ao indivíduo uma composição que compreende: um meio de preservação de células que compreende: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2-etanossulfônico))) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); e células do EPR.

[016]Em outros aspectos, é descrito um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento, incluindo: (a) suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio de preservação de células que compreende: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriôênico (por exemplo, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2- etanossulfônico)) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); (b) armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e (c) descongelar a suspensão de criopreservação, em que pelo menos cerca de 60% a cerca de 92% das células são viáveis após o descongelamento.

[017]Em alguns aspectos, é descrito um método de formulação de células de epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento, incluindo: (a) suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio de preservação de células que compreende: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2- etanossulfônico)) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); (b) armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e (c) descongelar a suspensão de criopreservação, em que há pelo menos cerca de 50% a cerca de 120% de rendimento de células após o descongelamento.

[018]Em alguns aspectos, havia pelo menos cerca de 65% a cerca de 70% de rendimento de células após o descongelamento; pelo menos cerca de 64% a cerca de 97% de rendimento de células após o descongelamento; pelo menos cerca de 59% a cerca de 82% de rendimento de células após o descongelamento.

[019]Em outros aspectos, é descrito um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento, incluindo: (a) suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio de preservação de células que compreende: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2- etanossulfônico)) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); (b) armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e (c) descongelar a suspensão criopreservada, em que havia pelo menos cerca de 30% a cerca de 112% de vitalidade das células cerca de vinte e quatro (24) horas após o descongelamento.

[020]Em alguns aspectos, havia pelo menos cerca de 89% a cerca de 110% de vitalidade das células cerca de vinte e quatro (24) horas após o descongelamento; havia pelo menos cerca de 76% a cerca de 112% de vitalidade das células cerca de vinte e quatro (24) horas após o descongelamento.

[021]Em outros aspectos, é descrito um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento, o método incluindo: (a) suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio de preservação de células compreendendo: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2- etanossulfônico)) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); (b) armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e (c) descongelar a suspensão criopreservada, em que havia pelo menos cerca de expansão 3 a 7 vezes de células cerca de 8 a 18 dias após o descongelamento e a cultura.

[022]Em outros aspectos, havia pelo menos uma expansão de cerca de 4,2 a cerca de 5,4 vezes de células cerca de catorze (14) dias após o descongelamento e cultura. Em ainda outros aspectos, havia pelo menos uma expansão de cerca de 4,2 a cerca de 4,9 vezes de células cerca de catorze (14) dias após o descongelamento e cultura; havia pelo menos uma expansão de cerca de 4,5 a cerca de 5,4 vezes de células cerca de catorze (14) dias após o descongelamento e cultura.

[023]Em outros aspectos, é descrito um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento, o método incluindo: (a) suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio de preservação de células compreendendo: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2- etanossulfônico)) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); (b) armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e (c) descongelar a suspensão de células criopreservada, em que as células demonstraram um ou mais dos seguintes após o descongelamento: uma função de barreira TEER de cerca de 100 OQ a cerca de 1300 O; uma razão PEDF superior para inferior de cerca de 3,5 a cerca de 9,4; uma razão VEGF inferior para superior de cerca de 1,2 a cerca de 5; ou uma pureza de cerca de 95% a cerca de 100%.

[024]Em alguns aspectos, as células tinham uma função de barreira de cerca de 107 a cerca de 402 O; ou de cerca de 241 a cerca de 715 O. Em outros aspectos, as células tinham uma razão PEDF superior para inferior de cerca de 5,1 a cerca de 9,4; ou de cerca de 3,5 a cerca de 9,4. Em outros aspectos, as células tinham uma razão VEGF inferior para superior de cerca de 1,2 a cerca de 1,7; ou de cerca de 1,2 a cerca de 1,9.

[025]Em alguns aspectos, um ou mais de nucleosídeos de purina, glucano ramificado, agente tampão, e o solvente aprótico polar são geralmente reconhecidos como seguros pela US FDA.

[026]Em outros aspectos, a preservação celular compreende ainda um ou mais de: um ácido de açúcar (por exemplo, ácido lactobiônico), uma ou mais de uma base (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio), um antioxidante (por exemplo, L-glutationa), um ou mais sal haleto (por exemplo, cloreto de potássio, cloreto de sódio, cloreto de magnésio), um sal básico (por exemplo, bicarbonato de potássio), sal fosfato (por exemplo, fosfato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio), um ou mais açúcares (por exemplo, dextrose, sacarose), álcool de açúcar (por exemplo, manitol), e água.

[027]Ainda em outros aspectos, o ácido de açúcar compreende ácido lactobiônico, ácido glicérico, ácido xilônico, ácido glucônico, ácido ascórbico, ácido neuramínico, ácido cetodeoxioctulosônico, ácido glucurônico, ácido galacturônico, ácido idurônico, ácido tartárico, ácido múcico, ou ácido sacárico.

[028]Em alguns aspectos, as uma ou mais de uma base compreendem hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio. Em alguns aspectos, o antioxidante compreende L-glutationa, ácido ascórbico, ácido lipoico, ácido úrico, um caroteno, alfa-tocoferol, ou ubiquinol. Em alguns aspectos, os um ou mais sais haleto compreendem cloreto de potássio, cloreto de sódio ou cloreto de magnésio. Em alguns aspectos, o sal básico compreende bicarbonato de potássio, bicarbonato de sódio ou acetato de sódio. Em alguns aspectos, o sal fosfato compreende fosfato de potássio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Em alguns aspectos, os um ou mais açúcares compreendem dextrose, sacarose. Em alguns aspectos, o álcool de açúcar compreende manitol, sorbitol, eritritol ou xilitol. Em alguns aspectos, os um ou mais de ácido de açúcar, base, sal haleto, sal básico, antioxidante, sal fosfato, açúcares e álcoois de açúcar são geralmente reconhecidos como seguros pela US FDA.

[029]Em outros aspectos, a composição de EPR é administrada de forma subrretiniana. Em outros aspectos, a composição de EPR é administrada usando um dispositivo de entrega. Em outros aspectos, o dispositivo de entrega compreende uma agulha, um capilar e uma ponta. Em outros aspectos, o dispositivo de entrega compreende uma agulha com um diâmetro externo de cerca de 0,63 mm e um diâmetro interno de cerca de 0,53 mm, um capilar com um diâmetro externo de cerca de 0,5 mm e um diâmetro interno de cerca de 0,25 mm, e uma ponta com um diâmetro externo de cerca de 0,12 mm e um diâmetro interno de cerca de 0,07 mm.

[030]Em certos aspectos, a porcentagem de viabilidade pós-entrega está entre 85% e 99%, a porcentagem de recuperação pós-entrega está entre 65% e 99%, a função de barreira TEER pós-entrega está entre cerca de 100 e cerca de 600 OQ, a razão PEDF apical / basal está entre cerca de 2 e cerca de 7, e a razão VEGF basal / apical pós-entrega está entre cerca de 1,5 e cerca de 3.

[031]Em alguns aspectos, a composição é administrada no espaço subrretiniano. Em alguns aspectos, a composição é injetada. Em alguns aspectos, a composição é administrada como um tratamento de dose única.

[032]Em outros aspectos, a composição não causa inflamação após ser administrada. Em ainda outros aspectos, a inflamação é caracterizada pela presença de células associadas à inflamação. Em outros aspectos, a composição de células é administrada sem vitrectomia e sem a necessidade de perfurar a retina. Em alguns aspectos, a composição de células é administrada por uma injeção supracoroidal.

[033]EmM alguns aspectos, as células secretam um ou mais dos fatores neurotróficos: fatores de crescimento de fibroblastos (DbFGF e aFGF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Em alguns aspectos, as células secretam uma ou mais citocinas anti- inflamatórias.

[034]Em outros aspectos, é descrito um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento, incluindo: (a) suspender as células do EPR em uma composição de meio compreendendo: adenosina, dextrano-40, ácido lactobiônico, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), e água; (b) armazenar a suspensão de células a uma temperatura adequada para a criopreservação; e (c) descongelar a suspensão criopreservada, em que pelo menos cerca de 60% a cerca de 95% das células são viáveis após o descongelamento.

[035]Em outros aspectos, pelo menos cerca de 40% a cerca de 100% das células são viáveis após o descongelamento; pelo menos cerca de 45% a cerca de 95% das células são viáveis após o descongelamento; pelo menos cerca de 62% a cerca de 70% das células são viáveis após o descongelamento.

[036]Em alguns aspectos, é descrito um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento, o método inclui: (a) diferenciar células-tronco em uma população de células compreendendo células do EPR; (b) colher enzimaticamente as células do EPR; (c) neutralizar a enzima com um agente neutralizante, em que o agente neutralizante não compreende soro humano; (d) suspender as células do EPR em uma composição de meio compreendendo: adenosina, dextrano-40, ácido lactobiônico, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), e água; (e) armazenar a suspensão de células a uma temperatura adequada para a criopreservação; e (f) descongelar a suspensão criopreservada, em que pelo menos cerca de 70% das células são viáveis após o descongelamento.

[037]Em alguns aspectos, as células do EPR são armazenadas no agente neutralizante por cerca de 1 a cerca de 8 horas e a viabilidade não diminui em mais de cerca de 10%. Em alguns aspectos, as células do EPR são suspensas na composição de meio por cerca de 3 horas antes da criopreservação, e a porcentagem de viabilidade pós-descongelamento não diminui em mais de 10%, a porcentagem de rendimento pós-descongelamento não diminui em mais de 20%, e a vitalidade pós- descongelamento não diminui em mais de 10% em comparação com as células do EPR suspensas no meio por menos de 1 hora.

[038]Em alguns aspectos, as células do EPR são suspensas na composição do meio por cerca de 3 horas antes da criopreservação, e a função de barreira pós- descongelamento não diminui, a razão de PEDF superior para inferior pós- descongelamento não diminui em mais de 10%, e a razão de VEGF inferior para superior pós-descongelamento não diminui em comparação com as células do EPR suspensas no meio por menos de 1 hora.

[039]Em alguns aspectos, as células do EPR são suspensas na composição do meio por cerca de 2 a 3 horas antes da criopreservação, e a porcentagem de viabilidade pós-descongelamento está entre 50 e 75, a porcentagem de rendimento pós-descongelamento está entre 50 e 95, a vitalidade pós-descongelamento está entre cerca de 80 e cerca de 120, a função de barreira pós-descongelamento é de cerca de 100 a cerca de 750 O, a razão de PEDF superior / inferior pós- descongelamento está entre cerca de 3 a 7, e a razão VEGF inferior para superior pós-descongelamento está entre cerca de 1 a 3.

[040]Em alguns aspectos, os métodos descritos compreendem ainda: filtrar sequencialmente as células do EPR após a etapa (c), em que a porcentagem de viabilidade é de pelo menos 98%. Em alguns aspectos, o método compreende ainda: filtrar sequencialmente as células do EPR após a etapa (c) e incubar as células do EPR na composição do meio por cerca de 2 a 4 horas, em que a porcentagem de recuperação está entre cerca de 80% e cerca de 95%.

[041]Em alguns aspectos, os métodos descritos compreendem ainda: filtrar sequencialmente as células do EPR após a etapa (c), incubar as células do EPR na solução de neutralização por cerca de 2 a cerca de 4 horas, e incubar as células do EPR na composição do meio por aproximadamente 2 a 4 horas, em que a porcentagem de viabilidade está entre cerca de 80% e cerca de 99%, e em que a porcentagem de recuperação está entre cerca de 70% e cerca de 95%.

[042]Em outros aspectos, os métodos descritos compreendem ainda: filtrar sequencialmente as células do EPR após a etapa (c), incubar as células do EPR na solução de neutralização por cerca de 2 a cerca de 4 horas, e incubar as células do EPR na composição do meio por aproximadamente 2 a 4 horas, em que a porcentagem de viabilidade pós-descongelamento está entre cerca de 80% e cerca de 99%, a porcentagem de recuperação pós-descongelamento está entre cerca de 70% e cerca de 95%, e a secreção de PEDF está entre cerca de 2.000 ng / ml / dia e cerca de 3.000 ng / ml / dia.

[043]Em outros aspectos, os métodos descritos compreendem ainda: incubar as células do EPR na composição do meio por cerca de 2 a 6 horas em temperatura ambiente, em que a porcentagem de viabilidade está entre cerca de 80% e cerca de 99%, e em que a porcentagem de recuperação está entre cerca de 80% e cerca de 120%.

[044]Em outros aspectos, é descrita uma composição compreendendo: (a) adenosina, dextrano-40, ácido lactobiônico, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), e água; e (b) células do EPR, em que a composição pode ser armazenada em temperaturas criotérmicas e em que a composição está pronta para administrar a um indivíduo diretamente após o descongelamento.

[045]Em outros aspectos, uma composição é descrita incluindo: (a) um meio de preservação celular compreendendo: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico))), e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO)), e (b) células do EPR.

[046]Em certas composições, os um ou mais de nucleosídeos de purina, glucano ramiíficado, agente tampão, e o solvente aprótico polar são geralmente reconhecidos como seguros pela US FDA.

[047]Em outros aspectos, as composições de células terapêuticas descritas neste documento compreendem ainda: um ou mais de: um ácido de açúcar (por exemplo, ácido lactobiônico), uma ou mais de uma base (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio), um antioxidante (por exemplo, L-glutationa), um ou mais sais haleto (por exemplo, cloreto de potássio, cloreto de sódio, cloreto de magnésio), um sal básico (por exemplo, bicarbonato de potássio), sal fosfato (por exemplo, fosfato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio), um ou mais açúcares (por exemplo, dextrose, sacarose), álcool de açúcar (por exemplo, manitol), e água.

[048]EmM outros aspectos das composições descritas, o ácido de açúcar compreende ácido lactobiônico, ácido glicérico, ácido xilônico, ácido glucônico, ácido ascórbico, ácido neuramínico, ácido cetodeoxioctulosônico, ácido glucurônico, ácido galacturônico, ácido idurônico, ácido tartárico, ácido múcico, ou ácido sacárico. Em outros aspectos das composições descritas, as uma ou mais de uma base compreendem hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio. Em outros aspectos das composições descritas, o antioxidante compreende L-glutationa, ácido ascórbico, ácido lipoico, ácido úrico, um caroteno, alfa-tocoferol, ou ubiquinol. Em outros aspectos das composições descritas, os um ou mais sais haleto compreendem cloreto de potássio, cloreto de sódio ou cloreto de magnésio. Em outros aspectos das composições descritas, o sal básico compreende bicarbonato de potássio, bicarbonato de sódio ou acetato de sódio. Em outros aspectos das composições descritas, o sal fosfato compreende fosfato de potássio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Em outros aspectos das composições descritas, os um ou mais açúcares compreendem dextrose, sacarose. Em outros aspectos das composições descritas, o álcool de açúcar compreende manitol, sorbitol, eritritol ou xilitol. Em outros aspectos das composições descritas, os um ou mais de ácido de açúcar, base, sal haleto, sal básico, antioxidante, sal fosfato, açúcares, e álcoois de açúcar são geralmente reconhecidos como seguros pela US FDA.

[049]Em outros aspectos das composições descritas, a concentração de células do EPR está entre cerca de 100.000 e cerca de 10.000.000 células / mL. Em outros aspectos das composições descritas, o número de células na dita composição está entre cerca de 100.000 e cerca de 500.000.

[050]Em outros aspectos das composições descritas, o meio de preservação de células compreende ainda um ou mais de: um ácido de açúcar (por exemplo, ácido lactobiônico), uma ou mais de uma base (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio), um antioxidante (por exemplo, L-glutationa), um ou mais sal haleto (por exemplo, cloreto de potássio, cloreto de sódio, cloreto de magnésio), um sal básico (por exemplo, bicarbonato de potássio), sal fosfato (por exemplo, fosfato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio), um ou mais açúcares (por exemplo, dextrose, sacarose), álcool de açúcar (por exemplo, manitol), e água.

[051]EmM outros aspectos das composições descritas, as composições compreendem ainda um ou mais de inibidor de ROCK ou NA.

[052]Em outros aspectos, o meio de criopreservação compreende: adenosina, dextrano-40, ácido lactobiônico, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2- etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), e água.

[053]Em algumas modalidades, o meio de criopreservação inclui cerca de 2% de DMSO. Em outras modalidades, o meio de criopreservação inclui cerca de 5% de DMSO. Em ainda outras modalidades, o meio de criopreservação inclui entre cerca de 1% e cerca de 15% de DMSO.

[054]EM outras modalidades, o meio de criopreservação inclui: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramiíficado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico))) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO)). Em ainda outras modalidades, um ou mais de nucleosídeos de purina, glucano ramiíficado, agente tampão, e solvente aprótico polar geralmente são reconhecidos como seguros pela US FDA.

[055]Em algumas modalidades, o meio de criopreservação inclui ainda um ou mais de: um ácido de açúcar (por exemplo, ácido lactobiônico), uma ou mais de uma base (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio), um antioxidante (por exemplo, L-glutationa), um ou mais sais haleto (por exemplo, cloreto de potássio, cloreto de sódio, cloreto de magnésio), um sal básico (por exemplo, bicarbonato de potássio), sal fosfato (por exemplo, fosfato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio), um ou mais açúcares (por exemplo, dextrose, sacarose), álcool de açúcar (por exemplo, manitol), e água.

[056]EM outras modalidades, um ou mais de ácidos de açúcar, base, sal haleto, sal básico, antioxidante, sal fosfato, açúcares e álcoois de açúcar são geralmente reconhecidos como seguros pela US FDA.

[057]Em certas modalidades, a doença degenerativa da retina pode ser um ou mais de: disfunção do EPR, disfunção de fotorreceptores, acúmulo de lipofuscina, formação de drusas, ou inflamação.

[058]Em outras modalidades, a doença degenerativa da retina é selecionada a partir de pelo menos uma de retinite pigmentar, amaurose congênita de Leber, degeneração macular hereditária ou adquirida, degeneração macular relacionada à idade (DMRI), doença de Best, descolamento de retina, atrofia girata, coroideremia, distrofia padrão, distrofias do EPR, doença de Stargardt, danos no EPR e na retina causados por qualquer lesão fótica, laser, infecção, radiação, lesão neovascular ou traumática. Em ainda outras modalidades, a DMR! é atrofia geográfica (AG).

[059]Em certas modalidades, os defeitos do EPR podem resultar de um ou mais de: idade avançada, tabagismo, peso corporal não saudável, baixa ingestão de antioxidantes, ou distúrbios cardiovasculares. Em outras modalidades, os defeitos do EPR podem resultar de uma anomalia congênita.

[060]Em outras modalidades, um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento inclui: suspender as células do EPR em uma composição que compreende: adenosina, dextrano-40, ácido lactobiônico, HEPES (N-(2- hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), e água, armazenar a suspensão de células a uma temperatura adequada para a criopreservação e descongelar a suspensão criopreservada, em que pelo menos cerca de 70% das células são viáveis após o descongelamento.

[061]Em outras modalidades, um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento inclui: suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio que inclui: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampãp químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico))) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e descongelar a suspensão de criopreservação, em que pelo menos cerca de 60% a cerca de 75% das células são viáveis após o descongelamento.

[062]Em outras modalidades, um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina humana (EPR) para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento inclui a adição de um ou mais de: um ácido de açúcar (por exemplo, ácido lactobiônico), uma ou mais de uma base (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio), um antioxidante (por exemplo, L-glutationa), um ou mais sais haleto (por exemplo, cloreto de potássio, cloreto de sódio, cloreto de magnésio), um sal básico (por exemplo, bicarbonato de potássio), sal de fosfato (por exemplo, fosfato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio), um ou mais açúcares (por exemplo, dextrose, sacarose), álcool de açúcar (por exemplo, manitol), e água à formulação.

[063]Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 40% a cerca de 100% das células são viáveis após o descongelamento; pelo menos cerca de 45% a cerca de 95% das células são viáveis após o descongelamento; pelo menos cerca de 62% a cerca de 70% das células são viáveis após o descongelamento.

[064]EmM algumas modalidades, um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina (EPR) humano para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento inclui: suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio, que inclui: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico))) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e descongelar a suspensão criopreservada, em que havia pelo menos um rendimento de cerca de 59% a cerca de 92% das células após o descongelamento.

[065]Em algumas modalidades, havia pelo menos cerca de 65% a cerca de 70% de rendimento de células após o descongelamento; pelo menos cerca de 64% a cerca de 92% de rendimento de células após o descongelamento; pelo menos cerca de 59% a cerca de 82% de rendimento de células após o descongelamento.

[066]EmM algumas modalidades, um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina (EPR) humano para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento inclui: suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio, que inclui: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico))) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e descongelar a suspensão criopreservada, em que havia pelo menos cerca de 76% a cerca de 112% de vitalidade das células por vinte e quatro (24) horas após o descongelamento.

[067]Em algumas modalidades, havia pelo menos cerca de 89% a cerca de 110% de vitalidade das células cerca de vinte e quatro (24) horas após o descongelamento; havia pelo menos cerca de 76% a cerca de 112% de vitalidade das células cerca de vinte e quatro (24) horas após o descongelamento.

[068]Em outras modalidades, um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina (EPR) humano para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento inclui: suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio, que inclui: um nucleosídeo de purina (por exemplo,

adenosina), um glucano ramiíficado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico))) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e descongelar a suspensão de criopreservação, em que havia pelo menos uma expansão de cerca de 4,2 a cerca de 5,4 vezes de células cerca de catorze (14) dias após o descongelamento e cultura.

[069]Em algumas modalidades, havia pelo menos uma expansão de cerca de 4,2 a cerca de 4,9 vezes de células de cerca de catorze (14) dias após o descongelamento e a cultura; havia pelo menos uma expansão de cerca de 4,5 a cerca de 5,4 vezes de células cerca de catorze (14) dias após o descongelamento e cultura. Em algumas modalidades, havia pelo menos uma expansão de cerca de 3 a cerca de 7 vezes de células cerca de 8 a 18 dias após o descongelamento e cultura. Em algumas modalidades, havia pelo menos uma expansão de cerca de 3 a cerca de vezes de células cerca de 8 dias após o descongelamento e cultura.

[070]Em algumas modalidades, um método de formulação de células do epitélio pigmentar da retina (EPR) humano para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento inclui: suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio, que inclui: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico))) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e descongelar a suspensão criopreservada, em que as células demonstraram um ou mais dos seguintes após o descongelamento: tinham uma função de barreira de cerca de 100 a cerca de 720; uma razão de PEDF superior para inferior de cerca de 3,5 a cerca de 9,4; tinham uma razão de VEGF inferior para superior de cerca de 1,2 a cerca de 2,7; tinham uma pureza de cerca de 95 a cerca de 100%; tinham uma potência de cerca de 150 a cerca de 900.

[071]Em algumas modalidades, as células tinham uma função de barreira de cerca de 107 a cerca de 402 O; ou de cerca de 241 a cerca de 7150.

[072]EmM algumas modalidades, as células tinham uma razão de PEDF superior para inferior de cerca de 5,1 a cerca de 9,4; ou de cerca de 3,5 a cerca de 9,4.

[073]Em algumas modalidades, as células tinham uma razão de VEGF inferior para superior de cerca de 1,2 a cerca de 1,7; ou de cerca de 1,2 a cerca de 1,9.

[074]EmM algumas modalidades, um método para restaurar a visão em um indivíduo em necessidade de tratamento inclui: administrar ao indivíduo uma composição incluindo: adenosina, dextrano-40, ácido lactobiônico, HEPES (N-(2- hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), água, e células do epitélio pigmentar da retina.

[075]EmM algumas modalidades, um método para restaurar a visão em um indivíduo em necessidade de tratamento inclui: administrar ao indivíduo uma composição incluindo: um meio de preservação de células que compreende: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramiíficado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico))) e um solvente aprótico polar tolerável às células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO); e células do EPR. Em algumas modalidades, o meio de preservação celular compreende ainda um ou mais de: um ácido de açúcar (por exemplo, ácido lactobiônico), uma ou mais de uma base (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio), um antioxidante (por exemplo, L-glutationa), um ou mais sais haleto (por exemplo, cloreto de potássio,

cloreto de sódio, cloreto de magnésio), um sal básico (por exemplo, bicarbonato de potássio), sal fosfato (por exemplo, fosfato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio), um ou mais açúcares (por exemplo, dextrose, sacarose), álcool de açúcar (por exemplo, manito), e água.

[076]Em algumas modalidades, a composição de células é administrada no espaço subrretiniano. Em outras modalidades, a composição de células é injetada. Em algumas modalidades, a composição de células pode ser administrada no espaço subrretiniano por via transvítrea.

[077]Em algumas modalidades, a composição de células é administrada como um tratamento de dose única. Em algumas modalidades, o tratamento de dose única compreende uma administração única compreendendo várias injeções. Em algumas modalidades, as injeções compreendem a administração de várias bolhas subrretinianas.

[078]Em algumas modalidades, a composição de células é administrada ao espaço subrretiniano sem vitrectomia e sem a necessidade de perfurar a retina. Em algumas modalidades, a composição de células é administrada por injeção supracoroidal.

[079]Em algumas modalidades, as células do EPR secretam uma variedade de fatores neurotróficos, tal como fatores de crescimento de fibroblastos (DFGF e aFGF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator derivado de epitélio pigmentar (PEDF), fator neurotrófico derivado de pigmento (PEDF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e outros, que ajudam a manter a integridade estrutural do endotélio e fotorreceptores da coriocapilar. As células do EPR também secretam citocinas anti-inflamatórias, tal como o fator de crescimento transformante (TGF)-B, importante no estabelecimento das propriedades imunes privilegiadas do olho. As células do EPR utilizadas nas composições de células terapêuticas RTA aqui descritas são capazes de secretar fatores neurotróficos.

[080]EmM algumas modalidades, a composição de células não causa inflamação após ser administrada. Em algumas modalidades, uma inflamação leve pode ser caracterizada pela presença de células associadas à inflamação.

[081]EmM algumas modalidades, uma composição inclui: (a) adenosina, dextrano-40, ácido lactobiônico, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2- etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO) e água; e (b) células do EPR, em que a composição pode ser armazenada a temperaturas criotérmicas, e em que a composição está pronta para administrar a um indivíduo diretamente após o descongelamento.

[082]Em outras modalidades, uma composição de células terapêutica pode compreender: um meio de preservação celular, incluindo: um nucleosídeo de purina (por exemplo, adenosina), um glucano ramíificado (por exemplo, dextrano-40), um agente tampão químico orgânico zwitteriônico (por exemplo, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico))) e um solvente aprótico polar tolerável por células (por exemplo, dimetil sulfóxido (DMSO)), e células do EPR.

[083]Em algumas modalidades, o meio de preservação celular compreende ainda um ou mais de: um ácido de açúcar (por exemplo, ácido lactobiônico), uma ou mais de uma base (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio), um antioxidante (por exemplo, L-glutationa), um ou mais sais haleto (por exemplo, cloreto de potássio, cloreto de sódio, cloreto de magnésio), um sal básico (por exemplo, bicarbonato de potássio), sal fosfato (por exemplo, fosfato de potássio, fosfato de sódio, fosfato de potássio), um ou mais açúcares (por exemplo, dextrose, sacarose), álcool de açúcar (por exemplo, manitol), e água.

[084]Em ainda outras modalidades, o meio de preservação celular pode compreender um ou mais inibidores de ROCK e NA.

[085JEM algumas modalidades, uma composição de células do EPR compreende adenosina, dextrano-40, ácido lactobiônico, HEPES (N- (2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), e água; e células do EPR a uma concentração de células entre cerca de 2.000.000 e cerca de 5.000.000 células / mL. A composição pode ser armazenada a temperaturas criotérmicas e a composição está pronta para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento. Nesta composição de células do EPR, o número de células pode estar entre cerca de

200.000 e cerca de 500.000. Além disso, o volume administrado ao indivíduo pode estar entre cerca de 50 ul e cerca de 100 yl.

[O86]Aspectos adicionais da tecnologia aqui descrita serão apresentados nas seguintes partes da especificação, em que a descrição detalhada tem como objetivo descrever completamente modalidades preferenciais da tecnologia sem colocar limitações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[087]A tecnologia aqui descrita será mais completamente compreendida por referência aos desenhos a seguir, que são apenas para fins ilustrativos:

[088]A Figura 1 é um gráfico que mostra a viabilidade e a vitalidade das células do epitélio pigmentar da retina (EPR) após o descongelamento. As células foram criopreservadas em meio de criopreservação com 5% de DMSO (CS5) antes do descongelamento.

[089]A Figura 2 é uma imagem histológica do olho de um animal virgem (animal não tratado) não mostrando nenhuma patologia (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[090]A Figura 3 é uma imagem histológica do olho direito (olho não tratado /

olho de controle) de um animal no grupo de controle que não mostra alterações patológicas (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[091]A Figura 4A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com BSS Plus e sacrificado no dia 1 do estudo, mostrando inflamação leve com infiltração leve da esclera (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[092]A Figura 4B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com BSS Plus e sacrificado no dia 1 do estudo, mostrando inflamação leve e alguns macrófagos e linfócitos faltando (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[093]A Figura 5A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS5 e sacrificado no dia 1 do estudo, mostrando inflamação e infiltração moderadas da esclera (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[094]A Figura 5B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS5 e sacrificado no dia 1 do estudo, mostrando inflamação moderada com alguns macrófagos e poucos neutrófilos (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[095]A Figura 6A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS2 e sacrificado no dia 1 do estudo, mostrando inflamação moderada com macrófagos e neutrófilos na córnea (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[096]A Figura 6B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS2 e sacrificado no dia 1 do estudo, mostrando inflamação moderada com macrófagos e neutrófilos (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[097]A Figura 7A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado)

obtida a partir de um animal tratado com BSS PLUS:CS?2 e sacrificado no dia 1 do estudo, mostrando forte inflamação com infiltração moderada da esclera (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[098]A Figura 7B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com BSS PLUS:CS2 e sacrificado no dia 1 do estudo, mostrando forte inflamação com fibrina mostrada no canto inferior direito próximo aos linfócitos na esclera (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[099]A Figura 8A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com BSS PLUS e sacrificado no dia 3 do estudo, mostrando inflamação moderada com infiltração moderada da esclera (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[0100]A Figura 8B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com BSS PLUS e sacrificado no dia 3 do estudo, mostrando inflamação moderada com vários macrófagos (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[0101]A Figura 9A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS5 e sacrificado no dia 3 do estudo, mostrando forte inflamação com uma reação de granulação focal (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[0102]A Figura 9B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS5 e sacrificado no dia 3 do estudo, mostrando forte inflamação com vários macrófagos e fibroblastos, demonstrando uma reação transitória de corpo estranho em estágio precoce (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[0103]A Figura 10A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS2 e sacrificado no dia 3 do estudo, mostrando forte inffamação com uma reação de granulação focal (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[0104]A Figura 10B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS2 e sacrificado no dia 3 do estudo, mostrando forte inflamação com vários macrófagos e fibroblastos, demonstrando uma reação transitória de corpo estranho em estágio precoce (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[0105]A Figura 11A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com BSS PLUS:CS2 e sacrificado no dia 3 do estudo, mostrando inflamação leve com edema leve (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[0106]A Figura 11B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com BSS PLUS:CS2 e sacrificado no dia 3 do estudo, mostrando inflamação leve e poucos macrófagos (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[0107]A Figura 12A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com BSS PLUS e sacrificado no dia 10 do estudo, mostrando inflamação leve com poucos macrófagos (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[0108]A Figura 12B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com BSS PLUS e sacrificado no dia 10 do estudo, mostrando inflamação leve com poucos macrófagos (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[0109]A Figura 13A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS5 e sacrificado no dia 10 do estudo, mostrando inflamação leve com poucos macrófagos (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[0110]A Figura 13B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado)

obtida a partir de um animal tratado com CS5 e sacrificado no dia 10 do estudo, mostrando inflamação leve com poucos macrófagos (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[0111]A Figura 14A é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS2 e sacrificado no dia 10 do estudo, mostrando inflamação leve com poucos macrófagos (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[0112]A Figura 14B é uma imagem histológica do olho esquerdo (olho tratado) obtida a partir de um animal tratado com CS2 e sacrificado no dia 10 do estudo, mostrando inflamação leve com poucos macrófagos (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[0113]A Figura 15 é uma ilustração do EPR e células adjacentes.

[0114]A Figura 16 é um gráfico da viabilidade do Grupo 2 (G2) (NUTS (-) + HSA) e do Grupo 3 (G3) (NUTS (-)) a 4º C ao longo do tempo após a filtração em comparação com o grupo de controle, G1. As composições de células filtradas foram amostradas e contadas (n = 3) em três pontos no tempo: O horas após a filtração, após 2 horas e após 4 horas.

[0115]A Figura 17A é um gráfico que mostra o efeito de O horas de incubação das composições de células terapêuticas após a filtração, seguido de O, 2, 3 e 4 horas de incubação das composições de células terapêuticas em meio de criopreservação na viabilidade celular, antes da criopreservação.

[0116]A Figura 17B é um gráfico que mostra o efeito de O horas de incubação das composições de células terapêuticas após a filtração, seguido de O, 2, 3 e 4 horas de incubação das composições de células terapêuticas em meio de criopreservação na recuperação celular, antes da criopreservação.

[0117]A Figura 18A é um gráfico que mostra o efeito de 2 horas de incubação das composições de células terapêuticas após a filtração, seguido de O, 2, 3 e 4 horas de incubação das composições de células terapêuticas em meio de criopreservação na viabilidade celular, antes da criopreservação.

[0118]A Figura 18B é um gráfico que mostra o efeito de 2 horas de incubação das composições de células terapêuticas após a filtração, seguido de O, 2, 3 e 4 horas de incubação das composições de células terapêuticas em meio de criopreservação na recuperação celular, antes da criopreservação.

[0119]A Figura 19A é um gráfico que mostra o efeito de 4 horas de incubação das composições de células terapêuticas após a filtração, seguido de 0, 2, 3 e 4 horas de incubação das composições de células terapêuticas em meio de criopreservação na viabilidade celular, antes da criopreservação.

[0120]A Figura 19B é um gráfico que mostra o efeito de 4 horas de incubação das composições de células terapêuticas após a filtração, seguido de O, 2, 3 e 4 horas de incubação das composições de células terapêuticas no meio de criopreservação na recuperação celular, antes da criopreservação.

[0121]A Figura 20A é um gráfico que mostra o efeito da incubação prolongada pré-criopreservação de composições celulares em crio-meio para 0, 2, 3 e 4 na viabilidade celular pós-descongelamento.

[0122]A Figura 20B é um gráfico que mostra o efeito da incubação prolongada pré-criopreservação de composições celulares em crio-meio para 0, 2, 3 e 4 na recuperação celular pós-descongelamento.

[0123]A Figura 21A é um gráfico que mostra o efeito de composições de células terapêuticas incubadas em solução de neutralização de enzimas pré- criopreservação, seguida de incubação em crio-meio pré-criopreservação. As células foram então criopreservadas, descongeladas e analisadas quanto à viabilidade pós- descongelamento.

[0124]A Figura 21B é um gráfico que mostra o efeito das composições de células terapêuticas incubadas em solução de neutralização de enzimas pré-

criopreservação, seguida pela incubação e crio-meio pré-criopreservação. As células foram então criopreservadas, descongeladas e analisadas quanto à recuperação pós- descongelamento.

[0125]A Figura 22 é um gráfico que mostra a porcentagem de recuperação de células terapêuticas pós-filtração e incubação por 2 horas a cerca de 2a 8º Ce em temperatura ambiente.

[0126]A Figura 23A é um gráfico que mostra a viabilidade de composições de células terapêuticas compreendendo crio-meio em diferentes condições de incubação.

[0127]A Figura 23B é um gráfico que mostra a viabilidade de composições de células terapêuticas compreendendo crio-meio em diferentes condições de incubação.

[0128]A Figura 24A é um gráfico que mostra a viabilidade das composições de células RTA descongeladas mantidas em temperatura ambiente durante um período de 4 horas. As células foram testadas nos pontos no tempo 0, 2, 4 horas.

[0129]A Figura 24B é um gráfico que mostra a recuperação de composições de células RTA descongeladas mantidas em temperatura ambiente durante um período de 4 horas. As células foram testadas nos pontos no tempo 0, 2, 4 horas.

[0130]A Figura 25A é uma imagem histológica do olho tratado obtida a partir de um animal tratado com RTA (células + CS5) e sacrificado no dia 14 do estudo, mostrando inflamação leve e alguns macrófagos e linfócitos faltando (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[0131]A Figura 25B é uma imagem histológica do olho tratado obtida a partir de um animal tratado com RTA (células + CS5) e sacrificado no dia 14 do estudo, mostrando inflamação leve e alguns macrófagos e linfócitos faltando (Corado com H8&E no campo de ampliação x20).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0132]As composições aqui descritas podem ser usadas como uma composição de células do epitélio pigmentar da retina (EPR) pronta para administrar (RTA) adequada para uso terapêutico que não requer procedimentos de preparação, tal como lavagem ou reconstituição antes da injeção ou implantação no olho de um indivíduo. Em algumas modalidades, a composição de terapia celular é preservada em uma solução criogênica não tóxica, enviada para o sítio clínico, descongelada e prontamente administrada ao olho do indivíduo pelos profissionais de saúde. Ao eliminar os procedimentos de preparação antes da administração, especialmente aqueles que devem ser executados sob condições de GLP / GMP, é possível disponibilizar amplo acesso à terapia com células do EPR, preservando a segurança e a qualidade do produto.

[0133]“Células do epitélio pigmentar da retina”, “Células do EPR”, “EPRS”, que podem ser usados de forma intercambiável conforme o contexto permite, referem-se a células de um tipo que é, por exemplo, funcional, epigeneticamente, ou por um perfil de expressão semelhante ao das células do EPR nativas que formam a camada de células do epitélio pigmentar da retina (por exemplo, após transplante, administração ou entrega dentro de um olho, elas exibem atividades funcionais semelhantes às das células do EPR nativas).

[0134]De acordo com algumas modalidades, a célula do EPR expressa pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco marcadores de células do EPR maduras. De acordo com algumas modalidades, a célula do EPR expressa entre pelo menos dois e pelo menos dez, ou pelo menos dois e pelo menos trinta marcadores de células do EPR maduras. Tais marcadores incluem, mas não estão limitados a, CRALBP, RPE65, PEDF, PMEL17, bestrofina 1 e tirosinase. Opcionalmente, a célula do EPR também pode expressar um marcador de um progenitor de EPR (por exemplo, MITF). Em outras modalidades, as células do EPR expressam PAX-6. Em outras modalidades, as células do EPR expressam pelo menos um marcador de uma célula progenitora da retina incluindo, mas não limitada a Rx, OTX2 ou SIX3. Opcionalmente, as células do EPR podem expressar SIX6 e / ou LHX2.

[0135]Como aqui utilizada, a frase “marcadores de células do EPR maduras” refere-se a antígenos (por exemplo, proteínas) que são elevados (por exemplo, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes) em células do EPR maduras em relação a células não EPR ou células do EPR imaturas.

[0136]Como aqui utilizada, a frase “marcadores de células progenitoras do EPR' refere-se a antígenos (por exemplo, proteínas) que são elevados (por exemplo, pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes) nas células progenitoras do EPR quando comparadas com células não EPR.

[0137]De acordo com outras modalidades, as células do EPR têm uma morfologia semelhante à das células do EPR nativas que formam a camada de células do epitélio pigmentar da retina. Por exemplo, as células podem ser pigmentadas e têm uma forma poligonal característica.

[0138]Ainda de acordo com outras modalidades, as células do EPR são capazes de tratar doenças tal como a degeneração macular.

[0139]De acordo com modalidades adicionais, as células do EPR cumprem pelo menos 1, 2, 3, 4 ou todos os requisitos listados aqui acima.

[0140]Como usada aqui, a frase “células-tronco” refere-se a células que são capazes de permanecer em um estado não diferenciado (por exemplo, células-tronco pluripotentes ou multipotentes) por períodos estendidos de tempo em cultura até serem induzidas a se diferenciarem em outros tipos de células tendo uma função especializada particular (por exemplo, células totalmente diferenciadas). De preferência, a frase “células-tronco” abrange células-tronco embrionárias (ESCs), células-tronco pluripotentes induzidas (IPSCs), células-tronco adultas, células-tronco mesenquimais, e células-tronco hematopoiéticas.

[0141]De acordo com algumas modalidades, as células do EPR são geradas a partir de células-tronco pluripotentes (por exemplo, ESCs ou iPSCs).

[0142]As células-tronco pluripotentes induzidas (IPSCs) podem ser geradas a partir de células somáticas por manipulação genética de células somáticas, por exemplo, por transdução retroviral de células somáticas tal como fibroblastos, hepatócitos, células epiteliais gástricas com fatores de transcrição tal como Oct-3/4, Sox2, c-Myc e KLF4 [Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1 (1): 39-49; Aoi T, e outros, Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Live rand Stomach Cells. Science. 14 de fevereiro de 2008 (Epub antes da impressão); IH Park, Zhao R, West JA, e outros, Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008; 451: 141 a 146; K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M, e outros, Induction of pluripotente stem cells from adult human fibroblastos by defined factors. Cell 2007; 131: 861 a 872]. Outras células-tronco do tipo embrionário podem ser geradas por transferência nuclear para oócitos, fusão com células-tronco embrionárias ou transferência nuclear para zigotos se as células receptoras tiverem a mitose interrompida. Além disso, os iPSCs podem ser gerados usando métodos não integrantes, por exemplo, usando pequenas moléculas ou RNA.

[0143]A frase “células-tronco embrionárias” refere-se a células embrionárias que são capazes de se diferenciar em células de todas as três camadas germinativas embrionárias (isto é, endoderma, ectoderma e mesoderma), ou de permanecer em um estado não diferenciado. A frase “células-tronco embrionárias” pode compreender células que são obtidas a partir do tecido embrionário formado após a gestação (por exemplo, blastocisto) antes da implantação do embrião (isto é, um blastocisto pré- implantação), células de blastocisto expandido (EBCs) obtidas a partir de um blastocisto no estágio pós-implantação / pré-gastrulação (ver WO 2006/040763) e células germinativas embrionárias (EG) que são obtidas a partir do tecido genital de um feto a qualquer momento durante a gestação, de preferência antes de 10 semanas de gestação. As células-tronco embrionárias de algumas modalidades da presente descrição podem ser obtidas usando métodos bem conhecidos de cultura de células. Por exemplo, células-tronco embrionárias humanas podem ser isoladas a partir de blastocistos humanos.

[0144]Os blastocistos humanos são tipicamente obtidos a partir de embriões pré-implantação humanos in vivo ou de embriões fertiizados in vitro (FIV). Alternativamente, um embrião humano de célula única pode ser expandido para o estágio de blastocisto. Para o isolamento de células ES humanas, a zona pelúcida é removida do blastocisto e a massa celular interna (ICM) é isolada por um procedimento no qual as células do trofectoderma são lisadas e removidas da ICM intacta por pipetagem suave. A ICM é então plaqueada em um frasco de cultura de tecidos contendo o meio apropriado que permite seu crescimento. Após 9 a 15 dias, o crescimento derivado da ICM é dissociado em aglomerados por dissociação mecânica ou por uma degradação enzimática e as células são então re-plaqueadas em um meio de cultura de tecido fresco. As colônias que demonstram morfologia não diferenciada são selecionadas individualmente por micropipeta, dissociadas mecanicamente em aglomerados, e re-plaqueadas. As células ES resultantes são divididas rotineiramente a cada 4 a 7 dias. Para mais detalhes sobre métodos de preparação de células ES humanas, consultar Reubinoff e outros, Nat Biotechnol 2000, maio: 18 (5): 559; Thomson e outros, [Patente U.S. No. 5.843.780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Topo. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso e outros, [Hum Reprod 4: 706, 1989]; e Gardner e outros, [Fertil. Steril. 69: 84, 1998].

[0145]Será apreciado que as células-tronco disponíveis comercialmente também podem ser usadas de acordo com algumas modalidades da presente descrição. As células ES humanas podem ser adquiridas a partir do registro de células-tronco embrionárias humanas NIH, www .grants.nih.govstem cells / ou a partir de outros registros hESC. Exemplos não limitantes de linhagens de células-tronco embrionárias disponíveis comercialmente são HAD-C 102, ESI, BGO 1, BGO02, BGO03, BGO04, CY12, CY30, CY92, CYIO, TEO03, TE32, CHB-4, CHB-5, CHB- 6, CHB-8, CHB- 9, CHB-10, CHB-11, CHB-12, HUES 1, HUES 2, HUES 3, HUES 4, HUES 5, HUES 6, HUES 7, HUES 8, HUES 9, HUES 10, HUES 11, HUES 12, HUES 13, HUES 14, HUES 15, HUES 16, HUES 17, HUES 18, HUES 19, HUES 20, HUES 21, HUES 22, HUES 23, HUES 24, HUES 25, HUES 26, HUES 27, HUES 28, CyT49, RUES3, WAO 1, UCSF4, NYUES |, NYUES2, NYUES3, NYUESA4, NYUES5, NYUES6, NYUES7, UCLA 1, UCLA 2, UCLA 3, WAO77 (H7), WAO9 (H9), WA 13 (H13), WA14 (H14), HUES 62, HUES 63, HUES 64, CT 1, CT2, CT3, CT4, MA135, Eneavour-2, WIBR 1, WIBR2, WIBR3, WIBR4, WIBR5, WIBR6, HUES 45, Shef 3, Shef 6, BJNhem119, BJNhem20, SAGO 1, SAOO1.

[0146]De acordo com algumas modalidades, a linhagem de células-tronco embrionárias é HAD-C102 ou ES.

[0147]Além disso, as células ES podem ser obtidas a partir de outras espécies, incluindo camundongos (Mills e Bradley, 2001), hamster dourado [Doetschman e outros, 1988, Dev Biol. 127: 224-7], rato [lannaccone e outros, 1994, Dev Biol. 163: 288-92], coelho [Giles e outros 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8; Graves & Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 30 36: 424-33], várias espécies de animais domésticos [Notarianni e outros, 1991, J. Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60; Wheeler 1994, Reprod. Fertil Dev. 6: 563-8; Mitalipova e outros, 2001, Cloning. 3: 59 a 67] e espécies de primatas não humanos (macaco Rhesus e sagui) [Thomson e outros, 1995, Proc Natl Acad Sci USA A. 92: 7844-8; Thomson e outros, 1996, Biol Reprod. 55: 254-9].

[0148]As células de blastocisto expandido (EBCs) podem ser obtidas a partir de um blastocisto de pelo menos nove dias após a fertilização em um estágio anterior à gastrulação. Antes de cultivar o blastocisto, a zona pelúcida é digerida [por exemplo, pela solução ácida de Tyrode (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA)], de modo a expor a massa celular interna. Os blastocistos são então cultivados como embriões inteiros por pelo menos nove dias (e preferencialmente não mais que catorze dias) após a fertilização (isto é, antes do evento de gastrulação) in vitro usando métodos padrão de cultura de células-tronco embrionárias.

[0149]Outro método para a preparação de células ES é descrito por Chung e outros, Cell Stem Cell, Volume 2, Edição 2, 113 a 117, 7 de fevereiro de 2008. Este método compreende remover uma única célula de um embrião durante um processo de fertilização in vitro. O embrião não é destruído neste processo.

[0150]As células EG (germe embrionário) podem ser preparadas a partir de células germinativas primordiais obtidas a partir de fetos com cerca de 8 a 11 semanas de gestação (no caso de um feto humano) usando técnicas de laboratório conhecidas por qualquer versado na técnica. As cristas genitais são dissociadas e cortadas em pequenas porções que são posteriormente desagregadas em células por dissociação mecânica. As células EG são então cultivadas em frascos de cultura de tecidos com o meio apropriado. As células são cultivadas com substituição diária do meio até que seja observada uma morfologia celular consistente com as células EG, tipicamente após 7 a 30 dias ou de 1 a 4 passagens. Para detalhes adicionais sobre métodos de preparação de células EG humanas, ver Shamblott e outros, [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998] e Patente U.S. No. 6.090.622 aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0151]Ainda outro método para a preparação de células ES é por partenogênese. O embrião também não é destruído no processo.

[0152]Os métodos de cultura de ES podem incluir o uso de camadas de células alimentadoras que secretam fatores necessários para a proliferação de células-tronco e, ao mesmo tempo, inibem sua diferenciação. A cultura é tipicamente realizada em uma superfície sólida, por exemplo, uma superfície revestida com gelatina ou vimentina. Camadas de alimentação exemplificativas incluem fibroblastos embrionários humanos, células epiteliais de falópio adultas, fibroblastos embrionários primários de camundongo (PMEF), fibroblastos embrionários de camundongo (MEF), fibroblastos fetais murinos (MFF), fibroblastos embrionários humanos (HEF), fibroblastos humanos obtidos a partir da diferenciação de células-tronco embrionárias humana, células musculares fetais humanas (HFM), células epiteliais fetais humanas (HFS), células da pele adulta humana, fibroblastos de prepúcio humano (HFF), fibroblastos do cordão umbilical humano, células humanas obtidas a partir do cordão umbilical ou placenta, e células-tronco da medula humana (hMSCs). Fatores de crescimento podem ser adicionados ao meio para manter as ESCs em um estado não diferenciado. Tais fatores de crescimento incluem bFGF e / ou TGF. Em outra modalidade, podem ser adicionados agentes ao meio para manter as hpESCs em um estado não diferenciado virgem; ver, por exemplo, Kalkan e outros, 2014, Phil. Trans. R. Soc. B, 369: 20130540.

[0153]Os fibroblastos do cordão umbilical humano podem ser expandidos no meio de Eagle modificado por Dulbecco (por exemplo, DMEM, SH30081.01, Hyclone) suplementado com soro humano (por exemplo, 20%) e glutamina. De preferência, as células do cordão humano são irradiadas. Isto pode ser efetuado utilizando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, célula Gamma, 220 Exel, MDS Nordion 3.500 — 7500 rads). Uma vez obtidas células suficientes, elas podem ser congeladas (por exemplo, criopreservadas). Para expansão de ESCs, os fibroblastos do cordão humano podem ser semeados em uma superfície sólida (por exemplo, frascos T75 ou T 175) opcionalmente revestidos com um substrato aderente, tal como gelatina (por exemplo, gelatina humana recombinante (RhG 100-001, Fibrogen) ou vitronectina humana ou Laminina 521 (Bio lamina) a uma concentração de cerca de 25.000 -

100.000 células / cm? em DMEM (por exemplo, SH30081.01, Hyclone) suplementada com cerca de 20% de soro humano (e glutamina). DESCs podem ser revestidos em cima das células alimentadoras 1 a 4 dias depois em um meio de suporte (por exemplo, NUTRISTEMO ou NUT(+) com albumina sérica humana). Fatores adicionais podem ser adicionados ao meio para impedir a diferenciação de ESCs tal como bFGF e TGFRB. Uma vez que uma quantidade suficiente de hESCs seja obtida, as células podem ser interrompidas mecanicamente (por exemplo, usando uma ponta estéril ou uma ferramenta descartável de células-tronco estéreis; 14602 Swemed). Por exemplo, as células podem ser expandidas mecanicamente durante a passagem semanal. Alternativamente, as células podem ser removidas por tratamento enzimático (por exemplo, collagenase A ou TrypLE Select). Este processo pode ser repetido várias vezes para atingir a concentração necessária de hESC. De acordo com algumas modalidades, após a primeira rodada de expansão, as hESCs são removidas usando o TrypLE Select e após a segunda rodada de expansão, as hESCs são removidas usando a colagenase A.

[0154]As ESCs podem ser expandidas em alimentadores antes da etapa de diferenciação. Culturas baseadas em camada alimentadora exemplificativas são descritas aqui acima. A expansão geralmente é realizada por pelo menos dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, sete dias, oito dias, nove dias ou dez dias. A expansão pode ser realizada por pelo menos 1 passagem, pelo menos 2 passagens, pelo menos 3 passagens, pelo menos 4 passagens, pelo menos 5 passagens, pelo menos 6 passagens, pelo menos 7 passagens, pelo menos 8 passagens, pelo menos 9 passagens ou pelo menos 10 passagens. Em algumas modalidades, a expansão é realizada por pelo menos 2 passagens a pelo menos 20 passagens. Em outras modalidades, a expansão é realizada por pelo menos 2 a pelo menos 40 passagens. Após a expansão, as células-tronco pluripotentes (por exemplo, ESCs) podem ser submetidas a diferenciação direcionada usando um agente de diferenciação.

[0155]Sistemas livres de células alimentadoras também podem ser usados na cultura de células ES. Tais sistemas utilizam matrizes suplementadas com reposição sérica, citocinas e fatores de crescimento (incluindo IL6 e quimera receptora solúvel de IL6) como um substituto para a camada de células alimentadoras. As células-tronco podem ser cultivadas em uma superfície sólida, tal como uma matriz extracelular (por exemplo, MATRIGELRY, laminina ou vitronectina) na presença de um meio de cultura — por exemplo, o sistema Lonza L7, MTeSR, StemPro, XFKSR, E8, NUTRISTEMO). Diferentemente das culturas baseadas em alimentadoras, que requerem o crescimento simultâneo de células alimentadoras e células-tronco e que podem resultar em populações de células mistas, as células-tronco cultivadas em sistemas sem alimentadoras são facilmente separadas da superfície. O meio de cultura utilizado para o crescimento das células-tronco contém fatores que efetivamente inibem a diferenciação e promovem seu crescimento, tal como o meio condicionado a MEF e o bFGF.

[0156]Em algumas modalidades, após a expansão, as ESCs pluripotentes são submetidas à diferenciação direcionada em uma superfície aderente (sem geração intermediária de corpos esferoides ou embrioides). Ver, por exemplo, a publicação de pedido de patente internacional No. WO 2017/072763, aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0157]Assim, de acordo com um aspecto da presente descrição, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% das células que são submetidas à diferenciação direcionada na superfície aderente são ESCs não diferenciadas e expressam marcadores de pluripotência. Por exemplo, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% das células são Oct4*TRA-I-60*. As ESCs não diferenciadas podem expressar outros marcadores de pluripotência, tal como NANOG, Rex-1, fosfatase alcalina, Sox2, TDGF-beta, SSEA-3, SSEA-4, SSEA-5, OCTA4, TRA-1-60 e / ou TRA-1-81.

[0158]Em um protocolo de diferenciação exemplificativo, as células-tronco embrionárias não diferenciadas são diferenciadas em relação à linhagem de células

EPR em uma superfície aderente usando um primeiro agente de diferenciação e depois diferenciadas ainda mais em células do EPR usando um membro da superfamília do fator de crescimento transformante-B (TGFB), (por exemplo, subtipos de TGF 1, TGF2 e TGF 3, bem como ligantes homólogos, incluindo activina (por exemplo, activina A, activina B e activina AB), hormônio antimulleriano (AMH) nodal, algumas proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), por exemplo, BMP2, BMP3, BMPA4, BMP5, BMP6 e BMP7, e fatores de crescimento e diferenciação (GDF)). De acordo com uma modalidade específica, o membro da superfamília do fator de crescimento transformante-B (TGFB) é a activina A — por exemplo, entre 20 e 200 ng / mL, por exemplo, 100 e 180 ng / mL.

[0159]De acordo com algumas modalidades, o primeiro agente de diferenciação é a nicotinamida (NA) usada em concentrações entre cerca de 1 e 100 mM, 5 e 50 MM, 5 e 20 MM e, por exemplo, 10 mM. De acordo com outras modalidades, o primeiro agente de diferenciação é 3-aminobenzmina.

[0160]NA, também conhecida como “niacinamida”, é a forma derivada de amida da Vitamina B3 (niacina) que se acredita preservar e melhorar a função das células beta. NA tem a fórmula química CSGBH6NZ20. NA é essencial para o crescimento e a conversão de alimentos em energia, e tem sido usada no tratamento da artrite e no tratamento e prevenção de diabetes.

NH va | Pá

N Nicotinamida (NA)

[0161]De acordo com algumas modalidades, a nicotinamida é um derivado de nicotinamida ou um imitador de nicotinamida. O termo “derivado de nicotinamida

(NA)”, conforme aqui utilizado, denota um composto que é um derivado quimicamente modificado de NA natural. Em uma modalidade, a modificação química pode ser uma substituição do anel piridina da estrutura básica de NA (através do membro de carbono ou nitrogênio do anel), através dos átomos de nitrogênio ou oxigênio da porção amida. Quando substituído, um ou mais átomos de hidrogênio podem ser substituídos por um substituinte e / ou um substituinte pode ser ligado a um átomo de N para formar um nitrogênio tetravalente carregado positivamente. Assim, a nicotinamida da presente invenção inclui uma nicotinamida substituída ou não substituída. Em outra modalidade, a modificação química pode ser uma deleção ou substituição de um único grupo, por exemplo, para formar um análogo tiobenzamida de NA, sendo todos apreciados pelos versados em química orgânica. O derivado no contexto da invenção também inclui o derivado nucleosídeo de NA (por exemplo, nicotinamida adenina). Uma variedade de derivados de NA é descrita, algumas também em conjunto com uma atividade inibidora da enzima PDE4 (WO 03/068233; WO 02/060875; GB2327675A) ou como inibidores do receptor tirosina quinase de VEGF (WOO 1/55114). Por exemplo, o processo de preparação de derivados de 4-aril-nicotinamida (WO 05/014549). Outros derivados de nicotinamida exemplificativos são descritos em WOO 1/55114 e EP2128244.

[0162]Os imitadores de nicotinamida incluem formas modificadas de nicotinamida, e análogos químicos de nicotinamida que recapitulam os efeitos da nicotinamida na diferenciação e maturação de células do EPR a partir de células pluripotentes. Os imitadores de nicotinamida exemplificativos incluem ácido benzoico, ácido 3-aminobenzoico, e 6-aminonicotinamida. Outra classe de compostos que podem atuar como imitadores de nicotinamida são inibidores de poli(ADP-ribose) polimerase (PARR). Os inibidores de PARP exemplificativos incluem 3- aminobenzamida, Iniparib (BSI 201), Olaparib (AZD-2281), Rucaparib (AG014699, PF-01367338), Veliparib (ABT-888), CEP 9722, MK 4827 e BMN- 673.

[0163]Agentes de diferenciação considerados adicionais incluem, por exemplo, noggin, antagonistas de Wnt (DKkKk1 ou IWR1e), antagonistas nodais (Lefty- A), ácido retinoico, taurina, inibidor de GSK3b (CHIR99021) e inibidor de ntch (DAFT).

[0164]De acordo com certas modalidades, a diferenciação é realizada como segue: (a) cultura de ESCs em um meio compreendendo um primeiro agente de diferenciação (por exemplo, nicotinamida); e (b) cultura de células obtidas a partir da etapa a) em um meio compreendendo um membro da superfamília de TGFB (por exemplo, activina A) e o primeiro agente de diferenciação (por exemplo, nicotinamida). A etapa (a) pode ser realizada na ausência do membro da superfamília de TGFB (por exemplo, activina A).

[0165]EmM algumas modalidades, o meio na etapa (a) é completamente desprovido de um membro da superfamília de TGFB. Em outras modalidades, o nível de membro da superfamília de TGFB no meio é inferior a 20 ng / mL, 10 ng / mL, 1 ng / mL ou mesmo inferior a 0,1 ng / mL.

[0166]O protocolo descrito acima pode ser continuado cultivando as células obtidas na etapa (b) em um meio compreendendo o primeiro agente de diferenciação (por exemplo, nicotinamida), mas desprovido de um membro da superfamília de TGFB (por exemplo, activina A). Esta etapa é aqui chamada de etapa (b*).

[0167]O protocolo descrito acima é agora descrito em mais detalhes, com modalidades adicionais.

[0168]Etapa (a): O processo de diferenciação é iniciado uma vez que quantidades suficientes de ESCs são obtidas. Elas são normalmente removidas da cultura de células (por exemplo, usando colagenase A, dispase, TrypLE select, EDTA) e plaqueadas em um substrato não aderente (por exemplo, placa de cultura de células, tal como Hydrocell ou uma placa de cultura revestida com agarose, ou placas de petri bacteriológicas) na presença de nicotinamida (e na ausência de activina A). Concentrações exemplificativas de nicotinamida estão entre 0,01 e 100 MM, 0,1 e 100

MM, 0,1 e 50 MM, 5 e 50 MM, 5 e 20 MM e 10 MM. Uma vez que as células são plaqueadas no substrato não aderente (por exemplo, placa de cultura celular), a cultura celular pode ser chamada de uma suspensão de células, de preferência aglomerados flutuantes livres em uma cultura de suspensão, ou seja, agregados de células derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs). Os aglomerados de células não aderem a nenhum substrato (por exemplo, placa de cultura, carreador). As fontes de células-tronco flutuantes livres foram previamente descritas no documento WO 06/070370, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Este estágio pode ser realizado por um período mínimo de 1 dia, mais preferencialmente dois dias, três dias, 1 semana ou até 14 dias. Preferencialmente, as células não são cultivadas durante mais de 3 semanas em suspensão juntamente com a nicotinamida, por exemplo, entre 0,01 e 100 mM, 0,1 e 100 MM, 0,1 e 50 mM, e 50 MM, 5 e 20 MM, por exemplo, 10 mM (e na ausência de activina A). Em uma modalidade, as células são cultivadas por 6 a 8 dias em suspensão juntamente com a nicotinamida, por exemplo, entre 0,01 e 100 mM, 0,1 e 100 mM, 0,1 e SOmMM, 5 e 50 mM, 5 e 20 MM, por exemplo, 10 mM (e na ausência de activina A).

[0169]De acordo com algumas modalidades, quando as células são cultivadas no substrato não aderente, por exemplo, placas de cultura de células, as condições de oxigênio atmosférico são de 20%. No entanto, a manipulação das condições de oxigênio atmosférico também é considerada de modo que a porcentagem de oxigênio atmosférico seja inferior a cerca de 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou até inferior a cerca de 5% (por exemplo, entre 1% e 20%, 1% e 10% ou O e 5%). De acordo com outras modalidades, as células são cultivadas no substrato não aderente inicialmente sob condições normais de oxigênio atmosférico e depois abaixadas para condições de oxigênio atmosférico abaixo do normal. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob níveis mais baixos de oxigênio durante a diferenciação precoce e, em seguida, sob níveis mais altos de oxigênio durante a diferenciação tardia.

[0170]Exemplos de placas de cultura de células não aderentes incluem aquelas fabricadas por Nunc (por exemplo, Hydrocell Cat No. 174912), etc.

[0171]Os agrupamentos podem compreender pelo menos 50 a 500.000, 50 a

100.000, 50 a 50.000, 50 a 10.000, 50 a 5000, 50 a 1000 células. De acordo com uma modalidade, as células nos aglomerados não são organizadas em camadas e formam formas irregulares. Em uma modalidade, os aglomerados são desprovidos de células- tronco embrionárias pluripotentes. Em outra modalidade, os aglomerados compreendem pequenas quantidades de células-tronco embrionárias pluripotentes (por exemplo, não mais do que 5% ou mais do que 3% (por exemplo, 0,01 a 2,7%) células que coexpressam OCT4 e TRA-1-60 no nível de proteína). Tipicamente, os aglomerados compreendem células que foram parcialmente diferenciadas sob a influência de nicotinamida. Tais células expressam principalmente marcadores precursores neurais e da retina, tal como PAX6, Rax, Six3 e / ou CHX10.

[0172]Os aglomerados podem ser dissociados usando métodos enzimáticos ou não enzimáticos (por exemplo, mecânicos) conhecidos na técnica. De acordo com algumas modalidades, as células são dissociadas de modo que não estão mais em aglomerados — por exemplo, agregados ou blocos de 2 a 100.000 células, 2 a 50.000 células, 2 a 10.000 células, 2 a 5000 células, 2 a 1000 células, 2 a 500 células, 2 a 100 células, 2 a 50 células. De acordo com uma modalidade particular, as células estão em uma suspensão de única célula.

[0173]As células (por exemplo, células dissociadas) podem então ser plaqueadas em um substrato aderente e cultivadas na presença de nicotinamida, por exemplo, entre 0,01 e 100 mM, 0,1 e 100 MM, 0,1 e 50 MM, 5 e 50 MM, 5 e 20 MM, por exemplo, 10 mM (e a ausência de activina A). Este estágio pode ser realizado por um período mínimo de 1 dia, mais preferencialmente dois dias, três dias, 1 semana ou até 14 dias. De preferência, as células não são cultivadas por mais de 3 semanas na presença de nicotinamida (e na ausência de activina)). Em uma modalidade exemplificativa, este estágio é realizado por 6 a 7 dias.

[0174]De acordo com outras modalidades, quando as células são cultivadas no substrato aderente, por exemplo, laminina, as condições de oxigênio atmosférico são de 20%. Elas podem ser manipuladas de modo que a porcentagem seja menor do que cerca de 20%, 15%, 10%, mais preferencialmente menor do que cerca de 9%, menor do que cerca de 8%, menor do que cerca de 7%, menor do que cerca de 6% e mais preferencialmente cerca de 5% (por exemplo, entre 1% e 20%, 1% e 10% ou O e 5%).

[0175]De acordo com algumas modalidades, as células são cultivadas no substrato aderente inicialmente sob condições normais de oxigênio atmosférico e subsequentemente o oxigênio é reduzido para menos do que as condições normais de oxigênio atmosférico. De acordo com outras modalidades, as células são cultivadas no substrato aderente inicialmente sob condições de oxigênio atmosférico abaixo do normal e subsequentemente o oxigênio é elevado para condições de oxigênio atmosférico normal.

[0176]Exemplos de substratos aderentes ou uma mistura de substâncias podem incluir, mas não estão limitados a, fibronectina, laminina, poliD-lisina, colágeno e gelatina.

[0177]Etapa (b): Após o primeiro estágio da diferenciação direcionada, (etapa a; isto é, cultura na presença de nicotinamida (por exemplo, entre 0,01 e 100 mM, 0,1 e 100 mM, 0,1 e 50 MM, 5 e 50 MM, 5 e 20 mM, por exemplo, 10 mM), as células parcialmente diferenciadas são então submetidas a um estágio adicional de diferenciação em um substrato aderente — cultivando na presença de activina A (por exemplo, 0,01 a 1000 ng / mL, 0,1 a 200 ng / mL, 1 a 200 ng / mL, por exemplo, 140 ng / mL, 150 ng / mL, 160 ng / mL ou 180 ng / mL). Assim, a activina A pode ser adicionada a uma molaridade final de 0,1 pM a 10 nM, 10 pM a 10 nM, 0,1 nM a 10 NM, 1 NM a 10 NM, por exemplo 5,4 nM.

[0178]A nicotinamida também pode ser adicionada neste estágio (por exemplo, entre 0,01 e 100 mM, 0,1 e 100 mM, 0,1 e 50 mM, 5e 50 mM, 5 e 20 mM, por exemplo, 10 mM). Esse estágio pode ser realizado por 1 dia a 10 semanas, 3 dias a 10 semanas, 1 semana a 10 semanas, uma semana a oito semanas, uma semana a quatro semanas, por exemplo, pelo menos um dia, pelo menos dois dias, em pelo menos três dias, pelo menos 5 dias, pelo menos uma semana, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos quatro semanas, pelo menos cinco semanas, pelo menos seis semanas, em pelo menos sete semanas, pelo menos oito semanas, pelo menos nove semanas, pelo menos dez semanas.

[0179]De acordo com algumas modalidades, esse estágio é realizado por cerca de oito dias a cerca de duas semanas. Esse estágio de diferenciação pode ser efetuado em condições baixas ou normais de oxigênio atmosférico, conforme detalhado acima.

[0180]Etapa (b*): Após o segundo estágio da diferenciação direcionada (ou seja, cultura na presença de nicotinamida e activina A em um substrato aderente; etapa (b), as células diferenciadas adicionais são opcionalmente submetidas a um estágio subsequente de diferenciação no substrato aderente — cultura na presença de nicotinamida (por exemplo, entre 0,01 e 100 mM, 0,1 e 100 mM, 0,1 e 50 MM, 5 e 50 MM, 5 e 20 MM, por exemplo, 10 mM), na ausência de activina A. Esse estágio pode ser realizado por pelo menos um dia, 2, dias, 5 dias, pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas ou até quatro semanas. Este estágio de diferenciação também pode ser realizado em níveis baixos ou condições normais de oxigênio atmosférico, conforme detalhado acima.

[0181]O meio básico no qual as ESCs são diferenciadas é qualquer meio de cultura celular conhecido na técnica para suportar o crescimento de células in vitro, tipicamente, um meio compreendendo uma solução base definida, que inclui sais,

açúcares, aminoácidos e quaisquer outros nutrientes necessários para a manutenção das células na cultura em um estado viável. De acordo com uma modalidade específica, o meio básico não é um meio condicionado. Exemplos não limitantes de meios básicos disponíveis comercialmente que podem ser utilizados de acordo com a invenção compreendem NUTRISTEMO (sem bFGF e TGF para diferenciação de ESC, com bFGF e TGF para expansão de ESC), NEUROBASAL'", KO-DMEM, DMEM, DMEM / F12, meio de crescimento de células-tronco CELLGROTY, ou X-VIVOTY. O meio básico pode ser suplementado com uma variedade de agentes, como conhecido na técnica, que trata de culturas de células. A seguir, é apresentada uma referência não limitante a vários suplementos que podem ser incluídos na cultura a serem utilizados de acordo com a presente descrição: soro ou um meio contendo substituição de soro, tal como, sem estar limitado a esse, substituição de soro nocaute (KOSR), NUTRIDOMA-CS, TCHTY, N2, derivado de N2, ou B27 ou uma combinação; um componente de matriz extracelular (ECM), tal como, sem estar limitado a esse, fibronectina, laminina, colágeno e gelatina. O ECM pode então ser usado para transportar um ou mais membros da superfamília de fatores de crescimento TGFB; um agente antibacteriano, tal como, sem estar limitado a esse, penicilina e estreptomicina; e aminoácidos não essenciais (NEAA), neurotrofinas que são conhecidas por desempenhar um papel na promoção da sobrevida de SCs em cultura, como, sem se limitar a esses, BDNF, NT3, NTA4.

[0182]De acordo com algumas modalidades, o meio usado para diferenciar as ESCs é o meio NUTRISTEMO (Biological Industries, 06-5102-01- IA).

[0183]De acordo com algumas modalidades, a diferenciação e expansão de ESCs são realizadas sob condições livres de xeno.

[0184]De acordo com outras modalidades, o meio de proliferação / crescimento é desprovido de contaminantes xeno, isto é, isento de componentes derivados de animais, tal como soro, fatores de crescimento derivados de animais e albumina. Assim, de acordo com essas modalidades, a cultura é realizada na ausência de contaminantes xeno.

[0185]Outros métodos para cultivar ESCs em condições livres de xeno são fornecidos no Pedido de Patente U.S. No. 20130196369, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0186]As preparações compreendendo células do EPR podem ser preparadas de acordo com Boas Práticas de Fabricação (GMP) (por exemplo, as preparações são compatíveis com GMP) e / ou Boas Práticas em Tecidos (GTP) atuais (por exemplo, as preparações podem ser compatíveis com GTP).

[0187]Durante as etapas de diferenciação, as células-tronco embrionárias podem ser monitoradas quanto ao seu estado de diferenciação. A diferenciação celular pode ser determinada após o exame de marcadores célula-específicos ou tecido-específicos que são conhecidos por serem indicativos de diferenciação.

[0188]Os marcadores célula-específicos ou tecido-específicos podem ser detectados usando técnicas imunológicas bem conhecidas [Thomson JA e outros, (1998). Science 282: 1145-7]. Os exemplos incluem, entre outros, citometria de fluxo para marcadores intracelulares ou ligados à membrana, imuno-histoquímica para marcadores extracelulares e intracelulares, e imunoensaio enzimático para marcadores moleculares secretados.

[0189]Após os estágios de diferenciação aqui descritos acima, uma população de células mista pode ser obtida compreendendo células pigmentadas e não pigmentadas. De acordo com este aspecto, as células da população de células mista são removidas da placa. Em algumas modalidades, isso é realizado enzimaticamente (por exemplo, usando tripsina, (TrypLE Select); ver, por exemplo, a publicação de pedido de patente internacional No. WO 2017/021973, incorporada aqui por referência em sua totalidade). De acordo com este aspecto da presente invenção, pelo menos 10%, 20%, 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos

70% das células que são removidas da cultura (e posteriormente expandidas) são células não pigmentadas. Em outras modalidades, isso é realizado mecanicamente — por exemplo, usando um raspador de células. Em ainda outras modalidades, isso é realizado quimicamente (por exemplo, EDTA). Também são consideradas combinações de tratamento enzimático e químico. Por exemplo, EDTA e tratamentos enzimáticos podem ser usados. Além disso, pelo menos 10%, 20% ou mesmo 30% das células que são removidas da cultura (e subsequentemente expandidas) são células pigmentadas.

[0190]De acordo com este aspecto da presente descrição, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% de todas as células na cultura são removidas (e subsequentemente expandidas).

[0191]A expansão da população de células mista pode ser efetuada em uma matriz extracelular, por exemplo, gelatina, colágeno |, colágeno IV, laminina (por exemplo, laminina 521), fibronectina e poli-D-lisina. Para expansão, as células podem ser cultivadas em KOM livre de soro, meio compreendendo soro (por exemplo, DMEM com soro humano a 20%) ou meio NUTRISTEMO (06- 5102-01- IA, Biological Industries), Sob estas condições de cultura, após passagem sob condições adequadas, a relação de células pigmentadas para células não pigmentadas aumenta de tal modo que uma população de células do EPR purificadas é obtida. Tais células mostram a morfologia de forma poligonal e a pigmentação características das células do EPR.

[0192]EM uma modalidade, a expansão é efetuada na presença de nicotinamida (por exemplo, entre 0,01 e 100 mM, 0,1 e 100 mM, 0,1 e 50 MM, 5 e 50 MM, 5 e 20 mM, por exemplo, 10 mM) e na ausência de activina A.

[0193]A população de células mista pode ser expandida em suspensão (com ou sem um microcarreador) ou em uma monocamada. A expansão da população de células mista em culturas de monocamada ou em suspensão pode ser modificada para expansão em larga escala em biorreatores ou multi / hiper módulos por métodos bem conhecidos dos versados na técnica.

[0194]De acordo com algumas modalidades, a fase de expansão é efetuada por pelo menos 20 semanas, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo menos 4 semanas, pelo menos 5 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 7 semanas, pelo menos 8 semanas, pelo menos 9 semanas ou até 10 semanas. De preferência, a fase de expansão é efetuada por 1 semana a 10 semanas, mais preferencialmente 2 semanas a 10 semanas, mais preferencialmente, 3 semanas a semanas, mais preferencialmente 4 semanas a 10 semanas ou 4 semanas a 8 semanas.

[0195]De acordo com ainda outras modalidades, a população de células mista é passada pelo menos 1 vez durante a fase de expansão, pelo menos duas vezes durante a fase de expansão, pelo menos três vezes durante a fase de expansão, pelo menos quatro vezes durante a fase de expansão, pelo menos cinco vezes durante a fase de expansão, ou pelo menos seis vezes durante a fase de expansão.

[0196]Os presentes inventores mostraram que quando as células são coletadas enzimaticamente, é possível continuar a expansão por mais de 8 passagens, mais de 9 passagens e até mais de 10 passagens (por exemplo, 11 a 15 passagens). O número total de duplicação de células pode ser aumentado para mais de 30, por exemplo, 31, 32, 33, 34 ou mais. (Consultar a publicação de pedido de patente internacional No. WO 2017/021973, incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[0197]A população de células do EPR geradas de acordo com os métodos aqui descritos pode ser caracterizada de acordo com vários parâmetros diferentes. Assim, por exemplo, as células do EPR obtidas podem ter uma forma poligonal e podem ser pigmentadas.

[0198]Será apreciado que as populações celulares aqui descritas são geralmente desprovidas de células-tronco embrionárias humanas não diferenciadas. De acordo com algumas modalidades, menos de 1:250.000 células são células Oct4*TRA-1-60*, conforme medido por exemplo por FACS. As células também podem ter expressão reprimida (em mais de 5.000 vezes) de GDF3 ou TDGF, conforme medido por PCR. As células do EPR desse aspecto não expressam marcadores de células-tronco embrionárias. Os um ou mais ditos marcadores de células-tronco embrionárias podem compreender OCT-4, NANOG, Rex-1, fosfatase alcalina, Sox2, TDGF-beta, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 e / ou TRA-1- 81.

[0199]As preparações de células do EPR terapêuticas podem ser substancialmente purificadas, em relação às células não-EPR, compreendendo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de células do EPR. A preparação de células do EPR terapêuticas pode estar essencialmente livre de células não-EPR ou consistir de células do EPR. Por exemplo, a preparação substancialmente purificada de células do EPR pode compreender menos de cerca de 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de tipo de célula não-EPR. Por exemplo, a preparação de células do EPR pode compreender menos de cerca de 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%, 0,005%, 0,004%, 0,003%, 0,002%, 0,001%, 0,0009%, 0,0008%, 0,0007%, 0,0006%, 0,0005%, 0,0004%, 0,0003%, 0,0002% ou 0,0001% de células não-EPR.

[0200]As preparações de células do EPR podem ser substancialmente puras, tanto em relação às células não-EPR quanto em relação às células do EPR de outros níveis de maturidade. As preparações podem ser substancialmente purificadas, com relação a células não-EPR, e enriquecidas para células do EPR maduras. Por exemplo, em preparações de células do EPR enriquecidas para células do EPR maduras, pelo menos cerca de 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% das células do EPR são células do EPR maduras. As preparações podem ser substancialmente purificadas, com relação a células não-EPR, e enriquecidas para células do EPR diferenciadas, em vez de células do EPR maduras. Por exemplo, pelo menos cerca de 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% das células do EPR podem ser células do EPR diferenciadas em vez de células do EPR maduras.

[0201]As preparações aqui descritas podem estar substancialmente livres de contaminação ou infecção bacteriana, viral ou fúngica, incluindo, entre outras, a presença de HIV 1, HIV 2, HBV, HCV, HAV, CMV, HTLV 1, HTLV 2, parvovírus B19, Vírus Epstein-Barr ou herpesvírus 1 e 2, SV40, HHV5, 6, 7, 8, CMV, polioma vírus, HPV, Enterovírus. As preparações aqui descritas podem estar substancialmente livres de contaminação ou infecção por micoplasma.

[0202] Outra maneira de caracterizar as populações de células aqui descritas é pela expressão do marcador. Assim, por exemplo, pelo menos 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% das células podem expressar Bestrophin 1, conforme medido por imunocoloração. De acordo com uma modalidade, entre 80 e 100% das células expressam bestrofina 1.

[0203]De acordo com outras modalidades, pelo menos 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% ou 100% das células expressam o fator de transcrição associado à Microftalmia (MITF), conforme medido por imunocoloração. Por exemplo, entre 80 e 100% das células expressam MITF.

[0204]De acordo com outras modalidades, pelo menos 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% ou 100% das células expressam o fator de transcrição associado à Microftamia (MITF) e bestrofina 1, medida por imunocoloração. Por exemplo, entre 80 e 100% das células coexpressam MITF e bestrofina 1.

[0205]De acordo com outras modalidades, pelo menos 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% ou 100% das células expressam o fator de transcrição associado à Microftalmia (MITF) e o Z0-1, conforme medido por imunocoloração. Por exemplo, entre 80 e 100% das células coexpressam MITF e Z0-1.

[0206]De acordo com outras modalidades, pelo menos 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% ou 100% das células expressam Z0-1 e bestrofina 1, como medido por imunocoloração. Por exemplo, entre 80 e 100% das células coexpressam Z0-1 e bestrofina 1.

[0207]De acordo com outra modalidade, pelo menos 50%, 60% 70% 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% ou 100% das células expressam o gene 6 da caixa pareada (PAX-6) conforme medido por imunocoloração ou FACS.

[0208]De acordo com outra modalidade, pelo menos 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% ou 100% das células expressam a proteína de ligação ao retinaldeído celular (CRALBP), como medido por imunocoloração. Por exemplo, entre 85 e 100% das células expressam CRALBP.

[0209]De acordo com outra modalidade, pelo menos 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% ou 100% das células expressam o antígeno específico de linhagem de melanócitos celulares GP100 (PMEL17), conforme medido por imunocoloração. Por exemplo, entre 85 e 100% das células expressam PMEL 17.

[0210]As células do EPR tipicamente coexpressam marcadores indicativos de diferenciação terminal, por exemplo, bestrofina 1, CRALBP e / ou EPR65. Além disso, as células do EPR aqui descritas podem expressar marcadores para cílios primários de EPR, tal como ARL13B e GT335.

[0211]Após a fase de expansão, as populações de células compreendendo células do EPR são obtidas, onde pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 16%, 77%, T8%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,

92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mesmo 100% são CRALBP + PMEL1 T+.

[0212]Em certas modalidades, as composições de células do EPR podem ser produzidas de acordo com os seguintes métodos: (1) cultivar nESCs em huCFs em placas de poço central (CW) por 2 semanas em NUT+ com albumina sérica humana (HSA), (2) passagem mecânica para expandir as DESCs em huCFs em placas CW por entre quatro e cinco semanas (ou até a quantidade desejada de células) em NUT+ com HSA, (3) continuar a expandir colônias hESC (usando, por exemplo, colagenase) em hUCFs em placas de 6 cm por mais uma semana em NUT+ com HSA, (4) preparar corpos esferoides (SB) transferindo colônias de cerca de cinco placas de 6 cm para 1 HydroCell por cerca de uma semana em NUT- com nicotinamida (NIC), (5) o achatamento de SBs em Lam511 pode ser realizado transferindo-se os SBs para 2 a 3 poços de uma placa de 6 poços por cerca de uma semana em NUT- com NIC, (6) cultivar células aderentes em Lam511 em NUT- com NIC e Activina por cerca de uma a duas semanas e substituir meios com NUT- por NIC e cultivar por uma a três semanas, (7) enriquecer as células pigmentadas usando enzimas, tal como TrypLE Select, por exemplo, (8) expandir as células do EPR em gelatina em frascos por cerca de duas a nove semanas (substituindo o meio) em soro humano a 20% e NUT-, e (9) colher as células do EPR.

[0213]A colheita da população expandida de células do EPR pode ser realizada usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, usando uma enzima tal como tripsina ou quimicamente usando EDTA, etc.). Em algumas modalidades, as células do EPR podem ser lavadas usando uma solução apropriada, tal como PBS ou BSS plus. Em algumas modalidades, uma solução de neutralização de enzima pode ser usada após a colheita ou enriquecimento para células do EPR. A solução de neutralização pode compreender, por exemplo, meio com ou sem soro humano ou albumina sérica humana. Em algumas modalidades, a incubação prolongada em solução de neutralização de enzima com ou sem HS ou HAS não tem efeito na viabilidade celular ou na recuperação celular.

[0214]Em outras modalidades, as células do EPR podem ser filtradas antes da formulação das células do EPR para criopreservação e administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento. Em algumas modalidades, a porcentagem de viabilidade de células pós-filtradas é de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a porcentagem de viabilidade de células pós-filtradas armazenadas em uma solução de neutralização por cerca de O a cerca de 8 horas é de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0215]Após a colheita, a população expandida de células do EPR pode ser formulada em uma dose terapêutica específica (por exemplo, número de células) e criopreservada para envio à clínica. A composição de terapia celular EPR pronta para administrar (RTA) pode então ser administrada diretamente após o descongelamento sem processamento adicional. Exemplos de meios adequados para a criopreservação incluem, entre outros, soro humano a 90% / DMSO a 10%, meio 3 a 10% (CS10), meio 2 a 5% (CS5), e meio 1 a 2% (CS2), Stem Cell Banker, PRIME XVO FREEZIS, HYPOTHERMASOLO, CSB, Trealose, etc.

[0216]EmM algumas modalidades, a porcentagem de viabilidade de células pós-filtradas armazenadas em um meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas é de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em outras modalidades, a porcentagem de recuperação de células pós-filtradas armazenadas em um meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas é de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0217]Em outras modalidades, a porcentagem de viabilidade de células pós-

filtradas armazenadas em um meio de neutralização por cerca de O a cerca de 8 horas, seguida pelo armazenamento em meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas é de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em outras modalidades, a porcentagem de recuperação de células pós-filtradas armazenadas em um meio de neutralização por cerca de O a cerca de 8 horas, seguida pelo armazenamento em meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas é de pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0218]Em ainda outras modalidades, a porcentagem de viabilidade de células pós-filtradas armazenadas em um meio de neutralização por cerca de O a cerca de 8 horas, seguida de armazenamento em meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas, após o descongelamento da composição criopreservada, é de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em ainda outras modalidades, a porcentagem de recuperação de células pós- filtradas armazenadas em um meio de neutralização por cerca de O a cerca de 8 horas, seguida de armazenamento em meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas, após o descongelamento da composição criopreservada, é pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0219]EM algumas modalidades, as células do EPR pós-fitradas armazenadas em um meio de neutralização por cerca de O a cerca de 8 horas, seguidas de armazenamento em meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas, pós-descongelamento da composição criopreservada é capaz de secretar PEDF entre cerca de 1.500 ng / mL / dia e cerca de 4.500 ng / mL / dia, cerca de 2.000 ng / mL / dia e cerca de 3.000 ng / mL / dia. Em outras modalidades, as células do EPR pós-filtradas armazenadas em um meio de neutralização por cerca de O a cerca de 8 horas, seguidas de armazenamento em meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas, pós-descongelamento da composição criopreservada são capazes de ser expandidas pelo menos entre cerca de 1,2 x 10º e 5 x 106, ou cerca de 2,5 x 108º a cerca de 4 x 10º células em 14 dias.

[0220]Em algumas modalidades, a porcentagem de viabilidade de células do EPR pós-filtradas armazenadas em um meio de neutralização por cerca de O a cerca de 8 horas em temperatura ambiente é de pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a porcentagem de viabilidade de células do EPR pós-filtradas armazenadas em um meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas em temperatura ambiente é de pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em outras modalidades, a porcentagem de viabilidade de células pós-filtradas armazenadas em uma solução de neutralização em temperatura ambiente por cerca de O a cerca de 8 horas, seguida de armazenamento em meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas em temperatura ambiente é de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em ainda outras modalidades, a porcentagem de recuperação de células pós-filtradas armazenadas em uma solução de neutralização em temperatura ambiente por cerca de O a cerca de 8 horas, seguida de armazenamento em meio de criopreservação por cerca de O a cerca de 8 horas em temperatura ambiente é de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 140%, 150%.

[0221]As células do EPR formuladas em meio de criopreservação apropriado para aplicações pós-descongelamento prontas para administração (RTA) podem compreender células do EPR suspensas em adenosina, dextrano40, ácido lactobiônico, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO), e água. Um exemplo desse meio de criopreservação está disponível comercialmente sob o nome comercial CRYOSTOROGO e é fabricado por BioLife Solutions, Inc.

[0222]O DMSO pode ser usado como um agente crioprotetor para impedir a formação de cristais de gelo, que podem matar as células durante o processo de criopreservação. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células de EPR criopreserváveis compreende entre cerca de 0,1% e cerca de 2% de DMSO (em volume). Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende entre cerca de 1% e cerca de 20% de DMSO. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende cerca de 2% de DMSO. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende cerca de 5% de DMSO.

[0223]Em algumas modalidades, a terapia com células do EPR formuladas em meios de criopreservação apropriados para aplicações pós-descongelamento prontas para administrar (RTA) pode compreender células do EPR suspensas em meios de criopreservação que não contêm DMSO. Por exemplo, as composições de células terapêuticas do EPR RTA podem compreender células do EPR suspensas em Trolox, Nat, K+, Ca2+, Mg2+, c1-, H2PO4-, HEPES, lactobionato, sacarose, manitol, glicose, dextrano-40, adenosina, glutationa sem DMSO (dimetil sulfóxido, (CH3)2SO) ou quaisquer outros solventes apróticos dipolares. Um exemplo deste meio de criopreservação está disponível comercialmente sob o nome comercial HYPOTHERMOSOLO ou HYPOTHERMOSOLOE-FRS e também é fabricado por BioLife Solutions, Inc. Em outras modalidades, as composições de células do EPR formuladas em meios de criopreservação apropriados para aplicações pós- descongelamento prontas para administrar podem compreendem células do EPR suspensas em Trealose.

[0224]A composição de terapia com células do EPR RTA pode opcionalmente compreender fatores adicionais que suportam enxerto, integração, sobrevida, potência de EPR, etc. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende ativadores da função das preparações de células do EPR aqui descritas. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende nicotinamida. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende nicotinamida a uma concentração entre cerca de 0,01 e 100 mM, 0,1 e 100 MM, 0,1 e 50 MM, 5 e 50 MM, 5 e 20 MM, por exemplo, 10 mM. Em outras modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende ácido retinoico. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende ácido retinoico a uma concentração entre cerca de 0,01 e 100 mM, 0,1 e 100 mM, 0,1 e 50 MM, 5e 50 mM, 5 e 20 mM, por exemplo, 10 mM.

[0225]Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA pode ser formulada para incluir ativadores de várias integrinas que demonstraram aumentar a aderência das preparações de células do EPR, como as descritas aqui, à membrana de Brunch. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende manganês extracelular (Mn2+) a uma concentração entre cerca de 5 uM e 1.000 uM. Em outras modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende o anticorpo monoclonal específico da conformação, TS2/16.

[0226]Em outras modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA também pode ser formulada para incluir ativadores da atividade reguladora imune de células do EPR.

[0227]Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA pode incluir um inibidor de ROCK.

[0228]Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do

EPR RTA pode ser formulada em um meio compreendendo componentes que diminuem o estresse celular molecular durante os processos de congelamento e descongelamento, eliminando radicais livres, tamponamento de pH, suporte oncótico / osmótico e manutenção do equilíbrio de concentração iônica.

[0229]Em algumas modalidades, as terapias com células do EPR formuladas em meios de criopreservação apropriados para aplicações pós-descongelamento prontas para administtar podem compreender um ou mais compostos imunossupressores. Em certas modalidades, as terapias com células do EPR formuladas em meios de criopreservação apropriados para aplicações pós- descongelamento prontas para administrar podem compreender um ou mais compostos imunossupressores que são formulados para liberação lenta de um ou mais compostos imunossupressores. Os compostos imunossupressores para uso com as formulações descritas neste documento podem pertencer às seguintes classes de fármacos imunossupressores: Glucocorticoides, citostáticos (por exemplo, agente alquilante ou antimetabólito), anticorpos (policionais ou monoclonais), fármacos que atuam sobre imunofilinas (por exemplo, ciclosporina, Tacrolimus ou sirolímus). Fármacos adicionais incluem interferons, opioides, proteínas de ligação ao TNF, micofenolato e pequenos agentes biológicos. Exemplos de fármacos imunossupressores incluem: células-tronco mesenquimais, anticorpo policlonal globulina anti-linfocitária (ALG), anticorpo policlonal globulina anti-timocitária (ATG), azatioprina, BAS 1LI X IMABO (anticorpo antirreceptor 1-2Ra), ciclosporina (ciclosporina A), DACLIZUMABO (anticorpo antirreceptor L-2Ra), everolimus, ácido micofenólico, RITUX IMABO (anticorpo anti-CD20), sirolimus, tacrolimus, Tacrolimus e / ou micofenolato mofetil.

[0230]O número de células viáveis que podem ser administradas ao indivíduo está tipicamente entre pelo menos cerca de 50.000 e cerca de 5 x 10º por dose. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 100.000 células viáveis. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 150.000 células viáveis. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 200.000 células viáveis. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 250.000 células viáveis. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 300.000 células viáveis. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 350.000 células viáveis. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 400.000 células viáveis. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 450.000 células viáveis. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 500.000 células viáveis. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA compreende pelo menos 600.000, pelo menos 700.000, pelo menos 800.000, pelo menos 900.000, pelo menos 1.000.000, pelo menos, 2.000.000, pelo menos 3.000.000, pelo menos, 4.000.000, pelo menos 5.000.000 pelo menos

6.000.000, pelo menos 7.000.000, pelo menos 8.000.000, pelo menos 9.000.000, pelo menos 10.000.000, pelo menos 11.000.000 ou pelo menos 12.000.000 de células viáveis.

[0231]Em algumas modalidades, o volume da formulação de EPR RTA administrada ao indivíduo está entre cerca de 50 uL e cerca de 100 uL, cerca de 25 uL e cerca de 100 uL, cerca de 100 uL e cerca de 150 uL, ou cerca de 10 ul e cerca de 200 ul. Em certas modalidades, duas doses entre 10 ul e 200 ul da formulação de EPR RTA podem ser administradas. Em certas modalidades, o volume da formulação de EPR RTA é administrado no espaço subrretiniano do olho de um indivíduo. Em certas modalidades, o método de entrega subrretiniano pode ser transvítreo ou supracoroidal. Em algumas modalidades, o volume da formulação de EPR RTA pode ser injetado no olho do indivíduo.

[0232]Em certas modalidades, as composições de células terapêuticas de EPR RTA podem ser formuladas a uma concentração de células entre cerca de

100.000 células / mL e cerca de 1.000.000 células / mL. Em certas modalidades, a terapia com células do EPR RTA pode ser formulada a uma concentração de células de cerca de 1.000.000 células / mL, cerca de 2.000.000 células / mL, cerca de

3.000.000 células / mL, cerca de 4.000.000 células / mL, cerca de 5.000.000 células / mL, 6.000.000 células / mL, 7.000.000 células / mL, 8.000.000 células / mL, cerca de

9.000.000 células / mL, cerca de 10.000.000 células / mL, cerca de 11.000.000 células / mL, cerca de 12.000.000 células / mL, 13.000.000 células / mL, 14.000.000 células / mL, 15.000.000 células / mL, 16.000.000 células / mL, cerca de 17.000.000 células / mL, cerca de 18.000.000 células / mL, cerca de 19.000.000 células / mL ou cerca de

20.000.000 células / mL.

[0233]Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA pode ser criopreservada e armazenada a uma temperatura entre cerca de -4º C e cerca de -200º C. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA pode ser criopreservada e armazenada a uma temperatura entre cerca de -20º C e cerca de -200º C. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA pode ser criopreservada e armazenada a uma temperatura entre cerca de -70º C e cerca de -196º C. Em algumas modalidades, a temperatura adequada para criopreservação ou temperatura de criopreservação compreende uma temperatura entre cerca de -4º C a cerca de -200º C, ou uma temperatura entre cerca de -20º C e cerca de -200º C, -70º C e cerca de -196º C.

[0234]Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA pode ser armazenada congelada por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12,13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31 dias.

Em outras modalidades, as células do EPR podem ser armazenadas congeladas por cerca de 1,5 a 48 meses. Em outras modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA pode ser armazenada congelada por cerca de 1 a cerca de 48 meses sem uma diminuição na porcentagem de viabilidade ou recuperação celular. Em algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA pode ser armazenada por pelo menos cerca de 38 horas a 2 a 8º C, enquanto mantendo a estabilidade.

[0235]EmM algumas modalidades, a composição de terapia com células do EPR RTA pode ser transportada congelada por mais de 12.874 km (8.000 milhas) sem uma diminuição na porcentagem de viabilidade, porcentagem de recuperação celular, ou potência.

[0236]Seria bem apreciado pelos versados na técnica que a derivação de células do EPR é de grande benefício. Elas podem ser usadas como modelo in vitro para o desenvolvimento de novos fármacos para promover sua sobrevida, regeneração e função. As células do EPR podem servir para triagem de alto rendimento por compostos que têm um efeito tóxico ou regenerativo nas células do EPR. Elas podem ser usadas para descobrir mecanismos, novos genes, fatores solúveis ou ligados à membrana que são importantes para o desenvolvimento, diferenciação, manutenção, sobrevida e função das células fotorreceptoras.

[0237]As células do EPR aqui descritas também podem servir como uma fonte ilimitada de células do EPR para transplante, reposição e suporte de células do EPR com defeito ou degeneradas em degenerações na retina e outros distúrbios degenerativos. Além disso, as células do EPR geneticamente modificadas podem servir como um vetor para transportar e expressar genes no olho e na retina após o transplante.

[0238]As condições do olho para as quais as células do EPR podem servir como terapêutica incluem, mas não estão limitadas a doenças ou distúrbios da retina geralmente associados à disfunção retiniana, lesão retiniana e / ou perda do epitélio pigmentar da retina. Uma lista não limitante de condições que podem ser tratadas de acordo com a invenção compreende retinite pigmentosa, amaurose congênita de Leber, degeneração macular hereditária ou adquirida, degeneração macular relacionada à idade (DMRI), DMRI não exsudativa (seca), atrofia geográfica (AG), doença de Best, descolamento de retina, atrofia girata, coroideremia, distrofia padrão, e outras distrofias do EPR, doença de Stargardt, danos no EPR e na retina devido a danos causados por qualquer um de lesões fóticas, laser, inflamatórias, infecciosas, radiação, lesão neovascular ou traumática.

[0239]Os distúrbios degenerativos exemplificativos que podem ser tratados usando as células deste aspecto da presente invenção incluem distúrbios neurodegenerativos incluindo, entre outros, doença de Parkinson, ALS, esclerose múltipla, doença de Huntingdon, encefalomielite autoimune, neuropatia diabética, doença de Alzheimer e epilepsia.

[0240]Os indivíduos que podem ser tratados incluem primatas (incluindo humanos), caninos, felinos, ungulados (por exemplo, equinos, bovinos, suínos (por exemplo, porcos)), aves e outros. Seres humanos e animais não humanos com importância comercial (por exemplo, gado e animais domesticados) são de particular interesse. Os mamíferos exemplificativos que podem ser tratados incluem caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos, roedores, etc. e primatas, particularmente seres humanos. Modelos animais não humanos, particularmente mamíferos, por exemplo, primata, murino, lagomorfos, etc. podem ser utilizados para investigações experimentais.

[0241]As células do EPR geradas como aqui descritas podem ser transplantadas para vários sítios alvo no olho de um indivíduo ou outras localizações (por exemplo, no cérebro). De acordo com uma modalidade, o transplante das células do EPR é para o espaço subrretiniano do olho, que é a localização anatômica normal do EPR (entre os segmentos externos do fotorreceptor e a coroide). Além disso, dependendo da capacidade migratória e / ou efeitos parácrinos positivos das células, pode-se considerar o transplante em compartimentos oculares adicionais, incluindo, entre outros, o espaço vítreo, a retina interna ou externa, a periferia da retina e dentro dos coroides.

[0242]O transplante pode ser realizado por várias técnicas conhecidas. Os métodos para realizar transplantes de EPR são descritos, por exemplo, nas patentes U.S. Nos. 5.962.027, 6.045.791 e 5.941.250 e em Eye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol, março de 1997; 235 (3): 149-58; Biochem Biophys Res Commun, 24 de fevereiro de 2000; 268 (3): 842-6; Opthalmic Surg, fevereiro de 1991; 22 (2): 102-8. Os métodos para realizar transplantes de córnea são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.755.785, e em Eye 1995; 9 (Pt 6 Su): 6 a 12; Curr Opin Opthalmol, agosto de 1992; 3 (4): 473-81; Ophthalmic Surg Lasers, abril de 1998; 29 (4): 305-8; Ophthalmology, abril de 2000; 107 (4): 719-24; e Jpn J Ophthalmol, novembro - dezembro de 1999; 43 (6): 502-8. Se forem utilizados principalmente efeitos parácrinos, as células também podem ser entregues e mantidas no olho encapsulado em um recipiente semipermeável, o que também diminuirá a exposição das células ao sistema imunológico do hospedeiro (Neurotech USA CNTF delivery system; PNAS, 7 de março, 2006, 103 (10) 3896 a 3901).

[0243]A etapa de administração pode compreender a administração intraocular das células do EPR em um olho em necessidade de tratamento. A administração intraocular pode compreender a injeção das células do EPR no espaço subrretiniano.

[0244]De acordo com uma modalidade, o transplante é realizado via cirurgia de vitrectomia pars plana seguida pela entrega das células através de uma pequena abertura na retina no espaço subrretiniano ou por injeção direta.

[0245]EmM certas modalidades, a administração pode compreender uma vitrectomia seguida pela entrega da composição de células terapêutica RTA no espaço subrretiniano na área macular via uma cânula através de uma pequena retinotomia. Um volume total de 50 a 100 ul de suspensão de células, dependendo da dose celular, pode ser implantado em áreas com potencial risco de expansão de AG.

[0246]Em algumas modalidades, é realizado um único procedimento cirúrgico no qual a composição de células terapêutica RTA é entregue através de uma pequena retinotomia, após vitrectomia, em um espaço subrretiniano criado na área macular, ao longo da borda entre as áreas de AG, se presente, e a retina extra-foveal mais bem preservada e camada de EPR. Após a colocação de um espéculo da tampa, uma vitrectomia padrão de 3 portas pode ser realizada. Isso pode incluir a colocação de uma cânula de infusão de 23G ou 25G e duas portas de 23G ou 25 / 23G (trocars). Uma vitrectomia central pode ser realizada com instrumentos 23G ou 25G, seguida pelo descolamento da face vítrea posterior. A composição de células terapêutica RTA pode ser injetada no espaço subrretiniano em um sítio predeterminado dentro do polo posterior, penetrando preferencialmente na retina em uma área que ainda é relativamente preservada perto da borda da AG, se presente.

[0247]Em algumas modalidades, a composição de células é administrada por uma injeção supracoroidal.

[0248]As células do EPR podem ser transplantadas de várias formas. Por exemplo, as células do EPR podem ser introduzidas no sítio alvo na forma de suspensão de célula única, com matriz ou aderidas a uma matriz ou membrana, matriz extracelular ou substrato tal como um polímero biodegradável ou uma combinação. As células do EPR também podem ser impressas em uma matriz ou arcabouço. As células do EPR também podem ser transplantadas em conjunto (cotransplante) com outras células da retina, tal como fotorreceptores. A eficácia do tratamento pode ser avaliada por diferentes medidas da função e estrutura visual e ocular, incluindo, entre outras, a melhor acuidade visual corrigida (BCVA), sensibilidade da retina à luz medida por perimetria ou microperimetria nos estados escuro e adaptado à luz, eletrorretinografia de campo inteiro, multifocal, focal ou padrão 5 ERG, sensibilidade ao contraste, velocidade de leitura, visão de cores, exame biomicroscópico clínico, fotografia de fundo, tomografia de coerência óptica (OCT), autofluorescência de fundo (FAF), imageamento infravermelho e multicor, angiografia por fluoresceína ou ICG, óptica adoptiva, e meios adicionais usados para avaliar a função visual e a estrutura ocular.

[0249]Ao indivíduo podem ser administrados corticosteroides antes ou simultaneamente à administração das células do EPR, tal como prednisolona ou metilprednisolona, Predforte. De acordo com outra modalidade, ao indivíduo não foram administrados corticosteroides antes ou simultaneamente à administração das células do EPR, tal como prednisolona ou metilprednisolona, Predforte.

[0250]Os fármacos imunossupressores podem ser administrados ao indivíduo antes, simultaneamente com e / ou após o tratamento. O fármaco imunossupressor pode pertencer às seguintes classes: Glucocorticoides, Citostáticos (por exemplo, agente alquilante ou antimetabólito), anticorpos (policlonais ou monoclonais), fármacos que atuam sobre imunofilinas (por exemplo, ciclosporina, Tacrolimus ou Sirolimus). Fármacos adicionais incluem interferons, opioides, proteínas de ligação ao TNF, micofenolato e pequenos agentes biológicos. Exemplos de fármacos imunossupressores incluem: células-tronco mesenquimais, anticorpo policlonal globulina anti-linfocitário (ALG), anticorpo policlonal globulina anti-timocitário (ATG), azatioprina, BAS 1LI X IMABO (anticorpo antirreceptor 1-2Ra), ciclosporina (ciclosporina A), DACLIZUMABO (anticorpo antirreceptor L-2Ra), everolimus, ácido micofenólico, RITUX IMABO (anticorpo anti-CD20), sirolimus, tacrolimus, Tacrolimus e / ou micofenolato mofetil.

[0251]Alternativamente, a composição de terapia com células do EPR RTA pode ser administrada sem o uso de fármacos imunossupressores.

[0252]Os antibióticos podem ser administrados ao indivíduo antes, simultaneamente com e / ou após o tratamento. Exemplos de antibióticos incluem Oflox, Gentamicina, Cloranfenicol, Tobrex, Vigamox ou qualquer outra preparação antibiótica tópica autorizada para uso ocular.

[0253]As terapias com células RTA EPR formuladas de acordo com a presente descrição não requerem o uso de instalações GMP para a preparação da formulação da dose final antes da injeção no olho de um indivíduo. As formulações de terapia com células do EPR RTA aqui descritas podem ser criopreservadas em uma criossolução não tóxica que compreende a formulação de dose final que pode ser enviada diretamente para o sítio clínico. Quando necessário, a formulação pode ser descongelada e administrada no olho do indivíduo sem ter que executar nenhuma etapa de preparação intermediária.

[0254]As células do EPR estão envolvidas em muitos processos cruciais para a sobrevida dos fotorreceptores, incluindo transporte de nutrientes, água e íons, absorção de luz, fagocitose dos segmentos externos do fotorreceptor (POS), reisomerização de all-trans-retinal em 11-cis-retinal, que é crucial para o ciclo visual, regulação imune, secreção de fatores essenciais, e formação da barreira hemato- retiniana. Como mostrado na Figura 15, a monocamada de EPR atua como um mediador metabólico polarizado entre os PRs e os coriocapilares (CC). O EPR tem uma polaridade estrutural e funcional apical para basolateral. No lado apical, as células do EPR formam várias vilosidades, permitindo o contato direto com o POS e transportam moléculas tal como glicose e vitamina A dos coriocapilares para os PRs. No lado basal, as células do EPR transportam metabólitos, tal como 002, lactato e água, para os coriocapilares e geram a membrana basal de Bruch (BM) subjacente que separa o EPR da coroide, gerando a barreira hemato-retiniana. Nas paredes laterais, células do EPR adjacentes formam junções estreitas.

[0255]A função de barreira pode ser usada para determinar a potência das culturas de células do EPR medindo as junções estreitas formadas entre as células. As junções estreitas do EPR limitam o movimento paracelular de íons e água através da monocamada do EPR e mantêm a distribuição apico-basal correta dos transportadores do EPR. As composições de células do EPR aqui descritas exibem função de barreira determinada pela capacidade de gerar Resistência Elétrica Transepitelial (TEER) acima de 100 O.

[0256]Além disso, as células do EPR secretam uma variedade de fatores neurotróficos, tal como fatores de crescimento de fibroblastos (DFGF e aFGF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator derivado de epitélio pigmentar (PEDF), fator neurotrófico derivado de cérebro (BDNF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e outros, que ajudam a manter a integridade estrutural do endotélio e fotorreceptores de coriocapilar. As células do EPR também secretam citocinas anti- inflamatórias, tal como o fator de crescimento transformante (TGF)-B, importante no estabelecimento das propriedades imunológicas privilegiadas do olho. As células do EPR utilizadas nas composições de células terapêuticas RTA aqui descritas são capazes de secretar fatores neurotróficos. As composições de células do EPR aqui descritas também demonstram a secreção de PEDF e VEGF polarizada, o que aumenta o crescimento de EPR e a formação de vasos sanguíneos, respectivamente.

[0257]Diferentes meios de cultura de células podem afetar a eficiência de expansão das células. No entanto, as composições de células do EPR aqui descritas demonstram a capacidade de expandir após serem suspensas em formulações de meios compreendendo DMSO.

[0258]As composições de células do EPR aqui descritas também exibem uma porcentagem de células viáveis pós-descongeladas que permite que as formulações sejam usadas como uma terapia celular pronta para injetar, sem a necessidade de remover células mortas. A porcentagem de rendimento das composições de células do EPR aqui descritas, conforme medido por células por mililitro, é característica de formulações que são otimizadas para atender aos requisitos de uso clínico em larga escala.

[0259] Exemplo 1

[0260]Aqui utilizadas são suspensões celulares de células do EPR, derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) através de um processo de diferenciação direcionada sob condições de fabricação GMP livres de xeno. Estas células foram expandidas em alimentadores de fibroblastos do cordão umbilical humano irradiados (hUCFs). As hESCs expandidas foram então diferenciadas em células do epitélio pigmentar da retina (EPR) usando nicotinamida e activina A. As células do EPR foram então expandidas e criopreservadas em meio de criopreservação.

[0261]As hESCs HAD-C 102 de grau GMP livres de xeno foram expandidas como colônias em huCFs CRDOO08 de grau GMP livres de xeno irradiadas que foram semeadas em vitronectina humana recombinante (rhVTN) ou em gelatina humana recombinante (rhGelatin). A expansão de hESC foi realizada na presença do meio NUTRISTEMO que contém albumina sérica humana, além dos fatores de crescimento FGF básico e TGF beta (Biological Industries). As hESCs expandidas foram então transferidas para uma cultura em suspensão para iniciar a diferenciação de maneira direcionada sob condições normais de O> (atmosférico).

[0262]Corpos esferoides (SBs) foram formados e depois plaqueados como uma cultura celular aderente sob condições de diferenciação direcionada contínua em direção a um destino neural e subsequentemente em direção a um destino de células do EPR.

[0263]No final da fase de diferenciação, as células foram colhidas usando as duas técnicas a seguir e expandidas 1) As áreas não pigmentadas foram excisadas e removidas manualmente e as áreas de células pigmentadas restantes foram coletadas enzimaticamente e 2) As células (pigmentadas e não pigmentadas) foram coletadas enzimaticamente. As células foram então semeadas e expandidas por 3 passagens em cima de placas de cultura de células cobertas com rhGelatin, de acordo com as instruções de fabricação na presença e ausência de nicotinamida ou em cima de Laminina 521, Fibronectina, Colágeno | ou Colágeno IV. As células foram colhidas e criopreservadas na passagem 2 (P2) em crio-meio composto de 90% de soro humano e 10% de DMSO e em crio-meio de grau GMP livre de xeno — livre de soro (Meio 2 (CS5) e Meio 1 (CS2)), BioLife Solutions).

[0264]Exemplo 2

[0265]A vitalidade e a viabilidade pós-descongelamento foram avaliadas para células do EPR terapêuticas criopreservadas em meios de criopreservação com 5% de dimetil sulfóxido (DMSO) (Meio 2, CS5) nas densidades celulares de 1,5 x 10º e 5 x 10º. Os resultados foram comparados com os resultados de células que foram criopreservadas em 90% de soro humano (HS) com 10% de DMSO usando uma máquina de congelamento controlada (por exemplo, um aparelho de resfriamento lento contendo isopropanol). Após o descongelamento de 3 frascos de cada composição congelados em cada meio de criopreservação, a viabilidade foi testada usando um contador de células. As células de cada frasco foram semeadas em uma placa de 12 poços, a uma densidade de 0,5 x 10º células viáveis / poço em um volume final de 2 mL de DMEM contendo 20% de soro humano por poço, por 24 horas a 37º C e 5% de CO>. No final do período de incubação, as culturas foram lavadas com PBS. Após o tratamento com TrypLE Select, as células foram enumeradas usando um contador de células. A porcentagem de vitalidade foi então calculada dividindo-se o número médio de células aderentes viáveis pelo número total de células semeadas por poço e multiplicando-se o resultado por 100.

[0266] Como mostrado na Figura 1, os resultados demonstram que as células do EPR que foram criopreservadas nos meios aqui utilizados apresentaram viabilidade — pós-descongelamento — semelhante e melhor vitalidade pós- descongelamento (melhor % de adesão celular 24 horas após o descongelamento) quando comparadas com o meio de criopreservação composto por 90% de soro humano e 10% de DMSO (HS / DMSO).

[0267]Exemplo 3

[0268]As composições terapêuticas de células do EPR foram formuladas usando reagentes de grau GMP livres de xeno, células de grau GMP livres de xeno (HAD-C 102-hESCs cultivadas em CRDO08 irradiado), como descrito no Exemplo 1.

[0269]A avaliação das células CRALBP*PMEL17* para medição da pureza de EPR foi realizada no final da fase de diferenciação. Como mostrado na Tabela 1a e na Tabela 1b, a pureza das células do EPR foi de pelo menos 98,76% ou mais para todas as composições de terapia com células do EPR RTA formuladas com CS2 (Meio 1) ou CS5 (Meio 2).

[0270]Junções estreitas geradas entre células do EPR permitem a geração da barreira hemato-retiniana e uma secreção polarizada de PEDF e VEGF. O PEDF é secretado no lado apical, onde atua como um fator de crescimento antiangiogênico e neurotrópico. O VEGF é secretado principalmente no lado basal, onde atua como fator de crescimento pró-angiogênico no endotélio coroide. A polarização do EPR (função de barreira e secreção polarizada de PEDF e VEGF) foi medida em um sistema transwell nas células no final do processo de produção. Como mostrado nas Tabelas 1a e 1b, a função de barreira / resistência elétrica transepitelial (TEER) foi demonstrada, bem como a secreção polarizada de PEDF e VEGF.

[0271]As amostras de controle (Ctrl) foram criopreservadas em 10% de DMSO e 90% de soro humano.

Tabela la. Caracterização de células do EPR terapêuticas criopreservadas nos meios 1 (CS2) e meios 2 (CS5) para as corridas de produção (PR) 1 e 2 Média + SD (n) Média + SD (n)

EL TT | T&) % de Viabilidade (Contador de | 85+3 871 89+3 84 84 92 células) (n=3) | (n=3) | (n=3) | 1n=2) | (n=2) | n=2) Pureza (FACS): % de células 29,78 99,54 29,57 98,74 99,50 | 99,87 CRALBP*PMEL17* Potência: Resistência Elétrica Transepitelial (TEER) 274 175 225 663 739 753 Secreção Polarizada de PEDF (Relação Apical para Basal) 36 3,2 4.1 4,0 66 61 Secreção Polarizada de VEGF (Relação Basal para Apical) 14 15 V 7 23 22 Tabela lb. Caracterização das células terapêuticas EPR criopreservadas nos meios 1 (CS2) e meios 2 (CS5) para as experiências (PR) 3 e 4 EPR terapêutica PR 3 EPR terapêutica PR 4 Teste (Método) Média + SD (n) Média + SD (n) % de Viabilidade (Contador de | 87+5 89+5 90 +4 84 84 91 células) (n=4) (n=4) (n=4) (n=2) (n=2) | (n=2) Pureza (FACS): % de células 99,51 99,21 98,76 29,27 99,28 | 99,07 CRALBP*PMEL17* Potência: Resistência Elétrica Transepitelial (TEER) NA 233 385 881 846 701 Secreção Polarizada de PEDF (Relação Apical para Basal) NA 56 11,5 83 TA 61 Secreção Polarizada de VEGF (Relação Basal para Apical) NA 20 26 31 28 25 Exemplo 4

[0272]Os ensaios de estabilidade foram realizados em composições de terapia com células do EPR RTA. As células produzidas de acordo com os métodos do Exemplo 1 foram suspensas no Meio 1 contendo 2% de DMSO (CS2) ou Meio 2 contendo 5% de DMSO (CS5) por até 3 horas antes da criopreservação. As células do EPR terapêuticas que foram criopreservadas após 3 horas de incubação em CS2 e CS5 mostraram viabilidade, vitalidade e rendimento pós-descongelamento semelhantes às células incubadas por menos de uma hora antes da criopreservação. Os resultados da estabilidade são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Estabilidade das células do EPR terapêuticas após o descongelamento (incubação no meio 1 (CS2) e no meio 2 (CS5) antes da criopreservação Tempo de | % de Viabilidade % de rendimento % de Viabilidade Expansão no Dia incubação (h) pós- pós- 24 horas pós- 14 de cultura a2-8ºC descongelamento | descongelamento | descongelamento antes da . cs2 cs5 cs2 cs5 css preservação [e 67 70 73 70 94 92 4,2 4,8 EFIAoLE EEE E EE ORA 70 67 92 82 89 112 4,9 4,5

[0273]Além disso, as células incubadas em CS2 ou CS5 por 3 horas antes da criopreservação demonstraram a capacidade de gerar função de barreira (junções estreitas entre células do EPR), medida pela capacidade de gerar Resistência Elétrica Transepitelial (TEER) acima de 100 O e secretar VEGF e PEDF de maneira polarizada, como mostrado na Tabela 3 (Ver também a Figura 15).

Tabela 3. TEER e secreção polarizada de PEDF e VEGF de células terapêuticas EPRO no meio 1 (CS2) e meio 2 (CS5) após descongelamento incubação nos meios antes da criopreservação Tempo de Secreção polarizada de PEDF e VEGF Função de Barreira TEER incubação (o) PEDF Relação superior VEGF Relação inferior (h)a2-8º para inferior para superior : o 188 392 7,1 7,6 14 1,8 Loo E a RR se

[0274]A estabilidade pós-descongelamento foi avaliada para as composições de terapia com células do EPR descritas acima. As composições de células do EPR foram formuladas no meio 1 contendo 2% de DMSO (CS2) ou meio 2 contendo 5% de DMSO (CS5) e incubadas por até 3 horas antes da criopreservação. A viabilidade, o rendimento de células vivas, e a potência foram determinados como descrito acima nos pontos no tempo de 0 horas, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas, 6 horas e 24 horas após a criopreservação entre aproximadamente 2 a 8º C.

[0275] Verificou-se que as células do EPR eram estáveis no meio 1 contendo 2% de DMSO (CS2) ou no meio 2 contendo 5% de DMSO (CS5) por pelo menos cerca de 3 horas antes da criopreservação e pelo menos cerca de 1 hora após a criopreservação ou pelo menos cerca de 2 horas antes da criopreservação e pelo menos cerca de 5 horas após a criopreservação.

Exemplo 5

[0276]A segurança de três soluções de criopreservação para uso com formulações de composição de terapia com células do EPR prontas para administrar (RTA) foi avaliada após injeção subrretiniana em camundongos Balb/c.

[0277]Um total de 36 camundongos Balb/c foram utilizados e divididos em quatro (4) grupos de nove (9) em cada grupo (n = 3 para cada um dos pontos no tempo de término; 1, 3 e 10 dias após a administração). Esses grupos continham um grupo de controle de veículo (BSS PLUS, Alcon Laboratories) e três grupos tratados que receberam os itens de teste (CS5, CS2 e CS2 diluídos 1:1 em volume com BSS PLUS). Todos os animais foram administrados com os vários tratamentos via injeção subrretiniana no olho esquerdo. O procedimento foi realizado sob anestesia com cetamina / medetomidina a 75 mg / kg, que foi administrada IP dois minutos antes da injeção.

[0278]Durante o estudo, foram realizadas avaliações da morbidez e mortalidade, peso corporal e observação clínica geral, bem como exames oculares externos e internos. A avaliação ocular foi realizada pelo oftalmologista veterinário uma vez durante a aclimatação (medição da linha de base antes da dosagem) e em cada dia de término subsequente. A avaliação ocular incluiu: exame do segmento anterior e lente usando biomicroscopia com lâmpada de fenda e exame do fundo usando oftalmoscopia indireta. Os animais foram sacrificados nos dias 1, 3 e 10 após a administração e o exame histopatológico foi realizado nos olhos injetados.

[0279]Os exames clínico, oftalmológico e histopatológico, realizados por um oftalmologista veterinário e um conselho de patologistas veterinários certificados, não demonstraram efeitos importantes relacionados ao tratamento ou toxicologicamente significativos, após a administração subrretiniana de formulações de EPR RTA em um acompanhamento de 10 dias. As avaliações histopatológicas da inflamação foram baseadas na presença de neutrófilos, linfócitos, macrófagos e mastócitos, de acordo com os seguintes critérios: sem inflamação como indicado pela ausência de células inflamatórias, inflamação leve como indicado por até 10 células por campo de ampliação x10, inflamação moderada como indicado entre cerca de 10 a 20 células por campo de ampliação x10, e inflamação forte como indicado por mais de 20 células por campo de ampliação x10.

[0280]A avaliação histopatológica do olho nativo de um animal não tratado e dos olhos direitos não tratados de animais nos grupos de controle não revelou alterações patológicas, como mostrado na Figura 2 e na Figura 3.

[0281]A avaliação histopatológica dos olhos tratados (olhos esquerdos) revelou que no final do Dia 1, apenas os animais do grupo tratado com BSS PLUS: CS2 (1:1 em volume) apresentaram sinais de inflamação forte. Todos os outros animais tratados com BSS PLUS, CS5 ou CS2 apresentaram inflamação leve a moderada. Imagens de lâminas histopatológicas do olho tratado, obtidas a partir de um animal tratado com BSS Plus e sacrificado no dia 1 do estudo são mostradas na

Figura 4A e na Figura 4B. Essas lâminas mostram inflamação leve com infiltração leve da esclera e alguns macrófagos e linfócitos faltando (Corado com H&E no campo de ampliação x4 e x20, respectivamente). A Figura 5A e a Figura 5B mostram imagens de lâminas histopatológicas do olho tratado obtidas a partir de um animal tratado com CS5 e sacrificado no dia 1. Essas lâminas mostram inflamação moderada com infiltração da esclera, alguns macrófagos e poucos neutrófilos (Corado com H&E no campo de ampliação x4 e x20, respectivamente). Imagens de lâminas histopatológicas do olho tratado obtidas a partir de um animal tratado com CS?2 e sacrificado no dia 1 do estudo são mostradas na Figura 6A e na Figura 6B. Essas lâminas mostram inflamação moderada com macrófagos e neutrófilos na córnea (Corado com H&E no campo de ampliação x4 e x20, respectivamente).

[0282]Embora a maioria dos animais tratados com CS2 ou BSS PLUS:CS2 tenha apresentado deposição mínima de fibrina na câmara anterior no final do dia 1, essas alterações agudas demonstram uma reação a curto prazo. A Figura 7A mostra uma imagem de uma lâmina histopatológica do olho tratado obtida a partir de um animal tratado com BSS PLUS:CS?2 e sacrificado no dia 1 do estudo, mostrando forte inflamação com infiltração moderada da esclera (Corado com H&E no campo de ampliação x4).

[0283]A Figura 7B mostra deposição de fibrina no canto inferior direito ao lado dos linfócitos na esclera (Corado com H&E no campo de ampliação x20).

[0284]No dia de término 3, todos os animais tratados com CS5 ou CS2 apresentaram uma reação granulomatosa da esclera focal (inflamação leve a moderada) caracterizada por macrófagos e fibroblastos em divisão. Os macrófagos também foram observados em animais tratados com BSS PLUS, no entanto, mostraram um padrão e concentração diferentes de células sem ativação de fibroblastos e não estavam relacionados ao material injetado. Esses resultados indicam um padrão típico de reação em estágio precoce ao corpo estranho em geral.

Consequentemente, no dia de término 10, todos os animais tratados com BSS PLUS, CS5 ou CS2 não apresentaram inflamação ou inflamação leve e sem deposição de fibrina. Além disso, apenas um animal tratado com BSS PLUS:CS2 apresentou inflamação moderada, enquanto todos os outros animais apresentaram inflamação leve.

[0285]lmagens histopatológicas demonstrando inflamação moderada com infiltração moderada da esclera e vários macrófagos em um animal tratado com BSS PLUS e sacrificado no dia 3 do estudo são mostradas na Figura 8A e na Figura 8B. A Figura 9A e a Figura 9B mostram imagens histopatológicas de inflamação forte com uma reação de granulação focal e vários macrófagos e fibroblastos, que ilustram uma reação transitória ao corpo estranho em estágio precoce em um animal tratado com CS5 e sacrificado no dia 3 do estudo. A Figura 10A e a Figura 10B são imagens histopatológicas de um animal tratado com CS2 e sacrificado no dia 3 do estudo, mostrando forte inflamação com vários macrófagos e fibroblastos, também demonstrando uma reação transitória ao corpo estranho em estágio precoce. Imagens histopatológicas de um animal tratado com BSS PLUS:CS?2 e sacrificado no dia 3 do estudo, com inflamação e edema leves são mostradas na Figura 11A e na Figura 11B. A Figura 12A e a Figura 12B mostram imagens histopatológicas de um animal tratado com BSS PLUS e sacrificado no dia 10 do estudo, ilustrando inflamação leve com poucos macrófagos. A Figura 13A e a Figura 13B mostram imagens histopatológicas de um animal tratado com CS5 e sacrificado no dia 10 do estudo, ilustrando inflamação leve com poucos macrófagos. A Figura 14A e a Figura 14B mostram imagens histopatológicas de um animal tratado com CS2 e sacrificado no dia 10 do estudo, ilustrando inflamação leve com poucos macrófagos.

[0286]Os resultados da avaliação histopatológica demonstram que não houve efeitos importantes relacionados ao tratamento e / ou toxicologicamente significativos após a administração subrretiniana de BSS PLUS, CS5, CS2 ou BSS PLUS:CS2 em comparação ao controle após 10 dias de acompanhamento. A avaliação histopatológica dos olhos tratados revelou uma reação típica em estágio precoce a um corpo estranho no dia de término 3 em grupos tratados com BSS Plus, CS5 e CS?2. No entanto, esta reação foi transitória e diminuiu no dia 10, deixando uma infiltração muito menor de macrófagos no sítio injetado. Necrose não estava presente na retina de nenhum animal ou em qualquer outro lugar.

Exemplo 6

[0287]As composições de terapia com células do EPR RTA foram formuladas usando enriquecimento enzimático (isolamento / colheita) de células pigmentadas e soluções de neutralização de enzimas compreendendo NUTS(-) + albumina sérica humana (HSA) e NUTS(-) (sem soro humano (HS)) e foram analisadas quanto à estabilidade antes e após a adição de crio-meio.

[0288]As células foram semeadas e expandidas nos frascos T25, T75 e T175 até a passagem 4. Ao atingir uma poligonalidade superior a cerca de 90%, as células foram incubadas no TrypLE Select (1X) por até 50 minutos a 37º C / 5% CO>2. As células foram agrupadas e colocadas em gelo. Os frascos foram lavados uma vez com volume igual de PBS(-) e a lavagem foi adicionada ao grupo de células. A lavagem com PBS() foi substituída por NUTS(-) para melhorar a neutralização de enzimas e reduzir o estresse celular.

[0289]O grupo de células foi então amostrado (20 ul em 180 ul de PBS(-)) e contado usando um contador de células, tal como o contador de células NC-200, por exemplo. O grupo de células foi então dividido em alíquotas nas várias soluções de arrefecimento em grupos (G1, G2 e G3). As células de cada grupo foram então contadas, filtradas e divididas em alíquotas para análise de estabilidade da composição de células a 4º C.

[0290]Os tipos de solução de neutralização de enzimas analisados incluem: * Grupo 1 (G1) - 20% de soro humano (HS) / DMEM (grupo de controle HS-

positivo) * Grupo 2 (G2) - Nutristem (-) com albumina sérica humana (HSA) * Grupo 3 (G3) - Nutristem (-) (NUTS)

[0291]Cada um dos grupos de arrefecimento, G1, G2 e G3, foi passado através de um sistema de filtração sequencial em tandem de 500-200-40 micra. As soluções celulares filtradas foram mantidas a 4º C e a viabilidade celular foi testada nos pontos no tempo 0, 2 e 4 horas após a filtração.

[0292]No final de cada ponto no tempo após a filtração, as células foram contadas, centrifugadas em cerca de 220 g por cerca de 5 minutos, o sobrenadante foi descartado, e o pelete foi ressuspenso em cerca de 5 a 10 mL de CS5, amostrado e contado (20 ul em 180 ul 20% HS / DMEM). Com base nos resultados da contagem, as células foram diluídas em CS5 para obter uma concentração final de 2 x 108 células / mL. As células foram colocadas a 4º C por diferentes tempos (0, 2, 3 ou 4 horas) para análise de estabilidade pré-criopreservação, após o que as composições de células do EPR + crio-meio foram divididas em alíquotas em criofrascos. Três criofrascos foram amostrados aleatoriamente, as células foram contadas, e criopreservadas.

[0293]Os frascos foram descongelados em banho-maria a 37º C por cerca de 2,5 minutos. As células foram imediatamente amostradas para contagem (20 ul em 180 ul de HS / DMEM a 20%) e as suspensões de células foram diluídas por adição gota a gota de meio de cultura HS / DMEM quente a 20%. As células foram então lavadas e colocadas em gelo para análise adicional.

[0294]As porcentagens de recuperação foram calculadas com base em uma concentração final alvo de 2 x 106º células / mL.

[0295]Após a filtração sequencial, as suspensões de células filtradas nas diferentes soluções de neutralização de enzimas foram mantidas a 4º C e a viabilidade celular O, 2 e 4 horas após a filtração foi avaliada.

Tabela 4. Viabilidade da composição de células pós-filtração

LEE WA

LRF TIE E G2 (n=6) Les a

ER IE G3 Logs o (n=6) Ls TE

[0296]A viabilidade em todos os grupos, em todos os pontos no tempo, permaneceu em 98% ou 99%, conforme mostrado na Tabela 4. Não foram encontradas diferenças significativas entre os dois grupos de formulação de solução de neutralização G2 e G3, em diferentes pontos no tempo (0, 2 e 4 horas) comparado ao ponto no tempo O horas de G1 (grupo de controle). A Figura 16 mostra a viabilidade dos grupos G2 (NUTS(-) + HSA) e G3 (NUTS(-)) a 4º C ao longo do tempo após a filtração em comparação com o grupo de controle G1.

[0297]A recuperação e viabilidade celular foram avaliadas em solução de criopreservação antes do processo de congelamento (pré-criopreservação). As composições de terapia celular (pós-filtração) foram mantidas a 4º C por períodos de tempo de O, 2 e 4 horas. Cada solução foi então centrifugada e ressuspensa em solução de criopreservação, CS5, até uma concentração final de 2 x 10º células / mL. Em seguida, as células nas soluções de criopreservação (criopreservação + composição da terapia celular, pré-criopreservação) foram mantidas a 4º C por 0,2,3 e 4 horas antes de serem divididas em alíquotas em frascos de 1 mL. Três frascos de cada grupo foram amostrados e contados para avaliar a porcentagem de viabilidade e recuperação antes dos frascos serem criopreservados.

[0298]A viabilidade celular e a recuperação, antes do processo de congelamento, das composições de terapia celular no tempo de incubação O horas, seguidas de incubação em crio-meio por O, 2, 3 e 4 horas, estão resumidas na Tabela 4A. As Tabelas 4B e 4C incluem composições de células incubadas por O, 2, 4 horas,

seguidas de incubação por O, 2, 3, 4 horas em solução de criopreservação (células + CM). O grupo de controle (G1) foi avaliado apenas no ponto no tempo de 0 horas para composições celulares e O horas para células + CM, pré-criopreservação.

Tabela 5A. Viabilidade e recuperação pré-criopreservação de composições de terapia celular às O horas de incubação em solução de neutralização seguida de incubação por O, 2, 3 e 4 horas em crio-meio (Células + CM).

Células + CM % de Viabilidade % de Recuperação pre-crio média média G1 8,1 G2 87 12,5 G3 84 5,3 G2 1,0 7,9 G3 97 18 12,0 G2 n= 3 horas G3 97 34 92 10,4 (n=6) G2 8,7 G3 95 3,3 92 7,8

[0299] Como mostrado na Tabela 5A, na Figura 17A e na Figura 17B, no ponto no tempo 0 horas de incubação da composição de células terapêutica seguida de O horas de incubação em crio-meio, pré-criopreservação, não foram detectadas diferenças significativas na viabilidade e recuperação entre os dois grupos de neutralização G2 e G3, em comparação com o grupo de controle G1. Além disso, às O horas de incubação terapêutica da composição de células em solução de neutralização, seguida de 2, 3 e 4 horas de incubação em crio-meio, pré- criopreservação, não apresentaram redução na viabilidade ou recuperação das células em ambos os grupos G2 e G3 em comparação com o grupo de controle G1. A viabilidade permaneceu acima de 95% ao longo do tempo e não foram observadas diferenças significativas entre os três grupos.

Além disso, a recuperação de todos os grupos permaneceu na faixa de 75% a 100%. Tabela 5B.

Viabilidade celular pré-criopreservação e recuperação celular após 2 horas de incubação da composição de células terapêutica seguida de 0,2, 3 e 4 horas de incubação em crio-meio, pré-criopreservação.

Tempo de Células às 2 horas de incubação Células + CM % de Viabilidade % de Recuperação pre-crio média média G2 0,5 77 2,5 (n=6) 0 horas G3 98 0,3 82 87 (n=6) G2 18 79 3,0 (n=6) G3 97 1,0 84 3,9 (n=6) G2 97 83 8,8 (n=6) 3 horas G3 1,0 76 12,5 (n=6) G2 97 2,0 75 9,0 (n=6) 4 horas G3 o,7 74 4,9 (n=6) Tabela 5C.

Viabilidade celular pré-criopreservação e recuperação celular após 4 horas de incubação da composição de células terapêutica seguida de 0, 2, 3, 4 horas de incubação em crio-meio, pré-criopreservação.

E Células às 4 horas de incubação

Tempo de % de Viabilidade % de Recuperação Células + CM média média pré-crio G2 04 10,4 G3 97 12 92 29,5 (n=6) G2 0,2 87 7,9 (n=6) G3 0,2 6,4 G2 2,4 82 8,3 (n=6) G3 97 0,5 88 7,0 (n=6) G2 97 85 7,8 (n=6) G3 97 1,0 92 81 (In=6)

[0300]As Tabelas 5B e 5C e a Figura 18A, a Figura 18B, a Figura 19Ãe a Figura 19B mostram que quando as composições de células do EPR terapêuticas são incubadas em solução de neutralização por 2 e 4 horas, seguidas de O a 4 horas de incubação em crio-meio, pré-criopreservação, são observados valores de viabilidade e recuperação celular semelhantes para ambos os grupos G2 (composições celulares em Nutistem (-) com HSA) e G3 (composições celulares em Nutistem (-) (NUTS)). Este ensaio demonstrou que não houve efeitos significativos na viabilidade celular ou na recuperação celular, após incubação prolongada nas soluções de neutralização ou no crio-meio, antes da criopreservação. Exemplo 7

[0301]As células podem sofrer estresse durante a criopreservação, o que pode levar a baixas taxas de sobrevida após o descongelamento. Além disso, o estresse nas células durante os procedimentos de colheita pode afetar a viabilidade e a recuperação das células após o descongelamento. Consequentemente, a viabilidade celular e a recuperação das composições de células terapêuticas RTA foram avaliadas após o descongelamento. As composições de células terapêuticas que foram incubadas por O horas em diferentes soluções de neutralização (G1, G2 e G3, como descrito acima), seguidas de incubação em crio-meio por O, 2, 3 e 4 horas antes da criopreservação, foram avaliadas quanto à viabilidade e à recuperação pós- criopreservação.

[0302]A Tabela 6 resume os resultados de viabilidade e estabilidade obtidos quando as composições de células terapêuticas foram incubadas em soluções de neutralização enzimática por O horas, seguidas de incubação em crio-meio por 0,2, 3 e 4 horas (pré-criopreservação), criopreservadas e depois descongeladas.

Tabela 6. Viabilidade e recuperação pós-descongelamento de células de O horas + incubação com solução de neutralização, seguida de incubação de 0,2,3e 4 horas em crio-meio % de % de % de % % de Tempo pré- a % de Recupe % de ea % de . Recupe | Recupe | Viabili |" Viabiida | Criopreserva Viabilida ração Recupe Viabilida ração | ração | dade de entre ção em CS5 de SD entre ração SD de SD grupos 0 horas 92 7o ETÁ 11 92 79 97 11 (In=4) [ess TN e e) oras | | 91 10,0 E 13 [grs Rs ss [rss Ts is Ga 2 horas 104 18,9 EM [ 98 14,7 96 o7 (In=4-6) 3 horas 99 171 96 0,9 [mess Ds ss e)

[0303]JA análise da viabilidade e recuperação celular, antes da criopreservação com diferentes tempos de incubação em crio-meio, revelou que a viabilidade era mantida acima de cerca de 90% em todos os grupos em todos os pontos no tempo e a recuperação estava na faixa de 75% a 100%.

[0304]Como mostrado na Figura 20A, não houve diferenças significativas na viabilidade celular entre os grupos e a viabilidade permaneceu acima de cerca de 95%

em todo o intervalo de tempo de pré-criopreservação e foi comparável à viabilidade do grupo de controle G1. A análise dos resultados de recuperação, mostrados na Figura 20B, revelou valores mais altos de recuperação para o grupo G4, que atingiu o pico em 2 horas pré-criopreservação e depois diminuiu ligeiramente após 3 e 4 horas pré-criopreservação. No entanto, a recuperação permaneceu na faixa de cerca de 80% a 100%.

[0305]Os resultados pós-descongelamento obtidos quando as composições de células terapêuticas foram incubadas por O, 2 e 4 horas em solução de neutralização, seguidas de incubação por O, 2, 3 e 4 horas em crio-meio, são apresentados na Tabela 7. Esses resultados demonstram a relação de viabilidade e recuperação pós-descongelamento na exposição prolongada das células a CS5 pré- criopreservação que, por sua vez, pode ser afetada pela incubação prolongada das células na solução de neutralização de enzimas.

Tabela 7. Viabilidade e recuperação pós-descongelamento de células incubadas em solução de neutralização de enzimas por O, 2, 4 horas, seguidas de incubação em crio-meio (pré-criopreservação) por O, 2, 3 e 4 horas % de % de % de Tempo % de % de % de % de Recupe % de : sea . Recupe | Viabilida | DS/DP pré- | Recupera | Viabilda | Recupera | Recupera | ração . Viabilida ração | deentre crio çãomédia | desD | çãomédia | çãosD entre de SD sp grupos grupos gnroh | pos | a | S | | molas ds | + EG Es Tv Tr | 4h/4h 93 | 18 | 7O 21 Eres Tv ss Pane a a A Do Err Re)

[0306]A viabilidade medida para ambos os grupos G2 e G3 foi robusta acima de 93%, sem diferenças significativas entre os grupos G2 e G3 em todos os pontos no tempo. A recuperação de ambos os grupos não mostrou diferenças significativas.

A recuperação para o grupo G2 foi de 75% + 3,3 e a recuperação para o grupo G3 foi de 81% + 7,1.

[0307]Estes resultados demonstram que as soluções de neutralização (NUT (-) com HSA (grupo G2) e sem HSA (grupo G3)) não comprometeram a recuperação ou a viabilidade celular. Não foram encontradas diferenças significativas entre os dois grupos de arrefecimento com ou sem HSA (G2 e G3). Os resultados de viabilidade celular e recuperação celular para as soluções de neutralização de enzimas sem HS foram comparáveis às soluções de neutralização de enzimas que compreendem HS (G1) pré-criopreservação ou pós-criopreservação.

[0308]Além disso, o procedimento de colheita de células compreendendo soluções de neutralização de enzimas sem HS e uma etapa de filtração não comprometeu a viabilidade das células (Tabela 4). A análise pré-criopreservação e pós-descongelamento da recuperação e viabilidade celular não mostrou diferenças significativas entre os grupos G2 e G3 em comparação com o grupo de controle (G1) (Tabelas 5 a 7). A maior porcentagem de recuperação e viabilidade foi encontrada quando as células foram incubadas nas soluções de neutralização de enzimas por até 2 horas, seguidas pela incubação em crio-meio por até 3 horas. No entanto, os tempos de incubação de pelo menos 4 horas na solução de neutralização de enzimas ou no crio-meio não resultaram em uma diminuição significativa na viabilidade celular ou na recuperação celular.

[0309]A secreção de PEDF e a capacidade de expansão celular também foram medidas após as células serem colhidas, criopreservadas e descongeladas. Os resultados são mostrados na Tabela 8.

Tabela 8. Secreção de PEDF e capacidade de expansão de células pós- colheita e criopreservação para composições de células do EPR com solução de neutralização de enzimas (células) e composições de células do EPR RTA (células + CM)

Tempo de Células — Células PEDF Dia 14 % de Grupo . ; : z Células + CM | VIVAS Dia 14 | ng/ml/dia Recuperação pré-crio 0-0 ND 2364 ND Corrida de Produção de Teste 2413 0-0 3,54E + 06 2379 3 2-2 2,90E + 06 2063 Corrida de Produção de Teste 2,35E + O6 2404 ND - Sem dados

[0310]Conforme mostrado na Tabela 8, após o descongelamento, as células mantiveram sua capacidade funcional de secretar PEDF e se expandir. Os resultados indicaram que não houve diferenças significativas entre os dois grupos em solução de neutralização de enzimas sem HS (G2, G3), em todos os pontos no tempo medidos ou entre esses grupos e o grupo de solução de neutralização de enzimas com HS (61). Exemplo 8

[0311]As composições de células terapêuticas foram analisadas quanto à estabilidade (% de viabilidade e % de recuperação) após a filtração após incubação em temperatura ambiente (RT) e a temperaturas entre cerca de 2 a 8º C, como mostrado na Tabela 9.

Tabela 9. Tempos de Incubação

CM

[0312]As células foram colhidas enzimaticamente (por exemplo, TrypLE Select). A enzima foi neutralizada usando Nutristem (-) (NUTS). Após a filtração sequencial, a suspensão de células filtrada (Grupo de Células) foi dividida em 2 grupos, o 1º grupo (“Células a 2 - 8º C”) foi mantido a cerca de 2 a 8º C e o 2º grupo (“Células RT”) foi mantido em RT. A viabilidade celular e a concentração de células dos 2 grupos foram avaliadas no Tempo O e após 2 horas de incubação.

[0313]Como mostrado na Tabela 10, não houve diferenças significativas na viabilidade celular e na concentração de células entre os grupos de composições de células incubadas pré-criopreservação a cerca de 2 a 8º C ou RT. Da mesma forma, não houve diferenças significativas na porcentagem de recuperação entre os grupos, como mostrado na Figura 22.

Tabela 10. Viabilidade celular e concentração de células após 2 horas de incubação células (n=2) Fosse eee ss [Free [ee | =

[0314]Após 2 horas de incubação, os dois grupos foram centrifugados e ressuspensos na solução de criopreservação, CS5, até uma concentração final de 2 x 108 células / ml. O grupo “Células 2-8º C” foi dividido em 4 subgrupos (células + CM grupos 1-4), que foram incubados a 2-8º C. As células + CM - grupo 1 foram contadas no ponto no tempo O horas quanto à concentração e viabilidade celular e criopreservadas (n = 29 criofrascos). As células + CM - grupo 2 foram contadas após 2 horas de incubação a 2-8º C, as células + CM - grupo 3 foram amostradas após 4 horas e as células + CM - grupo 4 foram contadas 6 horas após a incubação quanto à concentração e viabilidade celular. Nos vários pontos no tempo de incubação, quando a contagem foi concluída, Células + CM - grupos 2-4 foram criopreservadas dividindo-as em alíquotas de 1 ml em cada criofrasco (n = 30, 30 e 29 criofrascos, respectivamente). “Células + CM RT” foram amostradas quanto à viabilidade e concentração de células nos pontos no tempo de 2, 4 e 6 horas. Após 6 horas de incubação, esse grupo também foi criopreservado (n = 22 criofrascos).

Tabela 11. Composição de células terapêuticas em crio-meio: concentração e viabilidade celular em vários momentos.

% de Concentração de Condições Grupo Viabilidade Recuperação células (n=2) Células +CM - grupo R 2,0x106 97 NA 1 (Tempo 0) Células +CM - grupo R 2,30 x 106 95 115 1 (2 horas) 4Fc Células +CM - grupo 2,20 x 106 93 3 (4 horas) Células +CM - grupo 2,30 x 10º 93 115 4 (6 horas) Células +CM RT 2,0x106 94 NA (Time O) Células +CM RT 1,70 x 10º 93 85 Temperatura (2 horas) ambiente (RT) Células +CM RT . 1,78 x 106 91 (4 horas) Células +CM RT 1,73 x 106º 88 (6 horas)

[0315]Como mostrado na Tabela 11 e na Figura 23A e na Figura 23B, não houve diferenças significativas na viabilidade entre as composições de células + crio- meio em RT e as composições de células + crio-meio nos grupos de cerca de 2-8º C,

com uma pequena diminuição na viabilidade celular em todos os grupos ao longo do tempo. Os resultados indicam que a recuperação celular permanece estável em todos os grupos por pelo menos 6 horas em ambas as condições de temperatura, cerca de 2-8º Ce RT, com uma recuperação ligeiramente maior de células incubadas a cerca de 2-8º C, antes do processo de congelamento. As células que foram incubadas em RT mostraram uma redução de 15% na recuperação em 2 horas, no entanto, a recuperação e a viabilidade permaneceram estáveis por pelo menos 6 horas.

Exemplo 9 Dois métodos de descongelamento celular, um compreendendo um banho- maria a cerca de 37º C e o outro compreendendo uma unidade automatizada de descongelamento celular, foram avaliados com base na viabilidade celular, recuperação, esterilidade, potência e identidade, conforme mostrado na Tabela 12.

Tabela 12. Grupos de teste e pontos no tempo de ensaio para análise pós- descongelamento.

Células + CM (RTA) | Dose (células V -% de viabilidade, R - % de recuperação, | - Identidade, P - Potência, S - Esterilidade

[0316]Dois frascos de cada um dos 4 grupos de composições de células terapêuticas RTA foram descongelados simultaneamente; 1 frasco usando uma unidade de descongelamento celular automatizada (por exemplo, um sistema de descongelamento automático ThawSTAR da Sigma-Aldrich) e o segundo usando um banho-maria padrão a cerca de 37º C. Os frascos descongelados foram então colocados em gelo. Cada frasco foi pipetado suavemente e foram colhidas 2 amostras de 20 ul de cada frasco, diluídas em 180 ul de NUTS (-), submetidas a vórtice e contadas. As porcentagens médias de viabilidade e de recuperação foram calculadas para cada frasco descongelado.

[0317]A estabilidade das composições de células terapêuticas RTA em temperatura ambiente pós-descongelamento por até 4 horas foi avaliada analisando- se composições celulares descongeladas quanto à viabilidade, recuperação, esterilidade, potência e identidade. A potência foi determinada por TEER, secreção basal de razão PEDF / VEGF no dia 21 e secreção apical de razão VEGF / PEDF no dia 21. As porcentagens de recuperação foram calculadas com base na concentração final alvo de 2 x 10º ou 5 x 106 células / ml.

[0318]As médias de viabilidade e recuperação das composições de células terapêuticas RTA que foram descongeladas usando uma unidade de descongelamento celular automatizada foram comparáveis àquelas alcançadas usando um banho-maria convencional a cerca de 37º C, em ambas as concentrações de células, como mostrado na Tabela 13.

Tabela 13. Viabilidade e recuperação médias das composições de células terapêuticas RTA descongeladas usando uma unidade de descongelamento celular automatizada vs. descongelamento usando um banho-maria a cerca de 37º C em diferentes concentrações de células.

Concentração de Concentração de % de % de Método de . , células vivas a células (células / . Viabilidade Recuperação descongelamento (células / mL) x , 1a mL) média média 106 o 2x10 2,32 95 117 Banho-maria a (n=2) 37 e = Sx10 4,92 95 (n=2) Unidade de 2x106 2,29 95 116 descongelamento (n=2) celular 5x 10º automatizada - 5,55 is 12 (n=2)

[0319]Conforme mostrado na Tabela 14, a porcentagem de viabilidade média para cada grupo nos pontos no tempo de 0, 2 e 4 horas foi de pelo menos 83%. A porcentagem de recuperação média de todos os grupos testados foi de pelo menos cerca de 78% nos pontos no tempo de 0, 2 e 4 horas. Houve uma ligeira diminuição de cerca de 4% a 10% na viabilidade e até 17% na recuperação de todos os grupos após 2 e 4 horas de incubação em temperatura ambiente. A recuperação média da concentração de 5 x 106º células por mL foi superior à da concentração de 2 x 106º células por mL em todos os pontos no tempo. Tabela 14. Médias de viabilidade e recuperação. % de Células-FCM (RTA) % de Viabilidade ' Ponto no tempo Frasco No. Recuperação Grupo No. média por frasco média por frasco Pr a Grupo 1 a a Lama a Grupo 4 1 93 90 2 Horas Rs EE E Grupo 3

E N SD E E

[0320]A Figura 24A e a Figura 24B são gráficos que mostram a viabilidade e a recuperação das composições de células RTA descongeladas em temperatura ambiente durante um período de incubação de 4 horas. Exemplo 10

[0321]A compatibilidade das composições de células terapêuticas RTA com um dispositivo de entrega foi avaliada. Exemplos de dispositivos de entrega incluem,

entre outros, dispositivos fabricados por Dutch Ophthalmic Research Center (D.O.R.C), compreendendo uma agulha com um diâmetro externo de cerca de 0,63 mm e um diâmetro interno de cerca de 0,53 mm, um capilar com um diâmetro externo de cerca de 0,5 mm e um diâmetro interno de cerca de 0,25 mm, e uma ponta com um diâmetro externo de cerca de 0,12 mm e um diâmetro interno de cerca de 0,07 mm.

As composições de células terapêuticas RTA liberadas pelo dispositivo de entrega compreendendo 4 lotes foram analisadas quanto à viabilidade, recuperação e potência após um período de incubação de 2 horas em RT, pós-descongelamento, usando um sistema de descongelamento automático.

Todas as composições de células RTA foram formuladas como descrito no Exemplo 6, exceto no Grupo 4, no qual não foi aplicada nenhuma etapa de filtração antes da criopreservação.

Os resultados são apresentados na Tabela 15. Tabela 15. Estabilidade da composição de células RTA antes da liberação a partir do dispositivo de entrega Ensaio de Ensaio de Potência Identidade Ponto TEER Razão Razão VEGF no Lote ID % CRALBP/PMEL1 | Líquido PEDF Basal/Apical tempo 7 (92) Apical/Basal (dia 21) (dia 14) (dia 21) Es RR a o ns Grupo 4 NA 333 5,21

[0322]Os valores de CRALBP / PMEL17 (identidade) dos grupos testados (Tabela 15) estavam acima de 98% para todos os lotes testados em todos os pontos no tempo. Os valores líquidos de TEER (dia 14) permaneceram bem acima de 100 Q em todos os grupos. Uma diminuição gradual foi aparente com o passar do tempo, principalmente nos Grupos 1 e 4 após 4 horas. Os lotes do grupo 1 e do grupo 2 foram testados quanto à esterilidade após 4 horas de incubação em temperatura ambiente e não houve crescimento detectado para ambos os lotes.

[0323]A compatibilidade de um dispositivo de entrega para entregar composições de células terapêuticas RTA viáveis e potentes foi avaliada liberando-se composições de células terapêuticas RTA descongeladas, que foram incubadas em RT por 2 horas, dentro do dispositivo de entrega. Os volumes da primeira e da segunda dose foram testados para permitir flexibilidade. As células foram analisadas quanto à viabilidade, recuperação e potência. São mostrados os resultados para as porcentagens de viabilidade e recuperação após serem mantidas em temperatura ambiente por 2 horas antes de as composições de células terapêuticas RTA serem carregadas no dispositivo de entrega.

Tabela 16. Viabilidade e recuperação após 2 horas em RT (dispositivo de pré- entrega).

Ls OR

[0324]A viabilidade de liberação do dispositivo pós-entrega e a porcentagem de recuperação de todos os grupos são apresentadas na Tabela 17. A viabilidade média ficou entre 89% e 95%. A recuperação total média em todos os grupos ficou entre 71% e 94%. Houve uma ligeira diminuição de até 8% na recuperação dos primeiros 100 ul e uma redução de até 16% no segundo volume de 100 ul em comparação com os resultados de recuperação do dispositivo pré-entrega (exceto no Grupo 2, onde a recuperação permaneceu estável).

Tabela 17. Resultado de viabilidade e recuperação celular de liberação do dispositivo pós-entrega.

% de % de % de Conc. Grupo ID Céu Amostra Viabilidade por | Recuperação Recuperação êluias amostra por amostra por frasco Es E O Grupo 1 2x106 ces = [= Grupo 2 5x106 94 100 pyha 90 86 Grupo 3 2x106 84 es o [o es o Grupo 4 5x106 71 estos [+

[0325]O grupo 4 foi formulado sem etapa de filtação antes da criopreservação. Assim, a recuperação reduzida pode estar relacionada a agregados celulares e matrizes extracelulares que residem no dispositivo de entrega.

[0326]Os valores líquidos de TEER de liberação a partir do dispositivo pós- entrega (para o dia 14) são mostrados na Tabela 18. Os valores líquidos de TEER variaram entre cerca de 154 O e cerca de 435 O. Os resultados da razão de PEDF apical / basal (dia 21) e da razão de VEGF apical / apical (dia 21) também são apresentados na Tabela 18.

Tabela 18. Resultados da potência de liberação do dispositivo pós-entrega.

27 TE ETA IRES (dia 14) Apical/Basal (dia 21) Basal/Apical (dia 21) Grupo 1 331 6,70 1,80

[0327]Embora os valores de TEER para as 2 x 106 doses de células dos Grupos 1 e 3 tenham sido ligeiramente superiores aos valores de TEER das 5 x 106 doses de células (Grupos 2 e 4), todos os grupos de amostras de dispositivos pós- entrega testados exibiram atividade biológica, de acordo com os resultados do ensaio de potência.

Exemplo 11

[0328]Os cryoshippers foram carregados com nitrogênio líquido, preparados para o transporte e carregados com os lotes de composições de células terapêuticas RTA criopreservadas descritas no Exemplo 10 (Grupos 1 a 4). Todas as composições de células RTA foram formuladas como descrito no Exemplo 6, exceto no Grupo 4, no qual não foi aplicada nenhuma etapa de filtração antes da criopreservação. As composições de células terapêuticas RTA foram enviadas de Jerusalém, Israel para um biorrpositório americano em Frederick, Maryland, com armazenamento intermediário na fase de vapor de um congelador de nitrogênio líquido e remessa do produto de volta para Jerusalém, Israel. Os envios incluíram transporte aéreo e terrestre de 4 lotes (Grupos 1 a 4) armazenados em um único cryoshipper de fase de vapor e foram realizados por World Courier. O Cryoshipper forneceu as condições de armazenamento necessárias de aproximadamente -196º C a -150º C e foi monitorado por um Registro de Dados interno. Os grupos 1 a 4 foram analisados quanto à aparência, viabilidade, recuperação, potência e esterilidade. Os resultados são apresentados na Tabela 19.

Tabela 19. Aparência, viabilidade, recuperação, potência e esterilidade de composições de células RTA enviadas por cryoshippers.

Ensaio Grupo 1 (2 x 106 Grupo 2 (5 x 106 Grupo 3 (2 x 106 Grupo 4 (5 x 106 células / ml) células / ml) células / ml) células / ml) Suspensão Suspensão Suspensão homogênea de homogênea de homogênea de células opacas, células opacas, células opacas, * Aglomerados Aparência livre de partículas livre de partículas livre de partículas foram estranhas visíveis e | estranhas visíveis | estranhas visíveis e observados agregados não e agregados não agregados não dissociados dissociados dissociados % de 95% 94% 91% 90% Viabilidade (Média) % de 98% 110% 108% 75% Recuperação (Média) TEER (O) (dia 672 522 658 395 14) Razão PEDF 7,73 8,14 7,59 4,89 Apical/Basal (dia 21) Razão VEGF 1,97 2,35 2,26 2,44 Basal/Apical (dia 21) Esterilidade Sem crescimento | Sem crescimento Não testado Não testado aos 14 dias * Os aglomerados foram o resultado da formulação sem filtração antes do procedimento de preenchimento e acabamento.

[0329]Embora a temperatura no cryoshipper tenha atingido abaixo de -196º C, essa temperatura não representa um risco para a integridade e a qualidade da composição de células e está dentro da faixa calibrada dos registros de dados de nitrogênio líquido.

[0330]Os resultados indicam que a estabilidade, a qualidade e a integridade das composições de células RTA criopreservadas formuladas no crio-meio CS5 são mantidas durante o transporte controlado de Jerusalém, Israel para um biorrepositório americano em Frederick, Maryland, com armazenamento intermediário na fase de vapor de um congelador de nitrogênio líquido e remessa do produto de volta para Jerusalém, Israel. Exemplo 12

[0331]JA segurança das composições de células terapêuticas RTA compreendendo células do EPR e solução de criopreservação foi avaliada após injeção subrretiniana em camundongos NOD / SLID. Quarenta (40) camundongos NOD / SLID fêmeas no total com 5 a 9 semanas de idade foram utilizados e divididos em quatro (4) grupos de 4 ou 12 animais em cada grupo (n = 1 ou 3 para cada um dos pontos no tempo de término; 1, 3, 7 e 14 dias após a administração).

[0332] Quatro composições foram avaliadas. O grupo 1 foi administrado com BSS Plus, o grupo 2 foi administrado com crio-meio CS5, o grupo 3 foi administrado com a composição de células terapêuticas RTA (compreendendo células do EPR e CS5), e o grupo 4 foi administrado com células do EPR em BSS Plus, como mostrado na Tabela 20. Tabela 20. Modelo experimental. Grupo No. No. de Tratamento Volume de Concentração Administração Animais Dose (ul / de células camundongo) 1 4 BSS Plus 1u N/A 3 12 RTA (Células + qu! 5 x 10º células / o Subrretiniana CS5) camundongo 4 12 BSS Plus + 1u 5x 10º células / Células camundongo

[0333]Os animais foram observados periodicamente durante as primeiras 24 horas (com atenção especial dada durante as primeiras 4 horas após a administração), e diariamente depois, até o término. Observações realizadas para quaisquer alterações no sítio de injeção local, pele, pelo, olhos, nembranas mucosas, respiratórias, ocorrência de secreções e excreções (por exemplo, diarreia) e atividade autonômica (por exemplo, lacrimação, salivação, piloereção, tamanho da pupila, padrão respiratório incomum). Alterações na marcha, postura e resposta ao manuseio, como a presença de comportamento bizarro, tremores, convulsões, sono e coma também estão incluídos. Não foram observadas anormalidades, sinais tóxicos, condição moribunda e óbitos não programados. O exame dos olhos foi realizado pelo oftalmologista veterinário uma vez durante a aclimatação, e em cada dia de término. Em todos os olhos direitos (não tratados) de todos os grupos, não foram observadas lesões visíveis (NVL).

[0334]No término, os animais foram sacrificados por asfixia com CO? e uma patologia grosseira foi realizada examinando o sítio de injeção local (olhos), incluindo as diferentes estruturas de olhos, principais tecidos e sistemas orgânicos. Os animais foram enucleados, incluindo o nervo óptico, e fixados em solução de Davidson. Todos os olhos foram submetidos a exames histopatológicos.

[0335]A avaliação histopatológica revelou a presença de infiltração de macrófagos em alguns animais tratados com células dos Grupos 3 e 4, nos Dias 3 e 14 (1 de 3 animais em cada dia de término e grupo). Esses achados provavelmente se devem a uma resposta imune tardia à injeção de células do EPR humanas. No entanto, a maioria dos animais nos grupos tratados com células (20/24) não mostrou nenhuma resposta imune às células transplantadas. Nos grupos 1 e 2, que não foram tratados com células, foram observados neutrófilos nos dias 1, 3 e 7 (em 3 animais). Os neutrófilos são comuns nos estágios precoces da resposta imune, enquanto a falta de macrófagos não indica resposta tardia. Exceto pela aparência de macrófagos em alguns camundongos tratados com células (4/24), todos os grupos exibiram patologias semelhantes, indicando que os achados estavam provavelmente relacionados a uma inflamação induzida pelo procedimento. A Figura 25A e a Figura 25B são imagens histológicas representativas com ampliação de x4 e x20, respectivamente, mostrando inflamação leve em um animal tratado com a formulação RTA (células + CS5). Com base nos dados coletados, não houve efeitos importantes relacionados ao tratamento e / ou toxicologicamente significativos após a administração subrretiniana das composições terapêuticas de células em comparação com o veículo após 10 dias de acompanhamento.

Exemplo 13

[0336]Para avaliar a comparabilidade das composições de células do EPR terapêuticas RTA formuladas durante diferentes corridas de fabricação, vários lotes foram preparados. As hESCs foram passadas mecanicamente pelo primeiro descongelamento de pelo menos uma ampola de hESCs. Após o descongelamento, fragmentos recuperados a partir da ampola, foram semeados em duas placas de poço central (CW) contendo uma monocamada de células alimentadoras derivadas de cordão humano irradiadas e incubadas em meio “Nutristem Plus' + HSA (ou equivalente) a 37º C / 5% de CO>2 (1 ampola — 2 CW com 10 fragmentos de colônia).

[0337]As colônias de hESC foram expandidas e passadas uma vez por semana por mais 3 semanas até atingir um total de 45 placas de poços centrais. As colônias foram então transferidas para placas de 6 cm com alimentadores a uma relação de cerca de 2:1 (2 CW — placa de 6 cm) e cultivadas por cerca de 6 dias em meio “NutriStem Plus' + HSA a 37º C / 5% de CO».

[0338]Para formar corpos esferoides (SBs) e iniciar o processo de diferenciação direcionada ao EPR, colônias de hESC foram coletadas a partir das placas de 6 cm e transferidas para as placas (tal como Hydrocell"" (Nunc)) (superfície não aderente) a uma relação de cerca de 5:1 (placa de 5 x 6 cm — placa) e cultivada por cerca de 1 semana em meio “NutriStem Minus' suplementado com Nicotinamida a 37º C / 5% de CO2 / 5% de Oz. Cerca de uma semana após a formação de SB, os SBs foram coletados e decompostos em fragmentos menores por pipetagem. Os fragmentos SB foram semeados em placas de 6 poços revestidas com Laminina 511 (BioLamina, Estocolmo, Suécia) ou equivalente e cultivadas na presença de nicotinamida e activina A (a combinação de nicotinamida e activina A variou de acordo com o estágio de diferenciação) por cerca de 5 semanas em NuriStem Minus ou equivalente a cerca de 37º C / 5% CO>2 / 5% O» e cerca de | semana a 37º C/5% CO». No final do estágio de diferenciação, as células pigmentadas foram enriquecidas enzimaticamente e transferidas para frascos T175 (175 cm?) revestidos com gelatina humana recombinante (PO) e incubados em NutriStem Minus (soro humano / 20% de DMEM nos primeiros 2 a 3 dias) a 37º C / 5% de CO».

[0339]As células podem ser colhidas por volta do dia 14 e passadas para os frascos T175 revestidos com rh-gelatina e incubadas em NutriStem Minus (20% de soro humano / DMEM nos primeiros 2 a 3 dias) a cerca de 37º C / 5% CO2 (P1). As células foram colhidas no dia 12 e passadas para os frascos T175 revestidos com rh- gelatina e incubadas em NutriSstem Minus (20% de soro humano / DMEM nos primeiros 2 a 3 dias) a 37º C / 5% CO» (P2).

[0340]No dia 10 após a passagem P2, os frascos T175 foram colhidos, filtrados usando tandem sequencial do sistema de filtro de células de 500-200-40 um e depois reunidos. O número total de células neste ponto no tempo pode ser pelo menos cerca de 551 x 10º células. As células foram centrifugadas e ressuspensas em crio-meio (tal como o CryoStor 5 (BioLife Solutions Inc., Bothell, WA) por exemplo) e contadas para atingir uma concentração final de cerca de 1 x 106º célula / ml, cerca de 21086 célula / ml, cerca de 3 x 106 célula / ml, cerca de 4 x 10º células / ml, cerca de x 108 células / ml, cerca de 6 x 10º células / ml, cerca de 7 x 10º células / ml, cerca de 8 x 10º células / ml ou cerca de 9 x 106º células / ml. Esta suspensão de células pode ser mantida a 2-8º C até ser dispensada em criofrascos. A composição de células terapêuticas RTA pode então ser criopreservada usando um congelador de taxa controlada e depois transferida para o congelador de LN2 em fase de vapor. Exemplos de perfis de congelamento que podem ser usados incluem: * Aguardar a 4º C

* Manter 1 minuto a 4º C * Amostra de 1,00º C / minuto a -11º C * Câmara de 30,00º C / minuto a -50º C * Câmara de 15,00º C / minuto a -25º C * Câmara de 1,00º C / minuto a -50º C * Câmara de 10,00º C / minuto a -90º C Fim ou * Aguardar a 4º C * Amostra de 1,00º C / minuto a 4º C * Câmara de 25,00º C / minuto a -40º C * Câmara de 10,00º C / minuto a -12º C * Câmara de 1,00º C / minuto a 40º C * Câmara de 10,00º C / minuto a -90º C “Fim

[0341]A Tabela 21 fornece resultados de morfologia e pureza das hESCs à medida que elas são expandidas, diferenciadas em células do EPR e expandidas como células do EPR. Conforme mostrado na Tabela 21, as hnESCs foram expandidas e diferenciadas com sucesso usando o processo descrito acima. Tabela 21. Análise de células durante as fases de expansão e diferenciação para o lote A RTA Etapa Teste Resultado (TRA-1-60+/OCT4+) Isolamento enzimático

Fim de PO (início de expansão | Pureza (CRALBP+/PMEL17+) 88,95% de EPR) Fim de P1 (meio da expansão | Pureza (CRALBP+/PMEL17+) 98,85% do EPR) Impurezas de hESC (TRA-1-/0,00000%BLOD 60+/OCT4+) Fim de P2 (fim de expansão do | Avaliação de morfologia Confluente e poligonal EPR) Pureza (CRALBP+/PMEL17+) 98,37%

[0342] Além disso, a porcentagem de viabilidade, a concentração de células, a porcentagem de recuperação, e a pureza foram determinadas para o lote À. Os resultados são apresentados na Tabela 22. Tabela 22. Porcentagem de viabilidade, concentração de células, porcentagem de recuperação e pureza para o Lote A RTA Teste Resultado Viabilidade + S.E 95% + 0,97% Células Totais /1 mL + S.E 2,36 x 10º + 5,86 x 10º % de Recuperação + S.E 118% + 2,93% Pureza (CRALBP+/PMEL17+) 98,74% Impurezas de hESC (TRA-1- 60+/OCT4+) 0,00000% BLOD

[0343]Lotes adicionais foram produzidos e analisados conforme descrito para o Lote A. A dose de célula para cada Lote é mostrada na Tabela 23. Tabela 23. Doses de células para cada lote

[0344]Os resultados para os lotes B-F são apresentados na Tabela 24 e na Tabela 25. Tabela 24. Morfologia, esterilidade e pureza para os lotes B-F Fim da expansão de hESCs Avaliação de morfologia

Análise de marcadores pluripotentes | 78,30% Fim de P2 (fim da expansão do | Avaliação de morfologia Confluente e LL are am Fr Fa Lote E Sem crescimento Po Lote F Sem crescimento Fe Fe Fa

E Fo Fe

FA

E * Composição de células testada Tabela 25. Porcentagem de viabilidade, concentração de células, porcentagem de recuperação, pureza, esterilidade, secreção de PEDF e secreção de VEGF para Lotes B-F Lote ID Teste Resultado Lote C 95% + 0,37% Lote D Porcentagem de viabilidade + SE Lote E 97% + 0,22% Lote F 96% + 0,25%

Lote F 5,81 x 108 + 6,90 x 104 Lote D Porcentagem de recuperação + SE Lote E 109% + 3,89% Lote F 112% + 1,44% Lote D Pureza (CRALBP+/PMEL17+) Lote F 99,40% Lote B Impurezas de hESC (TRA-1-60+/OCT4+) Não detectado Lote D Esterilidade Lote E Sem crescimento Lote F Sem crescimento Secreção de PEDF (ng / ml / dia) - Dia 7 Lote B Secreção de VEGF (ng / ml / dia) - Dia 7 Secreção de PEDF (ng / ml / dia) — Dia 14 Secreção de VEGF (ng / ml / dia) — Dia 14 5,90 Secreção de PEDF (ng / ml / dia) - Dia 7 Lote Secreção de VEGF (ng / ml / dia) — Dia 7 Secreção de PEDF (ng / ml / dia) — Dia 14 Secreção de VEGF (ng / ml / dia) — Dia 14 Secreção de PEDF (ng / ml / dia) - Dia 7 Lote D Secreção de VEGF (ng / ml / dia) - Dia 7 Secreção de PEDF (ng / ml / dia) — Dia 14 Secreção de VEGF (ng / ml / dia) — Dia 14 Secreção de PEDF (ng / ml / dia) - Dia 7 Lote E Secreção de VEGF (ng / ml / dia) — Dia 7 Secreção de PEDF (ng / ml / dia) - Dia 14 2117 Secreção de VEGF (ng / ml / dia) — Dia 14 5,20

Secreção de VEGF (ng / ml / dia) — Dia 7 Secreção de PEDF (ng / ml / dia) — Dia 14 | EBETISC O

[0345] Como mostrado na Tabela 24 e na Tabela 25, o método de formulação das composições de células do EPR terapêuticas RTA é reproduzível e robusto em relação à morfologia celular, esterilidade, pureza, porcentagem de viabilidade, concentração de células, porcentagem de recuperação, secreção de PEDF e secreção de VEGF (potência).

[0346]Embora a descrição contida aqui contenha muitos detalhes, estes não devem ser interpretados como limitando o escopo da descrição, mas apenas como ilustrações de algumas das modalidades atualmente preferenciais. Portanto, será apreciado que o escopo da descrição engloba totalmente outras modalidades que podem se tornar óbvias para os versados na técnica.

[0347]Nas reivindicações, a referência a um elemento no singular não significa “um e apenas um”, a menos que seja explicitamente indicado, mas sim “um ou mais”. Todos os equivalentes estruturais, químicos e funcionais aos elementos das modalidades descritas que são conhecidos dos versados na técnica são expressamente incorporados aqui por referência e devem ser abrangidos pelas presentes reivindicações. Além disso, nenhum elemento, componente ou etapa do método na presente descrição se destina a ser dedicado ao público, independentemente de o elemento, componente ou etapa do método ser explicitamente citado nas reivindicações. Nenhum elemento de reivindicação neste documento deve ser interpretado como um elemento “meio mais função”, a menos que o elemento seja expressamente citado usando a frase “meio para”. Nenhum elemento de reivindicação neste documento deve ser interpretado como um elemento “etapa mais função”, a menos que o elemento seja expressamente citado usando a frase “etapa para”.

Claims (43)

UT REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma composição compreendendo um meio de preservação de células que compreende: um nucleosídeo de purina, um glucano ramiíficado, um agente tampão químico orgânico zwitteriônico e um solvente aprótico polar tolerável por células e células do epitélio pigmentar da retina (EPR), CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma condição retiniana em um indivíduo em necessidade do mesmo.

2. Método para formular células de epitélio pigmentar da retina (EPR) humano para administração a um indivíduo diretamente após o descongelamento, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) suspender as células do EPR para formar uma suspensão de células em um meio de preservação celular compreendendo: um nucleosídeo de purina, um glucano ramificado, um agente tampão químico orgânico zwitteriônico e um solvente aprótico polar tolerável por células; (b) armazenar a suspensão de células a uma temperatura de criopreservação; e (c) descongelar a suspensão de células criopreservada.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as células demonstram um ou mais dos seguintes itens após o descongelamento: uma função de barreira TEER de cerca de 100 OQ a cerca de 1300 O; uma razão de PEDF superior para inferior de cerca de 3,5 a cerca de 9,4; uma razão de VEGF inferior para superior de cerca de 1,2 a cerca de 5; ou uma pureza de cerca de 95% a cerca de 100%.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de EPR é formulada para ser administrada de forma subrretiniana.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de EPR é formulada para ser administrada usando um dispositivo de entrega.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dispositivo de entrega compreende uma agulha, um capilar e uma ponta.

7. Uso, de acordo a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é formulada para ser administrada na retina.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de células é formulada para ser administrada por uma injeção supracoroidal.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as células secretam um ou mais de fatores de crescimento de fibroblastos (DFGF e aFGF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) ou uma ou mais citocinas anti-inflamatórias.

10. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição do meio compreende adenosina, dextran-40, ácido lactobiônico, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetil sulfóxido (DMSO) e água.

11. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que antes da etapa (a) as células do EPR são derivadas por diferenciação de células pluripotentes em uma população de células compreendendo células do EPR, coletando enzimaticamente as células do EPR com uma ezima, e neutralizando a enzima com um agente neutralizante, em que o agente neutralizante não compreende soro humano.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que as células do EPR são armazenadas no agente neutralizante por cerca de 1 a cerca de 8 horas e em que a viabilidade não diminui em mais de cerca de 10%.

13. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as células do EPR são suspensas na composição do meio por cerca de 3 horas antes da criopreservação, em que a porcentagem de viabilidade pós- descongelamento não diminui em mais de cerca de 10%, em que a porcentagem de rendimento pós-descongelamento não diminui em mais de 20%, e em que a vitalidade pós-descongelamento não diminui em mais de 10% em comparação com as células do EPR suspensas no meio por menos de 1 hora.

14. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as células do EPR são suspensas na composição do meio por cerca de 3 horas antes da criopreservação, em que a função da barreira pós-descongelamento não diminui, em que a razão de PEDF superior para inferior pós-descongelamento não diminui em mais de 10%, e em que a razão de VEGF inferior para superior após o descongelamento não diminui em comparação com as células do EPR suspensas no meio por menos de 1 hora.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda: filtrar sequencialmente as células do EPR após a etapa (c), em que a porcentagem de viabilidade é de pelo menos 98%.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda: filtrar sequencialmente as células do EPR após a etapa neutralizante e incubar as células do EPR na composição do meio por cerca de 2 a 4 horas, em que a porcentagem de recuperação está entre cerca de 80% e cerca de 295%.

17. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) um meio de preservação de células que compreende: um nucleosídeo de purina, um glucano ramiíficado, um agente tampão químico orgânico zwitteriônico, e um solvente aprótico polar tolerável por células; e

(b) células do EPR.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um ou mais de: um ácido de açúcar, uma ou mais de uma base, um antioxidante, um ou mais sais haleto, um sal básico, sal fosfato, um ou mais açúcares, álcool de açúcar, e água.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido de açúcar compreende ácido lactobiônico, ácido glicérico, ácido xilônico, ácido glucônico, ácido ascórbico, ácido neuramínico, ácido cetodesoxioctulosônico, ácido glucurônico, ácido galacturônico, ácido idurônico, ácido tartárico, ácido múcico, ou ácido sacárico.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que uma ou mais de uma base compreende hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o antioxidante compreende L-glutationa, ácido ascórbico, ácido lipoico, ácido úrico, um caroteno, alfa-tocoferol, ou ubiquinol.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que um ou mais sais haleto compreende cloreto de potássio, cloreto de sódio ou cloreto de magnésio.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o sal básico compreende bicarbonato de potássio, bicarbonato de sódio, ou acetato de sódio.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o sal fosfato compreende fosfato de potássio, fosfato de sódio, ou fosfato de potássio.

25. Composição, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais açúcares compreende dextrose, sacarose.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o álcool de açúcar compreende manitol, sorbitol, eritritol ou xilitol.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um ou mais inibidores de ROCK ou NA.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o nucleosídeo purina é adenosina.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o glucano ramificado é dextran-40.

30. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente tampão químico orgânico zwitteriônico é N-(2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico) (HEPES).

31. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o solvente aprótico polar tolerável por células é dimetilsulfóxido (DMSO).

32. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita condição retiniana é selecionada a partir de um ou mais de, retardar a progressão da doença degenerativa da retina, retardar a progressão da degeneração macular relacionada à idade (AMD), prevenir a doença degenerativa da retina, prevenir a AMD, restaurar o epitélio pigmentar da retina (EPR), aumentar o EPR, substituir o RPE ou tratar defeitos do RPE.

33. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita composição compreende: adenosina, dextran-40, ácido lactobiônico, HEPES (N-(2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico)), hidróxido de sódio, L-glutationa, cloreto de potássio, bicarbonato de potássio, fosfato de potássio, dextrose, sacarose, manitol, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, dimetilsulfóxido (DMSO), água e células do epitélio pigmentar da retina (EPR).

34. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o nucleosídeo purina é adenosina.

35. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o glucano ramificado é dextran-40.

36. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente tampão químico orgânico zwitteriônico é N-(2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico) (HEPES).

37. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos cerca de 40% a cerca de 100% das células estão viáveis após o descongelamento.

38. Composição, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o nucleosídeo purina é adenosina.

39. Composição, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o glucano ramiíficado é dextran-40.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o agente tampão químico orgânico zwitteriônico é N-(2-hidroxietil) piperazina-N'- (ácido 2-etanossulfônico) (HEPES).

41. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as células secretam um ou mais de fatores de crescimento de fibroblastos (bFGF e aFGF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) ou uma ou mais citocinas anti-inflamatórias.

42. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as células do EPR expressam um ou mais de bestrofina 1, fator de transcrição associado à microftalmia (MITF), ZO-1, gene da caixa pareada 6 (PAX-6), proteína de ligação a retinaldeído celular (CRALBP), antígeno específico da linhagem de melanócitos GP100 (PMEL 17), RPE65 e marcadores para os cílios primários do EPR.

43. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de

TIT que as células do EPR expressam um ou mais de bestrofina 1, fator de transcrição associado à microftalmia (MITF), ZO-1, gene da caixa pareada 6 (PAX-6), proteína de ligação a retinaldeído celular (CRALBP), antígeno específico da linhagem de melanócitos GP100 (PMEL 17), RPE65 e marcadores para os cílios primários do EPR.

44, Composição, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que as células do EPR expressam um ou mais de bestrofina 1, fator de transcrição associado à microftalmia (MITF), ZO-1, gene da caixa pareada 6 (PAX-6), proteína de ligação a retinaldeído celular (CRALBP), antígeno específico da linhagem de melanócitos GP100 (PMEL 17), RPE65 e marcadores para os cílios primários do EPR.