TW202303145A - 治療視網膜疾病及病況之方法及組成物 - Google Patents

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加里 霍格
喬帝 蒙內斯
阿維 本 莎貝特
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拉維德 蒂科茨基
尼曼 德娜 海揚
奧弗 懷什
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美商譜系細胞治療公司
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Abstract

本文提供治療包括諸如黃斑部病變之視網膜病況的眼睛疾病及病症之方法、物質組成物及裝置。

Description

治療視網膜疾病及病況之方法及組成物
本文提供治療包括諸如黃斑部病變之視網膜病況的眼睛疾病及病症之方法、物質組成物及裝置。
本揭露一般涉及治療視網膜疾病的領域，且更具體地涉及使用人胚胎幹細胞衍生的視網膜色素上皮 (RPE) 細胞組成物治療視網膜疾病。
RPE 細胞之功能障礙、退化及喪失是視網膜疾病的顯著特徵，諸如 AMD、斯特格氏病 (Stargardt’s Disease)、貝斯氏特病 (Best Disease) 及色素性視網膜炎 (RP) 的亞型。AMD 是西方世界視覺障礙的主要原因。在 75 歲以上的人群中，25-30% 的人患有年齡相關性黃斑部病變 (AMD)，其中 6-8% 的患者會出現進行性中心視力喪失，導致失明。AMD 涉及諸如衰老、吸煙及補體多態性等多種病因危險因素，其病理生理根源可歸納為 RPE 老化、氧化壓力、亞炎症、布魯赫膜 (Bruch's membrane) 老化及脈絡膜缺血，它們單獨或共同引發視網膜健康的代謝退化。視網膜退化主要涉及黃斑，黃斑是視網膜的中心部分，負責精細的視覺細節、顏色感知、面部識別、閱讀及駕駛。晚期 AMD有兩種形式：濕性或滲出性 AMD 及萎縮性 AMD。乾性或中度 AMD 是 AMD 的最常見形式，約佔病例的 85-90%。濕性 AMD 是兩種晚期類型中較不常見的類型，約佔病例的 10-15%。AMD 的乾性形式是由 RPE 官能障礙及 RPE 下方或上方或由代謝終產物組成的布魯赫膜內形成玻璃膜疣沉積物引發。該疾病將逐漸進展至大面積黃斑上的 RPE 細胞及感光受體退化並最終導致細胞死亡的地圖狀萎縮 (GA) 的晚期階段，從而導致中心視力喪失。此外，退化 RPE 會影響由內部屏障及外部屏障構成的血液-視網膜屏障 (BRB)。外部 BRB 是指在視網膜色素上皮細胞層與布魯赫膜一起形成的屏障，其調節自脈絡膜至視網膜下腔的溶質及營養物質。外部 BRB 在維持感光受體之解剖學及功能完整性方面起著至關重要的作用，尤其是在身體中進行最高氧代謝活性的黃斑區域內。hRPE 細胞療法之主要目標是替代損失或受損的宿主 RPE，並提供功能性、活性及存活的 RPE 以支持感光受體。
該疾病之發病機制涉及四種功能相關組織，即視網膜色素上皮 (RPE)、布魯赫膜、脈絡膜毛細血管及感光受體的異常。然而，RPE 細胞功能之損傷是導致臨床相關 AMD 變化的分子途徑中之早期及關鍵事件。
乾性老年性黃斑部病變 (AMD) 至萎縮性 AMD 或地圖狀萎縮之晚期形式是發達國家成人失明的主要原因。幾乎所有濕性 AMD 病例均以乾性 AMD 開始。乾性 AMD 通常會影響雙眼。目前沒有美國食品藥品管理局 (FDA) 或歐洲藥品管理局 (EMA) 批准的可用於乾性 AMD 患者的治療選擇。預防措施包括維生素/礦物質補充劑。該等措施降低發展為濕性 AMD 的風險，但不影響地圖狀萎縮進展之發展。濕性 AMD 是一種避免萎縮性 AMD 的修復反應。遺憾的是，在大多數情況下，其為一種過度的反應，並導致滲出、炎症及結疤，隨後在相對較短的時間內視力喪失。用抗血管內皮生長因子 (VEGF) 藥物進行適當的治療可控制滲出及其相關危害，防止結疤並允許此等眼睛歷經逐漸進入萎縮的自然過程。因此，大多數成功治療的滲出性 AMD 的眼睛最終會發展為萎縮性 AMD。
本文的實施例一般涉及用於治療包括諸如黃斑部病變的視網膜病況的眼部疾病及病症之方法、物質組成物及裝置。
在一個態樣中，本揭露提供一種用於在移植視網膜色素上皮 (RPE) 細胞後評估個體視網膜中視網膜萎縮區域進展之方法，該方法包含 a) 在第一時間點在視網膜外界膜 (ELM) 邊界內定義地圖狀萎縮或完全 RPE 及外視網膜萎縮 (cRORA) 之區域；b) 使用光學同調斷層掃描 (OCT) 標記及測量 ELM 邊界或 ELM 邊界下降，其中 ELM 邊界是萎縮的界線，且 ELM 邊界下降是藉由組織學對具有近乎總感光受體耗盡的區域的劃界；c) 計算包括在 ELM 邊界內的面積以定義第一計算面積，以及 d) 確定第一計算面積之平方根轉換 (SQRT)；及藉由將第一計算面積之 SQRT 與對照進行比較來定義萎縮的進展速率。
在一些實施例中，該方法可進一步包含在第二時間點重複步驟 a) 至 c) 以確定第二計算面積之 SQRT，其中對照是第二計算面積之 SQRT。
在一些實施例中，對照是視網膜的歷史進展速率。在一些實施例中，對照是對照視網膜的進展速率。在一些實施方案中，對照視網膜是個體之未經治療之視網膜。
在一些實施例中，ELM 邊界的測量及第一計算面積的計算是手動執行的。在一些實施例中，ELM 邊界的測量由 OCT 設備藉由獨立演算法自動執行。在一些實施例中，使用人工智慧來執行 ELM 邊界的測量及計算，用於自動偵測特定層的面積及體積偵測以及生長預測。
在一些實施例中，根據萎縮分類會議 (CAM) 研究組共識分類，該萎縮是不完全 RPE 及外視網膜萎縮 (iRORA)。
在一些實施例中，視網膜萎縮區域的進展係以 mm 2及藉由 SQRT 兩者來測量。
在一些實施例中，該方法之步驟 a) 至 c) 在第三時間點執行。
在一些實施例中，第一時間點、第二時間點及第三時間點分別為移植後約 12 個月、約 24 個月及約 36 個月。
在一些實施例中，歷史進展速率是根據關於萎縮區域的歷史資料並使用 SQRT 線性生長計算來預測任何未來時間點的萎縮區域的理論大小，從而預測歷史進展速率。
在一些實施例中，用於比較地圖狀萎縮生長速率的對照組係同一隻眼睛生長的理論預測。
在一些實施例中，使用 mm 2及 SQRT 兩者在個體之經治療的眼睛與對側眼之間執行萎縮區域的比較。在一些實施例中，以 mm 2執行計算。
在一些實施例中，對複數隻眼睛執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，第一時間點是在 RPE 細胞移植之前。在一些實施例中，第一時間點是在 RPE 細胞移植時。在一些實施例中，第一時間點是在 RPE 細胞移植之後。
在另一態樣中，本揭露提供一種用於評估萎縮區域內的區域中視網膜的恢復或再生之方法，該方法包含 a) 定義及使用 OCT 生物標記作為任何視網膜層的界線；b) 使用 OCT 標記及測量任何視網膜層的邊界；c) 計算特定視網膜層的長度/寬度及體積；d) 藉由比較步驟 (a)-(c) 中計算的 ELM 面積來定義恢復或再生的程度；以及 e) 偵測新出現的 ELM 面積。
在一些實施例中，視網膜層是 ONL 並且該方法偵測新出現的 ONL 面積。在一些實施例中，視網膜層是 OPL 並且該方法偵測新出現的 OPL 面積。在一些實施例中，視網膜層是橢圓體帶並且該方法偵測橢圓體帶之新出現的區域。在一些實施例中，視網膜層是感光受體並且該方法偵測新出現的感光受體區域。
在一些實施例中，視網膜層是RPE細胞層並且該方法偵測新出現的 RPE 面積。
在一些實施例中，組合計算視網膜層。
在一些實施例中，OCT 檢查在約 12 個月、約 24 個月及約 36 個月時執行。
在一些實施例中，視網膜層之比較在同一隻眼睛上執行。在一些實施例中，萎縮區域之比較在經治療的眼睛與對側眼之間執行。在一些實施例中，萎縮區域之比較在經治療的眼睛及對照眼睛之間執行。
在一些實施例中，對複數隻眼睛執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，RPE恢復區域是當 ELM、ONL 及 OPL 均存在時。
在又一態樣中，本揭露提供一種用於評估臨床改善之方法，其中該臨床改善係選自由以下所組成之群組：有或無電腦輔助之 BCVA 正常光線及低光線、微視野檢查 (microperimetry)、閱讀速度、有或無電腦輔助的顏色測試、閃爍測試、錐體細胞靈敏度及視桿細胞靈敏度。
在一些實施例中，視網膜萎縮區域是晚期地圖狀萎縮、早期地圖狀萎縮、高風險 AMD 或中晚期 AMD。
在一個態樣中，本揭露提供一種治療視網膜疾病或病症或減緩其進展之方法，該方法包含向有需要之個體投予細胞治療劑，其中該細胞治療劑包含視網膜色素上皮 (RPE) 細胞，並且其中 RPE 細胞恢復個體視網膜之解剖學或功能。
在一些實施例中，RPE 細胞衍生自多能細胞。在一些實施例中，RPE 細胞為 人類 RPE 細胞。在一些實施例中，RPE 細胞衍生自人胚胎 (hESC) 細胞系。在一些實施例中，RPE 細胞衍生自來自患者自身、其他供體患者或來自 iPSC 的 HLA-庫的人類誘導多能幹細胞 (hiPSC)。
在一些實施例中，RPE 細胞係在補充有高濃度活化素 A、轉化生長因子 β (TGF-b) 家族成員及菸鹼醯胺的低氧 (5%) 培養下衍生，之後轉換到正常氧 (20%) 培養以富集 RPE 群體。
在一些實施例中，RPE 細胞以約 2000 ng/ml/天至約 4000 ng/ml/天的濃度分泌 PEDF。
在一些實施例中，將細胞治療劑投予患者之萎縮性視網膜區域或與萎縮性視網膜區域相鄰之區域。
在一些實施例中，細胞治療劑以約 50,000 個細胞至約 1,000,000 個細胞的劑量投予。在一些實施例中，細胞治療劑以約 100,000 個細胞至約 750,000 個細胞的劑量投予。在一些實施例中，細胞治療劑以約 200,000 個細胞至約 500,000 個細胞的劑量投予。
在一些實施例中，細胞治療劑的投予減少個體萎縮性視網膜中的萎縮區域。
在一些實施例中，細胞治療劑的投予恢復視網膜的一個或多個視網膜層。
在一些實施例中，細胞治療劑的投予恢復視網膜中感光受體的功能。
在一些實施例中，細胞治療劑的投予恢復視網膜的外核層 (ONL)。
在一些實施例中，細胞治療劑的投予恢復視網膜的橢圓體帶 (EZ)。
在一些實施例中，細胞治療劑的投予恢復視網膜的中央凹。
在一些實施例中，細胞治療劑的投予恢復視網膜的血液-視網膜屏障 (BRB)。
在一些實施例中，細胞治療劑的投予重塑視網膜的細胞外基質 (ECM)。
在一些實施例中，視網膜解剖學或功能的恢復藉由評估地圖狀萎縮的生長減少、視敏度提高、閱讀速度提高、視網膜結構改善、玻璃膜疣減少或細胞的穩定植入中的一項或多項來確定。
在一些實施例中，改善係藉由微視野檢查來測量。
在一些實施例中，個體的視力藉由治療得到改善，並且改善的視力藉由以下一項或多項來評估：GA 病變之總面積的變化；單眼閱讀速度的變化；功能性閱讀獨立指數(FRII)綜合評分的變化；正常亮度最佳矯正視敏度評分 (NL-BCVA) 的變化；低亮度最佳矯正視敏度評分 (LL-BCVA) 的變化；低亮度不足 (LLD) 的變化；單眼臨界文字尺寸 (critical print size) 的變化；國家眼科研究所視覺功能問卷 25 項版本 (NEI VFQ-25) 距離活動分量表評分的變化；暗點數量的變化；黃斑敏感性的變化；色覺測試的變化，以及 APL-2 全身性血漿濃度的變化。
在一些實施例中，該方法導致植入細胞排斥的最小或不具延遲炎症。
在一些實施例中，投予包含將 RPE 細胞遞送至視網膜區域或與視網膜相鄰的區域。在一些實施例中，遞送包含將 RPE 細胞植入視網膜區域或與視網膜相鄰的區域。
在一些實施例中，治療包含 RPE 細胞的多能分泌作用。
在一些實施例中，個體患有選自乾性或萎縮性 AMD、色素性視網膜炎、尤塞氏綜合症 (usher syndrome)、卵黃樣黃斑部病變、斯特格病 (Stargardt disease)、視網膜脫離、視網膜發育不良、視網膜萎縮、視網膜病變、黃斑失養症、視錐細胞失養症、視錐-視桿細胞失養症、馬拉蒂亞萊維登病 (Malattia Leventinese)、多因蜂窩失養症 (Doyne honeycomb dystrophy)、索斯比失養症 (Sorsby's dystrophy)、圖案/蝴蝶失養症、貝斯特卵黃樣失養症 (Best vitelliform dystrophy)、北卡羅來納失養症 (North Carolina dystrophy)、中央暈輪狀脈絡膜失養症、血管狀痕、毒性黃斑部病變、病理性近視及黃斑部病變的視網膜疾病狀況。
在一些實施例中，細胞治療劑與遞送裝置一起投予。
在一些實施例中，使用遞送裝置將細胞治療劑投予至或鄰近視網膜的地圖狀萎縮。
在一些實施例中，遞送裝置包含針、毛細管及尖端。在一些實施例中，遞送裝置包含具有約 0.63 mm 外徑及約 0.53 mm 內徑的針、具有約 0.5 mm 外徑及約 0.25 mm 內徑的毛細管以及具有約 0.12 mm 外徑及約 0.07 mm 內徑的尖端。
在另一態樣中，本揭露提供用於本文所描述之方法中之任一者的遞送裝置。
在一些實施例中，遞送裝置包含針、毛細管及尖端。
在一些實施例中，該裝置包含具有約 0.63 mm 外徑及約 0.53 mm 內徑的針、具有約 0.5 mm 外徑及約 0.25 mm 內徑的毛細管、以及具有約 0.12 mm 外徑及約 0.07 mm 內徑的尖端。
在又一態樣中，本揭露提供一種組成物，其包含根據本揭露的用於恢復個體視網膜的解剖學或功能的細胞治療劑。
在一些實施例中，新 RPE 的區域將藉由 IR 成像的變化定義為新的淺灰色脫色區域。
在一些實施例中，本揭露提供一種用於評估視網膜色素上皮 (RPE) 細胞移植後視網膜中視網膜萎縮區域進展之方法。該方法可包含在視網膜的外界膜 (ELM) 邊界內定義地圖狀萎縮或完全 RPE 及外視網膜萎縮 (cRORA) 之區域；使用光學同調斷層掃描 (OCT) 將 ELM 邊界定義為萎縮的界線，其中 ELM 邊界經組織學接受為具有近乎總感光受體耗盡的區域的劃界；在每次檢查中使用 OCT 標記及測量 ELM 邊界或 ELM 下降；計算檢查中包括在 ELM 邊界內的面積 (例如，以 mm 2為單位)，並利用計算面積的平方根轉換 (SQRT) 來評估與眼睛本身相比或與對照眼睛相比隨時間的變化；並且藉由比較使用 OCT 及 ELM 邊界作為邊界的兩個或兩個以上不同檢查之間計算的萎縮區域來定義萎縮的進展速率。
在一些實施例中，萎縮區域可由保留的 ONL 的邊界或區域定義
在一些實施例中，萎縮區域可由保留的 OPL 的邊界或區域定義
在一些實施例中，萎縮區域可由保留的 RPE 的邊界或區域定義
在一些實施例中，萎縮區域可由保留的 ONL、ELM、OPL 及 RPE 的任何或所有邊界或區域的組合來定義
在一些實施例中，該方法可包含手動測量及計算 ELM 邊界及邊界內的面積。
在一些實施例中，ELM 邊界的測量及計算由 OCT 設備藉由獨立演算法自動執行，並且視情況使用人工智慧進行自動偵測、特定層的面積及體積偵測以及生長預測。
在一些實施例中，根據萎縮分類會議 (CAM) 研究組共識分類，萎縮可為不完全RPE及外視網膜萎縮 (iRORA)。
在一些實施例中，萎縮區域的變化以 mm 2為單位並藉由 SQRT 測量。
在一些實施例中，檢查各自在約 12 個月、約 18 個月、約 24 個月及約 36 個月執行。
在一些實施例中，可以使用根據關於萎縮區域的歷史資料的預測生長及使用 SQRT 線性生長計算來預測在任何未來時間點的萎縮區域的理論大小，對同一隻眼睛執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，用於比較地圖狀萎縮生長速率的對照組係同一隻眼睛生長的理論預測。
在一些實施例中，可使用 mm 2及 SQRT 在經治療的眼睛與對側眼之間執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，可使用 mm 2及 SQRT 在經治療的眼睛與對照眼睛之間執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，對複數隻眼睛執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，第一時間點可在 RPE 細胞移植之前。在一些實施例中，第一時間點可在 RPE 細胞移植時。在一些實施例中，第一時間點可在 RPE 細胞移植之後。
在一些實施例中，移植前的時間可變化以涵蓋許多時間點，範圍為一至數天、數週或數年。在一些實施例中，移植後的時間可變化以涵蓋許多時間點，範圍為一至數天、數週或數年。
在一些實施例中，第二時間點在第一時間點之後。因此，第二時間點可在第一時間點之後的一週至 10 年的任何時間。在一些實施例中，第二時間點可為 RPE 細胞移植後一週至 10 年之間的任何時間。
在一些實施例中，本揭露提供一種用於評估萎縮區域內的區域中視網膜的恢復或再生之方法，該方法包含使用 OCT 及視情況使用人工智慧的一種或多種獨立演算法，用於自動偵測特定層的面積及體積檢測以及生長或動力學的預測。評估恢復或再生可藉由對視網膜的一項或多項檢查來執行，該方法包含定義及使用 OCT 生物標記作為任何視網膜層的界線；使用 OCT 標記並測量任何視網膜層的邊界；計算特定視網膜層的長度/寬度及體積；藉由比較自步驟 (a)-(c) 計算的 ELM 面積來定義恢復或再生的程度；以及偵測新出現的 ELM 面積。
在一些實施例中，視網膜層是 ONL 並且該方法偵測新出現的 ONL 面積。在一些實施例中，視網膜層是 OPL 並且該方法偵測新出現的 OPL 面積。在一些實施例中，視網膜層是橢圓體帶並且該方法偵測橢圓體帶之新出現的區域。在一些實施例中，視網膜層是感光受體並且該方法偵測新出現的感光受體區域。在一些實施例中，視網膜層是RPE細胞層並且該方法偵測新出現的 RPE 面積。
在一些實施例中，組合計算視網膜層。
在一些實施例中，OCT 檢查在約 12 個月、約 18 個月、約 24 個月或約 36 個月執行。
在一些實施例中，視網膜層之比較在同一隻眼睛上執行。在一些實施例中，萎縮區域之比較在經治療的眼睛與對側眼之間執行。在一些實施例中，萎縮區域之比較在經治療的眼睛及對照眼睛之間執行。在一些實施例中，對複數隻眼睛執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，RPE 恢復的區域包括當 ELM、ONL 及 OPL 均存在時。
在一些實施例中，本揭露提供一種藉由以下方式來評估臨床改善之方法：在視網膜的外界膜 (ELM) 邊界內定義地圖狀萎縮或完全 RPE 及外視網膜萎縮 (cRORA) 的區域；使用光學同調斷層掃描 (OCT) 將 ELM 邊界定義為萎縮的界線，其中 ELM 邊界下降或 ELM 邊界經組織學接受為具有近乎總感光受體耗盡的區域的劃界；在每次檢查中使用 OCT 標記及測量 ELM 邊界或 ELM 下降；計算檢查中包括在 ELM 邊界內的面積 (例如，以 mm 2為單位)，並利用計算面積的平方根轉換 (SQRT) 來評估與眼睛本身相比或與對照眼睛相比隨時間的變化；並且藉由比較使用 OCT 及 ELM 邊界作為邊界的兩個或兩個以上不同檢查之間計算的萎縮區域來定義萎縮的進展速率。
在一些實施例中，本揭露提供一種藉由以下方式來評估臨床改善之方法：定義及使用OCT生物標誌物作為任何視網膜層的界線；使用 OCT 標記並測量任何視網膜層的邊界；計算特定視網膜層的長度/寬度及體積；藉由比較自步驟 (a)-(c) 計算的 ELM 面積來定義恢復或再生的程度；以及偵測新出現的 ELM 面積。
在一些實施例中，臨床改善係選自有或無電腦輔助之BCVA正常光線及低光線、微視野檢查、閱讀速度、有或無電腦輔助的顏色測試、閃爍測試、錐體細胞靈敏度及視桿細胞靈敏度。
在一些實施例中，視網膜萎縮區域是晚期地圖狀萎縮、早期地圖狀萎縮、高風險 AMD 或中晚期 AMD。
視網膜色素上皮 (RPE) 是神經上皮衍生之色素細胞的單層，其位於感光受體外段 (POS) 與脈絡膜脈管系統之間的布魯赫膜上。RPE 單層對感光受體的功能及健康至關重要。視網膜色素上皮 (RPE) 細胞子功能障礙、損傷及喪失是某些眼部疾病及病症的顯著特徵，諸如老年性黃斑部病變 (AMD)、遺傳性黃斑部病變，包括斯特格氏病、貝斯氏特病 (卵黃樣黃斑失養症的早期發病形式) 及色素性視網膜炎 (RP) 的亞型。將 RPE 移植至受該等疾病影響之人的視網膜中，可以用作 RPE 已退化的視網膜疾病的細胞置換療法。
人類多能幹細胞作為用於移植的 RPE 細胞來源具有顯著優勢。其多能發育潛力使其能夠分化成真正的功能性 RPE 細胞，並且鑑於其具有無限自我更新的潛力，其可以用作 RPE 細胞的無限來源。事實上，已經證明人胚胎幹細胞 (hESCs) 及人類誘導多能幹細胞 (iPSCs) 可在活體外分化成 RPE 細胞，減輕視網膜退化並在視網膜下植入後保留視覺功能。因此，hESCs 可以成為生產用於細胞療法的 RPE 細胞的無限來源。
然而，大多數基於細胞的治療通常在冷凍溶液 (cryo-solution) 中冷凍保存，與直接投予至體內不兼容，這給臨床使用帶來了實際問題。細胞應在解凍後數小時內移植，否則其可能會開始失去生存力及品質。此外，細胞必須在經過認證的設施中投予前進行製備，此等設施可能不靠近臨床場所、醫院或其他治療設施。最後，每一個體的治療劑量必須由合格的技術人員釋出，因為最終配方的製備被認為是細胞療法生產過程的一部分。
本揭露解決了再生醫學及 RPE 細胞療法領域中的此等及其他缺點。本揭露進一步提供與各種方法、裝置及物質組成物有關的資料。
本實施例的教導、方法、物質組成、裝置及專有技術在 2019 年 7 月 4 日公佈的題為「RETINAL PIGMENT EPITHELIUM CELL COMPOSITIONS」的 PCT 公開案第 WO 2019/130061 號；2018 年 9 月 20 日 公佈的題為「METHODS FOR MEASURING THERAPEUTIC EFFECTS OF RETINAL DISEASE THERAPIES」的第 WO 2018/170494 號；及 2017 年 2 月 2 日公佈的題為「LARGE SCALE PRODUCTION OF RETINAL PIGMENT EPITHELIAL CELLS」的第 WO 2017/017686 號中找到；此等公開案中之每一者單獨或彼此組合的所有方法、裝置及設備、物質組成物均以全文引用之方式併入本文。
相關申請案
根據 35 U.S.C. §119(e)，本申請案主張 2021 年 6 月 9 日提出申請之美國臨時申請案第 63/208,921 號及 2022 年 6月 8 日提出申請之美國臨時申請案第 63,350,175 號的優先權權益，該等申請案之完整內容以全文引用之方式併入本文。
本文的實施例一般涉及用於治療包括諸如黃斑部病變的視網膜病況的眼部疾病及病症之方法、物質組成物及裝置。
在一些實施例中，物質組成物、方法及裝置可以利用同種異體的產品候選物 (「現成的」)。例如，此可能意謂該材料衍生自細胞株，而不是衍生自個體患者，與針對患者的治療相比，這有助於大規模生產及降低生產成本。
方法、裝置、物質組成物等可以包括在附圖中闡述的彼等。
在閱讀本描述之後，對於熟習此項技術者而言，如何在各種替代實施例及替代應用中實施本揭示內容將變得顯而易見。然而，本文將不描述本發明之所有各種實施例。應理解，本文呈現之實施例僅以實例之方式呈現，而非限制性的。因此，各種替代實施例之此詳細描述不應解釋為限制如本文所闡述之本揭示內容的範疇或廣度。
在揭示及描述本技術之前，應理解，以下描述之態樣不限於特定組成物、製備該等組合物之方法或其用途，當然可改變。亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定態樣之目的，而無意於進行限制。
僅為了讀者之方便而將詳細描述分為多個部分，見於任何部分之揭示內容均可與另一部分中之內容組合。為了方便讀者，可在說明書中使用標題或副標題，其不意欲影響本揭示內容之範疇。 定義
術語「治療 (treating/treatment)」 係指治療或改善損傷、疾病、病理或病況的任意之成功標記，包括任意客觀或主觀參數，諸如減輕；緩解；減輕症候或使患者更容易忍受損傷、病理或狀況；減慢退化或衰退的速度；使退化的最終點不那麼衰弱；改善患者的身體或心理健康。症候之治療或改善可以基於客觀或主觀參數；包括身體檢查、神經精神病學檢查及/或精神病學評估的結果。術語「治療」及其詞形變化可以包括預防損傷、病理、病況或疾病。在實施例中，治療為預防。在實施例中，治療不包括預防。如本文所用 (並且如本領域所熟知的)「治療 (treating/treatment)」亦廣泛地包括用於在個體的病況中獲得有益或所需結果 (包括臨床結果) 的任意方法。有益或所欲之臨床結果可以包括但不限於，減輕或改善一種或多種症候或病況、減輕疾病的程度、安定 ( 即，不惡化) 疾病狀態、預防疾病的傳播或擴散、延遲或減緩疾病進展、改善或緩解疾病狀態、減少和緩解疾病復發，無論是部分的還是全部的，無論是可偵檢的還是不可偵檢的。換言之，本文所用之「治療」包括疾病的任意治癒、改善或預防。治療可以預防疾病的發生；抑制疾病的傳播；緩解疾病的症候，完全或部分地消除疾病的根本原因；縮短疾病的持續時間；或將此等事情結合起來。
如本文所用，「治療 (treating/treatment)」包括預防性治療。治療方法包括向個體投予治療有效量的活性劑。投予步驟可以由單次投予組成或可以包括一系列投予。治療期的長短取決於多種因素，諸如病況的嚴重程度、患者的年齡、活性劑的濃度、治療中使用之組成物的活性或其組合。亦應理解，用於治療或預防之藥劑的有效劑量可以在特定治療或預防方案的過程中增加或減少。劑量的改變可以藉由本領域已知標準診斷檢定法獲得並且變得顯而易見。在某些情況下，可能需要長期投予。例如，將組成物以足以治療患者的量和持續時間投予至個體。在實施例中，「治療 (treating/treatment)」不是預防性治療。
術語「預防」係指減少患者疾病症狀的發生。如上所述，預防可為完全的 (非可偵測到的症候群) 或部分的，使得觀測到的症候群比沒有治療時可能出現的要少。
「病患」或「有需要的個體」涉及罹患或易患疾病或症狀的生物體，其可藉由如本文中所提供的藥物組成物的施藥來治療。非限制性示例包括人類、其他哺乳動物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、綿羊、牛、鹿和其他非哺乳動物。在一些實施例中，患者為人類。
「有效量」是組合物足以在組合物不存在下完成規定目的之量 (例如，達成投予之效果、治療疾病、減弱酶活性、增加酶活性、減弱傳訊通路，或減弱疾病或病況的一種或多種症候群)。「有效量」的示例為足以有助於治療、預防或減弱疾病之一種或多種症候的量，其亦可稱為「治療有效量」。一種或多種症候的「減弱」 (以及該短語的語法等價物) 意指降低症候的嚴重性或頻率，或消除症候。藥物 (例如本文所描述的細胞) 的「預防有效量」為當投予至個體時將具有預期之預防效果的藥物量，例如預防或延遲損傷、疾病、病理或病況的發作 (或復發)，或降低損傷、疾病、病理或狀況或其症候群發作 (或復發) 的可能性。完全的預防效果不一定藉由投予一次劑量而發生，並且可能僅在投予一系列劑量後發生。因此，預防有效量可於一次或多次投藥中投予。如本文所用，「活性降低量」指代相對於拮抗劑不存在時降低酶活性所需的拮抗劑之量。如本文所用，「功能破壞量」指代相對於拮抗劑不存在時破壞酶或蛋白質的功能所需的拮抗劑之量。確切的量將取決於治療之目的，並且將由本領域技術人員使用已知技術確定 ( 參見，例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999); Pickar, Dosage Calculations(1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第 20 版, 2003, Gennaro 編, Lippincott, Williams & Wilkins)。
對於本文所描述之任意組成物，治療有效量可以最初由細胞培養分析測定。目標濃度將為彼等能夠達成本文所描述之方法的活性組成物之濃度 (例如細胞濃度或數目)，如使用本文所描述或本領域已知的方法測量。
如本領域習知者，用於人類的治療有效量亦可以自動物模型測定。例如，可以配製用於人的劑量以達成已發現對動物有效的濃度。如上文所描述，可以藉由監測組成物有效性及上調或下調劑量來調整人體劑量。基於上揭方法和其他方法調整劑量以在人類中達成最大效力完全在普通技術人員的能力範圍內。
如本文所用，術語「治療有效量」係指足以改善上文所描述病症的治療劑之量。例如，對於給定參數，治療有效量將顯示至少 5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、75%、80%、90% 或至少 100% 的增加或降低。治療效力也可以表示為「倍」增加或降低。例如，治療有效量可以具有至少1.2 倍、1.5 倍、2 倍、5 倍或更多倍於對照的效果。
劑量可根據患者及所使用的組成物的需要而變化。在本揭露的上下文中，投予至患者的劑量應足以隨著時間經過而在患者中產生有益的治療反應。劑量的大小亦將取決於任何不良副作用的存在、性質和程度。確定用於特定情況的適當劑量是在執業人員的技術範圍內。通常，以低於組合物最優劑量的較小劑量開始治療。此後，劑量以小的增量增加，直到在情況下達到最優效果。可個別地調節劑量及間隔以對所治療的特定臨床適應症提供有效的投予組成物的含量。此將提供與個體疾病狀態嚴重程度相稱的治療方案。
「共同投予」意指在投予一種或多種額外療法例如癌症療法的同時、就在之前或就在之後，投予本文所描述的組成物。本文所提供之組成物可以單獨投予或可以共同投予患者。共同投予意指包括將組成物單獨或以組合方式 (一種以上的組成物) 同時或順序投予。因此，當需要時，製劑亦可與其他活性物質組合 (例如為了減少代謝降解)。
「對照」或「對照實驗」是按照其完全普通的含義使用，並涉及其中實驗的個體或試劑以平行實驗方式處理的實驗，除了省略步驟、試劑或實驗變量之外。在一些情況下，對照用作評估實驗效果的比較標準。在一些實施例中，對照是在不存在如本文所描述之組成物 (包括實施例及實例) 的情況下對蛋白質活性的測量。
「醫藥上可接受之賦形劑」和「醫藥上可接受之載劑」涉及有助於向個體投予活性劑並被其吸收的物質，並且可被包括於本揭露之組成物中而不會對患者產生明顯的不良毒理作用。醫藥上可接受之賦形劑的非限制性示例包括水、NaCl、生理鹽水溶液、乳酸林格氏 (Ringer) 液、正蔗糖 (normal sucrose)、正葡萄糖 (normal glucose)、黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑、塗覆劑、甜味劑、調味劑、鹽溶液 (例如，林格氏液)、醇、油、明膠、碳水化合物諸如乳糖、直鏈澱粉或澱粉、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇及著色劑等。可對該等製劑進行滅菌，並且如果需要，可與不會與本揭露之組成物有害地反應的輔助劑混合，諸如與潤滑劑、防腐劑、安定劑、濕潤劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽類、緩衝劑、著色劑及/或芳香物質等。本領域技術人員將認識到，其他藥物賦形劑可用於本揭露。
如本文所用，「細胞」係指執行足以保存或複制其基因體 DNA 的代謝或其他功能的細胞。可以藉由本領域熟知的方法來鑑別細胞，包括例如完整膜的存在、特定染料的染色、產生子代的能力，或者在配子的情況下，與第二配子結合以產生一個可行的後代的能力。細胞可包括原核及真核細胞。原核細胞包括但不限於細菌。真核細胞包括但不限於酵母細胞及衍生自植物及動物的細胞，例如哺乳動物、昆蟲 ( 例如，甜菜夜蛾 (spodoptera)) 及人類細胞。當細胞天然不黏附或經過處理不黏附表面時，例如藉由胰蛋白酶消化，細胞可能是有用的。
如本文所用，「幹細胞」係指能夠在培養中長時間保持未分化狀態的細胞 (例如，多能或多能幹細胞)，直至經誘導分化成具有特定、特化功能的其他細胞類型 (例如，完全分化的細胞)。在實施例中，「幹細胞」包括胚胎幹細胞 (ESC)、誘導多能幹細胞 (iPSC)、成人幹細胞、間充質幹細胞及造血幹細胞。在實施例中，RPE 細胞由多能幹細胞 (例如，ESC 或 iPSC) 產生。
如本文所用，「誘導多能幹細胞」或「iPSC」係可以藉由體細胞的遺傳操作，例如，藉由用轉錄因子對體細胞如成纖維細胞、肝細胞、胃上皮細胞的逆轉錄病毒轉導從體細胞產生的細胞，諸如 Oct-3/4、Sox2、c-Myc 及 KLF4 [Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49；Aoi T 等人，Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells.Science.2008 年 2 月 14 日(電子版提前印刷)；IH Park、Zhao R、West JA 等人，Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.Nature 2008；451:141-146；K Takahashi、Tanabe K、Ohnuki M 等人，Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell 2007；131:861-872]。若受體細胞在有絲分裂中停滯，其他胚胎樣幹細胞可以藉由核轉移至卵母細胞、與胚胎幹細胞融合或核轉移至受精卵中來產生。此外，iPSC 可使用非整合方法生成，例如，藉由使用小分子或 RNA。
術語「胚胎幹細胞」係指能夠分化成所有三個胚胎胚層 (即內胚層、外胚層及中胚層) 的細胞或保持未分化狀態的胚胎細胞。片語「胚胎幹細胞」包含自妊娠後形成的胚胎組織 (例如，胚泡) 在胚胎植入前獲得的細胞 (即，植入前胚泡)、擴展的胚泡細胞 (EBC)，其自一個植入後/原腸胚形成階段的囊胚 (參見 WO 2006/040763) 及胚胎胚芽 (EG) 細胞，其在妊娠期間的任何時間，較佳在妊娠 10 週之前自胎兒的生殖器組織獲得。在實施例中，胚胎幹細胞係使用眾所週知的細胞培養方法獲得的。例如，人胚胎幹細胞可以自人類胚泡中分離出來。
應當理解，商業上可獲得的幹細胞亦可以用於本揭露的態樣及實施例中。人類 ES 細胞可自 NIH 人類胚胎幹細胞登記處 www.grants.nih.govstem_cells/ 或其他 hESC 登記處購買。可商購的胚胎幹細胞株的非限制性實例係 HAD-C 102、ESI、BGO 1、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY1O、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES 20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES3、WAO 1、UCSF4、NYUES 1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUESS、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077 (H7)、WA09 (H9)、WA 13 (H13)、WA14 (H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CT I、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR 1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBRS、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BINhem19、BJNhem20、SAGO 1、SAOO1。
術語「視網膜色素上皮」或「RPE」亦稱為「視網膜色素層」，係指視網膜外的細胞色素層。RPE 層位於布魯赫膜 (脈絡膜內邊界) 與感光受體之間。RPE 是為視網膜供應營養的中間體，並有助於許多功能，包括視網膜發育、吸收光、分泌生長因子及介導眼睛的免疫反應。RPE 功能障礙可能導致視力喪失或失明，包括視網膜色素變性、糖尿病性視網膜病變、西尼羅河病毒及黃斑部病變。
術語「疾病」或「病況」係指能夠用本文提供的組成物或方法治療的患者或個體的狀態或健康狀況。老年性黃斑部病變或 AMD 是中央視網膜的一種進行性慢性疾病，並且是全球視力喪失的主要原因。大多數視力喪失發生在疾病的晚期，此是由於以下兩個過程之一：新生血管(「濕性(wet)」) AMD 及地圖狀萎縮 (GA，「乾性(dry)」)。在 GA 中，會出現視網膜色素上皮、脈絡膜毛細血管及感光受體的進行性萎縮。AMD 的乾性形式更為常見 (佔所有病例的 85-90%)，但可能會發展為「濕性」形式，若不及時治療，會導致快速及嚴重的視力喪失。在美國及其他發達國家，AMD 的估計患病率為 2,000 人中有 1 人。預計此患病率將隨著老年人在一般人群中的比例而增加。該疾病之危險因素包括環境因素及遺傳因素兩者。該疾病之發病機制涉及四種功能相關組織的異常，即視網膜色素上皮 (RPE)、布魯赫膜、脈絡膜毛細血管及感光受體。然而，RPE 細胞功能之損傷是導致臨床相關 AMD 變化的分子途徑中之早期及關鍵事件。目前沒有批准的乾性 AMD 治療方法。預防措施包括維生素/礦物質補充劑。此等方法降低發展為濕性 AMD 的風險，但不影響地圖狀萎縮 (GA) 進展的發展。
可以根據本文提供的方法測量治療效果之疾病的非限制性列表包含視網膜色素變性、萊伯氏先天性黑矇症、遺傳性或獲得性黃斑部病變、老年性黃斑部病變 (AMD)、地圖狀萎縮 (GA)、貝斯氏特病、視網膜脫離、迴旋萎縮、無脈絡膜症、模式失養症以及 RPE 的其他失養症、斯特格病, RPE 及視網膜損傷 (由光、雷射、炎症、感染、輻射、新生血管或創傷性損傷中之任一者引起的損傷)、視網膜發育不良、視網膜萎縮、視網膜病變、黃斑部失養症、視錐細胞失養症、視錐-視桿細胞失養症、馬拉蒂亞萊維登病、多因蜂窩失養症、索斯比失養症、圖案/蝴蝶失養症、貝斯特卵黃樣失養症、北卡羅來納失養症、中央暈輪狀脈絡膜失養症、血管狀痕、毒性黃斑部病變、病理性近視、視網膜色素變性及黃斑部病變。在實施例中，疾病為乾性 AMD。在實施例中，疾病為 GA。
「地圖狀萎縮」或「GA」或「萎縮性視網膜」，亦稱為萎縮性老年性黃斑部病變 (AMD) 或晚期乾性 AMD，是一種晚期形式的老年性黃斑部病變，其可以導致進行性及不可逆轉的視網膜損失 (感光受體、視網膜色素上皮、脈絡膜毛細血管)，隨著時間的推移可能導致視覺功能喪失。
在實施例中，RPE 缺陷可能由以下一種或多種引起：高齡、吸煙、不健康的體重、抗氧化劑攝入量低或心血管病症。在其他實施例中，RPE 缺陷可能由先天性異常引起。「視網膜色素上皮細胞」、「RPE 細胞」、「RPE」，在上下文允許的情況下可以互換使用，係指一種細胞類型的細胞，例如，在功能上、表觀遺傳上或表達譜類似於形成視網膜色素上皮細胞層的天然 RPE 細胞 (例如，在眼內移植、投予或遞送後，其表現出與天然 RPE 細胞相似的彼等功能活性)。
如本文所用，術語「OpRegen」係指譜係受限的人類 RPE 細胞株。RPE 細胞是在補充有活化素 A、轉化生長因子 β (TGF-b) 家族及菸鹼醯胺的分化培養基下衍生的，以富集 RPE 群體。OpRegen 是在眼用平衡鹽溶液 (BSS Plus) 或即用型 (RTA) 解凍及注射 (TAI) 製劑中調配的單細胞懸浮液，例如如 PCT 公開案第 WO/2019/130061 中所描述，其中所描述之所有調配物、組成物、方法、試劑等藉由全文引用之方式併入本文。 治療方法
本文的實施例一般涉及用於治療包括諸如黃斑部病變的視網膜病況的眼部疾病及病症之方法、物質組成物及裝置。
因此，在一個態樣中，提供治療如本文所闡述、描述或說明的視網膜疾病或病症或減緩其進展的方法。
根據一些實施例，治療視網膜疾病或減緩視網膜疾病的進展可以藉由微視野檢查來評估視力恢復。微視野檢查是可用於測量或評估視覺功能的工具之一，具有視覺敏感區域的高解析度映射。微視野檢查允許在視網膜上定位此特定的視覺區域或受損的視覺區域，並且可以「跨越」解剖學與臨床變化之間的差距，這兩個重要參數 (解剖學缺陷與視覺障礙) 之間具有良好的相關性。
根據其他實施例，經微視野檢查評估的視力恢復包含證明 RPE 細胞的投予包含與基線微視野檢查評估相比改進的微視野檢查評估。根據其他實施例，經微視野檢查評估的視力恢復包含證明 RPE 細胞的投予包含與基線及另一側/未經治療之眼睛相比保留的微視野檢查評估。
根據某些實施例，治療或減緩視網膜疾病的進展包含在投予 RPE 細胞後一年，GA 病變生長速率相對於基線或對側眼降低約 5％至約 20％。在實施例中，治療或減緩視網膜疾病的進展包含在投予一年後 GA 病變生長速率相對於基線或對側眼降低約 5％至約 50％。在實施例中，治療或減緩視網膜疾病的進展包含在投予一年後 GA 病變生長速率相對於基線或對側眼降低約 5％至約 25%。在實施例中，治療或減緩視網膜疾病的進展包含在投予一年後 GA 病變生長速率相對於基線或對側眼降低約 5％至約 100%。在實施例中，治療或減緩視網膜疾病的進展包含在投予一年後 GA 病變生長速率相對於基線或對側眼降低約 5％至約 10%。該數量可為包括端點的引述範圍內的任意值或子範圍。
根據一些實施例，治療或減緩視網膜疾病的進展包含以下一項或多項：穩定的最佳矯正視敏度 (BCVA)；低亮度測試性能無劣化；或微視野檢查靈敏度無劣化；或閱讀速度無劣化。在實施例中，比較是與年齡匹配、性別匹配的對照。在實施例中，比較是針對基線。在實施例中，比較是針對對側眼。在實施例中，比較是在約一週與約5年之間的時段。在實施例中，比較是在約一個月。在實施例中，比較是在約三個月。在實施例中，比較是在約六個月。在實施例中，比較是在約一年。該時段可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。
根據一些實施例，提供一種用於治療視網膜疾病或病症或減緩其進展的藥物組成物，其包含約 25,000 至約 1,000,000 個 RPE 細胞作為活性物質。在實施例中，組成物包含約 50,000 至約 500,000 個 RPE 細胞。在實施例中，組成物包含約 100,000 至約 500,000 個 RPE 細胞。在實施例中，組成物包含約 250,000 至約 500,000 個 RPE 細胞。在實施例中，組成物包含約 50,000 至約 400,000 個 RPE 細胞。在實施例中，組成物包含約 50,000 至約 300,000 個 RPE 細胞。在實施例中，組成物包含約 50,000 至約 250,000 個 RPE 細胞。在實施例中，組成物包含約 50,000 至約 200,000 個 RPE 細胞。該數量可為包括端點的引述範圍內的任意值或子範圍。
在一些實施例中，該方法包含向有需要之個體投予細胞治療劑，其中該細胞治療劑能夠恢復視網膜疾病的視網膜結構。 細胞治療劑
在一些態樣中，本揭露涉及包含衍生自多能細胞的視網膜色素上皮 (RPE) 細胞的細胞治療劑。此等細胞治療劑包括但不限於 OpRegen。
根據一些實施例，RPE 細胞表現成熟 RPE 細胞之至少一種、兩種、三種、四種或五種標記。根據一些實施例，RPE 細胞表現成熟 RPE 細胞之至少兩種至至少十種或至少兩種至至少三十種標記。此等標記包括但不限於 CRALBP、RPE65、PEDF、PMEL17、斑萎蛋白 1 (bestrophin 1) 及酪胺酸酶。視情況，RPE 細胞亦可表現 RPE 先驅細胞的標記 (例如，MITF)。在某些實施例中，RPE 細胞表現 PAX-6。在其他實施例中，RPE 細胞表現視網膜先驅細胞之至少一種標記，包括但不限於 Rx、OTX2 或 SIX3。任選地，RPE 細胞可表現 SIX6 及/或 LHX2。
根據一些實施例，RPE 細胞是 OpRegen® 細胞。
如本文所用，片語「成熟 RPE 細胞之標記」係指在成熟 RPE 細胞中相對於非 RPE 細胞或未成熟 RPE 細胞升高 (例如，至少 2 倍、至少 5 倍、至少 10 倍) 的抗原 (例如，蛋白質)。
如本文所用，片語「RPE 先驅細胞之標記」係指與非 RPE 細胞相比在 RPE 先驅細胞中升高 (例如，至少 2 倍、至少 5 倍、至少 10 倍) 的抗原 (例如，蛋白質)。
根據其他實施例，RPE 細胞具有類似於形成視網膜色素上皮細胞層的天然 RPE 細胞的形態。例如，細胞可經著色並具有特徵性的多邊形形狀。
根據一些實施例，RPE 細胞由多能幹細胞 (例如，ESC 或 iPSC) 產生。
誘導多能幹細胞 (iPSC) 可以藉由體細胞之遺傳操作自體細胞產生，例如，藉由使用轉錄因子諸如 Oct-3/4、Sox2、c-Myc 及 KLF4 逆轉錄病毒轉導體細胞諸如成纖維細胞、肝細胞、胃上皮細胞 [Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49；Aoi T等人，Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 2008 年 2 月 14 日 (電子版提前印刷)；IH Park、Zhao R、West JA 等人，Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008；451:141-146；K Takahashi、Tanabe K、Ohnuki M等人，Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007；131:861-872]。若受體細胞在有絲分裂中停滯，其他胚胎樣幹細胞可以藉由核轉移至卵母細胞、與胚胎幹細胞融合或核轉移至受精卵中來產生。此外，iPSC 可使用非整合方法生成，例如，藉由使用小分子或 RNA。
人胚胎幹細胞可自人胚泡中分離出來。人胚泡通常自人體內植入前胚胎或活體外受精 (IVF) 胚胎中獲得。或者，可以將單細胞人胚胎擴大到胚泡階段。為了分離人類 ES 細胞，自胚泡中去除透明帶，並藉由裂解滋養外胚層細胞並藉由溫和移液自完整 ICM 中去除的程序分離內細胞團 (ICM)。然後將 ICM 置於含有適當培養基的組織培養瓶中，使其能夠生長。9 至 15 天後，ICM 衍生之生長物藉由機械分離或酶降解分離成團塊，並且然後將細胞重新鋪盤在新鮮的組織培養基上。藉由微量移液器單獨選擇表現出未分化形態的菌落，機械分離成團塊，然後重新鋪盤。然後每 4-7 天例行地分裂產生的 ES 細胞。有關製備人類 ES 細胞的方法的更多詳細資訊，請參見 Reubinoff 等人，Nat Biotechnol 2000 年 5 月：18(5): 559；Thomson等人，[美國專利第 5,843,780 號；Science 282: 1145, 1998；Curr. Top.Dev. Biol. 38: 133, 1998；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]；Bongso等人，[Hum Reprod 4: 706, 1989]；及 Gardner 等人，[Fertil. Steril. 69: 84, 1998]。
此外，ES 細胞可以自其他物種獲得，包括小鼠 (Mills 及 Bradley，2001)、金倉鼠 [Doetschman 等人，1988, Dev Biol. 127: 224-7]，大鼠 [Iannaccone 等人，1994，Dev Biol. 163: 288-92]，兔子 [Giles 等人，1993，Mol Reprod Dev.36: 130-8；Graves & Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev.1993, 30 36: 424-33], several domestic animal species [Notarianni等人，1991, J Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60；Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev.6: 563-8；Mitalipova等人，2001, Cloning.3：59-67]及 non-human primate species (Rhesus monkey and marmoset) [Thomson等人，1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 7844-8；Thomson等人，1996, Biol Reprod. 55: 254-9]。
擴展的囊胚細胞 (EBC) 可以自受精後至少九天在原腸胚形成之前的階段的囊胚中獲得。在培養囊胚之前，透明帶經消化 [例如藉由 Tyrode 的酸性溶液 (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA)] 以暴露內細胞團。然後使用標準胚胎幹細胞培養方法將囊胚作為完整胚胎在活體外受精後培養至少九天且不超過十四天 (即原腸胚形成事件之前)。
製備 ES 細胞的另一種方法描述於 Chung 等人，Cell Stem Cell，第 2 卷，第 2 期，113-117，2008 年 2 月 7 日。該方法包含在活體外受精過程中自胚胎中去除單細胞。在此過程中胚胎未經破壞。
EG (胚胎生殖) 細胞是使用熟習此項技術者已知的實驗室技術自妊娠約 8-11 週的胎兒 (在人類胎兒的情況下) 獲得的原始生殖細胞製備的。生殖脊經解離並切成小部分，然後藉由機械分離分解成細胞。然後 EG 細胞在具有適當培養基的組織培養瓶中生長。每天更換培養基培養細胞直至觀測到與 EG 細胞一致的細胞形態，通常在 7-30 天或 1-4 代後。有關製備人類 EG 細胞方法的更多詳細資訊，請參見 Shamblott 等人，[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998] 及美國專利第 6,090,622 號。
另一種製備 ES 細胞的方法是藉由孤雌生殖。胚胎亦不會在此過程中被破壞。
ES 培養方法可包括使用飼養細胞層，此等細胞層分泌幹細胞增殖所需的因子，同時抑制其分化。培養通常在固體表面上進行，例如塗有明膠或波形蛋白的表面。示例性飼養層包括人胚胎成纖維細胞、成體輸卵管上皮細胞、原代小鼠胚胎成纖維細胞 (PMEF)、小鼠胚胎成纖維細胞 (MEF)、鼠胎成纖維細胞 (MFF)、人胚胎成纖維細胞 (HEF)、自分化人類胚胎幹細胞獲得的人類成纖維細胞、人類胎兒肌肉細胞 (HFM)、人類胎兒皮膚細胞 (HFS)、人類成人皮膚細胞、人類包皮成纖維細胞 (HFF)、人類臍帶成纖維細胞、自臍帶或胎盤獲得的人類細胞及人類骨髓基質細胞 (hMSC)。可將生長因子添加至培養基中以維持 ESC 處於未分化狀態。此類生長因子包括 bFGF 及/或 TGF。在另一個實施例中，可將試劑添加至培養基中以將 hESC 維持在天然未分化狀態-參見例如 Kalkan 等人，2014，Phil.Trans.R. Soc. B, 369: 20130540。
人類臍帶成纖維細胞可在添加人類血清 (例如，20%) 及麩醯胺酸的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (例如 DMEM、SH30081.01、胎牛血清) 中擴增。較佳人類臍帶細胞是經照射。此可使用本領域已知的方法來實現 (例如 Gamma cell、220 Exel、MDS Nordion 3,500-7500 弧度)。一旦獲得足夠的細胞，就可以將其冷凍 (例如冷凍保存)。對於 ESC 的擴增，通常將人類臍帶成纖維細胞接種在固體表面 (例如 T75 或 T 175 燒瓶) 上，視情況塗有黏附受質如明膠 (例如重組人類明膠 (RhG 100-001，Fibrogen) 或在補充有約 20%人類血清 (及麩醯胺酸)的 DMEM (例如 SH30081.01，Hyclone) 中濃度約為 25,000-100,000 個細胞/cm2 的人類玻連蛋白或層黏連蛋白 521 (Bio lamina)。hESC 通常在 1-4 天後在支持性培養基 (例如 NUTRISTEM® 或 NUT(+) 與人類血清白蛋白) 中鋪盤在飼養細胞的頂部。可向培養基中添加其他因子以防止 ESC 分化，諸如 bFGF 及 TGFI3。一旦獲得足夠量的 hESC，就可以對細胞進行機械破壞 (例如，藉由使用無菌尖端或一次性無菌幹細胞工具；14602 Swemed)。或者，可藉由酶處理 (例如膠原酶 A 或 TrypLE Select) 去除細胞。此過程可重複數次以達到所需 hESC 數量。根據一些實施例，在第一輪擴增之後，使用 TrypLE Select 去除 hESC，並且在第二輪擴增之後，使用膠原酶 A 去除 hESC。
ESC 可在分化步驟之前在飼養層上擴增。上文描述基於飼養層的培養物的非限制性實例。擴增通常進行至少兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天或十天。擴增進行至少 1 次、至少 2 次、至少 3 次、至少 4 次、至少 5 次、至少 6 次、至少 7 次、至少 8 次、至少 9 次或至少 10 次。在一些實施例中，擴增進行至少 2 次至至少 20 次。在其他實施例中，擴增進行至少 2 次至至少 40 次。擴增後，使用分化劑對多能幹細胞 (例如 ESC)進行定向分化。
無飼養細胞系統亦已用於 ES 細胞培養，此類系統利用補充有血清置換物、細胞介素及生長因子 (包括 IL6 及可溶性 IL6 受體嵌合體) 的基質作為飼養細胞層的置換物。幹細胞可以在存在培養基 (例如 Lonza L7 系統、mTeSR、StemPro、XFKSR、E8、NUTRISTEM ®) 的情況下在固體表面諸如細胞外基質 (例如 MATRIGELR TM、層黏連蛋白或玻連蛋白) 上生長。與需要飼養細胞及幹細胞同時生長並可能導致混合細胞群的基於飼養細胞的培養不同，在無飼養細胞系統上生長的幹細胞很容易自表面分離。用於生長幹細胞的培養基含有有效抑制分化並促進其生長的因子，諸如 MEF條件培養基及 bFGF。
在一些實施例中，在擴增後，多能 ESC 在黏附表面上進行定向分化 (沒有中間生成球狀體或胚狀體)。參見，例如，國際專利申請公開案第WO 2017/072763號，以全文引用之方式併入本文。
因此，根據本揭露的一個態樣，至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94 %、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 在黏附表面上進行定向分化的細胞是未分化的 ESC 並表現多能性標記。例如，至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99% 或 100% 的細胞係 Oct4±TRA-1-60+。未分化的ESC可表現其他多能性標記，例如 NANOG、Rex-1、鹼性磷酸酶、Sox2、TDGF-β、SSEA-3、SSEA-4 及/或 TRA-1-81。
在一個例示性分化方案中，未分化的胚胎幹細胞使用第一分化劑在黏附表面上向 RPE 細胞譜系分化，然後使用轉化生長因子-B(TGFB) 超家族的成員進一步向 RPE 細胞分化，(例如 TGF 1、TGF2 及 TGF 3 亞型，以及同源配體，包括活化素 (例如活化素 A、活化素 B 及活化素 AB)、淋巴結、抗穆勒管激素 (anti-mullerian hormone，AMH)、一些骨塑型蛋白 (BMP)，例如 BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6 及 BMP7，以及生長及分化因子 (GDF))。根據具體實施例，轉化生長因子-B (TGFB) 超家族的成員是活化素 A-例如在 20-200 ng/ml 之間，例如100-180 ng/ml。
根據一些實施例，第一分化劑是以約1-100 mM、5-50 mM、5-20 mM 及例如10 mM之間的濃度使用的菸鹼醯胺 (NA)。根據其他實施例，第一分化劑是3-氨基苯胺。
NA，亦稱為「菸鹼醯胺」，是維生素 B3 (菸酸) 的醯胺衍生物形式，其被認為保護及改善 β 細胞功能。NA 的化學式為 C6H6N20。NA 對於生長及食物轉化為能量係必不可少的，並且其已用於關節炎治療及糖尿病的治療及預防。
根據一些實施例，菸鹼醯胺是菸鹼醯胺衍生物或菸鹼醯胺模擬物。如本文所用，術語「菸鹼醯胺 (NA) 之衍生物」表示作為天然NA的化學修飾衍生物的化合物。在一個實施例中，化學修飾可為經由醯胺部分的氮或氧原子取代基本 NA 結構的吡啶環 (經由環的碳或氮成員)。當經取代時，一個或多個氫原子可經取代基置換及/或取代基可附接至 N 原子以形成帶正電荷的四價氮。因此，本發明的菸鹼醯胺包括取代或未取代的菸鹼醯胺。在另一個實施例中，化學修飾可為單個基團的缺失或置換，例如形成 NA 的硫代苯甲醯胺類似物，所有此等類似物均為有機化學專業人士所理解。本發明上下文中之衍生物亦包括 NA 的核苷衍生物 (例如菸鹼醯胺腺嘌呤)。描述了多種 NA 衍生物，其中一些亦與 PDE4 酶的抑制活性有關 (WO 03/068233；WO 02/060875；GB2327675A)，或作為 VEGF 受體酪胺酸激酶抑製劑 (WOO 1/55114)。例如，製備 4-芳基-菸鹼醯胺衍生物的方法 (WO 05/014549)。其他例示性菸鹼醯胺衍生物揭露於 WOO 1/55114 及 EP2128244。
菸鹼醯胺模擬物包括菸鹼醯胺的修飾形式及菸鹼醯胺的化學類似物，其概括菸鹼醯胺在 RPE 細胞自多能細胞分化及成熟中的作用。例示性菸鹼醯胺模擬物包括苯甲酸、3-氨基苯甲酸及6-氨基菸鹼醯胺。可作為菸鹼醯胺模擬物的另一類化合物係聚 (ADP-核糖) 聚合酶 (PARP)的抑製劑。例示性 PARP 抑製劑包括 3-氨基苯甲醯胺、Iniparib (BSI 201)、Olaparib (AZD-2281)、Rucaparib (AG014699、PF-01367338)、Veliparib (ABT-888)、CEP 9722、MK 4827 及 BMN-673。
其他考慮的分化劑包括例如頭蛋白、Wnt 拮抗劑 (Dkkl 或 IWR1e)、淋巴結拮抗劑 (Lefty-A)、視黃酸、牛磺酸、GSK3b 抑製劑 (CHIR99021) 及缺口抑製劑 (DAPT)。
根據某些實施例，分化如下進行：(a) 在包含第一分化劑 (例如菸鹼醯胺) 的培養基中培養 ESC；及 (b) 在包含 TGFB 超家族成員 (例如活化素 A) 及第一分化劑 (例如菸鹼醯胺) 的培養基中培養自步驟 a) 獲得的細胞。
步驟 (a) 可在不存在 TGFI3 超家族成員 (例如活化素 A) 的情況下進行。
在一些實施例中，步驟 (a) 中的培養基完全不含 TGFI3 超家族成員。在其他實施例中，培養基中 TGFI3 超家族成員之水平低於20 ng/ml、10 ng/ml、1 ng/ml 或甚至低於 0.1 ng/ml。
上述方案可藉由在包含第一分化劑 (例如菸鹼醯胺) 但不含 TGFI3 超家族成員 (例如活化素 A) 的培養基中培養步驟 (b) 中獲得的細胞來繼續。該步驟在本文中稱為步驟 (b*)。
現在用另外的實施例更詳細地描述上述方案。步驟 (a)：一旦獲得足夠數量的 ESC，則開始分化過程。可自細胞培養物中取出細胞 (例如，藉由使用膠原酶 A、分散酶、TrypLE select、EDTA) 並且在存在菸鹼醯胺 (及不存在活化素 A) 的情況下將其鋪盤至非黏附受質上 (例如細胞培養盤，諸如 Hydrocell 或瓊脂糖包被之培養皿，或 petri 細菌培養皿)。菸鹼醯胺之例示性濃度在 0.01-100 mM、0.1 -100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM 及 10 mM 之間。一旦將細胞鋪盤至非黏附受質 (例如細胞培養盤) 上，細胞培養物可稱為細胞懸浮液，較佳懸浮培養物中的自由浮動簇，即衍生自人胚胎幹細胞的細胞聚集體 (hESC)。細胞簇不黏附在任何受質 (例如培養盤、載劑)上。自由浮動幹細胞之來源先前在WO 06/070370中有所描述，該文獻以全文引用之方式併入本文。該階段可進行最少 1 天，更佳兩天、三天、1 週或甚至 14 天。較佳的是，細胞與例如在 0.01-100 mM、0.1-100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM，例如 10 mM 之間 (並且在不存在活化素 A 的情況下) 的菸鹼醯胺一起懸浮培養不超過 3 週。在一個實施例中，細胞與例如在 0.01-100 mM、0.1-100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM，例如 10 mM 之間 (並且在不存在活化素 A 的情況下) 的菸鹼醯胺一起懸浮培養 6-8 週。
根據一些實施例，當細胞在非黏附受質上培養時，例如，細胞培養盤，氧氣氣氛條件為 20%。然而，亦考慮控制大氣養條件，使得氧氣氣氛百分比小於約 20%、15%、10%、9%、8%、7%、6% 或甚至小於約 5% (例如 1% - 20%、1%-10% 或 0-5% 之間)。根據其他實施例，細胞最初在正常氧氣氣氛條件下在非黏附受質上培養，然後降低至低於正常氧氣氣氛條件。
非黏附細胞培養盤的例子包括 Nunc 製造的彼等 (例如 Hydrocell 目錄號 174912) 等。
通常，簇包含至少約 50 至 500,000、50 至 100,000、50 至 50,000、50 至 10,000、50 至 5000或 50 至 1000 個細胞。根據一個實施例，簇中的細胞未經組織成層並且形成不規則的形狀。在一個實施例中，簇基本上不含多能胚胎幹細胞。在另一實施例中，簇包含少量的多能胚胎幹細胞 (例如不超過5%，或不超過3% (例如 0.01-2.7%) 的細胞在蛋白質水平上共表現 OCT4 及 TRA-1-60)。通常，簇包含在菸鹼醯胺的影響下已部分分化的細胞。此等細胞主要表現神經及視網膜前體標記，諸如 PAX6、Rax、Six3 及/或 CHX10。
可使用本領域已知的酶促或非酶促方法 (例如，機械) 分離簇。根據一些實施例，分離細胞以使得其不再成簇-例如，2-100,000 個細胞、2-50,000 個細胞、2-10,000 個細胞、2-5000 個細胞、2-1000 個細胞、2-500 個細胞、2-100 個細胞、2-50 個細胞的聚集體或團塊。根據特定實施例，細胞處於單細胞懸浮液中。
然後可以將細胞 (例如經分離之細胞) 鋪盤在黏附受質上，並且在例如在 0.01-100 mM、0.1-100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM，及例如 10 mM 之間 (並且在不存在活化素 A 的情況下) 的菸鹼醯胺存在下培養。該濃度可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。該階段可進行最少 1 天，更佳兩天、三天、1 週或甚至 14 天。較佳的是，在菸鹼醯胺存在下 (並且在不存在活化素的情況下) 培養細胞不超過 3 週。在例示性實施例中，該階段進行 6-7 天。
根據其他實施例，當細胞在黏附受質上培養時，例如，層黏連蛋白，氧氣氣氛條件為 20%。可以對其進行操作，以使氧氣氣氛百分比小於約 20%、15%、10%，更佳小於約 9%、小於約 8%、小於約 7%、小於約 6% 及較佳約 5% (例如在 1%-20%、1%-10% 或 0-5% 之間)。該數量可為包括端點的引述範圍內的任意值或子範圍。
根據一些實施例，細胞最初在正常氧氣氣氛條件下在黏附受質上培養，並且隨後將氧降低至低於正常氧氣氣氛條件。
黏附受質或物質混合物之實例可以包括但不限於纖連蛋白、層黏連蛋白、聚 D-離胺酸、膠原蛋白及明膠。
步驟 (b)：在定向分化之第一階段之後，(步驟 a；即在菸鹼醯胺存在下培養 (例如在 0.01-100 mM、0.1 -100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM，例如 10 mM))，然後可藉由在活化素 A (例如 0.01-1000 ng/ml、0.1-200 ng/ml、1-200 ng/ ml - 例如 140 ng/ml、150 ng/ml、160 ng/ml 或 180 ng/ml) 存在下培養來將部分分化之細胞在黏附受質上經歷另一階段之分化。因此，可以 0.1 pM-10 nM、10 pM-10 nM、0.1 nM-10 nM、1 nM-10 nM，例如 5.4 nM 的最終摩爾濃度添加活化素 A。該濃度可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。
在該階段亦可添加菸鹼醯胺 (例如，0.01-100 mM、0.1-100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM，例如 10 mM)。該濃度可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。該階段可進行 1 天至 10 週、3 天至 10 週、1 週至 10 週、1 週至 8 週、1 週至 4 週，例如至少 1 天、至少 2 天、至少 3 天、至少 5 天、至少 1 週、至少 9 天、至少 10 天、至少 2 週、至少 3 週、至少 4 週、至少 5 週、至少 6 週、至少至少 7 週、至少 8 週、至少 9 週、至少 10 週。該時段可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。
根據一些實施例，該階段進行約八天至約兩週。如上文詳述，該分化階段可在低或正常氧氣氣氛條件下進行。
步驟 (b*)：在定向分化之第二階段 (即在黏附受質上在菸鹼醯胺及活化素 A 存在下培養) 之後；步驟 (b)，進一步分化之細胞視情況在黏附受質上進行後續分化階段-在菸鹼醯胺 (例如在 0.01 - 100 mM、0.1 -100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM 之間，例如 10 mM) 存在下，在不存在活化素 A 的情況下培養。濃度可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。該階段可進行至少 1 天、2 天、5 天、至少 1 週、至少 2 週、至少 3 週或甚至 4 週。如上文所詳述，該分化階段亦可在低或正常氧氣氣氛條件下進行。
ESC 在其中分化之基礎培養基係本領域已知的用於支撐活體外細胞生長的任何已知細胞培養基，通常是包含確定的鹼溶液的培養基，該培養基包括鹽、糖、氨基酸及任何用於將培養物中的細胞維持在存活狀態的其他所需營養物質。根據具體實施例，基礎培養基不是條件培養基。可根據本發明使用的市售基礎培養基的非限制性實例包括 NUTRISTEM® (不含用於 ESC 分化的 bFGF 及 TGF，具有用於 ESC 擴增的 bFGF 及 TGF)、NEUROBASAL TM、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、CELLGRO TM幹細胞培養基或 X-VIVO TM。基礎培養基可補充有本領域已知的處理細胞培養物的多種試劑。以下是對可包括在根據本揭露使用的培養物中的各種補充劑的非限制性參考：血清或含有血清置換物的培養基，諸如但不限於敲除血清置換物 (KOSR)、NUTRIDOMA-CS、TCH TM、N2、N2 衍生物或 B27 或組合；細胞外基質 (ECM) 組分，諸如但不限於纖連蛋白、層黏連蛋白、膠原蛋白及明膠。然後可以使用 ECM 來攜帶 TGFI3 生長因子超家族的一個或多個成員；抗菌劑，諸如但不限於青黴素及鏈黴素；及非必需胺基酸 (NEAA)、神經營養因子，已知其在促進培養中 SC 的存活中發揮作用，諸如但不限於 BDNF、NT3、NT4。
根據一些實施例，用於分化 ESC 的培養基是 NUTRISTEM® 培養基 (Biological Industries, 06-5102-01-1A)。
根據一些實施例，ESC 的分化及擴增在無異源條件下進行。根據其他實施例，增殖/生長培養基基本上不含異種污染物，即不含動物衍生之組分，諸如血清、動物衍生之生長因子及白蛋白。因此，根據此等實施例，培養是在不存在異種污染物的情況下進行的。在美國專利申請案第 20130196369 號中提供在無異種條件下培養 ESC 的其他方法，其內容以全文引用之方式併入本文。
包含 RPE 細胞的製劑可根據良好生產規範 (GMP) (例如，該製劑符合 GMP) 及/或當前的組織優良操作規範 (GTP) (例如，該製劑可符合 GTP) 製備。
在分化步驟期間，可監測胚胎幹細胞的分化狀態。細胞分化可以藉由檢查已知指示分化的細胞或組織特異性標記來確定。
可以使用本領域眾所週知的免疫學技術偵測組織/細胞特異性標記 [Thomson JA等人，(1998). Science 282: 1145-7]。實例包括但不限於用於膜結合或細胞內標記的流式細胞術、用於細胞外及細胞內標記的免疫組織化學以及用於分泌分子標記的酶免疫測定。
在上文所描述之分化階段之後，可以獲得包含色素沉著細胞及非色素沉著細胞兩者的混合細胞群。根據此態樣，自盤中去除混合細胞群之細胞。在一些實施例中，此藉由酶促實現 (例如使用胰蛋白酶，(TrypLE Select)；參見例如國際專利申請公開案第 WO 2017/021973 號，其以全文引用之方式併入本文)。根據本發明之此態樣，自培養物中去除的細胞的至少 10%、20%、30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70% (並隨後擴增) 是非色素沉著細胞。在其他實施例中，此是機械地實現的-例如，使用細胞刮刀。在其他實施例中，此是藉由化學方式實現的 (例如，藉由EDTA)。亦考慮酶處理及化學處理的組合。例如，可以使用 EDTA 及酶處理。此外，自培養物中去除的細胞的至少 10%、20% 或甚至 30% (並隨後擴增) 可為色素沉著細胞。
根據本揭露之一個態樣，培養物中之所有細胞的至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% 經去除並隨後擴增。
混合細胞群之擴增可在細胞外基質上進行，例如明膠、膠原蛋白 I、膠原蛋白 IV、層黏連蛋白 (例如層黏連蛋白 521)、纖連蛋白及聚-D-離胺酸。為了擴增，細胞可在無血清 KOM、含血清培養基 (例如具有 20% 人類血清的 DMEM) 或 NUTRISTEM® 培養基 (06-5102-01-1A，Biological Industries) 中培養。在此等培養條件下，在適合的條件下傳代後，色素沉著細胞與非色素沉著細胞的比例增加，從而獲得純化的 RPE 細胞群。此等細胞顯示 RPE 細胞的特徵性多邊形形態及色素沉著。
在一個實施例中，在菸鹼醯胺存在下 (例如 0.01-100 mM、0.1-100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM，例如 10 mM) 及在不存在活化素 A 的情況下進行擴增。濃度可為包括端點之引述範圍內的任何值或子範圍。
混合的細胞群可在懸浮液 (具有或不具有微載劑) 或單層中擴增。藉由熟習此項技術者熟知的方法，可將單層培養物或懸浮培養物中混合細胞群的擴增修飾為生物反應器或多/超堆疊中的大規模擴增。
根據一些實施例，擴增階段進行至少 1 至 20 週、至少 2 週、至少 3 週、至少 4 週、至少 5 週、至少 6 週、至少 7 週、至少 8 週，至少 9 週或甚至 10 週。較佳的是，擴增階段進行 1 週至 10 週，更佳 2 週至 10 週，更佳 3 週至 10 週，更佳 4 週至 10 週，或 4 週至 8 週。該時段可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。
根據其他實施例，混合細胞群在擴增階段傳代至少 1 次，在擴增階段至少傳代 2 次，在擴增階段至少傳代 3 次，在擴增階段至少傳代 4 次，在擴增階段至少傳代 5 次，或在擴張階段至少傳代 6 次。
酶法採集細胞時，可能繼續擴增 8 代以上、9 代以上，甚至 10 代以上 (例如 11-15 代)。總細胞倍增的數量可以增加至大於 30，例如 31、32、33、34 或更多。(參見國際專利申請公開號 WO 2017/021973，其以全文引用之方式併入本文)。
根據本文所描述之方法產生的 RPE 細胞群可根據許多不同的參數來表徵。因此，例如，獲得的 RPE 細胞可為多邊形的並且是色素沉著的。
應當理解，本文揭露之細胞群及細胞組成物通常不含未分化的人胚胎幹細胞。根據一些實施例，少於 1:250,000 的細胞是 Oct4+TRA-1-60+ 細胞，例如藉由 FACS 測量。如藉由 PCR 所測量，細胞亦可能具有下調 (超過 5,000 倍) GDF3 或 TDGF 的表現。此態樣之 RPE 細胞基本上不表現胚胎幹細胞標記。該一種或多種胚胎幹細胞標記可包含 OCT-4、NANOG、Rex-1、鹼性磷酸酶、Sox2、TDGF-β、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60 及/或 TRA-1-81。
治療性 RPE 細胞製劑可基本上純化，相對於非 RPE 細胞，包含至少約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或 100% RPE 細胞。RPE 細胞製劑可基本上不含非 RPE 細胞或由 RPE 細胞組成。例如，RPE 細胞的基本上純化的製劑可包含小於約 25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%，或 1% 非 RPE 細胞類型。例如，RPE 細胞製劑可包含小於約 25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%, 0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02 %、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002% 或 0.0001% 非 RPE 細胞。
RPE 細胞製劑對於非 RPE細胞及對於其他成熟度水平的 RPE 細胞均可為基本上純的。就非 RPE 細胞而言，製劑可基本上純化，並富集成熟 RPE 細胞。例如，在富含成熟 RPE 細胞的 RPE 細胞製劑中，至少約 30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90 %、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99% 或 100% 的 RPE 細胞是成熟的 RPE 細胞。就非 RPE 細胞而言，該等製劑可基本上純化，並富集分化的 RPE 細胞而不是成熟的 RPE 細胞。例如，至少約 30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的 RPE 細胞可為分化的 RPE 細胞而不是成熟的 RPE 細胞。
本文所描述之製劑可基本上不含細菌、病毒或真菌污染或感染，包括但不限於存在 HIV I、HIV 2、HBV、HCV、HAV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、微小病毒 B19、艾司坦-巴爾病毒 (Epstein-Barr virus) 或皰疹病毒 1 及 2、SV40、HHVS、6、7、8、CMV、多瘤病毒、HPV、腸道病毒。本文所描述之製劑可基本上不含黴漿菌污染或感染。
表徵本文所揭露之細胞群的另一種方式是藉由標記表現。因此，例如，如藉由免疫染色所測量，至少 80%、85%、90%、95% 或 100% 的細胞可表現斑萎蛋白 1。根據一個實施例，80-100% 的細胞表現斑萎蛋白 1。
根據其他實施例，如藉由免疫染色所測量，至少 80%、85%、87%、89%、90%、95%、97% 或 100% 的細胞表現小眼畸形相關轉錄因子 (MITF)。例如，80-100% 的細胞表現 MITF。
根據其他實施例，如藉由免疫染色所測量，至少 80%、85%、87%、89%、90%、95%、97% 或 100% 的細胞表現小眼畸形相關轉錄因子 (MITF) 及斑萎蛋白 1 兩者。例如，80-100% 的細胞共同表現 MITF 及斑萎蛋白 1。
根據其他實施例，如藉由免疫染色所測量，至少 80%、85%、87%、89%、90%、95%、97% 或 100% 的細胞表現小眼畸形相關轉錄因子 (MITF) 及 Z0-1。例如，80-100% 的細胞共同表現 MITF 及 Z0-1。
根據其他實施例，如藉由免疫染色所測量，至少 80%、85%、87%、89%、90%、95%、97% 或 100% 的細胞表現 Z0-1 及斑萎蛋白 1。
例如，80-100% 的細胞共同表現 Z0-1 及斑萎蛋白 1。
根據另一個實施例，如藉由免疫染色或 FACS 所測量，至少 50%、60%、70%、80%、85%、87%、89%、90%、95%、97% 或 100% 的細胞表現配對盒基因 6 (PAX-6)。例如，至少 50% 與 100% 之間的細胞表現配對盒基因 6 (PAX-6)。
根據另一實施例，如藉由免疫染色所測量，至少 80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％ 或 100％ 的細胞表現細胞視黃醛結合蛋白 (CRALBP)。例如，80-100% 的細胞表現 CRALBP。
根據另一實施例，如藉由免疫染色所測量，至少 80%、85%、87%、89%、90%、95%、97% 或 100% 的細胞表現細胞黑素細胞譜系特異性抗原 GP100 (PMEL17)。例如，約 80-100% 的細胞表現 PMEL17。
RPE 細胞可共同表現指示終末分化的標記，例如斑萎蛋白 1、CRALBP 及/或 RPE65。根據一個實施例，至少 95%、至少 96%、至少 97%、至少 98%、至少 99%、至少 100%、或甚至在約 50% 至 100% 之間的 RPE 細胞群獲得的細胞共同表現前黑素體蛋白 (PMEL17) 及細胞視黃醛結合蛋白 (CRALBP)。
根據特定實施例，細胞共同表現 PMEL17 (SwissProt 第 P40967 號) 及至少一種選自由以下所組成之群組的多肽：細胞視黃醛結合蛋白 (CRALBP；SwissProt 第 P12271 號)、卵磷脂視黃醇醯基轉移酶 (LRAT；SwissProt 第 095327 號) 及性別決定區 Y-box 9 (SOX 9；P48436)。
根據特定實施例，至少 80% 的細胞群表現可偵測水平的 PMEL17 及上述多肽之一 (例如 CRALBP)，更佳至少 85% 的細胞群表現可偵測水平的 PMEL17 及上述多肽之一 (例如 CRALBP)，更佳至少 90% 的細胞群表現可偵測水平的 PMEL17 及上述多肽之一 (例如 CRALBP)，更佳至少 95% 的細胞群表現可偵測水平的 PMEL17 及上述多肽之一 (例如 CRALBP)，更佳 100％ 的細胞群表現可偵測水平的 PMEL17 及上述多肽之一 (例如藉由熟習此項技術者已知的方法分析的 CRALBP) (例如 FACS)。
根據另一實施例，如與未分化的 ESC 相比，CRALBP 及上述多肽之一 (例如 PMEL17) 共同表現的水平 (例如藉由平均熒光強度所測量) 增加至少兩倍，更佳至少 3 倍，更佳至少 4 倍，及甚至更佳至少 5 倍、至少 10 倍、至少 20 倍、至少 30 倍、至少 40 倍、至少 50 倍。
在一個實施例中，RPE 是末端分化的並且通常不表現 Pax6。在另一實施例中，RPE 細胞是終末分化的並且通常表現 Pax6。
本文所描述之 RPE 細胞亦可在移植後充當功能性 RPE 細胞，其中 RPE 細胞可在接受移植細胞之患者的神經感覺視網膜與脈絡膜之間形成單層。RPE 細胞亦可為相鄰的感光受體供應營養，並藉由吞噬作用處理脫落的感光受體外段。
根據一個實施例，單層細胞的跨上皮電阻大於 100 歐姆。
較佳的是，細胞的跨上皮電阻大於 150、200、250、300、300、400、500、600、700、800 或甚至大於 900 歐姆。該電阻可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。
用於測量跨上皮電阻 (TEER) 的裝置在本領域中是已知的並且包括例如 EVOM2 跨膜電阻儀 (世界精密儀器 (World Precision Instruments))。
在擴增階段之後，獲得包含 RPE 細胞的細胞群，其中其至少 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或甚至 100% 為 CRALBP+PMEL1 7+。
本領域技術人員將很好地理解，RPE 細胞的衍生是非常有益的。其可用作開發新藥以促進其存活、再生及功能的活體外模型。RPE 細胞可用於高通量篩選對 RPE 細胞具有毒性或再生作用的化合物。其可用於揭示對感光受體細胞的發育、分化、維持、存活及功能很重要的機制、新基因、可溶性或膜結合因子。
本文所描述之 RPE 細胞亦可用作 RPE 細胞的無限來源，用於移植、補充及支持視網膜退化及其他退行性病症中的機能不全或退化的 RPE 細胞。此外，遺傳修飾的 RPE 細胞可用作載體在移植後在眼睛及視網膜中攜帶並表現基因。
在某些實施例中，RPE 細胞組成物可根據以下方法生產：(1) 在帶有人類血清白蛋白 (HSA) 的 NUT+ 中在 CW 盤上的 hUCF 上培養 hESC 2 週，(2) 機械傳代以在帶有 HSA 的 NUT+ 中在 CW 盤中的 hUCF 上擴增 hESC 4 至 5 週 (或直至所需細胞數量)，(3) 繼續在帶有 HSA 的 NUT+ 中在 6 cm 盤中的 hUCF 上擴增 hESC 菌落 (使用例如膠原酶) 再一週，(4) 藉由在帶有菸鹼醯胺 (NIC) 的 NUT 中將菌落自約 5 個 6 cm 盤轉移至 1 個 HydroCell 中約 1 週來製備球體，(5) Lam511 上的 SB 的展平可藉由在帶有菸鹼醯胺 (NIC) 的 NUT 中將 SB 轉移至 6 孔盤的 2-3 個孔中約 1 週來進行，(6) 在帶有 NIC 及活化素的 NUT 中在 Lam511 上培養黏附細胞約一至兩週，並用帶有 NIC 的 NUT 及培養物置換培養基一至三週，(7) 使用酶 (諸如 TrypLE Select) 富集著色細胞，(8) 在 20% 人類血清及 NUT- 中將 RPE 細胞在燒瓶中的明膠上擴增約 2 至 9 週 (更換培養基)，以及 (9) 收穫 RPE 細胞。
可使用本領域已知的方法 (例如使用諸如胰蛋白酶的酶，或以化學方式使用 EDTA 等) 來實現擴增的 RPE 細胞群的收穫。在一些實施例中，RPE 細胞可使用適當的溶液洗滌，諸如 PBS 或 BSS plus。在其他實施例中，可在調配用於冷凍保存的 RPE 細胞組成物之前過濾 RPE 細胞並在解凍後直接投予個體。在一些實施例中，過濾後細胞的存活率百分比為至少約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。在一些實施例中，在中和溶液中儲存約 0 至約 8 小時的過濾後細胞的存活率百分比為至少約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
在其他實施例中，在中和培養基中儲存約 0 至約 8 小時然後在冷凍保存的培養基中儲存約 0 至約 8 小時的過濾後細胞的存活率百分比為至少約 75%、80%、85 %、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。在其他實施例中，在中和培養基中儲存約 0 至約 8 小時，然後在冷凍保存的培養基中儲存約 0 至約 8 小時的過濾後細胞的回收百分比為至少約 70%、75%、80 %、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
在其他實施例中，在冷凍保存的組成物解凍後，在中和培養基中儲存約 0 至約 8 小時，然後在冷凍保存的培養基中儲存約 0 至約 8 小時，過濾後細胞的存活率百分比為至少約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。在其他實施例中，在冷凍保存的組成物解凍後，在中和培養基中儲存約 0 至約 8 小時，然後在凍存培養基中儲存約 0 至約 8 小時，過濾後細胞的回收百分比為至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
在一些實施例中，在冷凍保存的組成物解凍後，在中和培養基中儲存約 0 至約 8 小時，然後在冷凍保存的培養基中儲存約 0 至約 8 小時，過濾後的 RPE 細胞能夠以約 1,500 ng/ml/天至約 4,500 ng/ml/天、約 2,000 ng/ml/天至約 3,000 ng/ml/天之間分泌 PEDF。該濃度可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。在其他實施例中，在冷凍保存的組成物解凍後，過濾後的 RPE 細胞在中和培養基中儲存約 0 至約 8 小時，然後在冷凍保存的培養基中儲存約 0 至約 8 小時，過濾後的 RPE 細胞能夠在 14 天內擴增至至少約 1.2x10 6及 5 x10 6之間，或約 2.5x x10 6至約 4 x10 6個細胞。
在一些實施例中，在室溫下在中和培養基中儲存約 0 至約 8 小時的過濾後 RPE 細胞的存活率百分比為至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。在一些實施例中，在室溫下在冷凍保存的培養基中儲存約 0 至約 8 小時的過濾後 RPE 細胞的存活率百分比為至少約 70%、75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。在其他實施例中，在室溫下在中和溶液中儲存約 0 至約 8 小時，然後在室溫下在冷凍保存的培養基中儲存約 0 至約 8 小時的過濾後細胞的存活率百分比為至少約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。在其他實施例中，在室溫下在中和溶液中儲存約 0 至約 8 小時，然後在室溫下在冷凍保存的培養基中儲存約 0 至約 8 小時的過濾後細胞的回收百分比為至少約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、140%、150%。
收穫後，可以將擴增的 RPE 細胞群調配成特定的治療劑量 (例如細胞數量) 並冷凍保存以運送至診所。然後可以在解凍後直接投予即用型 (RTA) RPE細胞治療組成物而無需進一步處理。適用於冷凍保存的培養基的實例包括但不限於 90% 人類血清/10% DMSO、培養基 3 10% (CS10)、培養基 2 5% (CS5) 及培養基 1 2% (CS2)、幹細胞庫、PRIME XV° FREEZIS、HYPOTHERMASOL®、海藻糖等。
在適合解凍後即用型 (RTA) 應用的冷凍保存的培養基中調配的 RPE 細胞可包含懸浮於腺苷、葡聚醣 40、乳糖酸、HEPES (N-(2-羥乙基) 哌𠯤 N'-(2-乙磺酸))、氫氧化鈉、L-麩胱甘肽、氯化鉀、碳酸氫鉀、磷酸鉀、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、氯化鈣、氯化鎂、氫氧化鉀、氫氧化鈉、二甲基亞碸 (DMSO) 及水中的 RPE 細胞。該低溫保存培養基的一個實例可以以商品名 CRYOSTOR® (例如，CRYOSTOR®5) 商購併且由 BioLife Solutions, Inc. 製造。
在其他實施例中，冷凍保存培養基包括：嘌呤核苷 (例如，腺苷)、支鏈葡聚醣 (例如，葡聚醣 40)、兩性離子有機化學緩沖劑 (例如，HEPES (N-(2-羥乙基) 哌𠯤 EN'-(2E 乙磺酸)))，以及細胞可耐受的極性非質子溶劑 (例如，二甲亞碸 (DMSO))。在其他實施例中，一種或多種嘌呤核苷、支鏈葡聚醣、緩沖劑及極性非質子溶劑通常被美國 FDA 認為是安全的。
在一些實施例中，冷凍保存培養基進一步包括以下中之一種或多種：糖酸 (例如乳糖酸)、鹼 (例如氫氧化鈉、氫氧化鉀)、抗氧化劑 (例如 L-麩胱甘肽) 中之一種或多種、一種或多種鹵化物鹽 (例如，氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂)、鹼式鹽 (例如，碳酸氫鉀)、磷酸鹽 (例如，磷酸鉀、磷酸鈉、磷酸鉀)、一種或多種糖 (例如，葡萄糖、蔗糖)、糖醇 (例如甘露醇) 以及水。
在其他實施例中，糖酸、鹼、鹵化物鹽、鹼式鹽、抗氧化劑、磷酸鹽、糖、糖醇中之一種或多種通常被美國 FDA 認為是安全的。
DMSO 可用作冷凍保護劑，以防止冰晶的形成，冰晶可以在冷凍保存過程中殺死細胞。在一些實施例中，可冷凍保存的 RPE 細胞治療組成物包含約 0.1％ 至約 2％ DMSO (v/v)。在一些實施例中，RTA RPE細胞治療組成物包含約 1％ 至約 20％ DMSO。在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物包含約 2% DMSO。在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物包含約 5% DMSO。
在一些實施例中，調配於適合解凍後即用型應用的冷凍保存培養基中之 RPE 細胞療法可包含懸浮於不含 DMSO 的冷凍保存培養基中的 RPE 細胞。例如，RTA RPE 細胞治療組成物可包含懸浮於 Trolox、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、cl-、H2P04-HEPES、乳糖酸鹽、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、葡聚醣-40、腺苷、麩胱甘肽中之 RPE 細胞，而沒有 DMSO (二甲亞碸、(CH3)2SO) 或任何其他偶極非質子溶劑。該冷凍保存培養基之實例可以商品名 HYPOTHERMOSOL® 或 HYPOTHERMOSOL®-FRS 商購，並且亦由 BioLife Solutions, Inc. 製造。在其他實施例中，調配於適用於解凍後即用型應用的冷凍保存培養基中之 RPE 細胞組成物可包含懸浮於海藻糖中之 RPE 細胞。
根據本揭露調配之 RTA RPE 細胞療法不需要使用 GMP 設施在註射至個體眼睛之前製備最終劑量調配物。本文所描述之 RTA RPE 細胞治療調配物可冷凍保存於無毒冷凍溶液中，該冷凍溶液包含可以直接運送至臨床部位的最終劑量調配物。需要時，可以將調配物解凍並投予個體的眼睛，而無需進行任何中間製備步驟。
在一些實施例中，RPE 細胞組成物可在約 -4℃ 至約 -200℃ 之間的溫度下冷凍保存並儲存。在一些實施例中，RPE 細胞組成物可在約 -20℃ 至約 -200℃ 之間的溫度下冷凍保存並儲存。在一些實施例中，RPE 細胞組成物可在約 -70°C 至約 -196°C 之間的溫度下冷凍保存並儲存。在一些實施例中，足以用於冷凍保存的溫度或冷凍保存溫度包含約 -4℃ 至約 -200°C 之間的溫度，或約 -20°C 至約 -200°C，-70°C 至約 -196 °C 之間的溫度。
在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物可冷凍儲存約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或 31 天。在其他實施例中，RPE 細胞可冷凍儲存約 1.5 至 48 個月。在其他實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物可冷凍儲存約 1 至約 48 個月而不降低存活率或細胞恢復百分比。在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物可在 2-8°C 下儲存至少約 38 小時，同時保持穩定性。
在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物可冷凍運送超過 8,000 英里而不降低存活率百分比、細胞恢復百分比或效力。
例如，可以根據 Idelson M、Alper R、Obolensky A 等人 (將人胚胎幹細胞定向分化為功能性 RPE 細胞。Cell Stem Cell 2009；5:396-408) 或根據 Parul Choudhary 等人，(「引導多能幹細胞向視網膜色素上皮譜係分化」，Stem Cells Translational Medicine，2016)，或 WO 2008129554 的方法生產 RPE 細胞，其均以全文引用之方式併入本文。
RTA RPE 細胞治療組成物可視情況包含支持 RPE 植入、整合、存活、效力等的額外因子。在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物包含本文所描述之 RPE 細胞製劑的功能活化物。在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物包含菸鹼醯胺。在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物包含濃度在約 0.01-100 mM、0.1-100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM 之間，例如 10 mM 的菸鹼醯胺。在其他實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物包含視黃酸。在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物包含濃度在約 0.01-100 mM、0.1-100 mM、0.1-50 mM、5-50 mM、5-20 mM 之間，例如 10 mM 的視黃酸。該濃度可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。
在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物可調配成包括各種整聯蛋白的活化劑，此等整聯蛋白已顯示可增加 RPE 細胞製劑 (諸如本文所描述之彼等製劑)對布魯赫膜的黏附。例如，在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物包含濃度在約 5 μM 及 1,000 μM 之間的細胞外錳 (Mn2+)。在其他實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物包含構象特異性單株抗體 TS2/16。
在其他實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物亦可經調配為包括 RPE 細胞免疫調節活性的活化劑。
在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物可包括 ROCK 抑製劑。
在一些實施例中，RTA RPE 細胞治療組成物可調配於培養基中，該培養基包含藉由清除自由基、pH 緩衝劑、腫脹/滲透支持及維持離子濃度平衡來降低冷凍及解凍過程期間的分子細胞壓力的組分。
在一些實施例中，調配於適合解凍後即用型應用的冷凍保存培養基中之 RPE 細胞療法可包含一種或多種免疫抑制化合物。在某些實施例中，調配於適合解凍後即用型應用的冷凍保存培養基中之 RPE 細胞療法可包含一種或多種免疫抑制化合物，其經調配用於緩慢釋放一種或多種免疫抑制化合物。與本文所描述之調配物一起使用的免疫抑制化合物可屬於以下免疫抑製藥物類別：糖皮質素、細胞抑製劑 (例如烷化劑或抗代謝物)、抗體 (多株或單株)、作用於免疫親和素的藥物 (例如環孢素、他克莫司 (Tacrolimus) 或西羅莫司 (Sirolimus))。其他藥物包括干擾素、類鴉片、TNF 結合蛋白、黴酚酸酯及小型生物製劑。免疫抑製藥物之實例包括：間充質幹細胞、抗淋巴細胞球蛋白 (ALG) 多株抗體、抗胸腺細胞球蛋白 (ATG) 多株抗體、硫唑嘌呤、BAS 1L1 X 1MAB® (抗 I L-2Ra 受體抗體)、環孢素 (環孢素 A)、DACLIZUMAB® (抗 I L-2Ra 受體抗體)、依維莫司 (everolimus)、黴酚酸、RITUXUMAB® (抗 CD20 抗體)、西羅莫司、他克莫司、他克莫司及或黴酚酸酯 (Mycophenolate mofetil)。
PCT/US2018/023030 (WO 2018/170494) 中描述用於產生如本揭露中所設想的 RPE 細胞的其他方法，其內容以全文引用之方式併入本文。
PCT/IB2018/001579 (WO 2019/130061) 中描述用於產生如本揭露中所設想的「解凍及注射」調配物的其他方法，其內容以全文引用之方式併入本文。
在某些實施例中，RPE 細胞療法可以約 100,000 個細胞/ml 至約 1,000,000 個細胞/ml 的細胞濃度調配。在某些實施例中，RPE 細胞療法可以約 1,000,000 個細胞/ml、約 2,000,000 個細胞/ml、約 3,000,000 個細胞/ml、約 4,000,000 個細胞/ml、約 5,000,000 個細胞/ml、6,000,000 個細胞/ml、7,000,000 個細胞/ml、8,000,000 個細胞/ml、約 9,000,000 個細胞/ml、約 10,000,000 個細胞/ml、約 11,000,000 個細胞/ml、約 12,000,000 個細胞/ml、13,000,000 個細胞/ml、14,000,000 個細胞/ml、15,000,000 個細胞/ml、16,000,000 個細胞/ml、約 17,000,000 個細胞/ml、約 18,000,000 個細胞/ml、約 19,000,000 個細胞/ml 或約 20,000,000 個細胞/ml 的細胞濃度調配。該細胞濃度可為包括端點的引述範圍內的任何值或子範圍。
在一些實施例中，RPE 細胞在治療或醫藥上可接受之載劑或生物相容性培養基中投予。在一些實施例中，投予至個體的 RPE 調配物的體積為約 10 μl 至約 50 μl、約 20 μl 至約 70 μl、約 20 μl 至約 100 μl、約 25 μl 至約 100 μl、約 100 μl µl 至約 150 µl，或約 10 µl 至約 200 µl。在某些實施例中，可以投予 10 μl 與 200 μl 之間的兩種或兩種以上劑量的 RPE 調配物。在某些實施例中，將一定體積的 RPE 調配物投予至個體眼睛的視網膜下腔。在某些實施例中，視網膜下遞送方法可以是經玻璃體的或脈絡膜上的。在一些實施例中，對於一些個體，可使用經玻璃體或脈絡膜上視網膜下遞送方法來減少 ERM 的發生。在一些實施例中，可以將一定體積的 RPE 調配物注射至個體的眼睛中。
在一些實施例中，細胞治療劑的 RPE 細胞是人類 RPE 細胞。
在一些實施例中，RPE 細胞是 OpRegen® 細胞。OpRegen 是一種 RPE 細胞株，其衍生自人胚胎 (hESC) 細胞株，在低氧 (5%) 培養條件下補充高濃度的活化素 A、轉化生長因子 β (TGF-b) 家族及菸鹼醯胺，然後轉換為正常氧 (20%) 培養以富集 RPE 群體。活化素 A 可提高在剛性或剛性但不柔軟的受質上的RPE 細胞存活率。因此，與天然 RPE 細胞相比，OpRegen 已獲得額外的生物學能力，提高了在惡劣微環境中的存活率，諸如在 GA 環境中，布魯赫膜退化並變得僵硬或增厚。在 OpRegen 細胞分泌的 120+ 多種已鑑別的蛋白質中，色素上皮衍生之因子 (PEDF)、血小盤衍生之生長因子 (PDGF)、血管內皮生長因子 (VEGF)、斑萎蛋白、血管生成素、CRLABP、TIMP-2、TIMP-1、IL-6、PMEL-1 (暗色體)、整合素、TNF-a 及補體保護蛋白是高水平的分泌蛋白。其效力已在第 21 天藉由基礎 PEDF/VEGF 比率及頂端 VEGF/PEDF 比率進行測試，兩者均＞ 1。值得注意的是，高氧水平會增加 PEDF 分泌。懸浮配方的 OpRegen 在 2-8 °C 下 24 小時仍可產生 PEDF，此表明其穩健性。
OpRegen 以 2000-4000 ng/ml/天的速度分泌極高水平的 PEDF，此可以解釋其高治療效力，因為 PEDF 在 RPE 中對 BRB 具有抗氧化作用，這對 AMD 適應症很感興趣。PEDF 是RPE 及穆勒膠質細胞在活體內分泌的 50kDa 的蛋白質；其亦展示感光受體的神經保護功能，可能係經由恢復受衰老及氧化壓力干擾的線粒體動力學。PEDF 可以防止 H202 引起的 RPE 滲透性變化，並保持 RPE 對氧化壓力的屏障功能。經由與主因子 NF-KappaB 的相互作用，PEDF 亦是內源性抗炎因子。PEDF 與細胞外基質 (膠原蛋白及蛋白聚醣)結合，並經由抑制 TGF-β 在糖尿病視網膜病變及濕性 AMD 中發揮抗纖維化作用。部分地，PEDF 分泌支持 OpRegen 治療個體的發現，如熒光素血管造影 (FA) 改善彼等具有/不具有玻璃膜疣的人，以及早在移植後 2-4 週就可以看到 GA 病變內可能存在 ECM 重塑或疤痕衰減跡象的 OCT 成像。
適用於本揭露範疇內的 RPE 細胞不限於本文所描述之 RPE 細胞。可使用任何市售的或以其他方式可獲得的 RPE 細胞。
在一些實施例中，本文所描述之細胞治療劑能夠恢復視網膜疾病的視網膜結構。
恢復患者視網膜的解剖學可與「恢復 (restoration)」及「恢復 (restoring)」互換使用，並且意謂與年齡匹配、性別匹配的對照、基線或對側眼相比，恢復或復原患者的正常結構；恢復正常解剖結構的區域，如藉由受影響區域的橢圓體帶 (EZ) 的變化、OCT 證明的 RPE 植入及改善的視網膜厚度確定；恢復或誘導視網膜色素上皮 (RPE) 的再生；恢復正常解剖結構的區域，由受影響區域的橢圓體 (EZ) 的變化、OCT 證明的 RPE 植入和改善的視網膜厚度確定；恢復視力；減少萎縮性視網膜的萎縮區域；恢復視網膜的一個或多個視網膜層；恢復視網膜的感光受體；恢復視網膜的外核層 (ONL)；恢復視網膜的橢圓體帶 (EZ)；恢復視網膜中央凹；恢復視網膜的血液-視網膜屏障 (BRB)；並恢復視網膜的細胞外基質 (ECM)。
恢復或復原患者視網膜的功能意謂視網膜層恢復至其正常結構並且 RPE 細胞執行活動，諸如光吸收、上皮轉運、感光受體外段 (POS) 膜的吞噬作用及分泌諸如 PEDF 及感光受體的因子具有功能活性並能夠進行光轉導，從而實現功能性視覺。
「復原 (Recovery)」及「復原 (recover)」及「復原 (recovers)」及「復原 (recovering)」可互換使用，意謂橢圓體帶的復原；藉由恢復正常架構進行復原；如與年齡匹配、性別匹配的對照、基線或對側眼相比；主觀評估以下一項或多項變得更有條理，包括外界膜、肌樣區 (感光受體的內段)、橢圓體帶 (IS/OS 連接)、感光受體的外段、玻璃膜疣的丟失，以及網狀假玻璃膜疣消失；對視網膜的一個或多個基本基礎層變得更有條理的主觀評估，包括但不限於一個或多個外界膜、肌樣區 (感光受體的內段)、橢圓體帶 (IS/OS 連接) 及感光受體的外段；證明與基線微視野檢查評估相比，在 RPE 細胞投予位點附近或投予位點處的視網膜位點包含改進的微視野檢查評估；橢圓體帶的復原，包含改進 EZ-RPE 厚度、面積或體積測量中之一項或多項；EZ-RPE 中央凹平均厚度改進；EZ-RPE 中央凹厚度改進；EZ-RPE 中央子場體積改進；色素上皮及視網膜厚度的復原；視網膜基礎層的組織；以及2 - 6 的12 -14 層的視網膜的組織。 治療及劑量
可投予至個體的活細胞的數量通常在每劑至少約 50,000 與約 5x10 6之間。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 50,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 100,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 150,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 200,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 250,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 300,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 350,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 400,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 450,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 500,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含至少約 600,000、至少約 700,000、至少約 800,000、至少約 900,000、至少約 1,000,000、至少約 2,000,000、至少約 3,000,000、至少約 4,000,000、至少約 5,000,000、至少約 6,000,000、至少約 7,000,000、至少約 8,000,000、至少約 9,000,000、至少約 10,000,000、至少約 11,000,000 或至少約 12,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 50,000 至 100,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 100,000 至 200,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 200,000 至 300,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 300,000 至 400,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 400,000 至 500,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 500,000 至 1,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 1,000,000 至 2,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 2,000,000 至 3,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 3,000,000 至 4,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 4,000,000 至 5,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 5,000,000 至 6,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 6,000,000 至 7,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 7,000,000 至 8,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 8,000,000 至 9,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 9,000,000 至 10,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 10,000,000 至 11,000,000 個活細胞。在一些實施例中，細胞治療劑包含 11,000,000 至 12,000,000 個活細胞。在具體實施例中，細胞治療劑以 50,000 至 1,000,000 個細胞的劑量投予。在具體實施例中，細胞治療劑以 100,000 至 750,000 個細胞的劑量投予。在具體實施例中，細胞治療劑以 200,000 至 500,000 個細胞的劑量投予。本文所述之每個值或範圍可包括包括端點之其間的任何值或子範圍。
在一些實施例中，投予至個體的RTA RPE 調配物的體積在約 50 μl 至約 100 μl、約 25 μl 至約 100 μl、約 100 μl 至約 150 μl，或約 10 μl 至約 200 μl 之間。在某些實施例中，可以投予介於 10 μl 與 200 μl 之間的兩個劑量之 RTA RPE 調配物。本文所述之每個值或範圍可包括包括端點之其間的任何值或子範圍。
在某些實施例中，將一定體積之 RTA RPE 調配物投予至個體眼睛的視網膜下腔。在某些實施例中，視網膜下遞送方法可以是經玻璃體的或脈絡膜上的。在一些實施例中，可以將一定體積之 RTA RPE 調配物注射至個體的眼睛中。
在某些實施例中，可將 RTA RPE 治療性細胞組成物以約 100,000 個細胞/ml 至約 1,000,000 個細胞/ml 之間的細胞濃度調配。在某些實施例中，RTA RPE 細胞療法可以約 1,000,000 個細胞/ml、約 2,000,000 個細胞/ml、約 3,000,000 個細胞/ml、約 4,000,000 個細胞/ml、約 5,000,000 個細胞/ml、6,000,000 個細胞/ml、7,000,000 個細胞/ml、8,000,000 個細胞/ml、約 9,000,000 個細胞/ml、約 10,000,000 個細胞/ml、約 11,000,000 個細胞/ml、約 12,000,000 個細胞/ml、13,000,000 個細胞/ml、14,000,000 個細胞/ml、15,000,000 個細胞/ml、16,000,000 個細胞/ml、約 17,000,000 個細胞/ml、約 18,000,000 個細胞/ml、約 19,000,000 個細胞/ml 或約 20,000,000 個細胞/ml 的細胞濃度調配。本文所述之每個值或範圍可包括包括端點之其間的任何值或子範圍。
在實施例中，該方法包括將 RPE 細胞投予至個體的眼睛。在實施例中，該方法包括在個體眼睛的視網膜下腔投予 RPE 細胞。在實施例中，該方法包括將 RPE 細胞投予至玻璃體腔、視網膜內層或外層、視網膜周邊或個體眼睛的脈絡膜內。在實施例中，該方法包括在 GA 病變上投予 RPE 細胞。在實施例中，該方法包括以個體眼睛中之 GA 為目標。在實施例中，該方法包括藉由提起 GA 來投予 RPE 細胞。在實施例中，該方法包括在 GA 病變附近的週圍健康組織上投予 RPC 細胞。在實施例中，RPE 細胞作為單層投予。在一些實施例中，注射細胞組成物。
如本文所描述產生的 RPE 細胞可移植至個體眼睛或其他位置 (例如大腦中) 內的各種目標位點。根據一個實施例，RPE 細胞移植至眼睛的視網膜下腔，其為 RPE 的正常解剖位置 (在感光受體外段及脈絡膜之間)。此外，根據細胞的遷移能力及/或正旁分泌作用，可以考慮移植至額外的眼部隔室，包括但不限於玻璃體腔、視網膜內層或外層、視網膜周邊及脈絡膜內。
移植可藉由本領域已知的各種技術完成。進行 RPE 移植之方法描述於例如美國專利第 5,962,027 號、第 6,045,791 號及 第 5,941,250 號以及 Eye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol 1997 年 3 月；235 (3)：149-58；Biochem Biophys Res Commun 2000 年 2 月 24 日; 268 (3): 842-6；Opthalmic Surg 1991 年 2 月；22(2): 102-8。進行角膜移植之方法描述於例如美國專利第 5,755,785 號及 Eye 1995 中；9 (Pt 6 Su): 6-12；Curr Opin Opthalmol August 1992；3 (4)：473-81；Ophthalmic Surg Lasers 1998 年 4 月；29 (4): 305-8；Ophthalmology 2000 年 4 月；107 (4): 719-24；及 Jpn J Ophthalmol 1999 年 11 月-12 月；43 (6)：502-8。若主要利用旁分泌效應，細胞亦可在封裝於半透性容器或可生物降解的細胞外基質中的眼睛中遞送及維持，這亦將減少細胞對宿主免疫系統的暴露 (Neurotech USA CNTF 遞送系統；PNAS 2006 年 3 月 7 日，第 103 (10) 卷 3896-3901)。
在一些實施例中，細胞治療劑被植入鄰近萎縮的視網膜。
在實施例中，細胞治療劑鄰近 GA 投予。在實施例中，將細胞治療劑投予至 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 20％ 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 30% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 40% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 50% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 60% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 70% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 75% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 80% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 85% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 90% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 95% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 96% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 97% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 98% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋至少約 99% 的 GA。在實施例中，細胞治療劑在投予後覆蓋約 100％ 的 GA。
根據一個實施例，移植是藉由帕爾斯平面玻璃體切除手術進行的，隨後經由小的視網膜開口將細胞遞送至視網膜下腔或藉由直接注射。
在某些實施例中，投予可包含玻璃體切除術，然後通過小視網膜切開術經由套管將 RTA 治療細胞組成物遞送至黃斑區的視網膜下腔中。根據細胞劑量，總體積為 50-100 µL 的細胞懸浮液可植入有潛在 GA 擴增風險的區域。
在一些實施例中，進行單次外科手術，其中在玻璃體切除術後，RTA 治療細胞組成物經由小的視網膜切開術被遞送至在黃斑區域中產生的視網膜下腔中，沿著 GA 區域之間的邊界，若存在，並且更好地保留中央凹外視網膜及 RPE 層。置放蓋窺器後，可以進行標準的 3 端口玻璃體切除術。此可包括置放一個 23G 或 25G 輸液套管及兩個 23G 或 25/23G 端口 (套管針)。然後可以使用 23G 或 25G 器械進行核心玻璃體切除術，然後分離後玻璃體面。RTA 治療細胞組成物可在後極內的預定位點處注射至視網膜下腔中，若存在，較佳的是在接近 GA 邊界處仍相對保留的區域中穿透視網膜。
在一些實施例中，細胞組成物藉由脈絡膜上註射投予。
RPE 細胞可以多種形式移植。例如，可將 RPE 細胞以單細胞懸浮液的形式引入靶位點，具有基質或黏附至基質或膜、細胞外基質或受質，諸如生物可降解聚合物或組合上。RPE 細胞亦可印刷至基質或支架上。RPE 細胞亦可與其他視網膜細胞一起移植 (共同移植)，例如與感光受體一起移植。治療的有效性可藉由視覺及眼部功能及結構的不同測量來評估，其中包括最佳矯正視敏度 (BCVA)、在黑暗及光照適應狀態、全視野、多焦點、焦點或模式視網膜電圖 5 ERG) 下藉由視野檢查或微視野檢查測量視網膜對光的敏感性、對比敏感度、閱讀速度、色覺、臨床生物顯微鏡檢查、眼底攝影、光學同調斷層掃描 (OCT)、眼底自發熒光 (FAF)、紅外及多色成像、熒光素或 ICG 血管造影、過繼光學及其他用於評估視覺功能及眼部結構的手段。
可以在投予 RPE 細胞之前或同時向個體投予皮質類固醇，諸如普賴蘇穠 (prednisolone) 或甲基普賴蘇穠 (methylprednisolone)、百力特 (Predforte)。根據另一實施例，個體在投予 RPE 細胞之前或同時不投予皮質類固醇，諸如普賴蘇穠或甲基普賴蘇穠、百力特。
免疫抑製藥物可在治療之前、同時及/或之後投予個體。免疫抑製藥物可屬於以下類別：糖皮質素、細胞抑製劑 (例如烷化劑或抗代謝物)、抗體 (多株或單株)、作用於免疫親和素的藥物 (例如環孢素、他克莫司 (Tacrolimus) 或西羅莫司 (Sirolimus))。其他藥物包括干擾素、類鴉片、TNF 結合蛋白、黴酚酸酯及小型生物製劑。免疫抑製藥物之實例包括：間充質幹細胞、抗淋巴細胞球蛋白 (ALG) 多株抗體、抗胸腺細胞球蛋白 (ATG) 多株抗體、硫唑嘌呤、BAS 1L1 X 1MABO (抗 I L-2Ra 受體抗體)、環孢素 (環孢素 A)、DACLIZUMAB ®(抗 I L-2Ra 受體抗體)、依維莫司、黴酚酸、RITUX 1MABO (抗 CD20 抗體)、西羅莫司、他克莫司、他克莫司及或黴酚酸酯。
免疫抑製藥物可投予至個體，例如，局部、眼內、視網膜內或全身。免疫抑製藥物可同時以一種或多種此等方法投予，或者遞送方法可以交錯的方法使用。
或者，可在不使用免疫抑製藥物的情況下投予 RTA RPE 細胞治療組成物。
可在治療之前、同時及/或之後向個體投予抗生素。抗生素之實例包括 Oflox、建它黴素、氯黴素、托百士 (tobrex)、莫西沙星 (vigamox) 或任何其他授權用於眼部的局部抗生素製劑。
在一些實施例中，細胞組成物在投予後不會引起炎症。在一些實施例中，炎症可以存在與炎症相關的細胞為特徵。
在一些實施例中，恢復導致萎縮區域減少。在治療後的特定時間，隨後眼底自發熒光 (FAF) 可以用於偵測任何高熒光，特別是在病變邊緣週圍，並可以測量萎縮區域的大小。除了病變整體大小減小外，病變週圍高熒光邊緣的大小減小或消失可以用於表明治療正在減慢或阻止疾病進展。可以測量經過治療的一半病變及未經治療的一半病變之間的高熒光差異，並用於確定治療的功效。因此，同一隻眼睛可用作治療個體及對照個體。
在一些實施例中，恢復導致萎縮區域減少。如本文所用，術語「降低」、「減少 (reduce)」、「減少 (reduction)」、「最小」、「低」或「較低」係指例如與對照相比降低至低於基礎水平。術語「增加」、「高」、「較高」、「最大」、「升高 (elevate)」或「升高 (elevation)」係指例如與對照相比增加高於基礎水平。與對照或標準水平相比，增加、升高、降低或減少可以是 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14 %、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。本文所述之每個值或範圍可包括包括端點之其間的任何值或子範圍。
在某些實施例中，治療導致視網膜層的恢復。在另一實施例中，使用光學同調斷層掃描 (OCT) 增強使用眼底自發熒光的二維成像的治療效果評估。OCT 可以用於生成三維高解析度圖像，並可以為視網膜層的結構評估提供重要的橫截面資訊，特別是在接受視網膜疾病治療的個體中。使用 OCT，可以在對視網膜病症投予治療之前及之後獲得視網膜各層的輪廓圖像。在健康的眼睛中，視網膜組織的各個層可以被視為清晰的條帶。相反，例如，由 AMD 或 GA 引起的特徵性缺陷可以被視為 RPE 及感光受體層中明顯劃分的退化區域。在許多患有 GA 的眼睛中，OCT 圖像可以顯示可以在布魯赫膜及外叢狀層之間形成的楔形低反射結構。鑑別並監測此類結構可以用於定義感光受體層的 OCT 界線，其在旨在保持 AMD 與 GA 患者視網膜層活力的療法的臨床試驗中非常重要。
藉由將 OCT 中視網膜層的分割與眼底自發熒光的代謝映射組合，可以更清楚地看到與功能變化相關的形態學變化。使用專門的軟體，可以量化及追蹤 FAF 圖像中的病變區域。亦可以鑑別治療效果，包括覆蓋病變的 RPE 再生區域，並且可以藉由測量視網膜的厚度來量化 RPE 的恢復。
在一些實施例中，治療導致感光受體的恢復。RPE 細胞參與許多對感光受體存活至關重要的過程，包括營養、水及離子轉運、光吸收、脫落的感光受體外段 (POS)的吞噬作用、全反式視網膜重新異構化為 11-順式視網膜、這對視覺週期、免疫調節、必需因子的分泌及血液-視網膜屏障的形成至關重要。RPE 單層充當 PR 及脈絡毛細血管 (CC) 之間的極化代謝看門人。RPE 具有自頂端至基底外側的結構及功能極性。在頂端，RPE 細胞形成多個絨毛，能夠與 POS 直接接觸，並將諸如葡萄糖及維生素 A 等分子自脈絡膜毛細血管轉運至 PR。在基底側，RPE 細胞將諸如 CO2、乳酸及水等代謝物轉運至脈絡膜毛細血管，並產生將 RPE 與脈絡膜分離的底層布魯赫膜 (BM)，從而產生血液-視網膜屏障。在側壁上，相鄰的 RPE 細胞形成緊密的連接。屏障功能可以用於藉由測量細胞之間形成的緊密連接來確定 RPE 細胞培養物的效力。RPE 緊密連接限制離子及水在 RPE 單層上的細胞旁運動，並維持 RPE 轉運蛋白的正確頂端-基底分佈。本文所揭露之 RPE 細胞組成物顯示由產生高於 100Ω (100Ω*cm 2)的跨上皮電阻 (TEER) 的能力確定的屏障功能。
此外，RPE 細胞分泌多種神經營養因子，諸如成纖維細胞生長因子 (bFGF和aFGF)、睫狀神經營養因子 (CNTF)、色素上皮衍生之因子 (PEDF)、腦衍生之神經營養因子 (BDNF)、血管內皮生長因子 (VEGF) 等，其有助於維持脈絡膜毛細血管內皮與感光受體的結構完整性。RPE 細胞亦分泌抗炎細胞介素，諸如轉化生長因子 (TGF)-β，這對於建立眼睛的免疫特權特性係重要的。本文所描述之 RTA 治療細胞組成物中使用的 RPE 細胞能夠分泌神經營養因子。本文所揭露之 RPE 細胞組成物亦證明了極化的 PEDF 及 VEGF 分泌，其分別增強 RPE 生長及血管形成。
在某些實施例中，RPE 細胞植入物藉由在植入後分泌此等因子為退化的視網膜組織提供持久的營養支持。此熱帶支持可起到減輕視網膜退化及視力喪失的作用。營養因子被稱為細胞存活及分化促進劑。營養因子及熱帶因子家族之實例包括但不限於神經營養因子、睫狀神經營養因子/白血病抑制因子 (CNTF/LIF) 家族、肝細胞生長因子/散射因子家族、胰島素樣生長因子 (IGF) 家族，以及膠質細胞系衍生之神經營養因子 (GDNF) 家族。本文所描述之 RPE 細胞可在投予或視網膜移植後立即開始分泌營養因子。此外，當細胞整合至受體細胞之間並與個體之細胞建立突觸接觸時，可能會開始穩定的神經保護支持。
在一些實施例中，RPE 細胞的治療/投予導致如 J. Cell. Mol. Med. 第 17 卷，第 7 期，2013 年，第 833-843 頁，以全文引用之方式併入本文。
在一些實施例中，治療可導致外核層 (ONL) 的恢復。ONL (或外顆粒層或外核層) 是脊椎動物視網膜的層之一，是眼睛的光檢測部分。與內核層一樣，外核層以包含數層橢圓形核體；其有兩種：棒狀顆粒及錐狀顆粒，因分別與下一層的棒狀及錐狀顆粒相連而得名。
球形棒狀顆粒的數量要多得多，並且分佈在整個層的不同高度。其細胞核呈奇特的橫條紋狀，自各細胞的任一端延伸出來都是一個精細的突起；外層過程與棒錐層中的單棒是連續的；內端在擴大的末端的外叢狀層中，並嵌入至桿狀雙極細胞的外突分解的簇中。在其過程中，其呈現出許多靜脈曲張。
莖狀錐形顆粒的數量少於桿狀顆粒，靠近外膜極限置放，其與桿及錐層的錐形連續。其沒有任何橫紋，但含有梨狀核，幾乎完全填滿細胞。從顆粒的內端，一個粗突起進入外叢狀層，並在那裡擴增成一個錐體擴大或足盤，從中釋放出許多細纖維，與錐形雙極的外突接觸。
在一些實施例中，治療可導致橢圓體帶的恢復，如本文別處所描述。
在一些實施例中，治療可導致視網膜中央凹的恢復。
在一些實施例中，治療可導致血液-視網膜屏障 (BRB) 的恢復或修復，如本文別處所描述。
在一些實施例中，恢復可能導致細胞外基質 (ECM) 的重塑。ECM 是由細胞外大分子及礦物質組成的三維網絡，如膠原蛋白、酶、糖蛋白及羥基磷灰石，其為週圍細胞提供結構及生化支持。由於多細胞性在不同的多細胞譜系中獨立進化，ECM 之組成因多細胞結構而異；然而，細胞黏附、細胞間通訊及分化是 ECM 的常見功能。
動物細胞外基質包括間質基質及基底膜。間質基質存在於各種動物細胞之間 (即細胞間隙)。多醣及纖維蛋白凝膠填充間質空間並充當壓縮緩衝液以抵抗施加在 ECM 上的壓力。基底膜是 ECM 的片狀沉積物，各種上皮細胞位於其上。動物的每種結締組織類型都有一種 ECM類型：膠原纖維及骨礦物質包含骨組織之 ECM；網狀纖維及基質包含疏鬆結締組織之 ECM；並且血漿是血液之 ECM。
在一些實施例中，恢復包含地圖狀萎縮的生長減少、視敏度改善、閱讀速度提高、視網膜結構改善、玻璃膜疣 (由 RPE 細胞去除的廢物) 減少或細胞的穩定植入中之一種或多種。
在實施例中，恢復包括減少地圖狀萎縮的生長。在實施例中，減少地圖狀萎縮之生長包括減小地圖狀萎縮的大小，例如減小萎縮的總面積。在實施例中，減少地圖狀萎縮之生長包括減少萎縮性病變的生長。在實施例中，萎縮性病變是分離的 (獨立於原發性 GA)。在實施例中，減少地圖狀萎縮之生長包括降低地圖狀萎縮的生長速率。在實施例中，將降低與對照進行比較，例如預期生長或生長速率、歷史生長或生長速率、未經治療的眼睛中的生長或生長速率、患有類似疾病或病症的個體的平均生長或生長速率，或可比個體之生長或生長速率。
在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 98％。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 95%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 90%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 85%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 80%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 75%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 70%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 65%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 60%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 50%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 40%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 30%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 25%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 20%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長小於對照的約 10%。在實施例中，地圖狀萎縮之生長在對照的約 1％ 與約 99％ 之間。在實施例中，地圖狀萎縮之生長在對照的約 10% 與約 90% 之間。值可以是包括端點之引述範圍內的任何值或子範圍。
在實施例中，恢復包括改善視敏度。在實施例中，視敏度之改善包括相對於對照之改善，例如治療前 (基線) 視敏度。在實施例中，「改善」包括視敏度損失小於預期，例如小於對照、小於未經治療的眼睛、小於歷史損失率、小於患有類似疾病或病症之個體的平均損失率等。在實施例中，視敏度之改善包括改善的一般視力。在實施例中，視敏度之改善包括改善的色覺。在實施例中，視敏度之改善包括周邊視力的改善。在實施例中，視敏度之改善包括遠距視力的改善。在實施例中，視敏度之改善包括視力特異性社會功能的改善。在實施例中，視敏度之改善包括視力特異性心理健康的改善。在實施例中，視敏度之改善包括視力特異性依賴性的改善。
在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 5%。在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 10%。在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 20%。在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 25%。在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 30%。在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 40%。在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 50%。在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 60%。在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 70%。在實施例中，與對照相比，視敏度之改善至少改善 80%、90%、100% 或更多。在實施例中，與對照相比，視敏度改善約 5% 至約 500%。在實施例中，與對照相比，視敏度改善約 5% 至約 250%。在實施例中，與對照相比，視敏度改善約 5% 至約 100%。改善可以是包括端點之引述範圍內的任何值或子範圍。
在實施例中，恢復包括提高閱讀速度。在實施例中，閱讀速度的提高包括相對於控制的提高，例如治療前 (基線) 閱讀速度。在實施例中，「改善」包括閱讀速度的損失小於預期，例如小於對照，例如小於未經治療的眼睛、小於歷史損失率、小於患有類似疾病或病症之個體的平均損失率、小於可比個體的損失率等。
在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 5%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 10%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 20%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 25%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 30%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 40%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 50%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 60%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 70%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度的提高至少提高 80%、90%、100% 或更多。在實施例中，與對照相比，閱讀速度提高約 5% 至約 500%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度提高約 5% 至約 250%。在實施例中，與對照相比，閱讀速度提高約 5% 至約 100%。改善可以是包括端點之引述範圍內的任何值或子範圍。
在實施例中，恢復包括增加視網膜的一個或多個區域的厚度、防止厚度損失或降低厚度損失率。在實施例中，恢復包括增加視網膜的一個或多個區域的面積、防止面積損失或降低面積損失率。在實施例中，恢復包括增加視網膜的一個或多個區域的體積、防止體積損失或降低體積損失率。在實施例中，視網膜區域包括萎縮區域附近。在實施例中，視網膜區域可為總視網膜、中央凹中心、中央凹下、中央萎縮或病變、周邊萎縮或病變、多發病變、RPE、外界膜 (ELM)、外核層 (ONL)、外叢狀層 (OPL)、內核層 (INL)、內叢狀層 (IPL)、神經節細胞層 (GCL)、視網膜神經纖維層 (RNFL)、內界膜 (ILM)、橢圓體帶 (EZ)、PR 之內/外段 (IS/OS) 中之一個或多個。
在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 5%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 10%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 20%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 25%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 30%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 40%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 50%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 60%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 70%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善至少 80%、90%、100% 或更多。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善約 5% 至約 500%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善約 5% 至約 250%。在實施例中，與對照相比，視網膜區域的厚度、面積或體積改善約 5％ 至約 100%。改善可以是包括端點之引述範圍內的任何值或子範圍。
在某些實施例中，治療或減緩進展、維持視網膜疾病的停滯或逆轉視網膜疾病藉由微視野檢查評估的視力恢復來證明。微視野檢查，有時稱為眼底相關視野檢查，是一種視野測試類型，其使用數種技術中之一種技術來創建「視網膜敏感性圖」，該圖反映失去在物體或光源上注視能力的人在視網膜特定部位感知到的光量。與基線、年齡匹配、性別匹配的對照或個體的對側眼相比，微視野檢查評估之視力恢復包含微視野檢查上的視網膜敏感性及視網膜解剖變化/缺陷之間的相關性。在某些實施例中，治療或減緩進展、維持視網膜疾病的停滯或逆轉視網膜疾病藉由微視野檢查評估的視力恢復來證明，其中存在在光譜域光學同調斷層掃描 (SD-OCT) 上發現的解剖性視網膜變化或萎縮區域與在黃斑完整性評估 (MAIA) 微視野檢查中視網膜敏感性喪失的相關性。參閱 Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017 年 5 月 1 日；58 (6): BIO291-BIO299. doi：10.1167/iovs.17-21834，「Correlation Between Macular Integrity Assessment and Optical Coherence Tomography Imaging of Ellipsoid Zone in Macular Telangiectasia Type 2」；Mukherjee D. 等人，其以全文引用之方式併入本文。
在其他實施例中，橢圓體帶的地形圖，例如正交地形 (正面) 圖是自 OCT 體積掃描生成的，例如海德堡光譜 OCT 體積掃描 (15 x 10° 區域，30-μm B 掃描間隔) 或 Zeiss Cirrus HD-OCT 4000 512 x 128 立方體掃描，藉由將地形圖與年齡匹配、性別匹配的對照、個體的基線或個體之對側眼進行比較，以證明治療或減緩進展、維持視網膜疾病的停滯或逆轉視網膜疾病。EZ 的組織與視網膜敏感性之間存在相關性。投予 RPE 細胞後，EZ 區域組織起來，並且視網膜敏感性得到改善。參見例如 Retina，2018 年 1 月；38 增刊 1:S27-S32。「Correlation Of Structural And Functional Outcome Measures In A Phase One Trial Of Ciliary Neurotrophic Factor In Type 2 Idiopathic Macular Telangiectasia,」，Sallo FB 等人，其以全文引用之方式併入本文。
在某些實施例中，與年齡匹配、性別匹配的對照、投予之前或之後個體或對側眼的基線相比，OCT-A 證明治療或減緩進展、維持視網膜疾病的停滯或逆轉視網膜疾病。
例如，使用光譜域 (SD)-OCT 及 OCT-A 成像並使用例如 OCT EZ 映射分析 SD-OCT 資料，以獲得與黃斑立方體複合的 EZ-視網膜色素上皮 (RPE) 的線性、面積及體積測量值。OCT-A 視網膜毛細血管密度可以使用例如 Optovue Avanti 分譜振幅去相關血管造影演算法來測量。EZ-RPE 參數與年齡匹配、性別匹配的對照、個體的基線或對側眼進行比較。
在一個實施例中，在投予後，EZ-RPE 中心中央凹平均厚度改善，EZ-RPE 中心中央凹厚度改善，並且 EZ-RPE 中心子區域體積改善。EZ-RPE 厚度、面積及體積與改善的視敏度相關，以測量治療反應。此等測量中之每一者都與視敏度成反比。例如，參見 Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017 年 7 月 1 日；58(9): 3683-3689，「OCT Angiography and Ellipsoid Zone Mapping of Macular Telangiectasia Type 2 From the AVATAR Study」，Runkle AP. 等人中所概述之方法，其以全文引用之方式併入本文。
在一個實施例中，例如，恢復是以下一項或多項變得更有條理的主觀評估，包括外界膜、肌樣區 (感光受體內段)、橢圓體帶 (IS/OS 連接)、感光受體外段、玻璃膜疣脫落、網狀假玻璃膜疣消失。恢復亦可包含主觀評估，即視網膜的一個或多個基本基礎層變得更有條理。如本文所用，變得更有條理的視網膜的基本基礎層包含外界膜、肌樣區 (感光受體內段)、橢圓體帶 (IS/OS連接) 及感光受體外段中之一個或多個。
在一個實施例中，橢圓體帶分析藉由與年齡匹配、性別匹配的對照、基線或對側眼相比 EZ 體積的減小來證明 EZ 的組織。在另一實施例中，EZ 體積的減少包含至少 2% 或至少 5% 或至少 7% 或至少 10%，或 1至 5% 或 1 至 10% 或 1 至 50% 或 10% 至 50% 之間。在另一實施例中，EZ 的組織例如藉由 EZ 結構體積的減少來證明，參見例如基線與第 2 個月及第 3 個月的比較。例如，EZ 的體積減少至少 2%、至少 5%、至少 10%。本文所述之每個值或範圍可包括包括端點之其間的任何值或子範圍。
在一個實施例中，恢復包含 EZ-RPE 中央凹平均厚度改善、EZ-RPE 中心中央凹厚度改善及 EZ-RPE 中心子場體積改善中之一項或多項。EZ-RPE 厚度、面積及體積與改善的視敏度相關，以測量治療反應。此等測量中之每一者都與視敏度成反比。
在一些實施例中，改善或恢復藉由微視野檢查來測量。
在微視野檢查中，視網膜的特定區域受到光點的刺激，並且個體按下按鈕以確認對刺激的感知。除了鑑別功能性及非功能性區域外，亦可以改變刺激強度以鑑別視網膜特定區域的相對敏感性。眼底可以經由紅外相機監測，並且視野的靈敏度可以映射到眼底照片，並與其他技術獲得的圖像進行比較。
在某些實施例中，治療或減緩進展、維持視網膜疾病的停滯或逆轉視網膜疾病藉由微視野檢查評估的視力恢復來證明，其中與基線、年齡匹配、性別匹配的對照或個體的對側眼相比，微視野檢查評估的視力恢復包含微視野檢查的視網膜敏感性與視網膜解剖變化/缺陷之間的相關性。在某些實施例中，治療或減緩進展、維持視網膜疾病的停滯或逆轉視網膜疾病藉由微視野檢查評估的視力恢復來證明，其中存在在光譜域光學同調斷層掃描 (SD-OCT) 上發現的解剖性視網膜變化或萎縮區域與在黃斑完整性評估 (MAIA) 微視野檢查中視網膜敏感性喪失的相關性。參閱 Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017 年 5 月 1 日；58 (6): BIO291-BIO299. doi: 10.1167/iovs.17-21834，「Correlation Between Macular Integrity Assessment and Optical Coherence Tomography Imaging of Ellipsoid Zone in Macular Telangiectasia Type 2」；Mukherjee D. 等人，其以全文引用之方式併入本文。
RPE 細胞可以多種形式移植。例如，可將 RPE 細胞以單細胞懸浮液的形式引入靶位點，具有基質或黏附至基質或膜、細胞外基質或受質，諸如生物可降解聚合物或組合上。RPE 細胞亦可印刷至基質或支架上。RPE 細胞亦可與其他視網膜細胞一起移植 (共同移植)，例如與感光受體一起移植。治療的有效性可藉由視覺及眼部功能及結構的不同測量來評估，其中包括最佳矯正視敏度 (BCVA)、在黑暗及光照適應狀態、全視野、多焦點、焦點或模式視網膜電圖 5 ERG) 下藉由視野檢查或微視野檢查測量視網膜對光的敏感性、對比敏感度、閱讀速度、色覺、臨床生物顯微鏡檢查、眼底攝影、光學同調斷層掃描 (OCT)、眼底自發熒光 (FAF)、紅外及多色成像、熒光素或 ICG 血管造影、過繼光學及其他用於評估視覺功能及眼部結構的手段。
在一些實施例中，使用遞送裝置將細胞治療劑植入視網膜下腔。在一些實施例中，遞送裝置包含針、毛細管及尖端。在實施例中，遞送裝置包含具有約 0.63 mm 外徑及約 0.53 mm 內徑的針、具有約 0.5 mm 外徑及約 0.25 mm 內徑的毛細管以及具有約 0.12 mm 外徑及約 0.07 mm 內徑的尖端。
在另一個態樣中，提供一種評估如本文所闡述、描述或說明的視網膜疾病或病症的進展的方法。
在一個態樣中，提供產生如本文所闡述、描述或說明的細胞治療劑的方法。
在一個態樣中，提供一種根據本文所闡述、描述或說明的評估措施來評估及改善視力的方法。在實施例中，評估為以下各項中之一種或多種：地圖狀萎縮、視敏度、閱讀速度、視網膜結構、玻璃膜疣減少或細胞穩定植入的生長減少。在實施例中，評估是減少地圖狀萎縮的生長。在實施例中，評估是視敏度。在實施例中，評估是閱讀速度。在實施例中，評估是視網膜結構。在實施例中，評估是玻璃膜疣的減少。在實施例中，評估是細胞的穩定植入。
對於本文所提供之方法，在實施例中，該方法導致植入細胞排斥的最小或沒有延遲炎症。在實施例中，該方法導致對植入細胞的排斥最小。在實施例中，該方法導致植入細胞排斥的延遲炎症。
對於本文所提供之方法，在實施例中，該方法包括本文所闡述、描述或說明的患者群體、患者特徵或患者人口統計。在實施例中，該方法包括如本文所闡述、描述或說明的患者群體。在實施例中，該方法包括如本文所闡述、描述或說明的患者特徵。在實施例中，該方法包括如本文所闡述、描述或說明的患者人口統計。
在一些實施例中，該方法可進一步包含選擇如本文所闡述、描述或說明的患者 (個體)、患者群體、患者特徵或患者人口統計。在一些實施例中，患者群體患有視網膜疾病源自或與 RPE 損傷、機能不全或各種病理損失有關。在一些實施例中，患者群體患有選自由以下所組成之群組的視網膜疾病病況：乾性 AMD、色素性視網膜炎、尤塞氏綜合症、卵黃樣黃斑部病變、斯特格病、視網膜脫離、視網膜發育不良、視網膜萎縮、視網膜病變、黃斑失養症、視錐細胞失養症、視錐-視桿細胞失養症、馬拉蒂亞萊維登病、多因蜂窩失養症、索斯比失養症、圖案/蝴蝶失養症、貝斯氏特卵黃樣失養症、北卡羅來納失養症、中央暈輪狀脈絡膜失養症、血管狀痕、毒性黃斑部病變、病理性近視、視網膜色素變性及黃斑部病變。在實施例中，選擇患有 AMD 的患者。在實施例中，患者患有乾性 AMD。在實施例中，患者患有濕性 AMD。
除了上述疾病，可根據所描述之方法測量治療效果的疾病的非限制性列表亦包含萊伯氏先天性黑矇症 (lebers congenital amaurosis)、遺傳性或獲得性黃斑部病變、年齡相關性黃斑部病變 (AMD)、地圖狀萎縮 (GA)、貝斯氏特病、視網膜脫離、旋渦狀萎縮、無脈絡膜症、圖案失養症以及 RPE 的其他失養症、RPE 及由光、雷射、炎性、感染性、輻射、新生血管或外傷中之任一種引起的損傷引起的視網膜損傷。根據特定實施例，該疾病是乾性 AMD。根據另一實施例，該疾病是 GA。
在實施例中，該方法包括選擇患有乾性 AMD 的患者。在實施例中，該方法包括選擇患有晚期乾性 AMD 的患者。在實施例中，該方法包括選擇患有乾性 AMD 及 GA 的患者。在實施例中，該方法包括選擇患有伴有 GA 的晚期乾性 AMD 的患者。在實施例中，該方法包括選擇具有 20/200 或更差的最佳矯正視敏度 (BCVA) 的患者。在實施例中，該方法包括選擇具有 20/63 至 20/250 的最佳矯正視敏度 (BCVA) 的患者。在實施例中，該方法包括選擇具有優於 20/250 的最佳矯正視敏度 (BCVA)的患者。在實施例中，該方法包括選擇具有優於 20/100 的最佳矯正視敏度 (BCVA)的患者。在實施例中，該方法包括選擇具有優於 20/63 的最佳矯正視敏度 (BCVA)的患者。在實施例中，該方法包括選擇具有包括黃斑區域的中央 GA 的患者。在實施例中，該方法包括選擇具有中央 GA 但不包括黃斑區域的患者。在實施例中，該方法包括選擇患有周邊 GA 的患者。在實施例中，該方法包括選擇患有中央及周邊 GA 的患者。在實施例中，該方法包括選擇具有約 0.2 mm 2或更大的 GA 大小的患者。
本文所描述之發現支持一種獨特的觀點，根據本發明之教導，RPE 細胞移植可以置換或挽救患有視網膜病變或退化的患者的視網膜細胞。重要的是，在遠離原發性萎縮病變的不完全 RPE 及外視網膜萎縮 (iRORA) 的周邊區域中，揭露放大解析度之 OpRegen 移植後的實例 (參見例如圖 21)。 評估臨床改善的方法
在一些實施例中，本揭露提供一種用於評估視網膜色素上皮 (RPE) 細胞移植後視網膜中視網膜萎縮區域進展之方法。該方法可包含在視網膜的外界膜 (ELM) 邊界內定義地圖狀萎縮或完全 RPE 及外視網膜萎縮 (cRORA) 之區域；使用光學同調斷層掃描 (OCT) 將 ELM 邊界定義為萎縮的界線，其中 ELM 邊界下降經組織學接受為具有近乎總感光受體耗盡的區域的劃界；在每次檢查中使用 OCT 標記及測量 ELM 邊界或 ELM 下降；計算檢查中包括在 ELM 邊界內的面積 (例如，以 mm 2為單位)，並利用計算面積的平方根轉換 (SQRT) 來評估與眼睛本身相比或與對照眼睛相比隨時間的變化；並且藉由比較使用 OCT 及 ELM 邊界作為界線的兩個或兩個以上不同檢查之間計算的萎縮區域來定義萎縮的進展速率。
在一些實施例中，該方法可包含手動測量及計算 ELM 邊界及邊界內的面積。
在一些實施例中，ELM 邊界的測量及計算由 OCT 設備藉由獨立演算法自動執行，並且視情況使用人工智慧進行自動偵測、特定層的面積及體積偵測以及生長預測。
在一些實施例中，根據萎縮分類會議 (CAM) 研究組共識分類，萎縮可為不完全 RPE 及外視網膜萎縮 (iRORA)。
在一些實施例中，萎縮區域的變化以 mm 2為單位並藉由 SQRT 測量。
在一些實施例中，檢查各自在約 12 個月、約 24 個月及約 36 個月時進行。
在一些實施例中，可以使用根據關於萎縮區域的歷史資料的預測生長及使用 SQRT 線性生長計算來預測在任何未來時間點的萎縮區域的理論大小，對同一隻眼睛執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，用於比較地圖狀萎縮生長速率的對照組係同一隻眼睛生長的理論預測。
在一些實施例中，可使用 mm 2及 SQRT 在經治療的眼睛與對側眼之間執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，可使用 mm 2及 SQRT 在經治療的眼睛與對照眼睛之間執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，對複數隻眼睛執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，第一時間點可在 RPE 細胞移植之前。在一些實施例中，第一時間點可在 RPE 細胞移植時。在一些實施例中，第一時間點可在 RPE 細胞移植之後。
在一些實施例中，移植前的時間可變化以涵蓋許多時間點，範圍為一至 5 天/週/年。在一些實施例中，移植後的時間可變化以涵蓋許多時間點，範圍為一至 10 天/週/年。
在一些實施例中，第二時間點在第一時間點之後。因此，第二時間點可在第一時間點之後的一週至 10 年的任何時間。在一些實施例中，第二時間點可為 RPE 細胞移植後一週至 10 年之間的任何時間。
在一些實施例中，本揭露提供一種用於評估萎縮區域內的區域中視網膜的恢復或再生之方法，該方法包含使用 OCT 及視情況使用人工智慧的一種或多種獨立演算法，用於自動偵測特定層的面積及體積檢測以及生長或動力學的預測。評估恢復或再生可藉由對視網膜的一項或多項檢查來執行，該方法包含定義及使用 OCT 生物標記作為任何視網膜層的界線；使用 OCT 標記並測量任何視網膜層的界線；計算特定視網膜層的長度/寬度及體積；藉由比較自步驟 (a)-(c) 計算的 ELM 面積來定義恢復或再生的標準；以及偵測新出現的 ELM 面積。
在一些實施例中，視網膜層是 ONL 並且該方法偵測新出現的 ONL 面積。在一些實施例中，視網膜層是 OPL 並且該方法偵測新出現的 OPL 面積。在一些實施例中，視網膜層是橢圓體帶並且該方法偵測橢圓體帶之新出現的區域。在一些實施例中，視網膜層是感光受體並且該方法偵測新出現的感光受體區域。在一些實施例中，視網膜層是RPE細胞層並且該方法偵測新出現的 RPE 面積。
在一些實施例中，組合計算視網膜層。
在一些實施例中，OCT 檢查在約 12 個月、約 24 個月及約 36 個月時執行。
在一些實施例中，視網膜層之比較在同一隻眼睛上執行。在一些實施例中，萎縮區域之比較在經治療的眼睛與對側眼之間執行。在一些實施例中，萎縮區域之比較在經治療的眼睛及對照眼睛之間執行。在一些實施例中，對複數隻眼睛執行萎縮區域的比較。
在一些實施例中，RPE 恢復的區域包括當 ELM、ONL 及 OPL 均存在時。
在一些實施例中，新 RPE 的區域將藉由 IR 成像的變化定義為新的淺灰色脫色區域。
在一些實施例中，萎縮區域可由保留的 ONL 的邊界或區域定義
在一些實施例中，萎縮區域可由保留的 OPL 的邊界或區域定義
在一些實施例中，萎縮區域可由保留的 RPE 的邊界或區域定義
在一些實施例中，萎縮區域可由保留的 ONL、ELM、OPL 及 RPE 的任何或所有邊界或區域的組合來定義
在一些實施例中，本揭露提供一種藉由以下方式來評估臨床改善之方法：在視網膜的外界膜 (ELM) 邊界內定義地圖狀萎縮或完全 RPE 及外視網膜萎縮 (cRORA) 的區域；使用光學同調斷層掃描 (OCT) 將 ELM 邊界定義為萎縮的界線，其中 ELM 邊界下降經組織學接受為具有近乎總感光受體耗盡的區域的界定；在每次檢查中使用 OCT 標記及測量 ELM 邊界或 ELM 下降；計算檢查中包括在 ELM 邊界內的面積 (例如，以 mm 2為單位)，並利用計算面積的平方根轉換 (SQRT) 來評估與眼睛本身相比或與對照眼睛相比隨時間的變化；並且藉由比較使用 OCT 及 ELM 邊界作為界線的兩個或兩個以上不同檢查之間計算的萎縮區域來定義萎縮的進展速率。
在一些實施例中，本揭露提供一種藉由以下方式來評估臨床改善之方法：定義及使用OCT生物標誌物作為任何視網膜層的界線；使用 OCT 標記並測量任何視網膜層的邊界；計算特定視網膜層的長度/寬度及體積；藉由比較自步驟 (a)-(c) 計算的 ELM 面積來定義恢復或再生的程度；以及偵測新出現的 ELM 面積。
在一些實施例中，臨床改善係選自有或無電腦輔助之 BCVA 正常光線及低光線、微視野檢查、閱讀速度、有或無電腦輔助的顏色測試、閃爍測試、錐體細胞靈敏度及視桿細胞靈敏度。
在一些實施例中，視網膜萎縮區域是晚期地圖狀萎縮、早期地圖狀萎縮、高風險 AMD 或中晚期 AMD。
描述本發明預期範疇的附加材料在此作為附錄 A 提交，其以全文引用之方式併入本文。 裝置
對於本文所提供之方法，在實施例中，該方法包括如本文所描述、呈現或闡述的裝置或設備。
在一個態樣中，裝置及/或組成物被提供用於本文所闡述、描述或說明的方法、裝置及組成物。
在一些實施例中，本揭露提供用於本文所描述之方法中之任一者中之遞送裝置。
在一些實施例中，該裝置包含針、毛細管及尖端。在一些實施例中，該裝置包含具有約 0.63 mm 外徑及約 0.53 mm 內徑的針、具有約 0.5 mm 外徑及約 0.25 mm 內徑的毛細管、以及具有約 0.12 mm 外徑及約 0.07 mm 內徑的尖端。
在實施例中，物質組成物、方法及裝置可以利用同種異體的產品候選物 (「現成的」)。例如，此可能意謂該材料衍生自細胞株，而不是衍生自個體患者，與針對患者的治療相比，這有助於大規模生產及降低生產成本。
方法、裝置、物質組成物等可以包括在附圖中所闡述的彼等，其以引用之方式併入本文。 實例
以下實例說明本發明之某些具體實施例，並不意謂限制本發明之範疇。
本文之實施例藉由以下實例及詳細方案進一步說明。然而，此等實例僅旨在說明實施例並且不應被解釋為限制本文之範疇。在本申請案中引用之所有參考文獻及公開的專利及專利申請案的內容均以引用之方式併入本文。 實例 1 ： OpRegen 的 24 名患者 I/IIa 期臨床研究的中期結果
OpRegen 在 I / IIa 期開放標籤、劑量遞增安全性及有效性研究中進行評估，該研究對衍生自已建立的多能細胞株的人類視網膜色素上皮細胞進行單次注射並在患有晚期乾性 AMD 與 GA 的患者的視網膜下移植。該研究將 24 名患者納入 4 個組。前 3 個組登記疾病晚期的個體。前 3 個組的所有 12 名個體都是法定失明的，具有晚期 GA 的最佳矯正視敏度 (BCVA) 為 20/200 或更差 (大小約為 17 mm 2)。與第 1-3 組相比，第四組招募 12 名處於疾病早期階段的個體，他們的視力更好 (視力自 20/63 至 20/250) 及較小的 GA 區域 (最大為 11 mm 2)。第 4 組亦包括使用新的「解凍及注射」 (TAI) OpRegen 調配物治療的個體，該調配物可以直接運送至現場並在解凍後立即使用，從而消除了併發症及必須使用劑型製備設施的物流配送。第 4 組的前 3 名個體用之前的調配物治療，並且第 4 組的最後 9 名個體用「TAI」調配物治療。該研究的主要目的是評估 OpRegen 的安全性及耐受性，如藉由治療出現的不良事件的發生率及頻率進行評估。次要目標是藉由評估各種主要臨床相關方法測量的眼科參數變化來評估 OpRegen 治療的初步療效。其他目標包括評估使用 Gyroscope SDS 遞送 OpRegen 的安全性。
在第 4 組中接受治療的 12 名個體具有更好的基線視力及更小的地圖狀萎縮 (GA) 區域。在第 1-3 組中，在基線時法定失明的個體，由於進行性 GA，視力 (VA) 降低如預期的那樣發生。在第 4 組中，在 11/12 (92%) 的個體中觀測到 GA 面積較小且基線最佳矯正視敏度 (BCVA) 較高或持續的個體，截至其最後一次訪問 (範圍為-7 至 +19 ETDRS 字母)。OpRegen 在所有接受治療的個體 (N = 24) 中均具有良好的耐受性，包括 2 名免疫抑制較少 (COVID 或其他健康狀況) 的個體。未觀測到急性或延遲性炎症，亦未觀測到眼內壓 (IOP) 持續升高。所有個體均報告了至少一種不良事件 (AE)，然而，大多數 AE 是輕微的 (87%)。眼睛相關病症系統中之 AE (n = 165 個事件) 包括：在經帕爾斯平面玻璃體切除術 (Pars Plana Vitrectomy，PPV) 治療的個體中 n = 136 (n = 17 名個體；54.7 年 F/U) 及在經 Orbit SDS 治療的個體中 n = 29(n = 7 名個體；6.9 年 F/U)。持續的視網膜下色素沉著表明 OpRegen 的多年持久性。在一些個體中繼續觀測到改善的解剖結構及功能，包括：玻璃膜疣、感光受體減少及 RPE 層恢復，治療區域中 GA 進展的局部減慢，經由 ETDRS 評分及閱讀速度所得較佳的視敏度，以及改善 NEI 視覺功能問卷 (VFQ-25) 評分 (國家眼科研究所視覺功能問卷-25 (NEI VFQ-25) 版本 2000 - 調訪員管理格式)。4 例患者 (4 名個體發生 5 次事件) 發生治療後手術干預，包括：三個視網膜前膜 (ERM) 被手術剝離 (17 名個體中有 15 名觀測到 ERM，大多數在臨床上不顯著)，經由 PPV 視網膜切開術接受細胞的 17 名個體中有 2 名觀測到視網膜脫離 (RD)，並且在三名接受 Orbit SDS 治療的個體中觀測到治療反應性脈絡膜新生血管形成 (CNV)，所有個體均接受單次投予批准的抗 VEGF。OpRegen TAI 調配物在 7 個 Orbit SDS 及 2 個 PPV 治療的個體中投予。在 4 個經 Orbit SDS/TAI 治療的個體中觀測到視網膜下液的緩慢吸收，沒有後遺症。臨床益處的評估正在進行中，並且除了標準 FAF 測量外，並利用詳細的 OCT 分析。個體的長期追蹤正在進行中。
作為持續努力管理免疫抑制治療的最低有效劑量及持續時間的一部分，僅在第 4 組個體約 3 個月的圍手術期期間使用免疫抑制。值得注意的是，一名 OpRegen 患者在基線時接受改良的免疫抑制方案，其中不包括他克莫司，只包括黴酚酸酯，移植後 4.5 個月未顯示任何急性或延遲炎症或 OpRegen 細胞排斥的跡象。一名患者在治療後不久被診斷出患有 COVID，一旦患者無症狀，所有的免疫抑制均停止並恢復。第二名患者在手術後 4.5 個月同樣沒有表現出急性或延遲炎症或 OpRegen 細胞排斥的跡象。除了上述減少方案外，免疫抑製劑按計劃停用，通常在術後 90 天內停用，並且沒有報告由於 OpRegen 引起的急性或延遲排斥或炎症病例。
9 名個體接受 OpRegen 的新「解凍及注射」 (TAI) 調配物治療，並且7 名個體使用 Gyroscope Orbit™ 視網膜下遞送系統 (Orbit SDS) 治療。在治療後 3 個月 (圖 1)及 9 個月 (圖 2) 顯示經治療的眼睛的 GA 內色素沉著區域的代表性 FP 圖像。色素沉著區域是 GA 內存在 RPE 細胞的證據。
總體而言，在移植後 4.5 個月至 ＞ 3 年，11/12 (92%) 的第 4 組個體之接受治療的眼睛達到或高於基線視敏度。在早期治療糖尿病視網膜病變研究 (ETDRS) 圖表上，最佳矯正視敏度 (BCVA) 的改善達成 +19 個字母。相比之下，11/12 (92%) 的個體之未經治療的眼睛在相同時間點低於基線進入值。在新報告的資料中，最近接受治療的第 4 組個體中有 3 名 (50%) 在至少 4.5 個月的最後一次預定評估中表現出 BCVA 顯著改善，範圍為 +7 至 +16 個字母。兩個額外的第 4 組個體自基線值增加了 2 個字母。一名患者測量到低於基線 7 個字母。先前報導的一些個體的視網膜結構改善及玻璃膜疣密度的降低仍在繼續。OpRegen RPE 細胞持久植入的證據在最早接受治療的個體中延長至 5 年以上。與對側眼相比，治療中 GA 進展較慢的趨勢仍在繼續。總體而言，OpRegen 耐受性良好，沒有意外的不良事件或嚴重的不良事件。
下表 1、2 及 3 中的資料概述第 4 組 (14、15、13、16 及 17) 中五名個體的重新編碼值的變化。對於視力類別，所有五個個體都有所改善。視力類別的所有五名個體的重新編碼值的平均變化為 18%。
具有視網膜恢復證據及確認 GA 生長史的第 4 組個體在 9 個月時首次報告，在第 23 個月時繼續具有比基線更小的 GA 面積。自治療後 9 至 23 個月，該個體的 BCVA 亦經歷額外的改善，而未經治療的眼睛的視敏度進一步下降。
第 4 組的個體視敏度隨時間 (1 至 24 個月) 的變化如圖 3 (藉由 ETDRS 字母數量相對於基線的變化來測量) 及圖 8 (以閱讀速度測量) 所示。視敏度的平均變化 (藉由 ETDRS 字母數量相對於基線的變化來測量) 顯示與圖 5 中。經處理之眼睛中 GA 大小的平均變化顯示在圖 4 中。
本文所描述之 OpRegen 細胞是同種異體 RPE 細胞的懸浮液，具有藉由支持視網膜結構及功能來抵消 GA 中 RPE 細胞損失的潛力。下表 13 提供研究的資格準則、管理及目標。圍手術期免疫抑制方案包括他克莫司每日投予 0.01 mg/kg 直至術後 6 週，並且黴酚酸酯每日投予至多 2.0 g 直至術後至少 3 個月。 表 13：I/IIa 期研究設計準則、管理及目標。視網膜下遞送是經由玻璃體切除術/視網膜切開術 (n=17) 及僅在第 4 組中使用帶有 Orbit SDS® (Gyroscope Therapeutics) 的脈絡膜上套管 (n=7)。
Figure 02_image001
個人個體的資料顯示於圖 6 及 7A-7C 中。 表 1. 所有個體及類別的總百分比變化平均值。
全視覺 / 眼部
類別 / 患者 14 15 13 16 17 平均變化 ( 全部 )   55%    93%    28% 36%    10%       83%    161%    9%    -19%    0%    20%    改善 4/5 2/5 5/5 3/5 3/5 5/5 4/5 3/5 0 否 2/5
訪問/總變化 % -＞    V-1 V-17 變化% V-1 V-17 變化% V-1 V-17 變化% V-1 V-17 變化% V-1 V-17 變化%
總體視覺 40.0 80.0 100.0 80.0 60.0 -25% 40.0 80.0 100% 40.0 60.0 50% 40.0 60.0 50%
眼痛 100.0 87.5 -13% 12.5 75.0 500% 100.0 100.0 0% 100.0 75.0 -25% 100.0 100.0 0%
近距離活動 50.0 56.7 13% 40.0 56.7 42% 48.3 56.7 17% 40.0 66.7 67% 48.3 50.0 3%
遠距離 活動 33.3 62.5 88% 41.7 41.7 0% 83.3 75.0 -10% 41.7 83.3 100% 66.7 66.7 0%
具體視覺：社會功能 62.5 62.5 0% 87.5 100.0 14% 100.0 100.0 0% 87.5 100.0 14% 62.5 75.0 20%
具體視覺：心理健康 62.5 87.5 40% 12.5 37.5 200% 62.5 68.8 10% 18.8 37.5 100% 50.0 81.3 63%
具體視覺：角色困難 75.0 62.5 -17% 12.5 100.0 700% 62.5 75.0 20% 50.0 75.0 50% 50.0 75.0 50%
具體視覺：依賴性 83.3 100.0 20% 91.7 66.7 -27% 100.0 100.0 0% 41.7 58.3 40% 83.3 91.7 10%
駕駛 N/A N/A N/A 0.0 2.5 N/A N/A N/A N/A 58.3 41.7 -29% 83.3 75.0 -10%
色覺 100.0 100.0 0% 100.0 100.0 0% 100.0 100.0 0% 100.0 100.0 0% 100.0 100.0 0%
周邊視覺 100.0 50.0 -50% 50.0 100.0 100% 100.0 100.0 0% 50.0 75.0 50% 100.0 100.0 0%
每位患者平均值 70.7 74.9 6% 52.8 73.8 40% 79.7 85.5 7% 57.08 70.2 23% 71.3 79.5 12% 18%   
表 2. 所有個體及類別的總百分比變化平均值。
總體健康
類別 / 患者 14 15 13 16 17 平均 變化 (全部)
訪問/總計 變化 % -＞ V-1 V-17 CHG V-1 V-17 CHG V-1 V-17 CHG V-1 V-17 CHG V-1 V-17 CHG
總體健康 75 75 0 50 25 -50% 100 100 0% 50 75 50% 50 50 0% 0
表 3. 該表顯示第 4 組中的五名個體中有多少人在每個類別中表現出改善。
類別 # 個體 (共 5 個) %
總體視覺 4 80% 的個體表現出改善
眼痛 2 40% 的個體表現出改善
近距離活動 5 100% 的個體表現出改善
遠距離活動 3 60% 的個體表現出改善
具體視覺：社會功能 3 60% 的個體表現出改善
具體視覺：心理健康 5 100% 的個體表現出改善
具體視覺：角色困難 4 80% 的個體表現出改善
具體視覺：依賴性 3 60% 的個體表現出改善
駕駛 0 0% 的個體表現出改善 (篩選時只有 2 名個體在駕駛)
色覺 0 0% 與基線篩選相比沒有變化
周邊視覺 2 40% 的個體表現出改善
包含所有問題的空白問卷 (國家眼科研究所視覺功能問卷 – 25 (VFQ-25) 2000 版 – 面試官管理格式)，其中所有問題以引用之方式併入本文。在篩選第 11 次訪問、第 17 次訪問、第 18 次訪問、第 19 次訪問、第 20 次訪問、第 21 次訪問及第 22 次訪問時進行問卷調查。對錶 4 中所示的項目進行平均生成 VFQ-25 子量表。 表 4
規模 項目數 待平均的項目 (根據表 2 重新編碼後)
總體健康 1 1
總體視覺 1 2
眼痛 2 4, 19
近距離活動 3 5、6、7
遠距離活動 3 8、9、14
具體視覺：      
社會功能 2 11、13
心理健康 4 3、21、22、25
角色困難 2 17、18
依賴性 3 20、23、24
駕駛 3 15c、16、16a
色覺 1 12
周邊視覺 1 10
臨床試驗資料的觀測結果包括生活品質的提高、閱讀速度的提高及微視野檢查的改善。 實例 2 ：伴有 GA 的乾性 AMD 個體的視網膜修復
視網膜修復很難觀測，因為本文所使用之細胞在 FAF 下不會自發熒光，其為一種用於測量 GA 界線的常用成像技術。IR 測量從未被接受為評估萎縮界線的方法。高解析度 OCT 是 FAF 的替代方法，用於測量 GA 病變界線及視網膜的細層。以此方式使用 OCT 是一個較慢的手動過程，有其自身的局限性，但其提供區分視網膜內單個細胞類型的能力，例如餅層 (例如：ONL、OPL、RPE)。圖 9、12-14、16、18-22、26-28 及 30 顯示在基線及治療後萎縮區域的多個橫截面及「空中」透視圖。
個體 14 在治療後 9 個月及 23 個月具有 OPL、ONL、ELM、RPE 及外層視網膜再生/恢復的解剖學改善 (圖 9 至 15)。類似地，個體 21 在 1 個月時 GA 界線減少，ELM 的解剖學改善及恢復 (圖 16 及 17)，以及先前的萎縮區域 (與原發性 GA 分離) 幾乎完全恢復，其中缺失層再生並且萎縮性病變「消失」 (圖 18)。在治療後 2 個月及 3 個月觀測到改善(圖 18-22)。在治療過程期間以及治療後 2 個月及 3 個月在個體 14 中觀測到向 GA RPE 遞送 (圖 31)。
微視野檢查。圖 15 顯示修復區域亦可能為功能性的初步證據 (僅僅看到組織並不意謂組織是 活躍的)。微視野檢查包括在視網膜上閃爍精確的光，以「映射」用於視覺的區域。微視野檢查資料難以收集，因此其僅在少數時間點存在於少數個體。然而，其至少提供一些證據表明患者 14 在修復區域具有視覺能力。
與未經治療的眼睛相比，個體 22 在經治療的眼睛中表現出視敏度及 GA 大小的改善 (圖 23)。個體 22 治療後 3 個月的色素沉著表明存在 RPE 細胞 (圖24)。藉由 IR 成像測量之 GA 大小表明 3 個月時 GA 的界線減少 (圖 25)，OCT 測量結果亦是如此 (圖 26-30)。
個體 14 被追蹤到 35 個月。離散組織層在 23 個月時可偵測到，但在 9 個月時不存在。在整個觀測期間及整個 (周邊) 萎縮區域都有很多此類現象的實例。申請者在治療前一年測量患者的 GA 生長率，允許根據未經治療之生長率推斷患者的 GA 大小。與基線相比，GA 在 3 年內保持不變，考慮到疾病的自然過程 (即情況逐漸惡化)，預計不會發生這種情況。患者的經治療的眼睛最近才降至基線以下，但仍亦優於患者不再用於視力的對側眼。個體 14 是原始案例，並顯示出效果的持久性。
個體 21 的新發現。早在 2.5 個月時，在另一名患者中亦偵測到了類似的觀測結果。僅對外部視網膜區域進行分析。基線顯示預期的 GA/cRORA 與預期位置處的 ELM、EZ 損失。三週後，觀測到顯著的外部視網膜變化，包括明顯的 ELM/EZ 部分改造。存在 EZ 及無定形超反射視網膜下材料的瀰漫性增厚。在六週時，一些 EZ 變化持續存在，但亦出現了 EZ 損失。亦觀測到 RPE/布魯赫氏膜的增厚。
個體 22 的新發現。個體 22 是一名女性，其將自己的治療經歷稱為「改變生活」。在 GA 週圍以及與主要區域不相連的 GA 的一些小區域或「島嶼 (islands)」中，鑑別新物質及 ELM 在各個位置的延伸。到 3 個月時，彼等島嶼在治療後消失了，其支持早期干預將導致乾性 AMD 的更好臨床結果的說法。使用 Orbit SDS 對患者 22 進行治療。
基線顯示具有多焦點衛星的中央 GA/cRORA。經由 RPE 觀測到 EZ/ELM/超傳輸的預期損失。4 週時，黃斑裂孔形成，收集大量視網膜下液。在 IR 及 OCT 上鑑別了 RPE 表面上的許多沉積物。第 6 週時，RPE 表面出現殘留的視網膜下液及新物質。PED 很明顯，內部物質的反射率非常高，可能是 1 型 CNV。到 3 個月時，所有視網膜下液分解，視網膜下物質持續存在，並出現大的中央視網膜下沉積物。存在新的優質視網膜內液。到 4 個月時，許多位置都注意到了 ELM 的延伸。視網膜下物質增多。眼底照片上的視網膜出血可能對應於液體區域及布魯赫氏 1 型 CNV 的可能芽。FAF 上 RPE 損失總體擴大，但色素沉著增加，ELM 延伸到定義的萎縮界線。 發明內容
在個體 14、21 及 22 中，移植細胞的修復案例覆蓋了大部分 GA。細胞置放似乎對實現此等結果至關重要，其對軌道評估具有重要意義。在看到個體 14 (一名完全覆蓋 GA 的患者) 的修復後，外科醫生付出了更大的努力，在最後 7 名個體中遞送細胞通過 GA。在最後的 4 名 Orbit個體中，儘管由訓練有素的外科醫生掌握，但只有一名成功地將細胞置放於 GA 上。相比之下， PPV 訪問的兩個程序均成功地實現了這一點 (PPV 在此方面更靈活)。在第三種情況下 (Pt. #22)，使用 Orbit，由完成全面覆蓋的同一位外科醫生實現了部分覆蓋。
此時恢復與臨床結果並不完全相關，但可能會得出一些有趣的聯繫。但鑑於以前沒有觀測到任何其他治療 AMD 的方法可以恢復，因此沒有先例可以幫助預測功能恢復的動力學 (若發生)。 實例 3 ：乾性及濕性形式的老年性黃斑部病變 (AMD) 的關鍵監管終點
預期療效終點如下： 主要療效終點。基於 FAF 的研究眼 GA 病變總面積 (以 mm 2為單位) 相對於基線至第 12 個月的變化。
關鍵次要療效終點。1) 單眼閱讀速度 (研究眼) 相對於基線的變化，由 MNRead 或 Radner 閱讀表 (Radner Reading Charts) 在第 24 個月 (在選定國家/地區) 評估。2) 在第 24 個月時，功能性閱讀獨立指數 (FRII) 綜合評分相對於基線相比的變化。3) 由 ETDRS 表評估的第 24 個月的正常亮度最佳矯正視敏度評分 (NL-BCVA) 相對於基線的變化。4) 由 ETDRS 表評估的第 12 個月及第 24 個月的低亮度最佳矯正視敏度評分 (LL-BCVA) 相對於基線的變化。5) 第 12 個月及第 24 個月的低亮度缺陷 (LLD) 相對於基線的變化。6) 由 FAF (在選定部位) 評估的研究眼中 GA 病變的總面積 (以 mm 2) 為單位在每次計劃評估時相對於基線的變化。7) 在第 12 個月及第 24 個月 (在選定國家/地區)，由 MNRead 或 Radner 閱讀表評估的單眼臨界文字尺寸 (研究眼) 與基線的變化。8) 在第 12 個月及第 24 個月，國家眼科研究所視覺功能問卷 25 項版本 (NEI VFQ-25) 距離活動分量表評分相對於基線的變化。9) 藉由中間微視野檢查評估黃斑功能反應的暗點數量 (僅限 Oaks 研究)。10) 黃斑敏感性的變化，如藉由中間微視野檢查評估黃斑功能反應。11) APL-2的全身血漿濃度隨時間變化。
安全終點。1) 眼部及全身治療出現的不良事件的發生率及嚴重程度。2) 針對 APL-2 的抗治療抗體的發生率。3) 研究眼中新的活性 CNV 的發生率。
乾性 AMD 研究中一些關鍵次要終點的詳細資訊如下。 在第 48 週 [ 時間範圍：基線，第 48 週 ] ，由中間微視野檢查評估的絕對暗點數相對於基線的變化。暗點是微視野檢查中以黃斑為中心的測試點，並且報告在測試範圍內缺乏視網膜敏感性，在此範圍內最多測試 68 個點。更高的結果表明絕對暗點的擴增及更多的絕對暗點。僅在研究眼的擴張後進行中微視野檢查評估，並將資料轉發到中央閱讀中心。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。相對於基線的正變化表明絕對暗點數增加 (更缺乏視網膜敏感性)；病情惡化。
在第 48 週 [ 時間範圍：基線，第 48 週 ] ，藉由中間微視野檢查評估的平均黃斑敏感性相對於基線變化。使用中間微視野檢查評估黃斑敏感性，並且僅在研究眼的擴張後進行評估，並將資料轉發到中央閱讀中心。相對於基線的負變化表明平均黃斑敏感性降低；病情惡化。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
在第 48 週 [ 時間框架：基線，第 48 週 ] ，藉由早期治療糖尿病視網膜病變研究 (ETDRS) 表評估的最佳矯正視敏度 (BCVA) 評分相對於基線的變化。BCVA 評分基於在 4 公尺 (m) 的起始距離評估的 ETDRS 視敏度表上正確讀取的字母數。在散瞳前進行 BCVA 評分測試。BCVA 評分範圍為研究眼中之 0 至 100 個字母。視力表上正確讀取的字母數越少，視力 (或視敏度) 越差。相對於基線的負變化表明視敏度下降；病情惡化。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
第 48 週時 BCVA 評分相對於基線丟失少於 15 個字母的參與者百分比 [ 時間範圍：第 48 週 ] 。在 4 公尺 (m) 的起始距離處，ETDRS 表評估相對於基線丟失少於 15 個字母的情況。使用視力表測量 BCVA，並報告為正確閱讀的字母數 (範圍為 0 至 100 個字母)。視力表上正確讀取的字母數越少，視力 (或視敏度) 越差。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
在第 48 週 [ 時間範圍：基線，第 48 週 ] 在低亮度條件下，由 ETDRS 表評估的低亮度視敏度 (LLVA) 相對於基線的變化。LLVA 是藉由將 2.0 對數單位的中性密度濾光片 (log-unit neutral density filter) 置放在該眼睛的最佳校正上並讓參與者閱讀正常照明的 ETDRS 表來測量的。評估是在散瞳前進行的。LLVA 評分範圍為研究眼中之 0 至 100 個字母。視力表上正確讀取的字母數越少，視力 (或視敏度) 越差。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
在第 48 週 [ 時間範圍：第 48 週 ] ， LLVA 評分相對於基線丟失少於 15 個字母的參與者百分比。ETDRS 表在 4 m 的起始距離處評估相對於基線丟失少於 15 個字母的情況。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
在第 48 週由明尼蘇達州低視力閱讀測試 (MNRead) 圖或 Radner 閱讀表 [ 時間範圍：基線，第 48 週 ] 評估的雙眼閱讀速度相對於基線的變化。明尼蘇達州敏銳度卡是連續文本閱讀敏銳度卡，適用於測量正常及低視力參與者的閱讀敏銳度及閱讀速度。MNRead 視敏度卡由具有相同字符數的單個簡單句子組成。秒錶用於記錄時間至十分之一秒。因視力而無法閱讀或未嘗試的句子應記錄為次數為0，錯誤為10。Radner 閱讀卡適用於測量閱讀速度、閱讀視敏度及臨界文字尺寸。當閱讀時間超過 20 秒或參與者出現嚴重錯誤時，停止閱讀測試。相對於基線的負變化表明雙目閱讀速度下降；病情惡化。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
在第 48 週 [ 時間範圍：基線，第 48 週 ] ，由 MNRead 表或 Radner 閱讀表評估的單眼最大閱讀速度相對於基線的變化。明尼蘇達州敏銳度卡是連續文本閱讀敏銳度卡，適用於測量正常及低視力參與者的閱讀敏銳度及閱讀速度。MNRead 視敏度卡由具有相同字符數的單個簡單句子組成。秒錶用於記錄時間至十分之一秒。因視力而無法閱讀或未嘗試的句子應記錄為次數為0，錯誤為10。Radner 閱讀卡適用於測量閱讀速度、閱讀視敏度及臨界文字尺寸。當閱讀時間超過 20 秒或參與者出現嚴重錯誤時，停止閱讀測試。相對於基線的負變化表明單眼閱讀速度下降；病情惡化。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
在第 48 週國家眼科研究所視覺功能問卷 25 項 (NEI VFQ-25) 版本綜合評分相對於基線的變化 [ 時間範圍：基線，第 48 週 ] 。NEI-VFQ-25 問卷包括 25 個項目，基於此等項目的總體複合 VFQ 評分及 12 個分量表得出：近距離活動、遠距離活動、總體健康、總體視力、眼痛、視覺特異性社會功能、視覺特異性心理健康、視覺特異性角色困難、視覺特異性依賴、駕駛、色覺及周邊視覺。對每個問題的回答轉換為 0-100 分。每個分量表，總分=有助於評分的項目的平均值。對於每個分量表及總分，評分範圍：0 到 100，評分越高代表功能越好。相對於基線的負變化表明視覺功能下降；病情惡化。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
第 48 週 NEI VFQ-25 近距離活動分量表評分相對於基線的變化 [ 時間範圍：基線，週 ] 。NEI-VFQ-25 問卷包括 25 個項目，根據此等項目測量近距離活動。近距離活動被定義為閱讀報紙上的普通印刷品、從事需要近距離視力的工作或愛好，或者在擁擠的架子上找東西。對每個問題的回答轉換為 0-100 分。分量表 = 有助於評分的項目的平均值。對於此分量表，評分範圍為 0 至 100，分數越高代表功能越好。相對於基線的負變化表明近視活動減少；病情惡化。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
第 48 週時 NEI VFQ-25 距離活動分量表評分相對於基線的變化 [ 時間範圍：基線，第 48 週 ] 。NEI-VFQ-25 問卷包括 25 個項目，根據此等項目測量距離活動。距離活動被定義為閱讀街道標誌或商店上的名稱，以及下樓梯、台階或路緣石。對每個問題的回答轉換為 0-100 分。分量表 = 有助於評分的項目的平均值。對於此分量表，評分範圍為 0 至 100，分數越高代表功能越好。相對於基線的負變化表明距離視覺活動減少；病情惡化。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。
第 48 週時平均功能閱讀依賴性 (FRI) 指數相對於基線的變化 [ 時間範圍：基線，第 48 週 ] 。FRI 是一個採訪者管理的問卷，具有 7 個與 GA AMD 參與者最相關的功能性閱讀活動項目。其具有一個總指數評分。對於過去 7 天內進行的每項 FRI 指數閱讀活動，參與者被問及他們需要視力輔助設備、活動調整或其他參與者幫助的程度。平均 FRI 指數評分範圍為 1 至 4，評分越高表明依賴性越高。相對於基線的負變化表明 FRI 下降；病情惡化。由於研究提前終止，資料收集至第 48 週而不是第 96 週。 實例 4 ：用於測量厚度及麵積之 SD-OCT 成像
在經治療的眼睛中測定不同視網膜層的厚度、面積及體積。SD-OCT 圖像是使用 Spectralis (Spectralis; Heidelberg Engineering, Inc., Heidelberg, Germany) 捕獲的，黃斑體積由 512X49 等距 B 掃描組成，位於以中央凹為中心的 20X20 度視野內。使用 3D-OCTOR (由 Doheny Eye Institute 開發) 手動分割所有 B 掃描中的視網膜層以進行厚度及麵積測量。具體來說，使用黃斑體積中之所有 B 掃描手動分割外核層、感光受體內段 (肌樣區)、感光受體外段 (橢圓體帶狀態) 及 RPE+玻璃膜疣複合體。
實例 B 掃描顯示於圖 33A-33C 中。B 掃描 (圖 33A) 基於界線 (圖 33B) 被劃分成層，並確定層厚度及麵積 (圖33C)。厚度圖顯示總視網膜、ONL、感光受體外段、RPE+Drusen 複合體 (圖 34，分別由左到右) 及感光受體內段的厚度。個別個體的實例厚度圖顯示於圖 35-52 中。結果顯示於圖 5 至圖 10 中。 表 5. 研究眼基線及第 6 個月時總黃斑體積的 SD-OCT 參數
Figure 02_image003
表 6. 對側眼基線及第 6 個月時總黃斑體積的 SD-OCT 參數
Figure 02_image005
表 7. 研究眼基線及第 12 個月時總黃斑體積的 SD-OCT 參數
Figure 02_image007
表 8. 對側眼基線及第 12 個月時總黃斑體積的 SD-OCT 參數
Figure 02_image009
表 9. 研究眼基線及第 6 個月時總黃斑體積 – 第 4 組的 SD-OCT 參數
Figure 02_image011
表 10. 對側眼基線及第 6 個月時總黃斑體積 – 第 4 組的 SD-OCT 參數
Figure 02_image013
表 11. 研究眼基線及第 12 個月時總黃斑體積 – 第 4 組的 SD-OCT 參數
Figure 02_image015
表 12. 對側眼基線及第 12 個月時總黃斑體積 – 第 4 組的 SD-OCT 參數
Figure 02_image017
實例 5 ： RPE 治療恢復血液 - 視網膜屏障。
RPE 分泌極高水平的 PEDF (測量的 OpRegen 水平為 2000-4000 ng/ml/天)，其有助於其治療效力。PEDF 是 RPE 及 Muller 膠質細胞在活體內分泌的一種 50 kDa 蛋白質，具有有益功能，諸如抗血管生成活性、感光受體的神經保護功能，可能經由恢復因老化及氧化壓力而擾動的線粒體動力學、抗炎活性 (經由其與主因子 NF-KappaB 相互作用)，以及經由與細胞外基質 (膠原蛋白及蛋白聚醣) 結合的抗纖維化活性。在經 OpRegen 治療的個體中，具有/不具有玻璃膜疣的患者的熒光素血管造影 (FA) 改善證明了這一點，並且早在移植後 2-4 週就可以看到 GA 病變內可能出現 ECM 重塑或疤痕衰減跡象的 OCT 成像。
個體 8 的基線 FA 檢查顯示大量熒光素染料洩漏至玻璃體腔中，其阻礙脈絡膜沖洗及動脈期血管灌注的可見性，表明眼內預先存在血液-視網膜屏障破壞及亞炎症 (圖 53)。移植後 22 個月，FA 檢查顯示清晰脈絡膜及視網膜血管灌注，並且沒有染料洩漏至玻璃體腔中，表明 OpRegen 恢復破損 BRB 的完整性，可能經由多種作用機制，諸如經由 PEDF 各種個體。圖 54A-54D 提供藉由 OpRegen 細胞療法恢復或修復 BRB 的另外三個案例實例。
個體 8 是患有大量玻璃膜疣的患者的典型實例，其廣泛覆蓋整個後部視網膜。圖 55 顯示玻璃膜疣分解自上部 (左上) 的移植區域開始，然後向下移動，清理幾乎整個後部，除了在術後 8 個月仍保留的小細長帶 (上，左起第二個，大圓圈)。與基線 (右上及右下) 相比，OCT 成像特徵與彩色眼底攝影一致，分別為 5.5 個月 (上，右起第二個) 及 8 個月 (下，右起第二個)；subRPE 玻璃膜疣顯著減少或分解。宿主視網膜紋理似乎減弱，其表明可能的 ECM 重塑，部分原因可能是由於高水平 PEDF 存在所帶來的生物學效應。
在 11 個月時，在個體 8 中，在大玻璃膜疣分解後，移植物繼續重塑宿主視網膜 (圖 56A-56C)。FA 顯示顯著減少的染色 (玻璃膜疣)，然而，似乎具有使視網膜血管結構模糊的膜狀面紗。在 22 個月的彩色眼底檢查中，與基線相比，視網膜組織看起來更清晰，此可能係由於它的抗炎作用，或 PEDF 在調節基質外週轉中發揮作用的 ECM 清潔。
圖 57 提供自早期、中期及晚期的時程 FA 檢查，表明視網膜健康顯著改善，整個血管灌注的可見性更好，炎症減少。視網膜組織看起來很乾淨；此 FA 模式以前在其他治療方式中沒有報導過。此對 OpRegen 的治療效果係非常獨特的。
本文提供的所有參考文獻 (包括所有非專利文獻、專利及專利出版物) 以全文引用之方式併入本文。 實例 6 ：利用外界膜 (ELM) 生物標記評估萎縮性 AMD 的臨床試驗設計 ELM 生物標記臨床試驗的目標 1.證明 OpRegen 細胞減緩萎縮區域的進展 (目前萎縮性 AMD 臨床試驗的黃金標準)。 2.證明 OpRegen 細胞在萎縮內區域恢復/再生外部視網膜 (一種全新的範式，目前治療萎縮性 AMD 的方法為解決)。 3.根據食品藥品管理局 (FDA) 及其他監管機構的要求，至少展示視覺功能改善的某種趨勢。 4.將選擇方法論、選定生物標記及臨床試驗設計，以最大限度地利用先前的要點，並根據實例 1 中所描述之正在進行的 OpRegen 1/2a 期臨床試驗 (「正在進行的試驗」) 中獲知的進行預先指定。 實例 1 之 1/2a 期臨床研究中使用的方法論及生物標記
背景技術。近年來，眼底自發熒光 (FAF) 已被用作解剖學生物標記來測量萎縮區域並評估其隨時間的進展 [1-3]。
現在咸信，在正在進行的涉及同種異體移植 RPE 的試驗中藉由 FAF 測量萎縮病變不足以收集其全部功能。由於其作為 RPE 細胞生命的早期階段，它們沒有足夠的時間來積累足夠的脂褐質以發出自發熒光。此外，FAF 沒有考慮視網膜層的狀態，因此不能給出潛在的視網膜恢復的指示。
從未接受僅使用紅外成像 (IR) 測量來評估萎縮界線。
視網膜區域的趨勢已經轉向基於光學同調斷層掃描 (OCT) 的萎縮測量。此係由於掃描解析度、層偵測以及專家知識進步的改進。[4-7] 萎縮界線的測量可以非常精確，沒有 FAF 的潛在偽影和限制，同時允許同時精確評估所有視網膜層 [8] 的狀態，特別是 RPE、橢圓體帶 (EZ)、外界膜 (ELM)；外核層 (ONL) 和外叢狀層 (OPL)。
在地圖狀萎縮或 cRORA (完全 RPE 及外部視網膜萎縮) 區域的布魯赫氏膜上使用新的超反射層作為移植 OpRegen RPE 細胞的生物標記可能會影響準確性，此係由於目前使用當前技術是不可能的，以證明這些是真正的活細胞，而不僅僅是細胞碎片或非活細胞。
因此，為了認為 RPE 位置的高反射新層確實是新植入的、功能性RPE，必須有視網膜外層恢復的跡象，諸如新的 EZ、新的 ELM、新的 ONL 及新的或更少的 OPL 下沉。 成像生物標記：
主要： ELM 邊界 。ELM 邊界下降被認為是感光受體幾乎完全耗盡的區域的界限，並且因此也是 cRORA [9] 中萎縮的界線。
在正在進行的試驗中，手動測量的 ELM 邊界或 ELM 下降，逐個掃描，用於定義萎縮的界線。但是，由於掃描的解析度/品質，確切的 ELM 邊界是有問題的，因此準確性可能會受到影響。儘管存在這種限制，但總體而言，儘管不完全準確，但結果是一致的。考慮潛在的光掃描錯位。結果是一致的，知曉可能存在一些無法偵測到的潛在小錯位。
次要： ONL 及 OPL 。ONL 及 OPL 新區域的測量已被用作視網膜修復/再生概念的支持及證明。然而，儘管新的 ONL 可見，但在許多圖像上甚至可以看到新的下沉 OPL。為了一致性，萎縮的界線僅基於 ELM，即使 ELM 的位置不如新 ONL 及 OPL 建議的恢復位置。此方法被認為是最保守的。
RPE : 僅當存在 ELM、ONL 及 OPL 時才考慮由 OpRegen 細胞恢復 RPE 的新區域或新的 RPE 層，以避免對非功能性細胞或可能由細胞碎片引起的誤解。 設計未來的臨床試驗
選定的生物標記及終點將最終影響未來試驗的設計，這亦將決定樣本大小。儘管隨機試驗看起來很理想，但存在許多困難：由於表型的巨大異質性，該患者群體中萎縮進展的高度可變性表明需要使用大量患者。然而，即使患者在至少 3 種不同表型 (GA 與主要為軟玻璃膜疣相關，GA 與網狀玻璃膜疣相關，以及 GA 與混合玻璃膜疣相關) 進行分層，入組、完成及解釋也將具有挑戰性。
由於 GA 的其他臨床試驗或未來 2 年內可能獲批的藥物的可用性，很難將對照組的 GA 患者長期維持在不接受治療的情況下。對於此等患者來說，唯一符合倫理的解決方案是在可能的 12 個月的規定時段後允許交叉到治療組。
儘管患者是隨機分組的，但由於研究的手術性質，不可能遮盲它們，因此與使用對側眼作為研究對照相比，其並沒有太大優勢。由於目前試驗中出現恢復跡象的患者數量有限，因此進行更大規模的 2b/3 期研究可能還為時過早。
與對側眼進行比較的非隨機試驗，具有更好的定義及預先指定的生物標記及終點，更好的進入 VA 以及更好的基線及歷史資訊可能看起來更可取。 試驗設計：
使用對側眼本身以及對等眼進行的非隨機比較試驗。與對側眼比較的優點有很多：無需根據表型與匹配的對照眼進行比較，因為表型是相同的。其消除維持對照眼長達 3 年的潛在需要。這在對照患者中是不合倫理的，會阻止其經由其他試驗或一旦獲得可能獲得批准的藥物進行治療。由於手術干預的性質，對於研究現場人員來說，即使並非不可能，亦很難遮盲試驗患者。然而，驗光師及影像分級師可能會被遮盲。 解剖終點：
一些終點將集中在病變大小的變化 (目前臨床試驗中的黃金標準) 及視網膜再生/恢復 (一種全新的治療效果範式)。
主要終點 :(藉由 SQRT 以 mm 為單位改變病變大小)。主要終點是根據歷史進展，研究眼本身在某個時間點 (可能 12 個月) 的實際病變大小增長與預測增長的比較。
使用平方根轉換 (SQRT) 測量病變大小的單位為 mm。將在同一患者的經治療的眼睛及對側眼之間進行萎縮區域的比較，同時使用 mm 2及 SQRT 來避免比較不同萎縮大小的眼睛的問題。
若排除極小及極大的病變，則在使用 SQRT 測量時，病變生長率被認為是線性的並被接受為是線性的。因此，若眼睛未經治療，歷史增長可以預測任何時間點的病變生長速度。
此外，已經報道由於使用 SQRT 進行測量的可變性而導致的潛在誤差的大小。[8]。病變面積測量的 SQRT 似乎消除基線病變大小的混雜變量，並消除基於基線病變大小對病變進行分層的需要。因此，無論病變大小是否不同，均可以比較研究眼與對側眼。
因此，與研究眼在 12 個月時的預測生長 (次要終點在 24 個月及 36 個月) 相比，主要終點將是藉由 SQRT 測量的病變大小的變化，正如藉由 OCT 使用 ELM 的邊緣所測量。
為了準確預測生長，需要至少 6 個月的良好及可靠的歷史資料。如有必要，若沒有可用的歷史資料，可以在移植前 6 個月將患者納入研究。精確的歷史資料對於試驗的成功及準確預測回歸隨時間的增長至關重要。若此資訊是準確的，則萎縮生長速度的變化將是可偵測的且可靠的。
圖 11 顯示正在進行的試驗的患者 120 的研究眼及對側眼的理論增長 (虛線)。研究眼顯示 M33 的實際增長遠小於預測的增長。事實上，3 年後的病變大小與基線相比是相同的。對側眼的實際增長略低於理論增長，雖然很接近，每年僅相差 0.1 mm。這支持歷史資料必須盡可能精確並自可靠及一致的成像中獲得的假設。此外，必須考慮到應該考慮一些誤差範圍並將其考慮到研究設計中。[8]
評估病變大小變化的 解剖學次要終點：次要終點是藉由 SQRT 測量的病變大小的變化，藉由 OCT 使用 ELM 的邊緣測量，與對側眼的增長相比。藉由 SQRT 測量的病變大小變化，藉由 OCT 使用 ELM 的邊緣測量，與研究眼在 24 個月及 36 個月時的預測增長進行比較。
評估視網膜再生/恢復的 解剖學次要終點：在 12、24 及 36 個月時，與基線大小相比，藉由 SQRT 測量的病變大小的變化，藉由 OCT 使用 ELM 的邊緣測量 (圖 62)。在視網膜恢復的情況下，該終點將導致負數，其意謂病變大小的減小。
圖 63 顯示在 12、24 及 36 個月時，基線處病變邊界內/外的存活 RPE 面積的變化 (定義為布魯赫膜上方存在超反射單層的區域，其上方存在 ELM、ONL 及 PLEXIFORM)。圖 64 顯示在 12、24 及 36 個月時 ONL 體積在基線處病變邊界內/外的變化 (若存在 OPL 及/或 ELM，則定義為 ONL)。特別是在此終點，應該使用自動偵測及人工智慧。
視覺功能次要終點： BCVA 及 LLVA ：為了能夠在 12、24 或 36 個月時偵測到研究眼與比較眼 (對側眼) 之間的差異，基線相對保留的視覺功能應為強制性的。因此，基線 BCVA 的進入準則應為約 20/40 。為了不影響 BCVA 及 LLVA 的結果，研究眼應為最差的眼。理想情況下，兩隻眼睛應具有相似的 BCVA，差異小於 10 個字母，以便始終具有可比性。
視敏度次要終點：● 與基線相比，12、24 及 36 個月時 BCVA 及 LLVA 的變化。 ● 與對側眼相比，12、24 及 36 個月時 BCVA 及 LLVA 的變化。
微視野檢查：為了能夠在 12、24 或 36 個月時偵測到研究眼與比較眼 (對側眼) 之間的差異，雙眼執行微視野檢查的基線能力應為強制性的，並且在沒有能力的情況下應該有一個排除準則。
微視野檢查次要終點：● 與基線相比，12、24 及 36 個月時微視野檢查的變化。 ● 與對側眼相比，12、24 及 36 個月時微視野檢查的變化。
( 患者回報之結果措施 ) ：在研究眼是患者最好的眼睛的情況下，其對於視敏度終點並非較佳的。
FRI - 功能性閱讀依賴性 (FRI) 指數
NEI VFQ-25 - 國家眼科研究所視力功能問卷；參見例如 www.nei.nih.gov/sites/default/files/2019-06/vfq_sa.pdf，以全文引用之方式併入本文。 發明內容
目標。在接受 OpRegen 細胞移植治療的 AMD 繼發性地圖狀萎縮患者中，評估定義為病變增長速度降低及視網膜恢復/再生的療效，以及安全性及耐受性。
階段。2b 期
研究人群及主要進入準則：● 患有雙側 AMD 及地圖狀萎縮的患者，以前沒有任何一隻眼睛的滲出性 AMD 病史。(若雙側招募太困難，作為替代選擇，可考慮第二組無滲出物單側 GA 患者。此等眼睛不能與其對側眼相比，但可以與雙側組的對側眼相比。僅一半的次要終點適用於該組。使用此選項，經治療的眼睛的數量將是對照眼的兩倍，即 2:1)。 ● 雙眼的 BCVA 優於 20/80。 ● 雙眼之間的差異少於 10 個字母。 ● 中央凹至少部分受萎縮影響 (約 50%)，以排除沒有中央凹受累且視敏度極好的眼睛，以證明儘管基線處 BCVA 相對較好，但同時可能保證未經治療的對側眼功能下降。 ● 能夠在雙眼中進行微視野檢查。
試驗設計：● 單盲、非隨機試驗 ● 比較者/對照組： ○ 同一隻眼睛的 GA 的預測增長及視網膜外層特徵的變化 ○ GA 的對側眼增長 ○ 與基線相同眼睛相比的功能性終點 ○ 與對側眼相比的功能性終點 終點
主要終點。藉由 SQRT 測量的病變大小變化，藉由 OCT 使用 ELM 的邊緣測量，與 12 個月時研究眼的預測增長相比。
次要終點：
解剖學。藉由 SQRT 測量的病變大小變化，藉由 OCT 使用 ELM 的邊緣測量，與研究眼在 24 個月及 36 個月時的預測增長進行比較。
藉由 SQRT 測量的病變大小變化，藉由 OCT 使用 ELM 的邊緣測量，與對側眼的增長相比。
藉由 SQRT 測量的病變大小變化，藉由 OCT 使用 ELM 的邊緣測量，與 12、24 及 36 個月時的基線增長相比。
基線處病變邊界內/外 12、24 及 36 個月時存活 RPE 面積的變化。
基線處病變邊界內/外 12、24 及 36 個月的 ONL 體積變化。
功能性。與基線相比，12、24 及 36 個月時 BCVA 的變化。
與基線相比，12、24 及 36 個月時 LLVA 的變化。
與對側眼相比，12、24 及 36 個月時 BCVA 的變化。
與對側眼相比，12、24 及 36 個月時 LLVA 的變化。
與基線相比，12、24 及 36 個月時微視野檢查的變化。
與對側眼相比，12、24 及 36 個月時微視野檢查的變化。
(生活品質，僅在最好的眼睛得到治療的情況下，不太可能並且也不是視敏度終點的最佳方案)。
將 FRI 測試相對於基線更改為 12、24 及 36 個月。
NEI VFQ-25 測試相對於基線至 12、24 及 36 個月的變化。 實例 7 ： OpRegen 在繼發於老年性黃斑部病變 (AMD) 的地圖狀萎縮 (GA) 中之安全性及活性的 1/IIa 期研究的其他資料
如上文所描述，I/IIa 期研究是一項開放標籤、單臂、多中心、劑量遞增試驗，其評估單次投予雙側 GA 患者視網膜下遞送的 OpRegen。24 名患者被納入 4 組。前 3 組僅招募最佳矯正視敏度 (BCVA) 為 20/200 或更差的法定失明患者。第四組招募 12 名視力受損的患者 (BCVA 自 20/65 至 20/250，GA 的平均面積較小)。第 4 組亦包括接受新的「解凍及注射」 OpRegen 調配物治療的患者，該調配物可以直接運送至現場並在解凍後立即使用，從而消除必須使用劑量製備設施的併發症及後勤保障。該研究的主要目的是評估 OpRegen 的安全性及耐受性，藉由治療出現的不良事件的發生率及頻率進行評估。次要目標是藉由評估藉由各種主要臨床相關方法測量之眼科參數的變化來評估 OpRegen 治療的初步活性。
基線特徵及追蹤研究如下表14所示。在第 1-3 組與第 4 組中觀測到更大的疾病嚴重程度。 表 14：基線特徵及研究追蹤
Figure 02_image019
a選擇基於 BCVA 的較差眼睛進行 OpRegen 視網膜下遞送。 b基於眼底自發熒光成像的中心分級。
提供安全性摘要，並顯示 OpRegen 具有良好的耐受性，以及可接受的安全性概況。所有 24 名 (100%) 接受治療的患者回報≥ 1 次 AE 及 ≥ 眼部 AE (最常見的全身性 AE 是 URTI (n=7)，最常見的眼部 AE 是結膜出血/充血 (n=17) 及 ERM (n= 16))。回報的大多數 AE (第 1-3 組為 87%；第 4 組為 93%) 是輕度的。沒有回報與免疫抑制方案相關的 AE 集群。一名患者因 AE (與治療無關的 IV 級肺腺癌) 而停藥。未回報 OpREgen 視網膜下遞送後的排斥反應的案例。未觀測到急性或遲發性眼內炎症，或持續眼內壓升高。
使用 OpRegen 的眼部 AE 回報在下表 15 中。 表 15：OpRegen 的眼部 AE 主要與視網膜下遞送的外科手術有關。
Figure 02_image021
OpRegen 向 GA 區域及中央凹的視網膜下遞送顯示出更大的視覺功能增益，同時視網膜外層結構得到改善。第 4 組中的 5 名患者將 OpREgen 遞送至大部分或全部 GA 區域，包括中央凹。此等五名患者的視覺功能獲得了更大的收益 (平均增加 12.8 個字母)，有證據表明藉由 SD-OCT 評估的外部視網膜結構區域明顯改進 (圖 69)。
該研究進一步包括在 OpRegen 遞送後對 GA 的評估，並提供 SD-OCT 與眼底自發熒光 (FAF) 成像相比的優勢 (圖 70)。OpRegen 中之同種異體 hESC 衍生之 RPE 細胞很年輕，脂褐質含量低，因此在視網膜下遞送後，標準 FAF 預計不容易偵測到 OpRegen RPE 細胞。在 RPE/布魯赫膜上可見更大的超反射率 (圖 71)。SD-OCT 成像表明 OpRegen 存在於前 GA 區域。在將 OpREgen 遞送至 GA 區域的情況下，藉由 SD-OCT 提供對外部視網膜結構的改進。如圖 72 所示，在第 12 個月時，RPE 層的局部破壞、脈絡膜超透射及基線時的外部視網膜下陷不再存在，並且藉由存在顯著的玻璃膜疣及脈絡膜血管標記證實掃描的登記。此外，在圖 73A 及 73B 中，將第 12 個月與基線進行比較，並觀測到以下情況：cRORA 的特徵不再存在，在 RPE/布魯赫膜水平下存在更大的超反射率，更少的脈絡膜超透射率，視網膜下陷的消退，具有更大的外部視網膜層連續性，在 GA 的鼻、上及下邊界亦可以看到類似的特徵。圖 74 顯示中央凹中心附近外部視網膜層的改進。
此項 I/IIa 期研究的 12 個月主要終點資料表明， OpRegen 具有良好的耐受性，以及可接受的安全性概況及大多數輕度 AE。使用 OpRegen 觀測到的眼部 AE 主要與用於視網膜下遞送的外科手術有關。在患有 GA 及視力受損的患者 (第 4 組；n=12)中觀測到 OpREgen 可改善外部視網膜結構及視覺功能的初步證據。所有 24 名接受治療的患者均回報至少一種不良事件 (AE) 及至少一種眼部 AE。OpRegen 回報的大多數 AE 是輕度的 (第 1-3 組，87%；第 4 組，93%)，並且免疫抑制方案耐受性良好。使用 OpRegen 觀測到的眼部 AE 主要與用於視網膜下遞送的外科手術有關，其中最常見的是結膜出血/充血 (n=17) 及視網膜前膜 (n=16)。一名患者因與治療無關的 AE 終止研究。未回報在 OpRegen 視網膜下遞送後出現排斥、急性或延發性眼內炎症或眼內壓持續升高的案例。在基線時具有 GA 及視力受損的患者中觀測到視覺功能改善的初步證據 (第 4 組 [n = 12])。第 4 組中之患者在 12 個月的研究眼中視敏度平均增加 7.6 個字母。第 4 組中之 3 名患者 (25%) 在 12 個月的研究眼中視敏度增加 15 個字母或更多。第 4 組中之 5 名患者將 OpRegen 遞送至大部分或所有 GA 區域，包括中央凹，視覺功能獲得更大的增益 (平均 12.8 個字母增益)，有證據表明外部視網膜結構明顯改進的區域由 SD-OCT 評估。此等資料支持 OpRegen 減緩、停止或逆轉 GA 疾病進展的潛力。需要在更大的對照臨床研究中進一步評估干預的最佳疾病階段、視網膜下遞送的外科手術及 OpRegen 的目標遞送位置，以確認此等發現。
此等資料支持 OpRegen 減緩、停止或逆轉 GA 疾病進展的潛力。 參考文獻 1.     Holz, F.G. 等人， Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age- Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials.JAMA Ophthalmol, 2018. 136(6)：第 666-677 頁。 2.     Liao, D.S. 等人， Complement C3 Inhibitor Pegcetacoplan for Geographic Atrophy Secondary to Age-Related Macular Degeneration: A Randomized Phase 2 Trial.Ophthalmology, 2020. 127(2)：第 186-195 頁。 3.     Jaffe, G.J.等人， C5 Inhibitor Avacincaptad Pegol for Geographic Atrophy Due to Age- Related Macular Degeneration: A Randomized Pivotal Phase 2/3 Trial.Ophthalmology, 2021. 128(4)：第 576-586 頁。 4.     Sadda, S.R.等人， Consensus Definition for Atrophy Associated with Age-Related Macular Degeneration on OCT: Classification of Atrophy Report 3.Ophthalmology, 2018. 125(4)：第 537-548 頁。 5.     Guymer, R.H.等人， Incomplete Retinal Pigment Epithelial and Outer Retinal Atrophy in Age-Related Macular Degeneration: Classification of Atrophy Meeting Report 4.Ophthalmology, 2020. 127(3)：第 394-409 頁。 6.     Jaffe, G.J.等人， Imaging Features Associated with Progression to Geographic Atrophy in Age-Related Macular Degeneration: Classification of Atrophy Meeting Report 5.Ophthalmol Retina, 2020. 7.     Wu, Z.等人， OCT Signs of Early Atrophy in Age-Related Macular Degeneration: Interreader Agreement: Classification of Atrophy Meetings Report 6.Ophthalmol Retina, 2021. 8.     Yehoshua, Z.等人， Progression of geographic atrophy in age-related macular degeneration imaged with spectral domain optical coherence tomography.Ophthalmology, 2011. 118(4)：第 679-86 頁。 9.     Li, M.等人， HISTOLOGY OF GEOGRAPHIC ATROPHY SECONDARY TO AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION: A Multilayer Approach.Retina, 2018. 38(10)：第 1937-1953 頁。
無
[ 圖 1]顯示視網膜掃描，其顯示在用 RPE 細胞治療後 3 個月時個體 18 的地圖狀萎縮 (GA) 內的色素沉著區域 (箭頭)，證明在 GA 的下部區域中存在 RPE 細胞。由白色圓圈表示的 RPE 細胞移植區域也稱為泡區，其是由 RPE 細胞注射產生的水泡狀形成物。 [ 圖 2]顯示視網膜掃描，其顯示在治療後 9 個月時個體18 的 GA 內的色素沉著區域 (箭頭)，證明在 GA 的下部區域中存在 RPE 細胞。 [ 圖 3]是顯示在指定治療後 12 名個體中之每一者的基於早期治療糖尿病視網膜病變研究 (ETDRS) 字母數相對於基線變化的視敏度變化的圖。幾乎所有個體都保持其基線 BCVA，並且超過一半個體的 BCVA 穩步改善。 [ 圖 4]是顯示組 4 中經治療及未經治療 (另一側) 的眼睛的 GA (mm 2) 大小隨時間的平均變化的圖。資料表明，與對側眼相比，經治療的眼睛的 GA 生長較慢。 [ 圖 5]是顯示組 4 中經治療及未經治療 (另一側) 的眼睛的基於 ETDRS 字母數隨時間相對於基線的平均變化的視敏度變化的圖。資料表明，與對側眼相比，經治療的眼睛的 BCVA 降低不太嚴重。 [ 圖 6]是顯示個體 22 中經治療及未經治療 (另一側) 的眼睛的 ETDRS 字母數隨時間相對於基線的平均變化的圖。個體表現出經治療的眼睛的視覺功能活動的顯著改善及獲得相對於對側眼的減少。 [ 圖 7A-7C]顯示個體 14 隨時間的變化。 圖 7A是顯示經治療及未經治療(另一側) 的眼睛的 ETDRS 字母數相對於基線隨時間的平均變化的圖。 圖 7B是顯示經治療及未經治療 (另一側) 的眼睛的 GA (mm 2) 大小相對於基線隨時間的平均變化的圖。 圖 7C顯示經治療及未經治療 (另一側) 的眼睛中在基線及治療後 3 年讀取的字母數的圖。個體在解剖及視覺功能態樣表現出經治療的眼睛與對側眼之間的顯著差異，有利於經治療的眼睛。 [ 圖 8]是顯示來自組 4 的個人個體的經治療 (左圖) 及未經治療 (另一側，右圖)的眼睛中之閱讀速度 (每分鐘字組) 隨時間的變化的圖。資料表明經治療與對側眼的功能性臨床視覺改善。 [ 圖 9]顯示在基線 (頂部) 及治療後 9 個月 (底部) 來自個體 14 的經治療之視網膜的高解析度光學同調斷層掃描 (OCT) 圖像。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。GA 的邊界表明 9 個月時外部視網膜層恢復/再生。 [ 圖 10]顯示在開始研究之前 (歷史，橙色，左圖)、在基線 (紅色)、治療後 9 個月 (藍色) 及 23 個月 (黃色) 的個體 14 的經治療之視網膜的 OCT 圖像。在治療後 9 個月及 23 個月觀測到 GA 相對於基線退化，表明解剖學改善及外部視網膜再生/恢復。 [ 圖 11]是顯示個體 14 的雙眼中 GA 的總大小 (平方根轉換的總面積，SQRT) 的變化以及以 mm SQRT/yr 計的相對於先前及相對於基線的變化率 (自歷史繪製的預期增長) 的圖。黃色陰影條表示另一側 (FE)、未經治療的眼睛的預測/預期生長。藍色陰影條表示研究經治療的眼睛的預測/預期生長。 [ 圖 12]是來自個體 14 的經治療的眼睛的 OCT 視網膜圖像，其顯示在基線 (頂部) 及在治療後 3 個月 (底部) 基於 ELM 邊界的 GA 邊界。ELM 邊界由紅色箭頭及虛線顯示。ELM 邊界自基線 (BSL) 至 3 個月 (3M) 的變化由大箭頭表示。外叢狀層由藍色箭頭表示。底部圖像中的綠色小箭頭顯示新的 RPE 細胞。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。在 3M 治療後已經觀測到 ELM 邊界及/或 ONL/OPL 的中心生長，以及新的可能 RPE。 [ 圖 13]是來自個體 14 的經治療的眼睛的 OCT 視網膜圖像，其顯示在基線 (頂部) 及在治療後 5 個月 (底部) 基於 ELM 邊界的 GA 邊界。ELM 邊界由紅色箭頭及虛線顯示。ELM 邊界自基線 (BSL) 至 5 個月 (5M) 的變化由大箭頭表示。外叢狀層由藍色箭頭表示。新的 RPE 細胞由綠色小箭頭顯示。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。在 5M 治療後觀測到 ELM 邊界及/或 ONL/OPL 的中心生長，以及新的可能 RPE。 [ 圖 14]是來自個體 14 的經治療的眼睛的OCT視網膜圖像，其顯示在基線 (頂部)、在治療後 9 個月 (中心) 及 23 個月 (底部) 基於 ELM 邊界的 GA 邊界。ELM 邊界由紅色箭頭及虛線顯示。ELM 邊界自基線 (BSL) 至 9 個月 (9M) 的變化由大箭頭表示。9M 至 23 個月 (23M) 的變化用中箭頭表示。外叢狀層由藍色箭頭表示。新的 RPE 細胞由綠色小箭頭顯示。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。在治療後 9M 處觀測到 ELM 邊界及/或 ONL/OPL 的中心生長，以及新的可能 RPE，在 23M 處有小幅回歸。 [ 圖 15]顯示在治療後 23 個月 (23M) 及 35 個月 (35M) 時個體 14 的經治療的眼睛的微視野檢查測試的變化。圖 15 表明視覺功能的改善及暗點的減少 (「盲點/區域」表示為橙色圓圈中的黑色污點)，以及與 23M 相比，35M 的光敏感度有所改善。微視野檢查是一種與眼底相關的視野測試，其可捕獲黃斑區域的特定視覺區域，並生成高解析度及準確的視網膜敏感區域映射。與「簡單」的 BCVA 測試相比，微視野檢查是一種更好的評估視覺功能變化的測試，其具有更高的可靠性。此外，微視野檢查提供解剖變化與視覺功能缺陷之間的準確相關性。 [ 圖 16]是來自個體 21 的經治療的眼睛的 OCT 視網膜圖像，顯示在基線 (頂部) 及治療後 1 個月 (底部) 基於 ELM 邊界的 GA 邊界。ELM 邊界由箭頭及虛線表示。OPL 邊界用箭頭表示。ELM 邊界自基線 (BSL) 至 1 個月 (1M) 的變化由虛線之間的箭頭表示。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。在 1M 治療後觀測到 ELM 邊界及/或 OPL 的中心生長。 [ 圖 17]是個體 21 的視網膜的紅外 (IR) 圖像。顯示基線及 1 個月處的 GA 邊界。 [ 圖 18]是來自個體 21 的經治療的眼睛的 OCT 視網膜圖像，其顯示在基線 (頂部) 及治療後 3 個月 (底部) 的孤立的萎縮性病變。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。新特徵 (圓圈) 表明 3 個月時外部視網膜再生。觀測到先前萎縮區域幾乎完全恢復，其中缺失層再生並且萎縮性病變「消失」。 [ 圖 19]是來自個體 21 的經治療的眼睛的 OCT 視網膜圖像，其顯示基線 (頂部) 及治療後 3 個月 (底部) 的 GA。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。一個新的超反射單層可能在 3 個月時顯示 RPE 細胞，及可能恢復 ELM、OPL 及 ONL。 [ 圖 20]是來自個體 21 的經治療的眼睛的 OCT 視網膜圖像，其顯示基線 (頂部) 及治療後 3 個月 (底部) 的 GA。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。一個非常薄但均勻且連續的 ONL 層 (圓圈) (其在脈絡膜超透射區域上具有保留的 ELM 及 RPE 單層) 通常不存在，但在治療後 3 個月時被觀測到。此表明在萎縮區域內的恢復之新層。 [ 圖 21]顯示在投予 OpRegen-RPE 之前 (基線，左上)、1 個月 (左中) 及 2 個月 (左下) 之後個體 21 的視網膜中孤立的萎縮性病變的圖像。右圖表示左圖中所示的視網膜區域。 [ 圖 22]顯示在投予 OpRegen-RPE 之後 (基線，左上)、1 個月 (左中) 及 2 個月 (左下) 之前個體 21 的視網膜中的上部 GA 區域的圖像。右圖表示左圖中所示的視網膜區域。 [ 圖 23]顯示個體 22 隨時間的變化。左圖是顯示經治療及未經治療 (對側) 的眼睛的 ETDRS 字母數相對於基線隨時間的平均變化的圖。右圖是顯示經治療及未經治療 (對側) 的眼睛的 GA (mm 2) 大小相對於基線隨時間的平均變化的圖。資料表明在解剖及視覺功能態樣表現出經治療的眼睛與對側眼之間的顯著差異，有利於經治療的眼睛。在經治療的眼睛上觀測到顯著的視敏度改善。 [ 圖 24]是眼底攝影 (FP) 圖像，顯示在個體 22 的視網膜中在治療後 3 個月 (右圖) 的細色素斑，但在基線 (左圖) 處沒有，表明在 3 個月時存在 RPE 細胞。 [ 圖 25]是個體 22 在基線 (左) 及治療後 3 個月 (右) 的視網膜的 IR 圖像。GA 邊界在 3 個月時減少並且不太明確。 [ 圖 26]是來自個體 22 的經治療的眼睛的OCT視網膜圖像，其顯示基線 (頂部) 及治療後 3 個月 (底部) 的中央 GA。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。萎縮的基線界線用線顯示。用小箭頭表示新特徵，包括外叢狀的較少下陷，萎縮區域內的新 ELM，萎縮區域內的新 RPE，以及較少的超傳遞。 [ 圖 27]是來自個體 22 的經治療之眼睛的 OCT 視網膜圖像，其顯示基線 (頂部) 及治療後 3 個月 (底部) 的低級 GA。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。萎縮的基線界線用線顯示。用小箭頭表示新特徵，包括外叢狀的較少下陷，萎縮區域內的新 ELM 以及萎縮區域內的新 RPE。 [ 圖 28]是來自個體 22 的經治療的眼睛的 OCT 視網膜圖像，其顯示在基線 (頂部) 及治療後 3 個月 (底部) 的孤立的萎縮性病變。左側圖像表示右側圖像中顯示的視網膜區域。萎縮的基線界線用線顯示。用小箭頭表示新特徵，包括外叢狀的較少下陷，萎縮區域內的新 ELM 以及萎縮區域內的新 RPE。 [ 圖 29]是基於 ELM 邊界的 OCT 視網膜圖像，其顯示基線 (左) 及 3 個月 (右) 的 GA 邊界。指出總面積、增長率及 SQRT 轉化生長率。 [ 圖 30]是 OCT 視網膜圖像，其顯示個體 22 在基線 (左上)、治療後 2 個月 (左中)及 3 個月 (左下) 的中央 GA 區域。在 2 個月時觀測到新的視網膜下材料 (RPE 細胞)，在 3 個月 (箭頭)時觀測到視網膜下材料增加及 ELM 再形成。右圖表示左圖中所示的視網膜區域。藍色圓圈是漸進坐標，顯示脈絡膜的血管，其用於標記同一位置並在隨後的訪問中捕獲視網膜的確切區域。 [ 圖 31]是顯示個體 14 在基線 (左上)、手術期間 (手術內，右上)、治療後 2 個月 (左下) 及 3 個月 (右下) 的RPE遞送區域的視網膜圖像。氣泡代表細胞遞送的區域。氣泡在手術期間覆蓋 GA，表明 RPE 細胞完全覆蓋 GA。 [ 圖 32]是顯示代表個體 19 (左) 及 21 (右) 的 RPE 細胞遞送區域的氣泡的術中成像的視網膜圖像。GA 用箭頭表示。 [ 圖 33A-33C]是光譜域光學同調斷層掃描 (SD-OCT) 圖像。 圖 33A顯示示例 B 掃描。 圖 33B是來自圖 33A 的 B 掃描，其中各層之間的界線重疊。 圖 33C是來自圖 33A 的 B 掃描，其中層厚度疊加。 [ 圖 34]顯示自 SD-OCT 生成的厚度及面積圖的示例說明。組織損失用白色區域表示，保留的組織區域用灰色或黑色表示。顯示整個視網膜 (左圖)、外核層 (左起第二個)、感光受體外段 (右起第二個) 及 RPE + 玻璃膜疣複合體 (右圖) 的相對厚度。 [ 圖 35]顯示個體 8 在基線 (左)、治療後 3 個月 (左起第二個)、6 個月 (右起第二個) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上)及未經治療的眼睛 (下) 的總視網膜厚度圖。表示平均總厚度。 [ 圖 36]顯示個體 8 在基線 (左)、治療後 3 個月 (左起第二個)、6 個月 (右起第二個) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上)及未經治療的眼睛 (底部) 的外核層 (ONL) 的厚度圖。表示 ONL 的總面積。 [ 圖 37]顯示個體 8 在基線 (左)、治療後 3 個月 (左起第二個)、6 個月 (右起第二個) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上)及未經治療的眼睛 (底部) 的感光受體外段的厚度圖。表示感光受體外段的總面積。 [ 圖 38]顯示個體 8 在基線 (左)、治療後 3 個月 (左起第二個)、6 個月 (右起第二個) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上)及未經治療的眼睛 (底部) 的 RPE 及玻璃膜疣複合體的厚度圖。表示 RPE 及玻璃膜疣複合體的總面積。 [ 圖 39]顯示個體 5 在基線 (左)、治療後 6 個月 (中央) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的總視網膜厚度圖。表示平均總厚度。 [ 圖 40]顯示個體 5 在基線 (左)、治療後 6 個月 (中央) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的外核層 (ONL) 的厚度圖。表示 ONL 的總面積。 [ 圖 41]顯示個體 5 在基線 (左)、治療後 6 個月 (中央) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的感光受體外段的厚度圖。表示感光受體外段的總面積。 [ 圖 42]顯示個體 5 在基線 (左)、治療後 6 個月 (中央) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的 RPE 及玻璃膜疣複合體的厚度圖。表示 RPE 及玻璃膜疣複合體的總面積。 [ 圖 43]顯示個體 13 在基線 (左)、治療後 6 個月 (中央) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的總視網膜厚度圖。表示平均總厚度。 [ 圖 44]顯示個體 13 在基線 (左)、治療後 6 個月 (中央) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的外核層 (ONL) 的厚度圖。表示 ONL 的總面積。 [ 圖 45]顯示個體 13 在基線 (左)、治療後 6 個月 (中央) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的感光受體內段的厚度圖。表示感光受體外段的總面積。 [ 圖 46]顯示個體 13 在基線 (左)、治療後 6 個月 (中央) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的感光受體外段的厚度圖。表示感光受體外段的總面積。 [ 圖 47]顯示個體 13 在基線 (左)、治療後 6 個月 (中央) 及 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的 RPE 及玻璃膜疣複合體的厚度圖。表示 RPE 及玻璃膜疣複合體的總面積。 [ 圖 48]顯示個體 14 在基線 (左) 及治療後 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的總視網膜厚度圖。表示平均總厚度。 [ 圖 49]顯示個體 14 在基線 (左) 及治療後 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的外核層 (ONL) 的厚度圖。表示 ONL 的總面積。 [ 圖 50]顯示個體 14 在基線 (左) 及治療後 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的感光受體內段的厚度圖。表示感光受體外段的總面積。 [ 圖 51]顯示個體 14 在基線 (左) 及治療後 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的感光受體外段的厚度圖。表示感光受體外段的總面積。 [ 圖 52]顯示個體 14 在基線 (左) 及治療後 12 個月 (右) 的經治療的眼睛 (上) 及未經治療的眼睛 (底部) 的 RPE 及玻璃膜疣複合體的厚度圖。表示 RPE 及玻璃膜疣複合體的總面積。 [ 圖 53]顯示個體 8 的基線FA檢查，其中大量熒光素染料洩漏到玻璃體腔中，這在脈絡膜沖洗及動脈期阻斷了血管灌注的可見性，表明眼內預先存在血液-視網膜屏障破壞及副炎症。在移植後 22 個月，FA檢查顯示清晰的脈絡膜及視網膜血管灌注，沒有染料滲入玻璃體腔，表明 OpRegen 可能經由多種作用機制恢復破損BRB的完整性。 [ 圖 54A-54D]顯示在基線及移植後 10.5 個月至 22 個月之間FA成像的相似變化或改善的四個案例。 [ 圖 55]顯示自上 (左上) 移植區域開始的玻璃膜疣解析，然後向下移動，清理幾乎整個後部，除了在術後 8 個月保留的小細長帶(上，左起第二個，大圓圈)。OCT 成像特徵與彩色眼底攝影一致，在 5.5 個月(上，右起第二個) 及 8 個月 (下，右起第二個)，與基線 (右上及右下) 相比，subRPE 玻璃膜疣顯著減少或消退。 [ 圖 56A]: FA 顯示顯著減少的染色 (玻璃膜疣)，然而，似乎具有使視網膜血管結構模糊的膜狀遮蓋物。外被細胞反應可見。 圖 56B: 在 22 個月的彩色眼底檢查(color fundus exam)中，與基線相比，視網膜組織看起來更清晰。 圖 56C顯示在 11 個月時，移植物在大玻璃膜疣溶解後繼續重塑宿主視網膜。 [ 圖 57]提供自早期、中期及晚期的時程 FA 檢查，表明視網膜健康顯著改善，其中整個血管灌注的可見性更好，並且炎症減少，視網膜組織看起來非常清晰。 [ 圖 58]顯示在 GA 疤痕及 ECM 重塑中的 OpRegen 細胞療法。 [ 圖 59]顯示不同形式的ECM重塑的OCT圖像。 [ 圖 . 60A 及 60B]顯示兩個表格，藉由測量ETDRS測試中字母數從自基線至 6M 時間的變化來說明組 4 個體的視覺功能。 圖 60A表示經治療的眼睛的視覺功能，並且 圖 60B表示對側眼的視覺功能。基線由 0 表示，並且正數 (亦標記為綠色) 表示自基線獲得的字母數。負數 (亦標記為紅色) 由數字前的減號表示，並表示自基線丟失的字母數。例如，個體 13 (602) 保持穩定的 BCVA 改善，並在其上次訪問時自基線獲得 19 個字母。 [ 圖 61A]是彩色攝影及紅外成像的眼底圖像。左上圖顯示基線的彩色眼底攝影。右上圖以紅色顯示基線時的萎縮，並且橙色顯示基線前 14 個月的萎縮，顯示自橙色至紅色的自然歷史生長。左下方彩色眼底攝影圖像顯示病變週圍有淡褐色邊緣，對應於移植後 15 個月 OpRegen 細胞的位置。右下方的紅外圖像以綠色顯示移植後 15 個月的萎縮區域，其中週圍的灰色邊緣對應於 OpRegen 細胞的區域及視網膜恢復區域。 圖 61B是光學同調斷層掃描的圖像。上圖為移植後 15 個月穿過萎縮區域的OCT掃描，其中紅色區域為RPE，深藍色區域為ELM，並且淺藍色區域為 ONL。由於視網膜恢復，此等層與相同的掃描相比已經進展到中央，但在基線處進行。下圖顯示相同的基線處掃描，其中未顯示 RPE、ELM 及 ONL 的萎縮區域要大得多。 [ 圖 62]顯示 OpRegen 細胞移植後病變大小的潛在減小。紅色：病變的基線界線。藍色：8 個月。 [ 圖 63]顯示在先前 CRORA 區域中存在新的超反射單層，可能是可行的 RPE，因為其顯示了 ELM、ONL 及 OPL 的特徵。 [ 圖 64]顯示視網膜再生的一致發現 (新的 ONL、EM、ELZ 及 RPE)：使用 ELM 及/或 OPL 界線定義新的 ONL 區域。 [ 圖 65]是顯示雙眼SQRT中萎縮性病變的總大小的變化及以 mm SQRT/yr 為單位的相對於先前及相對於基線的變化率 (自歷史繪製的預期生長) 的圖。 [ 圖 66]顯示 OpRegen的示意圖，一種同種異體 RPE 細胞的懸浮液，具有抵消 GA 中 RPE 細胞損失的潛力。 [ 圖 67]是顯示 OpRegen 具有藉由支持視網膜結構及功能來抵消 GA 區域中 RPE 細胞損失的潛力的圖。 [ 圖 68A 及 68B]是顯示視覺功能改善的證據的圖；其中在組 4 中，平均增加 7.6 個字母，並且 25% 的患者增加 ≥ 15 個字母。圖 68A 顯示組 1-3 的圖。並且圖 68B 顯示組 4 的圖。 [ 圖 69]是顯示 OpRegen 向 GA 區域及中央凹的視網膜下遞送的圖像；觀測到外部視網膜結構改善區域的視覺功能獲得更大。組 4 中的 5 名患者將 OpRegen 遞送至大部分或全部 GA 區域，包括中央凹。這五名患者的視覺功能增加較大 (平均增加 12.8 個字母)，藉由 SD-OCT 評估外部視網膜結構明顯改善的區域的證據。 [ 圖 70]顯示 OpRegen 遞送後的 GA 評估圖像；顯示 SD-OCT 與眼底自發熒光 (FAF) 成像的優勢。OpRegen 中的同種異體 hESC 衍生之 RPE 細胞係年輕的且脂褐質含量低。OpRegen RPE 細胞預計在視網膜下遞送後不易被標準 FAF 偵測到。 [ 圖 71]顯示在 RPE/布魯赫膜處可見的更大超反射率的圖像。SD-OCT 成像表明 OpRegen 存在於前 GA 區域。 [ 圖 72]顯示在 OpRegen 遞送至 GA 區域的情況下藉由 SD-OCT 對外部視網膜結構的示例性改善的圖像。在第 12 個月時，在基線處不再存在 RPE 層的局灶性破壞、脈絡膜超透射及外部視網膜下陷。藉由存在顯著的玻璃膜疣及脈絡膜血管標記來確認配準掃描。 [ 圖 73A 及 73B]是顯示在將 OpRegen 遞送至 GA 區域的情況下藉由 SD-OCT 改善外部視網膜結構的實例的圖像。圖 73A 是顯示基線 GA 邊界附近的 cRORA 解析度的圖像。圖 73B 是顯示第 12 個月時的比較的圖像，與基線及以下觀測相比：cRORA 的特徵不再存在；在 RPE/布魯赫膜的程度上的更大的超反射率，更少的脈絡膜超透射，以及具有更大外部視網膜層連續性的視網膜下陷的解析度。在 GA 的鼻、上及下邊界亦看到了類似的特徵。 [ 圖 74]是顯示在將 OpRegen 遞送至 GA 區域的情況下藉由 SD-OCT 改善外部視網膜結構的實例的圖像。 [ 圖 75]是顯示個體#120 在基線訪問時的結果的圖像。經治療的眼睛 (OS) 的 BCVA 為 54，與基線相同，並且比前一年 (50) 多 4 個字母。對側眼的 BCVA 為 28，與基線 (61) 相比減少了 33 個字母，並且比上一年 (21) 多 7 個字母。恢復層仍然保留，並且細胞仍然存在。與經治療的眼睛相比，FAF 在對側眼上表現出快速生長。 [ 圖 76]是顯示個體 #120 在 4 年訪問中的結果的圖像。經治療的眼睛 (OS) 的 BCVA 為 54，與基線相同，並且比前一年 (50) 多 4 個字母 。對側眼的 BCVA 為 28，與基線 (61) 相比減少了 33 個字母，並且比上一年 (21) 多 7 個字母。恢復層仍然保留，並且細胞仍然存在。與經治療的眼睛相比，FAF 在對側眼上表現出快速生長。 [ 圖 77]是顯示經治療的眼睛的結果的圖像。經治療的眼睛 (OS) 的 BCVA 為 54，與基線相同，並且比前一年 (50) 多 4 個字母 。對側眼的 BCVA 為 28，與基線 (61) 相比減少了 33 個字母，並且比上一年 (21) 多 7 個字母。恢復層仍然保留，並且細胞仍然存在。與經治療的眼睛相比，FAF 在對側眼上表現出快速生長。 [ 圖 78]是顯示對側眼的結果的圖像。經治療的眼睛 (OS) 的 BCVA 為 54，與基線相同，並且比前一年 (50) 多 4 個字母 。對側眼的 BCVA 為 28，與基線 (61) 相比減少了 33 個字母，並且比上一年 (21) 多 7 個字母。恢復層仍然保留，並且細胞仍然存在。與經治療的眼睛相比，FAF 在對側眼上表現出快速生長。 [ 圖 79]是顯示基線及 9 個月訪問結果的圖像。經治療的眼睛 (OS) 的 BCVA 為 54，與基線相同，並且比前一年 (50) 多 4 個字母 。對側眼的 BCVA 為 28，與基線 (61) 相比減少了 33 個字母，並且比上一年 (21) 多 7 個字母。恢復層仍然保留，並且細胞仍然存在。與經治療的眼睛相比，FAF 在對側眼上表現出快速生長。 [ 圖 80]是顯示基線及 4 年訪問結果的圖像。經治療的眼睛 (OS) 的 BCVA 為 54，與基線相同，並且比前一年 (50) 多 4 個字母。對側眼的 BCVA 為 28，與基線 (61) 相比減少了 33 個字母，並且比上一年 (21) 多 7 個字母。恢復層仍然保留，並且細胞仍然存在。與經治療的眼睛相比，FAF 在對側眼上表現出快速生長。 附圖提供令人驚訝及出乎意料的結果的各種說明及實例。實施例涉及各種方法，此等方法可以包括所論述、闡述或在圖中呈現資料的任何評估及分析。

Claims (36)

  1. 一種評估移植視網膜色素上皮 (RPE) 細胞後個體之視網膜中視網膜萎縮區域之進展的方法，其包含 a) 在第一時間點定義在該視網膜的外界膜 (ELM) 邊界內之地圖狀萎縮或完全 RPE 和外視網膜萎縮 (cRORA) 的區域； b) 使用光學同調斷層掃描 (OCT) 來標記及測量 ELM 邊界或 ELM 邊界下降 (descend)，其中該 ELM 邊界為該萎縮的界線且該 ELM 邊界下降為根據組織學具有接近完整 (near-total) 感光受體耗盡的區域之劃界； c) 計算包括在該 ELM 邊界內的區域以定義第一計算面積，並確定該第一計算面積之平方根轉換 (SQRT)；以及 d) 藉由比較該第一計算面積之該 SQRT 與對照來定義該萎縮的進展速率。
  2. 如請求項1之方法，其進一步包含在第二時間點重複步驟 a) 到 c) 以確定第二計算面積之 SQRT，其中該對照為該第二計算面積之該 SQRT。
  3. 如請求項1之方法，其中該對照為該視網膜之歷史進展速率。
  4. 如請求項1之方法，其中該對照為對照視網膜之進展速率。
  5. 如請求項4之方法，其中該對照視網膜為該個體之未經治療的視網膜。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該 ELM 邊界的測量及該第一計算面積的計算係手動進行。
  7. 如請求項1之方法，其中該 ELM 邊界的測量係藉由該 OCT 設備透過獨立演算法來自動進行。
  8. 如請求項7之方法，其中該 ELM 邊界的測量及計算係使用用於自動檢測、按特定層的區域和體積檢測及生長預測之人工智慧來進行。
  9. 如請求項1之方法，其中該萎縮為根據萎縮分類會議 (CAM) 研究組共識分類之不完全 RPE 和外視網膜萎縮 (iRORA)。
  10. 如請求項1之方法，其中視網膜萎縮區域之進展係以 mm 2及藉由 SQRT 兩者來測量。
  11. 如請求項2之方法，其中在第三時間點進行步驟 a) 到 c)。
  12. 如請求項11之方法，其中該第一時間點、第二時間點及第三時間點分別為移植後約12個月、約24個月及約36個月。
  13. 如請求項3之方法，其中該歷史進展速率為預測的生長，該預測的生長係根據關於萎縮區域之歷史資料並使用 SQRT 直系 (lineal) 生長計算以預測在任何未來時間點之該萎縮區域的理論尺寸。
  14. 如前述請求項中任一項之方法，其中用於比較地圖狀萎縮的生長速率之對照組為同一眼睛的生長之理論預測。
  15. 如前述請求項中任一項之方法，其中萎縮區域的比較係使用 mm 2及 SQRT 兩者在該個體之經治療的眼睛與對側眼之間進行。
  16. 如前述請求項中任一項之方法，其中計算係以 mm 2進行。
  17. 如前述請求項中任一項之方法，其中萎縮區域的比較係對複數隻眼睛進行。
  18. 如前述請求項中任一項之方法，其中該第一時間點係在移植 RPE 細胞前。
  19. 如前述請求項中任一項之方法，其中該第一時間點係在移植 RPE 細胞時。
  20. 如前述請求項中任一項之方法，其中該第一時間點係在移植 RPE 細胞後。
  21. 一種評估在萎縮區域內的區域中之視網膜的恢復或再生之方法，其包含 a) 定義及使用 OCT 生物標記作為任何視網膜層的界線； b) 使用該 OCT 來標記及測量任何視網膜層的界線； c) 計算特定視網膜層的長度/寬度及體積； d) 藉由比較來自步驟 (a) 至 (c) 之經計算的 ELM 面積來定義恢復或再生的程度；以及 e) 檢測 ELM 之新出現的區域。
  22. 如請求項21之方法，其中該視網膜層為 ONL 且該方法檢測 ONL 之新出現的區域。
  23. 如請求項21之方法，其中該視網膜層為 OPL 且該方法檢測該 OPL 之新出現的區域。
  24. 如請求項21之方法，其中該視網膜層為橢圓體帶且該方法檢測該橢圓體帶之新出現的區域。
  25. 如請求項21之方法，其中該視網膜層為感光受體且該方法檢測感光受體之新出現的區域。
  26. 如請求項21之方法，其中該視網膜層為 RPE 細胞層且該方法檢測 RPE 之新出現的區域。
  27. 如請求項21至26中任一項之方法，其中該等視網膜層係經組合計算。
  28. 如請求項21至27之方法，其中 OCT 檢查係在約12個月、在約24個月及在約36個月時進行。
  29. 如請求項21至28之方法，其中視網膜層的比較係對同一眼睛進行。
  30. 如請求項21至29之方法，其中萎縮區域的比較係在經治療的眼睛與對側眼之間進行。
  31. 如請求項21至30之方法，其中萎縮區域的比較係在經治療的眼睛與對照眼之間進行。
  32. 如請求項21至30之方法，其中萎縮區域的比較係對複數隻眼睛進行。
  33. 如請求項21至32之方法，其中 RPE 恢復區域是當 ELM、ONL 及 OPL 都存在時。
  34. 一種如請求項 1 所述來評估臨床改善之方法，其中該臨床改善係選自由以下所組成之群組：有或無電腦輔助的 BCVA 正常光線及低光線、微視野檢查 (microperimetry)、閱讀速度、有或無電腦輔助的顏色測試、閃爍測試、視錐細胞靈敏度及視桿細胞靈敏度。
  35. 一種如請求項21所述來評估臨床改善之方法，其中該臨床改善係選自由以下所組成之群組：有或無電腦輔助的 BCVA 正常光線及低光線、微視野檢查 (microperimetry)、閱讀速度、有或無電腦輔助的顏色測試、閃爍測試、視錐細胞靈敏度及視桿細胞靈敏度。
  36. 如前述請求項中任一項之方法，其中該視網膜萎縮區域為晚期地圖狀萎縮、早期地圖狀萎縮、高風險 AMD 或中晚期 AMD (late intermediate AMD)。
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