CN110913874A - 用于测量视网膜疾病疗法的疗效的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了使用RPE细胞治疗视网膜疾病或病症的组合物和方法。

Description

用于测量视网膜疾病疗法的疗效的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年3月16日提交的美国临时专利申请序列号62/472,544，2017年5月4日提交的美国临时专利申请序列号62/501,690和2017年11月13日提交的美国临时专利申请序列号62/585,520的优先权和权益，其全部内容各自通过引用并入本文。

背景技术

本公开通常涉及治疗视网膜疾病的领域，更具体地涉及使用使用衍生自人胚胎干细胞的视网膜色素上皮(RPE)细胞组合物治疗视网膜疾病。

RPE细胞功能障碍、变性和丢失是视网膜疾病(例如AMD、贝斯特病和视网膜色素变性(RP)的亚型)的显著特征。AMD是在西方世界导致视力障碍的主要原因。在75岁以上的人群中，有25-30％的人会受到年龄相关性黄斑变性(AMD)的影响，具有渐进性中央视力丧失而导致6-8％的患者失明。视网膜变性主要累及黄斑，黄斑是视网膜的中央部分，负责精细的视觉细节和颜色感知、面部识别、阅读和驾驶。干燥形式的AMD是由RPE的增生以及在RPE下方或Bruch膜内由代谢终产物组成的玻璃疣沉积形成而引发。该疾病可能会逐渐进展到地图样萎缩(geographic atrophy)(GA)的晚期，随着较大黄斑区域的RPE细胞和感光细胞变性，导致中央视力丧失。

该疾病的发病机制涉及四个功能相关组织的异常，即视网膜色素上皮(RPE)、Bruch膜、脉络膜毛细血管和感光细胞。然而，RPE细胞功能受损是导致临床相关AMD改变的分子途径中的一个早期且至关重要的事件。

目前尚无有效或已获批的用于干性-AMD的治疗。预防措施包括维生素/矿物质补充剂。这些降低了发生湿性AMD的风险，但是不影响地图样萎缩进展的发展。

在中央凹(fovea)的中央未受影响的情况下，最佳校正视敏度(BCVA)评分也可能不会受影响，因为BCVA是中央凹中心视敏度的度量。尽管BCVA作为视觉功能的关键指标已被全世界的临床界和监管机关广泛接受，并代表了判断视网膜疾病治疗的功效的金标准，但有时其无法评估全面视觉功能的细微差别。已经证明，在BCVA为20/50或更高的受试者中，视觉功能的其他特征可能显著受损，包括对比灵敏度、低亮度BCVA和阅读速度。此外，仅靠最佳校正视敏度不能充分衡量所有受试者中视力障碍的进展，包括那些患有中央凹GA的受试者。

发明内容

已经开发了用于治疗视网膜疾病和病症的视网膜色素上皮(RPE)细胞和RPE细胞组合物，包括防止视网膜变性进展和视力丧失。当向有需要的受试者施用时，这些RPE细胞和细胞组合物安全地促进眼结构的植入、整合、存活和功能。

可以使用评估定量形态的技术检测和监控视觉功能受损、视网膜疾病进展和视网膜疾病治疗效果，即使在BCVA未受损的受试者中也是如此。旨在量化视觉功能变化并将其与疾病进展关联的涉及患有AMD和GA的受试者的临床研究可以纳入另外解释所述疾病的潜在病理生理过程的评估。本文还公开了使用改进的定量结构和功能评估来测量视网膜疾病疗法的治疗作用的方法。

根据一些方面，本文提供了治疗或延缓视网膜疾病或病症进展的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效量的包含视网膜色素上皮(RPE)细胞的药物组合物。

在一些实施方式中，所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致从基线所测量的最佳校正视敏度(BCVA)约1天至约3个月、1天至约15个月或从1天至约24个月或约从90天至约24个月不降低。

在一些实施方式中，所述受试者包括BCVA为20/64或更低；20/70或更低；或者约20/64至约20/400之间。

在一些实施方式中，所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致从基线所测量的最佳校正视敏度(BCVA)约1天至约15个月，或从约1天至约24个月或从约90天至约24个月保持稳定。

在一些实施方式中，所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致约89％至约96％的受试者色素沉着增加。在其他实施方式中，所述色素沉着增加保持(maintain)至少约6个月至约12个月，或从约90天至约24个月。在另外的其他实施方式中，所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致视网膜色素沉着。

在进一步的实施方式中，所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致从基线所测量的视网膜色素沉着增加至少约2个月至约1年，或从90天至约24个月。在其他实施方式中，施用后约2至约12个月，视网膜色素沉着为稳定的持续从约90天至约24个月。在又另一个实施方式中，施用后约3至约9个月，所述视网膜色素沉着为稳定的。

根据本公开的一些方面，在其中施用了所述细胞的小泡(bleb)内的视网膜下液在小于48小时内被吸收。

根据其他方面，所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致椭圆体带的恢复。在又其他方面，椭圆体带的恢复包括根据椭圆体带分析的恢复。

在一些实施方式中，椭圆体带的分析包括对所述椭圆体带的目测分析，其中将受试者的所述椭圆体带与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼进行比较。

根据进一步的实施方式，通过与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼相比正常结构的重塑指示恢复。根据其他实施方式，恢复包括以下一个或多个变得更加有序的主观评估，包括外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)、感光细胞的外段、玻璃膜疣消失和网状假性玻璃膜疣消失。在一些实施方式中，恢复包括一个或多个视网膜的基本基础层变得更加有序的主观评估。

根据某些实施方式，变得更加有序的所述视网膜的所述基本基础层包含外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)和感光细胞的外段的一个或多个。

根据其他实施方式，新的或恶化的ERM在施用约1周至约12个月内，或从约1周至约24个月内，或从约90天至约24个月内无需手术移除。

根据一些实施方式，所述RPE细胞在施用约1周至约1年内，或从约1周至约24个月内，或从约90天至约24个月内不显示出致肿瘤性。

根据一些实施方式，所述RPE细胞在施用约9个月内显示出从0％至约5％的组织学致肿瘤性。

根据一些实施方式，所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞不会导致视网膜破坏或破裂。

根据一些实施方式，所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞不会导致视网膜水肿。

根据一些实施方式，所述治疗有效量的RPE细胞是每次施用约50,000至5,000,000个细胞之间。

根据一些实施方式，所述治疗有效量的RPE细胞是每次施用约200,000个细胞。

根据一些实施方式，所述治疗有效量的RPE细胞是每次施用约500,000个细胞。

根据一些实施方式，所述药物组合物包含约500个细胞每μl至约10,000个细胞每μl。

根据一些实施方式，当所述量是每次施用50,000个细胞时，所述药物组合物包含约500-1,000个细胞每μl。

根据一些实施方式，当所述量是每次施用200,000个细胞时，所述药物组合物包含约2,000个细胞每μl。

根据一些实施方式，当所述量是每次施用500,000个细胞时，所述药物组合物包含约5,000个细胞每μl。

根据一些实施方式，当所述量是每次施用1,000,000个细胞时，所述药物组合物包含约10,000个细胞每μl。

根据一些实施方式，至少95％的所述细胞共表达前黑素体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)。

根据一些实施方式，所述细胞对所述受试者的跨上皮电阻大于100欧姆。

根据一些实施方式，所述RPE细胞由人胚胎干细胞的离体分化产生。

根据一些实施方式，施用包括：植入RPE细胞。

根据一些实施方式，本文所述的方法还包括在RPE细胞植入前，制备所述RPE剂量。根据一些实施方式，制备所述RPE剂量包括解冻所述剂量。根据一些实施方式，制备所述RPE剂量包括将所述RPE细胞混合并加载到递送装置中。

根据一些实施方式，本文所述方法还包括在RPE细胞植入之前，进行玻璃体切除术。根据一些实施方式，进行玻璃体切除术包括施用曲安西龙以染色玻璃体和移除玻璃体牵引。

根据某些实施方式，本文所述的方法还包括在植入RPE细胞之前，清洁手术部位。

根据一些实施方式，本文所述的方法还包括在植入RPE细胞之后，清洁手术部位。

根据一些实施方式，施用包括：清洁手术部位，进行玻璃体切除术，制备RPE剂量和RPE细胞植入。

根据一些实施方式，植入RPE细胞包括将所述RPE细胞注射到距地图样萎缩(GA)病变的边缘至少1-视盘直径处。

根据一些实施方式，植入RPE细胞包括以以下一种或多种注射所述RPE细胞：覆盖GA病变，覆盖中央凹，覆盖与所述GA病变毗邻的部分或全部过渡区，或覆盖与GA病变邻近的周围健康组织。

根据一些实施方式，所述过渡区包含完整和变性视网膜之间的区域。

根据一些实施方式，覆盖GA病变包括用小泡覆盖整个GA病变。根据其他实施方式，GA尺寸包括从0.1mm²至约50mm²；从约0.5mm²至约30mm²；从约0.5mm²至约15mm²；从约0.1mm²至约10mm²；从约0.25mm²至约5mm²或者两点之间的任一点。

根据一些实施方式，施用包括：施用RPE细胞使得维持(preserve)黄斑中央视力。

根据一些实施方式，通过以下步骤产生所述RPE细胞：(a)在含有烟酰胺的培养基中培养人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞，以产生分化细胞；(b)在含有烟酰胺和激活素A的培养基中培养所述分化细胞，以产生进一步向RPE谱系分化的细胞；和(c)在含有烟酰胺的培养基中培养进一步向所述RPE谱系分化的所述细胞，其中所述培养基不含激活素A。

根据一些实施方式，所述胚胎干细胞或诱导的多能干细胞在非贴壁条件下在含有bFGF和TGFβ的培养基中繁殖。根据进一步的实施方式，(a)的所述培养基基本上不含激活素A。

根据一些实施方式，所述细胞以单次施用的方式施用。根据一些实施方式，将所述细胞施用至所述受试者的视网膜下腔。根据一些实施方式，视网膜下施用是经玻璃体或脉络膜上腔。根据一些实施方式，施用是通过套管施用。

根据一些实施方式，通过所述套管的施用的部位的愈合在约1天至约30天内。根据一些实施方式，通过所述套管的施用的部位的愈合在约5天至约21天内或在约7天至约15天内。

根据一些实施方式，本文所述的方法还包括：在施用RPE细胞后向所述受试者施用免疫抑制1天至3个月。

根据其他实施方式，本文所述的方法还包括：在施用RPE细胞后向所述受试者施用免疫抑制3个月。

根据又其他实施方式，本文所述的方法还包括：在施用RPE细胞后向所述受试者施用免疫抑制1天至1个月。

根据一些实施方式，所述视网膜疾病或病况选自：中度干性AMD、视网膜色素变性、视网膜脱落、视网膜发育不良、视网膜萎缩、视网膜病变、黄斑营养不良、视锥细胞营养不良、视锥细胞-视杆细胞营养不良、Malattia Leventinese、Doyne蜂窝状营养不良、Sorsby营养不良、图形样/蝶形营养不良、Best卵黄样营养不良、北卡罗莱纳营养不良、中心性晕轮状脉络膜营养不良、血管样条纹、毒性黄斑病变、Stargardt病、病理性近视、视网膜色素变性和黄斑变性。

根据一些实施方式，所述疾病是年龄相关性黄斑变性。根据一些实施方式，所述年龄相关性黄斑变性是干燥形式的年龄相关性黄斑变性。

根据一些方面，本文提供了增加治疗患有干性AMD的受试者的方法的安全性的方法，其包括：向受试者施用治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞，其中未向所述受试者施用全身性免疫抑制。

根据一些实施方式，治疗紧急不良事件的发生率和频率低于使用免疫抑制。

根据一些方面，本文提供了在患有GA的受试者中使视网膜的椭圆体带有序化的方法，所述方法包括：施用治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞，其中施用后无序的椭圆体带变得有序。

根据一些实施方式，椭圆体带的恢复包括根据椭圆体带分析的恢复。

根据一些实施方式，椭圆体带的分析包括对所述椭圆体带的目测分析，其中将受试者的所述椭圆体带与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼进行比较。

根据一些实施方式，通过与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼相比正常结构的重塑指示恢复。

根据一些实施方式，恢复包括以下一个或多个变得更加有序的主观评估，包括外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)、感光细胞的外段、玻璃膜疣消失和网状假性玻璃膜疣消失。

根据一些实施方式，恢复包括一个或多个视网膜的基本基础层变得更加有序的主观评估。

根据一些实施方式，变得更加有序的所述视网膜的所述基本基础层包含外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)和感光细胞的外段的一个或多个。

根据一些实施方式，所述受试者包括BCVA为20/64或更低；20/70或更低；或者约20/64至约20/400之间。

根据一些实施方式，通过微视野检查评估的视力恢复证实治疗或延缓视网膜疾病的进展，其中微视野检查评估的视力恢复包括与基线相比在微视野检查上的视网膜灵敏性与EZ缺陷之间的关联性。

根据其他实施方式，微视野检查评估的视力恢复包括证实施用所述RPE细胞的部位处或附近的视网膜的部位与基线微视野检查评估相比具有改善的微视野检查评估。

根据某些实施方式，治疗或延缓视网膜疾病进展包括在施用后一年相对于基线或对侧眼GA病变的速率降低约5％至约20％之间；或约5％至约50％之间；或约5％至约25％之间；或约5％至约100％之间；或约5％至约10％之间。

根据一些实施方式，治疗或延缓视网膜疾病进展包括以下一种或多种：当与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼比较时，BCVA稳定；低亮度测试性能无恶化；或微视野检查灵敏性无恶化；或阅读速度无恶化，其中所述比较是在1个月、在3个月、在6个月或在1年中的一个或多个。

根据一些实施方式，一种用于治疗或延缓视网膜疾病或病症进展的药物组合物，所述药物组合物包含约50,000至500,000个之间的RPE细胞作为活性物质。

根据其他实施方式，一种用于稳定患有视网膜疾病或病症的受试者的RPE的药物组合物，所述药物组合物包含约50,000至500,000个之间的RPE细胞作为活性物质。

根据一些实施方式，所述RPE细胞的特征为具有以下特征：(a)至少95％的所述细胞共表达前黑素体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)；和(b)对于在其中施用所述细胞的受试者，所述细胞的跨上皮电阻大于100欧姆；其中施用后从约90天至约24个月，在所述受试者中的视网膜色素沉着为稳定的。

根据一些实施方式，椭圆体带的恢复包括以下一种或多种改善：EZ-RPE厚度、面积或体积测量。

根据一些实施方式，EZ-RPE厚度、面积或体积测量的一种或多种的改善与视敏度呈负相关。

根据一些实施方式，所述椭圆体带分析通过与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼相比EZ体积的减小证实EZ的有序化。

根据一些实施方式，所述EZ体积的减小包括至少2％或至少5％或至少7％或至少10％，或者1％至5％之间或1至10％之间或1％至50％之间或10％至50％之间。

根据一些实施方式，所述EZ的有序化包括从基线所述EZ的结构的体积减小至少2％、至少5％、至少10％、至少约1％至约50％之间。

根据一些实施方式，通过营养因子的细胞分泌增强所述治疗或延缓视网膜疾病或病症的进展。

附图说明

参考以下附图，将更全面地理解本文描述的技术，这些附图仅用于说明性目的：

图1举例说明了基于细胞的疗法，以替代和支持具有GA的干性AMD中功能障碍和退化的RPE。

图2A是使用1剂量约50,000个RPE细胞进行治疗的组(cohort)1(患者1、2和3(Pt.1、Pt.2、Pt.3))的治疗眼在1年测得的最佳校正视敏度(BCVA)的图。

图2B是针对组1(患者1、2和3(Pt.1、Pt.2、Pt.3))的对侧眼在1年内测得的最佳校正视敏度(BCVA)的图。

图3显示了于术前(pre-op)和手术期间(intra-op)时间点组1(患者1、2和3(Pt.1、Pt.2、Pt.3))的彩色眼底(fundus)图像。

图4显示了使用目标剂量50,000个RPE细胞治疗前(pre-op)和治疗后2个月，组1(患者1、2和3(Pt.1、Pt.2、Pt.3)的彩色眼底图像。

图5显示了使用目标剂量50,000个RPE细胞治疗前(pre-op)和治疗后(post-op)9个月至1年时间点，组1(患者1、2和3(Pt.1、Pt.2、Pt.3)的彩色眼底图像。

图6显示了在手术前，手术后1天、1周、2个月、4.5个月和9个月时间点，来自患者1(组1，用剂量为50,000个RPE细胞治疗)的蓝色自发荧光图像。

图7显示了在手术前，手术后1天、1周、2个月、6个月和9个月时间点，来自患者2的蓝色自发荧光图像。

图8显示了在手术前，手术后1天、1周、2个月、7个月和9个月时间点，来自患者3的蓝色自发荧光图像。

图9显示了组2患者4(200,000个RPE细胞悬液剂量)在手术时(第0天)的彩色图像，手术后第1天的FAF和彩色图像，以及手术后2个月、3个月、4个月和6个月的彩色图像。

图10显示了组2患者5(200,000个RPE细胞悬液剂量)在第0天、第1个月、第2个月、第3个月和第6个月的彩色和相应的FAF图像。

图11显示了组1的愈合注射部位的OCT图像。

图12显示了患者1在手术前，手术后1周、1个月和1年时间点的OCT扫描。

图13显示了患者2在手术前，手术后1个月和9个月时间点的OCT扫描。

图14显示了患者3在手术前，手术后3个月和9个月时间点的OCT扫描。

图15显示了组2的患者4(200,000个RPE细胞悬液剂量)在手术前，手术后1个月和9个月时间点的OCT和红外OCT扫描。

图16显示了组2的患者5(200,000个RPE细胞悬液剂量)在基线，手术后1周、2周、1个月、2个月、3个月和6个月时间点的OCT扫描。

图17显示了在猪眼中hESC-RPE细胞视网膜下移植后的OCT扫描、红外图像和组织学图像。

图18显示了NOD-SKID小鼠视网膜下腔中的良性畸胎瘤。

图19显示了用含100,000个衍生自hESC的RPE细胞的溶液处理的NOD-SKID小鼠的视网膜下腔中的衍生自hSEC的RPE细胞。

图20显示了用含100,000个衍生自hESC的RPE细胞的溶液处理的NOD-SKID小鼠的视网膜下腔中的HuNu⁺细胞。

图21显示了在使用指示人细胞存在的染料的3个动物物种中衍生自hESC的RPE的植入和存活情况。

图22A显示了患者8(组3；剂量为100,000个RPE细胞/50μl)在手术前拍摄的蓝色自发荧光图像，显示了GA(深色区域)、未来气泡边界的轮廓(虚线)和精确植入位置(星号)的基线图像。

图22B显示了患者8在手术前拍摄的彩色眼底图像，显示了GA(深色区域)、未来气泡边界的轮廓(虚线)和精确植入位置(星号)的基线图像。

图22C显示了拍摄在手术时植入的小泡的彩色图像。

图23显示了患者8在1个月时的彩色眼底图像。

图24A显示了患者8在1个月时拍摄的蓝色自发荧光图像。

图24B显示了患者8在2个月时拍摄的蓝色自发荧光图像。

图24C显示了患者8在3个月时拍摄的蓝色自发荧光图像。

图25显示了患者8在基线(手术前)、1个月、2个月和3个月时间点的过渡区的红外图像和相应的OCT图像。

图26显示了患者8在基线(手术前)、1个月、2个月和3个月时间点的过渡区的红外图像和相应的OCT图像。

图27显示了患者8在基线(手术前)、1个月、2个月和3个月时间点的过渡区的红外图像和相应的OCT图像。

具体实施方式

本文所述的RPE细胞组合物和方法可以在受试者中通过向所述受试者施用包含所述RPE细胞的组合物用于减缓视网膜变性疾病或病症的进展，减缓年龄相关性黄斑变性(AMD)或中年年龄相关性黄斑变性(AMD)的进展，预防视网膜变性疾病，预防AMD，恢复视网膜色素上皮(RPE)，增加RPE，替代RPE或治疗RPE疾病、缺陷、病况和/或损伤。例如，可以将衍生自人胚胎干细胞的RPE细胞组合物注射进入视网膜下腔以促进RPE恢复和预防由视网膜疾病或病况引起的视网膜退化的进展。

在某些实施方式中，RPE细胞是在GA病变或GA病变附近周围健康组织上施用的。向GA病变施用将有助于修复或校正病变。在GA病变附近周围健康组织上施用RPE细胞将防止病变进一步生长。

在某些实施方式中，RPE细胞植入物一旦植入，便会通过分泌这些因子为变性视网膜组织提供持久的营养支持。在一些受试者中，这种营养支持可能会减慢视网膜退化和视力丧失。营养因子已知为细胞存活和分化促进剂。营养因子和营养因子家族的实例包括但不限于神经营养蛋白、睫状神经营养因子/白血病抑制因子(CNTF/LIF)家族、肝细胞生长因子/散射因子家族、胰岛素样生长因子(IGF)家族和来源于胶质细胞系的神经营养因子(GDNF)家族。施用或视网膜移植后，本文所述的RPE细胞可立即开始分泌营养因子。此外，当细胞整合到受体细胞之间并与受试者的细胞建立突触接触时，就可以开始源源不断的神经保护性支持。

在某些实施方式中，视网膜变性疾病可以是以下一种或多种：RPE功能障碍、感光细胞功能障碍、脂褐素累积、玻璃膜疣形成或炎症。

在其他实施方式中，视网膜变性疾病选自下述中的至少一种：视网膜色素变性，勒伯尔先天性黑蒙，遗传性或获得性黄斑变性，年龄相关性黄斑变性(AMD)，贝斯特氏症，视网膜脱落，回旋状萎缩，无脉络膜，图形样营养不良(pattern dystrophy)，RPE营养不良，Stargardt病，由光、激光、感染、辐射、新生血管或外伤的任一种引起的损伤导致的RPE或视网膜损伤。在另外其他实施方式中，AMD是地图样萎缩(GA)。

在某些实施方式中，RPE缺陷可能由下述一种或多种原因引起：年老、吸烟、体重不健康、抗氧化剂摄入不足或心血管病症。在其他实施方式中，RPE缺陷可能由先天性异常引起。

在上下文允许的情况下，“视网膜色素上皮细胞”、“RPE细胞”、“RPE”可以互换使用，是指例如在功能上、表观遗传学上或表达性质上类似于形成视网膜的色素上皮细胞层的天然RPE细胞的细胞类型的细胞(例如，在眼内的移植、施用或递送后，其表现出与天然RPE细胞相似的功能活性)。

根据一些实施方式，RPE细胞表达成熟RPE细胞的至少1、2、3、4或5种标志物。根据一些实施方式，RPE细胞表达成熟RPE细胞的至少2种至至少10种或者至少2种至至少30种标志物。这样的标志物包括但不限于CRALBP、RPE65、PEDF、PMEL17、bestrophin 1和酪氨酸酶。任选地，RPE细胞还可以表达RPE前体的标志物(例如，MITF)。在其他实施方式中，RPE细胞表达PAX-6。在其他实施方式中，RPE细胞表达视网膜祖细胞的至少一种标志物，包括但不限于Rx、OTX2或SIX3。任选地，RPE细胞可以表达SIX6和/或LHX2。

本文中使用的短语“成熟RPE细胞的标志物”指与非RPE细胞或未成熟的RPE细胞相比，在成熟RPE细胞中升高(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如，蛋白)。

本文中使用的短语“RPE祖细胞的标志物”指当与非RPE细胞相比时，在RPE祖细胞中升高(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如，蛋白)。

根据其他实施方式，RPE细胞的形态与形成视网膜的色素上皮细胞层的天然RPE细胞相似。例如，细胞可能是着色的，并具有特征性的多边形形状。

根据另外其他实施方式，RPE细胞能够治疗疾病，如黄斑变性。

根据另外的实施方式，RPE细胞至少满足以上列出的1、2、3、4个或所有要求。

如在本文中使用的，短语“干细胞”指能够在培养中长时间保持未分化状态(例如，多能(pluripotent)或多能(multipotent)干细胞)，直至诱导以分化成具有特定的、专门的功能(例如，完全分化的细胞)的其他细胞类型的细胞。优选地，短语“干细胞”包括胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质干细胞和造血干细胞。

根据一些实施方式，RPE细胞由多能干细胞(例如，ESC或iPSC)产生。

诱导的多能干细胞(iPSC)可以通过对体细胞进行遗传操纵由体细胞产生，例如用转录因子例如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4逆转录转导体细胞例如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞[Yamanaka S,Cell Stem Cell.2007,l(l):39-49；Aoi T,等,Generation ofPluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and StomachCells.Science.2008Feb 14.(出版前电子公开)；IH Park,Zhao R,West JA,等,Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with definedfactors.Nature2008；451:141-146；K Takahashi,Tanabe K,Ohnuki M,等,Induction ofpluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell2007；131:861-872]。如果使受体细胞停止在有丝分裂中，则可以通过核转移到卵母细胞、与胚胎干细胞融合或核转移到合子中来生成其他胚胎样干细胞。此外，可以使用非整合方法(例如，通过使用小分子或RNA)产生iPSC。

短语“胚胎干细胞”指能够分化为所有三个胚胎胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的细胞或保持未分化状态的胚胎细胞。短语“胚胎干细胞”可以包括从胚胎植入前(即，植入前囊胚)和妊娠后(例如，囊胚)形成的胚胎组织获得的细胞，从植入后/妊娠前阶段的囊胚获得的扩展囊胚细胞(EBC)(见WO2006/040763)和从妊娠期间任何时间(优选妊娠的10周前)胎儿的生殖组织获得的胚胎生殖(EG)细胞。可以使用本领域熟知的细胞培养方法获得本发明一些实施方式的胚胎干细胞。例如，可以从人囊胚中分离人胚胎干细胞。

人囊胚通常从人体内植入前胚胎或从体外受精(IVF)胚胎获得。或者，可以将单细胞人胚胎扩增至囊胚期。为了分离人ES细胞，将透明带从囊胚中取出，并通过下述程序分离内细胞团(ICM)，将滋养层细胞裂解并通过轻柔吸取将其从完整的ICM上除去。然后将ICM铺板在含有能够使其向外生长的适宜培养基的组织培养瓶中。9至15天后，通过机械解离或通过酶促降解将ICM衍生的向外生长解离成团块，然后将细胞重新铺板在新鲜的组织培养基上。通过微量移液器个体地选择显示出未分化形态的集落，将其机械解离成团块，并且重新铺板。然后，每4-7天将所得到的ES细胞常规分瓶(split)。人ES细胞制备方法的更多细节参见Reubinoff等,Nat Biotechnol 2000,May:18(5):559；Thomson等,[美国专利号5,843,780；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995]；Bongso等,[Hum Reprod 4:706,1989]；和Gardner等,[Fertil.Steril.69:84,1998]。

应当意识到的是，根据本公开的一些实施方式也可以使用市售的干细胞。人ES细胞可以购自NIH人胚胎干细胞登记处[www(dot)grants(dot)nih(dot)gov/stem_cells/registry/current(dot)htm]或其他hESC登记处。市售胚胎干细胞系的非限制性实例为HAD-C 102、ESI、BGO 1、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CYIO、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES25、HUES 26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES3、WAO 1、UCSF4、NYUES1、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUES5、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077(H7)、WA09(H9)、WA 13(H13)、WA14(H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CT I、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR 1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBR5、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BJNheml9、BJNhem20、SAOO 1、SAOOl。

根据一些实施方式，胚胎干细胞系是HAD-C102或ESI。

此外，ES细胞还可以来自其他物种，包括小鼠(Mills and Bradley,2001)、黄金地鼠[Doetschman等,1988,Dev Biol.127:224-7]、大鼠[Iannaccone等,1994,Dev Biol.163:288-92]、兔子[Giles等,1993,Mol Reprod Dev.36:130-8；Graves&Moreadith,1993,MolReprod Dev.1993,30 36:424-33]、几种家畜[Notarianni等,1991,J Reprod FertilSuppl.43:255-60；Wheeler 1994,Reprod Fertil Dev.6:563-8；Mitalipova等,2001,Cloning.3:59-67]和非人灵长类动物(恒河猴和绒猴)[Thomson等.,1995,Proc Natl AcadSci U S A.92:7844-8；Thomson等,1996,Biol Reprod.55:254-9]。

扩展的囊胚细胞(EBC)可以获自原肠胚之前阶段受精后至少9天的囊胚。在培养囊胚之前，先消化透明带[例如使用Tyrode酸性溶液(Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA)]，以暴露内细胞团。然后，使用标准胚胎干细胞培养方法，将囊胚作为完整胚胎培养至少9天且不超过受精后14天(即，在原肠胚形成事件之前)。

在Chung等,Cell Stem Cell,Volume 2,Issue 2,113-117,7 February 2008中描述了用于制备ES细胞的另一种方法。这种方法包括在体外受精过程中从胚胎中去除单个细胞。在该过程中不破坏胚胎。

使用本领域技术人员公知的实验室技术，从妊娠约8-11周的胎儿(在人类胎儿的情况下)获得的原始生殖细胞制备EG细胞(胚胎生殖干细胞(embryonic germ))。将生殖嵴解离并切成小部分，然后通过机械解离将其解聚成细胞。随后，在含有适宜的培养基的组织培养瓶中生长EG细胞。每天更换培养基培养细胞，直到观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常是在7-30天或1-4代后。对于人EG细胞制备方法的其他细节，参见Shamblott等,[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998]和美国专利号6,090,622。

制备ES细胞的另一种方法是孤雌生殖。该过程中也不破坏胚胎。

ES培养方法可以包括使用饲养细胞层，其分泌干细胞增殖所需的因子，同时抑制其分化。培养通常在固体表面上进行—例如包被有明胶或波形蛋白的表面。示例性的饲养细胞层包括人胚胎成纤维细胞、成人输卵管上皮细胞、原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、鼠胎儿成纤维细胞(MFF)、人胚胎成纤维细胞(HEF)、从人胚胎干细胞的分化获得的人成纤维细胞、人胎儿肌肉细胞(HFM)、人胎儿皮肤细胞(HFS)、人成年皮肤细胞、人包皮成纤维细胞(HFF)、人脐带成纤维细胞、从脐带或胎盘获得的人细胞以及人骨髓基质细胞(hMSC)。可以向培养基中加入生长因子以维持ESC处于未分化状态。这样的生长因子包括bFGF和/或TGFβ。在另一个实施方式中，可以向培养基中加入试剂以维持hESC处于幼稚的未分化状态——参见例如Kalkan等,2014,Phil.Trans.R.Soc.B,369:20130540。

可以在补充了人血清(例如，20％)和谷氨酰胺的Dulbecco's Modified Eagle'sMedium(例如，DMEM,SH30081.01,Hyclone)中扩增人脐带成纤维细胞。优选地，对人脐带细胞进行照射。可以使用本领域公知的方法进行(例如，γ细胞，220 Exel,MDS Nordion 3,500 rads-7500rads)。一旦获得足够的细胞，可以将其冷冻(例如，冻存)。为了扩增ESC，通常将人脐带成纤维细胞铺板在任选地使用贴壁基材如明胶(例如，重组人明胶(RHG100-001，纤维蛋白原))或人波连蛋白或层粘连蛋白521(Bio lamina)包被的固体表面(例如，T75或T175培养瓶)上，其浓度为在补充了约20％人血清(和谷氨酰胺)的DMEM(例如，SH30081.01,Hyclone)中约25,000-40,000个细胞/cm²。通常将hESC在1-4天后在支持性培养基(例如，含人血清白蛋白的

或NUT(+))中铺板在饲养细胞上面。可以向培养基中加入另外的因子，以防止ESC分化，例如bFGF和TGFβ。一旦获得足够量的hESC，可以将细胞机械破坏(例如，通过使用无菌吸头或一次性无菌干细胞工具；14602Swemed)。或者，可以通过酶处理(例如，胶原酶A或TrypLE Select)或化学处理(例如，EDTA)去除细胞。可以重复该过程几次，以达到必要的hESC量。根据一些实施方式，在第一轮扩增之后，使用TrypLE Select去除hESC，并且在第二轮扩增之后，使用胶原酶A去除hESC。

在分化步骤之前，可以在饲养细胞上扩增ESC。示例性的基于饲养层的培养物如上文所述。扩增通常进行至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。扩增通常进行至少1代、至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少6代、至少7代、至少8代、至少9代或至少10代。在一些实施方式中，扩增进行至少2代至至少20代。在其他实施方式中，扩增进行至少2代至至少40代。扩增后，使用分化剂对多能干细胞(例如，ESC)进行定向分化。

在ES细胞培养中还使用了无饲养细胞系统，这样的系统利用添加了血清替代物、细胞因子和生长因子(包括IL6和可溶性IL6受体嵌合体)的基质作为饲养细胞层的替代。在存在培养基-例如Lonza L7系统，mTeSR、StemPro、XFKSR、E8、

的条件下，干细胞可以在固体表面例如细胞外基质(例如，MATRIGELR^TM、层粘连蛋白或波连蛋白)上生长。与需要饲养细胞与干细胞同时生长并且可能导致产生混合细胞群的基于饲养细胞的培养不同的是，在无饲养细胞系统上生长的干细胞易于从表面上分离。用于生长干细胞的培养基包含有效抑制分化并促进其生长的因子，如MEF条件培养基和bFGF。

在一些实施方式中，扩增后，多能ESC在粘附表面上进行定向分化(没有中间产生的球形或胚状体)。参见例如，国际专利申请公开号WO 2017/072763，其全部内容通过引用并入本文。

因而，根据本公开的一个方面，在粘附表面上进行定向分化的细胞中有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞是未分化的ESC并且表达多能性标志物。例如，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞是Oct4⁺TRA-1-60⁺。未分化的ESC可以表达其他多能性标志物，如NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-β、SSEA-3、SSEA-4和/或TRA-1-81。

在一个示例性的分化方案中，在粘附表面上使用第一分化试剂将未分化的胚胎干细胞向RPE细胞谱系分化，然后使用转化生长因子B(TGFB)超家族成员(例如，TGF1、TGF2和TGF3亚型，以及同源配体包括激活素(例如，激活素A、激活素B和激活素AB)、nodal、抗苗勒管激素(AMH)、一些骨形态发生蛋白(BMP)，例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7，以及生长和分化因子(GDF))进一步分化为RPE细胞。根据一个特定的实施方式，转化生长因子B(TGFB)超家族成员是激活素A—例如，20-200ng/ml之间，例如100-180ng/ml。

根据一些实施方式，第一分化试剂是烟酰胺(NA)，其以约1-100mM、5-50mM、5-20mM之间，以及例如10mM的浓度使用。根据其他实施方式，第一分化试剂是3-氨基苯甲胺。

NA，也称为“烟酰胺”，是维生素B3(烟酸)的酰胺衍生物形式，认为其可以保持和改善β细胞的功能。NA的化学式为C₆H₆N₂O。NA对于生长和食物向能量的转化至关重要，并且已将其用于治疗关节炎以及治疗和预防糖尿病。

根据一些实施方式，烟酰胺是烟酰胺衍生物或烟酰胺模拟物。如在本文中所使用的，术语“烟酰胺(NA)衍生物”指其是天然NA的化学修饰衍生物的化合物。在一个实施方式中，化学修饰可以是基本NA结构的吡啶环(经由环的碳或氮原子)经由酰胺部分的氮或氧原子的取代。当被取代时，一个或多个氢原子可以被取代基取代和/或取代基可以与N原子连接以形成四价带正电荷的氮。因而，本发明的烟酰胺包括取代的或非取代的烟酰胺。在另一个实施方式中，化学修饰可以是缺失或取代单个基团，例如以形成NA的硫代苯甲酰胺类似物，所有这些都是有机化学领域的技术人员能够预期的。在本发明背景下的衍生物还包括NA的核苷衍生物(例如，烟酰胺腺嘌呤)。已描述了多种NA衍生物，其中的一些还与PDE4酶的抑制活性相关(WO03/068233；WO02/060875；GB2327675A)，或者作为VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂(WO01/55114)。例如，在WO05/014549中公开了4-芳基-烟酰胺衍生物的制备方法。在WO01/55114和EP2128244中公开了其他示例性的烟酰胺衍生物。

烟酰胺模拟物包括烟酰胺的修饰形式和烟酰胺的化学类似物，其概括了烟酰胺在RPE细胞从多能细胞分化和成熟中的作用。示例性的烟酰胺模拟物包括苯甲酸、3-氨基苯甲酸和6-氨基烟酰胺。可以作为烟酰胺模拟物的另一类化合物是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂。示例性的PARP抑制剂包括3-氨基苯甲酰胺、Iniparib(BSI201)、Olaparib(AZD-2281)、Rucaparib(AG014699，PF-01367338)、Veliparib(ABT-888)、CEP 9722、MK 4827和BMN-673。

考虑的另外分化试剂包括例如头蛋白、Wnt拮抗剂(Dkkl或IWRle)、nodal拮抗剂(Lefty-A)、视黄酸、牛磺酸、GSK3b抑制剂(CHIR99021)和notch抑制剂(DAPT)。

根据某些实施方式，按照如下所示进行分化：(a)在含有第一分化试剂(例如，烟酰胺)的培养基中培养ESC；和(b)在含有TGFB超家族成员(例如，激活素A)和第一分化试剂(例如，烟酰胺)的培养基中培养从步骤a)获得的细胞。

可以在不存在TGFβ超家族成员(例如，激活素A)的条件下进行步骤(a)。

在一些实施方式中，步骤(a)中的培养基完全不含TGFβ超家族成员。在其他实施方式中，培养基中TGFβ超家族成员的水平低于20ng/ml、10ng/ml、1ng/ml或者甚至低于0.1ng/ml。

通过在含有第一分化试剂(例如，烟酰胺)，但不含TGFβ超家族成员(例如，激活素A)的培养基中培养从步骤(b)中获得的细胞可以继续上文所述的方案。本文将该步骤称为步骤(b*)。

现在利用另外的实施方式进一步详细描述上述方案。步骤(a)：一旦获得足量的ESC，则开始分化过程。从细胞培养物中移出细胞(例如，通过使用胶原酶A、分散酶、TrypLESelect、EDTA)，并且在存在烟酰胺(和不存在激活素A)的条件下，将细胞铺板在非贴壁基材上(例如，细胞培养板例如Hydrocell或包被了琼脂糖的培养皿，或皮氏细菌培养皿)。示例性的烟酰胺浓度为0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM和10mM。一旦将细胞铺板在非贴壁基材(例如，细胞培养板)上，则将细胞培养物称为细胞悬液，优选悬浮培养的自由漂浮簇，即衍生自人胚胎干细胞(hESC)的细胞的聚集体。细胞簇不在任何基材上贴壁(例如，培养板，运载体)。此前已在WO 06/070370中描述了游离漂浮干细胞的来源，其全部内容通过引用并入本文。这一阶段可以进行最少1天，更优选地2天、3天、1周或者甚至14天。优选地，细胞在含烟酰胺(例如，0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM和例如10mM)(和不存在激活素A)的悬浮液中培养不超过3周。在一个实施方式中，细胞在含烟酰胺(例如，0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM和例如10mM)(和不存在激活素A)的悬浮液中培养6-8天。

根据一些实施方式，当在非贴壁基材(例如，细胞培养板)上培养细胞时，大气氧条件是20％。然而，还考虑操纵大气氧条件，以使得大气氧百分比低于约20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或者甚至低于约5％(例如，在1％-20％、1％-10％或0-5％之间)。根据其他实施方式，最初在正常大气氧条件下在非贴壁基材上培养细胞，然后降至低于正常的大气氧条件。

非贴壁细胞培养板的实例包括由Nunc生产的那些(例如，Hydrocell；目录号174912)等等。

通常地，簇包含至少50-500,000、50-100,000、50-50,000、50-10,000、50-5000、50-1000个细胞。根据一个实施方式，在簇中的细胞没有被组织成层并且形成不规则形状。在一个实施方式中，簇基本上不含多能胚胎干细胞。在另一个实施方式中，簇包含少量的多能胚胎干细胞(例如，不超过5％，或不超过3％(例如，0.01-2.7％)的细胞，其在蛋白水平共表达OCT4和TRA-1-60)。通常，簇包含在烟酰胺影响下已部分分化的细胞。这样的细胞主要表达神经和视网膜前体标志物，如PAX6、Rax、Six3和/或CHX10。

可以使用本领域公知的酶促或非酶促方法(例如，机械)将簇解离。根据一些实施方式，将细胞解离，以使得其不再成簇-例如2-100,000个细胞、2-50,000个细胞、2-10,000个细胞、2-5,000个细胞、2-1,000个细胞、2-500个细胞、2-100个细胞、2-50个细胞的聚集体或团块。根据一个特定的实施方式，细胞处于单细胞悬液中。

然后可以将细胞(例如，解离的细胞)铺板在贴壁基材上，并且在存在烟酰胺(例如，0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM和例如10mM)(和不存在激活素A)的条件下培养。这一阶段可以进行最少1天，更优选地2天、3天、1周或者甚至14天。优选地，细胞在存在烟酰胺(和不存在激活素A)的条件下培养不超过3周。在一个示例性的实施方式中，这一阶段进行6-7天。

根据其他实施方式，当在贴壁基材(例如，层粘连蛋白)上培养细胞时，大气氧条件是20％。可以对其进行操纵，以使得大气氧百分比低于约20％、15％、10％，更优选地低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％和更优选地约5％(例如，1％-20％、1％-10％或0-5％之间)。

根据一些实施方式，最初在正常大气氧条件下在贴壁基材上培养细胞，然后将氧气降至低于正常的大气氧条件。

贴壁基材或基材混合物的实例可以包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、聚D-赖氨酸、胶原和明胶。

步骤(b)：在第一阶段定向分化之后，(步骤a；即在存在烟酰胺(例如，0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM和例如10mM)的条件下培养)，然后可以将部分分化的细胞置于贴壁基材上通过在存在激活素A(例如，0.01-1000ng/ml、0.1-200ng/ml、1-200ng/ml——例如140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml或180ng/ml)的条件下培养进行进一步的分化阶段。因而，可以以最终摩尔浓度0.1pM-10nM、10pM-10nM、0.1nM-10nM、1nM-10nM，例如5.4nM加入激活素A。

在这一阶段也可以加入烟酰胺(例如，0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM和例如10mM)。该阶段可以进行1天至10周、3天至10周、1周至10周、1周至8周、1周至4周，例如至少1天、至少2天、至少3天、至少5天、至少1周、至少9天、至少10天、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周。

根据一些实施方式，这一阶段进行约8周至约2周。这一阶段的分化可以在低于或正常大气氧条件下进行，如上文所详述的。

步骤(b*)：第二阶段定向分化之后(即，在存在烟酰胺和激活素A的条件下在贴壁基材上培养；步骤(b))，进一步分化的细胞可以任选地在贴壁基材上进行随后的分化阶段——在存在烟酰胺(例如，0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM和例如10mM)的条件下，在不存在激活素A的条件下培养。这一阶段可以进行至少1天、2天、5天、至少1周、至少2周、至少3周或者甚至4周。这一阶段的分化也可以在低于或正常大气氧条件下进行，如上文所详述的。

ESC在其中分化的基础培养基是本领域公知的用于支持细胞在体外生长的任何已知的细胞培养基，通常地，培养基包含确定的基本溶液，其包含盐、糖、氨基酸和维持培养物中的细胞成活状态所需的任何其他营养物质。根据一个特定的实施方式，基础培养基不是条件培养基。根据本发明可以使用的市售基础培养基的非限制性实例包括

(用于ESC分化时不含bFGF和TGF，用于ESC扩增时含有bFGF和TGF)、Neurobasal^TM、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、CELLGRO^TM干细胞生长培养基或X-Vivo^TM。可以向基础培养基中补充本领域公知用于细胞培养的各种试剂。以下是对根据本公开所使用的培养基中可能包括的各种补充剂的非限制性参考：含有血清或血清替代物的培养基，例如但不限于敲除血清替代物(KOSR)、NUTRIDOMA-CS、TCH^TM、N2、N2衍生物、或B27或者组合；细胞外基质(ECM)组分，例如但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和明胶。然后，可以将ECM用于携带一种或多种TGFβ生长因子超家族成员；抗菌剂，例如但不限于青霉素和链霉素；和非必需氨基酸(NEAA)、已知在促进培养中SC的存活中起作用的神经营养蛋白，例如但不限于BDNF、NT3、NT4。

根据一些实施方式，用于ESC分化的培养基是

培养基(BiologicalIndustries，06-5102-01-1A)。

根据一些实施方式，ESC的分化和扩增是在无xeno条件下进行。根据其他实施方式，增殖/生长培养基基本上不含xeno污染物，即不含动物来源的组分，例如血清、动物来源的生长因子和白蛋白。因此，根据这些实施方式，培养在不含xeno污染物的条件下进行。在美国专利申请号20130196369中提供了在不含xeno成分的条件下培养ESC的其他方法，其全部内容通过引用并入本文。

可以根据药品生产质量管理规范(GMP)(例如，制剂符合GMP)和/或现行的药品组织质量管理规范(GTP)(制剂可以符合GTP)制备含有RPE细胞的制剂。

在分化步骤期间，可以监测胚胎干细胞的分化状态。可以在检查已知指示分化的细胞或组织特异性标志物之后确定细胞的分化状态。

可以使用本领域熟知的免疫学技术检测组织/细胞特异性标志物[Thomson JA等,(1998).Science 282:1145-7]。实例包括但不限于用于膜结合或胞内标志物的流式细胞术，用于胞外和胞内标志物的免疫组化和用于分泌的分子标志物的酶促免疫测定。

在本申请上文所述的分化阶段之后，可以得到包含色素细胞和非色素细胞的混合细胞群。根据这一方面，将混合细胞群的细胞从培养板上移出。在一些实施方式中，这是通过酶实现的(例如，使用胰蛋白酶(TrypLE Select)；参见例如，国际专利申请公开号WO2017/021973，其全部内容通过引用并入本文)。根据本发明的这一方面，至少10％、20％、30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％从培养物中移出的(和随后扩增的)细胞是非色素细胞。在其他实施方式中，这是通过机械实现的，例如使用细胞刮刀。在另外其他实施方式中，这是通过化学实现的(例如，使用EDTA)。还涉及了酶和化学处理的组合。例如，可以使用EDTA和酶促处理。而且，至少10％、20％或者甚至30％的从培养物中移出的(和随后扩增的)细胞可以是色素细胞。

根据本公开的一个方面，将培养的所有细胞的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％移出和随后扩增。

混合细胞群的扩增可以在细胞外基质上进行，例如明胶、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、层粘连蛋白(例如，层粘连蛋白521)、纤连蛋白和聚D-赖氨酸。对于扩增，可以在无血清KOM、含血清培养基(例如，含20％人血清的DMEM)或

培养基(06-5102-01-1A,Biological Industries)中培养细胞。在这些培养条件下，在适宜条件下传代后，色素细胞与非色素细胞之比增加，从而获得纯化的RPE细胞群。这样的细胞显示出RPE细胞的特征性多边形性状和色素沉着。

在一个实施方式中，在存在烟酰胺(例如，0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM和例如10mM)和不存在激活素A的条件下进行扩增。

混合细胞群可以在悬液(具有或不具有微载体)或在单层中扩增。可以对在单层培养物或在混悬培养物中的混合细胞群的扩增进行改进以通过本领域技术人员熟知的方法在生物反应器或多重/超堆叠中大规模扩增。

根据一些实施方式，扩增期进行至少1至20周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或者甚至10周。优选地，扩增期进行1周至10周、更优选地2周至10周、更优选地3周至10周、更优选地4周至10周或者4周至8周。

根据另外其他实施方式，将混合细胞群在扩增期传代至少1次、在扩增期至少2次、在扩增期至少3次、在扩增期至少4次、在扩增期至少5次或者在扩增期至少6次。

本发明人发现当酶促收集细胞时，可以连续扩增超过8代、超过9代以及甚至超过10代(例如，11-15代)。总细胞倍增数可以增至大于30，例如31、32、33、34或更多。(参见国际专利申请公开号WO 2017/021973，其全部内容通过引用并入本文)。

可以根据多种不同参数对根据本文所述的方法产生的RPE细胞群进行表征。因而，例如，所获得的RPE细胞的形状可以是多边形和着色的。

应当意识到的是，本文公开的细胞群和细胞组合物通常不存在未分化的人胚胎干细胞。根据一些实施方式，例如通过FACS所测量的，少于1:250,000的细胞是Oct4+TRA-1-60+细胞。如通过PCR所测量的，细胞还可以具有下调的(超过5,000倍)GDF3或TDGF表达。该方面的RPE细胞基本上不表达胚胎干细胞标志物。所述一种或多种胚胎干细胞标志物可以包含OCT-4、NANOG、Rex-1、碱性磷酸酶、Sox2、TDGF-β、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。

相对于非RPE细胞，治疗性RPE细胞制剂可以是基本上纯的，包含至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的RPE细胞。RPE细胞制剂可以基本上不含非RPE细胞或由RPE细胞组成。例如，基本上纯的RPE细胞制剂可以包含少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的非RPE细胞类型。例如，RPE细胞制剂可以包含少于约25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％的非RPE细胞。

相对于非RPE细胞和相对于其他成熟水平的RPE细胞，RPE细胞制剂可以是基本上纯的。相对于非RPE细胞，制剂可以是基本上纯的，并且富含成熟RPE细胞。例如，在富含成熟RPE细胞的RPE细胞制剂中，至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99％或100％的RPE细胞是成熟RPE细胞。相对于非RPE细胞，制剂可以是基本上纯的，并且富含分化RPE细胞而不是成熟RPE细胞。例如，至少约30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的RPE细胞可以是分化的RPE细胞而不是成熟RPE细胞。

本申请所述的制剂可以基本上不含细菌、病毒或真菌污染物或感染，包括但不限于存在HIV I、HIV 2、HBV、HCV、HAV、CMV、HTLV 1、HTLV 2、细小病毒B19、爱泼斯坦-巴尔病毒、或疱疹病毒1和2、SV40、HHV5，6，7，8、CMV、多瘤病毒、HPV、肠病毒。本申请所述的制剂可以基本上不含支原体污染物或感染。

表征本文公开的细胞群的另一种方式是通过标志物表达。因而，例如，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、90％、95％或100％的细胞可以表达bestrophin 1。根据一个实施方式，80-100％之间的细胞表达bestrophin 1。

根据其他实施方式，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达小眼畸形相关转录因子(MITF)。例如，80-100％的细胞表达MITF。

根据其他实施方式，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达小眼畸形相关转录因子(MITF)和bestrophin 1。例如，80-100％的细胞共表达MITF和bestrophin 1。

根据其他实施方式，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达小眼畸形相关转录因子(MITF)和Z0-1。例如，80-100％的细胞共表达MITF和Z0-1。

根据其他实施方式，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达Z0-1和bestrophin 1。例如，80-100％的细胞共表达Z0-1和bestrophin 1。

根据另一实施方式，如通过免疫染色或FACS所测量的，至少50％、60％70％80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达配对盒基因6(PAX-6)。例如，至少50％至100％的细胞表达配对盒基因6(PAX-6)。

根据另一实施方式，如通过免疫染色所测量的，至少80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达视黄醛结合蛋白(CRALBP)。例如，80-100％的细胞表达CRALBP。

根据另一实施方式，如通过免疫染色所测量的，80％、85％、87％、89％、90％、95％、97％或100％的细胞表达细胞黑色素细胞谱系特异性抗原GP100(PMEL17)。例如，约80-100％的细胞表达PMEL17。

RPE细胞可以共表达指示终末分化的标志物，例如bestrophin 1、CRALBP和/或RPE65。根据一个实施方式，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％或者甚至约50％至100％之间的所获得的RPE细胞群的细胞共表达前黑色素体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)。

根据一个特定的实施方式，细胞共表达PMEL17(SwissProt No.P40967)和至少一种选自下组的多肽：细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP；SwissProt No.P12271)、卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT；SwissProt No.095327)和性别决定区域Y-box 9(SOX 9；P48436)。

根据一个特定的实施方式，如通过本领域技术人员公知的方法所测量的(例如，FACS)，至少80％的细胞群表达可检测水平的PMEL17和上述提及的多肽之一(例如，CRALBP)，更优选地至少85％的细胞群表达可检测水平的PMEL17和上述提及的多肽之一(例如，CRALBP)，更优选地至少90％的细胞群表达可检测水平的PMEL17和上述提及的多肽之一(例如，CRALBP)，更优选地至少95％的细胞群表达可检测水平的PMEL17和上述提及的多肽之一(例如，CRALBP)，更优选地至少100％的细胞群表达可检测水平的PMEL17和上述提及的多肽之一(例如，CRALBP)。

根据另一实施方式，与未分化的ESC相比，CRALBP和上述提及的多肽之一(例如，PMEL17)共表达的水平(例如，如通过平均荧光强度所测量的)增加至少2倍、更优选地至少3倍、更优选地至少4倍和甚至更优选地至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍。

在一个实施方式中，RPE是终末分化的并且通常不表达Pax6。在另一个实施方式中，RPE细胞终末分化并且通常表达Pax6。

本文所述的RPE细胞还可在移植后充当功能性RPE细胞，其中RPE细胞可在接受移植细胞的患者中的神经感觉视网膜与脉络膜之间形成单层。RPE细胞还可以向邻近的感光细胞提供营养，并通过吞噬作用处理脱落的感光细胞外段。

根据一个实施方式，单层细胞的跨上皮电阻大于100欧姆。

优选地，细胞的跨上皮电阻大于150、200、250、300、300、400、500、600、700、800或者甚至大于900欧姆。

用于测量跨上皮电阻(TEER)的设备是本领域公知的，并且包括例如EVOM2上皮伏特计(World Precision Instruments)。

在扩增阶段之后，获得包含RPE细胞的细胞群，其中至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者甚至100％的细胞是CRALBP+PMEL1 7+。

本领域技术人员将充分理解，RPE细胞的衍生是非常有益的。可以将其作为开发促进其存活、再生和功能的新药的体外模型。RPE细胞可用于高通量筛选对RPE细胞具有毒性或再生作用的化合物。其可用于发现机制、新基因、可溶性或膜结合因子，这些因子对感光细胞的发育、分化、维持、存活和功能很重要。

本文所述的RPE细胞还可以充当用于在视网膜变性和其他变性病症中的功能障碍或变性的RPE细胞的移植、补充和支持的RPE细胞的无限来源。此外，基因修饰的RPE细胞可以充当载体，以在移植后在眼和视网膜中携带和表达基因。

在某些实施方式中，可以根据下述方法生产RPE细胞组合物：(1)在含有人血清白蛋白(HSA)的NUT+中，在CW培养板的hUCF上培养hESC 2周，(2)机械传代以在含有HSA的NUT+中在CW培养板的hUCF上扩增hESC持续4至5周之间(或直至获得所需量的细胞)，(3)在含有HSA的NUT+中，在6cm培养皿中在hUCF上再继续扩增hESC集落(例如，使用胶原酶)持续另外一周，(4)在含有烟酰胺(NIC)的NUT-中，通过将来自约5个6cm培养板中的集落转移至1个HydroCell中培养约1周制备球形体(SB)，(5)在含有NIC的NUT-中，通过将SB转移至6孔板的2-3个孔中培养约1周，可以实现使SB在Lam511上变平，(6)在含有NIC和激活素的NUT-中，在Lam511上将贴壁细胞培养约1至2周，将培养基更换成含有NIC的NUT-并培养1至3周，(7)使用酶(例如TrypLE Select)富集色素细胞，(8)在20％人血清和NUT-中，在培养瓶的明胶上扩增RPE细胞约2周9周(更换培养基)，和(9)收获RPE细胞。

可以使用本领域公知的方法收获扩增的RPE细胞群(例如，使用酶例如胰蛋白酶，或利用EDTA的化学方法等)。在一些实施方式中，可以使用适宜溶液(如PBS或BSS plus等)洗涤RPE细胞。在其他实施方式中，在配制用于冷冻保存的RPE细胞组合物之前，可以过滤RPE细胞，并在解冻后直接施用于受试者。

收获后，可以将扩增的RPE细胞群以特定治疗剂量(例如，细胞数)制剂并冷冻用于向临床运输。然后可以在解冻后直接施用即用型(RTA)RPE细胞治疗组合物，而无需进一步处理。适于冷冻的培养基的实例包括但不限于90％人血清/10％DMSO、培养基3 10％(CS10)、培养基2 5％(CS5)和培养基1 2％(CS2)、Stem Cell Banker、PRIME

FREEZIS、

海藻糖(Trehalose)等。

在适于解冻后立即施用(RTA)应用的冻存培养基中制剂的RPE细胞可以包含在腺苷、葡聚糖40、乳糖酸、HEPES(N(2羟乙基)哌嗪N'(2乙磺酸))、氢氧化钠、L-谷胱甘肽、氯化钾、碳酸氢钾、磷酸钾、右旋糖、蔗糖、甘露醇、氯化钙、氯化镁、氢氧化钾、氢氧化钠、二甲亚砜(DMSO)和水中混悬的RPE细胞。这种冻存培养基的一个实例是市售的，商品名为

由BioLife Solutions,Inc生产。

在进一步的实施方式中，冻存培养基包括：嘌呤核苷(例如，腺苷)、支链葡聚糖(例如，葡聚糖40)、两性离子有机化学缓冲剂(例如，HEPES(N(2羟乙基)哌嗪N'(2乙磺酸)))和细胞可耐受的极性非质子溶剂(例如，二甲亚砜(DMSO))。在更进一步的实施方式中，嘌呤核苷、支链葡聚糖、缓冲剂和极性非质子溶剂中的一种或多种通常被美国FDA认为是安全的。

在一些实施方式中，冻存培养基还包含下述中的一种或多种：糖酸(例如，乳糖酸)、一种或多种碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾)、抗氧剂(例如，L-谷胱甘肽)、一种或多种卤化物盐(例如，氯化钾、氯化钠、氯化镁)、碱性盐(例如，碳酸氢钾)、磷酸盐(例如，磷酸钾、磷酸钠、磷酸钾)、一种或多种糖(例如，右旋糖、蔗糖)、糖醇(例如，甘露醇)和水。

在其他实施方式中，糖酸、碱、卤化物盐、碱性盐、抗氧化剂、磷酸盐、糖、糖醇中的一种或多种通常被美国FDA认为是安全的。

DMSO可用作冻存保护剂，以防止形成冰晶，而冰晶会在冻存过程中杀死细胞。在一些实施方式中，可冻存的RPE细胞治疗组合物包含约0.1％至约2％的DMSO(v/v)。在一些实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含约1％至约20％DMSO。在一些实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含约2％DMSO。在一些实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含约5％DMSO。

在一些实施方式中，在适于解冻后立即施用应用的冻存培养基中制剂的RPE细胞疗法可以包含在不含DMSO的冻存培养基中混悬的RPE细胞。例如，RTA RPE细胞疗法组合物可以包含在Trolox、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、cl-、H2P04-、HEPES、乳糖酸、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖40、腺苷、谷胱甘肽中混悬的RPE细胞(不含DMSO(二甲亚砜，(CH₃)₂SO)或任何其他偶极非质子溶剂)。这种冻存培养基的一个实例是市售的，商品名为

或

-FRS，由BioLife Solutions,Inc生产。在其他实施方式中，在适于解冻后立即施用应用的冻存培养基中制剂的RPE细胞组合物可以包含在海藻糖中混悬的RPE细胞。

RTA RPE细胞疗法组合物可以任选地包含支持RPE植入、整合、存活、效力等的其他因子。在一些实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含本文所述RPE细胞制剂的功能活化剂。在一些实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含烟酰胺。在一些实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含浓度为约0.01-100 mM、0.1-100 mM、0.1-50mM、5-50 mM、5-20 mM和例如10 mM的烟酰胺。在其他实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含视黄酸。在一些实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含浓度为约0.01-100 mM、0.1-100 mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20 mM和例如10 mM的视黄酸。

在一些实施方式中，可以将RTA RPE细胞疗法组合物配制为包含各种整合素的活化剂，所述活化剂已显示出增加RPE细胞制剂(如本文中描述的那些)对Brunch膜的粘附。例如，在一些实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含浓度为约5μΜ至1,000μΜ之间的细胞外锰(Mn2+)。在其他实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物包含构象特异性单克隆抗体TS2/16。

在其他实施方式中，可以将RTA RPE细胞疗法组合物配制为包含RPE细胞免疫调节活性的活化剂。

在一些实施方式中，RTA RPE细胞疗法组合物可以包含ROCK抑制剂。

在一些实施方式中，在适于解冻后立即施用应用的冻存培养基中制剂的RPE细胞疗法可以包含一种或多种免疫抑制化合物。在某些实施方式中，在适于解冻后立即施用应用的冻存培养基中制剂的RPE细胞疗法可以包含一种或多种免疫抑制化合物，将其配制成缓慢释放一种或多种免疫抑制化合物。与本文所述制剂一起使用的免疫抑制化合物可能属于以下类别的免疫抑制药物：糖皮质激素、细胞抑制剂(例如，烷化剂或抗代谢药)、抗体(多克隆或单克隆)、作用于免疫亲和素的药物(例如，环孢菌素、他克莫司或西罗莫司)。其他药物包括干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、霉酚酸酯和小型生物制剂。免疫抑制药物的实例包括：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、BAS1L1 X

(抗-IL-2Ra受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、

(抗-IL-2Ra受体抗体)、依维莫司、霉酚酸、

(抗-CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、他克莫司和或霉酚酸酯。

RPE细胞可以以各种形式移植。例如，RPE细胞可以以单细胞悬液形式与基质一起或粘附在基质或膜、细胞外基质或基材(如可生物降解的聚合物)或其组合上引入靶位点。还可以将RPE细胞印在基质或支架上。还可以将RPE细胞与其他视网膜细胞(如感光细胞)一起移植(共移植)。可以通过不同的视力和眼功能以及结构指标评估治疗作用，除了其他以外，包括最佳校正视敏度(BCVA)，在黑暗和光适应状态下通过视野检查或微视野检查的视网膜对光的灵敏性，全视野、多焦点、聚焦或模式视网膜电图5ERG)，对比灵敏度，阅读速度，色觉，临床生物显微镜检查，眼底照相，光学相干断层扫描(OCT)，眼底自发荧光(FAF)，红外和彩色成像，荧光素或ICG血管造影，自适应光学仪器以及用于评价视力功能和眼结构的其他方法。

在某些实施方式中，通过微视野检查评估的视力恢复证实治疗或延缓视网膜疾病的进展、维持其停滞或逆转，其中微视野检查评估的视力恢复包括与基线、年龄匹配、性别匹配的对照或受试者的对侧眼相比，在微视野检查上的视网膜灵敏性与EZ缺陷之间的关联性。在某些实施方式中，通过微视野检查评估的视力恢复证实治疗或延缓视网膜疾病的进展、维持其停滞或逆转，其中在光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)上的椭圆体带(EZ)缺陷与黄斑完整性评估(MAIA)微视野检查中的视网膜灵敏性丧失相关。参见InvestOphthalmol Vis Sci.2017年05月01日；58(6):BI0291-BI0299.doi:10.1167/iovs.l7-21834,"Correlation Between Macular Integrity Assessment and Optical CoherenceTomography Imaging of Ellipsoid Zone in Macular Telangiectasia Type 2"；Mukherjee D.等，其全部内容通过引用并入本文。

在其他实施方式中，由OCT体积扫描(例如，Heidelberg Spectralis OCT体积扫描(15x 10°区域，30-μm B-扫描间隔)或Zeiss Cirrus HD-OCT 4000 512x 128立方扫描)产生椭圆体带的地形图(例如，正交地形图(正面))，通过与年龄匹配、性别匹配的对照，受试者基线或受试者对侧眼的地形图进行比较，以证实治疗或延缓视网膜疾病的进展、维持其停滞或逆转。EZ的组织与视网膜灵敏性之间存在相关性。施用RPE细胞后，EZ区有序化和视网膜灵敏性得到改善。例如，参见图25和26，在3个月时。参见例如，Retina,2018年01月；38Suppl 1:S27-S32."Correlation Of Structural And Functional Outcome Measures InA Phase One Trial Of Ciliary Neurotrophic Factor In Type 2 Idiopathic MacularTelangiectasia,"Sallo FB等，其全部内容通过引用并入本文。

在某些实施方式中，通过OCT-A，通过施用前和使用后与年龄匹配、性别匹配的对照，受试者的基线或给药前后的对侧眼进行比较来证实治疗或延缓视网膜疾病的进展、维持其停滞或逆转。

例如，使用光谱域(SD)-OCT和OCT-A成像并使用例如OCT EZ-作图分析SD-OCT数据，以获得整个黄斑区的EZ-视网膜色素上皮(RPE)复合物的线性、面积和体积测量。可以使用例如Optovue Avanti裂谱振幅-去相关血管造影算法来测量OCT-A视网膜毛细血管密度。将EZ-RPE参数与年龄匹配、性别匹配对照，受试者的基线或对侧眼进行比较。

在一个实施方式中，施用后，EZ-RPE中央凹平均厚度改善，EZ-RPE中央凹厚度改善以及EZ-RPE中央子视野体积增加。

EZ-RPE的厚度、面积和体积与视敏度改善相关，以测量治疗响应。这些测量中的每一个均与视敏度负相关。

参见图25和2，其中从基线至3个月，EZ体积减少。参见例如，methods outlinedin,Invest Ophthalmol Vis Sci.2017年07月01日；58(9):3683-3689,"OCT Angiographyand Ellipsoid Zone Mapping of Macular Telangiectasia Type 2 From the AVATARStudy,"Runkle AP.等，其全部内容通过引用并入本文。

在一个实施方式中，恢复例如是以下一个或多个变得更加有序的主观评估，包括外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)、感光细胞的外段、玻璃膜疣消失和网状假性玻璃膜疣消失。恢复还可以包括一个或多个视网膜的基本基础层变得更加有序的主观评估。如在本文中使用的，变得更加有序的视网膜的基本基础层包含外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)和感光细胞的外段的一个或多个。如图25和26中所示，例如通过EZ结构的体积减小证实了有序化，参见例如基线与第2个月和第3个月的比较。例如，EZ的体积减小至少2％、至少5％、至少10％。

在一个实施方式中，椭圆体带分析表明，与年龄匹配、性别匹配的对照，基线或对侧眼相比，通过减小EZ体积使得EZ有序化。在另一个实施方式中，EZ体积减小包括至少2％或至少5％或至少7％或至少10％，或1％至5％之间或1％至10％之间或1％至50％之间或10％至50％之间。在另一个实施方式中，例如通过EZ结构的体积减小证实了EZ有序化，参见例如基线与第2个月和第3个月的比较。例如，EZ的体积减小至少2％、至少5％、至少10％。

在一个实施方式中，恢复包括EZ-RPE中央凹平均厚度改善、EZ-RPE中央凹厚度改善和EZ-RPE中央子视野体积改善中的一个或多个。EZ-RPE厚度、面积和体积与测量治疗响应的视敏度改善相关。这些测量的每一个均与视敏度成反比。

根据本公开配制的RTA RPE细胞疗法不需要在注射入受试者的眼睛之前使用GMP设施来制备最终给药制剂。本文所述的RTA RPE细胞疗法制剂可以在无毒的冻存溶液中冷冻保存，所述冻存溶液含有能够直接运送至临床地点的最终给药制剂。当有需要时，可以将制剂解冻并施用至受试者眼部，无需进行任何中间制剂步骤。

例如，可以根据Idelson M、Alper R、Obolensky A等(Directed differentiationof human embryonic stem cells into functional retinal pigment epitheliumcells.Cell Stem Cell 2009；5:396-408)或根据Parul Choudhary等("DirectingDifferentiation of Pluripotent Stem Cells Toward retinal pigment epitheliumLineage",Stem Cells Translational Medicine,2016)或WO 2008129554的方法生产RPE细胞，其全部内容通过引用并入本文。

可以施用给受试者的活细胞数通常为每剂量至少约50,000至约5xl0⁶个细胞。在一些实施方式中，RPE细胞组合物包含至少约100,000个活细胞。在一些实施方式中，RPE细胞组合物包含至少约150,000个活细胞。在一些实施方式中，RPE细胞组合物包含至少约200,000个活细胞。在一些实施方式中，RPE细胞组合物包含至少约250,000个活细胞。在一些实施方式中，RPE细胞组合物包含至少约300,000个活细胞。在一些实施方式中，RPE细胞组合物包含至少约350,000个活细胞。在一些实施方式中，RPE细胞组合物包含至少约400,000个活细胞。在一些实施方式中，RPE细胞组合物包含至少约450,000个活细胞。在一些实施方式中，RPE细胞疗法组合物包含至少约500,000个活细胞。在一些实施方式中，RPE细胞组合物包含至少约600,000、至少约700,000、至少约800,000、至少约900,000、至少约1,000,000、至少约2,000,000、至少约3,000,000、至少约4,000,000、至少约5,000,000、至少约6,000,000、至少约7,000,000、至少约8,000,000、至少约9,000,000、至少约10,000,000、至少约11,000,000或至少约12,000,000个活细胞。

在某些实施方式中，RPE细胞疗法可以以约100,000个细胞/ml至约1,000,000个细胞/ml之间的细胞浓度配制。在某些实施方式中，RPE细胞疗法可以以约1,000,000个细胞/ml、约2,000,000个细胞/ml、约3,000,000个细胞/ml、约4,000,000个细胞/ml、约5,000,000个细胞/ml、6,000,000个细胞/ml、7,000,000个细胞/ml、8,000,000个细胞/ml、约9,000,000个细胞/ml、约10,000,000个细胞/ml、约11,000,000个细胞/ml、约12,000,000个细胞/ml、13,000,000个细胞/ml、14,000,000个细胞/ml、15,000,000个细胞/ml、16,000,000个细胞/ml、约17,000,000个细胞/ml、约18,000,000个细胞/ml、约19,000,000个细胞/ml或者约20,000,000个细胞/ml的细胞浓度配制。

在一些实施方式中，可以将RPE细胞组合物冻存并贮存在约-4℃至约-200℃之间的温度下。在一些实施方式中，可以将RPE细胞组合物冻存并贮存在约-20℃至约-200℃之间的温度下。在一些实施方式中，可以将RPE细胞组合物冻存并贮存在约-70℃至约-196℃之间的温度下。在一些实施方式中，适于冻存的温度或冻存温度包括约-4℃至约-200℃之间的温度或者约-20℃至约-200℃、-70℃至约-196℃之间的温度。

在一些实施方式中，在视网膜下腔施用所述细胞组合物。在其他实施方式中，所述细胞组合物是注射的。

在一些实施方式中，所述细胞组合物以单剂量治疗的形式施用。

在一些实施方式中，RPE细胞在治疗或药学上可接受的运载体或生物相容性介质中施用。在一些实施方式中，向受试者施用的RPE制剂的体积为约10μl至约50μl、约20μl至约70μl、约20μl至约100μl、约25μl至约100μl、约100μl至约150μl或者约10μl至约200μl。在某些实施方式中，可以施用两剂或更多剂10μl至200μl之间的RPE制剂。在某些实施方式中，RPE制剂的体积向受试者眼部的视网膜下腔施用。在某些实施方式中，视网膜下递送方法可以是经玻璃体或脉络膜上。在一些实施方式中，对于一些受试者而言，使用经玻璃体或脉络膜上视网膜下递送方法可以降低ERM的发生率。在一些实施方式中，可以将RPE制剂的体积注射至受试者的眼部。

可以治疗的受试者包括灵长类(包括人)、犬科、猫科、有蹄类动物(例如，马、牛、猪(例如，猪))、禽类和其他受试者。人和具有重要商业价值的非人动物(例如，家畜和家养动物)是特别关注的。可以治疗的示例性动物包括犬科动物；猫科动物；马；牛；绵羊；啮齿动物等和灵长类动物，特别是人。非人动物模型(特别是哺乳动物，例如灵长类、鼠类、兔形目等)可以用于实验研究。

可以将如本文所述产生的RPE细胞移植到受试者眼内或其他位置(例如在脑内)的不同靶位点。根据一个实施方式，RPE细胞的移植到达眼的视网膜下腔，这是RPE的正常解剖位置(在感光细胞外段和脉络膜之间)。此外，根据细胞的迁移能力和/或阳性旁分泌作用，可以考虑移植到另外的眼室，包括但不限于玻璃体腔、视网膜的内部或外部、视网膜周围和脉络膜内。

可以根据本领域公知的各种技术进行移植。用于进行RPE移植的方法如下所述，例如，美国专利号5,962,027、6,045,791和5,941,250，以及Eye Graefes Arch Clin ExpOpthalmol March 1997；235(3):149-58；Biochem Biophys Res Commun Feb.24,2000；268(3):842-6；Opthalmic Surg February 1991；22(2):102-8。用于进行角膜移植的方法如下所述，例如，美国专利号5,755,785，以及Eye 1995；9(Pt 6Su):6-12；Curr Opin OpthalmolAugust 1992；3(4):473-81；Ophthalmic Surg Lasers April 1998；29(4):305-8；Ophthalmology April 2000；107(4):719-24；和Jpn J Ophthalmol November-December1999；43(6):502-8。如果主要利用旁分泌作用，也可以将细胞包封在半渗透容器或可生物降解的胞外基质中，将其递送并保持在眼中，这也将减少细胞暴露于宿主免疫系统中(Neurotech USA CNTF delivery system；PNAS March 7,2006 vol.103(10)3896-3901)。

根据一些实施方式，通过部分(pars)平面玻璃体切除术后利用小的视网膜开口将细胞递送至视网膜下腔或通过直接注射进行移植。

可以在施用RPE细胞之前或同时向受试者施用糖皮质激素，例如泼尼松龙或甲泼尼龙、百力特(Predforte)。根据另一实施方式，在施用RPE细胞之前或同时不向受试者施用糖皮质激素，例如泼尼松龙或甲泼尼龙、百力特。

可以在治疗之前、同时和/或之后向受试者施用免疫抑制药物。免疫抑制药物可以属于下述类别：糖皮质激素、细胞抑制剂(例如，烷化剂或抗代谢药)、抗体(多克隆或单克隆)、作用于免疫亲和素的药物(例如，环孢菌素、他克莫司或西罗莫司)。另外的药物包括干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、霉酚酸酯和小型生物制剂。免疫抑制药物的实例包括：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、BAS1L1

(抗-IL-2Ra受体抗体)、环孢菌素(环孢菌素A)、

(抗-IL-2Ra受体抗体)、依维莫司、霉酚酸、RITUX

(抗-CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、他克莫司和/或霉酚酸酯。

免疫抑制药物可以例如局部、眼内、视网膜内或向受试者全身施用。免疫抑制药物可同时以那些方法的一种或多种施用，或递送方法可以以交错方法使用。

或者，可以施用RTA RPE细胞疗法组合物，但不使用免疫抑制药物。

可以在治疗之前、同时和/或之后向受试者施用抗生素。抗生素的实例包括Oflox、庆大霉素、氯霉素、Tobrex、Vigamox或已批准供眼用的任何其他局部抗生素制剂。

在一些实施方式中，在施用后细胞组合物不会引起炎症。在一些实施方式中，通过存在炎症相关的细胞，可以鉴定炎症。

AMD是一种进行性的慢性中央视网膜疾病，是世界范围内导致视力丧失的主要原因。由于下述两个过程之一，大部分视力丧失发生在该疾病的晚期：新生血管(“湿性”)AMD和地图样萎缩(GA，“干性”)。在GA中，发生视网膜色素上皮、脉络膜毛细血管和感光细胞的进展性萎缩。干燥形式的AMD更常见(占全部病例的85-90％)，但可能进展为“湿”型，如果不进行治疗，会导致快速和严重的视力丧失。

在美国和其他发达国家，AMD的患病率估计为2000分之一。随着老年人在总人口中所占比例增加，预计这一发病率会增加。该疾病的风险因素包括环境因素和遗传因素。

该疾病的发病机制涉及四个功能相关组织的异常，即视网膜色素上皮(RPE)、Bruch膜、脉络膜毛细血管和感光细胞。然而，RPE细胞功能受损是导致临床相关AMD改变的分子途径中的一个早期且至关重要的事件。

目前尚无已获批的用于干性-AMD的治疗。预防措施包括维生素/矿物质补充剂。这些降低了发展为湿性AMD的风险，但是不影响地图样萎缩(GA)进展的发展。

可以将细胞植入用于延缓该疾病的进展，其诱导RPE再生并使中央视力恢复。

没有RPE，感光细胞将无法工作。因此，通过识别视野中的盲点实现使用成像技术进行GA检测。在一些患有GA受试者的眼中，该疾病最初可能会以独特的模式进展，其避开了视敏度最高的视网膜区域(如中央凹)。在这些受试者中，中央凹仅在疾病的晚期受到影响。

因此，使用本文所述的方法可以测量视网膜疾病疗法(如细胞疗法)的治疗作用。在一个实施方式中，该方法包括对患有所治疗的视网膜疾病的受试者的眼部进行定量结构评估和定量功能评估。

可以采用所述方法测量治疗作用的疾病的非限制性列表包括视网膜色素变性，勒伯尔先天性黑蒙，遗传性或获得性黄斑变性，年龄相关性黄斑变性(AMD)，地图样萎缩(GA)，贝斯特氏症，视网膜脱落，回旋状萎缩，无脉络膜，图形样营养不良(pattern dystrophy)以及其他RPE营养不良，Stargardt病，由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或外伤的任一种引起的损伤导致的RPE和视网膜损伤。根据一个特定的实施方式，所述疾病是干性AMD。根据另一实施方式，所述疾病是GA。

FDA已经接受眼结构的测量作为在临床试验中用于评价视网膜疾病疗法的终点。在某些实施方式中，可以使用眼底自发荧光(FAF)成像进行眼结构测量。眼底自发荧光能够对患有视网膜疾病的眼的萎缩区域进行精确测量。在FAF成像中，萎缩区域出现高荧光(暗)，其周围是具有轻度高荧光的正常视网膜组织。在大部分患有GA的受试者中，萎缩区域被强的高荧光的边缘围绕。这种高荧光与凋亡和细胞死亡区域相关。根据所公开方法的实施方式，可以将测量高荧光用于确定疾病进展，特别是治疗之后的。可以通过围绕萎缩区域的强高荧光边缘的缩小或消失来证明疾病进展减缓或停止。

在某些实施方式中，如通过FAF成像后萎缩区域周围围绕的高荧光边缘的存在情况所证实的，可以使用植入衍生自hESC的RPE治疗患有具有活动性病变(即萎缩区域或疤痕)的GA的受试者，例如根据WO 2016/108219中所述的方法，其全部内容通过引用并入本文，或者类似方法或具有降低的免疫抑制的新方法。为了测量对疾病进展的治疗作用，首先，通过插入由FAF成像装置产生的一条线人为地将病变分成两半，其与治疗区域平行地穿过病变。然后，将线垂直移向治疗区域的对侧，直至病变的两部分具有相似的面积。在整个受试者随后的测量中，该线穿过视网膜病变区域的位置保持不变。随后，一半病变区域使用植入衍生自hESC的RPE进行治疗(治疗区域)，未对另一半病变进行治疗。

在治疗后的特定时间，然后可以将FAF用于检测任何高荧光，特别是在病变边缘周围，并且可以测量萎缩区域的尺寸。除了减少病变的总尺寸以外，还可以将病变周围围绕的高荧光边缘的尺寸减少或消失用来表示治疗延缓或阻止了疾病进展。可以测量病变经治疗的一半与病变未经治疗的一半的高荧光的差异，并用于确定治疗的功效。这样，可以将同一只眼作为治疗受试者和对照受试者。

可以利用FAF来确定治疗区域已从高荧光变为低荧光，从而表明疾病进展延缓或停止，这种方法是对目前使用FAF的治疗作用评估技术的改进。可以将这种改进的方法作为临床试验中治疗作用的替代指标。

在一个实施方式中，使用BluePeak蓝色激光自发荧光(Heidelberg EngineeringGmbH,Max-Jarecki-StraBe 8 69115 Heidelberg Germany)进行FAF。BluePeak是一种非侵入性的扫描激光眼底成像方法，其使用脂褐素作为指示剂可揭示视网膜的代谢应激情况。BluePeak成像可以揭示RPE和感光细胞功能障碍。

在另一个实施方式中，使用光学相干断层扫描(OCT)增强了使用眼底自身荧光二维成像进行的治疗作用评估。可以将OCT用于产生三维高分辨率图像，并且其可以为视网膜层的结构评估提供重要的横截面信息，尤其是在接受视网膜疾病治疗的受试者中。使用OCT，可以在施用视网膜病症治疗之前和之后获得视网膜各层的轮廓图像。在健康眼中，可以清晰可见视网膜组织各层的条带。而相反的是，例如，由AMD或GA引起的特征性缺陷可被视为RPE和感光细胞层中存在界限分明的退化区域。在存在GA的很多眼中，OCT图像能够显示出可以在Brunch膜与外部丛状层之间形成的楔形低反射结构。可以将对此类结构的鉴定和监测用于定义感光细胞层的OCT边界，这在旨在保留患有AMD和GA患者视网膜层活力的疗法的临床试验中很重要。

通过将OCT中对视网膜层的分段与眼底自发荧光的代谢图谱结合起来，可以更清楚地看到与功能改变相关的形态学变化。使用专门的软件，可以对FAF图像中可见的病变区域随时间的变化进行量化和跟踪。还可以鉴定治疗作用(包括覆盖病变的RPE再生区域)，并且可以通过测量视网膜厚度来量化RPE的恢复情况。

目前，OCT可能并非总是临床试验中评估视网膜形态的标准方法。然而，根据所公开方法的实施方式，当将OCT与其他结构和功能评估技术结合使用时，可以优化对治疗作用的测量，从而能够通过需要更少患者来缩短临床试验时间。

本文所述方法的另一个方面包括用于测量对视网膜疾病的治疗作用的功能评估组件。目前有几种可用的功能性评估技术，包括低亮度视敏度、对比灵敏度评估、阅读速度评估、微视野测量和生活质量评估。在一个实施方式中，描述了使用微视野测量的改进方法。

低亮度视敏度和对比灵敏度可测量亮度和对比度对整体视觉功能的影响，但无法对视网膜特定区域的功能进行更详细的评估。在黄斑或中央凹中GA或其他视网膜疾病病变的特定位置能够决定视力结果。因而，对于患有诸如GA病症的受试者而言，高水平的细节对于视力的功能性评估是重要的。

在微视野测量中，使用光点刺激视网膜的特定区域，并且受试者按下按钮以确认对刺激的感知。除了识别功能和非功能区域以外，可以对刺激强度进行改变以鉴定视网膜特定区域的相对灵敏度。可以使用红外照相机对眼底进行监测，并且可以将视野的灵敏度映射到眼底照片上，并与使用其他技术获得的图像进行比较。

在一些实施方式中，在治疗程序后约1天(24小时)、1周、约2周、约3周、约4周、约5周内注射部位愈合。在其他实施方式中，在施用RPE细胞后约1天至约30天内注射部位愈合。在另外的其他实施方式中，在5天至约21天内或者在约7天至约15天内施用套管的部位愈合。

在一些方面中，当与年龄匹配、性别匹配的对照，受试者的基线或对侧眼的测量结果进行比较时，使用本文所述RPE细胞治疗的受试者的BCVA在约1天、约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月后显示出BCVA增加。在一些方面中，当与年龄匹配、性别匹配的对照，受试者的基线或对侧眼的测量结果进行比较时，使用本申请所述RPE细胞组合物治疗的受试者的BCVA从使用RPE细胞治疗后约1个月至约1年显示出BCVA增加。

在一些实施方式中，使用本文所述RPE细胞治疗的受试者的视网膜下色素沉着在施用治疗后约1个月至约24个月是稳定的。在一些实施方式中，使用本文所述RPE细胞治疗的受试者的视网膜下色素沉着在施用治疗后约2个月至约12个月、约3个月至约11个月、约1个月至约6个月、约4个月至约18个月是稳定的。

在一些实施方式中，在将RPE细胞施用给受试者后约1个月至约24个月，视网膜下色素沉着是稳定的。在一些实施方式中，在将RPE细胞施用给受试者后约2个月至约24个月，视网膜下色素沉着是稳定的。在一些实施方式中，在将RPE细胞给予受试者后约2个月至约12个月、约3个月至约11个月、约1个月至约6个月、约4个月至约18个月，视网膜下色素沉着是稳定的。

经历同种异体细胞移植程序(如本文所述的那些)的受试者可能产生对这些细胞的免疫应答，从而限制了其存活和功能。因此，在施用RPE细胞之前和/或之后，受试者可能接受全身性免疫抑制疗法(根据药物处方信息可进行低剂量的免疫抑制)，其由玻璃体切除术后常规的局部类固醇治疗和长期全身性治疗。

在其他实施方式中，受试者将接受1天至3个月的免疫抑制。在其他实施方式中，在施用RPE细胞治疗后，受试者将接受1天至3个月的免疫抑制。一种方法是提供泼尼松龙或地塞米松滴剂疗程，每天4-8次，逐渐减量。由研究人员酌情决定，从移植前至多两周持续至移植后至多六周，每天系统性(PO)给予0.01mg/kg他克莫司(应将剂量调整为达到3-7ng/mL的血液浓度)。

可以使用系统性(PO)霉酚酸酯，至多2克/天，从移植前至多两周开始服用，并在移植后持续一年。

在一个方面中，一种增加待针对干性-AMD进行治疗的受试者的安全性的方法不包括施用免疫抑制剂。在其他方面中，治疗紧急不良事件的发生率和频率低于当向受试者施用免疫抑制剂时。

实施例

现在参考以下非限制性实施例，其与以上描述一起示出了本公开的一些实施方式。

在通常情况下，本文所使用的命名法和在本公开中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。在文献中对这样的技术做出了详细的解释。参见例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook等,(1989)；"CurrentProtocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,NewYork；Birren等.,(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中列出的方法学；"Cell Biology:ALaboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of AnimalCells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites等,(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定，参见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；"Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984)；"AnimalCell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRLPress,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide ToMethods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual"CSHL Press(1996)；其各自通过引用并入本文，就如同在本文中完全示出一样。在本文件通篇提供了其他一般性的参考文献。据信其中的程序是本领域技术人员熟知的，并且是为了方便读者才提供的。其中包含的所有信息均通过引用并入本文。

RPE细胞生物活性的基本原理是，可以将衍生自hESC的RPE细胞安全地移植到因RPE细胞变性而导致黄斑变性疾病的患者的视网膜下腔中，这样将使用功能性RPE替代死亡或濒死的RPE并导致包括降低萎缩区域的增长速率并且相关的延缓或停止视力丧失在内的生物学获益。使用功能性RPE移植可能导致：1)重建功能性RPE层，2)保存现有的感光细胞，3)创建有利于现有细胞和细胞功能和/或结构的持续存活的微环境，和4)最终延缓或逆转疾病进展，从而保持视敏度。

如本文所述的RPE细胞移植物降低、减少或终止GA进展以及相关的视力功能丧失；基于微视野检查和/或多焦点ERG保持移植物区域的感光细胞功能；如通过受累区域椭圆体带(EZ)的变化所确定。证实正常解剖结构区域的改善或恢复，通过OCT证明RPE的植入，以及改善的视网膜的厚度。另外，RPE移植物保持中央凹区域的视力，改善BCVA、低亮度测试和/或读取速度。

在某些受试者(例如，患者)中，GA病变尺寸可以是从约0.1mm²至约500mm²；从约0.5mm²至约30mm²；从约0.5mm²至约15mm²；从约0.1mm²至约10mm²；从约0.25mm²至约5mm²；从约5mm²至约50mm²；从约100mm²至约500mm²；从约2mm²至约25mm²。可以通过本文所述的方法或本领域公知的方法测量GA病变尺寸。

排除标准包括：患者不能进行玻璃体切除术，或者有葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变、CRVO、BVO、AION、视神经萎缩、正在进行使用抗-VEGF对湿性AMD进行活性治疗的疗法、晚期青光眼、糖尿病性视网膜病变、血管阻塞、葡萄膜炎、渗出性视网膜炎(Coat's disease)、青光眼的病史，有晶状体植入(phakic)或者存在中度至重度ERM。

在一个实施方式中，RPE细胞移植物以例如解冻和注射制剂以100-250K RPE单次注射的形式施用。RPE移植物可能需要待确定的重复给药。在另一个实施方式中，以100-250K RPE单次注射形式施用RPE移植物，无需重复给药。在某些实施方式中，施用包括经玻璃体视网膜下注射。在其他实施方式中，施用包括经玻璃体视网膜下注射。

实施例1

临床方案

在患有晚期干性AMD伴GA的患者中进行的渐增剂量I/IIa期临床研究中评价了本文所述RPE细胞的安全性和耐受性。在组(cohort)1中的患者(患者1、2和3，年龄74-80岁，BCVA为20/200或更低)接受目标剂量50,000个RPE细胞，体积为100μl。在组2中的患者(患者4、5和6，年龄65和82岁，BCVA也为20/200或更低)接受目标治疗剂量200,000个RPE细胞，体积为100μl。组3(患者7、8和9，其BCVA为20/200或更低)接受100,000个细胞，体积为50μl。本文讨论的RPE细胞成功施用，并且未见严重不良事件。视网膜成像数据表明，所施用的RPE细胞已植入患者体内，并沉降为单层，这是天然RPE的特征。至少对于第1位患者，RPE细胞在一年后持续存在。第2位患者在6个月时间点显示出类似结果。其他受试者组将使用200,000至500,000个RPE细胞之间的更高剂量。

组1的数据显示出稳定的视力和FAF读数，这表明在已完成9个月和12个月时间点读数的患者中具有生物活性。此外，该初始数据表明，移植到患者体内的RPE细胞植入和存活至少一年，甚至可能更长时间。还有一些生物活性的早期迹象。

研究设计包括分成四个组的患有晚期干性形式AMD和地图样萎缩(GA)患者的单中心I/IIa期研究：前3个组，每个由最佳校正视敏度为20/200或更低的3名法定失明患者组成，接受RPE细胞的单次视网膜下注射，使用从50xl0³个细胞(组1)至200xl0³个细胞(组2和组3)的渐增剂量。第4个组包括最佳校正视敏度从20/64至约20/400、从20/70至约20/400或者约20/64或更低的9名患者，其将接受200,000至500,000个RPE细胞的单次视网膜下注射。

玻璃体切除术后，通过小视网膜切开术通过套管将细胞递送至黄斑区的视网膜下腔。在有GA扩张风险的区域中注射总体积最多约50-250μl细胞悬液。

与手术程序一起，患者还可以接受轻度免疫抑制和抗生素治疗，包括下述：

1.玻璃体切除术后通常采用局部类固醇和抗生素治疗：在6周时间内，使用局部类固醇疗法(Predforte滴剂，每日4-8次，逐渐减量)和局部抗生素滴剂(Oflox或等同物，每日4次)。

2.从移植前1周开始持续至移植后6周，全身性(PO)他克莫司(Tacrolimus)，每日0.01mg/kg(应将剂量调整为达到3-7ng/mL的血液浓度)。

3.从移植前2周开始持续至移植后1年，给予全身性(PO)霉酚酸酯(Myophenoalte)，共计2gr/天。

方案增强可以将所需免疫抑制的持续时间从12个月缩短至3个月。这对患者而言意义重大。我们计划在不进行免疫抑制的情况下施用RPE细胞，并期望具有增加的安全性以及相同或改善的功效。

在施用所述细胞后的整个12个月中，以预定时间间隔对患者进行评估。在手术后15个月以及2、3、4和5年进行研究后随访。

患者的纳入标准包括下述因素：年龄55岁及以上；诊断为双眼干性(非新生血管性)年龄相关性黄斑变性；对黄斑中有地图样萎缩的干性AMD的眼底镜检查发现，在研究眼有尺寸大于0.5视盘(disc)面积(1.25mm²至17mm²)和对侧眼中有尺寸大于0.5视盘面积；通过ETDRS视力检测，在研究眼中，在组1-3中最佳校正中央视敏度等于或小于20/200和在组4中等于或小于20/64；非手术眼的视力必须优于或等于手术眼的视力；患者健康状况良好，可以参加所有与研究相关的程序并完成研究(病历)；能够在有监护的麻醉下进行玻璃体视网膜手术程序；血液计数、血生化、凝血和尿常规正常；HIV、HBC和HCV阴性，CMV IgM和EBVIgM阴性；根据年龄匹配的筛查检查(由研究医师酌情决定)，患者无当前或恶性肿瘤病史(成功治疗的皮肤基底/鳞状细胞癌除外)；在手术前7天，患者能够停止服用阿司匹林、含有阿司匹林的产品和任何其他凝血调节药物；愿意推迟所有将来的血液和组织捐赠；能够理解并愿意签署知情同意书。

患者的排除标准包括下述因素：基线时在任一只眼中，有新生血管性AMD病史证据，以及通过临床检查、荧光素血管造影(FA)或眼相干断层扫描(OCT)有新生血管性AMD证据；有糖尿病性视网膜病变、血管闭塞、葡萄膜炎、渗出性视网膜炎(Coat's disease)、青光眼、白内障或妨碍后极视力的屈光间质(media)混浊或者除AMD以外的任何显著眼病(已损害或可以损害研究眼的视力并混淆主要结果的分析)的病史或者目前患有上述疾病；研究眼有视网膜脱落修复病史；轴向近视大于-6屈光度；在过去3个月内，研究眼进行过眼科手术；有认知障碍或痴呆的病史；有全身性免疫抑制禁忌症；研究眼有除AMD以外的与脉络膜新生血管生成相关的任何其他病症的病史(例如，病理性近视或推定的眼组织胞浆菌病)；目前患有或有下述疾病病史：癌症、肾病、糖尿病、在过去12个月的心肌梗死、免疫缺陷；女性；妊娠或哺乳；目前参与另一项临床研究。过去(在6个月内)参与全身或眼施用药物的任何临床研究。

可以通过移植物存活的持续时间以及通过检查之后GA进展的速率、移植物区域中的视网膜灵敏性、中央盲孔的程度和深度以及视敏度的变化来测量功效。

不良事件(AE)指受试者、使用者或其他人的任何不利的医学事件、意外疾病或伤害或者任何不利的临床指征(包括异常实验室检查结果)，无论其是否与研究药物治疗相关。

严重不良事件(SAE)指导致死亡、受伤或永久性损害身体结构或身体功能，导致受试者健康严重恶化的不良事件，受试者健康严重恶化可能导致：危及生命的疾病或损伤，或身体结构或身体功能的永久性损伤，或为了防止危及生命的疾病而住院或延长正在进行的住院或需要进行药物或手术治疗，导致胎儿窘迫、胎儿死亡或先天性异常或出生缺陷。

在研究中，未报告与治疗相关的SAE。

在本实施例中，选择用于RPE施用的眼是视觉功能最差的眼。手术由外科医师酌情决定并与患者讨论，其可以通过球后或球周麻醉阻滞并伴以监测的静脉镇静或全身麻醉下进行。根据机构规程，以无菌方式准备和遮盖接受手术的眼部。在放置开睑器后，进行标准3端口玻璃体切除术。其可以包括放置一个23G输注套管和2个23G端口。在对玻璃体腔中的输注套管进行目测检查后，开放输注管线以确保在整个手术过程中保持眼球的结构。然后，可以使用标准的23G仪器仔细进行核心玻璃体切除术，随后分离后玻璃体面。这使得能够通畅地进入后极。

在该实施例中，在后极内的预定位置将RPE引入视网膜下腔，最好在仍相对保持在GA边缘附近的区域穿透视网膜。避开血管。通过形成体积为50-150μl的小泡将细胞递送至视网膜下腔。

递送系统可以包括1mL注射器，该注射器通过10cm延长管与Peregrine 25G/41G柔性视网膜套管连接。

可以去除任何回流到玻璃体腔中的细胞，并且可以进行流体-空气交换。在除去输注套管之前，可以进行仔细检查以确保没有造成医源性视网膜撕裂或破裂。然后，可以除去输注套管。可以施用结膜下抗生素和类固醇。可以在眼部覆盖敷料和塑料护罩。可以记录手术施用程序。

在该实施例中，使用低剂量50,000个细胞/50-150μl或50,000个细胞/100μl，中剂量200,000个细胞/100μl(或100,000个细胞/50μl)和高剂量500,000个细胞/50-100μl。根据临床前研究中检测的最大可行剂量的安全性进行剂量选择，并且根据眼和小泡尺寸计算人等效剂量。

本文中提供的治疗包括视网膜下递送的治疗性RPE细胞的悬液。其是高度纯化的、分化的人多能干细胞，也是“无xeno”的，指在衍生和生产过程中的任何时候都不会使用任何动物产品。(例如，参见Idelson M等，2009."Directed differentiation of humanembryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells."CellStem Cell Oct 2,5(4):396-408和Tannenbaum SE等，2012."Derivation of xeno-freeand GMP-grade human embryonic stem cells-platforms for future clinicalapplications."PLoS One.7(6):e35325，这两者的全部内容均通过引入并入本文)。

在临床阶段研究中施用的RPE细胞针对干性AMD的主要未满足的医疗需求。年龄相关性黄斑变性或AMD是60岁以上人群失明的主要原因。据估计，罹患干性-AMD的人数是湿性AMD的数量的9倍。然而，目前尚无已获批的用于干性AMD的产品。

实施例2

在2名初始受试者中RPE细胞的生长和存活

使用本文所述方法的实施方式，在2名初始受试者中测量了衍生自hESC的RPE细胞植入物治疗干性AMD和GA的作用。如上文所述，根据WO 2016/108219中所述的方法，或类似方法或者使用减少的免疫抑制的新方法，使用衍生自hESC的REP植入物对2名受试者进行治疗。使用OCT通过测量视网膜厚度的增加证明RPE的新生长。还收集到了表明植入细胞可以在移植后在视网膜下存活6个月的数据。图1显示了基于细胞的疗法的实例的示意图，该疗法用于替代或支持或者替代和支持具有GA的干性AMD中的功能障碍和变性的RPE。

使用FAF测量了在这2名初始受试者中病变的尺寸。此外，使用改进的方法测量病变周围的高荧光边缘尺寸，以确定植入细胞是否影响了疾病进展。

从这2名受试者中收集的数据表明，在最靠近治疗区域的一半病变中，高荧光减少或消失，这表明疾病进展已停止。

实施例3

临床研究组1和2的安全性和功效结果

提供了组1(患者1、2和3)中患者的安全性和成像数据，其接受了50,000个RPE细胞悬液的视网膜下移植，和组2(患者4、5和6)中患者的安全性和成像数据，其接受了200,000个RPE细胞悬液的视网膜下移植。

患者是老年人，具有显著的视力丧失以及大面积具有临床显著性的GA。受试者的人口统计学和基线特征如表1中所示。

表1：基线时受试者的年龄和AMD特征

对于组1和2，在局部麻醉下的23G玻璃体切除术后，通过视网膜下注射进行RPE细胞移植。例如，可以按照如WO 2016/108219中所述的那些方法进行注射，其全部内容通过引用并入本文。对于组1和2中的患者，从移植前1周到术后1年进行全身性免疫抑制。然而，还可以使用不包括免疫抑制的方法。密切监测全身和眼部的安全性。使用各种技术评估视网膜功能和结构，包括BCVA、彩色和眼底自发荧光(FAF)成像和OCT。

在图2A中，提供了在组1(患者(Pt.)1、2和3)的治疗眼的最佳校正视敏度(BCVA)。如图中所示，患者1、2或3治疗眼的BCVA未下降。尽管患者2显示出显著改善，但是其可能部分与手术期间出现的玻璃体透明和囊后混浊有关。对侧眼的BCVA如图2B中所示，在已检测的一年中其保持稳定。

在组2(患者4、5和6)的治疗眼中，BCVA保持稳定且未出现下降，且其在对侧眼中保持稳定，如图2C至图2F中所示。每位患者的治疗眼如图2C和图2E中所示。

视网膜包含眼睛中的神经感觉组织，该组织将光学图像转化为大脑能理解的电脉冲。还将记录视网膜的眼底照片用于监测疾病进展和治疗作用。手术前(pre-op)和手术期间(intra-op)时间点组1的彩色眼底图像如图3中所示。将在注射治疗性RPE细胞悬液后出现的视网膜下小泡(治疗区域)的边界在手术期间图像中用箭头突出显示。手术顺利，视网膜下液在不到48小时内被吸收。如图3中所示，组1的患者出现了大面积GA进展，术中获得的图像证明移植细胞的正确放置。

在图4中显示并比较了组1在手术前和2个月时间点的彩色眼底图像。术后，患者1和2在最初的2-3个月内显示出在视网膜下小泡下部形成的视网膜下色素沉着的区域。如图5中所示，在最初的2-3个月后，视网膜下色素沉着开始稳定。

转到图6，提供了患者1在手术前，手术后1天、1周、2个月、4.5个月和9个月时间点的蓝色自发荧光图像。接受治疗受试者的蓝色眼底自发荧光(FAF)成像有助于说明大面积的GA和经RPE细胞治疗的视网膜下限(用虚线表示)。这些FAF图像还显示了在特定时间点移植的RPE细胞的证据，如黑色箭头所示。

患者2在手术前，手术后1天、1周、2个月、6个月和9个月时间点的蓝色自发荧光图像如图7中所示。患者3在手术前，手术后1天、1周、2个月、7个月和9个月时间点的蓝色自发荧光图像如图8中所示。

在最初2-3个月的过程中，患者1和2的视网膜下小泡下部区域出现了视网膜下低荧光和高荧光斑点，此后稳定下来。图6和图7显示了细胞数、色素上皮(PE)发展和由RPE细胞覆盖的表面积的逐渐增加，如图6术后图像右上角的黑色箭头所示。

图9显示了接受了200,000个RPE细胞悬液的剂量的患者4(组2)手术时(第0天)的彩色图像，术后第1天的FAF和彩色图像，以及术后2个月、3个月、4个月和6个月的彩色图像。在小泡区域的边界处，在长达6个月可见视网膜下色素沉着。如图中所示，重力能够导致细胞沉降以及色素沉着定位于小泡边界。

图10显示了患者5(组2)在第0天以及术后第1个月、第2个月、第3个月和第6个月的彩色图像以及相应的FAF图像，该患者也接受了200,000个RPE细胞悬液的剂量。如图10中所示，治疗耐受性良好，并且到第6个月仍可见稳定的色素增加。

图11显示了注射部位的愈合。如图中所示，视网膜下液迅速吸收(少于48小时)，并且OCT图像显示2周内套管穿透的视网膜部位愈合(箭头所示)。在一些病例中出现了薄视网膜前膜(ERM)。

可以将OCT扫描用于分析使用RPE细胞治疗后过渡区(transition zone)的变化。在视网膜退行性疾病中，过渡区出现在包含健康感光细胞的相对正常的视网膜与感光细胞严重萎缩(例如，GA病变，前-GA病变)的严重受累的视网膜之间。使用OCT扫描对组1(患者1、2和3)和组2(患者4和5)中的患者进行了过渡区分析。

在手术前以及手术后1周、1个月和1年时间点对患者1进行了OCT扫描，如图12中所示。在手术前以及手术后1个月和9个月时间点对患者2进行了OCT扫描，如图13中所示。图14显示了在手术前以及手术后3个月和9个月时间点对组1中的患者3进行的OCT扫描。图15显示了在手术前以及手术后1个月时间点对组2中的患者4进行的OCT和红外OCT扫描。图15显示了在手术前以及手术后1个月时间点对组2中的患者4进行的FAF(第1栏)、红外OCT扫描(第2栏)和OCT扫描(第3栏)。

图12、图13和图15中的术后OCT扫描显示了治疗区域视网膜下腔中的不规则反射(黄色箭头)，包括基线时萎缩的区域(图12中的绿色箭头)。这种不规则反射能够表明在视网膜下腔中存在新的RPE细胞。组2中受试者的图像显示了移植hESC-RPE细胞的视网膜下分层。提供了基线时以及1个月和9个月随访时拍摄的眼底自发荧光(FAF)、红外SLO(IR SLO)和光谱域OCT(SD-OCT)图像。白色竖线显示了在IR SLO和OCT图像中地图样区域的界线。绿线表示在右栏中的SD-OCT扫描。黄色虚线表示使用RPE细胞治疗的视网膜下限。这条线来自手术后立即拍摄的眼底照片，并且将其叠加到其他图像模式上。

转到图15中的眼底图像，随着时间的推移，在治疗小泡下部可见低荧光(hypofluorescent)的斑点，表明疾病进展减慢。在小泡的边界还可以见出现色素沉着。在图15的红外OC图像中(中间栏)，术后1个月可见色素细胞遮盖了GA的上部(红线表示GA的边界)。这表明细胞能够迁移并均匀地覆盖GA上部，并且并未仍定位在小泡边缘。由于红外OCT能够穿透视网膜的多层，因而能够观察到细胞、正常组织和疤痕。

在图15的最后一列中，在术前OCT图像中，GA区域可见裸露的RPE细胞。然而，术后1个月和9个月拍摄的OCT图像显示RPE细胞已植入(黄色箭头)。在1个月时，可见均匀的RPE细胞单层覆盖了术前图像中显示的缺陷，表明色素上皮和视网膜厚度得以恢复。在9个月时，色素上皮的厚度与GA边界线左右两侧所示的正常细胞区域一样厚。此外，在椭圆体带(EZ)中的一些区域显示出结构改善。EZ是与视觉功能相关的视网膜的重要区域，其中RPE细胞与感光细胞接触，并且该区域是视网膜中视觉过程开始的区域。

图16显示了组2的患者5(200,000个RPE细胞悬液剂量)在基线以及手术后1周、2周、1个月、2个月、3个月和6个月时间点的OCT扫描。在患者5中未观察到水肿或囊肿(当存在自身免疫反应时会出现)，表明该治疗具有良好的耐受性并且省去免疫抑制剂的该方法将产生相当的结果。

视网膜下移植在所有患者中具有良好的耐受性，并且来自组1和2(接受50,000或200,000个细胞的悬液)的长达15个月的随访的累积数据未显示出严重的全身性以及预料之外的眼部不良效应。将衍生自hESC的RPE移植到患有晚期干性AMD患者的视网膜下腔后，SD-OCT图像显示套管穿透视网膜的部位在2周内愈合。BCVA保持稳定，并且在大多数患者中，OCT成像中与不规则视网膜下高反射(hyperreflectance)相关的视网膜下色素沉着很明显，这表明视网膜下腔中存在新的RPE细胞。这些结果为将来在使用更高剂量的细胞治疗的组中进行结构和功能评估提供了框架。

实施例4

在猪眼中的视网膜下移植hESC-RPE细胞

将通过上文所述的方法获得的衍生自人胚胎干细胞的RPE细胞(hESC-RPE细胞)视网膜下移植到猪眼中，以进一步分析安全性和细胞存活。在手术后3个月进行OCT扫描(图17)并且在视网膜下腔中显示出不规则的反射性(右上方图像中的黄色箭头)，这与在组1和2的治疗患者中观察到的结果类似(见图12至图16)。可以将这种不规则的反射性与小泡边界之外的区域进行比较，其中该层的反射性是均匀的(粉红色箭头)。

还进行了组织学分析。进行了使用人特异性标志物TRA-1-85的免疫组化(ICH)。TRA-1-85抗原是在几乎所有人细胞类型中表达的细胞表面决定簇，并且将其用于体细胞杂交研究以鉴定人类来源的组织。经组织学检查，在视网膜下移植的人细胞的分层是明显的(如图17中所示，红色)。这些结果表明，施用数月后，在OCT扫描显示出不规则反射性的区域中存在植入的RPE细胞，能够将其与那些天然的猪RPE相区分。

实施例5

衍生自hESC的RPE细胞在NOD-SCID小鼠中的致瘤性、植入和存活

在长达9个月中，在NOD-SCID小鼠中对衍生自hESC的RPE细胞的致瘤性、植入和存活进行了检测。在该测定中，将100,000个衍生自hESC的RPE细胞的悬液注射进入NOD-SCID小鼠的视网膜下腔中。根据上文所述的方法制备衍生自hESC的RPE细胞。阳性对照组接受视网膜下注射的hESC片段(fragment)。载剂对照组注射BSS Plus。

如表2中所示，在视网膜下注射剂量为100,000个细胞的衍生自hESC的RPE的142只小鼠中未见畸胎瘤或人类肿瘤。令人吃惊的是，在视网膜下注射衍生自hESC的RPE的小鼠的组中未见畸胎瘤，其中衍生自hESC的RPE细胞悬液含有至多10％的hESC，这比注射到人类受试者中的高1000倍。在9个月时发现，少于5％的小鼠中含有罕见的hESC-RPE增殖细胞。如表2中所示，在注射了剂量为100,000个细胞悬液的类似于衍生自hESC的RPE细胞而制备的hESC的小鼠中，该悬液显示出视网膜下畸胎瘤形成的可能性降低(小于15％)。在注射hESC片段的大部分(54.5％-80％)阳性对照动物中发现了畸胎瘤，如图18中所示(箭头表示良性畸胎瘤)。

表2：视网膜下注射后9个月时hESC、hESC片段和衍生自hESC的RPE的致瘤性和存活

对注射了剂量为100,000个细胞的悬液的衍生自hESC的RPE细胞的那些小鼠9个月后的视网膜下腔采用组织学方法测量了长期持续植入和存活。如表2中所示，89.5％-96.4％的注射小鼠在视网膜下腔中具有色素细胞和83％-93％具有RPE。图19显示了在注射含100,000个衍生自hESC的RPE细胞悬液的小鼠的视网膜下腔中的衍生自hESC的RPE(箭头指向视网膜下腔中的衍生自hESC的RPE)。图20显示了HuNu+PMEL17+染色细胞的图像，表明在注射100,000个衍生自hESC的RPE细胞的小鼠中9个月后在视网膜下腔中衍生自hESC的RPE细胞的存在。使用抗人细胞核抗体对人细胞核染色，并使用DAPI对小鼠细胞核进行复染。

对NOD-SCID小鼠(雄性和雌性)视网膜下施用剂量至多100,000个衍生自hESC的RPE表明在持续9个月的研究期间衍生自hESC的RPE细胞在视网膜下腔中长期一致存活并且无产品相关的畸胎瘤/肿瘤/异常。施用至多10％hESC杂质的衍生自hESC的RPE不会导致畸胎瘤的形成。

此外，图21显示了在使用指示人细胞存在的染色的下述3个动物物种的视网膜中衍生自hESC的RPE的植入和存活：衍生自hESC的RPE移植后19周的RCS大鼠、衍生自hESC的RPE移植后9个月的NON-SCID小鼠和衍生自hESC的RPE移植后3个月的猪视网膜。在RCS大鼠视网膜图像中的箭头表示抗-GFP染色和RPE细胞植入的位置，在NOD-SCID小鼠视网膜图像中的箭头表示抗人细胞核染色，以及在猪视网膜图像中的箭头表示人特异性标志物TRA-1-85的染色。

实施例6

临床研究的组3中患者8的安全性和功效

如上所述，视网膜下向患者8施用50μl的100,000个衍生自hESC的RPE细胞。图22A是手术前拍摄的蓝色自发荧光图像，显示了GA的基线图像(深色区域)，未来小泡边界的轮廓(虚线)和精确的植入位置(星号)。图22B是在手术前拍摄的彩色眼底图像，显示了GA的基线图像(深色区域)，未来小泡边界的轮廓(虚线)和精确的植入位置(星号)。图22C是手术时拍摄的植入的小泡的彩色图像。

图23显示了1个月时的彩色眼底图像。1个月时，在小泡的上方区域可见轻微的视网膜下低荧光。

图24A、图24B和图24C是分别在1个月、2个月和3个月时拍摄的蓝色自发荧光图像。如图像中所示，随着时间的推移，在治疗小泡下部可见低荧光的斑点，表明疾病进展减慢。在小泡区域内还可见出现色素沉着斑点。

图25、图26和图27显示了患者8在基线(手术前)以及1个月、2个月和3个月时间点在过渡区不同横截面的红外和相应的OCT图像。在基线和1个月时间点的图25和图26的OCT图像中的垂直箭头显示了在这些时间点存在的一些玻璃膜疣体。在使用衍生自hESC的RPE细胞组合物治疗后的2个月和3个月观察到这些玻璃膜疣显著减少。此外，在3个月时间点拍摄的OC图像显示了椭圆体带的恢复和重建，如水平箭头突出显示的区域所示。根据椭圆体带分析，这些图像表明椭圆体带恢复。椭圆体带分析包括例如椭圆体带的目测分析。椭圆体带分析包括椭圆体带的目测分析，其中将受试者的椭圆体带与年龄匹配、性别匹配对照、受试者的基线或受试者的对侧眼进行比较。

例如，通过对包含椭圆体带(EZ)的内段和外段——内段和外段(IS/OS)连接的主观评估来指示恢复。通过正常结构的重塑来指示恢复(如图25、图26和图27中的下图所示)。例如，通过与年龄匹配、性别匹配对照，受试者的基线或受试者的对侧眼相比正常结构的重塑来指示恢复。正常结构的重塑表明视力可能恢复。例如，恢复如主观评估所示，例如开始能够看到下述中的一个或多个：外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)、感光细胞的外段和玻璃膜疣消失。在一些受试者中，网状假性玻璃膜疣消失。在一些实施方式中，恢复由视网膜基本基础层的有序化所证实，12-14个视网膜层的2-6个有序化。

例如，恢复是对以下一个或多个变得更加有序的主观评估，包括外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)、感光细胞的外段、玻璃膜疣消失和网状假性玻璃膜疣消失。恢复还可以包括对一个或多个视网膜的基本基础层变得更加有序的主观评估。如在本文中使用的，变得更加有序的视网膜的基本基础层包含下述中的一个或多个：外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)和感光细胞的外段。

组1-3的FAF图像中可见均匀的棕褐色，这与色素细胞一致，而相反的是，作为RPE损伤后的响应，当色素分散发生时，则呈现黑色。在至少4名患者中，在小泡区域内和GA边界的外部和内部两者可见色素变化。FAF图像中可见的色素沉着以及自发荧光区域的这些变化与在OCT图像中的发现(可以将新的视网膜下材料视为是在患者RPE已消失的区域中的精细层组装RPE)相对应。这些结果表明植入的衍生自hESC的RPE细胞具有存活和植入到宿主视网膜的能力。

手术安全性评估可以包括在手术部位处未愈合的视网膜脱落，增殖性玻璃体-视网膜病变(PVR)，视网膜下、视网膜或玻璃体内出血以及对相对仍然健康的视网膜的损伤。然而，在本研究的任何组中均未观察到这些事件。小泡的形成不会对RPE或神经感觉层造成干扰。类似地，未出现视网膜的破坏或破裂。缺乏视网膜破坏是值得注意的，因为覆盖GA的视网膜更薄并且不能忽略导致视网膜破坏的风险。

使用多种成像模式的结果表明在人类受试者的视网膜下腔中存在细胞，在使用衍生自hSEC的RPE细胞研究的小鼠、大鼠和猪模型的动物数据支持了这一观察结果。手术程序具有良好的耐受性，SD-OCT图像显示了手术后不到48小时小泡中的视网膜下液吸收，以及在几周内套管穿透的视网膜的部位愈合。在这些晚期患者的治疗眼中，BCVA保持稳定。在大多数患者中(5/6)，与OCT上不规则的视网膜下高反射相关的视网膜下色素沉着是明显的，表明在视网膜下腔存在细胞。

在后续组中将有另外的方法，以主动评估视觉改变，并且基于这些结果将引入另外的各种客观和主观评估，如微视野检查、低发光视敏度、阅读速度等，以确定潜在功效。

实施例7

视网膜下RPE植入的手术程序

手术程序基于常规的Pars Plana玻璃体切除术(PPV)，然后视网膜下注射RPE细胞的细胞悬液。

手术前阶段

手术眼的瞳孔放大

·1％盐酸环戊酸酯(Cyclopentolate Hydrochloride)(q 5分钟x 3)

·2.5％盐酸去氧肾上腺素(q 5分钟x 3)

·1％托吡卡胺(Tropicamide)(q 5分钟x 3)或

·根据研究中心的手术标准规程

麻醉

·眼球后或筋膜下阻滞

·根据外科医师的标准可以进行全身麻醉

·根据外科医师的标准可以施用轻度镇静

·根据护理标准给予周围或球后麻醉剂(常用的组合由2％利多卡因和0.75％布比卡因组成)

清洁

·聚维酮-碘溶液或按照研究中心的手术标准程序

玻璃体切除术

·进行标准3端口(port)部(pars)玻璃体切除术。

·DORC与23G兼容。

ο 23G套管针系统。

ο组合式23G/25G套管针系统

ο可以加入用于“枝形吊灯”型照明的第4个套管针

·使用40mg/ml曲安西龙(眼用)(浓度为4％)染色玻璃体并确保后玻璃样体(hyaloid)完全分离：

ο将未经稀释的曲安奈德(triamcinolone acetonide)(0.1至0.3ml)通过软头套管注射进入玻璃体腔，旨在朝向待可视化的区域(例如，视盘和后极)

·除去术前确定的任何玻璃体牵拉(例如，玻璃体黄斑牵拉，明显的视网膜前膜)。

·任选地使用术中OCT(如果有的话)，以确认后玻璃体面的完全分离已经完成。

递送装置(DD)的准备

·通过使用注射器吹打小药瓶中的细胞悬液，小心地将RPE细胞混合2-3次

·将0.35mL RPE细胞的细胞悬液装入注射器中

·向上握住注射器，同时取下18G针头，并通过推动柱塞并轻轻敲击注射器排出所有空气和气泡

·将注射器与DORC递送装置的延长管连接

·用RPE细胞悬液填充DORC可延伸的41G视网膜下注射针，直至在套管尖端出现液滴

·稍微缩回柱塞(如果使用Microdose，则抽回泵)以在针尖中包含少量空气(这将有助于在初始空气注射期间识别针尖处于视网膜下腔内，帮助在细胞注射之前用空气扩大视网膜下腔，并降低细胞注射过程中细胞回流到玻璃体腔的风险)

·启动计时器以记录细胞保持在装置中的时间

·从准备好DD到开始植入的时间应不超过2分钟

·当将DD准备好后开打计时器，当植入开始时将其关闭

·一旦将DD装载和组装后，保持翻转/旋转DD并且不要使其平放/静置，因为细胞可能会沉降到注射器和管内

·立即开始细胞植入，并且不超过装载DD后2分钟

·如果从DD组装算起已超过2分钟，则弃去已装载的DD并制备一个新的。

RPE细胞植入

·确定此前根据患者的图像已经选择的注射区域。

·注射区域应距地图样萎缩(GA)病变的边缘至少1视盘直径，并且位于GA病变上(superiorly)、颞上(superotemporally)或上方(over)或位于GA病变附近周围的健康组织上方。

·通过端口插入套管并将尖端放置在预先计划注射的视网膜位置；小心地穿透视网膜。

·慢慢开始将RPE细胞注射至视网膜下腔，并验证套管尖端在视网膜下腔中。

·一旦开始形成小泡，则将套管的尖端缓慢地推进到视网膜下腔中(以避免RPE细胞从视网膜下腔回流)并持续缓慢注射直至已将指定体积的RPE细胞已被递送至视网膜下腔。

·如果小泡似乎朝着不希望的方向扩张，则请停止注射并考虑将剩余量的RPE细胞移植到其他位置。

如果在植入过程中出现任何回流，则外科医生应立即停止注射RPE细胞，并进行完整的玻璃体切除术，以确保去除玻璃体中大部分的回流细胞。

如果在植入过程中未发现回流现象，请在完成手术前观看录像带，以确认没有回流现象发生。如果在观看期间发现有回流，则应进行完整的玻璃体切除术，以确保去除了玻璃体中大部分的回流细胞。如果需要额外的小泡(出于上述原因)，则新小泡的位置可以在RPE细胞植入的原始小泡处或其附近。

·确保整个小泡是可见的·将50μl RPE细胞的细胞悬液缓慢递送至视网膜下腔。

·轻柔且缓慢地撤出套管。

·手术结束时记录钟表上的时间

手术后

·在手术结束时，进行以下操作：

ο头孢呋辛酯0.1cc(10mg/ml)或等同的抗生素，和/或

ο Maxitrol眼药膏(1g中含3.5mg硫酸新霉素，1g中含硫酸多粘菌素b 10000[USP]，1g中含1mg地塞米松)，手术后给予一次，

能够影响结果的因素包括，例如选择的视网膜区域，尝试形成小泡的次数(尝试次数越多，会减少最佳结果)，任何并发症，回流程度(无、轻度、中度、很大)，使用曲安西龙，进行玻璃体清洗，是否出现回流，是否除去了玻璃体中的色素细胞以及所给予的所有伴随用药。

Eckardt,C,Tran's conjunctival suture less 23-gauge vitrectomy.Retina,2005.25(2):p.208-11。

Fujii,G.Y.等，A new 25-gauge instrument system for trans-conjunctivalsutureless vitrectomy surgery.Ophthalmology,2002.109(10):p.1807-12；discussion1813。

表3：受试者1-9总结

*模糊

HRA＝海德堡视网膜血管造影；OCT＝光学相干断层扫描；FAF＝眼底自发荧光；CFP＝彩色眼底(视网膜)照相

到目前为止，受试者1-9未表现出治疗相关的全身性SAE，但是在2名受试者中发生了2例不相关的SAE；未观察到预料之外的眼部AE；预料的AE包括手术相关的结膜出血、白内障恶化和视网膜前膜形成(ERM)；观察到新出现的ERM或ERM恶化(8/9)；无视网膜水肿，表明对RPE细胞无免疫应答。

受试者1-8在施用后的2-24个月显示出至少75％的受试者具有RPE细胞。在准备此数据时，观察受试者9中细胞的迹象还太早。

尽管本文的描述包含许多细节，但是这些细节不应被解释为限制本公开的范围，而仅为提供一些对当前优选实施方式的说明。因此，将理解本公开的范围完全涵盖了对于本领域技术人员而言显而易见的其他实施方式。

除非明确地这样指出，否则在权利要求书中，以单数形式提及要素并不旨在表示“一个并且只有一个”，而是表示“一个或多个”。本领域普通技术人员公知的所公开的实施方式的要素的所有结构、化学和功能等同物通过引用明确地并入本文，并且旨在被本权利要求所涵盖。而且，无论在权利要求中是否明确列举了要素、成分或方法步骤，本公开中的任何要素、成分或方法步骤都不旨在捐献给公众。除非使用短语“用于……的手段”明确叙述该要素，否则本文的权利要求要素均不应被解释为“手段加功能(mean plus function)”的要素。除非使用短语“用于……的步骤”明确叙述该要素，否则本文的权利要求要素均不应被解释为“步骤加功能”的要素。

Claims (87)

1.一种治疗或延缓视网膜疾病或病症进展的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效量的包含视网膜色素上皮(RPE)细胞的药物组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致从基线所测量的最佳校正视敏度(BCVA)约1天至约3个月、1天至约15个月或从1天至约24个月或约从90天至约24个月不降低。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者包括BCVA为20/64或更低；20/70或更低；或者约20/64至约20/400之间。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致从基线所测量的最佳校正视敏度(BCVA)约1天至约15个月，或从约1天至约24个月或从约90天至约24个月保持稳定。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致约89％至约96％的受试者色素沉着增加。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述色素沉着增加保持至少约6个月至约12个月，或从约90天至约24个月。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致视网膜色素沉着。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致从基线所测量的视网膜色素沉着增加至少约2个月至约1年，或从90天至约24个月。

9.根据权利要求7所述的方法，其中施用后约2至约12个月，视网膜色素沉着为稳定的持续从约90天至约24个月。

10.根据权利要求7所述的方法，其中施用后约3至约9个月，所述视网膜色素沉着为稳定的。

11.根据权利要求1所述的方法，其中在其中施用了所述细胞的小泡(bleb)内的视网膜下液在小于48小时内被吸收。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞导致椭圆体带的恢复。

13.根据权利要求12所述的方法，其中椭圆体带的恢复包括根据椭圆体带分析的恢复。

14.根据权利要求12所述的方法，其中椭圆体带的分析包括对所述椭圆体带的目测分析，其中将受试者的所述椭圆体带与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼进行比较。

15.根据权利要求12所述的方法，其中通过与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼相比正常结构的重塑指示恢复。

16.根据权利要求12所述的方法，其中恢复包括以下一个或多个变得更加有序的主观评估，包括外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)、感光细胞的外段、玻璃膜疣消失和网状假性玻璃膜疣消失。

17.根据权利要求12所述的方法，其中恢复包括一个或多个视网膜的基本基础层变得更加有序的主观评估。

18.根据权利要求17所述的方法，其中变得更加有序的所述视网膜的所述基本基础层包含外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)和感光细胞的外段的一个或多个。

19.根据权利要求1所述的方法，其中新的或恶化的ERM在施用的从约1周至约12个月内，或从约1周至约24个月内，或从约90天至约24个月内无需手术移除。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述RPE细胞在施用约1周至约1年内，或从约1周至约24个月内，或从约90天至约24个月内不显示出致肿瘤性。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述RPE细胞在施用约9个月内显示出从0％至约5％的组织学致肿瘤性。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞不会导致视网膜破坏或破裂。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用所述治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞不会导致视网膜水肿。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量的RPE细胞是每次施用约50,000至5,000,000个细胞之间。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量的RPE细胞是每次施用约200,000个细胞。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量的RPE细胞是每次施用约500,000个细胞。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述药物组合物包含约500个细胞每μl至约10,000个细胞每μl。

28.根据权利要求1所述的方法，其中当所述量是每次施用50,000个细胞时，所述药物组合物包含约500-1,000个细胞每μl。

29.根据权利要求1所述的方法，其中当所述量是每次施用200,000个细胞时，所述药物组合物包含约2,000个细胞每μl。

30.根据权利要求1所述的方法，其中当所述量是每次施用500,000个细胞时，所述药物组合物包含约5,000个细胞每μl。

31.根据权利要求1所述的方法，其中当所述量是每次施用1,000,000个细胞时，所述药物组合物包含约10,000个细胞每μl。

32.根据权利要求1所述的方法，其中至少95％的所述细胞共表达前黑素体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞对所述受试者的跨上皮电阻大于100欧姆。

34.根据权利要求1所述的方法，其中所述RPE细胞由人胚胎干细胞的离体分化产生。

35.根据权利要求1所述的方法，其中施用包括：植入RPE细胞。

36.根据权利要求35所述的方法，其还包括在RPE细胞植入前，制备所述RPE剂量。

37.根据权利要求36所述的方法，其中制备所述RPE剂量包括解冻所述剂量。

38.根据权利要求37所述的方法，其中制备所述RPE剂量包括将所述RPE细胞混合并加载到递送装置中。

39.根据权利要求35所述的方法，其还包括在RPE细胞植入之前，进行玻璃体切除术。

40.根据权利要求39所述的方法，其中进行玻璃体切除术包括施用曲安西龙以染色玻璃体和移除玻璃体牵引。

41.根据权利要求35所述的方法，其还包括在进行玻璃体切除术之前，清洁手术部位。

42.根据权利要求35所述的方法，其还包括在植入RPE细胞之后，清洁手术部位。

43.根据权利要求1所述的方法，其中施用包括：清洁手术部位，进行玻璃体切除术，制备RPE剂量和RPE细胞植入。

44.根据权利要求1所述的方法，其中植入RPE细胞包括将所述RPE细胞注射到距地图样萎缩(GA)病变的边缘至少1-视盘直径处。

45.根据权利要求1所述的方法，其中植入RPE细胞包括以以下一种或多种注射所述RPE细胞：覆盖GA病变，覆盖中央凹，覆盖与所述GA病变毗邻的部分或全部过渡区，或覆盖与GA病变邻近的周围健康组织。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述过渡区包含完整和变性视网膜之间的区域。

47.根据权利要求45所述的方法，其中覆盖GA病变包括用小泡覆盖整个GA病变。

48.根据权利要求45所述的方法，其中GA尺寸包括从0.1mm²至约50mm²；从约0.5mm²至约30mm²；从约0.5mm²至约15mm²；从约0.1mm²至约10mm²；从约0.25mm²至约5mm²或者两点之间的任一点。

49.根据权利要求1所述的方法，其中施用包括：施用RPE细胞使得维持黄斑中央视力。

50.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下步骤产生所述RPE细胞：

(a)在含有烟酰胺的培养基中培养人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞，以产生分化细胞；

(b)在含有烟酰胺和激活素A的培养基中培养所述分化细胞，以产生进一步向RPE谱系分化的细胞；和

(c)在含有烟酰胺的培养基中培养进一步向所述RPE谱系分化的所述细胞，其中所述培养基不含激活素A。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述胚胎干细胞或诱导的多能干细胞在非贴壁条件下在含有bFGF和TGFβ的培养基中繁殖。

52.根据权利要求50所述的方法，其中(a)的所述培养基基本上不含激活素A。

53.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞以单次施用的方式施用。

54.根据权利要求1所述的方法，其中将所述细胞施用至所述受试者的视网膜下腔。

55.根据权利要求1所述的方法，其中视网膜下施用是经玻璃体或脉络膜上腔。

56.根据权利要求1所述的方法，其中施用是通过套管施用。

57.根据权利要求56所述的方法，其中通过所述套管的施用的部位的愈合在约1天至约30天内。

58.根据权利要求56所述的方法，其中通过所述套管的施用的部位的愈合在约5天至约21天内或在约7天至约15天内。

59.根据权利要求1所述的方法，其还包括：在施用RPE细胞后向所述受试者施用免疫抑制1天至3个月。

60.根据权利要求1所述的方法，其还包括：在施用RPE细胞后向所述受试者施用免疫抑制3个月。

61.根据权利要求1所述的方法，其还包括：在施用RPE细胞后向所述受试者施用免疫抑制1天至1个月。

62.根据权利要求1所述的方法，其中所述视网膜疾病或病况选自：中度干性AMD、视网膜色素变性、视网膜脱落、视网膜发育不良、视网膜萎缩、视网膜病变、黄斑营养不良、视锥细胞营养不良、视锥细胞-视杆细胞营养不良、Malattia Leventinese、Doyne蜂窝状营养不良、Sorsby营养不良、图形样/蝶形营养不良、Best卵黄样营养不良、北卡罗莱纳营养不良、中心性晕轮状脉络膜营养不良、血管样条纹、毒性黄斑病变、Stargardt病、病理性近视、视网膜色素变性和黄斑变性。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述疾病是年龄相关性黄斑变性。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述年龄相关性黄斑变性是干燥形式的年龄相关性黄斑变性。

65.一种增加治疗患有干性AMD的受试者的方法的安全性的方法，其包括：向受试者施用治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞，其中未向所述受试者施用全身性免疫抑制。

66.根据权利要求65所述的方法，其中治疗紧急不良事件的发生率和频率低于使用免疫抑制。

67.一种在患有GA的受试者中使视网膜的椭圆体带有序化的方法，所述方法包括：施用治疗有效量的视网膜色素上皮(RPE)细胞，其中施用后无序的椭圆体带变得有序。

68.根据权利要求67所述的方法，其中椭圆体带的恢复包括根据椭圆体带分析的恢复。

69.根据权利要求67所述的方法，其中椭圆体带的分析包括对所述椭圆体带的目测分析，其中将受试者的所述椭圆体带与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼进行比较。

70.根据权利要求67所述的方法，其中通过与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼相比正常结构的重塑指示恢复。

71.根据权利要求67所述的方法，其中恢复包括以下一个或多个变得更加有序的主观评估，包括外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)、感光细胞的外段、玻璃膜疣消失和网状假性玻璃膜疣消失。

72.根据权利要求67所述的方法，其中恢复包括一个或多个视网膜的基本基础层变得更加有序的主观评估。

73.根据权利要求17所述的方法，其中变得更加有序的所述视网膜的所述基本基础层包含外界膜、肌样体带(感光细胞的内段)、椭圆体带(IS/OS连接)和感光细胞的外段的一个或多个。

74.根据权利要求67所述的方法，其中所述受试者包括BCVA为20/64或更低；20/70或更低；或者约20/64至约20/400之间。

75.根据权利要求1所述的方法，其中通过微视野检查评估的视力恢复证实治疗或延缓视网膜疾病的进展，其中微视野检查评估的视力恢复包括与基线相比在微视野检查上的视网膜灵敏性与EZ缺陷之间的关联性。

76.根据权利要求1所述的方法，其中微视野检查评估的视力恢复包括证实施用所述RPE细胞的部位处或附近的视网膜的部位与基线微视野检查评估相比具有改善的微视野检查评估。

77.根据权利要求1所述的方法，其中治疗或延缓视网膜疾病进展包括在施用后一年相对于基线或对侧眼GA病变的速率降低约5％至约20％之间；或约5％至约50％之间；或约5％至约25％之间；或约5％至约100％之间；或约5％至约10％之间。

78.根据权利要求1所述的方法，其中治疗或延缓视网膜疾病进展包括以下一种或多种：当与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼比较时，BCVA稳定；低亮度测试性能无恶化；或微视野检查灵敏性无恶化；或阅读速度无恶化，其中所述比较是在1个月、在3个月、在6个月或在1年中的一个或多个。

79.一种用于治疗或延缓视网膜疾病或病症进展的药物组合物，所述药物组合物包含约50,000至500,000个之间的RPE细胞作为活性物质。

80.用于稳定患有视网膜疾病或病症的受试者的RPE的药物组合物，所述药物组合物包含约50,000至500,000个之间的RPE细胞作为活性物质。

81.根据权利要求80所述的组合物，其中所述RPE细胞的特征为具有以下特征：

(a)至少95％的所述细胞共表达前黑素体蛋白(PMEL17)和细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)；和

(b)对于在其中施用所述细胞的受试者，所述细胞的跨上皮电阻大于100欧姆；其中施用后从约90天至约24个月，在所述受试者中的视网膜色素沉着是稳定的。

82.根据权利要求12所述的方法，其中椭圆体带的恢复包括以下一种或多种改善：EZ-RPE厚度、面积或体积测量。

83.根据权利要求82所述的方法，其中EZ-RPE厚度、面积或体积测量的一种或多种的改善与视敏度呈负相关。

84.根据权利要求12所述的方法，其中所述椭圆体带分析通过与年龄匹配、性别匹配对照、基线或对侧眼相比EZ体积的减小证实EZ的有序化。

85.根据权利要求84所述的方法，其中所述EZ体积的减小包括至少2％或至少5％或至少7％或至少10％，或者1％至5％之间或1至10％之间或1％至50％之间或10％至50％之间。

86.根据权利要求84所述的方法，其中所述EZ的有序化包括从基线所述EZ的结构的体积减小至少2％、至少5％、至少10％、至少约1％至约50％之间。

87.根据权利要求1所述的方法，其中通过营养因子的细胞分泌增强所述治疗或延缓视网膜疾病或病症的进展。

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