CN117479835A - 用于治疗视网膜疾病和病况的方法和组合物 - Google Patents

用于治疗视网膜疾病和病况的方法和组合物 Download PDF

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CN117479835A CN202280041215.0A CN202280041215A CN117479835A CN 117479835 A CN117479835 A CN 117479835A CN 202280041215 A CN202280041215 A CN 202280041215A CN 117479835 A CN117479835 A CN 117479835A
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G·霍奇
J·莫恩丝
A·B·莎芭
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德娜·海扬尼曼
O·维泽
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Abstract

本文提供了用于治疗眼睛的疾病和病症的方法、物质的组合物和装置，所述眼睛的疾病和病症包括视网膜病况诸如黄斑变性。

Description

用于治疗视网膜疾病和病况的方法和组合物
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年6月9日提交的美国临时申请第63/208,921号以及2022年6月8日提交的美国临时申请第63/350,175号的优先权的权益，每个申请的全部内容均通过引用整体并入本文。
背景技术
本公开整体涉及治疗视网膜疾病领域，并且更特别地涉及使用人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮(RPE)细胞组合物治疗视网膜疾病。
RPE细胞功能障碍、变性和丧失是视网膜疾病(诸如AMD、Stargardt氏病、卵黄状黄斑变性和视网膜色素变性(RP)亚型)的突出特征。AMD是西方世界视力残疾的主要原因。在75岁以上的人群中，25％至30％的人受到年龄相关性黄斑变性(AMD)的影响，其中进行性中心视力丧失导致6％至8％的患者失明。AMD涉及多种病原学风险因素，诸如衰老、吸烟和补体多态性，其病理生理根源可概括为RPE老化、氧化应激、副炎症、布鲁赫膜老化和脉络膜缺血，这些原因单独或共同引发影响视网膜健康的代谢恶化。视网膜变性主要涉及黄斑，黄斑是视网膜的中心部分，负责精细的视觉细节、色彩感知、面部识别、阅读和驾驶。晚期AMD存在两种形式：湿性或渗出性AMD和萎缩性AMD。干性或中度AMD是AMD的最主要形式，占病例的大约85％至90％。湿性AMD在这两种晚期类型中不太常见，占病例的大约10％至15％。干性AMD由RPE功能障碍以及在RPE下方或上方或布鲁赫膜内由代谢终产物组成的玻璃疣沉积物的形成而引起。该疾病将逐渐进展至晚期地图状萎缩(GA)，伴有跨大区域黄斑的RPE细胞和光感受器两者变性并最终细胞死亡，导致中心视力丧失。此外，变性RPE影响由内部和外部屏障组成的血-视网膜屏障(BRB)。外部BRB是指在视网膜色素上皮细胞层与布鲁赫膜一起形成的屏障，其调节从脉络膜到视网膜下腔的溶质和营养物质。外部BRB在维持光感受器的解剖结构和功能完整性方面起着至关重要的作用，在体内进行最高氧代谢活动的黄斑区域内尤其如此。hRPE细胞疗法的主要目标是替代丢失或受损的宿主RPE，并且提供功能性、活性和活RPE以支持光感受器。
该疾病的发病机理涉及四种功能相互关联的组织(即，视网膜色素上皮(RPE)、布鲁赫膜、脉络膜毛细血管和光感受器)的异常。但是，RPE细胞功能受损是导致临床相关AMD变化的分子通路中的早期关键事件。
干性年龄相关性黄斑变性(AMD)到萎缩性AMD或地图状萎缩的晚期形式是发达国家成人失明的主要原因。几乎所有湿性AMD的病例都始于干性AMD。干性AMD通常影响双眼。目前尚无获得美国食品药品监督管理局(FDA)或欧洲药品管理局(EMA)批准的针对干性AMD患者的治疗方案。预防性措施包括维生素/矿物质补充剂。这些措施降低了发生湿性AMD的风险，但不影响地图状萎缩的进展。湿性AMD是修复性反应，以避免萎缩性AMD。不幸的是，在大多数情况下，这是一种夸大的反应，并导致渗出、炎症和瘢痕形成，随后在相对较短的时间内视力丧失。用抗血管内皮生长因子(VEGF)药物进行适当的治疗可以控制渗出及其相关联的损害，防止瘢痕形成，并使这些眼睛能够实现其进展为萎缩性的自然过程。因此，大多数治疗成功的患有渗出性AMD的眼睛最终会发展成萎缩性AMD。
发明内容
本文中的实施例整体涉及用于治疗眼睛的疾病和病症的方法、物质的组合物和装置，该眼睛的疾病和病症包括视网膜病况诸如黄斑变性。
在一个方面，本公开提供了一种用于评定在视网膜色素上皮(RPE)细胞移植后受试者的视网膜中视网膜萎缩区域的进展的方法，该方法包括a)在第一时间点，定义在视网膜的外界膜(ELM)边缘内的地图状萎缩或完全RPE和外视网膜萎缩(cRORA)的区域；b)使用光学相干断层扫描(OCT)来标记并测量ELM边缘或ELM边缘下行，其中ELM边缘是萎缩的边界，且ELM边缘下行是通过组织学对具有近全光感受器耗尽的区域的定界；c)计算ELM边缘内所包括的区域以定义第一计算区域，及d)确定第一计算区域的平方根变换(SQRT)；以及通过将第一计算区域的SQRT与对照进行比较来定义萎缩的进展率。
在一些实施例中，该方法可进一步包括在第二时间点重复步骤a)至c)以确定第二计算区域的SQRT，其中对照是第二计算区域的SQRT。
在一些实施例中，对照是视网膜的历史进展率。在一些实施例中，对照是对照视网膜的进展率。在一些实施例中，对照视网膜是受试者的未经治疗的视网膜。
在一些实施例中，ELM边缘的测量和第一计算区域的计算是手动进行的。在一些实施例中，ELM边缘的测量由OCT设备通过独立算法是自动进行的。在一些实施例中，ELM边缘的测量和计算是使用用于自动检测、特定层的面积和体积检测以及对生长的预测的人工智能来进行的。
在一些实施例中，萎缩是根据萎缩分类会议(CAM)研究小组共识分类的不完全RPE和外视网膜萎缩(iRORA)。
在一些实施例中，以mm2为单位且通过SQRT测量视网膜萎缩区域的进展。
在一些实施例中，该方法的步骤a)至c)在第三时间点进行。
在一些实施例中，第一时间点、第二时间点和第三时间点分别是移植后约12个月、约24个月和约36个月。
在一些实施例中，历史进展率是根据萎缩区域的历史数据并使用SQRT线性生长计算预测的生长，以预测萎缩区域在任何未来时间点的理论大小。
在一些实施例中，用于比较地图状萎缩的生长速率的对照组为对同一只眼的生长的理论预测。
在一些实施例中，萎缩区域的比较是使用mm2和SQRT两者在受试者的经治疗的眼与对侧眼之间进行的。在一些实施例中，以mm2为单位进行计算。
在一些实施例中，萎缩区域的比较是对多只眼进行的。
在一些实施例中，第一时间点是在RPE细胞移植之前。在一些实施例中，第一时间点是在移植RPE细胞时。在一些实施例中，第一时间点是在RPE细胞移植之后。
在另一方面，本公开提供了一种用于评定萎缩区域内的以区域计的视网膜的恢复或再生的方法，其包括a)定义并使用OCT生物标志物作为任何视网膜层的边界；b)使用OCT来标记并测量任何视网膜层的边界；c)计算特定视网膜层的长度/宽度和体积；d)通过比较从步骤(a)至(c)计算的ELM区域来定义恢复或再生水平；以及e)检测ELM的新出现的区域。
在一些实施例中，视网膜层是ONL并且该方法检测ONL的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是OPL并且该方法检测OPL的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是椭球体带并且该方法检测椭球体带的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是光感受器并且该方法检测光感受器的新出现的区域。
在一些实施例中，视网膜层是RPE细胞层并且该方法检测RPE的新出现的区域。
在一些实施例中，组合计算视网膜层。
在一些实施例中，OCT检查是在约12个月时、约24个月时和约36个月时进行的。
在一些实施例中，视网膜层的比较是对同一只眼进行的。在一些实施例中，萎缩区域的比较是在经治疗的眼与对侧眼之间进行的。在一些实施例中，萎缩区域的比较是在经治疗的眼与对照眼之间进行的。
在一些实施例中，萎缩区域的比较是对多只眼进行的。
在一些实施例中，RPE区域恢复是当ELM、ONL和OPL都存在时。
在又一个方面，本公开提供了一种用于评定临床改善的方法，其中临床改善选自由以下项组成的组：有或没有计算机辅助的BCVA正常光和低光、微视野检查、阅读速度、有或没有计算机辅助的颜色测试、闪烁测试、视锥细胞敏感度和视杆细胞敏感度。
在一些实施例中，视网膜萎缩区域是晚期地图状萎缩、早期地图状萎缩、高危AMD或中晚期AMD。
在一个方面，本公开提供了一种治疗视网膜疾病或疾患或减慢其进展的方法，其包括向有此需要的受试者施用细胞治疗剂，其中该细胞治疗剂包含视网膜色素上皮(RPE)细胞，并且其中RPE细胞恢复受试者的视网膜的解剖结构或功能性。
在一些实施例中，RPE细胞衍生自多能细胞。在一些实施例中，RPE细胞为人RPE细胞。在一些实施例中，RPE细胞衍生自人胚胎(hESC)细胞系。在一些实施例中，RPE细胞衍生自来自患者本身、其他供体患者或来自iPSC的HLA库的人类诱导多能干细胞(hiPSC)。
在一些实施例中，RPE细胞衍生于补充有高浓度的转化生长因子β(TGF-b)家族成员激活素A以及烟酰胺的低氧(5％)培养下，然后切换为正常氧(20％)培养以富集RPE群。
在一些实施例中，RPE细胞分泌浓度为约2000ng/ml/天至约4000ng/ml/天的PEDF。
在一些实施例中，将细胞治疗剂施用到患者的萎缩视网膜的区域中或与萎缩视网膜的区域相邻处。
在一些实施例中，细胞治疗剂以约50,000个细胞至约1,000,000个细胞的剂量施用。在一些实施例中，细胞治疗剂以约100,000个细胞至约750,000个细胞的剂量施用。在一些实施例中，细胞治疗剂以约200,000个细胞至约500,000个细胞的剂量施用。
在一些实施例中，细胞治疗剂的施用减小受试者的萎缩视网膜中的萎缩区域。
在一些实施例中，细胞治疗剂的施用恢复视网膜的一个或多个视网膜层。
在一些实施例中，细胞治疗剂的施用恢复视网膜中的光感受器的功能性。
在一些实施例中，细胞治疗剂的施用恢复视网膜的外核层(ONL)。
在一些实施例中，细胞治疗剂的施用恢复视网膜的椭球体带(EZ)。
在一些实施例中，细胞治疗剂的施用恢复视网膜的中央凹。
在一些实施例中，细胞治疗剂的施用恢复视网膜的血-视网膜屏障(BRB)。
在一些实施例中，细胞治疗剂的施用重塑视网膜的细胞外基质(ECM)。
在一些实施例中，视网膜的解剖结构或功能性的恢复通过评定地图状萎缩生长的减少、视力的改善、阅读速度的改善、视网膜结构的改善、玻璃疣的减少或细胞的稳定移植中的一者或多者来确定。
在一些实施例中，改善通过微视野检查来测量。
在一些实施例中，受试者的视觉通过治疗得到改善，并且改善的视觉通过以下中的一者或多者来评定：GA病变总面积的变化；单眼阅读速度的变化；功能性阅读独立指数(FRII)综合评分的变化；正常亮度最佳矫正视力评分(NL-BCVA)的变化；低亮度最佳矫正视力评分(LL-BCVA)的变化；低亮度缺陷(LLD)的变化；单眼临界打印大小的变化；美国国家眼科研究所视觉功能问卷25项版本(NEI VFQ-25)距离活动分量表评分的变化；暗点数量的变化；黄斑敏感度的变化；色觉测试的变化；以及APL-2的全身血浆浓度的变化。
在一些实施例中，该方法引起对植入细胞的排斥的最小迟发性炎症或无迟发性炎症。
在一些实施例中，施用包括将RPE细胞递送至视网膜的区域中或与视网膜相邻处。在一些实施例中，递送包括将RPE细胞植入视网膜的区域中或与视网膜相邻处。
在一些实施例中，治疗包括RPE细胞的多能分泌作用。
在一些实施例中，受试者患有选自以下的视网膜疾病病况：干性或萎缩性AMD、视网膜色素变性、厄舍综合征(usher syndrome)、卵黄样黄斑病变、斯特格病(Stargardtdisease)、视网膜脱离、视网膜发育不良、视网膜萎缩、视网膜病变、黄斑营养不良、视锥细胞营养不良、视锥-视杆细胞营养不良、Malattia Leventinese、Doyne蜂窝状营养不良、Sorsby营养不良、图案性/蝴蝶状营养不良、Best卵黄样营养不良、北卡罗来纳营养不良、中心性晕轮状脉络膜营养不良、血管样条纹症、中毒性黄斑病变、病理性近视和黄斑变性。
在一些实施例中，细胞治疗剂用递送装置施用。
在一些实施例中，细胞治疗剂用递送装置施用到视网膜的地图状萎缩或与之相邻处。
在一些实施例中，递送装置包括针头、毛细管和尖端。在一些实施例中，递送装置包括外径为约0.63mm并且内径为约0.53mm的针头、外径为约0.5mm并且内径为约0.25mm的毛细管以及外径为约0.12mm并且内径为约0.07mm的尖端。
在另一方面，本公开提供了一种递送装置，该递送装置与本文所述的方法中的任一者一起使用。
在一些实施例中，递送装置包括针头、毛细管和尖端。
在一些实施例中，该装置包括外径为约0.63mm并且内径为约0.53mm的针头、外径为约0.5mm并且内径为约0.25mm的毛细管以及外径为约0.12mm并且内径为约0.07mm的尖端。
在又一方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含根据本公开所述的用于恢复受试者的视网膜的解剖结构或功能性的细胞治疗剂。
在一些实施例中，新RPE的区域将通过IR成像的变化被定义为浅灰色脱色的新区域。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于评定在视网膜色素上皮(RPE)细胞移植后视网膜中视网膜萎缩区域的进展的方法。该方法可以包括定义在视网膜的外界膜(ELM)边缘内的地图状萎缩或完全RPE和外视网膜萎缩(cRORA)的区域；使用光学相干断层扫描(OCT)将ELM边缘定义为萎缩的边界，其中ELM边缘被接受作为通过组织学对具有近全光感受器耗尽的区域的定界；利用OCT针对每次检查来标记并测量ELM边缘或ELM下行；计算检查中ELM边缘内所包括的区域(例如，以mm2为单位)，并利用计算区域的平方根变换(SQRT)来评定与眼本身相比或与对照眼相比随时间的变化；以及通过使用OCT和ELM边缘作为边界比较两个或更多个不同检查之间计算的萎缩区域来定义萎缩的进展率。
在一些实施例中，萎缩区域可以由保留的ONL的边缘或区域来定义。
在一些实施例中，萎缩区域可以由保留的OPL的边缘或区域来定义。
在一些实施例中，萎缩区域可以由保留的RPE的边缘或区域来定义。
在一些实施例中，萎缩区域可以由保留的ONL、ELM、OPL和RPE的任何或所有边缘或区域的组合来定义。
在一些实施例中，该方法可以包括手动测量并计算ELM边缘和边界内的区域。
在一些实施例中，ELM边缘的测量和计算是由OCT设备通过独立算法，并且任选地使用用于自动检测、特定层的面积和体积检测以及对生长的预测的人工智能自动进行的。
在一些实施例中，萎缩可以是根据萎缩分类会议(CAM)研究小组共识分类的不完全RPE和外视网膜萎缩(iRORA)。
在一些实施例中，以mm2为单位且通过SQRT测量萎缩区域的变化。
在一些实施例中，检查分别是在约12个月时、约18个月时、约24个月时和约36个月时进行的。
在一些实施例中，萎缩区域的比较可以对同一只眼使用根据萎缩区域的历史数据并使用预测萎缩区域在任何未来时间点的理论大小的SQRT线性生长计算预测的生长来进行。
在一些实施例中，用于比较地图状萎缩的生长速率的对照组为对同一只眼的生长的理论预测。
在一些实施例中，萎缩区域的比较可以使用mm2和SQRT两者经治疗的眼与对侧眼之间进行。
在一些实施例中，萎缩区域的比较可使用mm2和SQRT两者在经治疗的眼与对照眼之间进行。
在一些实施例中，萎缩区域的比较是对多只眼进行的。
在一些实施例中，第一时间点可以在RPE细胞移植之前。在一些实施例中，第一时间点可以在移植RPE细胞时。在一些实施例中，第一时间点可以在RPE细胞移植之后。
在一些实施例中，移植前的时间可以变化以囊括许多时间点，在一天至若干天、若干周或若干年的范围内。在一些实施例中，移植后的时间可以变化以囊括许多时间点，在一天至若干天、若干周或若干年的范围内。
在一些实施例中，第二时间点在第一时间点之后。因此，第二时间点可以是第一时间点之后一周至10年的任何时间点。在一些实施例中，第二时间点可以是RPE细胞移植后一周至10年之间的任何时间点。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于评定萎缩区域内的以区域计的视网膜的恢复或再生的方法，该方法包括使用OCT和任选地使用用于自动检测特定层的面积和体积检测以及对生长或动态的预测的人工智能的独立算法中的一种或多种。可以通过对视网膜的一次或多次检查来评定恢复或再生，该方法包括定义并使用OCT生物标志物作为任何视网膜层的边界；使用OCT来标记并测量任何视网膜层的边界；计算特定视网膜层的长度/宽度和体积；通过比较从步骤(a)至(c)计算的ELM区域来确定恢复或再生的水平；以及检测ELM的新出现的区域。
在一些实施例中，视网膜层是ONL并且该方法检测ONL的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是OPL并且该方法检测OPL的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是椭球体带并且该方法检测椭球体带的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是光感受器并且该方法检测光感受器的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是RPE细胞层并且该方法检测RPE的新出现的区域。
在一些实施例中，组合计算视网膜层。
在一些实施例中，OCT检查是在约12个月时、约18个月时、约24个月时和约36个月时进行的。
在一些实施例中，视网膜层的比较是对同一只眼进行的。在一些实施例中，萎缩区域的比较是在经治疗的眼与对侧眼之间进行的。在一些实施例中，萎缩区域的比较是在经治疗的眼与对照眼之间进行的。在一些实施例中，萎缩区域的比较是对多只眼进行的。
在一些实施例中，RPE恢复区域包括当ELM、ONL和OPL都存在时。
在一些实施例中，本公开提供一种用于通过以下方式来评定临床改善的方法：定义在视网膜的外界膜(ELM)边缘内的地图状萎缩或完全RPE和外视网膜萎缩(cRORA)的区域；使用光学相干断层扫描(OCT)将ELM边缘定义为萎缩的边界，其中ELM边缘下行或ELM边缘被接受作为通过组织学对具有近全光感受器耗尽的区域的定界；利用OCT针对每次检查来标记并测量ELM边缘或ELM下行；计算检查中ELM边缘内所包括的区域(例如，以mm2为单位)，并利用计算区域的平方根变换(SQRT)来评定与眼本身相比或与对照眼相比随时间的变化；以及通过使用OCT和ELM边缘作为边界比较两个或更多个不同检查之间计算的萎缩区域来确定萎缩的进展率。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于通过以下方式来评定临床改善的方法：定义并使用OCT生物标志物作为任何视网膜层的边界；使用OCT来标记并测量任何视网膜层的边界；计算特定视网膜层的长度/宽度和体积；通过比较从步骤(a)至(c)计算的ELM区域来定义恢复或再生水平；以及检测ELM的新出现的区域。
在一些实施例中，临床改善选自有或没有计算机辅助的BCVA正常光和低光、微视野检查、阅读速度、有或没有计算机辅助的颜色测试、闪烁测试、视锥细胞敏感度和视杆细胞敏感度。
在一些实施例中，视网膜萎缩区域是晚期地图状萎缩、早期地图状萎缩、高危AMD或中晚期AMD。
视网膜色素上皮(RPE)是单层神经上皮源性色素细胞，其位于光感受器外节段(POS)与脉络膜脉管系统之间的布鲁赫膜上。RPE单层对光感受器的功能和健康至关重要。视网膜色素上皮(RPE)细胞功能障碍、损伤和丧失是某些眼睛疾病和疾患的突出特征，这些眼睛疾病和疾患为诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)、遗传性黄斑变性(包括Stargardt氏病、卵黄状黄斑变性(卵黄样黄斑营养不良的早期症状)和视网膜色素变性(RP)亚型。将RPE移植到受此类疾病影响的视网膜中，可用作其中RPE已经变性的视网膜疾病的细胞替代疗法。
人多能干细胞作为RPE细胞移植的来源具有显著优势。它们的多能发育潜力使它们能够分化为真正的功能性RPE细胞，并且鉴于它们具有无限自我更新的潜力，它们可用作RPE细胞的无限的来源。事实上，已经证明人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(iPSC)可以在体外分化为RPE细胞、减弱视网膜变性并且在视网膜下植入保护视功能。因此，hESC可以是产生用于细胞疗法的RPE细胞的无限的来源。
但是，大多数基于细胞的治疗通常冷冻保存在低温溶液中，与直接施用至体内不相容，为临床使用带来了一个现实的问题。细胞应在其解冻后数小时内移植，否则它们可能会开始失去活力和质量。此外，细胞必须在施用前在经过认证的设施中制备，这些设施可能并非紧邻临床中心、医院或其他治疗设施。最后，每例受试者的治疗剂量必须由合格的技术人员释放，因为最终制剂的制备被视为细胞疗法产生过程的一部分。
本公开解决了再生医学和RPE细胞疗法领域的这些及其他缺点。本公开还提供了与各种方法、装置和组合物相关的数据。
关于本发明的实施例的教导内容、方法、物质的组合物、装置和专业知识见2019年7月4日公开的名称为“RETINAL PIGMENT EPITHELIUM CELL COMPOSITIONS”的PCT公开号WO2019/130061；2018年9月20日公开的名称为“METHODS FOR MEASURING THERAPEUTICEFFECTS OF RETINAL DISEASE THERAPIES”的WO 2018/170494；以及2017年2月2日公开的名称为“LARGE SCALE PRODUCTION OF RETINAL PIGMENT EPITHELIAL CELLS”的WO 2017/017686中；其各自全文出于其所有方法、装置和设备、物质的组合物单独或彼此组合地以引用方式并入本文。
附图说明
图1显示了视网膜扫描，示出受试者18在用RPE细胞治疗后3个月时在地图状萎缩(GA)内的色素沉着区域(箭头)，证明在GA下区中存在RPE细胞。由白色圆圈表示的RPE细胞移植区域也称为滤过泡区域，这是由于注射RPE细胞而产生的水疱状结构。
图2显示了视网膜扫描，示出受试者18在治疗后9个月时在GA内的色素沉着区域(箭头)，证明在GA下区中存在RPE细胞。
图3为示出12例受试者中的每一例在接受指定治疗后的视力变化的图，该视力变化基于早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)字母数量较基线的变化。几乎所有受试者均保持其基线BCVA，并且超过一半的受试者在BCVA方面稳步改善。
图4为示出队列4中经治疗和未经治疗的(对侧)眼的GA大小(mm2)随时间推移较基线的平均变化的图。数据表明，与对侧眼相比，经治疗的眼的GA增长较慢。
图5为示出队列4中经治疗和未经治疗的(对侧)眼的视力变化的图，该视力变化基于ETDRS字母数量随时间推移较基线的平均变化。数据表明，与对侧眼相比，经治疗的眼的BCVA下降不太严重。
图6为示出受试者22的经治疗和未经治疗的(对侧)眼的ETDRS字母数量随时间推移较基线的平均变化的图。受试者表现出经治疗的眼的视功能活动相对于对侧眼得到实质性的改善和增加。
图7A至7C显示了受试者14随时间推移的变化。图7A为示出经治疗和未经治疗的(对侧)眼的ETDRS字母数量随时间推移较基线的平均变化的图。图7B为示出经治疗和未经治疗的(对侧)眼的GA大小(mm2)随时间推移较基线的平均变化的图。图7C显示了经治疗的眼以及未经治疗的(对侧)眼在基线和治疗后3年时所读取的字母数量。受试者的经治疗的眼与对侧眼之间在解剖结构和视功能方面均表现出有利于经治疗的眼的实质性差异。
图8为示出队列4中个体受试者的经治疗的眼(左图)和未经治疗的(对侧，右图)眼的阅读速度(每分钟字数)随时间推移较基线的变化的图。数据表明，与对侧眼相比，经治疗的眼得到功能性临床视力改善。
图9显示了受试者14的经治疗的视网膜在基线(顶部)和治疗后9个月(底部)时的高分辨率光学相干断层扫描(OCT)图像。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。在9个月时，GA的边界表现出外视网膜层恢复/再生。
图10显示了受试者14的经治疗的视网膜在开始研究之前(过去，橙色，左图)、基线(红色)、治疗后9个月(蓝色)和23个月(黄色)时的OCT图像。在治疗后9个月和23个月均观察到GA较基线的消退，表现出解剖结构改善和外视网膜再生/恢复。
图11为示出受试者14双眼中总GA大小(以平方根变换的总面积，SQRT)的变化，以及以mm SQRT/年为单位的较先前和较基线的变化率(对较过去的预期增长作图)。黄色阴影条指示对侧(FE)未经治疗的眼的预测/预期增长。蓝色阴影条指示接受研究治疗的眼的预测/预期增长。
图12为来自受试者14的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基于基线(顶部)和治疗后3个月(底部)时的ELM边缘的GA边界。ELM边缘由红色箭头和虚线表示。ELM边缘从基线(BSL)到3个月(3M)的变化用大箭头指示。外丛状层用蓝色箭头表示。新RPE细胞在底部图像中用绿色小箭头显示。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。在治疗后3M已经观察到ELM边缘和/或ONL/OPL的中心增长以及新的推测RPE。
图13为来自受试者14的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基于基线(顶部)和治疗后5个月(底部)的ELM边缘的GA边界。ELM边缘由红色箭头和虚线表示。ELM边缘从基线(BSL)到5个月(5M)的变化用大箭头指示。外丛状层用蓝色箭头表示。新RPE细胞用绿色小箭头显示。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。在治疗后5M观察到ELM边缘和/或ONL/OPL的中心增长以及新的推测RPE。
图14为来自受试者14的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基于基线(顶部)、治疗后9个月(中心)和23个月(底部)时的ELM边缘的GA边界。ELM边缘由红色箭头和虚线表示。ELM边缘从基线(BSL)到9个月(9M)的变化用大箭头指示。从9M到23个月(23M)的变化用中等箭头指示。外丛状层用蓝色箭头表示。新RPE细胞用绿色小箭头显示。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。在治疗后9M观察到ELM边缘和/或ONL/OPL的中心增长以及新的推测RPE，在23M时有小幅消退。
图15显示了受试者14的经治疗的眼在治疗后23个月(23M)和35个月(35M)时的微视野检查的变化。图15显示了在35M时相比于23M时视功能的改善和暗点的减少(“盲点/区域”，由橙色圆圈中的黑色点表示)以及光敏度的改善。微视野检查是一种与眼底相关的视野检查，可捕获黄斑区域中的特定视野范围并且生成视网膜敏感区域的准确的高分辨率图。微视野检查是评估视功能变化的更好的检查，比“简单”的BCVA检查具有更高的可靠性。此外，微视野检查提供了解剖结构变化和缺陷与视功能缺陷之间的准确的相关性。
图16为来自受试者21的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基于基线(顶部)和治疗后1个月(底部)时的ELM边缘的GA边界。ELM边缘由箭头和虚线表示。OPL边缘由箭头显示。ELM边缘从基线(BSL)到1个月(1M)的变化用虚线之间的箭头指示。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。在治疗后1M观察到ELM边缘和/或OPL的中心增长。
图17为受试者21的视网膜的红外(IR)图像。标明了基线和1个月时的GA边界。
图18为来自受试者21的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基线(顶部)和治疗后3个月(底部)时的分离的萎缩病变。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。新特征(圆圈)显示3个月时外视网膜再生。观察到先前萎缩的区域几乎完全恢复，缺失层再生并且萎缩病变“消失”。
图19为来自受试者21的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基线(顶部)和治疗后3个月(底部)时的GA。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。新的高反射单层可能显示RPE细胞，以及3个月时可能得到恢复的ELM、OPL和ONL。
图20为来自受试者21的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基线(顶部)和治疗后3个月(底部)时的GA。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。通常不存在非常薄但均匀且连续的ONL层(圈出)，在脉络膜超传播区域上ELM和RPE单层得到保留，但在治疗后3个月观察到。这表示在萎缩区域内恢复了新层。
图21显示了在OpRegen-RPE施用前(基线，左上)、施用后1个月(左中)和2个月(左下)，受试者21的视网膜中分离的萎缩病变的图像。右侧图像示出了左侧图像所示的视网膜区域。
图22显示了在OpRegen-RPE施用前(基线，左上)、施用后1个月(左中)和2个月(左下)，受试者21的视网膜中的上GA区域的图像。右侧图像示出了左侧图像所示的视网膜区域。
图23显示了受试者22随时间推移的变化。左图为示出经治疗和未经治疗的(对侧)眼的ETDRS字母数量随时间推移较基线的平均变化的图。右图为示出经治疗和未经治疗的(对侧)眼的GA大小(mm2)随时间推移较基线的平均变化的图。数据表明，经治疗的眼与对侧眼之间在解剖结构和视功能方面均表现出有利于经治疗的眼的实质性差异。在经治疗的眼上观察到实质性视力改善。
图24为眼底照相(FP)图像，示出受试者22的视网膜在治疗后3个月(右图)时出现细小的色素斑驳，但在基线期则不存在(左图)，表明在3个月时存在RPE细胞。
图25为受试者22在基线(左)和治疗后3个月(右)时的视网膜的IR图像。GA边缘在3个月时减小且不太清晰。
图26为来自受试者22的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基线(顶部)和治疗后3个月(底部)时的中心GA。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。萎缩的基线边界用线表示。新特征，包括外丛状层下沉减少、萎缩区域内的新ELM、萎缩区域内的新RPE以及减少的超传播，用小箭头指示。
图27为来自受试者22的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基线(顶部)和治疗后3个月(底部)时的下GA。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。萎缩的基线边界用线表示。新特征，包括外丛状层下沉减少、萎缩区域内的新ELM和萎缩区域内的新RPE，用小箭头指示。
图28为来自受试者22的经治疗的眼的OCT视网膜图像，示出基线(顶部)和治疗后3个月(底部)时的分离的萎缩病变。左侧图像示出了右侧图像所示的视网膜区域。萎缩的基线边界用线表示。新特征，包括外丛状层下沉减少、萎缩区域内的新ELM和萎缩区域内的新RPE，用小箭头指示。
图29为OCT视网膜图像，示出基于ELM边缘的基线(左)和3个月(右)时的GA边界。标明总面积、增长率和SQRT变换增长率。
图30为OCT视网膜图像，示出受试者22在基线(左上)、治疗后2个月(左中)和3个月(左下)时的中心GA区域。在2个月时观察到新的视网膜下材料(RPE细胞)，在3个月时观察到视网膜下材料增加和ELM的重新形成(箭头)。右侧图像示出了左侧图像所示的视网膜区域。蓝色圆圈为渐进坐标，示出脉络膜的血管，用于标记同一位置并且在后续访视中捕获视网膜的确切区域。
图31为视网膜图像，示出受试者14在基线(左上)、手术期间(术中，右上)、治疗后2个月(左下)和3个月(右下)时的RPE递送区域。滤过泡代表细胞递送的区域。滤过泡在手术期间覆盖GA，表明RPE细胞完全覆盖GA。
图32为视网膜图像，示出代表受试者19(左)和21(右)的RPE细胞递送区域的滤过泡的术中成像结果。GA用箭头指示。
图33A至33C为光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)图像。图33A显示了示例性B超结果。图33B为图33A的B超扫描结果，各层之间的边界重叠。图33C是图33A的B超扫描结果，具有重叠的层厚度。
图34显示了由SD-OCT生成的厚度和面积图的示例图示。组织损失用白色区域指示，保存的组织区域用灰色或黑色表示。显示了总视网膜(左图)、外核层(左二)、光感受器外节段(右二)和RPE+玻璃疣复合体(右图)的相对厚度。
图35显示了受试者8在基线(左)、治疗后3个月(左二)、6个月(右二)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的总视网膜厚度图。标明平均总厚度。
图36显示了受试者8在基线(左)、治疗后3个月(左二)、6个月(右二)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的外核层(ONL)厚度图。标明ONL的总面积。
图37显示了受试者8在基线(左)、治疗后3个月(左二)、6个月(右二)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的光感受器外节段厚度图。标明光感受器外节段的总面积。
图38显示了受试者8在基线(左)、治疗后3个月(左二)、6个月(右二)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的RPE和玻璃疣复合体厚度图。标明RPE和玻璃疣复合体的总面积。
图39显示了受试者5在基线(左)、治疗后6个月(中)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的总视网膜厚度图。标明平均总厚度。
图40显示了受试者5在基线(左)、治疗后6个月(中)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的外核层(ONL)厚度图。标明ONL的总面积。
图41显示了受试者5在基线(左)、治疗后6个月(中)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的光感受器外节段厚度图。标明光感受器外节段的总面积。
图42显示了受试者5在基线(左)、治疗后6个月(中)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的RPE和玻璃疣复合体厚度图。标明RPE和玻璃疣复合体的总面积。
图43显示了受试者13在基线(左)、治疗后6个月(中)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的总视网膜厚度图。标明平均总厚度。
图44显示了受试者13在基线(左)、治疗后6个月(中)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的外核层(ONL)厚度图。标明ONL的总面积。
图45显示了受试者13在基线(左)、治疗后6个月(中)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的光感受器内节段厚度图。标明光感受器外节段的总面积。
图46显示了受试者13在基线(左)、治疗后6个月(中)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的光感受器外节段厚度图。标明光感受器外节段的总面积。
图47显示了受试者13在基线(左)、治疗后6个月(中)和12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的RPE和玻璃疣复合体厚度图。标明RPE和玻璃疣复合体的总面积。
图48显示了受试者14在基线(左)和治疗后12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的总视网膜厚度图。标明平均总厚度。
图49显示了受试者14在基线(左)和治疗后12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的外核层(ONL)厚度图。标明ONL的总面积。
图50显示了受试者14在基线(左)和治疗后12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的光感受器内节段厚度图。标明光感受器外节段的总面积。
图51显示了受试者14在基线(左)和治疗后12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的光感受器外节段厚度图。标明光感受器外节段的总面积。
图52显示了受试者14在基线(左)和治疗后12个月(右)时的经治疗的眼(顶部)和未经治疗的眼(底部)的RPE和玻璃疣复合体厚度图。标明RPE和玻璃疣复合体的总面积。
图53显示受试者8的基线FA检查结果，大量荧光素染料泄漏到玻璃体腔中，阻碍了脉络膜冲洗和动脉期血管灌注的可见度，表明眼内预先存在血-视网膜屏障破坏和副炎症。移植后22个月，FA检查显示脉络膜清晰，视网膜血管灌注清晰，无染料泄漏到玻璃体腔内，表明OpRegen可能通过多种作用机制恢复了破坏的BRB的完整性。
图54A至54D显示四例病例在基线和移植后10.5个月至22个月之间具有相似的FA成像变化或改善。
图55显示，玻璃疣消退从上部的移植区域(左上)开始，然后向下移动，清除几乎整个后段，除术后8个月时仍然存在的一小条细长的带外(顶部，左二，大圆圈)。OCT成像特征与彩色眼底照相结果一致，在5.5个月(顶部，右二)和8个月(底部，右二)时，与基线(右上和右下)相比，RPE下玻璃疣明显减少或消退。
图56A：FA显示染色显著减少(玻璃疣)，但是，看起来存在膜状面纱，使视网膜血管结构模糊。周细胞反应可见。图56B:在22个月时，视网膜组织比基线时更清晰。图56C显示，在11个月时，在大玻璃疣消退后，移植物继续重塑宿主视网膜。
图57提供了来自早期、中期和晚期时程FA检查结果，表明视网膜健康得到显著改善，其中整个血管灌注的可视性更好，并且炎症减少，视网膜组织看起来非常干净。
图58显示了OpRegen细胞疗法在GA疤痕和ECM重塑中的作用。
图59显示了不同形式的ECM重塑的OCT图像。
图60A和60B显示了两个表格，通过测量ETDRS测试中字母数量在6M时较基线的变化示出队列4受试者的视功能。图60A表示经治疗的眼的视觉功能并且图60B表示对侧眼的视觉功能。基线用0表示，并且正数(也标记为绿色)代表较基线增加的字母数量。负数(也标记为红色)用数字之前的减号表示，并且代表较基线减少的字母数量。例如，受试者13(602)保持稳定的BCVA改善，并且在其上次访视时较基线增加了19个字母。
图61A为通过彩色照相和红外成像得到的眼底图像。左上图像显示基线时的彩色眼底照相。右上图像以红色显示了基线时的萎缩，并且以橙色显示了基线前14个月的萎缩，显示了从橙色到红色的自然史生长。左下彩色眼底照相图像显示病变周围的浅褐色边沿，对应于移植后15个月时的OpRegen细胞的位置。右下红外图像以绿色显示了移植后15个月时的萎缩区域，其中周围的灰色边沿对应于OpRegen细胞区域和视网膜修复区域。图61B为通过光学相干断层扫描得到的图像。上部图像显示了移植后15个月扫描过萎缩区域的OCT扫描结果，其中红色区域是RPE，深蓝色区域是ELM，并且浅蓝色区域是ONL。与相同的扫描但在基线时拍摄的相比，由于视网膜修复，这些层已经发展到中心。下部图像显示了基线时的相同扫描，其中未显示RPE、ELM和ONL的萎缩区域要大得多。
图62显示OpRegen细胞移植后病变大小的潜在减小。红色：病变的基线边界。蓝色：8个月时。
图63显示了在先前CRORA的区域中存在新的高反射单层，推测是存活的RPE，因为它显示了ELM、ONL和OPL的特征。
图64显示了视网膜再生的一致发现(新的ONL、EM、ELZ和RPE)：ONL的新区域使用ELM和/或OPL边界来定义。
图65为示出SQRT双眼中萎缩性病变总大小的变化，以及以mm SQRT/年为单位的较先前和基线的变化率(对较过去的预期增长作图)。
图66显示了OpRegen的示意图，OpRegen为同种异体RPE细胞的悬浮液，具有抵消GA中RPE细胞损失的潜力。
图67为显示OpRegen具有通过支持视网膜结构和功能来抵消GA区域中的RPE细胞损失的潜力的图。
图68A和68B为显示视觉功能改善的证据的图；其中平均为7.6的字母增益，且队列4中25％的患者具有≥15的字母增益。图68A显示了队列1至3的图表，并且图68B显示了队列4的图表。
图69为显示OpRegen向GA区域和中央凹的视网膜下递送的图像；观察到外视网膜结构改善的区域具有更大的视觉功能增益。队列4中的五例患者将已经OpRegen递送至大部分或全部GA区域，包括中央凹。这五例患者在视觉功能方面获得了更大的增益(平均为12.8的字母增益)，通过SD-OCT评定了外视网膜结构明显改善的区域的证据。
图70显示了对在OpRegen递送后GA的评定的图像；显示了SD-OCT相对于眼底自发荧光(FAF)成像的优点。OpRegen中的同种异体hESC来源的RPE细胞年轻，并且具有低脂褐素含量。预计在视网膜下递送后，OpRegen RPE细胞不容易通过标准FAF检测到。
图71显示了在RPE/布鲁赫膜处可见的更大的高反射率的图像。SD-OCT成像建议OpRegen出现在前GA的区域中。
图72显示了在OpRegen递送至GA区域的情况下，通过SD-OCT获得的外视网膜结构的示例性改善的图像。在12个月时，RPE层的局灶性破裂、脉络膜超传播和基线时的外视网膜下沉不再存在。通过存在显著的玻璃疣和脉络膜血管标记来确认配准扫描。
图73A和73B为显示了在OpRegen递送至GA区域的情况下，通过SD-OCT获得的外视网膜结构改善的实例的图像。图73A是显示基线GA边缘附近的cRORA的分辨率的图像。图73B是显示在12个月时与基线和以下观察结果比较的图像：cRORA的特征不再存在；RPE/布鲁赫膜的水平的高反射率更大，脉络膜超传播更低，以及对外视网膜层的连续性更大的视网膜下沉的解决。类似的特征也见于GA的鼻侧、上侧和下侧边缘。
图74为显示了在OpRegen递送至GA区域的情况下，通过SD-OCT获得的外视网膜结构改善的实例的图像。
图75为显示受试者#120在基线访视时的结果的图像。经治疗的眼(OS)上的BCVA为54，与基线相同且比前一年(50)多4个字母。对侧眼上的BCVA为28，比基线(61)下降了33个字母，且比上一年(21)多7个字母。修复层仍然被保存，且细胞仍然存在。与经治疗的眼相比，FAF在对侧眼上展示出快速生长。
图76为显示受试者#120在4年访视时的结果的图像。经治疗的眼(OS)上的BCVA为54，与基线相同且比前一年(50)多4个字母。对侧眼上的BCVA为28，比基线(61)下降了33个字母，且比上一年(21)多7个字母。修复层仍然被保存，且细胞仍然存在。与经治疗的眼相比，FAF在对侧眼上展示出快速生长。
图77为显示经治疗的眼的结果的图像。经治疗的眼(OS)上的BCVA为54，与基线相同且比前一年(50)多4个字母。对侧眼上的BCVA为28，比基线(61)下降了33个字母，且比上一年(21)多7个字母。修复层仍然被保存，且细胞仍然存在。与经治疗的眼相比，FAF在对侧眼上展示出快速生长。
图78为显示对侧眼的结果的图像。经治疗的眼(OS)上的BCVA为54，与基线相同且比前一年(50)多4个字母。对侧眼上的BCVA为28，比基线(61)下降了33个字母，且比上一年(21)多7个字母。修复层仍然被保存，且细胞仍然存在。与经治疗的眼相比，FAF在对侧眼上展示出快速生长。
图79为显示基线和9个月访视时的结果的图像。经治疗的眼(OS)上的BCVA为54，与基线相同且比前一年(50)多4个字母。对侧眼上的BCVA为28，比基线(61)下降了33个字母，且比上一年(21)多7个字母。修复层仍然被保存，且细胞仍然存在。与经治疗的眼相比，FAF在对侧眼上展示出快速生长。
图80为显示基线和4年访视时的结果的图像。经治疗的眼(OS)上的BCVA为54，与基线相同且比前一年(50)多4个字母。对侧眼上的BCVA为28，比基线(61)下降了33个字母，且比上一年(21)多7个字母。修复层仍然被保存，且细胞仍然存在。与经治疗的眼相比，FAF在对侧眼上展示出快速生长。
这些附图提供了各种令人惊讶和出人意料的结果的图示和实例。实施例涉及多种方法，这些方法可包括任何在附图中讨论、阐述或呈现其数据的评估和测定。
具体实施方式
本文中的实施例整体涉及用于治疗眼睛的疾病和病症的方法、物质的组合物和装置，该眼睛的疾病和病症包括视网膜病况诸如黄斑变性。
在一些实施例中，物质的组合物、方法和装置可利用同种异体(“现成”)的候选物。例如，这可能意味着材料衍生自细胞系，而不是来自个体患者，与针对特定患者的治疗相比，便于大规模生产和降低生产成本。
方法、装置、组成物等可包括附图中所示的那些。
在阅读本说明书之后，如何在各种替代实施例和替代应用中实现本公开对于本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，本文将不描述本发明的全部的各种实施例。应当理解，此处所呈现的实施例仅以示例的方式呈现，而非限制性的。因此，各种替代实施例的详细描述不应被解释为限制如本文所述的本公开的范围或广度。
在公开和描述本技术之前，应当理解，下文描述的方面不限于特定的组合物、制备此类组合物的方法或其用途，因为这些当然可能有所不同。另外应当了解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并非旨在进行限制。
仅为方便读者而划分为各个部分的详细描述和在任何部分中发现的公开内容可与其他部分中的内容相结合。为方便读者，本说明书中可能会使用标题或副标题，其不旨在影响本公开的范围。
定义
术语“治疗(treating或treatment)”指成功治疗或改善受损伤、疾病、病理或病况的任何标记，包括任何客观或主观参数，诸如减轻；缓解；症状减少或使患者更易忍受损伤、病理或病况；减缓变性或衰退的速度；降低变性末期的衰弱程度；改善患者的身体或心理健康。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括体格检查、神经精神检查和/或精神病学评估的结果。术语“治疗”及其词形变化，可以包括预防损伤、病理、病况或疾病。在实施例中，治疗为预防。在实施例中，治疗不包括预防。如本文所用(以及如本领域所充分理解的)的“治疗(treating或treatment)”也广泛地包括在受试者的病况中获得有益或期望的结果(包括临床结果)的任何方法。有益或期望的临床结果可包括但不限于：减轻或改善一种或多种症状或病况，减轻疾病程度，稳定(即，不恶化)疾病状态，预防疾病的传播或蔓延，延缓或减慢疾病进展，改善或缓解疾病状态，减少疾病复发，以及缓解，包括部分的和完全的以及可检测的和不可检测的。换句话说，如本文所用的“治疗”包括对疾病的任何治愈、改善或预防。治疗可以预防疾病的发生；抑制疾病的蔓延；缓解疾病的症状，全部或部分消除疾病的根本原因，缩短疾病的持续时间，或实现这些目标的组合。
本文所用的“治疗(treating或treatment)”包括预防性治疗。治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的活性剂。施用步骤可以由单次施用组成，也可以包括一系列施用。治疗期的长度取决于多种因素，诸如病况的严重程度、患者的年龄、活性剂的浓度、用于治疗的组合物的活性、或它们的组合。还应当理解，用于治疗或预防的药物的有效剂量可以在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。剂量的变化可通过本领域已知的标准诊断测定得出并且变得明显。在一些情况下，可能需要长期施用。例如，将组合物以足以治疗患者的量和持续时间施用于受试者。在实施例中，治疗可能并非预防性治疗。
术语“预防”是指减少患者疾病症状的发生。如上所述，预防可以是完全的(无可检测的症状)或部分的，使得观察到的症状比没有治疗时可能发生的症状减少。
“患者”或“有此需要的受试者”是指患有或易于患有疾病或病症的活生物体，所述疾病或病症可通过施用如本文所提供的药物组合物来治疗。非限制性实例包括人类、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、犬、猴、山羊、绵羊、奶牛、鹿和其他非哺乳类动物。在一些实施例中，患者是人类。
“有效量”是足以使组合物达到相对于不存在组合物时的既定目的的量(例如，实现施用的效果，治疗疾病，降低酶活性，增加酶活性，减少信号通路，或减轻疾病或病况的一种或多种症状)。“有效量”的一个实例是足以有助于治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，也可以称为“治疗有效量”。一种或多种症状的“减少”(以及该短语的语法等效形式)意指降低一种或多种症状的严重程度或频率或消除一种或多种症状。药物(例如，本文中描述的细胞)的“预防有效量”是当施用于受试者时将具有预期的预防效果的药物的量，例如，预防或延缓损伤、疾病、病理或病况的发生(或复发)，或降低损伤、疾病、病理或病况或其症状发作(或复发)的可能性。单次施用后不一定能达到完全的预防效果，该效果可能只有在施用一系列剂量后才能达到。因此，预防有效的量可以一次或多次施用。如本文所用的“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂时降低酶活性所需的拮抗剂的量。如本文所用的“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂时破坏酶或蛋白质功能所需的拮抗剂的量。确切的量将取决于治疗的目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；以及Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2003，Gennaro编，Lippincott，Williams&Wilkins)。
对于本文所述的任何组合物，治疗有效量可从细胞培养测定中初步确定。目标浓度将是那些能够实现本文所述的方法的一种或多种活性组合物的浓度(例如，细胞浓度或数量)，如使用本文所述的方法或本领域已知的方法所测量的。
如本领域所熟知的，用于人体的治疗有效量也可以从动物模型确定。例如，可将人用剂量配制为实现已发现对动物有效的浓度。人用剂量可通过监测组合物的有效性和向上或向下调整剂量来调节，如上所述。根据上述方法和其他方法调整剂量以在人体内实现最大功效，完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指足以改善疾患的治疗剂的量，如上所述。例如，对于给定的参数，治疗有效量将表现出增加或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％。疗效也可表示为增加或减少的“倍数”。例如，治疗有效量相比于对照可具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多的效果。
剂量可根据患者的需要和所用组合物而变化。在本公开的上下文中，向患者施用的剂量应足以随着时间的推移在患者体内实现有益的疗效。剂量的大小也将取决于任何不良副作用的存在、性质和程度。确定特定情况下的合适剂量在从业人员的技术范围内。通常，开始治疗时，剂量小于组合物的最佳剂量。此后，小幅增加剂量直到达到特定情况下的最佳效果。剂量和间隔可单独调整，以提供对正在治疗的特定临床适应症有效的所施用的组合物的各种疗效水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相对应的治疗方案。
“共同施用”意指包括在施用一种或更多种另外的疗法的同时、刚好在其之前或刚好在其之后同时施用本文所述的组合物。本文提供的组合物可以单独施用或可以共同施用给患者。共同施用意指包括以单独或组合的方式同时或顺序地施用组合物(多于一种组合物)。因此，当需要时，所述制备物也可以与其他活性物质组合(例如，以减少代谢降解)。
“对照”或“对照实验”根据其一般含义使用并且是指除省略实验的程序、试剂或变量外，将实验的受试者或试剂视为平行实验的实验。在某些情况下，对照被用作评估实验效果的比较标准。在一些实施例中，对照是在不存在如本文(包括实施例和实例)所述的组合物的情况下测量蛋白质的活性。
“药用赋形剂”和“药用载体”是指有助于向受试者施用活性剂和被受试者吸收并且可以包括在本公开的组合物中而不会对患者造成显著的不良毒理学影响的物质。药用赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、正常蔗糖、正常葡萄糖、结合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂、盐溶液(诸如林格氏溶液)、醇、油、明胶、碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和色素等。此类制备物可以灭菌并且如果需要，可以与助剂混合，诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂和/或芳香族物质等，这些物质不会与本公开的组合物发生有害反应。本领域技术人员将认识到其他药物赋形剂可用于本公开。
如本文所用的“细胞”是指执行代谢或其他足以保存或复制其基因组DNA的功能的细胞。细胞可通过本领域所熟知的方法进行鉴定，包括例如，存在完整膜，用特定染料染色，产生子代的能力，或者在配子的情况下，与第二配子结合以产生可存活后代的能力。细胞可包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和衍生自植物和动物(例如哺乳动物、昆虫(例如，夜蛾)和人体细胞)的细胞。当细胞天然不贴壁或已经过处理以不粘附在表面上(例如通过胰蛋白酶消化)时，这些细胞可能是有用的。
如本文所用，“干细胞”是指能够在培养基中长时间保持未分化状态(例如，多能或多能干细胞)直至诱导分化成具有特定的特异性功能的其他细胞类型(例如，完全分化的细胞)的细胞。在实施例中，“干细胞”包括胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质干细胞和造血干细胞。在实施例中，RPE细胞由多能干细胞(例如，ESC或iPSC)产生。
如本文所用，“诱导多能干细胞”或“iPSC”为可通过遗传操纵从体细胞产生的细胞，例如，通过用转录因子诸如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4对体细胞诸如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞进行逆转录病毒转导来产生[Yamanaka S,Cell Stem Cell.2007,1(1):39-49；Aoi T,等人,Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver andStomach Cells.Science.2008年2月14日.(Epub ahead of print)；IH Park,Zhao R,WestJA,等人Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with definedfactors.Nature 2008；451:141-146；K Takahashi、Tanabe K、Ohnuki M等人Induction ofpluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell2007；131:861-872]。其他胚胎样干细胞可通过核转移至卵母细胞、与胚胎干细胞融合或将核转移至受精卵中(如果受体细胞在有丝分裂中被阻止)来产生。此外，iPSC可使用非整合方法(例如，通过使用小分子或RNA)产生。
术语“胚胎干细胞”是指能够分化成所有三个胚胎胚层(即，内胚层、外胚层和中胚层)的细胞或保持未分化状态的胚胎细胞。短语“胚胎干细胞”包括从胚胎植入前妊娠后形成的胚胎组织(例如囊胚)中(即，植入前囊胚)获得的细胞、从植入后/原肠胚形成前阶段囊胚获得的扩展囊胚细胞(EBC)(参见WO 2006/040763)以及在妊娠期间任何时间(优选在妊娠10周之前)从胎儿的生殖器组织获得的胚胎生殖(EG)细胞。在实施例中，胚胎干细胞使用熟知的细胞培养方法获得。例如，人胚胎干细胞可分离自人囊胚。
应当理解，可商购获得的干细胞也可用于本公开的各个方面和实施例中。人ES细胞可以购自NIH人胚胎干细胞登记处www.grants.nih.govstem_cells/或其他hESC登记机构。可商购获得的胚胎干细胞系的非限制性实例为HAD-C 102、ESI、BGO 1、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY1O、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES10、HUES11、HUES12、HUES13、HUES14、HUES15、HUES 16、HUES17、HUES18、HUES19、HUES20、HUES21、HUES22、HUES23、HUES24、HUES25、HUES26、HUES27、HUES28、CyT49、RUES3、WAO 1、UCSF4、NYUES1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUESS、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077(H7)、WA09(H9)、WA 13(H13)、WA14(H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CT I、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR 1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBRS、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BINhem19、BJNhem20、SAGO 1、SAOO1。
术语“视网膜色素上皮”或“RPE”，也称为“视网膜的色素层”，是指视网膜外的细胞色素层。RPE层位于布鲁赫膜(脉络膜内缘)与光感受器之间。RPE是为视网膜提供营养的中间体，并且协助许多功能，包括视网膜发育、光吸收、生长因子分泌和介导眼睛的免疫应答。RPE功能障碍可能在包括视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变、西尼罗病毒和黄斑变性的病况中导致视觉丧失或失明。
术语“疾病”或“病况”是指能够用本文提供的组合物或方法治疗的患者或受试者的身体状态或健康状况。年龄相关性黄斑变性或AMD是中心视网膜的一种进行性慢性病，并且是世界范围内人们视觉丧失的主要原因。大多数视力丧失发生在疾病的晚期，其由于以下两个过程之一：新生血管(“湿性”)AMD和地图状萎缩(GA，“干性”)。在GA中，视网膜色素上皮、脉络膜毛细血管和光感受器发生进行性萎缩。干性AMD更常见(占所有病例的85％至90％)，但可能会发展为“湿性”形式，其如果不治疗，将导致快速、重度视觉丧失。在美国和其他发达国家/地区，AMD的估计患病率为1/2000。预计该患病率将随老年人在一般人群中的比例升高而增加。该疾病的风险因素包括环境和遗传因素。该疾病的发病机理涉及四种功能相互关联的组织(即，视网膜色素上皮(RPE)、布鲁赫膜、脉络膜毛细血管和光感受器)的异常。但是，RPE细胞功能受损是导致临床相关AMD变化的分子通路中的早期关键事件。目前尚无获得批准的针对干性AMD的治疗方法。预防性措施包括维生素/矿物质补充剂。这些措施降低了发生湿性AMD的风险，但不影响地图状萎缩(GA)的进展。
可根据本文提供的方法衡量治疗效果的疾病的非限制性列表包括：视网膜色素变性；莱伯氏先天性黑蒙；遗传性或获得性黄斑变性；年龄相关性黄斑变性(AMD)；地图状萎缩(GA)；卵黄状黄斑变性；视网膜脱离；旋涡状萎缩；无脉络膜症；RPE的图案性营养不良以及其他营养不良；斯特格病；由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或创伤性损伤中的任一者引起的RPE和视网膜损伤；视网膜发育不良；视网膜萎缩；视网膜病变；黄斑营养不良；视锥细胞营养不良；视锥-视杆细胞营养不良；Malattia Leventinese；Doyne蜂窝状营养不良；Sorsby营养不良；图案性/蝴蝶状营养不良；Best卵黄样营养不良；北卡罗来纳营养不良；中心性晕轮状脉络膜营养不良；血管样条纹症；中毒性黄斑病变；病理性近视；视网膜色素变性；和黄斑变性。在实施例中，疾病为干性AMD。在实施例中，疾病为GA。
“地图状萎缩”或“GA”或“萎缩性视网膜”也称为萎缩性年龄相关性黄斑变性(AMD)或晚期干性AMD，是年龄相关性黄斑变性的一种晚期形式，可导致视网膜(光感受器、视网膜色素上皮、脉络膜)的进行性和不可逆丧失，其可能导致视功能随时间推移而丧失。
在实施例中，RPE缺陷可能由以下中的一者或多者引起：高龄、吸烟、体重不健康、抗氧化剂摄入量低或心血管疾病。在其他实施例中，RPE缺陷可能由先天性异常引起。“视网膜色素上皮细胞”、“RPE细胞”、“RPE”在上下文允许的情况下可以互换使用，是指在功能上、表观遗传学上或表达谱类似于形成视网膜色素上皮细胞层的天然RPE细胞的表达谱的细胞类型(例如，在眼内移植、施用或递送时，它们表现出与天然RPE细胞类似的功能活动)。
如本文所用，术语“OpRegen”是指谱系限制性人RPE细胞系。RPE细胞衍生于补充有激活素A、转化生长因子β(TGF-b)家族和烟酰胺的分化培养基下，以富集RPE群。OpRegen是一种单细胞悬液，在眼科平衡盐溶液(BSS Plus)中配制，或被配制为可立即施用(RTA)的解冻和注射(TAI)制剂，例如PCT Pub.第WO/2019/130061号中所述，该文献通过引用全文并入本文用于其中描述的所有制剂、组合物、方法、试剂等。
治疗方法
本文中的实施例整体涉及用于治疗眼睛的疾病和病症的方法、物质的组合物和装置，该眼睛的疾病和病症包括视网膜病况诸如黄斑变性。
因此，在一个方面，提供了一种治疗如本文所示、所述或示出的视网膜疾病或疾患或减慢其进展的方法。
根据一些实施例，治疗视网膜疾病或减慢其进展可通过微视野检查评估视力的恢复来证明。微视野检查是可使用视觉敏感区域的高分辨率图测量或评估视功能的工具之一。微视野检查可以在视网膜上定位该特定的视觉区域或受损的视觉，并且能够“弥合”解剖结构与临床变化之间的差距，与这两个重要参数(解剖结构缺陷与视觉障碍)之间具有良好的相关性。
根据其他实施例，通过微视野检查评定的视觉恢复包括证明RPE细胞的施用包括与基线微视野检查评估相比得到改善的微视野检查评估。根据其他实施例，通过微视野检查评定的视觉恢复包括证明RPE细胞的施用包括与基线和对侧/未经治疗的眼相比得以保留的微视野检查评定。
根据某些实施例，治疗视网膜疾病或减慢其进展包括在施用RPE细胞后一年时GA病变相对于基线或对侧眼的增长速率降低约5％至约20％。在实施例中，治疗视网膜疾病或减慢其进展包括在施用后一年时GA病变相对于基线或对侧眼的增长速率降低约5％至约50％。在实施例中，治疗视网膜疾病或减慢其进展包括在施用后一年时GA病变相对于基线或对侧眼的增长速率降低约5％至约25％。在实施例中，治疗视网膜疾病或减慢其进展包括在施用后一年时GA病变相对于基线或对侧眼的增长速率降低约5％至约100％。在实施例中，治疗视网膜疾病或减慢其进展包括在施用后一年时GA病变相对于基线或对侧眼的增长速率降低约5％至约10％。该量可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
根据一些实施例，治疗视网膜疾病或减慢其进展包括以下中的一者或多者：稳定的最佳矫正视力(BCVA)；低亮度测试表现无恶化；或微视野检查敏感度无恶化；或阅读速度无恶化。在实施例中，与年龄匹配、性别匹配的对照进行比较。在实施例中，与基线进行比较。在实施例中，与对侧眼进行比较。在实施例中，在约一周与约5年之间的时间段进行比较。在实施例中，在约一个月时进行比较。在实施例中，在约三个月时进行比较。在实施例中，在约六个月时进行比较。在实施例中，在约一年时进行比较。该时间段可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
根据一些实施例，提供了用于治疗视网膜疾病或疾患或减慢其进展的药物组合物，其包含作为活性物质的约25,000个至约1,000,000个RPE细胞。在实施例中，该组合物包含约50,000个至约500,000个RPE细胞。在实施例中，该组合物包含约100,000个至约500,000个RPE细胞。在实施例中，该组合物包含约250,000个至约500,000个RPE细胞。在实施例中，该组合物包含约50,000个至约400,000个RPE细胞。在实施例中，该组合物包含约50,000个至约300,000个RPE细胞。在实施例中，该组合物包含约50,000个至约250,000个RPE细胞。在实施例中，该组合物包含约50,000个至约200,000个RPE细胞。该量可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一些实施例中，该方法包括向有此需要的受试者施用细胞治疗剂，其中细胞治疗剂能够恢复视网膜疾病的视网膜结构。
细胞治疗剂
在一些方面，本公开提供了包含衍生自多能细胞的视网膜色素上皮(RPE)细胞的细胞治疗剂。此类细胞治疗剂包括但不限于OpRegen。
根据一些实施例，RPE细胞表达成熟RPE细胞的至少一种、两种、三种、四种或五种标志物。根据一些实施例，RPE细胞表达成熟RPE细胞的至少两种与至少十种之间、或至少两种与至少三十种之间的标志物。此类标志物包括但不限于CRALBP、RPE65、PEDF、PMEL17、Bestrophin 1和酪氨酸酶。任选地，RPE细胞也可以表达RPE祖细胞的标志物(例如，MITF)。在其他实施例中，RPE细胞表达PAX-6。在其他实施例中，RPE细胞表达视网膜祖细胞的至少一种标志物，包括但不限于Rx、OTX2或SIX3。任选地，RPE细胞可以表达SIX6和/或LHX2。
根据一些实施例，RPE细胞为细胞。
如本文所用的短语“成熟RPE细胞的标志物”是指在成熟RPE细胞中相对于非RPE细胞或未成熟的RPE细胞升高(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如，蛋白质)。
如本文所用的短语“RPE祖细胞的标志物”是指在RPE祖细胞中与非RPE细胞相比升高(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如，蛋白质)。
根据其他实施例，RPE细胞具有类似于天然RPE细胞的形态，其形成视网膜的色素上皮细胞层。例如，这些细胞可能是色素细胞并且具有特征性多边形形状。
根据一些实施例，RPE细胞由多能干细胞(例如，ESC或iPSC)产生。
诱导多能干细胞(iPSC)可为通过遗传操纵从体细胞产生的细胞，例如，通过用转录因子诸如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4对体细胞诸如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞进行逆转录病毒转导来产生[Yamanaka S,Cell Stem Cell.2007,1(1):39-49；Aoi T,等人,Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and StomachCells.Science.2008年2月14日.(Epub ahead of print)；IH Park,Zhao R,West JA,等人Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with definedfactors.Nature 2008；451:141-146；K Takahashi、Tanabe K、Ohnuki M等人Induction ofpluripotent stemcells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell2007；131:861-872]。其他胚胎样干细胞可通过核转移至卵母细胞、与胚胎干细胞融合或将核转移至受精卵中(如果受体细胞在有丝分裂中被阻止)来产生。此外，iPSC可使用非整合方法(例如，通过使用小分子或RNA)产生。
人胚胎干细胞可分离自人囊胚。人囊胚通常从人体内植入前胚胎或从体外受精(IVF)胚胎中获得。替代性地，单细胞人类胚胎可扩增到囊胚阶段。为分离人ES细胞，将透明带从囊胚中去除，并且利用其中裂解滋养外胚层细胞并通过轻轻移液从完整ICM中去除的程序来分离内部细胞团(ICM)。然后将ICM接种在含有使其能够生长的适当培养基的组织培养瓶中。9至15天后，利用机械解离或酶降解将ICM源性生长物解离成团块，并且将细胞重新接种在新鲜组织培养基上。利用微量移液器单独选择表现出未分化形态的菌落，机械解离成团块，然后重新铺板。然后使所得ES细胞常规地每4至7天分裂一次。有关制备人ES细胞的方法的更多详细信息，参见：Reubinoff等人Nat Biotechnol 2000年5月:18(5):559；Thomson等人,[美国专利第5,843,780号；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995]；Bongso等人,[Hum Reprod 4:706,1989]；以及Gardner等人,[Fertil.Steril.69:84,1998]。
此外，ES细胞可以从其他物种获得，包括小鼠(Mills和Bradley,2001)、金黄地鼠[Doetschman等人,1988,Dev Biol.127:224-7]、大鼠[Iannaccone等人,1994,DevBiol.163:288-92]、兔子[Giles等人1993,Mol Reprod Dev.36:130-8；Graves&Moreadith,1993,Mol Reprod Dev.1993,3036:424-33]、若干种家畜物种[Notarianni等人,1991,JReprod Fertil增刊43:255-60；Wheeler 1994,Reprod Fertil Dev.6:563-8；Mitalipova等人,2001,Cloning.3:59-67]以及非人灵长动物(恒河猴和狨猴)[Thomson等人,1995,Proc Natl Acad Sci U S A.92:7844-8；Thomson等人,1996,Biol Reprod.55:254-9]。
扩展囊胚细胞(EBC)可从受精后至少九天原肠胚形成前阶段的囊胚中获得。在培养囊胚之前，将透明带消化[例如，通过Tyrode酸性溶液(Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA)]，以便暴露内部细胞团。然后将囊胚作为全胚胎在受精后(即，在原肠胚形成事件之前)使用标准胚胎干细胞培养方法在体外培养至少九天并且不超过十四天。
另一种制备ES细胞的方法描述于Chung等人(Cell Stem Cell，第2卷，第2期，第113至117页，2008年2月7日)中。该方法包括在体外受精过程中从胚胎中取出单个细胞。在该过程中不破坏胚胎。
EG(胚胎生殖)细胞是使用本领域技术人员已知的实验室技术由从妊娠约8至11周的胎儿(在人类胎儿的情况下)获得的原始生殖细胞制备的。将生殖脊解离并且切成小部分，然后通过机械解离将其分解成细胞。然后使EG细胞在具有适当培养基的组织培养瓶中生长。通过每日更换培养基来培养细胞，直至观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常在7至30天或1至4代后。有关制备人EG细胞的方法的更多详细信息参见Shamblott等人,[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998]和美国专利第6,090,622号。
另一种制备ES细胞的方法是孤雌生殖。在该过程中也不破坏胚胎。
ES培养方法可包括使用饲养细胞层，该饲养细胞层分泌干细胞增殖所需的因子，同时抑制其分化。培养通常在固体表面上进行，例如涂布有明胶或波形蛋白的表面。示例性饲养层包括人胚胎成纤维细胞、成体输卵管上皮细胞、原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、鼠胎儿成纤维细胞(MFF)、人胚胎成纤维细胞(HEF)、由人胚胎干细胞分化获得的人成纤维细胞、人胎儿肌肉细胞(HFM)、人胎儿皮肤细胞(HFS)、人成体皮肤细胞、人包皮成纤维细胞(HFF)、人脐带成纤维细胞、从脐带或胎盘获得的人细胞、以及人骨髓基质细胞(hMSC)。可以将生长因子加入培养基中以使ESC维持在未分化状态。此类生长因子包括bFGF和/或TGF。在另一个实施例中，可以将试剂加入培养基中以使hESC维持在原始未分化状态，参见例如Kalkan等人,2014,Phil.Trans.R.Soc.B,369:20130540。
人脐带成纤维细胞可以在补充有人血清(例如20％)和谷氨酰胺的杜贝克氏改良伊格尔培养基(例如DMEM，SH30081.01，Hyclone)中扩增。优选地，对人脐带细胞进行辐照。这可以使用本领域已知的方法(例如伽马室，220Exel，MDS Nordion 3500至7500拉德)来实现。一旦获得足够的细胞，即可将其冷冻(例如冻存)。为扩增ESC，通常将人脐带成纤维细胞以在补充有约20％人血清(和谷氨酰胺)的DMEM(例如SH30081.01，Hyclone)中的浓度25,000至100,000个细胞/cm2接种到固体表面(例如，T75或T 175烧瓶)上，该固体表面任选地涂布有贴壁基质诸如明胶(例如，重组人明胶(RhG 100-001,Fibrogen)或人玻连蛋白或层粘连蛋白521(Bio lamina)。hESC通常接种在1至4天后的支持性培养基(例如包含人血清白蛋白的或NUT(+))中的饲养层细胞的顶部。可以向培养基中加入另外的因子以防止ESC分化，诸如bFGF和TGFI3。一旦获得足够量的hESC，即可机械破坏细胞(例如，通过使用无菌吸头或一次性无菌干细胞工具；14602Swemed)。替代性地，可通过酶处理(例如胶原酶A或TrypLE Select)移除细胞。该过程可以重复几次以达到所需的hESC量。根据一些实施例，在第一轮扩增之后，使用TrypLE Select去除hESC，在第二轮扩增之后，使用胶原酶A去除hESC。
在分化步骤之前，可以在饲养层上扩增ESC。基于饲养细胞的培养基的非限制性实例如上所述。扩增通常实施至少两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天或十天。扩增实施至少1代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少6代、至少7代、至少8代、至少9代或至少10代。在一些实施例中，扩增实施至少2代至至少20代。在其他实施例中，扩增实施至少2代至至少40代。扩增后，使用分化剂对多能干细胞(例如ESC)进行定向分化。
无饲养细胞系统也已用于ES细胞培养，此类系统利用补充有血清替代物、细胞因子和生长因子(包括IL6和可溶性IL6受体嵌合体)的基质作为饲养细胞层的替代物。干细胞可在培养基(例如，Lonza L7系统、mTeSR、StemPro、XFKSR、E8、)存在下在固体表面诸如细胞外基质(例如，MATRIGELRTM，层粘连蛋白或玻连蛋白)。与需要饲养细胞和干细胞同时生长并且可能产生混合细胞群的基于饲养细胞的培养细胞不同，在无饲养细胞系统上生长的干细胞很容易与表面分离。用于生长干细胞的培养基含有有效抑制分化并且促进其生长的因子，诸如MEF条件培养基和bFGF。
在一些实施例中，扩增后，多能ESC在贴壁表面上经受定向分化(未经中间生成球体或胚状体)。参见例如，国际专利申请公开号WO 2017/072763，其全文以引用方式并入本文。
因此，根据本公开的一个方面，在贴壁表面上经受定向分化的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞是未分化的ESC并且表达多能性的标志物。例如，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞为Oct4±TRA-1-60+。未分化的ESC可以表达多能性的其他标志物，诸如NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-β、SSEA-3、SSEA-4和/或TRA-1-81。
在一个示例性分化方案中，使用第一分化剂将未分化的胚胎干细胞在贴壁表面上分化为RPE细胞谱系，然后使用转化生长因子-B(TGFB)超家族的成员(例如TGF 1、TGF2和TGF 3亚型，以及同源配体，包括激活素(例如，激活素A、激活素B和激活素AB)、Nodal、抗苗勒管激素(AMH)、一些骨形态发生蛋白(BMP)(例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7)以及生长和分化因子(GDF))进一步分化为RPE细胞。根据一个具体实施例，转化生长因子-B(TGFB)超家族的成员为激活素A，例如在20ng/ml至200ng/ml之间，例如在100ng/ml至180ng/ml之间。
根据一些实施例，第一分化剂为烟酰胺(NA)，其浓度在约1mM至100mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间，并且为例如10mM。根据其他实施例，第一分化剂为3-氨基苯甲酰胺。
NA，也称为“烟酰胺”，是维生素B3(烟酸)的酰胺衍生物形式，被认为可以保持和改善β细胞功能。NA的化学式为C6H6N20。NA对于生长和食物转化为能量至关重要，并且已被用于关节炎治疗以及糖尿病的治疗和预防。
根据一些实施例，烟酰胺为烟酰胺衍生物或烟酰胺模拟物。如本文所用的术语“烟酰胺(NA)的衍生物”表示作为天然NA的化学改性衍生物的化合物。在一个实施例中，化学改性可以是取代基本NA结构的吡啶环(通过该环的碳或氮成员)、经由酰胺部分的氮或氧原子。当取代时，一个或多个氢原子可以被取代基取代，并且/或者取代基可以连接至N原子以形成四价带正电荷的氮。因此，本发明的烟酰胺包括取代的或未取代的烟酰胺。在另一个实施例中，化学改性可以是单个基团的缺失或替换，例如以形成NA的硫代苯甲酰胺类似物，所有这些都是精通有机化学的人所理解的。在本发明的上下文中的衍生物还包括NA的核苷衍生物(例如烟酰胺腺嘌呤)。描述了NA的各种衍生物，其中一些还与PDE4酶的抑制活性相关(WO 03/068233；WO 02/060875；GB2327675A)，或作为VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(WOO 1/55114)。例如，制备4-芳基-烟酰胺衍生物的方法(WO 05/014549)。其他示例性烟酰胺衍生物公开于WOO 1/55114和EP2128244中。
烟酰胺模拟物包括烟酰胺的改性形式，以及烟酰胺的化学类似物，其重现烟酰胺在RPE细胞从多能细胞分化和成熟中的作用。示例性烟酰胺模拟物包括苯甲酸、3-氨基苯甲酸和6-氨基烟酰胺。另一类可以用作烟酰胺模拟物的化合物为聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的抑制剂。示例性PARP抑制剂包括3-氨基苯甲酰胺、伊尼帕利布(Iniparib)(BSI 201)、奥拉帕尼(Olaparib)(AZD-2281)、芦卡帕尼(Rucaparib)(AG014699,PF-01367338)、维利帕尼(Veliparib)(ABT-888)、CEP 9722、MK 4827和BMN-673。
其他设想的分化剂包括例如noggin、Wnt的拮抗剂(Dkkl或IWR1e)、Nodal拮抗剂(Lefty-A)、视黄酸、牛磺酸、GSK3b抑制剂(CHIR99021)和Notch抑制剂(DAPT)。
根据某些实施例，分化按如下步骤实施：(a)在含有第一分化剂(例如烟酰胺)的培养基中培养ESC；以及(b)在包含TGFB超家族成员(例如激活素A)和第一分化剂(例如烟酰胺)的培养基中培养从步骤a)获得的细胞。
步骤(a)可以在不存在TGFI3超家族成员(例如激活素A)的情况下实施。
在一些实施例中，步骤(a)中的培养基完全缺乏TGFI3超家族的成员。在其他实施例中，培养基中的TGFI3超家族成员的含量小于20ng/ml、10ng/ml、1ng/ml或甚至小于0.1ng/ml。
上述方案可以通过在包含第一分化剂(例如烟酰胺)但缺乏TGFI3超家族的成员(例如激活素A)的培养基中培养在步骤(b)中获得的细胞来继续。该步骤在本文中称为步骤(b*)。
现在用附加实施例对上述方案进行更详细的描述。步骤(a)：一旦获得足够数量的ESC，即开始分化过程。可以将细胞从细胞培养物中取出(例如通过使用胶原酶A、分散酶、TrypLE select、EDTA)，并且接种到存在烟酰胺(并且不存在激活素A)的非贴壁基质(例如，细胞培养板，诸如涂布Hydrocell或琼脂糖的培养皿或细菌培养皿)上。烟酰胺的示例性浓度在0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间，或者为10mM。一旦将细胞接种到非贴壁基质(例如，细胞培养板)上，该细胞培养物可称为细胞悬液，优选在悬浮培养物中自由浮动的簇，即衍生自人胚胎干细胞(hESC)的细胞的聚集体。细胞簇不粘附至任何基质(例如，培养板、载体)。自由浮动的干细胞的来源先前描述于WO 06/070370中，其全文以引用方式并入本文。该阶段可以实施至少1天，更优选地两天、三天、1周或甚至14天。优选地，细胞在悬浮液中与烟酰胺(例如，在0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间，例如10mM)(并且不存在激活素A)一起培养不超过3周。在一个实施例中，细胞在悬浮液中与烟酰胺(例如，在0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间，例如10mM)(并且不存在激活素A)一起培养6至8天。
根据一些实施例，当细胞在非贴壁基质(例如细胞培养板)上培养时，大气氧条件为20％。但是，还设想了对大气氧条件的操纵，使得大气氧百分比小于约20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或甚至小于约5％(例如，在1％至20％、1％至10％或0％至5％之间)。根据其他实施例，细胞最初在正常大气氧条件下在非贴壁基质上培养，然后降低至低于正常大气氧条件。
非贴壁细胞培养板的实例包括由Nunc生产的细胞培养板(例如Hydrocell货号174912)等。
通常，簇包含至少约50至500,000个、50至100,000个、50至50,000个、50至10,000个、50至5000个或50至1000个细胞。根据一个实施例，簇中的细胞未组织为层，而是形成不规则的形状。在一个实施例中，簇基本上不含多能胚胎干细胞。在另一个实施例中，簇包含少量多能胚胎干细胞(例如，不超过5％或不超过3％(例如0.01％至2.7％)的在蛋白质水平上共表达OCT4和TRA-1-60的细胞)。通常，簇包含在烟酰胺的影响下已经部分分化的细胞。此类细胞主要表达神经和视网膜前体标志物，诸如PAX6、Rax、Six3和/或CHX10。
簇可以使用本领域已知的酶法或非酶法(例如，机械)解离。根据一些实施例，细胞被解离使得它们不再处于簇中，例如2至100,000个细胞、2至50,000个细胞、2至10,000个细胞、2至5000个细胞、2至1000个细胞、2至500个细胞、2至100个细胞、2至50个细胞的聚集体或团块。根据一个特定实施例，细胞处于单细胞悬液中。
然后将细胞(例如解离的细胞)接种在贴壁基质上并且在烟酰胺(例如，在0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间，例如10mM)存在下(并且不存在激活素A)培养。该浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。该阶段可以实施至少1天，更优选地两天、三天、1周或甚至14天。优选地，细胞在烟酰胺存在下(并且不存在激活素)培养不超过3周。在一个示例性实施例中，该阶段实施6至7天。
根据其他实施例，当细胞在非贴壁基质(例如层粘连蛋白)上培养时，大气氧条件为20％。它们可以被操纵，使得大气氧含量小于约20％、15％、10％，更优选小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％，并且更优选地小于约5％(例如，在1％至20％、1％至10％或0％至5％之间)。该量可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
根据一些实施例，细胞最初在正常大气氧条件下在贴壁基质上培养，随后将氧气降低至低于正常大气氧条件。
贴壁基质或物质混合物的实例可包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、聚D-赖氨酸、胶原蛋白和明胶。
步骤(b)：在定向分化的第一阶段(步骤a；即，在烟酰胺(例如，在0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间，例如10mM)存在下培养)之后，然后可通过在激活素A(例如0.01ng/ml至1000ng/ml、0.1ng/ml至200ng/ml、1ng/ml至200ng/ml，例如140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml或180ng/ml)存在下培养，以使部分分化的细胞在贴壁基质上经受进一步的分化阶段。因此，激活素A可以以0.1pM至10nM、10pM至10nM、0.1nM至10nM、1nM至10nM(例如5.4nM)的最终摩尔浓度加入。该浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
烟酰胺也可以在该阶段加入(例如，在0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间，例如10mM)。该浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。该阶段可以实施1天至10周、3天至10周、1周至10周、一周至八周、一周至四周，例如，至少一天、至少两天、至少三天、至少5天、至少一周、至少9天、至少10天、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十周。该时间段可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
根据一些实施例，该阶段实施约八天至约两周。该分化阶段可以在低或正常的大气氧条件下实施，如上文所详述。
步骤(b*)：在定向分化的第二阶段(即在贴壁基质上在烟酰胺和激活素A存在下培养；步骤(b))，进一步分化的细胞任选地在贴壁基质上在烟酰胺(例如，在0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间，例如10mM)存在下并且不存在没有激活素A的情况下培养，以经受后续阶段的分化。该浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。该阶段可以实施至少一天、2天、5天、至少一周、至少两周、至少三周或甚至四周。该分化阶段也可以在低或正常的大气氧条件下进行，如上文所详述。
ESC在其中分化的基础培养基是本领域已知的用于体外支持细胞生长的任何已知的细胞培养基，通常，培养基包含确定的基础溶液，其包括盐、糖、氨基酸以及维持细胞在培养物中处于存活状态所需的任何其他营养物质。根据一个具体实施例，基础培养基并非条件培养基。根据本发明可以利用的可商购获得的基础培养基包括(不含用于ESC分化的bFGF和TGF，包含用于ESC扩增的bFGF和TGF)、NEUROBASALTM、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、CELLGROTM干细胞生长培养基或X-VIVOTM。基础培养基可以补充有本领域已知的多种处理细胞培养物的试剂。以下是可以包括在根据本公开使用的培养物中的各种补充剂的非限制性参考：血清或含有血清替代物的培养基，诸如，但不限于此，敲除血清替代物(KOSR)、NUTRIDOMA-CS、TCHTM、N2、N2衍生物或B27或组合；细胞外基质(ECM)组分，诸如但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和明胶。然后，ECM可用于携带TGFI3生长因子超家族的一个或多个成员；抗菌剂，诸如但不限于青霉素和链霉素；以及非必需氨基酸(NEAA)，已知在促进SC存活于培养物中发挥作用的神经营养因子，诸如但不限于BDNF、NT3、NT4。
根据一些实施例，用于分化ESC的培养基为培养基(BiologicalIndustries,06-5102-01-1A)。
根据一些实施例，ESC的分化和扩增在无异种的条件下进行。根据其他实施例，增殖/生长培养基基本上不含异种污染物，即，不含动物源性组分诸如血清、动物源性生长因子和白蛋白。因此，根据这些实施例，培养在不存在异种污染物的情况下进行。美国专利申请号20130196369中提供了其他在无异种的条件下培养ESC的方法，其内容全文以引用方式并入本文。
包含RPE细胞的制备物可以按照良好生产规范(GMP)(例如，制备物符合GMP)和/或现行良好组织操作规范(GTP)(例如，制备物可以符合GTP)来制备。
在分化步骤中，可以监测胚胎干细胞的分化状态。细胞分化可以通过检查已知指示分化的细胞或组织特异性标志物来确定。
组织/细胞特异性标志物可使用本领域熟知的免疫学技术来检测[Thomson JA等人(1998).Science 282:1145-7]。实例包括但不限于用于膜结合或细胞内标志物的流式细胞术、用于细胞外和细胞内标志物的免疫组织化学以及用于分泌分子标志物的酶免疫测定。
在上述分化阶段之后，可获得包含色素细胞和非色素细胞的混合细胞群。根据该方面，将混合细胞群的细胞从平板中取出。在一些实施例中，该过程通过酶促作用来实现(例如使用胰蛋白酶(TrypLE Select)；参见例如，国际专利申请公开号WO 2017/021973，其全文以引用方式并入本文)。根据本发明的该方面，从培养物中取出(并且随后扩增)的细胞中的至少10％、20％、30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％的细胞为非色素细胞。在其他实施例中，该过程通过机械方法(例如使用细胞刮刀)来实现。在其他实施例中，该过程通过化学方法(例如，通过EDTA)来实现。还设想了酶法与化学处理的组合。例如，可使用EDTA和酶处理。此外，从培养物中取出(并且随后扩增)的细胞中的至少10％、20％或甚至30％的细胞可以是色素细胞。
根据本公开的一个方面，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％的培养物中的所有细胞被取出并且随后扩增。
混合细胞群的扩增可以在额外的细胞基质(例如明胶、胶原蛋白I、胶原IV、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白521)、纤连蛋白和聚-D-赖氨酸)上实现。对于扩增，可以在无血清的KOM、包含血清的培养基(例如包含20％人血清的DMEM)或培养基(06-5102-01-1A,Biological Industries)中培养细胞。在这些培养条件下，在合适的条件下传代后，色素细胞与非色素细胞的比率增加，使得获得纯化的RPE细胞群。此类细胞表现出RPE细胞的特征性多边形形态和色素沉着。
在一个实施例中，扩增在烟酰胺(例如，在0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间，例如10mM)存在下并且不存在激活素A的情况下实现。该浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
混合细胞群可以在悬浮液(具有或不具有微载体)或单层中扩增。混合细胞群在单层培养物或悬浮培养物中的扩增可通过本领域技术人员熟知的方法在生物反应器或多/超堆栈中被修改为大规模扩增。
根据一些实施例，扩展阶段实施至少一周至20周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或甚至10周。优选地，扩展阶段实施1周至10周，更优选2周至10周，更优选3周至10周，更优选4周至10周或4周至8周。该时间段可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
根据其他实施例，混合细胞群在扩增阶段期间传代至少1次，在扩增阶段期间传代至少两次，在扩增阶段期间传代至少三次，在扩增阶段期间传代至少四两次，在扩增阶段期间传代至少五次，或在扩增阶段期间传代至少六次。
当通过酶促方法收集细胞时，可以继续扩增8代以上、9代以上以及甚至10代以上(例如，11至15代)。总细胞倍增数可增加至30以上，例如31、32、33、34或更多。(参见国际专利申请公开号WO 2017/021973，其全文以引用方式并入本文)。
根据本文所述的方法生成的RPE细胞群可以根据许多不同的参数来表征。因此，例如，获得的RPE细胞的形状可能是多边形，并且可以为色素细胞。
应当理解，本文所公开的细胞群和细胞组合物通常不含未分化的人胚胎干细胞。根据一些实施例，少于1:250,000的细胞为Oct4+TRA-1-60+细胞，如例如通过FACS所测量。细胞也可能具有下调的GDF3或TDGF的表达(超过5000倍)，如通过PCR所测量。这一方面的RPE细胞基本上不表达胚胎干细胞标志物。所述一种或多种胚胎干细胞标志物可包含OCT-4、NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-β、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。
治疗性RPE细胞制备物相对于非RPE细胞可以是基本上纯化的，包含至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的RPE细胞。RPE细胞制备物可以基本上不含非RPE细胞或由RPE细胞组成。例如，基本上纯化的RPE细胞制备物可包含少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的非RPE细胞类型。例如，RPE细胞制备物可包含少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的非RPE细胞。
RPE细胞制剂相对于非RPE细胞以及相对于其他成熟水平的RPE细胞两者可以是基本上纯化的。制备物可相对于非RPE细胞进行实质上纯化，并且针对成熟RPE细胞进行富集。例如，在针对成熟RPE细胞富集的RPE细胞制备物中，至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99％或100％的RPE细胞为成熟RPE细胞。制备物可相对于非RPE细胞进行实质上纯化，并且针对分化的RPE细胞而非成熟RPE细胞进行富集。例如，至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的RPE细胞可以是分化的RPE细胞而非成熟RPE细胞。
本文所述的制备物可以基本上无细菌、病毒或真菌污染或感染，包括但不限于存在HIV I、HIV 2、HBV、HCV、HAV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、细小病毒B19、EB病毒或疱疹病毒1和2、SV40、HHVS、6、7、8、CMV、多瘤病毒、HPV、肠道病毒。本文所述的制备物可以基本上无支原体污染或感染。
另一种表征本文所公开的细胞群的方法是通过标志物表达来表征。因此，例如，至少80％、85％、90％、95％或100％的细胞可以表达Bestrophin 1，如通过免疫染色所测量的。根据一个实施例，80％至100％的细胞表达Bestrophin 1。
根据其他实施例，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达小眼畸形相关转录因子(MITF)，如通过免疫染色所测量的。例如，80％至100％的细胞表达MITF。
根据其他实施例，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达小眼畸形相关转录因子(MITF)和Bestrophin 1两者，如通过免疫染色所测量的。例如，80％至100％的细胞共表达MITF和Bestrophin 1。
根据其他实施例，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达小眼畸形相关转录因子(MITF)和Z0-1两者，如通过免疫染色所测量的。例如，80％至100％的细胞共表达MITF和Z0-1。
根据其他实施例，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达Z0-1和Bestrophin 1两者，如通过免疫染色所测量的。
例如，80％至-100％的细胞共表达Z0-1和Bestrophin 1。
根据另一个实施例，至少50％、60％、70％、80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达配对盒基因6(PAX-6),如通过免疫染色或FACS所测量的。例如，至少在50％与100％之间的细胞表达配对盒基因6(PAX-6)。
根据另一个实施例，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，如通过免疫染色所测量的。例如，80％至100％的细胞表达CRALBP。
根据另一个实施例，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达黑素细胞谱系特异性抗原GP100(PMEL17)，如通过免疫染色所测量的。例如，在约80％至100％之间的细胞表达PMEL17。
RPE细胞可共表达指示终末分化的标志物，例如Bestrophin 1、CRALBP和/或RPE65。根据一个实施例，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％或甚至在约50％至100％之间的所获得的RPE细胞群共表达前黑素体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)两者。
根据一个特定实施例，细胞共表达PMEL17(SwissProt编号P40967)和至少一种选自由细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP；SwissProt编号P12271)、卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT；SwissProt编号095327)和性别决定区Y框蛋白9(SOX 9；P48436)组成的组的多肽。
根据一个特定实施例，细胞群中至少80％的细胞表达可检测水平的PMEL17和上述多肽中的一者(例如CRALBP)；更优选地，细胞群中至少85％的细胞表达可检测水平的PMEL17和上述多肽中的一者(例如CRALBP)；更优选地，细胞群中至少90％的细胞表达可检测水平的PMEL17和上述多肽中的一者(例如CRALBP)；更优选地，细胞群中至少95％的细胞表达可检测水平的PMEL17和上述多肽中的一者(例如CRALBP)；更优选地，细胞群中100％的细胞表达可检测水平的PMEL17和上述多肽中的一者(例如CRALBP)，如通过本领域技术人员已知的方法(例如FACS)所测定的。
根据另一个实施例，CRALBP和上述多肽中的一者(例如PMEL17)共表达的水平(例如，如通过平均荧光强度所测量的)与未分化的ESC相比增加至少两倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，甚至更优选至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍。
在一个实施例中，RPE为终末分化的并且通常不表达Pax6。在另一实施例中，RPE细胞为终末分化的并且通常表达Pax6。
本文所述的RPE细胞还可以在移植后用作功能性RPE细胞，其中RPE细胞可以在接受移植细胞的患者中的神经感觉视网膜与脉络膜之间形成单层。RPE细胞还可以向相邻的光感受器提供营养物质，并且通过吞噬作用处理脱落的光感受器外节段。
根据一个实施例，单层中细胞的跨上皮电阻大于100欧姆。
优选地，细胞的跨上皮电阻大于150、200、250、300、300、400、500、600、700、800欧姆或甚至大于900欧姆。该电阻可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
用于测量跨上皮电阻(TEER)的装置是本领域已知的，包括例如EVOM2跨上皮细胞电阻仪(World Precision Instruments)。
在扩增阶段之后，获得包含RPE细胞的细胞群，其中至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的细胞为CRALBP+PMEL1 7+。
本领域技术人员应当充分了解，得到RPE细胞是非常有益的。它们可以用作体外模型以开发新药，促进其存活、再生和功能。RPE细胞可用于对RPE细胞具有毒性或再生作用的化合物的高通量筛选。它们可用于揭示对光感受器细胞的发育、分化、维持、存活和功能很重要的机制、新基因、可溶性或膜结合因子。
本文所述的RPE细胞还可以用作RPE细胞的无限的来源，用于移植、补充和支持视网膜变性和其他退行性疾患中功能障碍或变性的RPE细胞。此外，转基因RPE细胞可用作移植后在眼睛和视网膜中携带和表达基因的载体。
在某些实施例中，RPE细胞组合物可以按照以下方法来产生：(1)在CW平板的hUCF上，将hESC在具有人血清白蛋白(HSA)的NUT+中培养2周；(2)机械传代，以将CW平板中hUCF上的hESC在具有HSA的NUT+中扩增四至五周(或直至获得所需数量的细胞)；(3)在6cm平板的hUCF上将hESC集落(使用例如胶原酶)在具有HSA的NUT+中，再继续扩增一周；(4)具有烟酰胺(NIC)的NUT-中，通过将菌落从约五个6cm平板转移到1个HydroCell中约一周来制备球体(SB)；(5)在具有NIC的NUT-中，可通过将SB转移至6孔板的2至3个孔中约一周来将SB平铺到Lam511上；(6)在Lam511上，在具有NIC和激活素的NUT-中培养贴壁细胞约一至两周，并且将培养基替换为具有NIC的NUT-并且培养一至三周；(7)使用酶诸如TrypLE Select富集色素细胞；(8)将烧瓶中明胶上的RPE细胞在20％人血清和NUT-中扩增约二至九周(替换培养基)；以及(9)收获RPE细胞。
扩增的RPE细胞群的收获可使用本领域已知的方法(例如，使用酶诸如胰蛋白酶，或使用EDTA进行化学作用等)来实现。在一些实施例中，可使用适当的溶液诸如PBS或BSSplus来洗涤RPE细胞。在其他实施例中，可以在配制待冻存的RPE细胞组合物之前过滤RPE细胞组合物，以便在解冻后直接向受试者施用。在一些实施例中，过滤后细胞的活力百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，在中和溶液中储存约0至约8小时的过滤后细胞的活力百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在另外的实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冻存培养基中储存约0至约8小时之间的过滤后细胞的活力百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在其他实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冻存培养基中储存约0至约8小时之间的过滤后细胞的回收率百分比为至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在其他实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冻存培养基中储存约0至约8小时之间，将冻存组合物解冻后的过滤后细胞的活力百分比为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在其他实施例中，在中和培养基中储存约0至约8小时，然后在冻存培养基中储存约0至约8小时之间，将冻存组合物解冻后的过滤后细胞的回收率百分比为至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施例中，过滤后RPE细胞在中和培养基中储存约0至约8小时之间，随后在冻存培养基中储存约0小时至约8小时之间，冻存组合物解冻后能够分泌在约1500ng/ml/天至约4500ng/ml/天、约2000ng/ml/天至约3000ng/ml/天之间的PEDF。该浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。在其他实施例中，过滤后RPE细胞在中和培养基中储存约0小时至约8小之间时，随后在冻存培养基中储存约0小时至约8小时之间，冻存组合物解冻后能够在14天内扩增至至少约1.2×106个细胞至5×106个细胞、或约2.5×106个细胞至约4×106个细胞。
在一些实施例中，于室温在中和培养基中储存约0小时至约8小时之间的过滤后RPE细胞的活力百分比室温为至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，于室温在冻存培养基中储存约0小时至约8小时之间的过滤后RPE细胞的活力百分比室温为至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另外的实施例中，于室温在中和溶液中储存约0小时至约8小时之间，然后于室温在冻存培养基中储存约0至约8小时之间的过滤后细胞的活力百分比室温为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另一些实施例中，于室温在中和溶液中储存约0小时至约8小时之间，然后于室温在冻存培养基中储存约0至约8小时之间的过滤后细胞的回收率百分比室温为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、140％、150％。
收获后，可配制特定治疗剂量(例如，细胞数量)的扩增的RPE细胞群，并将其冷冻保存以运送到诊所。然后，可立即施用(RTA)的RPE细胞疗法组合物可在解冻后直接施用，而无需进一步处理。适合冻存的培养基包括但不限于90％人血清/10％DMSO、培养基3 10％(CS10)、培养基25％(CS5)和培养基1 2％(CS2)、Stem Cell Banker、PRIME XV FREEZIS、海藻糖等。
在适合解冻后立即施用(RTA)应用的冻存培养基中配制的RPE细胞可包括悬浮在腺苷、右旋糖酐40、乳糖酸、HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪N'-(2-乙基磺酸))、氢氧化钠、L-谷胱甘肽、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、氯化钙、氯化镁、氢氧化钾、氢氧化钠、二甲基亚砜(DMSO)和水中的RPE细胞。该冻存培养基的一个实例能够以商品名(例如，)商购获得，并且由BioLife Solutions,Inc生产。
在另外的实施例中，冻存培养基包括：嘌呤核苷(例如腺苷)、支链葡聚糖(例如右旋糖酐40)、两性离子有机化学缓冲剂(例如，HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪EN'-(2E-乙基磺酸)))和细胞耐受的极性非质子溶剂(例如，二甲基亚砜(DMSO))。在另一些实施例中，嘌呤核苷、支链葡聚糖、缓冲剂和极性非质子溶剂中的一者或多者通常被美国FDA认为是安全的。
在一些实施例中，冻存培养基进一步包括以下中的一者或多者：糖酸(例如，乳糖酸)、一种或多种碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾)、抗氧化剂(例如，L-谷胱甘肽)、一种或多种卤盐(例如，氯化钾、氯化钠、氯化镁)、碱性盐(例如，碳酸氢钾)、磷酸盐(例如，磷酸钾、磷酸钠、磷酸钾)、一种或多种糖(例如，葡萄糖、蔗糖)、糖醇(例如，甘露醇)和水。
在其他实施例中，糖酸、碱、卤盐、碱性盐、抗氧化剂、磷酸盐、糖、糖醇中的一者或多者通常被美国FDA认为是安全的。
DMSO可用作冷冻保护剂，防止形成冰晶，这些冰晶在冻存过程中可能杀死细胞。在一些实施例中，可冻存的RPE细胞治疗组合物包含在约0.1％与约2％(v/v)之间的DMSO。在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含在约1％与约20％之间的DMSO。在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含约2％的DMSO。在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含约5％的DMSO。
在一些实施例中，在适合解冻后立即施用应用的冻存培养基中配制的RPE细胞疗法可包括悬浮在不含DMSO的冻存培养基中的RPE细胞。例如，RTA RPE细胞治疗组合物可包含悬浮在不含DMSO(二甲基亚砜，(CH3)2SO)或任何其他偶极非质子溶剂的Trolox、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、cl-、H2P04-HEPES、乳糖酸盐、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、右旋糖酐-40、腺苷、谷胱甘肽中的RPE细胞。该冻存培养基的一个实例能够以商品名或-FRS商购获得，并且也由BioLife Solutions,Inc生产。在其他实施例中，在适合解冻后立即施用应用的冻存培养基中配制的RPE细胞组合物可包括悬浮在海藻糖中的RPE细胞。
根据本公开配制的RTA RPE细胞疗法无需在注射到受试者的眼睛之前使用GMP设施制备最终给药制剂。本文所述的RTA RPE细胞治疗制剂可以冷冻保存在无毒冷冻溶液中，该溶液包含可直接运送到临床中心的最终给药制剂。当需要时，可将制剂解冻并且施用到受试者的眼睛中，而无需执行任何中间制备步骤。
在一些实施例中，RPE细胞组合物可以冻存并且储存于约-4℃至约-200℃之间的温度下。在一些实施例中，RPE细胞组合物可以冻存并且储存于-20℃至约-200℃之间的温度下。在一些实施例中，RPE细胞组合物可以冻存并且储存于约-70℃至约-196℃之间的温度下。在一些实施例中，适合冻存的温度或冻存温度包括在约-4℃至约-200℃之间的温度、或在约-20℃至约-200℃、-70℃至约-196℃之间的温度。
在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物可以冷冻储存约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或31天。在其他实施例中，RPE细胞可冷冻储存约1.5个月至48个月。在其他实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物可冷冻储存约1个月至约48个月而不降低活力百分比或细胞回收率。在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物可以在2℃至8℃储存至少约38小时，同时保持稳定性。
在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物可以冷冻运输8000英里以上，而不降低活力百分比、细胞回收率百分比或功效。
RPE细胞可以例如根据Idelson M,Alper R,Obolensky A等人(Directeddifferentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigmentepithelium cells.Cell Stem Cell 2009；5:396-408)或根据Parul Choudhary等人(“Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal PigmentEpithelium Lineage”,Stem Cells Translational Medicine,2016)或WO 2008129554的方法来产生，所有这些文献全文均以引用方式并入本文。
RTA RPE细胞治疗组合物可任选地包含支持RPE植入、整合、存活、功效等的附加因子。在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含本文所述的RPE细胞制备物的功能活化剂。在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含烟酰胺。在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含浓度在约0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间(例如10mM)的烟酰胺。在其他实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含视黄酸。在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含浓度在约0.01mM至100mM、0.1mM至100mM、0.1mM至50mM、5mM至50mM、5mM至20mM之间(例如10mM)的视黄酸。该浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物可以配制成包括多种已被证明增加RPE细胞制备物(诸如本文所述的那些)对布鲁赫膜的粘附的整合素的活化剂。例如，在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含浓度在约5μM与1000μM之间的细胞外锰(Mn2+)。在其他实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物包含构象特异性单克隆抗体TS2/16。
在其他实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物还可以配制成包括RPE细胞免疫调节活性的活化剂。
在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物可包括ROCK抑制剂。
在一些实施例中，RTA RPE细胞治疗组合物可以在含有通过清除自由基、pH缓冲、胶体渗透/渗透支持和维持离子浓度平衡来降低冻融过程中的分子细胞应激的组分的培养基中配制。
在一些实施例中，在适合解冻后立即施用应用的冻存培养基中配制的RPE细胞疗法可包含一种或多种免疫抑制化合物。在某些实施例中，在适合解冻后立即施用应用的冻存培养基中配制的RPE细胞疗法可包含一种或多种免疫抑制化合物，这些免疫抑制化合物被配制为用于缓慢释放一种或多种免疫抑制化合物。与本文所述的制剂一起使用的免疫抑制化合物可属于以下类别的免疫抑制药物：糖皮质激素、细胞抑制剂(例如烷化剂或抗代谢物)、抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)、作用于免疫亲和素的药物(例如环孢菌素，他克莫司或西罗莫司)。其他药物包括干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、麦考酚酯和小生物制剂。免疫抑制药物的实例包括：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、BAS1L1 X(抗I L-2Ra受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、(抗I L-2Ra受体抗体)、依维莫司、麦考酚酸、(抗CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司(Tacrolimus)和/或吗替麦考酚酯。
本公开内设想的生成RPE细胞的另外的方法描述于PCT/US2018/023030(WO 2018/170494)中，其内容全文以引用方式并入本文。
本公开内设想的生成“解冻和注射”制剂的另外的方法描述于PCT/IB2018/001579(WO 2019/130061)中，其内容全文以引用方式并入本文。
在某些实施例中，RPE细胞疗法可配制为细胞浓度在约100,000个细胞/ml至约1,000,000个细胞/ml之间。在某些实施例中，RPE细胞疗法可配制为细胞浓度为约1,000,000个细胞/ml、约2,000,000个细胞/ml、约3,000,000个细胞/ml、约4,000,000个细胞/ml、约5,000,000个细胞/ml、6,000,000个细胞/ml、7,000,000个细胞/ml、8,000,000个细胞/ml、约9,000,000个细胞/ml、约10,000,000个细胞/ml、约11,000,000个细胞/ml、约12,000,000个细胞/ml、13,000,000个细胞/ml、14,000,000个细胞/ml、15,000,000个细胞/ml、16,000,000个细胞/ml、约17,000,000个细胞/ml、约18,000,000个细胞/ml、约19,000,000个细胞/ml或约20,000,000个细胞/ml。该细胞浓度可以是所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一些实施例中，RPE细胞在治疗用或药用载体或生物相容性介质中施用。在一些实施例中，向受试者施用的RPE制剂的体积在约10μl至约50μl、约20μl至约70μl、约20μl至约100μl、约25μl至约100μl、约100μl至约150μl或约10μl至约200μl之间。在某些实施例中，可施用两剂或更多剂在10μl与200μl之间的RPE制剂。在某些实施例中，将RPE制剂的体积施用于受试者眼睛的视网膜下腔。在某些实施例中，视网膜下递送方法可为经玻璃体或脉络膜上腔。在一些实施例中，对于一些受试者，可使用经玻璃体或脉络膜上腔视网膜下递送方法来减少ERM的发生率。在一些实施例中，可将RPE制剂的体积注射到受试者的眼睛中。
在一些实施例中，细胞治疗剂的RPE细胞为人RPE细胞。
在一些实施例中，RPE细胞为细胞。OpRegen为衍生自人胚胎(hESC)细胞系的RPE细胞系，其在补充有高浓度的转化生长因子β(TGF-b)家族成员激活素A以及烟酰胺的低氧(5％)培养下，然后切换为正常氧(20％)培养以富集RPE群。激活素A改善RPE细胞在刚性或硬的但非软质基质上的存活率。因此，与天然RPE细胞相比，OpRegen获得了额外的生物能力，增强了在恶劣的微环境中(诸如在其中布鲁赫膜退化并且变得刚硬或增厚的GA环境中)的存活率。在OpRegen细胞分泌的120多种已鉴定的蛋白质中，色素上皮源性因子(PEDF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、Bestrophine、血管生成素、CRLABP、TIMP-2、TIMP-1、IL-6、PMEL-1(黑素体)、整合素、TNF-a和补体保护蛋白是位居前列的高水平分泌蛋白。在第21天通过基础PEDF/VEGF比率和顶端VEGF/PEDF比率测试了其功效，其结果均>1。值得注意的是，高氧水平增加PEDF分泌。悬浮液制剂中的OpRegen在2℃至8℃下在24小时仍能产生PEDF，证明了它的稳健性。
OpRegen分泌2000ng/ml/天至4000ng/ml/天的极高水平的PEDF，这可以解释其高疗效，因为PEDF在RPE中对BRB具有抗氧化作用，这是AMD适应症所关注的。PEDF是由RPE和Muller胶质细胞在体内分泌的50kDa蛋白质；它还表现出对光感受器的神经保护功能，该功能可能通过恢复受衰老和氧化应激干扰的线粒体动力学来实现。PEDF可防止H202诱导的RPE通透性变化，并且保持RPE对氧化应激的屏障功能。PEDF通过与主因子NF-KappaB的相互作用，也是内源性抗炎因子。PEDF与细胞外基质(胶原蛋白和蛋白聚糖)结合，并且通过抑制TGF-β而在糖尿病性视网膜病变和湿性AMD中发挥抗纤维化的作用。PEDF分泌部分地支持经OpRegen治疗的受试者的结果，如具有/没有玻璃疣的受试者的荧光素血管造影(FA)结果的改善、以及早在移植后2周至4周即可见的GA病变内ECM重塑或疤痕减退的可能的迹象的OCT成像结果所证明的。
适合在本公开的范围内使用的RPE细胞不限于本文所述的RPE细胞。任何可商购获得的、或能够以其他方式获得的RPE细胞均可以使用。
在一些实施例中，本文所述的细胞治疗剂能够恢复视网膜疾病的视网膜结构。
恢复患者的视网膜的解剖结构可以与“恢复(restoration或restoring)”互换使用，并且意指与年龄匹配、性别匹配的对照、基线或对侧眼相比，恢复患者的正常结构；恢复由受影响区域中的椭球体带(EZ)变化所确定的正常解剖结构区域，由OCT证明的RPE植入，以及视网膜厚度的改善；恢复或诱导视网膜色素上皮(RPE)再生；恢复由受影响区域的椭球体带(EZ)变化所确定的正常解剖结构区域，由OCT证明的RPE植入以及视网膜厚度的改善；恢复视力；减少萎缩的视网膜中的萎缩区域；恢复视网膜的一个或多个视网膜层；恢复视网膜的光感受器；恢复视网膜的外核层(ONL)；恢复视网膜的椭球体带(EZ)；恢复视网膜的中央凹；恢复视网膜的血-视网膜屏障(BRB)；以及恢复视网膜的细胞外基质(ECM)。
恢复患者的视网膜功能意指视网膜层恢复至其正常结构，并且RPE细胞执行光吸收、上皮运输、光感受器外节段(POS)膜吞噬作用以及分析因子诸如PEDF等活动，并且光感受器具有功能活性并且能够进行光转导，从而实现功能性视觉。
“复原(recovery、recover、recovers或recovering)”意指椭球体带的复原；通过恢复正常结构得到复原；与年龄匹配、性别匹配的对照、基线或对侧眼相比；主观评估以下中的一者或多者正在变得更有条理，包括外界膜、肌样体带(光感受器的内节段)、椭球体带(IS/OS结)、光感受器的外节段、玻璃疣的丧失以及网状假玻璃疣的消失；主观评估视网膜的基础层中的一个或多个变得更有条理，包括但不限于以下中的一者或多者：外界膜、肌样体带(光感受器的内节段)、椭球体带(IS/OS结)和光感受器的外节段；证明与基线微视野检查评估相比，在RPE细胞的施用部位处或其附近的视网膜部位包括改善的微视野检查评估；椭球体带的复原，包括以下中的一者或多者的改善：EZ-RPE厚度、面积或体积测量结果；EZ-RPE中央凹平均厚度改善；EZ-RPE中央凹厚度改善；EZ-RPE中心子场体积改善；色素上皮和视网膜厚度的恢复；视网膜基础层的组织；以及12至14层视网膜中的2至6层的条理。
治疗和剂量
可以向受试者施用的活细胞的数量通常在每剂至少约50,000个与约5×106个之间。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约50,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约100,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约150,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约200,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约250,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约300,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约350,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约400,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约450,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约500,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含至少约600,000个、至少约700,000个、至少约800,000个、至少约900,000个、至少约1,000,000个、至少约2,000,000个、至少约3,000,000个、至少约4,000,000个、至少约5,000,000个、至少约6,000,000个、至少约7,000,000个、至少约8,000,000个、至少约9,000,000个、至少约10,000,000个、至少约11,000,000或至少约12,000,000个活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在50,000个与100,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在100,000个与200,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在200,000个与300,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在300,000个与400,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在400,000个与500,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在500,000个与1,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在1,000,000个与2,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在2,000,000个与3,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在3,000,000个与4,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在4,000,000个与5,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在5,000,000个与6,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在6,000,000个与7,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在7,000,000个与8,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在8,000,000个与9,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在9,000,000个与10,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在10,000,000个与11,000,000个之间的活细胞。在一些实施例中，细胞治疗剂包含在11,000,000个与12,000,000个之间的活细胞。在具体实施例中，细胞治疗剂以50,000个至1,000,000个细胞的剂量施用。在具体实施例中，细胞治疗剂以100,000个至750,000个细胞的剂量施用。在具体实施例中，细胞治疗剂以200,000个至500,000个细胞的剂量施用。这些值或范围中的每一者可包括所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一些实施例中，向受试者施用的RTA RPE制剂的体积在约50μl至约100μl、约25μl至约100μl、约100μl至约150μl、或约10μl至约200μl之间。在某些实施例中，可施用两剂在10μl与200μl之间的RTA RPE制剂。这些值或范围中的每一者可包括所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在某些实施例中，将RTA RPE制剂的体积施用于受试者眼睛的视网膜下腔。在某些实施例中，视网膜下递送方法可为经玻璃体或脉络膜上腔。在一些实施例中，可将RTA RPE制剂的体积注射到受试者的眼睛中。
在某些实施例中，RTA RPE治疗性细胞组合物可配制为细胞浓度在约100,000个细胞/ml至约1,000,000个细胞/ml之间。在某些实施例中，RTA RPE细胞疗法可以配制成细胞浓度为约1,000,000个细胞/ml、约2,000,000个细胞/ml、约3,000,000个细胞/ml、约4,000,000个细胞/ml、约5,000,000个细胞/ml、6,000,000个细胞/ml,7,000,000个细胞/ml,8,000,000个细胞/ml、约9,000,000个细胞/ml、约10,000,000个细胞/ml、约11,000,000个细胞/ml、约12,000,000个细胞/ml,13,000,000个细胞/ml,14,000,000个细胞/ml,15,000,000个细胞/ml,16,000,000个细胞/ml、约17,000,000个细胞/ml、约18,000,000个细胞/ml、约19,000,000个细胞/ml或约20,000,000个细胞/ml。这些值或范围中的每一者可包括所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，该方法包括将RPE细胞施用于受试者的眼睛。在实施例中，该方法包括将RPE细胞施用到受试者眼睛的视网膜下腔中。在实施例中，该方法包括将RPE细胞施用到受试者眼睛的玻璃体间隙、视网膜内或视网膜外、视网膜外周或脉络膜内。在实施例中，该方法包括将RPE细胞施用到GA病变上。在实施例中，该方法包括靶向受试者眼睛中的GA。在实施例中，该方法包括通过抬起GA来施用RPE细胞。在实施例中，该方法包括将RPC细胞施用到GA病变附近的周围健康组织上。在实施例中，RPE细胞作为单层施用。在一些实施例中，注射细胞组合物。
如本文所述产生的RPE细胞可以移植到受试者眼睛内或其他部位(例如大脑中)的多种靶位点。根据一个实施例，RPE细胞移植到眼睛的视网膜下腔，这是RPE的正常解剖位置(在光感受器外节段与脉络膜之间)。此外，根据细胞的迁移能力和/或正的旁分泌效应，可以考虑移植到额外的眼腔中，包括但不限于玻璃体间隙、视网膜内或视网膜外、视网膜外周或脉络膜内。
移植可通过本领域已知的多种技术来执行。执行RPE移植的方法描述于例如美国专利号5,962,027、6,045,791和5,941,250以及以下文献中：Eye Graefes Arch Clin ExpOpthalmol 1997年3月；235(3):149-58；Biochem Biophys Res Commun 2000年2月24日；268(3):842-6；Opthalmic Surg 1991年2月；22(2):102-8。用于执行角膜移植的方法描述于例如美国专利号5,755,785以及以下文献中：Eye 1995；9(Pt 6Su):6-12；Curr OpinOpthalmol1992年8月；3(4):473-81；Ophthalmic Surg Lasers 1998年4月；29(4):305-8；Ophthalmology 2000年4月；107(4):719-24；和Jpn J Ophthalmol 1999年11月-12月；43(6):502-8中。如果主要利用旁分泌效应，则细胞也可以被封装在半透性容器或可生物降解的细胞外基质中被递送并且维持在眼睛中，这也将减少细胞对宿主免疫系统的暴露(Neurotech USA CNTF delivery system；PNAS2006年3月7日第103(10)卷3896-3901)。
在一些实施例中，将细胞治疗剂植入萎缩的视网膜相邻处。
在实施例中，将细胞治疗剂施用到GA相邻处。在实施例中，将细胞治疗剂施用到GA。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约20％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约30％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约40％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约50％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约60％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约70％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约75％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约80％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约85％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约90％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约95％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约96％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约97％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约98％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的至少约99％。在实施例中，细胞治疗剂在施用后覆盖GA的约100％。
根据一个实施例，通过经睫状体平坦部玻璃体切割术，然后通过小视网膜开口将细胞递送到视网膜下腔或通过直接注射，以此来执行移植。
在某些实施例中，施用可包括玻璃体切除术，然后通过小视网膜切开术经由套管将RTA治疗性细胞组合物递送到黄斑区域的视网膜下腔中。可将总体积为50μL至100μL(取决于细胞剂量)的细胞悬液植入有潜在的GA扩增风险的区域。
在一些实施例中，执行单次外科手术，其中RTA治疗性细胞组合物在玻璃体切除术后通过小视网膜切开术沿GA区域之间的边缘(如果存在)递送到黄斑区域创建的视网膜下腔中，并且更好地保留外部中央凹视网膜和RPE层。放置眼睑窥器后，可执行标准的3端口玻璃体切除术。这可能包括放置一个23G或25G灌注导管头和两个23G或25/23G端口(套管针)。然后可使用23G或25G器械进行核心玻璃体切除术，然后分离玻璃体后缘面。可以将RTA治疗性细胞组合物注射到视网膜下腔的后极内预定位点，优选贯穿视网膜在靠近GA边缘(如果存在)的位置仍然相对保留的区域。
在一些实施例中，细胞组合物通过脉络膜上腔注射来施用。
RPE细胞可以以各种形式移植。例如，RPE细胞可以以单细胞悬液的形式、用基质或粘附在基质或膜上、细胞外基质或底物生物可降解聚合物或其组合引入靶位点中。RPE细胞也可以打印到基质或支架上。RPE细胞也可以与其他视网膜细胞一起移植(共移植)，诸如与光感受器一起移植。治疗的有效性可以通过视功能和眼功能以及结构的不同度量指标来评定，其中包括最佳矫正视力(BCVA)、视网膜对光的敏感度(如通过视野测量或微视野检查在黑暗和光适应状态下所测量的)、视野、多焦点、局灶性或图案性视网膜电图5ERG、对比敏感度、阅读速度、色觉、临床生物显微镜检查、眼底照相、光学相干断层扫描(OCT)、眼底自发荧光(FAF)、红外和多色成像、荧光素或ICG血管造影、自适应光学以及用于评定视功能和眼结构的其他方法。
可以在施用RPE细胞之前或同时向受试者施用皮质类固醇，诸如泼尼松龙或甲泼尼龙、Predforte。根据另一个实施例，在施用RPE细胞之前或同时不向受试者施用皮质类固醇，诸如泼尼松龙或甲泼尼龙、Predforte。
可以在治疗之前、同时和/或之后向受试者施用免疫抑制药物。免疫抑制药物可能属于以下类别：糖皮质激素、细胞抑制剂(例如烷化剂或抗代谢物)、抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)、作用于免疫亲和素的药物(例如环孢菌素，他克莫司或西罗莫司)。其他药物包括干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、麦考酚酯和小生物制剂。免疫抑制药物的实例包括：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、BAS1L1 X 1MABO(抗I L-2Ra受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、(抗I L-2Ra受体抗体)、依维莫司、麦考酚酸、RITUX 1MABO(抗CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司(Tacrolimus)和/或吗替麦考酚酯。
免疫抑制药物可例如局部、眼内、视网膜内或全身施用于受试者。免疫抑制药物可以通过这些方法中的一种或多种同时给药，或者递送方法可以交错使用。
替代性地，可以在不使用免疫抑制药物的情况下施用RTA RPE细胞治疗组合物。
可以在治疗之前、同时和/或之后向受试者施用抗生素。抗生素的实例包括氧氟沙星、庆大霉素、氯霉素、托百士(Tobrex)、维莫思(Vigamox)或任何其他获准用于眼部的局部抗生素制剂。
在一些实施例中，细胞组合物在施用后不会引起炎症。在一些实施例中，炎症的特征可能在于存在与炎症相关联的细胞。
在一些实施例中，恢复导致萎缩区域减小。在治疗后的特定时间，可使用眼底自发荧光(FAF)来检测任何高荧光，特别是在病变边沿周围的高荧光，并且可测量萎缩区域的大小。除病变总体大小的减小以外，病变周边高荧光边沿的大小减小或消失也可用于表明治疗正在减缓或阻止疾病进展。可测量治疗的经治疗的一半病变与未经治疗的一半病变之间的高荧光差异，并且利用其确定治疗的疗效。因此，同一只眼睛可以用作治疗对象和对照对象。
在一些实施例中，恢复导致萎缩区域减小。如本文所用的术语“减少”、“减小(reduce或reduction)”、“最小化”、“低”或“降低”是指减少至基础水平以下(例如，与对照相比)。如本文所用的术语“增加”、“高”、“更高”、“最大化”、“提高”或“升高”是指增加至基础水平以上(例如，与对照相比)。增加、提高、减少或减小可以指相对于对照或标准水平为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。这些值或范围中的每一者可包括所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在某些实施例中，治疗引起视网膜层的恢复。在另一实施例中，使用光学相干断层扫描(OCT)增强眼底自发荧光的二维成像的治疗效果评估。OCT可用于生成三维高分辨率图像，并且可为视网膜层的结构评估提供重要的横截面信息，特别是在接受视网膜疾病治疗的受试者中。使用OCT，可在针对视网膜疾患的治疗施用之前和之后获得视网膜层的轮廓图像。在健康的眼睛中，视网膜组织的每个单层可作为具有明确边界的条带观察到。相反，由AMD或GA引起的特征性缺陷，例如，可作为RPE层和光感受器层中边界清晰的退化区域观察到。在许多患有GA的眼睛中，OCT图像可显示可能形成于布鲁赫膜与外丛状层之间的楔形低反射结构。鉴别和监测此类结构可用于确定光感受器层的OCT边界，这在旨在保持AMD和GA患者的视网膜层活力的疗法的临床试验中很重要。
通过将OCT中视网膜层的分割与眼底自发荧光的代谢图谱相结合，可以更清楚地看到与功能性变化相关联的形态改变。使用专门的软件，可量化在FAF图像中观察到的病变区域并且随时间推移进行跟踪。还可鉴定治疗效果(包括覆盖病变的RPE再生区域)，并且可通过测量视网膜的厚度来量化RPE的复原。
在一些实施例中，治疗光感受器的恢复。RPE细胞参与许多对光感受器存活至关重要的过程，包括营养物质、水和离子转运、光吸收、脱落光感受器外节段(POS)的吞噬、全反式视黄醛再异构化为11-顺式视黄醛，这对于视觉周期、免疫调节、基本因子的分泌和血-视网膜屏障的形成。RPE单层用作PR与脉络膜毛细血管(CC)之间的极化代谢看门者。RPE具有顶端至基底外侧的结构和功能极性。在顶端侧，RPE细胞形成多个绒毛，能够与POS直接接触，并且将葡萄糖和维生素A等分子从脉络膜毛细血管转运至PR。在基底侧，RPE细胞将CO2、乳酸和水等代谢物转运到脉络膜毛细血管，并且产生下面的基底布鲁赫膜(BM)，该布鲁赫膜将RPE与脉络膜分离，生成血-视网膜屏障。在侧壁上，相邻的RPE细胞形成紧密的连接。屏障功能可用于通过测量细胞之间形成的紧密连接来确定RPE细胞培养物的功效。RPE紧密连接限制了离子和水在RPE单层上的细胞旁运动，并且保持RPE转运蛋白具有正确的顶端-基底分布。本文所公开的RPE细胞组合物显示的屏障功能通过产生高于100Ω的跨上皮电阻(TEER)(100Ω*cm2)的能力来确定。
此外，RPE细胞分泌多种神经营养因子，如成纤维细胞生长因子(bFGF和aFGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、色素上皮源性因子(PEDF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)等，其有助于维持脉络膜毛细血管和光感受器的结构完整性。RPE细胞还分泌抗炎细胞因子诸如转化生长因子(TGF)-β，其对于建立眼睛的免疫豁免特性很重要。本文所述的RTA治疗性细胞组合物中使用的RPE细胞能够分泌神经营养因子。本文所公开的RPE细胞组合物还分别表现出极化的PEDF和VEGF分泌，两者分别增强RPE生长和血管形成。
在某些实施例中，RPE细胞植入物通过在植入后分泌这些因子，为变性视网膜组织提供持久的营养支持。在一些受试者中，该营养支持可用于减弱视网膜退化和视觉丧失。营养因子被称为细胞存活和分化促进剂。营养因子和营养因子家族的实例包括但不限于神经营养因子、睫状神经营养因子/白血病抑制因子(CNTF/LIF)家族、肝细胞生长因子/离散因子家族、胰岛素样生长因子(IGF)家族和神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)家族。本文所述的RPE细胞可以在施用或视网膜移植后立即开始分泌营养因子。此外，当细胞整合到受体细胞之间并且与受试者的细胞建立突触接触时，可能会开始稳定的神经保护支持流。
在一些实施例中，RPE细胞的治疗/施用导致RPE细胞的多能分泌效应，如J.Cell.Mol.Med.第17卷,第7期,2013第833-843页所述，该文献通过引用全文并入本文。
在一些实施例中，治疗可引起外核层(ONL)的恢复。ONL(或外颗粒层或外核层)是脊椎动物视网膜(眼睛的光检测部分)的层之一。与内核层类似，外核层含有几层椭圆形核体；它们有两种：杆状颗粒和锥状颗粒，因其分别与下一层的杆体和锥体连接而得名。
球形杆状颗粒要多得多，并且在整个层中具有不同的水平。它们的细胞核呈现出奇特的交叉条纹外观，并且从每个细胞的任一末端延伸是一个精细的过程；外部过程与杆体和锥体层的单个杆连续；内端在外层丛状层中的扩大的末端，并且嵌入到杆状双极细胞的外部过程分解的簇中。在其过程中，它呈现出许多静脉曲张。
茎状锥颗粒数量少于杆状颗粒，位于靠近外界膜处，通过其，它们与杆体和锥体层的锥体连续。它们无任何交叉条纹，但含有梨状核，其几乎完全填充细胞。从颗粒的内端，增厚的过程进入外丛状层，并且在其中扩展到金字塔形扩大或足板，从中释放出许多细小的原纤维，这些原纤维与锥形双极的外部过程接触。
在一些实施例中，治疗可引起椭球体带的恢复，如本文其他地方所述。
在一些实施例中，治疗可引起视网膜的中央凹的恢复。
在一些实施例中，治疗可引起血-视网膜屏障(BRB)的恢复或修复，如本文其他地方所述。
在一些实施例中，恢复可引起细胞外基质(ECM)的重塑。ECM是由细胞外大分子和矿物质组成的三维网络，诸如胶原蛋白、酶、糖蛋白和羟磷灰石，为周围细胞提供结构和生化支持。由于多细胞性在不同的多细胞谱系中独立进化，因此ECM的组成在多细胞结构之间有所不同；但是，细胞粘附、细胞间通讯和分化是ECM的共同功能。
动物细胞外基质包括间质基质和基底膜。间质基质存在于多种动物细胞之间(即，在细胞间隙中)。多糖和纤维蛋白的凝胶填充间质间隙，并且用作抵抗施加在ECM上的应力的压缩缓冲器。基底膜是ECM的片状沉积物，多种上皮细胞位于其上。动物体内每种类型的结缔组织都有一种类型的ECM：胶原纤维和骨矿物质构成骨组织的ECM；网状纤维和基质(ground substance)构成疏松结缔组织的ECM；并且血浆为血液的ECM。
在一些实施例中，恢复包括以下中的一者或多者：地图状萎缩的减少的增长；视力的改善；阅读速度的改善；视网膜结构的改善；玻璃疣(由RPE细胞去除的废物)的减少；或细胞的稳定移植。
在实施例中，恢复包括地图状萎缩的减慢的增长。在实施例中，减少地图状萎缩的增长包括减小地图状萎缩的大小，诸如减小萎缩的总面积。在实施例中，减少地图状萎缩的增长包括减慢萎缩病变的增长。在实施例中，萎缩病变是分离的(独立于主要GA)。在实施例中，减少地图状萎缩的增长包括减小地图状萎缩的增长率。在实施例中，减少与对照进行比较，诸如预期增长或增长率、过去增长或增长率、未经治疗的眼睛的增长或增长率、患有类似疾病或疾患的受试者的平均增长或增长率、或可比较的受试者的增长或增长率。
在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约98％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约95％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约90％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约85％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约80％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约75％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约70％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约65％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约60％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约50％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约40％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约30％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约25％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约20％。在实施例中，地图状萎缩的增长小于对照的约10％。在实施例中，地图状萎缩的增长在对照的约1％与约99％之间。在实施例中，地图状萎缩的增长在对照的约10％与约90％之间。这些值可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，恢复包括视力的改善。在实施例中，视力的改善包括相比于对照(诸如治疗前(基线))视力的改善。在实施例中，“改善”包括视力丧失低于预期，诸如小于对照、小于未经治疗的眼、低于过去丧失率、小于患有类似疾病或疾患的受试者的平均丧失率等。在实施例中，视力的改善包括改善的通用视觉。在实施例中，视力的改善包括改善的色觉。在实施例中，视力的改善包括周边视觉的改善。在实施例中，视力的改善包括远视力的改善。在实施例中，视觉的改善包括视觉特定的社会功能的改善。在实施例中，视觉的改善包括视觉特定的心理健康的改善。在实施例中，视觉的改善包括视觉特定依赖性的改善。
在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少5％。在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少10％。在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少20％。在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少25％。在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少30％。在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少40％。在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少50％。在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少60％。在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少70％。在实施例中，视力的改善为相比于对照改善了至少80％、90％、100％。在实施例中，与对照相比，视力改善了约5％至约500％之间。在实施例中，与对照相比，视力改善了约5％至约250％之间。在实施例中，与对照相比，视力改善了约5％至约100％之间。改善可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，恢复包括阅读速度的改善。在实施例中，阅读速度的改善包括相比于对照(诸如治疗前(基线))阅读速度的改善。在实施例中，“改善”包括阅读速度损失低于预期，诸如小于对照，例如小于未经治疗的眼、低于过去损失率、小于患有类似疾病或疾患的受试者的平均损失率、小于可比较的受试者的损失率等。
在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少5％。在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少10％。在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少20％。在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少25％。在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少30％。在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少40％。在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少50％。在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少60％。在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少70％。在实施例中，阅读速度的改善为相比于对照改善了至少80％、90％、100％。在实施例中，与对照相比，阅读速度改善了约5％至约500％之间。在实施例中，与对照相比，阅读速度改善了约5％至约250％之间。在实施例中，与对照相比，阅读速度改善了约5％至约100％之间。改善可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
在实施例中，恢复包括增加视网膜的一个或多个区域的厚度、防止厚度损失、或减少厚度损失率。在实施例中，恢复包括增加视网膜的一个或多个区域的面积、防止面积损失、或减少面积损失率。在实施例中，恢复包括增加视网膜的一个或多个区域的体积、防止体积损失、或减少体积损失率。在实施例中，视网膜的区域包括萎缩的区域附近。在实施例中，视网膜的区域可以为以下中的一者或多者：总视网膜、中央凹中心、中央凹下、中央萎缩或病变、外周萎缩或病变、多发性病变、RPE、外界膜(ELM)、外核层(ONL)、外丛状层(OPL)、内核层(INL)、内丛状层(IPL)、神经节细胞层(GCL)、视网膜神经纤维层(RNFL)、内界膜(ILM)、椭球体带(EZ)、PR的内/外节段(IS/OS)。
在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少5％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少10％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少20％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少25％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少30％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少40％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少50％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少60％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少70％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了至少80％、90％、100％或更多。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了约5％至约500％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了约5％至约250％。在实施例中，视网膜区域的厚度、面积或体积相比于对照改善了约5％至约100％。改善可为所列举的范围内的任何值或子范围，包括端点。
在某些实施例中，治疗视网膜疾病或减慢其进展、维持其状态或将其逆转由微视野检查评定的视力的恢复证明。微视野检查，有时称为眼底相关视野测量，是一种视野检查，其使用几种技术之一创建失去注视物体或光源能力的人在视网膜的特定部位感知到的光量的“视网膜敏感度图”。通过微视野检查评定的视觉恢复包括视网膜对微视野检查的敏感度与视网膜解剖结构相比于基线、年龄匹配、性别匹配的对照或受试者的对侧眼的变化/缺陷之间的相关性。在某些实施例中，在某些实施例中，治疗视网膜疾病或减慢其进展、维持其状态或将其逆转由微视野检查评定的视力的恢复证明，其中或光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)中发现的视网膜解剖结构变化或萎缩面积与黄斑完整性评定(MAIA)微视野检查中的视网膜敏感度损失之间存在相关性。参见Invest Ophthalmol Vis Sci.2017May1；58(6):BIO291-BIO299。doi:10.1167/iovs.17-21834,“Correlation Between MacularIntegrity Assessment and Optical Coherence Tomography Imaging of EllipsoidZone in Macular Telangiectasia Type 2”；Mukherjee D.等人，其全文以引用方式并入本文。
在其他实施例中，椭球体带的地形图，例如，正交地形(正前)图，是由OCT体积扫描(例如，Heidelberg Spectralis OCT体积扫描(15×10°区域，30μm B超间隔)或ZeissCirrus HD-OCT 4000 512×128立方体扫描)生成的，通过将地形图与年龄匹配、性别匹配的对照、受试者的基线或受试者的对侧眼比较来证明治疗视网膜疾病或减慢其进展、维持其状态或将其逆转。EZ的组织与视网膜敏感度之间存在相关性。施用RPE细胞后，EZ区条理化，并且视网膜敏感度改善。参见例如，Retina,2018年1月；38增刊1:S27-S32.“Correlation Of Structural And Functional Outcome Measures In A Phase OneTrial Of Ciliary Neurotrophic Factor In Type 2Idiopathic MacularTelangiectasia,”Sallo FB,等人，其全文以引用方式并入本文。
在某些实施例中，治疗视网膜疾病或减慢其进展、维持其状态或将其逆转通过OCT-A得到证明，如在施用前后与年龄匹配、性别匹配的对照、受试者的基线或受试者的对侧眼相比。
例如，使用光谱域(SD)-OCT和OCT-A成像并且使用例如OCT EZ-mapping分析SD-OCT数据，以获得跨黄斑立方体的EZ-视网膜色素上皮(RPE)复合体的线性、面积和体积测量结果。OCT-A视网膜毛细管密度可使用Optovue Avanti分离谱振幅去相关血管造影算法进行测量。将EZ-RPE参数与年龄匹配、性别匹配的对照、受试者的基线或受试者的对侧眼进行比较。
在一个实施例中，施用后，EZ-RPE中央凹平均厚度改善，EZ-RPE中央凹厚度改善，EZ-RPE中心子场体积改善。EZ-RPE厚度、面积和体积与改善的视力相关，以衡量治疗应答。这些测量结果中的每一者都与视力呈负相关。例如，参见以下文献中概述的方法：InvestOphthalmol Vis Sci.2017年7月1日；58(9):3683-3689,“OCT Angiography andEllipsoid Zone Mapping of Macular Telangiectasia Type 2From the AVATARStudy,”RunkleAP.,等人，该文献通过引用全文并入本文。
在一个实施例中，复原例如为主观评估以下中的一者或多者正在变得更有条理，包括外界膜、肌样体带(光感受器的内节段)、椭球体带(IS/OS结)、光感受器的外节段、玻璃疣的丧失以及网状假玻璃疣的消失。复原还可包括主观评估视网膜的基础层中的一个或多个变得更有条理。如本文所用，视网膜的正在变得更有条理的基础层包括以下中的一者或多者：外界膜、肌样体带(光感受器的内节段)、椭球体带(IS/OS结)和光感受器的外节段。
在一个实施例中，椭球体带分析通过与年龄匹配、性别匹配的对照、基线或对侧眼相比，EZ体积减小，证明了EZ的条理化。在另一实施例中，EZ体积的减小包括至少2％、或至少5％、或至少7％、或至少10％、或在1％与5％之间、或在1％与10％之间、或在1％与50％之间、或在10％与50％之间。在另一实施例中，EZ的条理化通过例如EZ结构的体积的减小得到，参见例如基线与第2个月和第3个月结果的比较。例如，EZ的体积减少至少2％、至少5％、至少10％。这些值或范围中的每一者可包括所叙述范围内的任何值或子范围，包括端点。
在一个实施例中，复原包括以下中的一者或多者：EZ-RPE中央凹平均厚度改善，EZ-RPE中央凹厚度改善，以及EZ-RPE中心子场体积改善。EZ-RPE厚度、面积和体积与改善的视力相关，以衡量治疗应答。这些测量结果中的每一者都与视力呈负相关。
在一些实施例中，改善或恢复通过微视野检查来测量。
在微视野检查中，视网膜的特定区域受到光点的刺激，并且受试者按下按钮以确认对刺激的感知。除鉴别功能性和非功能性区域以外，还可改变刺激强度以鉴别视网膜特定区域的相对敏感度。眼底可通过红外摄像机进行监测，并且视野的敏感度可映射到眼底照片上，并且与用其他技术获得的图像进行比较。
在某些实施例中，治疗视网膜疾病或减慢其进展、维持其状态或将其逆转由微视野检查评定的视觉的复原证明，其中由微视野检查评定的视觉的复原包括视网膜对微视野检查的敏感度与视网膜解剖结构相比于基线、年龄匹配、性别匹配的对照或受试者的对侧眼的变化/缺陷之间的相关性。在某些实施例中，在某些实施例中，治疗视网膜疾病或减慢其进展、维持其状态或将其逆转由微视野检查评定的视力的复原证明，其中或光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)中发现的视网膜解剖结构变化或萎缩面积与黄斑完整性评定(MAIA)微视野检查中的视网膜敏感度损失之间存在相关性。参见Invest Ophthalmol VisSci.2017年5月1日；58(6):BIO291-BIO299.doi:10.1167/iovs.17-21834,“CorrelationBetween Macular Integrity Assessment and Optical Coherence Tomography Imagingof Ellipsoid Zone in Macular Telangiectasia Type 2”；Mukherjee D.等人，其全文以引用方式并入本文。
RPE细胞可以以各种形式移植。例如，RPE细胞可以以单细胞悬液的形式、用基质或粘附在基质或膜上、细胞外基质或底物生物可降解聚合物或其组合引入靶位点中。RPE细胞也可以打印到基质或支架上。RPE细胞也可以与其他视网膜细胞一起移植(共移植)，诸如与光感受器一起移植。治疗的有效性可以通过视功能和眼功能以及结构的不同度量指标来评定，其中包括最佳矫正视力(BCVA)、视网膜对光的敏感度(如通过视野测量或微视野检查在黑暗和光适应状态下所测量的)、视野、多焦点、局灶性或图案性视网膜电图5ERG、对比敏感度、阅读速度、色觉、临床生物显微镜检查、眼底照相、光学相干断层扫描(OCT)、眼底自发荧光(FAF)、红外和多色成像、荧光素或ICG血管造影、自适应光学以及用于评定视功能和眼结构的其他方法。
在一些实施例中，使用递送装置将细胞治疗剂植入视网膜下腔中。在一些实施例中，递送装置包括针头、毛细管和尖端。在实施例中，递送装置包括外径为约0.63mm并且内径为约0.53mm的针头、外径为约0.5mm并且内径为约0.25mm的毛细管以及外径为约0.12mm并且内径为约0.07mm的尖端。
在另一个方面，提供了一种评估如本文所示、所述或示出的视网膜疾病或疾患的进展的方法。
在一个方面，提供了一种产生如本文所示、所述或示出的细胞治疗药物的方法。
在一个方面，提供了一种根据如本文所示、所述或示出的评估度量指标来评估和改善视觉的方法。在实施例中，评估为以下中的一者或多者：地图状萎缩增长的减少，视力，阅读速度，视网膜结构，玻璃疣的减少，或细胞的稳定移植。在实施例中，评估为地图状萎缩增长的减少。在实施例中，评估为视力。在实施例中，评估为阅读速度。在实施例中，评估为视网膜结构。在实施例中，评估为玻璃疣的减少。在实施例中，评估为细胞的稳定移植。
对于本文提供的方法，在实施例中，该方法引起对植入细胞的排斥的最小迟发性炎症或无迟发性炎症。在实施例中，该方法引起对植入细胞的排斥的最小迟发性炎症。在实施例中，该方法引起对植入细胞的排斥的迟发性炎症。
对于本文提供的方法，在实施例中，该方法包括如本文所示、所述或示出的患者群体、患者特征或患者人口统计学资料。在实施例中，该方法包括如本文所示、所述或示出的患者群体。在实施例中，该方法包括如本文所示、所述或示出的患者特征。在实施例中，该方法包括如本文所示、所述或示出的患者人口统计学资。
在一些实施例中，该方法可进一步包括选择如本文所示、所述或示出的患者(受试者)、患者群体、患者特征或患者人口统计学资料。在一些实施例中，患者群体患有视网膜疾病来源或与多种病理引起的RPE损伤、功能障碍或丧失有关。在一些实施例中，患者群体患有选自由以下项组成的组中的视网膜疾病病况：干性AMD、视网膜色素变性、厄舍综合征、卵黄样黄斑病变、斯特格病、视网膜脱离、视网膜发育不良、视网膜萎缩、视网膜病变、黄斑营养不良、视锥细胞营养不良、视锥-视杆细胞营养不良、Malattia Leventinese、Doyne蜂窝状营养不良、Sorsby营养不良、图案性/蝴蝶状营养不良、Best卵黄样营养不良、北卡罗来纳营养不良、中心性晕轮状脉络膜营养不良、血管样条纹症、中毒性黄斑病变、病理性近视、视网膜色素变性和黄斑变性。在实施例中，选择患有AMD的患者。在实施例中，患者患有干性AMD。在实施例中，患者患有湿性AMD。
除上述疾病以外，可按照所述方法衡量治疗效果的非限制性疾病列表还包括：莱伯氏先天性黑蒙；遗传性或获得性黄斑变性；年龄相关性黄斑变性(AMD)；地图状萎缩(GA)；卵黄状黄斑变性；视网膜脱离；旋涡状萎缩；无脉络膜症；RPE的图案性营养不良以及其他营养不良；由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或创伤性损伤中的任一者引起的RPE和视网膜损伤；视网膜发育不良。根据一个特定实施例，疾病为干性AMD。根据另一个实施例，疾病为GA。
在实施例中，该方法包括选择患有干性AMD的患者。在实施例中，该方法包括选择患有晚期干性AMD的患者。在实施例中，该方法包括选择患有干性AMD伴GA的患者。在实施例中，该方法包括选择患有晚期干性AMD伴GA的患者。在实施例中，该方法包括选择最佳矫正视力(BCVA)为20/200或更差的患者。在实施例中，该方法包括选择最佳矫正视力(BCVA)为20/63至20/250的患者。在实施例中，该方法包括选择最佳矫正视力(BCVA)优于20/250的患者。在实施例中，该方法包括选择最佳矫正视力(BCVA)优于20/100的患者。在实施例中，该方法包括选择最佳矫正视力(BCVA)优于20/63的患者。在实施例中，该方法包括选择具有包括黄斑区域的中央GA的患者。在实施例中，该方法包括选择具有不包括黄斑区域的中央GA的患者。在实施例中，该方法包括选择患有外周GA的患者。在实施例中，该方法包括选择患有中央和外周GA的患者。在实施例中，该方法包括选择GA大小为约0.2mm2或更大的患者。
本文所述的结果支持一种独特的视角，根据该视角，根据本发明的教导内容的RPE细胞移植物可替代或补救患有视网膜病变或变性的患者的视网膜细胞。重要的是，在不完全RPE和外视网膜萎缩(iRORA)的远离原发性萎缩病变外围区域，公开了OpRegen移植后大范围消退的实例(参见例如图21)。
评定临床改善的方法
在一些实施例中，本公开提供了一种用于评定在视网膜色素上皮(RPE)细胞移植后视网膜中视网膜萎缩区域的进展的方法。该方法可以包括定义在视网膜的外界膜(ELM)边缘内的地图状萎缩或完全RPE和外视网膜萎缩(cRORA)的区域；使用光学相干断层扫描(OCT)将ELM边缘定义为萎缩的边界，其中ELM边缘下行被接受作为通过组织学对具有近全光感受器耗尽的区域的定界；利用OCT针对每次检查来标记并测量ELM边缘或ELM下行；计算检查中ELM边缘内所包括的区域(例如，以mm2为单位)，并利用计算区域的平方根变换(SQRT)来评定与眼本身相比或与对照眼相比随时间的变化；以及通过使用OCT和ELM边缘作为边界比较两个或更多个不同检查之间计算的萎缩区域来定义萎缩的进展率。
在一些实施例中，该方法可以包括手动测量并计算ELM边缘和边界内的区域。
在一些实施例中，ELM边缘的测量和计算是由OCT设备通过独立算法，并且任选地使用用于自动检测、特定层的面积和体积检测以及对生长的预测的人工智能自动进行的。
在一些实施例中，萎缩可以是根据萎缩分类会议(CAM)研究小组共识分类的不完全RPE和外视网膜萎缩(iRORA)。
在一些实施例中，以mm2为单位且通过SQRT测量萎缩区域的变化。
在一些实施例中，检查分别是在约12个月时、约24个月时和约36个月时进行的。
在一些实施例中，萎缩区域的比较可以对同一只眼使用根据萎缩区域的历史数据并使用预测萎缩区域在任何未来时间点的理论大小的SQRT线性生长计算预测的生长来进行。
在一些实施例中，用于比较地图状萎缩的生长速率的对照组为对同一只眼的生长的理论预测。
在一些实施例中，萎缩区域的比较可以使用mm2和SQRT两者经治疗的眼与对侧眼之间进行。
在一些实施例中，萎缩区域的比较可使用mm2和SQRT两者在经治疗的眼与对照眼之间进行。
在一些实施例中，萎缩区域的比较是对多只眼进行的。
在一些实施例中，第一时间点可以在RPE细胞移植之前。在一些实施例中，第一时间点可以在移植RPE细胞时。在一些实施例中，第一时间点可以在RPE细胞移植之后。
在一些实施例中，移植前的时间可以变化以囊括许多时间点，在一天至5天/周/年的范围内。在一些实施例中，移植后的时间可以变化以囊括许多时间点，在一天至10天/周/年的范围内。
在一些实施例中，第二时间点在第一时间点之后。因此，第二时间点可以是第一时间点之后一周至10年的任何时间点。在一些实施例中，第二时间点可以是RPE细胞移植后一周至10年之间的任何时间点。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于评定萎缩区域内的以区域计的视网膜的恢复或再生的方法，该方法包括使用OCT和任选地使用用于自动检测特定层的面积和体积检测以及对生长或动态的预测的人工智能的独立算法中的一种或多种。可以通过对视网膜的一次或多次检查来评定恢复或再生，该方法包括定义并使用OCT生物标志物作为任何视网膜层的边界；使用OCT来标记并测量任何视网膜层的边界；计算特定视网膜层的长度/宽度和体积；通过比较从步骤(a)至(c)计算的ELM区域来确定恢复或再生的水平；以及检测ELM的新出现的区域。
在一些实施例中，视网膜层是ONL并且该方法检测ONL的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是OPL并且该方法检测OPL的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是椭球体带并且该方法检测椭球体带的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是光感受器并且该方法检测光感受器的新出现的区域。在一些实施例中，视网膜层是RPE细胞层并且该方法检测RPE的新出现的区域。
在一些实施例中，组合计算视网膜层。
在一些实施例中，OCT检查是在约12个月时、约24个月时和约36个月时进行的。
在一些实施例中，视网膜层的比较是对同一只眼进行的。在一些实施例中，萎缩区域的比较是在经治疗的眼与对侧眼之间进行的。在一些实施例中，萎缩区域的比较是在经治疗的眼与对照眼之间进行的。在一些实施例中，萎缩区域的比较是对多只眼进行的。
在一些实施例中，RPE恢复区域包括当ELM、ONL和OPL都存在时。
在一些实施例中，新RPE的区域将通过IR成像的变化被定义为浅灰色脱色的新区域。
在一些实施例中，萎缩区域可以由保留的ONL的边缘或区域来定义。
在一些实施例中，萎缩区域可以由保留的OPL的边缘或区域来定义。
在一些实施例中，萎缩区域可以由保留的RPE的边缘或区域来定义。
在一些实施例中，萎缩区域可以由保留的ONL、ELM、OPL和RPE的任何或所有边缘或区域的组合来定义。
在一些实施例中，本公开提供一种用于通过以下方式来评定临床改善的方法：定义在视网膜的外界膜(ELM)边缘内的地图状萎缩或完全RPE和外视网膜萎缩(cRORA)的区域；使用光学相干断层扫描(OCT)将ELM边缘定义为萎缩的边界，其中ELM边缘下行被接受作为通过组织学对具有近全光感受器耗尽的区域的定界；利用OCT针对每次检查来标记并测量ELM边缘或ELM下行；计算检查中ELM边缘内所包括的区域(例如，以mm2为单位)，并利用计算区域的平方根变换(SQRT)来评定与眼本身相比或与对照眼相比随时间的变化；以及通过使用OCT和ELM边缘作为边界比较两个或更多个不同检查之间计算的萎缩区域来确定萎缩的进展率。
在一些实施例中，本公开提供了一种用于通过以下方式来评定临床改善的方法：定义并使用OCT生物标志物作为任何视网膜层的边界；使用OCT来标记并测量任何视网膜层的边界；计算特定视网膜层的长度/宽度和体积；通过比较从步骤(a)至(c)计算的ELM区域来定义恢复或再生水平；以及检测ELM的新出现的区域。
在一些实施例中，临床改善选自有或没有计算机辅助的BCVA正常光和低光、微视野检查、阅读速度、有或没有计算机辅助的颜色测试、闪烁测试、视锥细胞敏感度和视杆细胞敏感度。
在一些实施例中，视网膜萎缩区域是晚期地图状萎缩、早期地图状萎缩、高危AMD或中晚期AMD。
描述本发明预期范围的额外材料作为附录A与本文一起提交，其通过引用方式全文并入本文。
装置
对于本文提供的方法，在实施例中，该方法包括本文所述、呈现或所示的装置或设备。
在一个方面，提供装置和/或组合物用于如本文所示、所述或示出的方法、装置和组合物中。
在一些实施例中，本公开提供了一种递送装置，该递送装置与本文所述的方法中的任一者一起使用。
在一些实施例中，该装置包括针头、毛细管和尖端。在一些实施例中，该装置包括外径为约0.63mm并且内径为约0.53mm的针头、外径为约0.5mm并且内径为约0.25mm的毛细管以及外径为约0.12mm并且内径为约0.07mm的尖端。
在实施例中，物质的组合物、方法和装置可利用同种异体(“现成”)的候选物。例如，这可能意味着材料衍生自细胞系，而不是来自个体患者，与针对特定患者的治疗相比，便于大规模生产和降低生产成本。
方法、装置、组成物等可包括附图中所示的那些，这些附图以引用方式并入本文。
实例
以下实例说明了本发明的某些具体实施例，但并不意味着限制本发明的范围。
本文的实施例通过以下实例和详细方案进一步说明。然而，这些实例仅旨在说明实施例，而不应被解释为限制本文的范围。本申请中引用的所有参考文献以及公开的专利和专利申请的内容据此通过引用并入。
实例1：OpRegen的24例患者I/IIa期临床研究的中期结果
在一项在干性AMD伴GA的患者中单次注射衍生自确定的多能细胞系的人视网膜色素上皮细胞的I/IIa期开放、剂量递增安全性和功效研究中，对OpRegen进行了评定。该研究入组24例患者，将其分为4个队列。前3个队列入组患有晚期疾病的受试者。前3个队列的所有12例受试者均为法定盲人，最佳矫正视力(BCVA)为20/200或更差，并且伴有晚期GA(大小约17mm2)。第四个队列入组12例与队列1至3相比处于疾病较早期的受试者，其具有更好的视力(视力从20/63至20/250)和更小的GA区域(最大11mm2)。队列4还包括接受新型OpRegen“解冻和注射”(TAI)制剂治疗的受试者，该制剂可直接运送到场所并且在解冻后立即使用，消除了必须使用剂量制备设施的复杂操作和后勤工作。队列4的前3例受试者接受先前制剂治疗，并且队列4的最后9例受试者接受“TAI”制剂治疗。该研究的主要目的是通过治疗中出现的不良事件的发生率和频率来评定OpRegen的安全性和耐受性。次要目的是通过评估通过多种主要的临床相关方法测量的眼科参数的变化来评估OpRegen治疗的初步功效。其他目的包括使用Gyroscope SDS来评估OpRegen递送的安全性。
队列4中接受治疗的12例受试者具有更好的基线视力和更小的地图状萎缩(GA)区域。在队列1至3中，基线时为法定盲人的受试者由于进行性GA，视力(VA)下降按预期发生。在队列4中GA区域较小且基线最佳矫正视力(BCVA)较高的受试者，在12例受试者中的11例(92％)中观察到BCVA的改善或持续(范围为-7至+19个ETDRS字母)。OpRegen在所有接受治疗的受试者中耐受性良好(N＝24)，包括2例免疫抑制较少(COVID或其他健康状况)的受试者。未观察到急性或迟发性炎症和持续眼压(IOP)升高。所有受试者都报告了至少一例不良事件(AE)，但是，大多数AE是轻度的(87％)。眼相关疾患系统中的AE(n＝165例事件)包括：在接受经睫状体平坦部玻璃体切割术(PPV)治疗的受试者中，n＝136(n＝17例受试者；54.7年F/U)；在接受Orbit SDS治疗的受试者中，n＝29(n＝7例受试者；6.9年F/U)。持续的视网膜下色素沉着表明OpRegen具有多年的耐久性。在一些受试者中继续观察到改善的解剖结构和功能，包括：玻璃疣的减少，光感受器和RPE层恢复，接受治疗区域的GA进展的局部减慢，通过ETDRS评分和阅读速度所评估的更好的视力，以及改善的NEI视功能问卷(VFQ-25)评分(美国国家眼科研究所视觉功能问卷25项版本(NEI VFQ-25)2000版-调查人员施用格式)。治疗后手术干预发生于四个病例中(4例受试者中的5例事件)中，包括；手术剥离了3个视网膜前膜(ERM)(在17例受试者中的15例中观察到ERM，大多数在临床上不显著)，在经由PPV视网膜切开术接受细胞的17例受试者中的2例中观察到视网膜脱离(RD)，在三例接受Orbit SDS治疗的受试者中观察到治疗反应性脉络膜新生血管(CNV)，他们都接受了经批准的抗VEGF的单次施用。OpRegen TAI制剂在7例接受Orbit SDS和2例接受PPV治疗的受试者中施用。在4例接受Orbit SDS/TAI治疗的受试者中观察到视网膜下液的缓慢吸收，无后遗症。临床获益评估正在进行中，除标准FAF测量外，还利用详细的OCT分析。对受试者的长期随访正在进行中。
作为施用最低有效剂量和最短持续时间的免疫抑制疗法的持续努力的一部分，仅在队列4受试者的围手术期大约3个月期间利用免疫抑制。值得注意的是，一例OpRegen患者在基线时接受了改良的免疫抑制方案，该方案不包括他克莫司，而是仅包括吗替麦考酚酯，在移植后4.5个月未显示出任何急性或迟发性炎症或OpRegen细胞排斥的迹象。一例患者在治疗后不久被诊断出患有COVID，停止所有免疫抑制疗法，并且在该患者无症状后，恢复免疫抑制疗法。第二例患者在手术后4.5个月同样未表现出急性或迟发性炎症或OpRegen细胞排斥的迹象。除上述减少方案外，免疫抑制剂按计划停用(通常在术后90天内)，并且未报告由OpRegen引起的急性或延迟性排斥或炎症病例。
九例受试者接受新型OpRegen“解冻和注射”(TAI)制剂治疗，7例受试者使用Gyroscope OrbitTM视网膜下递送系统(Orbit SDS)进行治疗。显示了治疗后3个月(图1)和9个月(图2)时经治疗的眼的GA内色素沉着区域的代表性FP图像。色素沉着区域是GA内存在RPE细胞的证据。
总体而言，在队列4受试者的经治疗的眼中，12只眼中有11只(92％)在移植后4.5个月至>3年处于或高于基线视力。最佳矫正视力(BCVA)的改善在早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)图表上达到+19个字母。相比之下，在受试者的未经治疗的眼中，12只眼中有11只(92％)在同一时间点低于基线输入值。在新报告的数据中，最近接受治疗的队列4受试者中有三例(50％)在至少4.5个月的末次计划评估中表现出BCVA的显著改善，范围为+7至+16个字母。队列4的另外两例受试者较其基线值增加了2个字母。测得一例患者比基线少7个字母。先前报告的一些受试者的视网膜的结构改善和玻璃疣密度降低仍在继续。OpRegen RPE细胞持久植入的证据在最早接受治疗的受试者中延长至5年以上。与对侧眼相比，经治疗的眼的GA进展减慢的趋势仍在继续。总体而言，OpRegen耐受性良好，无意外不良事件或严重不良事件。
下表1、2和3中的数据总结了队列4中五例受试者(14、15、13、16和17)的重新编码值的变化。在视觉类别中，所有五例受试者均得到改善。针对视觉类别合并的所有五例受试者的重新编码值的平均变化为18％。
具有视网膜恢复证据和确认的GA增长史(首次报告于9个月时)队列4受试者在第23个月继续，具有的GA区域小于基线。从治疗后9个月到23个月，该受试者的BCVA也得到额外的改善，而未经治疗的眼的视力则经历进一步下降。
队列4随时间(1至24个月)的视力的个体变化示于图3(通过ETDRS字母数量相比于基线的变化来测量)和图8(通过阅读速度来测量)中。视力的平均变化(通过ETDRS字母数量相比于基线的变化来测量)示于图5经治疗的眼中GA大小的平均变化示于图4。
本文描述的OpRegen细胞是同种异体RPE细胞的悬浮液，其具有通过支持视网膜结构和功能来抵消GA中RPE细胞损失的潜力。下表13提供了研究的资格标准、施用和目标。围手术期免疫抑制方案包括每日施用他克莫司0.01mg/kg直至术后6周，且每日施用麦考酚酯2.0g直至术后至少3个月。
表13：I/IIa期研究设计标准、施用和目标。视网膜下递送是经由玻璃体切割术/视网膜切开术(n＝17)进行的，并且仅在队列4中使用脉络膜上腔插管和Orbit(Gyroscope Therapeutics)(n＝7)。
个体受试者的数据示于图6和7A-7C。
空白问卷(美国国家眼科研究所视觉功能问卷25(VFQ-25)2000版-调查人员施用格式)与所有问题据此以引用方式并入。在筛选访视11、访视17、访视18、访视19、访视20、访视21和、访视22时进行问卷。对表4所示的项目取平均，得到VFQ-25分量表。
表4
临床试验数据的观察结果包括生活质量改善、阅读速度的改善和微视野检查的改善。
实例2：患有干性AMD伴GA的受试者的视网膜恢复
难以观察视网膜恢复，因为本文所用的细胞在FAF(用于测量GA边界的常用成像技术)下无自发荧光。利用IR进行测量从未被接受作为评估萎缩边界的方法。高分辨率OCT是FAF的替代方法，适用于测量GA病变边界和视网膜的精细层。通过这种方式使用OCT是一个较慢的手动过程，有其自身局限性，但它能够区分视网膜内单个细胞类型，如蛋糕层一样(例如：ONL、OPL、RPE)。图9、图12至14、图16、图18至22、图26至28和图30显示了基线时和治疗后萎缩区域的一些横截面和“俯瞰”视角。
受试者14在治疗后9个月和23个月时，获得OPL、ONL、ELM、RPE解剖结构的改善以及外视网膜再生/恢复(图9至图15)。类似地，在1个月时，受试者21的GA边界减少，ELM的解剖结构改善和恢复(图16和图17)，并且先前萎缩区域几乎完全恢复(与原发性GA分离)，缺失的层再生，且萎缩性病变“消失”(图18)。在治疗后2个月和3个月时观察到改善(图18至22)。在治疗过程中以及治疗后2个月和3个月，在受试者14中观察到RPE向GA的递送(图31)。
微视野检查。图15显示了恢复区域也可能具有功能性的初步证据(仅仅观察到组织并不意味着该组织是活跃的)。微视野检查涉及将一束光闪烁到视网膜上，以便对用于视觉检查的区域“绘图”。微视野检查数据难以收集，因此仅存在几例受试者在少数时间点的数据。然而，它们至少提供了一些证据，证明患者14在恢复区域具有视觉能力。
受试者22的经治疗的眼与未经治疗的眼相比，表现出视力和GA大小的改善(图23)。受试者22在治疗后3个月时的色素沉着表明存在RPE细胞(图24)。通过IR成像所测量的GA大小表明GA的边界在3个月时减小(图25)，OCT测量结果也是如此(图26至30)。
对受试者14随访35个月。在23个月时可检测到离散的组织层，但在9个月时不存在。在整个观察期间和整个萎缩(外周)区域，这一现象的实例有很多。申请人测量了该患者在治疗前一年的GA增长率，可以根据未治疗时的增长率推断该患者的GA大小。与基线相比，GA在3年内保持不变，鉴于疾病的自然病程(即情况逐渐恶化)，预计不会发生这种情况。该患者的经治疗的眼直到最近才低于基线，但仍远好于患者不再用于视觉用途的对侧眼。受试者14为原始病例并且显示出效果的持久性。
受试者21新发现。早在2.5个月时，在不同患者中发现了类似的观察结果。仅对外视网膜区域进行分析。基线表现出预期的GA/cRORA，在预期位置处丧失了ELM、EZ。三周后，观察到明显的外视网膜变化，包括ELM/EZ的明显部分重新形成。存在EZ的弥漫性增厚和非晶高反射视网膜下材料。在六周时，一些EZ变化持续存在，但也发生了EZ损失。还观察到RPE/布鲁赫膜增厚。
受试者22新发现。受试者22是一位女性，她将自己的治疗经历称为“改变人生”。在GA周围鉴别出ELM的新材料和扩展，以及GA的一些小区域或未连接至主区域的“岛状物”。到3个月时，这些岛状物在治疗后消失，支持了早期干预干性AMD将产生更好的临床结果的说法。患者22使用Orbit SDS进行治疗。
基线表现出中心GA/cRORA与多灶性附属物。通过RPE观察到EZ/ELM/超传播的预期丧失。在4周时，形成黄斑孔，并且视网膜下积液量大。在IR和OCT上鉴别出RPE表面的大量沉积物。第6周，RPE表面残留视网膜下液和新材料明显。PED很明显，包含极高反射的内部材料，可能是1型CNV。到3个月时，所有视网膜下液消退，视网膜下物质持续存在，并且出现大的中心视网膜下沉积物。存在新的上视网膜内液。到4个月时，在许多位置观察到ELM的扩展。存在增加的视网膜下物质。眼底照片上的视网膜出血可能对应于通过布鲁赫膜的1型CNV的液体区域和可能的芽体。FAF上的RPE损失总体扩大，但增加的色素沉着和ELM扩展到确定的萎缩边界中。
发明内容
在受试者14、21和22中，经移植的细胞的恢复情况覆盖GA的大部分。细胞植入似乎对实现这些结果至关重要，其对于Orbit评估具有重要意义。在观察到受试者14(具有完全覆盖的GA的患者)的恢复后，外科医生在最后7例受试者中付出更大的努力，以将细胞递送到GA上。在最后4例Orbit受试者中，仅一例成功地将细胞沉积在GA上，尽管由训练有素的外科医生负责。相比之下，两次通过PPV的手术均成功地实现了这一目标(PPV在这方面更加灵活)。在第三个病例中(Pt.#22)，使用Orbit，由完成完全覆盖的同一位外科医生实现了部分覆盖。
此时恢复与临床结果并不完全相关，但可能会得出一些有趣的联系。但是，鉴于以前从未用任何治疗AMD的其他治疗方法观察到恢复，因此没有先例可以帮助预测功能性恢复(如果发生)的动力学。
实例3：干性和湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)的关键控制终点
预期功效终点如下：主要功效终点。基于FAF的研究眼中GA病变总面积(以mm2为单位)从基线到第12个月的变化。
关键次要功效终点。1)第24个月时单眼阅读速度(研究眼)较基线的变化，如通过明尼苏达阅读测试(MNRead)或Radner阅读图表所评定的(在特定国家/地区)。2)第24个月时功能性阅读独立指数(FRII)综合评分较基线的变化。3)第24个月时正常亮度最佳矫正视力评分(NL-BCVA)较基线的变化，如通过ETDRS图表所评定的。4)第12个月和第24个月时低亮度最佳矫正视力评分(LL-BCVA)较基线的变化，如通过ETDRS图表所评定的。5)第12个月和第24个月时低亮度缺陷(LLD)较基线的变化。6)在每次计划评定时，研究眼中GA病变总面积(以mm2为单位)较基线的变化，如通过FAF所评定的(在特定地点)。7)第12个月和第24个月时单眼临界打印尺寸(研究眼)较基线的变化，如通过MNRead或Radner阅读图表所评定的(在特定国家/地区)。8)第12个月和第24个月时美国国家眼科研究所视功能问卷25项版本(NEI VFQ-25)距离活动分量表评分较基线的变化。9)如用于评定黄斑功能反应的中间视微视野检查所评定的暗点数量(仅限Oaks研究)。10)如用于评定黄斑功能反应的中间视微视野检查所评定的黄斑敏感度的变化。11)APL-2的全身血浆浓度随时间推移的变化。
安全性终点。1)眼部和全身性治疗中出现的不良事件的发生率和严重程度。2)针对APL-2的抗治疗抗体的发生率。3)研究眼中新发活动性CNV的发生率。
干性AMD研究中一些关键次要终点的详细信息如下。在第48周通过间视测微法评定的绝对暗点数量较基线的变化[时间范围：基线，第48周]。暗点是微视野检查中以黄斑为中心的测试点，报告测试范围内缺乏视网膜敏感度，在该范围内检测最多68个点。较高的结果表明绝对暗点的扩增和绝对暗点的数量较多。间视微视野检查评估仅在散瞳后对研究眼进行，并且将数据转发至中央读片中心。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。较基线的正变化表明绝对暗点的数量增加(更多缺乏视网膜敏感度)；疾病恶化。
在第48周通过间视微视野检查评定的黄斑敏感度较基线的变化[时间范围：基线，第48周]。间视微视野检查用于评估黄斑敏感度，并且仅在散瞳后对研究眼进行评估，并且将数据转发至中央读片中心。较基线的负变化表明平均黄斑敏感度降低；疾病恶化。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
在第48周时通过早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)图表所评定的最佳矫正视力(BCVA)评分较基线的变化[时间范围：基线，第48周]。BCVA评分基于在4米(m)的起始距离处评定的在ETDRS视力图表上正确读取的字母数。在散瞳之前进行BCVA评分测试。在研究眼中，BCVA评分范围为0至100个字母。在视觉图表上正确读取的字母数量越少，视觉(或视力)越差。较基线的负变化表明视力降低；疾病恶化。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
第48周时BCVA评分较基线损失少于15个字母的参与者的百分比[时间范围：第48周]。在4米(m)的起始距离处通过ETDRS评定较基线损失少于15个字母的病例。BCVA使用视力表测量，并且报告为正确读取的字母数量(范围为0至100个字母)。在视觉图表上正确读取的字母数量越少，视觉(或视力)越差。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
第48周时在低亮度条件下通过ETDRS图表评定的低亮度视力(LLVA)较基线的变化[时间范围：基线，第48周]。LLVA通过在眼睛的最佳校正上放置一个2.0对数单位的中性密度滤光片并且让参与者阅读正常照明的ETDRS图表来测量。在散瞳之前进行评估。在研究眼中，LLVA评分范围为0至100个字母。在视觉图表上正确读取的字母数量越少，视觉(或视力)越差。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
第48周时LLVA评分较基线损失少于15个字母的参与者的百分比[时间范围：第48周]。在4m的起始距离处通过ETDRS评定较基线损失少于15个字母的病例。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
第48周时通过明尼苏达低视力阅读测试(MNRead)图表或Radner阅读图表评定的双眼阅读速度较基线的变化[时间范围：基线，第48周]。MNRead敏锐度卡是连续文本阅读敏锐度卡，适用于测量正常和低视力参与者的阅读敏锐度和阅读速度。MNRead敏锐度卡由单个具有相等的字符数的简单的句子组成。利用秒表记录时间，精确至十分之一秒。无法阅读或因视觉原因未尝试的句子应记录为0(表示时间)和10(表示错误)。Radner阅读卡适合测量阅读速度、阅读视力和临界打印尺寸。当阅读时间超过20秒或参与者出现严重错误时，停止阅读测试。较基线的负变化表明双目阅读速度降低；疾病恶化。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
第48周时通过MNRead图表或Radner阅读图表评定的单眼最大阅读速度较基线的变化[时间范围：基线，第48周]。MNRead敏锐度卡是连续文本阅读敏锐度卡，适用于测量正常和低视力参与者的阅读敏锐度和阅读速度。MNRead敏锐度卡由单个具有相等的字符数的简单的句子组成。利用秒表记录时间，精确至十分之一秒。无法阅读或因视觉原因未尝试的句子应记录为0(表示时间)和10(表示错误)。Radner阅读卡适合测量阅读速度、阅读视力和临界打印尺寸。当阅读时间超过20秒或参与者出现严重错误时，停止阅读测试。较基线的负变化表明单眼阅读速度降低；疾病恶化。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
第48周时美国国家眼科研究所视功能问卷25项版本(NEI VFQ-25)综合评分较基线的变化[时间范围：基线，第48周]。NEI-VFQ-25问卷包括25个项目，基于这些项目得出总体综合VFQ评分和12个分量表：近处活动、距离活动、一般健康、通用视觉、眼痛、视觉特定的社会功能、视觉特定第心理健康、视觉特定的角色困难、视觉特定的依赖、驾驶、色觉和周边视觉。将对每个问题的回答转换为0分至100分。对于各分量表，总分＝贡献得分的项目平均值。对于各分量表和总分，得分范围：0至100，得分越高代表功能越好。较基线的负变化表明视功能降低；疾病恶化。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
第48周时NEI VFQ-25近处活动分量表评分较基线的变化[时间范围：基线，周]。NEI-VFQ-25问卷包括25个项目，基于其测量近处活动。近处活动被定义为阅读报纸上的普通印刷文字、从事需要近视力的工作或爱好或在拥挤的搁架上找物品。将对每个问题的回答转换为0分至100分。分量表＝贡献得分的项目平均值。对于该分量表，得分范围为0至100，得分越高代表功能越好。较基线的负变化表明近视觉活动能力降低；疾病恶化。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
第48周时NEI VFQ-25距离活动分量表评分较基线的变化[时间范围：基线，第48周]。NEI-VFQ-25问卷包括25个项目，基于其测量距离活动。距离活动被定义为阅读路牌或商店上的名称，以及下楼梯、台阶或路缘石。将对每个问题的回答转换为0分至100分。分量表＝贡献得分的项目平均值。对于该分量表，得分范围为0至100，得分越高代表功能越好。较基线的负变化表明远距离视觉活动能力降低；疾病恶化。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
在第48周平均功能性阅读独立(FRI)指数较基线的变化[时间范围：基线，第48周]。FRI是一份由调查人员施用的问卷，包含7个与GA AMD参与者最相关的功能性阅读活动项目。它提供一个总指数得分。对于过去7天内进行的每项FRI指数阅读活动，参与者被问及他们在多大程度上需要助视器、调整活动或其他参与者的帮助。平均FRI指数得分范围为1至4，得分越高表示独立性越强。较基线的负变化表明FRI降低；疾病恶化。由于研究提前终止，收集到截至第48周而不是第96周的数据。
实例4：用于测量厚度和面积的SD-OCT成像
确定经治疗的眼中不同视网膜层的厚度、面积和体积。SD-OCT图像使用(Spectralis；Heidelberg Engineering,Inc.,Heidelberg,Germany)捕获，黄斑体积由以中央凹为中心的20×20度视野内的512×49等间距B扫描结果组成。所有B扫描中的视网膜层均使用3D-OCTOR(由Doheny Eye Institute开发)手动分割以测量厚度和面积。具体地，使用黄斑体积中的所有B扫描手动分割外核层、光感受器内节段(肌样体带)、光感受器外节段(椭球体带状态)和RPE+玻璃疣复合体。
示例B扫描示于图33A至33C中。B型扫描(图33A)基于边界(图33B)被分成层，并且确定层厚度和面积(图33C)。厚度图显示了总视网膜、ONL、光感受器外节段、RPE+玻璃疣复合体(图34，分别从左到右)和感光器内节段的厚度。个体受试者的示例厚度图示于图35图52。结果见表5至10。
实例5：RPE治疗引起血-视网膜屏障恢复。
RPE分泌非常高水平的PEDF(测得的OpRegen水平为2000ng/ml/天至4000ng/ml/天)，其有助于其疗效。PEDF是由RPE和Muller胶质细胞在体内分泌的50kDa蛋白质，具有抗血管生成活性、光感受器的神经保护功能等有益的功能，可能通过恢复受衰老和氧化应激干扰的线粒体动力学、抗炎活性(通过其与主因子NF-KappaB的相互作用)和通过与细胞外基质(胶原蛋白和蛋白聚糖)结合的抗纤维化活性来实现。在经OpRegen治疗的受试者中，这一结果通过具有/没有玻璃疣的受试者的荧光素血管造影(FA)结果的改善、以及早在移植后2周至4周即可见的GA病变内ECM重塑或疤痕减退的可能的迹象的OCT成像结果得到证明。
受试者8的基线FA检查显示，大量荧光素染料泄漏到玻璃体腔中，阻碍了脉络膜冲洗和动脉期血管灌注的可见度，表明眼内预先存在血-视网膜屏障破坏和副炎症(图53)。移植后22个月，FA检查显示脉络膜清晰，视网膜血管灌注清晰，并且无染料泄漏到玻璃体腔内，表明OpRegen可能通过多种作用机制(诸如经由PEDF)恢复了多例受试者的破坏的BRB的完整性。图54A至54D提供了另外三个通过OpRegen细胞疗法恢复或修复BRB的案例。
受试者8是在整个后视网膜具有广泛扩散的玻璃疣的患者的典型示例。图55显示，玻璃疣消退从上部的移植区域(左上)开始，然后向下移动，清除几乎整个后段，除术后8个月仍然存在的一小条细长的带外(顶部，左二，大圆圈)。OCT成像特征与彩色眼底照相结果一致，在5.5个月(顶部，右二)和8个月(底部，右二)时；与基线(右上和右下)相比，RPE下玻璃疣明显减少或消退。宿主视网膜纹理似乎在衰减，这表明可能存在ECM重塑，部分且可能是由于高水平PEDF存在所引起的生物学效应。
在11个月时，在受试者8中，移植物在大玻璃疣消退后继续重塑宿主视网膜(图56A至56C)。FA显示染色显著减少(玻璃疣)，但是，看起来存在膜状面纱，使视网膜血管结构模糊。在22个月时，视网膜组织比基线时更清晰，可能是因为其抗炎作用，或者ECM清洁，PEDF在调节基质外周转方面起作用。
图57提供了来自早期、中期和晚期时程FA检查结果，表明视网膜健康得到显著改善，其中整个血管灌注的可视性更好，并且炎症减少。视网膜组织显得非常干净；该FA图案在先前的其他治疗模式中尚未见诸报道。这是OpRegen的治疗效果所独有的。
本文提供的所有参考文献(包括所有非专利文献、专利和专利公开)全文以引用方式并入本文。
实例6：利用外界膜(ELM)生物标志物来评定萎缩性AMD的临床试验设计
ELM生物标志物临床试验的目标
1.证明OpRegen细胞减缓萎缩区域的进展(当前萎缩性AMD临床试验的金标准)。
2.证明OpRegen细胞使在萎缩内的外视网膜以区域计恢复/再生(当前萎缩性AMD方法未解决的全新范例)。
3.按照食品药品监督管理局(FDA)和其他监管机构的要求，证明至少一些视觉功能改善的趋势。
4.将根据实例1中所述的正在进行的OpRegen 1/2a期临床试验(“正在进行的试验”)中的经验，选择方法、所选择的生物标志物和临床试验设计，以最大限度地利用前面的要点并预先指定。
实例1的1/2a期临床研究中使用的方法和生物标志物
背景。近年来，眼底自发荧光(FAF)已被用作解剖生物标志物，以测量萎缩区域并评定其随时间的进展[1-3]。
现在认为，在涉及同种异体移植RPE的正在进行的试验中，通过FAF测量萎缩病变不足以收集它们的全部功能。由于它们作为RPE细胞的早期生命阶段，它们没有足够的时间积累足够的脂褐素来自发荧光。此外，FAF没有考虑视网膜层的状态，且因此不能给出关于潜在视网膜恢复的指示。
仅使用红外成像(IR)进行测量从未被接受来评定萎缩边界。
视网膜领域的趋势已经转移到对萎缩的基于光学相干断层扫描(OCT)的测量。这是由于扫描分辨率、层检测以及专家知识的进步的改善。[4-7]对萎缩边界的测量可以非常精确，而没有潜在的伪影和对FAF的限制，同时允许同时精确评定所有视网膜层的状态[8]，特别是RPE、椭球体带(EZ)、外界膜(ELM)；外核层(ONL)和外丛状层(OPL)。
使用在地图状萎缩或cRORA(完全RPE和外视网膜萎缩)区域中布鲁赫膜上存在高反射性的新层作为移植的OpRegen RPE细胞的生物标志物可能会损害准确性，因为当前不可能使用现有技术来证明这些是实际的活细胞，而不仅仅是细胞碎片或非活细胞。
因此，为了考虑在RPE位置处的高反射性新层确实是新移植的功能性RPE，必须有外视网膜层恢复的迹象，诸如新的EZ、新的ELM、新的ONL和新的或较少下沉的OPL。
成像生物标志物：
原发：ELM边缘。ELM边缘下行被认为是对具有近全光感受器耗尽的区域的定界，且因此是cRORA萎缩的边界[9]。
在正在进行的试验中，手动测量的ELM边缘或ELM下行(逐次扫描)用于定义萎缩的边界。然而，由于扫描的分辨率/品质，精确的ELM边缘是有问题的，因此准确性可能会受到影响。尽管有此种限制，但总的来说，结果是一致的，尽管不够准确。考虑了潜在的光扫描未对准。结果是一致的，知道一些潜在的小的未对准可能存在，不能被检测到。
继发：ONL和OPL。对ONL和OPL的新区域的测量已经被用作对视网膜恢复/再生的概念的支持和证明。然而，尽管新的ONL清晰可见，甚至新的下沉较少的OPL也在许多图像上可见。为了一致性，萎缩的边界仅基于ELM，即使ELM处于不如新的ONL和OPL所建议的修复有利的位置。此种方法被认为是最保守的。
RPE：仅当ELM、ONL和OPL存在时，才考虑OpRegen细胞的RPE恢复的新区域或新RPE层，以避免对非功能细胞或可能由于细胞碎片造成的误解。
设计未来的临床试验
所选择的生物标志物和终点将最终影响未来试验的设计，这也将决定样品大小。尽管随机试验将看起来很理想，但存在许多困难：由于表型的巨大异质性，此患者群体中萎缩性进展的高度可变性将表明使用非常大量的患者。然而，即使将患者分为至少3种不同的表型(与主要的软玻璃疣相关联的GA、与网状玻璃疣相关联的GA和与混合玻璃疣相关联的GA)，招募、完成和解释仍具有挑战性。
由于其他临床试验或未来2年内可能批准的药剂(针对GA)的可用性，很难将GA患者维持在不进行长期治疗的对照组中。对这些患者来说，唯一符合伦理的解决方案将是在大约12个月的定义时间后允许转到治疗组。
尽管患者被随机分组，但由于研究的手术性质，将不可能对他们进行掩盖，因此与使用对侧眼作为研究对照相比，没有太大优点。由于当前试验中有恢复迹象的患者数量有限，因此转向更大的2b/3期研究可能还为时过早。
与对侧眼进行比较的非随机试验，具有更好的定义和预先指定的生物标志物和终点，更好的进入VA和更好的基线和历史信息，这种试验将可能会显得更可取。
试验设计：
使用研究眼本身和对侧眼的非随机对比试验。与对侧眼相比有很多优点：无需根据表型与匹配的对照眼进行比较，因为表型是相同的。它消除了长达3年保持对照眼的潜在需要。这在对照患者中是不道德的，阻止了他们经由其他试验或潜在批准的药剂在一旦可用时进行治疗。由于外科手术干预的性质，对于研究现场的人员来说，很难(如果不是不可能的话)对试验患者进行掩盖。然而，验光师和影像分级师可能会被掩盖。
解剖学终点：
一些终点将集中于病变大小的变化(临床试验中的当前金标准)和视网膜再生/恢复(全新的治疗功效范例)。
主要终点：(通过SQRT改变病变大小，以mm为单位)。主要终点是根据研究眼本身的历史进展，在某个时间点(可能是12个月)实际病变大小增长与预测增长的比较。
使用平方根变换(SQRT)，病灶大小的测量将是以mm为单位。将使用mm2和SQRT在同一患者的经治疗的眼与对侧眼之间进行萎缩区域的比较，以避免比较具有不同萎缩大小的眼的问题。
如果排除非常小和非常大的病变，则当用SQRT测量时，病变生长率被考虑在内且被认为是线性的。因此，如果眼睛未经治疗，则历史生长可以预测任何时间点的病变生长率。
此外，报告了由于使用SQRT测量的可变性而导致的潜在误差的尺寸。[8]。病变区域测量的SQRT似乎消除了基线病灶大小的混淆变量，并消除了对基于基线病灶大小将病灶分层的需要。因此，无论病变大小是否不同，研究眼和对侧眼都可以进行比较。
因此，主要终点将是通过SQRT测量的病变大小的变化，如通过OCT使用ELM的边缘测量的，与研究眼睛在12个月时的预测的生长相比(次要终点在24和36个月)。
为了精确地预测增长，将需要至少6个月的良好可靠的历史数据。如果需要的话，如果没有可用的历史数据，则患者可以在移植前6个月被招募到研究中。精确的历史数据对于试验的成功和随时间推移回归生长的准确预测至关重要。如果此信息是准确的，则萎缩生长率的变化将是可检测的和可靠的。
图11显示了正在进行的试验的患者120的研究眼和对侧眼的理论生长(虚线)。研究眼显示在M33处的实际生长比预测的生长小得多。事实上，与基线相比，3年后病变大小是相同的。对侧眼的实际生长略小于理论生长，然而它非常接近，每年仅0.1mm的差异。这支持了历史数据必须尽可能精确，并从可靠和一致的成像中获得的假设。此外，必须考虑到，应考虑到一定的误差范围并将其作为因素考虑在研究设计中。[8]
用于评定病变大小的变化的解剖学次要终点：次要终点是通过SQRT测量的病变大小的变化，其是通过OCT使用ELM的边缘相比于对侧眼的生长测量的。通过SQRT测量的病变大小的变化，其是在24个月和36个月时通过OCT使用ELM的边缘相比于研究眼的预测的生长所测量的。
用于评定视网膜再生/恢复的解剖学次要终点：通过SQRT测量的病变大小的变化，其是在12个月、24个月和36个月时通过OCT使用ELM的边缘相比于基线大小所测量的(图62)。在视网膜修复的情况下，此终点将导致负数，这将意味着病变大小的减小。
图63显示了在12、24和36个月时的活RPE的区域的在基线时的病变的边缘内/外变化(被定义为在布鲁赫膜上存在高反射单层的区域，其上存在ELM、ONL和丛状结构)。图64显示了在12个月、24个月和36个月时的ONL体积在基线时的病变的边缘内/外变化(如果存在OPL和/或ELM，则定义为ONL)。特别是在此终点，应采用自动检测和人工智能。
视觉功能次要终点：BCVA和LLVA：为了能够在12个月、24个月或36个月时检测出研究眼与比较眼(对侧眼)之间的差异，基线相对保存的视觉功能应是强制性的。因此，BCVA在基线时的进入标准应是约20/40。为了不对BCVA和LLVA的结果进行罚分，研究眼应是最差的眼。理想情况下，两只眼应具有相似的BCVA，差异少于10个字母，以始终具有可比性。
视力次要终点：
·在12个月、24个月和36个月时的BCVA和LLVA与基线相比的变化。
·在12、24和36个月时的BCVA和LLVA与对侧眼相比的变化。
微视野检查：为了能够在12个月、24个月或36个月时检测研究眼与对照眼(对侧眼)之间的差异，两只眼都必须具备进行微视野检查的基线能力以及在无能力的情况下的排除标准。
微视野检查次要终点：
·在12个月、24个月和36个月时的微视野检查与基线相比的变化。
·在12个月、24个月和36个月时的微视野检查与对侧眼相比的变化。
(患者报告的结果测量)：在研究眼是患者的最佳眼的情况下，这对于视力终点将不是优选的。
FRI-功能性阅读独立性(FRI)指数
NEI VFQ-25-国家眼科研究所视觉功能问卷；参见例如www.nei.nih.gov/sites/default/files/2019-06/vfq_sa.pdf，其通过引用全文并入本文。
发明内容
目标。评价用OpRegen细胞的移植治疗继发于AMD的地图状萎缩患者的疗效(被定义为病变生长率降低和视网膜修复/再生)以及安全性和耐受性。
阶段。2b期
研究群体和主要入选标准：
·具有双侧AMD和地图状萎缩且双眼均无渗出性AMD病史的患者。(在双侧募集太困难的情况下，作为替代选择，可以考虑第二组具有单侧GA而无渗出的患者。这些眼不能与它们的对侧眼进行比较，但是可以与双侧组的对侧眼进行比较。仅一半的次要终点将适用于该组。使用此选项，经治疗的眼的数量将是对照眼的两倍，2:1)。
·双眼的BCVA都好于20/80。
·双眼之间的差异少于10个字母。
·中央凹至少部分地被萎缩所累及(约50％)，以排除中央凹未受累且视力非常好的眼，以证明尽管基线时BCVA相对好但仍需干预，但同时可能保证对侧眼在不治疗的情况下功能下降。
·能够对双眼进行微视野检查。
试验设计：
·单掩模、非随机试验
·比较物/对照组：
ο同一只眼的GA的预测的生长和外视网膜特征的变化
οGA的对侧眼生长
ο与基线同一只眼相比的功能终点
ο与对侧眼相比的功能终点
终点
主要终点。通过SQRT测量的病变大小的变化，其是在12个月时通过OCT使用ELM的边缘相比于研究眼的预测的生长所测量的。
次要终点：
解剖学。通过SQRT测量的病变大小的变化，其是在24个月和36个月时通过OCT使用ELM的边缘相比于研究眼的预测的生长所测量的。
通过SQRT测量的病变大小的变化，其是通过OCT使用ELM的边缘相比于对侧眼的生长测量的。
通过SQRT测量的病变大小的变化，其是在12个月、24个月和36个月时通过OCT使用ELM的边缘相比于基线生长所测量的。
在12个月、24个月和36个月时的活RPE的区域在基线时的病灶的边缘内/外变化。
在12、24和36个月时的ONL体积在基线时的病变的边缘内/外变化。
功能。在12、24和36个月时的BCVA与基线相比的变化。
在12、24和36个月时的LLVA与基线相比的变化。
在12个月、24个月和36个月时的BCVA与对侧眼相比的变化。
在12个月、24个月和36个月时的LLVA与对侧眼相比的变化。
在12个月、24个月和36个月时的微视野检查与基线相比的变化。
在12个月、24个月和36个月时的微视野检查与对侧眼相比的变化。
(生活质量，仅在最好的眼将得到治疗的情况下，不太可能，且也不是视力终点的最佳情况)。
FRI测试从基线到12个月、24个月和36个月的变化。
NEI VFQ-25测试从基线到12个月、24个月和36个月的变化。
实例7：OpRegen在继发于年龄相关性黄斑变性(AMD)的地图状萎缩(GA)中的安全性和活性的1/IIa期研究的额外数据
如上所述，I/IIa期研究是开放、单组、多中心、剂量递增的试验，评估在具有双侧GA的患者中视网膜下递送的OpRegen的单次施用。二十四例患者被纳入4个队列。前3个队列仅招募最佳矫正视力(BCVA)为20/200或更差的法定失明患者。第四队列纳入了12例视力受损患者(BCVA从20/65到20/250，GA平均面积较小)。队列4还包括接受新型OpRegen“解冻和注射”制剂治疗的患者，该制剂可直接运送到场所并且在解冻后立即使用，消除了必须使用剂量制备设施的复杂操作和后勤工作。该研究的主要目的是通过治疗中出现的不良事件的发生率和频率来评定OpRegen的安全性和耐受性。次要目的是通过评定通过多种主要的临床相关方法测量的眼科参数的变化来评定OpRegen治疗的初步活性。
基线特征和后续研究示于下表14中。与队列4相比，队列1至3中观察到更严重的疾病。
表14：基线特征和研究随访
a选择基于BCVA较差的眼睛进行OpRegen视网膜下递送。b基于眼底自发荧光成像的中央分级。
提供了安全性总结，并且表明OpRegen具有很好的耐受性和可接受的安全性特征。所有24例(100％)经治疗的患者均报告了≥1AE和≥眼部AE(最常见的全身性AE为URTI(n＝7)，并且最常见的眼部AE为结膜出血/充血(n＝17)和ERM(n＝16))。报告的大多数AE(队列1至3为87％；队列4为93％)是轻度的。未报告与免疫抑制方案相关的AE簇。一例患者因Ae(与治疗无关的IV期肺腺癌)而停止研究。未报告OpREgen视网膜下递送后出现排斥的病例。没有观察到急性或迟发性眼内炎症，或持续的眼内压升高。
在OpRegen情况下的眼部AE报告于下表15。
表15：在OpRegen情况下的眼部AE主要与视网膜下递送的外科手术有关。
a队列1至3中的7/12(58％)的患者和队列4中的5/12(42％)的患者在基线时有ERM；队列1至3中有6/10例患者报告了ERM AE，且队列4中有2/6的患者具有早先存在的ERM。b有临床意义表明ERM需要手术干预。
OpRegen向GA区域和中央凹的视网膜下递送显示，随着外视网膜结构区域的改善，视觉功能获得更大的改善。队列4中的五例患者将已经OpREgen递送至大部分或全部GA区域，包括中央凹。这五例患者在视觉功能方面获得了更大的增益(平均为12.8的字母增益)，通过SD-OCT评定了外视网膜结构明显改善的区域的证据(图69)。
该研究进一步包括对OpRegen递送后GA的评定，并提供了SD-OCT相对于眼底自发荧光(FAF)成像的优点(图70)。OpRegen中同种异体hESC衍生的RPE细胞是年轻的，具有低脂褐素含量，且因此OpRegen RPE细胞在视网膜下递送后不容易被标准FAF检测到。在RPE/布鲁赫膜上可以看到更大的高反射率(图71)。SD-OCT成像建议OpRegen出现在前GA的区域中。在OpREgen递送至GA区域的情况下，通过SD-OCT提供了外视网膜结构的改善。如图72所示，RPE层的局灶性破裂、脉络膜超传播和基线时的外视网膜下沉在12个月时不再存在，并且通过显著的玻璃疣和脉络膜血管标记的存在确认了扫描记录。此外，如图73A和图73B所示，对12个月与基线进行比较，并观察到以下情况：cRORA的特征不再存在，在RPE/布鲁赫膜的水平下存在更大的高反射率，脉络膜超传播更少，视网膜下沉得到解决，外视网膜层连续性更大，并且在该病例中在GA的鼻侧、上侧和下侧边缘处也观察到类似的特征。图74显示了中央凹中心附近的外视网膜层的改善。
来自该I/IIa期研究的12个月主要终点数据表明，OpRegen具有很好的耐受性，且具有可接受的安全性和大多数轻度的AE。在OpRegen情况下观察到的眼部AE主要与用于视网膜下递送的外科手术有关。在GA和视力受损的患者中观察到在OpREgen情况下外视网膜结构和视觉功能改善的初步证据(队列4；n＝12)。所有24例经治疗的患者都报告了至少一次不良事件(AE)和至少一次眼部AE。在OpRegen情况下报告的大多数AE为轻度(队列1至3，87％；队列4，93％)，并且免疫抑制方案具有很好的耐受性。在OpRegen情况下观察到的眼部AE主要与用于视网膜下递送的外科手术有关，其中最常见的是结膜出血/充血(n＝17)和视网膜前膜(n＝16)。一例患者因与治疗无关的AE而中止研究。尚未报告OpRegen视网膜下递送后出现排斥、急性或迟发性眼内炎症或眼压持续升高的病例。在患有GA和在基线时视力受损的患者中观察到视觉功能改善的初步证据(队列4[n＝12])。队列4中的患者在12个月时在研究眼的视力方面具有平均7.6的字母增益。队列4中的三例患者(25％)在12个月时在研究眼的视力方面具有15个字母或更大的增益。队列4中OpRegen递送至大部分或全部GA区域(包括中央凹)的五例患者在视觉功能方面有更大的增益(平均12.8的字母增益)，通过SD-OCT评定了外视网膜结构明显改善的区域的证据。这些数据支持OpRegen在GA中减缓、停止或逆转疾病进展的潜力。需要在更大的受控的临床研究中进一步评定干预的最佳疾病阶段、视网膜下递送的外科手术和OpRegen的靶向递送位置，以证实这些发现。
这些数据支持OpRegen在GA中减缓、停止或逆转疾病进展的潜力。
参考文献：
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3.Jaffe,G.J.,等人,C5 Inhibitor Avacincaptad Pegol for GeographicAtrophy Due to Age-Related Macular Degeneration:A Randomized Pivotal Phase 2/3Trial.Ophthalmology,2021.第128卷，第4期：第576-586页。
4.Sadda,S.R.,等人,Consensus Definition for Atrophy Associated withAge-Related Macular Degeneration on OCT:Classification of Atrophy Report3.Ophthalmology,2018.第125卷，第4期：第537-548页。
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Retina,2018.第38卷，第10期：第1937-1953页。

Claims (36)

1.一种用于评定在视网膜色素上皮(RPE)细胞移植后受试者的视网膜中视网膜萎缩区域的进展的方法，所述方法包括
a)在第一时间点，定义在视网膜的外界膜(ELM)边缘内的地图状萎缩或完全RPE和外视网膜萎缩(cRORA)的区域；
b)使用光学相干断层扫描(OCT)来标记并测量ELM边缘或ELM边缘下行，其中所述ELM边缘为所述萎缩的边界，且所述ELM边缘下行为通过组织学对具有接近全部光感受器耗尽的区域的定界；
c)计算所述ELM边缘的内部所包括的区域以定义第一计算区域，并确定所述第一计算区域的平方根变换(SQRT)；以及
d)通过将所述第一计算区域的所述SQRT与对照进行比较来定义所述萎缩的进展率。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在第二时间点重复步骤a)至c)以确定第二计算区域的SQRT，其中所述对照为所述第二计算区域的所述SQRT。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照为所述视网膜的历史进展率。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照为对照视网膜的进展率。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述对照视网膜为所述受试者的未经治疗的视网膜。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中对所述ELM边缘的测量和对所述第一计算区域的计算是手动进行的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中对所述ELM边缘的测量是由OCT设备通过独立算法自动进行的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中对ELM边缘的测量和计算是使用用于自动检测、特定层的面积和体积检测以及对生长的预测的人工智能来进行的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述萎缩为根据萎缩分类会议(CAM)研究小组共识分类的不完全RPE和外视网膜萎缩(iRORA)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中以mm2为单位且通过SQRT来测量视网膜萎缩区域的进展。
11.根据权利要求2所述的方法，其中步骤a)至c)是在第三时间点进行的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一时间点、所述第二时间点和所述第三时间点分别为移植后约12个月、约24个月和约36个月。
13.根据权利要求3所述的方法，其中所述历史进展率为根据萎缩区域的历史数据的并使用预测所述萎缩区域在任何未来时间点的理论大小的SQRT线性生长计算预测的生长。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于比较地图状萎缩的生长率的对照组为对同一只眼的生长的理论预测。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对萎缩区域的比较是使用mm2和SQRT两者在所述受试者的经治疗的眼与对侧眼之间进行的。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中计算是以mm2为单位进行的。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对萎缩区域的比较是对多只眼进行的。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一时间点是在移植RPE细胞之前。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一时间点是在移植RPE细胞当时。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一时间点是在移植RPE细胞之后。
21.一种用于评定萎缩区域内的多个区域中的视网膜的恢复或再生的方法，所述方法包括
a)定义并使用OCT生物标志物作为任何视网膜层的边界；
b)使用OCT来标记并测量任何视网膜层的边界；
c)计算特定视网膜层的长度/宽度和体积；
d)通过比较从步骤(a)至(c)计算的ELM区域来定义恢复或再生的水平；以及
e)检测ELM的新出现的区域。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述视网膜层为ONL，并且所述方法检测ONL的新出现的区域。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述视网膜层为OPL，并且所述方法检测所述OPL的新出现的区域。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述视网膜层为椭球体带，并且所述方法检测所述椭球体带的新出现的区域。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述视网膜层为光感受器，并且所述方法检测光感受器的新出现的区域。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述视网膜层为RPE细胞层，并且所述方法检测RPE的新出现的区域。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中组合计算所述视网膜层。
28.根据权利要求21至27所述的方法，其中OCT检查是在约12个月时、约24个月时和约36个月时进行的。
29.根据权利要求21至28所述的方法，其中对视网膜层的比较是对同一只眼进行的。
30.根据权利要求21至29所述的方法，其中对萎缩区域的比较是在经治疗的眼与对侧眼之间进行的。
31.根据权利要求21至30所述的方法，其中对萎缩区域的比较是在经治疗的眼与对照眼之间进行的。
32.根据权利要求21至30所述的方法，其中对萎缩区域的比较是对多只眼进行的。
33.根据权利要求21至32所述的方法，其中RPE区域恢复是当ELM、ONL和OPL都存在时。
34.一种根据权利要求1的用于评定临床改善的方法，其中所述临床改善选自由以下项组成的组：有或没有计算机辅助的BCVA正常光和低光、微视野检查、阅读速度、有或没有计算机辅助的颜色测试、闪烁测试、视锥细胞敏感度和视杆细胞敏感度。
35.一种根据权利要求21的用于评定临床改善的方法，其中所述临床改善选自由以下项组成的组：有或没有计算机辅助的BCVA正常光和低光、微视野检查、阅读速度、有或没有计算机辅助的颜色测试、闪烁测试、视锥细胞敏感度和视杆细胞敏感度。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述视网膜萎缩区域为晚期地图状萎缩、早期地图状萎缩、高风险AMD或中晚期AMD。
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