CN104994882A - 使用aavsflt-1治疗amd - Google Patents

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I.J.康斯特布尔
P.E.拉科克齐
C-m.莱
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Avalanche Australia Pty Ltd
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Abstract

本公开提供用于在人受试者中预防或治疗眼部新血管化如AMD的组合物和方法，其通过对所述人受试者视网膜下施用包含药学有效量的载体的药物组合物，所述载体包含编码可溶性Fms相关酪氨酸激酶1(sFlt-1)蛋白的核酸。

Description

使用AAVSFLT-1治疗AMD
序列表
本申请含有经由EFS-Web以ASCII形式提交的序列表，其通过提述完整并入本文。在2013年5月1日创建的所述ASCII拷贝称为43016-702.201_SL.txt，且大小为84,779个字节。
发明背景
年龄相关的黄斑变性(AMD)是年龄超过50岁的人中视觉不可逆损伤的最主要原因之一。AMD在临床上分成两种类型，“干性”和“湿性”。AMD的湿性形式可以快速进展并且常常导致目盲。该疾病的病理学变化可能导致严重的视觉损伤。AMD的表现可以包括但不限于视网膜色素上皮细胞(RPE)功能障碍和黄斑区域的脉络膜新血管化(CNV)。在严重病例中，可能发生流体渗漏、RPE或神经上皮脱离和从破裂血管出血。已发现许多细胞因子在CNV生成的调控中起重要作用，其中可以包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)、血小板来源的生长因子(PDGF)、缺氧可诱导因子(HIF)、血管生成素(Ang)和其他细胞因子、促分裂剂活化的蛋白质激酶(MAPK)等。
用于湿性AMD的一种当前批准的治疗物是 是抗血管发生药剂，且靶向血管内皮生长因子(VEGF)的所有同等型。临床研究已显示，在施用的患者中约95％有改善或稳定的视觉，相比之下在接受伪药物(sham)治疗的患者中为约60％。尽管是首个批准用于改善视觉的药剂，但其需要每4周玻璃体内施用以达到最佳视觉受益。是被批准用于治疗湿性AMD的另一种VEGF抑制剂。也需要每4-8周的频繁玻璃体内注射以产生最佳视觉受益。
玻璃体内施用路径可能增加严重并发症如感染性眼内炎和视网膜脱落的风险，对此重复施用提高了累积性风险。还报告了增加的眼内压、外伤性白内障、和视网膜撕裂。最后，对于由眼科医师递送的治疗，治疗频率决定了对于患者、医师和一般性医疗体系的负担和应当可以降低的程度。针对 AMD继发性的CNV的现有疗法的局限性已在本领域中产生了对于着手于所需治疗的高频率和治疗规程的侵袭性的其他办法的需要。牵涉VEGF升高的新血管化还可能导致其他眼部病理，如糖尿病视网膜病、糖尿病性黄斑水肿(DME)和视网膜静脉阻塞(RVO)。这些疾病导致视网膜新血管化和视觉丧失。VEGF抑制剂如已显示了在DME和RVO中的功效，且如同对于湿性AMD的，需要频繁的玻璃体内施用以维持益处。
发明概述
本公开提供了用于治疗人受试者中的CNV(如见于AMD的湿性形式)的组合物和方法。
在一个方面，本公开提供用于治疗人受试者中的AMD的组合物和方法，包括：对需要AMD治疗的人受试者视网膜下施用包含药学有效量的VEGF抑制剂的药物组合物。在一个方面，所述药物组合物包含重组病毒。在另一个方面，所述VEGF抑制剂包含编码可溶性Fms-相关酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白的核酸。
在一个方面，本公开提供用于预防患有AMD的人受试者中的CNV的组合物和方法，包括：对需要AMD治疗的人受试者视网膜下施用包含药学有效量的重组病毒的药物组合物，所述重组病毒包含编码可溶性Fms-相关酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白的核酸。
在一些方面，所述病毒选自以下：腺伴随病毒(AAV)、辅助物依赖性腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物、Moloney鼠白血病病毒、和基于HIV的病毒。在一些方面，AAV壳体或倒转的末端重复(ITR)选自下组：AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，AAV 12，rhlO，和其杂合体。
在一些方面，所述重组病毒包含选自以下的启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、MMT启动子、EF-1alpha启动子、UB6启动子、鸡beta-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。
在一些方面，所述重组病毒包含增强子。
在一些方面，所述重组病毒包含内含子或嵌合内含子。
在一些方面，所述重组病毒包含SV40聚A序列。
在一些方面，所述重组病毒包含人sFlt-1蛋白或其功能片段。
在一些方面，所述重组病毒从包含氨苄青霉素抗性标志或非氨苄青霉素抗性标志的质粒生成。
在一些方面，所述重组病毒包含细菌调控序列如T7 RNA聚合酶启动子。
在一些方面，所述重组病毒缺少细菌调控序列如T7 RNA聚合酶启动子。
在一些方面，所述重组病毒包含调控性核酸片段，该片段能指导所述sFLT-1蛋白或其功能片段在眼细胞中的选择性表达。
在一些方面，所述药物组合物包含约1x106至约1x1015个重组病毒载体基因组，约1x107至约1x1014个重组病毒载体基因组，约1x108至约1x1013个重组病毒载体基因组，约1x109至约3x1012个重组病毒载体基因组，或约1x1010至约3x1012个重组病毒载体基因组。
在一些方面，所述药物组合物经由视网膜下注射施用。
在一些方面，所述方法还包括对人受试者施用药学有效量的VEGF抑制剂。在一些方面，所述VEGF抑制剂包含针对VEGF的抗体或其功能片段。在一些方面，所述VEGF抑制剂包含兰尼单抗(ranibizumab)。在一些方面，所述药物组合物在施用VEGF抑制剂后至少5，6，7或8天时施用。在一些方面，所述药物组合物在施用VEGF抑制剂30，60或90天内施用。
在一些方面，所述VEGF抑制剂在施用包含重组病毒的所述药物组合物之前施用1次，并在其施用后施用1至2次。在一些方面，所述VEGF抑制剂在施用所述药物组合物之前施用至少2次，并在其施用后施用1至2次。在一些方面，所述VEGF抑制剂在6至7周的时段内施用。
在一些方面，所述VEGF抑制剂是抗VEGF抗体，如贝伐单抗(bevacizumab)或兰尼单抗。在其他方面，所述VEGF抑制剂是可溶性受体、融合蛋白、或其片段，如阿柏西普(aflibercept)或sFLTOl。
在一些方面，AMD是湿性AMD。
在一些方面，AMD是干性AMD。
在一些方面，所述人受试者有产生湿性AMD的风险。
在一些方面，所述人受试者呈现早期湿性AMD的症状。
在一些方面，先前已对所述人受试者施用至少3、5、10、15或20次使用不同VEGF抑制剂的治疗以用于治疗AMD。
在一些方面，最佳矫正视敏度(BCVA)在使用兰尼单抗的所述治疗后没有改善。
在一些方面，最佳矫正视敏度(BCVA)在使用兰尼单抗的所述治疗后改进了超过1行，如通过ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)字符表((Early Treatment Diabetic Retinopathy Study)letters)测量的。
在一些方面，人受试者呈现早期干性AMD的症状。
在一些方面，治疗以至少每半年一次的频率施用。
在一些方面，施用步骤在受试者年龄为20、40、50、55或65岁或更大的所述人受试者中进行。
在一些方面，对小凹以外的部位进行施用。
在一些方面，对中央视网膜的视网膜下空间的一个或多个细胞进行施用。
在一些方面，对外黄斑的一个或多个细胞进行施用。
在一些方面，对内黄斑的一个或多个细胞进行施用。
在一些方面，对视网膜色素上皮细胞进行施用。
在一些方面，施用没有不利影响中央视网膜功能或中央视网膜结构。
在一些方面，施用不提高所述人受试者中的VEGF抑制剂的系统性水平。
在一些方面，施用不提高所述人受试者中的sFlt-1的系统性水平。
在一些方面，施用步骤在两只眼中同时或序贯地进行。
在一些方面，施用步骤在一只眼中进行。
在一些方面，当一只眼呈现AMD症状时在另一只眼中进行所述施用步骤。
在一些方面，施用步骤在对青霉素抗性的所述人受试者中进行。
在一些方面，施用步骤在对青霉素敏感的所述人受试者中进行。
在一些方面，施用步骤在对青霉素过敏的所述人受试者中进行。
在一些方面，施用步骤在不对青霉素过敏的所述人受试者中进行。
在一些方面，施用步骤不导致玻璃体的炎症，如在施用步骤后通过生物显微术(biomicroscopy)(BE)和间接检眼镜检查(opthalmoscopy)(IOE)观察的。
在一些方面，施用步骤不导致细胞毒性T细胞。
在一些方面，施用步骤不导致细胞毒性T细胞应答，如通过超过基线范围不到10％细胞毒性T细胞的增加测量的。
在一些方面，T细胞在施用步骤后不展现激活的效应器表型。
在一些方面，在施用步骤后最佳矫正视敏度(BCVA)改善了1、2、3、4或5行或更多行，如通过ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)字符表测量的。
在一些方面，在施用步骤后使用荧光素血管造影术(FA)观察到新血管化中的降低。
在一些方面，兰尼单抗的施用频率降低到每年低于12剂。在一些方面，阿柏西普的施用频率降低到每年低于6剂。
在一些方面，兰尼单抗或阿柏西普或其他VEGF抑制剂以降低的频率施用或不再施用。
在一些方面，所述病毒包含与人sFLT-1基因序列有≥90％序列同源性的sFLT-1基因或其功能片段。
在一些方面，施用的病毒包含sFLT-1基因、基因变体或基因片段。
在一些方面，在施用所述药物组合物后7、14、21或30天时在所述人受试者的泪液、血液、唾液或尿液样品中未检测到载体。
在一些方面，通过qPCR或ELISA检测所述病毒载体的存在。
在一些方面，在施用所述药物组合物后7、14、21或30天时，所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白水平为约500-5,000pg/ml、约600-4,000pg/ml、约800-3,000pg/ml、约900-2,000pg/ml、或约1,000-1,800pg/ml。在一些方面，在施用所述药物组合物后7、14、31、30、60、90、180、270和365天时，所述人受试者的玻璃体中的sFLT-1蛋白水平(亦可称为sFlt-1蛋白浓度)升高。
在一些方面，所述人受试者不显示临床显著的视网膜毒性，如通过在至少两个月时段内的连续眼检查(serial ophthalmic examination)评估的。
在一些方面，在至少两个月时段内所述人受试者中不存在浅表性的前段或玻璃体炎性病征。
在一些方面，所述人受试者在施用所述重组病毒后至少120天内不需要使用VEGF抑制剂的援救治疗(rescue treatment)。在一些方面，所述人受试者在施用所述重组病毒后至少180天内或至少210天内不需要使用VEGF抑制剂的援救治疗。在一些方面，所述人受试者在施用所述重组病毒后至少270天内不需要使用VEGF抑制剂的援救治疗。在一些方面，所述人受试者在施用所述重组病毒后至少365天内不需要使用VEGF抑制剂的援救治疗。
在一些方面，在施用所述重组病毒后至少180天或至少210天内在所述人受试者中没有视敏度丧失、IOP升高、视网膜脱落、或任何眼内或系统性免疫应答的迹象(evidence)。在一些方面，在施用所述重组病毒后至少365天内在所述人受试者中没有视敏度丧失、IOP升高、视网膜脱落、或任何眼内或系统性免疫应答的迹象。
在另一个方面，本公开提供包含约1x106至1x1015个重组病毒的药物组合物，其中所述每种重组病毒均包含编码可溶性Fms-相关酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白的核酸。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或预防人受试者中眼部新血管化的方法，包括：对需要治疗的人受试者在一个或多个视网膜下部位处施用药学有效量的药物组合物，所述药物组合物包含编码sFLT-1的核酸。
在一些方面，本公开针对以下人受试者，其患有或怀疑患有选自下组的一种或多种疾患：年龄相关的黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新血管化、脉络膜新血管化和糖尿病视网膜病。在一些情况中，所述人受试者患有或怀疑患有选自下组的一种或多种疾患：增殖性糖尿病视网膜病、视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞、分枝视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病和糖尿病性视网膜水肿。
在一些方面，本公开提供包含重组病毒的药物组合物，所述病毒选自下组：腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、辅助物依赖性腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物、Moloney鼠白血病病毒、和基于HIV的病毒。
在一些方面，本公开提供编码sFLT-1的核酸，其可操作地连接于选自下组的启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、MMT启动子、EF-1alpha启动子、UB6启动子、鸡beta-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。
在一些方面，本公开提供sFLT-1核酸，其中所述sFLT-1编码至少一个二聚化域。在一些情况中，所述sFLT-1核酸不含有原核调控序列。在一些情况中，所述sFLT-1核酸含有原核调控序列。
在一些方面，本公开提供包含病毒或质粒的药物组合物。
在一些方面，本公开向人受试者提供施用一次或多次VEGF抑制剂治疗。在一些情况中，所述VEGF抑制剂在所述药物组合物施用的30、90或180天内 施用。在一些情况中，本公开的药物组合物和VEGF抑制剂的施用相隔至少24小时。
在一些方面，本公开提供对至少55岁龄的人受试者施用药物组合物。
在一些方面，本公开提供施用在小凹(fovea)外施用所述药物组合物。
在一些方面，本公开提供人受试者的最佳矫正视敏度(BCVA)在施用所述药物组合物后改进了至少1、2、3、4或5行，如通过ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)字符表测量的。
在一些方面，本公开提供最佳矫正视敏度(BCVA)在施用所述药物组合物后减少了不到15个字，如通过ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)测量的。
在一些方面，本公开提供在选自下组的条件下施用所述药物组合物：在一只眼中施用所述药物组合物、在两只眼中序贯施用所述药物组合物、和在两只眼中同时施用所述药物组合物。
在一些方面，本公开提供在施用所述药物组合物后新血管化中的降低，如通过荧光素血管造影术(FA)观察到的。
在一些方面，本公开提供在注射后至少1周在所述人受试者中不存在浅表性的前段或玻璃体炎性病征。
在一些方面，本公开提供在施用所述药物组合物后1周或3、6、9或12个月时在所述人受试者中不存在浅表性的前段或玻璃体炎性病征。
在一些方面，本公开提供在施用所述药物组合物后至少30、60、90、120、180、270或365天内所述人受试者不需要援救治疗。
在一些方面，本公开提供所述人受试者在施用所述药物组合物后不经历视敏度丧失、IOP升高、视网膜脱落、眼内或系统性免疫应答。
在一些方面，本公开提供在所述施用步骤后未测量到增加的抗AAV细胞毒性T细胞应答。
在一些方面，本公开提供在施用所述药物组合物后3、7、14、21或30天在所述人受试者的血液、唾液或尿液样品中未检测到病毒。
在一些方面，本公开提供在所述人受试者中施用所述药物组合物后7、14、21、30、60、90、120、150、180、270或365天时，所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白水平为约500-5,000pg/ml。
在一些方面，本公开提供所述人受试者在施用所述药物组合物之前已接 受一次或多次使用VEGF抑制剂的治疗。
在一些方面，本公开提供所述人受试者对于使用VEGF抑制剂的治疗是抗性的。
在一些方面，本公开提供所述人受试者在施用所述药物组合物之前未接受过VEGF抑制剂。
在一些方面，本公开提供以低于一年3次的频率在所述人受试者中施用所述药物组合物。
在一些方面，本公开提供施用所述药物组合物以降低另外的VEGF抑制剂治疗在所述人受试者中的施用频率。
在一些方面，本公开提供在施用所述药物组合物后7、14、21、30、60、90、120、150、180、270或365天测量时所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白的浓度升高。
在一些方面，本公开提供在施用所述药物组合物之前或一天内或一周内对所述人受试者消除玻璃体凝胶。
在一些方面，本公开提供使用小于20号的玻璃体切割术系统施用药物组合物。
在一些方面，本公开提供使用不需要缝合的玻璃体切割术系统来施用药物组合物。
在一些方面，本公开提供使用小于39号的插管尖端(cannula tip)施用药物组合物。
在一些方面，本公开提供药物组合物之后是玻璃体房中的气体/液体交换。
在一些方面，本公开提供在使用所述药理学药剂治疗后12个月内所述受试者的中央视网膜厚度增加不超过50微米、100微米或250微米。
在一些方面，本公开提供与未经治疗的人受试者的患病眼相比，在所述人受试者的患病眼中地图状萎缩(geographic atrophy)不进展。
在一些方面，本公开提供包含重组病毒或质粒的药物组合物，所述病毒或质粒包含核酸，该核酸包含至少1个启动子序列可操作地连接于sFLT-1转基因序列。在一些情况中，本公开的药物组合物包含启动子序列和所述sFLT-1转基因序列被超过300个碱基对的序列分隔开。在一些情况中，本公开的药物组合物包含被UTR序列分隔开的启动子序列和sFLT-1转基因序列。 在一些情况中，所述UTR序列包含至少10个碱基对。在一些情况中，所述药物组合物包含至少3个接头序列，该接头序列各包含至少50个碱基对。
在一些方面，本公开提供一种药物组合物，其中所述sFLT-1核酸编码至少1个二聚化域。
在一些方面，本公开提供一种药物组合物，其包含选自由以下序列组成的组的启动子序列：SEQ ID No.17，SEQ ID No.18，SEQ ID No.19，SEQ ID No.20，SEQ ID No.21，SEQ ID No.22，SEQ ID No.23，SEQ ID No.24，SEQ ID No.25，SEQ ID No.26，SEQ ID No.27，SEQ ID No.28，SEQ ID No.29，SEQ ID No.30，SEQ ID No.31，SEQ ID No.32，SEQ ID No.33，SEQ ID No.34，SEQ ID No.35，SEQ ID No.36，SEQ ID No.37，SEQ ID No.38，SEQ ID No.39，SEQ ID No.340，SEQ ID No.41，SEQ ID No.42，SEQ ID No.43，SEQ ID No.44，SEQ ID No.45，SEQ ID No.46和SEQ ID No.47；编码VEGF抑制剂的序列，其选自由以下序列组成的组：SEQ ID No.102，SEQ ID No.103，SEQ ID No.104，SEQ ID No.105，SEQ ID No.106，SEQ ID No.107和SEQ ID No.108；内含子序列，其由以下序列组成：SEQ ID No.48，SEQ ID No.115，SEQ ID No.116，SEQ ID No.117，SEQ ID No.118,和SEQ ID No.119；UTR序列，其选自由以下序列组成的组：SEQ ID No.91，SEQ ID No.2，SEQ ID No.92，SEQ ID No.93，SEQ ID No.94，SEQ ID No.95，SEQ ID No.96，SEQ ID No.97，SEQ ID No.98，SEQ ID No.99，SEQ ID No.100和SEQ ID No.101；和终止序列，其选自由以下序列组成的组：SEQ ID No.49，SEQ ID No.50，SEQ ID No.51，SEQ ID No.52，SEQ ID No.53，SEQ ID No.54和SEQ ID No.55。
在一些方面，本公开提供药物组合物的单位剂量，其包含lx106至lx1015个载体基因组的重组病毒，其中所述重组病毒包含与启动子可操作连接的编码sFLT-1的核酸。在一些情况中，所述药物组合物的单位剂量包含lx1010至3x1012个载体基因组。
在一些方面，本公开提供一种在细胞中生成重组病毒的方法，所述方法包括：将包含至少1个启动子序列可操作地连接于sFLT-1转基因序列、ITR序列、和UTR序列的核酸导入细胞，并纯化所述重组病毒。在一些情况中，所述UTR序列是人UTR序列。在一些情况中，所述核酸序列不含有beta-内酰胺抗生素抗性序列。在一些情况中，在以lx106的感染复数(MOI)转导HEK293 细胞后72小时测量时，所述重组病毒产生范围为100-10,000pg/mL的sFLT-1蛋白。在一些情况中，所述重组病毒抑制人脐带血管内皮(HUVEC)细胞的增殖。
在一些方面，本公开提供一种用于生成重组病毒载体的细胞，所述细胞包含至少1个启动子多核苷酸序列可操作地连接于sFLT-1转基因序列、ITR多核苷酸序列、和UTR多核苷酸序列。
在一些方面，本公开提供包含编码sFLT-1的序列的核酸用于治疗或预防人中的眼部新血管化；其中所述使用包括对有此需要的人受试者，在所述人受试者中的一个或多个视网膜下部位处直接施用有效量的药物组合物；其中所述药物组合物包含所述核酸。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，其中所述sFLT-1是VEGF的抑制剂，且其中治疗眼部新血管化或降低其可能性是作为VEGF抑制的结果而发生的。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，其中在对所述人受试者施用所述药物组合物后至少72小时后，与所述施用前在所述人的玻璃体中的sFLT-1蛋白水平相比，所述药物组合物能升高所述人受试者的玻璃体中的sFLT-1蛋白水平。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，其中包含所述sFLT-1的核酸包含重组病毒，所述病毒选自下组：腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、辅助物依赖性腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物、Moloney鼠白血病病毒、和基于HIV的病毒。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，其中所述编码sFLT-1的核酸可操作地连接于选自下组的启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、MMT启动子、EF-1alpha启动子、UB6启动子、鸡beta-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，其中所述核酸由病毒封装或者是质粒DNA。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，所述使用还包括对需要治疗或降低的人受试者施用一种或多种另外的VEGF抑制剂，任选地其中所述另外的VEGF抑制剂是兰尼单抗或贝伐单抗。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，所述使用包括对至少50、55或65 岁的人受试者施用所述药物组合物。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，所述使用包括在小凹外施用所述药物组合物。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，其中需要治疗的所述人受试者的最佳矫正视敏度(BCVA)在施用有效量的所述药物组合物后改进了至少1、2、3、4或5行，如通过ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)字符表测量的。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，其中在需要治疗的人受试者中以每3、6、9、12、18或24个月至少一次的频率施用所述药物组合物。
在一些方面，本公开提供使用的核酸，其中所述药物组合物的施用以低于一年三次的频率在人受试者中进行，或以降低另外的VEGF抑制剂治疗的施用频率的频率在人受试者中进行。
在一些方面，本公开提供单位剂量的药物组合物，其包含约lx106至lx1015或lx1010至3x1012个载体基因组。在一些方面，所述重组病毒包含编码sFLT-1或其功能片段的核酸可操作地连接于启动子。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或预防人受试者中眼部新血管化的方法，包括：对需要治疗的人受试者在一个或多个视网膜下部位处施用药学有效量的药物组合物，所述药物组合物包含编码VEGF抑制剂的核酸。在一些方面，所述VEGF抑制剂是抗VEGF抗体或其功能片段。在一些方面，所述VEGF抑制剂是可溶性受体、融合蛋白、或其功能片段。
通过提述并入 
本说明书中提及的所有公开出版物、专利和专利申请均通过提述并入本文，其程度如同每一件公开出版物、专利或专利申请均特定且分别地指示为通过提述并入的。
附图简述
本公开的新特征特别在所附权利要求中列出。通过以下详细描述获得对本公开的特征和优点的更好的理解，其列出了利用本公开的原理的例示性方面，且伴随的附图为：
图1描述了例示性质粒的示意图。
图2描述了来自经rAAV.sflt-1转导的细胞的sFLT-1的表达、分泌和生物学 活性。(a)对来自经Ad.sFlt-1转导的293细胞(第1道)、经rAAV.sFlt-1转导的D407细胞(第2道)、经rAAV.sFlt-1转导的293细胞(第3道)和经AAV.gfp转导的D407细胞(第4道)的条件培养基的Western印迹分析。(b)通过来自经rAAV.sFlt-1转导的细胞的条件培养基对VEGF诱导的HUVEC增殖的抑制。HUVEC在饥饿培养基(柱1)、含有重组VEGF的培养基(柱2)、含有VEGF和来自经rAAV.sFlt-1转导的293细胞的40μL条件培养基的培养基(柱3)、含有VEGF和来自经rAAV.sFlt-1转导的293细胞的80μL条件培养基(柱4)、和含有VEGF和来自经rAAV.gfp转导的293细胞的80μL条件培养基(柱5)中培养。(对于rAAV.sFlt-1加VEGF与仅VEGF之间的差异，*P<0.02，**P<0.00)。
图3A描述了在左眼中用rAAV.sFlt-1(猴8514、8530、8523、8524和999)、rAAV.gfp(猴8297和8532)注射、在两只眼中用重组sFLT-1蛋白(猴8294)注射的猴和对照未注射猴(对照)的玻璃体中的人sFlt-1(hsFLT-1)表达。将对照和猴8294和999在注射后3个月时实施安乐死，将猴8524在注射后9个月时实施安乐死，将猴8297、8532、8514、8530和8523在注射后12个月时实施安乐死。*指示在注射有rAAV.sFlt-1的眼中显著更高的sFLT-1蛋白水平(p<0.05)。图3B描述了显示在经rAAV.sFlt-1注射(999、8524、8523、8530和8514)、经rAAV.gfp注射(8297和8532)、经重组sFlt-1蛋白注射(8294)和未经注射(对照)的猴中在注射后不同时间的hsFLT-1水平的图。
图4：小鼠眼中的免疫细胞子集群体。该图显示在注射后不同时间时的免疫细胞子集群体。
图5：小鼠脾中的免疫细胞子集群体。该图显示在注射后不同时间时的免疫细胞子集群体。
图6绘出了比较在注射后不同时间时在不同小鼠的CD4+T细胞中的Ki67应答的图。
图7A至7D绘出多种例示性复制起点序列。
图8A至8F绘出多种例示性启动子的序列。
图9A至9C绘出多种例示性内含子、聚A序列和ITR区的序列。
图9D至9F绘出多种例示性接头序列的序列。
图9G至9H绘出多种例示性UTR序列的序列。
图10A至10C绘出编码多种例示性抗VEGF蛋白的序列。
图11A绘出sFLT-1的氨基酸序列。图11B绘出sFLT-1域2(sFLT-1的功能片 段)的氨基酸序列。
图12A至12B绘出多种例示性抗生素抗性基因的序列。
图13绘出一种例示性组合物(rAAV.sFlt-1)的PK，其在6-8周时达到最佳抗VEGF表达。RBZ是抗VEGF如兰尼单抗的标准医护。“RBZ援救”意指援救治疗。
图14绘出对患者的眼科学评估。炎症通过生物显微术(BE)和间接检眼镜检查(IOE)评测。Unrem：不显著的。
图15A和15B绘出视敏度结果。
图16绘出对给予24次在前Lucentis注射的患者的视网膜厚度的测量。
图17绘出sFLT-1序列的生物分布：qPCR(检测的拷贝数)。
图18绘出生物分布：通过ELISA测量的AAV壳体，AAV滴度为壳体/mL。
图19绘出通过ELISA测量的sFLT-1的生物分布。显示人sFLT-1浓度(pg/mL)。
图20A和20B绘出对使用低剂量rAAV.sFlt-1(R1,R2,R4)或高剂量rAAV.sFlt-1(R5,R6和R8)施用的患者的OCT评估。
图21A和21B绘出在治疗后180天时用rAAV.sFlt-1治疗的人受试者相对于未经治疗的对照患者的视敏度结果。
图22A和22B绘出在治疗后1年时用rAAV.sFlt-1治疗的人受试者相对于未经治疗的对照患者的视敏度结果。
图23绘出在rAAV.sFlt-1的临床研究中按周接受Lucentis援救注射(VEGF抑制剂再施用)的人受试者的表。
图24绘出在rAAV.sFlt-1的临床研究中对于用rAAV.sFlt-1治疗的人受试者按周的视敏度和SD-OCT图像。
图25A和25B绘出如通过ELISA检测的在人胚胎肾293(HEK293)细胞中关于人sFlt-1蛋白产生的数据。利用质粒转染在HEK293细胞中产生rAAV.sFlt-1。使用重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中产生第二构建体rAAV(bv).sFlt-1。在72小时后在多种MOI经由ELISA测量sFlt-1蛋白浓度。
发明详述
本公开提供用于预防或治疗人受试者中的眼部新血管化如AMD的组合物和方法，其通过对人受试者视网膜下施用包含药物有效量的载体的药物组 合物，所述自爱提包含编码可溶性Fms-相关酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白的核酸。
参照例子应用在下文描述本公开的几个方面用于示例。应理解阐述大量具体的细节、关系和方法以提供对本公开的全面理解。然而，所涉领域的普通技术人员将容易地认可，无需一项或多种具体细节或使用其他方法即可实践本公开。本公开不受行为或事件的例示次序的限制，因为一些行为可以不同次序发生和/或与其他行为或事件同时发生。此外，并不需要所有的例示行为或事件来执行依照本公开的方法学。
本公开的术语仅用于描述具体情况的目的，且不意图为限制本公开的组合物、方法和组合物。
除非另外指示，如本文中描述的本公开的组合物和方法可以采用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学、免疫化学和眼科技术的常规技术和说明，这是在本领域中实践的技术人员的技能能力以内的。这类常规技术包括用于观察和分析受试者中的视网膜或视觉、克隆和增殖重组病毒、配制药物组合物、和生化纯化和免疫化学的方法。适宜技术的具体示例可通过提述本文中的例子获得。然而，当然也可以使用等同的常规规程。这类常规技术和描述可见于标准实验室手册如Green等编,Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)(1999)；Weiner等编,Genetic Variation:A Laboratory Manual(2007)；Dieffenbach,Dveksler编,PCR Primer:A Laboratory Manual(2003)；Bowtell和Sambrook,DNA Microarrays:A Molecular Cloning Manual(2003)；Mount,Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis(2004)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2006)；及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2002)(all from Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer,L.,Biochemistry(4th Ed.)W.H.Freeman,N.Y.(1995)；Gait,“Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach”IRL Press,London(1984)；Nelson和Cox,Lehninger,Principles of Biochemistry,3rd Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York(2000)；及Berg等,Biochemistry,5th Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York(2002)，所有这些均通过提述完整并入本文用于所有目的。在描述所述组合物、研究工具和方法之前，应理解本公开不限于所描述的具体的方法、组合物、目标和用途，因为这些当然可以变化。还应理解本文中使用的 术语仅用于描述具体方面的目的，且不意图限制本公开的范围，该范围仅由所附权利要求限定。
如本文中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”意图还包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。此外，对于详细说明书和/或权利要求中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或其变体的程度，这类术语意图以类似于术语“包含”的方式为包含性的。
范围在本文中可表示为从“约”一个具体值，和/或至“约”另一个具体值。当表示这类范围时，另一种情况包括从该具体值和/或至该另一具体值。类似地，当值表示为近似值时，通过使用前缀“约”，应理解该具体值形成另一情况。进一步应理解每个范围的端点相对于其他端点不仅是显著的，而且是独立于另一端点的。如本文中使用的，术语“约”在具体使用的上下文中指从指定数值起加或减15％的范围。例如，约10将包括从8.5至11.5的范围。术语“约”还说明值测量中典型的误差或不准确。
I.AMD
AMD是年龄超过50岁的患者中目盲的最主要原因，其由光感受器、外部视网膜、和黄斑处的视网膜色素上皮的进行性退化表征。AMD的后期(advanced)“湿性”形式(新血管或渗出性)不太常见，但可经常导致患者中中央视觉的快速且经常实质性的丧失。在AMD的湿性形式中，脉络膜新血管化形成且发展成可在视网膜色素上皮下或经过视网膜色素上皮生长的血管网络。由于这伴随着血浆渗漏和/或出血到视网膜下间隙中，如果在黄斑中发生这可能会有严重的中央视觉的突然丧失。
如果没有另外指定，术语“AMD”可以是干性AMD或湿性AMD。本公开涵盖对AMD(湿性AMD和/或干性AMD)的治疗或预防。
如本领域中先前已知的，已显示AMD的起因不是唯一的。这一高度复杂的疾病可能来自多变的作用因素，包括但不限于，遗传素质(predisposition)和环境，或其组合。例如，在人中，确立的流行病学风险因子可以包括但不限于，吸烟、饮食、女性性别、白人人中、和AMD的家族史。由于AMD在低于50岁的个体中是少见的，仅需要的风险因子是年龄，这暗示伴随正常老化的多种细胞变化涉及AMD的发病机制。
AMD的病因学复杂性由有效疗法、预防性策略和用于研究其的优良动物模型的相对稀缺性所反映。由于该疾病的复杂性和不完全表征，AMD在 动物中是不完全建模的。这部分是由于动物和灵长类视网膜中的解剖学差异，以及该疾病形成所学的延长的时间。来自人分子遗传学和动物研究的证据支持以下观点，即负责正常光感受器RPE生理学的多种机制的改变的内稳态可促成该疾病。至少在分子水平上，可在动物模型中，且在一些情况中，甚至在那些其基因缺陷并非人中AMD的主要起因的模型中探索该疾病。
先前的遗传学研究以及深度病理学分析揭示对于AMD没有简单的遗传模式，且对各种AMD动物模型没有一种通用的病理学。本领域中已知非人灵长类模型比小鼠或大鼠模型更好地近似于人中的CNV，但非人灵长类在视网膜解剖学、组织学甚至遗传学中的根本性差异产生了不同物种特异性的病理学。
另外且如本文描述的，可将激光凝固法用于诱发动物模型中的CNV，一种类AMD症状。在一些情况中，激光处理使布鲁赫膜(Bruch’s membrane)破裂并引发在脉络膜中起源的纤维血管增殖性响应。该响应是针对后期AMD中的脉络膜新血管化建模的基础且在恒河猴和猕猴中开发。
使用氩激光器，将点保持较小并以足够功率激发以使布鲁赫膜破裂。这在眼底镜可见为光凝固时的泡。光凝固诱导脉络膜血管的血栓形成，继之以48小时后的再内皮化和到一周时新血管到视网膜下间隙中的生长。由于新形成的血管是更有渗透性的，可用荧光素血管造影术(fluorescein angiography)监测新血管化以评估血管渗漏。
自发的心血管退化(involution)(由减少的荧光素渗漏指示)在约3至7周时开始，然后逐渐进展(在约2至13个月的时段内)直至渗漏在该部位不再明显。
相比于较差形成血管的瘢痕，新血管生长的程度在所有模型中可以变化，且受到物种、视网膜中损伤的位置、和激光束的强度的影响。物种与物种之间的治疗差异中的内在可变性进一步证明了没有一种动物模型完全重演人中的AMD的观点。
随着结合蛋白VEGF的适体、抗体和可溶性受体诱饵的可获性，在过去的数年中针对AMD的治疗已发生变化。已显示VEGF蛋白或VEGF配体经由结合细胞受体(包括VEGF受体)刺激新血管的形成(即血管发生)。如本领域中已知的，抗VEGF药剂可在一定程度上预防在湿性AMD中发生的新血管化和血管发生。眼内注射或或(抗VEGF药剂)是昂贵的，且在大多数情况下，治疗必须每四至六周重复或每八周重复(在 的情况中)。例如，Lucentis是一种VEGF抗体片段，其花费约$1950/注射每月。Avastin(VEGF抗体)在标示外使用，而Eylea(VEGF阱)花费约$1850/注射且每隔一月施用。所有这些药物的共同问题是降低的药动学概况，因此需要重复的眼内注射。
本领域中需要实践和经济可行的、持续更长的治疗策略。本公开提供了针对其中一些需要的新的治疗物。
本公开提供一种抗VEGF分子如sFLT-1，其通过任何适宜的载体(例如重组病毒系统)投递到患有或怀疑患有AMD或相关的新血管视网膜疾病的人受试者的视网膜。在一些情况中，sFLT-1可以是VEGF的有力的直接结合的蛋白质。在一些情况中，sFLT-1可以阻断或抑制VEGF活性。
例如，如本领域中已知的，已观察到sFLT-1(如本文中进一步描述的)以Kd＝10pM结合VEGF蛋白二聚体。
本发明还提供涉及rAAV介导的到眼中的基因投递的组合物和方法。对于基于AAV的系统已观察到在犬眼中的长期基因表达(>8年)。sFLT-1mRNA在视网膜中的表达维持至少18个月。已进行了针对Leber先天性黑朦(Leber’s congenital amarousis)的3项人试验，其显示基于AAV的投递系统在视网膜变性疾病如LCA的背景中的安全性。
II.VEGF和Fms相关的酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白
A.VEGF
血管内皮生长因子(本文中称为“VEGF”或“VEGF配体”)是有力的内皮细胞特异性粗细胞分裂剂，其在生理学血管形成中起着关键作用。在一些情况中，VEGF活性起因于VEGF配体对细胞中一种或多种VEGF受体的结合。VEGF配体对VEGF受体的结合可具有大量下游细胞学和生化效应，包括但不限于组织中的血管发生。VEGF牵连于几乎每种类型的血管生成或新血管病症中，包括那些与癌症、缺血和验证有关的病症。另外，VEGF牵涉眼疾病，包括但不限于缺血性视网膜病、眼内新血管化、年龄相关的黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新血管化、和糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、糖尿病性视网膜水肿、增殖性糖尿病视网膜病、视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞、分枝视网膜静脉阻塞。另外，可将抗VEGF治疗，包括如本文中描述的本公开的组合物和方法，用于治疗本文中描述的这些疾 病的一种或多种中。
最近数据表明，VEGF是湿性形式AMD的发病机制中的主要血管生成性生长因子。
VEGF，一种46-kDa的同二聚体糖肽，由几种不同的眼细胞类型表达，包括但不限于色素上皮细胞、周细胞、血管内皮细胞、神经胶质和神经节细胞。在一些情况中，VEGF在视网膜形成期间以特定的时空模式表达。在一些情况中，VEGF的人同等型可包括206、189、183、165、148、145和121个氨基酸每单体的蛋白质，然而，主要的人VEGF同等型包括但不限于VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206。这些蛋白质由VEGF mRNA的可变剪接产生，且其结合肝素和特定VEGF受体或共受体(coreceptor)(神经毡蛋白)的能力不同。由VEGF基因的外显子1-5编码的域含有识别已知的VEGF受体KDR/FLK-1和FLT-1所需的信息。该域存在于所有的VEGF同等型中。VEGF经由这些作为高亲和力受体酪氨酸激酶的受体发挥作用，从而引起内皮细胞增殖、迁移和增加的血管通透性。
VEGF是涉及血管发生的复杂过程的几种因子之一，且对于血管内皮细胞具有非常高的特异性。VEGF是例如胚胎发生、骨骼生长和生殖功能的过程期间生理性血管发生的调节物，但其还牵涉与疾病如癌症、胎盘病症和其他状况有关的病理学血管发生。VEGF的潜在生物学作用可由特定的fms样膜跨越受体FLT-1和FLK-1/KDR介导。在一些情况中，VEGF的这些天然存在的结合配偶可以影响VEGF对VEGF受体的结合，如此调控VEGF受体和后续下游途径的激活。
由于与癌症相关，几种VEGF抑制剂(包括对VEGF的人源化单克隆抗体(rhuMab VEGF)、抗VEGFR-2抗体、抑制VEGFR-2信号转导的小分子和可溶性VEGF受体)已显示一些治疗特性。
由于与眼内新血管疾病(如糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、或年龄相关的黄斑变性)相关，一些VEGF拮抗剂已显示治疗效果，尽管需要频繁施用。
B.抗VEGF
本公开的重组病毒包含编码抗VEGF蛋白的序列，所述抗VEGF蛋白包括但不限于美国专利No5,712,380,5,861,484和7,071,159中披露的VEGF结合蛋 白或其功能片段，和美国专利No.7,635,474中披露的VEGF结合融合蛋白。抗VEGF蛋白还可以包括如本文中描述的sFLT-1蛋白。
本公开的重组病毒或质粒可包含编码抗VEGF蛋白(包括天然存在蛋白sFlt-1)的序列，如美国专利5,861,484中描述的且该序列由SEQ ID NO:109描述。这还包括但不限于其功能片段，包括sFlt-1域2的序列或在SEQ ID NO:121所列的那些，以及相关构建体，如美国专利No.7,635,474中披露的VEGF结合融合蛋白。抗VEGF蛋白还可包括如本文中描述的sFLT-1蛋白。这些序列可使用遗传密码子(一种本领域技术人员理解的标准技术)从编码这类序列的DNA表达。如本领域技术人员能领会的，由于遗传密码子的简并性，抗VEGF蛋白序列可容易地从许多不同的DNA序列表达。
本文中“sFlt-1蛋白”指与天然存在的人sFLT-1序列具有至少90％或更高同源性的多肽序列或其功能片段，从而所述sFlt-1蛋白或多肽结合VEGF和/或VEGF受体。同源性指两条序列之间比对的序列％保守(例如天然存在的人sFLT-1蛋白可包括sFLT-1的任意合适变体，包括但不限于功能片段，包含插入、缺失、取代的序列，假片段，假基因，剪接变体或人工优化序列。在一些情况中，“sFLT-1蛋白”可以与天然存在的人sFLT-1蛋白序列至少约90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.9％,99.99％或100％同源。在一些情况中，“sFLT-1蛋白”可以与天然存在的人sFLT-1蛋白质序列至多约90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.9％,99.99％或100％同源。在一些情况中，“sFLT-1蛋白”可以与天然存在的人sFLT-1蛋白构象至少约90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.9％,99.99％或100％空间同源。在一些情况中，“sFLT-1蛋白”可以与天然存在的人sFLT-1蛋白构象至多约90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,99.9％,99.99％或100％空间同源。
另外，VEGF受体FLT-1的可溶性截短形式sFLT-1是唯一已知的VEGF的内源性特异性抑制剂。在自然界中，其通过mRNA可变剪接生成且缺少膜近端的免疫球蛋白样域、跨膜跨越区和胞内酪氨酸激酶域。结构上，FLT-1和sFLT-1蛋白可以都包含多个功能域。在一些变体中，FLT和sFLT蛋白普遍共享6个互连的域；3个域涉及蛋白质的二聚化而3个域涉及配体如VEGF的结合。
sFLT-1是FLT-1的可溶性截短形式且其内源性表达。如本文中描述的，“可 溶性”FLT-1或sFLT-1指不受限于细胞膜的FLT-1。不结合的sFLT-1可在胞外空间或溶液中自由扩散。
sFLT-1是唯一已知的VEGF的内源性特异性抑制剂。该相互作用是特异性的且可与100倍过量的未标记VEGF抵消。在一些情况中，sFLT-1的血管稳定活性可起因于通过两种机制对VEGF的抑制：i)扣留其以高亲和力结合的VEGF，和ii)与VEGF受体FLTt-1和FLK-1/KDR的跨膜同等型形成无活性的异二聚体。如本领域中已知的，体外结合测定法已指示sFLT-1以高亲和力结合VEGF且还可以抑制人脐带静脉内皮细胞的VEGF驱动的增殖。在针对癌症的动物模型中，sFLT-1抑制肿瘤生长。在一些情况中，sFLT-1可以以亚化学计量或显性失活的方式作用，因为可阻止胞外空间中过量的VEGF结合和随后激活VEGF受体。sFLT-1的这些特性已记载于Kendall和Thomas,1993；Proc Natl Acad Sci.90:10705-10709，其通过提述完整并入本文中。如本领域中已知的，sFLT-1的功能片段可替换全长蛋白质使用。更具体地，VEGF结合域(域2)，或者sFLT-1的域2加上来自sFLT1、KDR或另一家族成员的域3，可用于结合VEGF并使其失活。这类功能片段记载于Wiesmann等,1997；Cell,91:695-704，其通过提述完整并入本文。术语“sFLT-1”和“sFLT-1的功能片段”等同且在本文中可交换使用。
III.载体和重组病毒
本公开的组合物和方法提供将编码抗VEGF(例如sFLT-1蛋白)的核酸投递到有此需要的人受试者或患者中的细胞。在一些情况中，核酸的投递可称为基因疗法。
本公开的组合物和方法提供任何适宜的方法用于投递所述抗VEGF核酸(例如sFLT-1)。在一些情况中，可使用任何适宜的“载体”(有时亦称为“基因投递”或“基因转移媒介物”)实施核酸的投递。载体、投递媒介物、基因投递媒介物或基因转移媒介物，可以指任何适宜的大分子或分子复合物，其包含要投递到靶细胞的多核苷酸。在一些情况中，靶细胞可以是投递该核酸或基因的任意细胞。要投递的多核苷酸可以包含基因疗法中感兴趣的编码序列，如sFLT-1基因。
例如，适宜的载体可包括但不限于，病毒载体如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、和逆转录病毒、脂质体、其他含脂质复合物、和能够介导多核苷酸 到靶细胞投递的其他大分子复合物。
在一些情况中，载体可以是有机或无机分子。在一些情况中，载体可以是小分子(即<5kD)，或大分子(即>5kD)。例如，载体可包括但不限于，惰性、无生物活性的分子如金属颗粒。在一些情况中，载体可以是金颗粒。
在一些情况中，载体可包含生物学活性分子。例如，载体可包含聚合的大分子，如树形分子(dendrimer)。
在一些情况中，载体可包含掺入一种或多种核酸的重组病毒载体。如本文描述的，核酸可以指多核苷酸。核酸和多核苷酸可交换使用。在一些情况中，核酸可包括DNA或RNA。在一些情况中，核酸可包括DNA或RNA用于表达sFLT-1。在一些情况中，RNA核酸可包括但不限于，目的基因的转录本(例如sFLT-1)、内含子、不翻译区、终止序列等。在其他情况中，DNA核酸可包括但不限于序列如杂合启动子基因序列，强组成型启动子序列，目的基因(例如sFLT-1)，不翻译区，终止序列等。在一些情况中，可使用DNA和RNA的组合。
如本文中的公开内容中描述的，术语“表达构建体”意为包括任何类型的含有编码基因产物的核酸或多核苷酸的遗传构建体，其中部分或所有的核酸编码序列能够被转录。转录本可以翻译成蛋白质。在一些情况中，它可以部分翻译或不翻译。在某些方面，表达包括基因的转录和mRNA翻译成基因产物。在其他方面，表达仅包括编码目的基因的核酸的转录。
在一个方面，本公开提供重组病毒，如腺伴随病毒(rAAV)作为载体来介导sFLT-1的表达。
在一些情况中，本公开的病毒载体可测量为pfu(噬斑形成单位)。在一些情况中，重组病毒，或本公开组合物和方法的病毒载体的pfu可以为约108至约5x1010pfu。在一些情况中，本公开的重组病毒为至少约1x108,2x108,3x108,4x108,5x108,6x108,7x108,8x108,9x108,1x109,2x109,3x109,4x109,5x109,6x109,7x109,8x109,9x109,1x1010,2x1010,3x1010,4x1010和5x1010pfu。在一些情况中，本公开的重组病毒为至多约1x108,2x108,3x108,4x108,5x108,6x108,7x108,8x108,9x108,1x109,2x109,3x109,4x109,5x109,6x109,7x109,8x109,9x109,1x1010,2x1010,3x1010,4x1010和5x1010pfu。
在一些情况中，本公开的病毒载体可测量为载体基因组。在一些情况中，本公开的重组病毒为1x1010至3x1012个载体基因组。在一些情况中，本公开的 重组病毒为1x109至3x1013个载体基因组。在一些情况中，本公开的重组病毒为1x108至3x1014个载体基因组。在一些情况中，本公开的重组病毒为至少约1x101,1x102,1x103,1x104,1x105,1x106,1x107,1x108,1x109,1x1010,1x1011,1x1012,1x1013,1x1014,1x1015,1x1016,1x1017和1x1018个载体基因组。在一些情况中，本公开的重组病毒为1x108至3x1014个载体基因组。在一些情况中，本公开的重组病毒为至多约1x101,1x102,1x103,1x104,1x105,1x106,1x107,1x108,1x109,1x1010,1x1011,1x1012,1x1013,1x1014,1x1015,1x1016,1x1017和1x1018个载体基因组。
在一些情况中，本公开的重组病毒可使用感染复数(MOI)测量。在一些情况中，MOI可指载体或病毒基因组对可投递核酸的细胞的比率或倍数。在一些情况中，MOI可以是1x106。在一些情况中，MOI可以是1x105-1x107。在一些情况中，MOI可以是1x104-1x108。在一些情况中，本公开的重组病毒为至少约1x101,1x102,1x103,1x104,1x105,1x106,1x107,1x108,1x109,1x1010,1x1011,1x1012,1x1013,1x1014,1x1015,1x1016,1x1017和1x1018MOI。在一些情况中，本公开的重组病毒为至1x108至3x1014MOI。在一些情况中，本公开的重组病毒为至多约1x101,1x102,1x103,1x104,1x105,1x106,1x107,1x108,1x109,1x1010,1x1011,1x1012,1x1013,1x1014,1x1015,1x1016,1x1017和1x1018MOI。
在一些方面，可不使用病毒来投递核酸(即使用非病毒载体)，且可以测量为核酸的量。一般地，可将任意合适量的核酸与本公开的组合物和方法一起使用。在一些情况中，核酸的量可以是至少约1pg,10pg,100pg,1pg,10pg,100pg,200pg,300pg,400pg,500pg,600pg,700pg,800pg,900pg,1μg,10μg,100μg,200μg,300μg,400μg,500μg,600μg,700μg,800μg,900μg,1ng,10ng,100ng,200ng,300ng,400ng,500ng,600ng,700ng,800ng,900ng,1mg,10mg,100mg,200mg,300mg,400mg,500mg,600mg,700mg,800mg,900mg 1g,2g,3g,4g或5g。在一些情况中，核酸可以是至多约1pg,10pg,100pg,1pg,10pg,100pg,200pg,300pg,400pg,500pg,600pg,700pg,800pg,900pg,1μg,10μg,100μg,200μg,300μg,400μg,500μg,600μg,700μg,800μg,900μg,1ng,10ng,100ng,200ng,300ng,400ng,500ng,600ng,700ng,800ng,900ng,1mg,10mg,100mg,200mg,300mg,400mg,500mg,600mg,700mg,800mg,900mg,1g,2g,3g,4g或5g。
在一些方面，可以使用自身互补载体(sc)。使用自身互补的AAV载体可以规避对病毒第二链DNA合成的需要且可以导致转基因蛋白的更高表达比率，如由通过提述并入本文的Wu,Hum Gene Ther.2007,18(2):171-82提供的。
在一些方面，可以生成几种AAV载体以实现最佳血清型、启动子和转基因的选择。
在一些情况中，所述载体可以是靶向性载体，特别是选择性结合特定细胞，如癌细胞或肿瘤细胞或眼细胞的靶向性载体。用于本公开的病毒载体可包括那些对靶细胞展现低毒性且以细胞特异性方式诱导治疗有效量的抗VEGF蛋白的产生的病毒载体。
本公开的组合物和方法提供任何适宜的病毒核酸投递系统，包括但不限于使用以下至少一种：腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、辅助物依赖性腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物、Moloney鼠白血病病毒、和基于HIV的病毒。优选地，病毒载体包含强真核启动子可操作地连接于多核苷酸，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。
一般地，可将任何适宜的病毒载体工程化以针对本公开的组合物和方法的使用进行优化。例如，可以使用源自腺病毒(Ad)或腺伴随病毒(AAV)的病毒载体。人和非人的病毒载体两者均可使用且可改变重组病毒载体从而使其在人中可以是复制缺陷性的。当载体是腺病毒时，所述载体可包含具有启动子可操作地连接于编码抗VEGF蛋白的基因且在人中是复制缺陷性的多核苷酸。
为了将两种病毒载体系统的有利特性组合，可以使用杂合病毒载体来将编码sFLT-1蛋白的核酸投递到靶细胞或组织。用于构建杂合载体的标准技术是本领域技术人员公知的。这类技术可见于例如，Sambrook等，于Molecular Cloning:A laboratory manual.Cold Spring Harbor,N.Y.或任意数目的论述重组DNA技术的实验室手册。可以使用腺病毒壳体中的双链AAV基因组(含有AAV和腺病毒ITR的组合)来转导细胞。在另一变化中，可将AAV载体置于“内空”、“辅助物依赖性”或“高容量”的腺病毒载体中。腺病毒/AAV杂合载体论述于Lieber等,J.Virol.73:9314-9324,1999。逆转录病毒/腺病毒杂合载体论述于Zheng等,Nature Biotechnol.18:176-186,2000。
腺病毒内含有的逆转录病毒基因组可整合到靶细胞基因组中并达到稳定的基因表达。
可依照已知技术产生复制缺陷性的重组腺病毒载体。参见Quantin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2581-2584(1992)；Stratford-Perricadet等,J.Clin.Invest.,90:626-630(1992)；和Rosenfeld等,Cell,68:143-155(1992)。
另外优选的载体可包括但不限于病毒载体，融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括Moloney鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。在一些情况中，可以使用基于HIV的病毒载体，其中所述基于HIV的病毒载体包含至少两种载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组而env基因来自另一种病毒。可以使用DNA病毒载体。这些载体包括痘载体如正痘病毒(orthopox)或禽痘病毒(avipox)载体，疱疹病毒载体如单纯疱疹I病毒(HSV)载体[Geller,A.I.等,J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.等，于DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover,Ed.(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.等,Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.:907603(1993)；Geller,A.I.等,Proc Natl.Acad.Sci USA:87:1149(1990)]，腺病毒载体[LeGal LaSalle等,Science,259:988(1993)；Davidson等,Nat.Genet.3:219(1993)；Yang等,J.Virol.69:2004(1995)]和腺伴随病毒载体[Kaplitt,M.G.等,Nat.Genet.8:148(1994)]，通过提述并入本文中。
可依照本公开使用的其他病毒载体包括基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体。缺失一个或多个立即早期基因(IE)的HSV载体是有利的，因为它们一般是无细胞毒性的，在靶细胞中持续以类似于潜伏的状态存在，且提供有效的靶细胞转导。重组HSV载体可掺入约30kb的异源核酸。
逆转录病毒，如C型逆转录病毒和慢病毒，亦可用于本公开。例如，逆转录病毒载体可基于鼠白血病病毒(MLV)，如Hu和Pathak,Pharmacol.Rev.52:493511,2000和Fong等,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17:1-60,2000提供的，其通过提述并入本文。基于MLV的载体可以含有长达8kb的代替病毒基因的异源(治疗性)DNA。所述异源DNA可含有组织特异性的启动子和抗VEGF蛋白核酸。在投递到赘生物细胞的方法中，它还可以编码针对组织特异性受体的配体。
可以使用的其他逆转录病毒载体包括但不限于复制缺陷性的基于慢病毒的载体，包括基于人免疫缺陷性病毒(HIV)的载体，如Vigna和Naldini,J.Gene Med.5:308-316,2000和Miyoshi等,J.Virol.72:8150-8157,1998提供的，其通过提述并入本文中。慢病毒载体可以是有利的，因为它们能感染活性分 裂和不分裂的细胞两者。它们还可以在转导人上皮细胞时高度有效。
用于本公开的慢病毒载体可以源自人和非人(包括SIV)慢病毒。慢病毒载体的例子包括载体增殖所需要的核酸序列以及组织特异性启动子可操作地连接于抗VEGF蛋白基因。核酸序列可包括病毒LTR、引物结合位点、聚嘌呤束、att位点和衣壳化位点。
慢病毒载体可包装到任何适宜的慢病毒壳体中。将一种颗粒蛋白用来自不同病毒的另一种取代称为“假型化(pseudotyping)”。载体壳体可含有来自其他病毒，包括鼠白血病病毒(MLV)或泡性口炎病毒(VSV)的病毒包膜。使用VSV G-蛋白得到高载体滴度且产生更高的载体病毒颗粒的稳定性。
基于α病毒的载体，如那些从semliki森林病毒(SFV)和sindbis病毒(SIN)制得的，也可用于本公开中。α病毒的使用记载于Lundstrom,K.,Intervirology43:247-257,2000和Perri等,Journal of Virology 74:9802-9807,2000，其通过提述并入本文。
重组、复制缺陷性α病毒载体可以是有利的，因为它们能实现高水平的异源(治疗性)基因表达，且能感染范围较宽的靶细胞。α病毒复制子可通过在其病毒粒体表面上展示功能性异源配体或结合域(其将允许选择性结合表达同类结合配偶的靶细胞)而靶向特定的细胞类型。α病毒复制子可建立潜伏期，且因此在靶细胞中有长期异源核酸表达。复制子还可以在靶细胞中展现瞬时异源核酸表达。
痘病毒载体可将基因引入细胞的细胞质中。禽痘病毒病毒载体可仅导致基因或核酸的短期表达。腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体可与本公开的组合物和方法一起使用。腺病毒载体可导致比腺伴随病毒更短期的表达(例如短于约1个月)，在一些方面，且可以展现长得多的表达。选择的具体载体可依赖于靶细胞和待治疗的疾患。
腺伴随病毒(AAV)是小的无包膜的单链DNA病毒。它们是不致病的人细小病毒且可以依赖于辅助物病毒(包括腺病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒和CMV)进行复制。暴露于野生型(wt)AAV不与任何人病理学相关或已知不导致任何人病理学，且在一般群体中是普遍性的，通常与腺病毒感染相关地发生在生命的头十年中。
如本文中描述的，“AAV”指腺伴随病毒。“rAAV”指重组的腺伴随病毒。
在一些情况中，野生型AAV编码rep和cap基因。Rep基因是病毒复制所需要的，而cap基因是壳体蛋白合成所需要的。经由备选的翻译起始和剪接位点的组合，小基因组可以能够表达四种rep和三种cap基因产物。Rep基因产物和反向末端重复中的序列(145bp ITR，其侧接基因组)在此过程中可能是关键性的。迄今为止，已分离出11种血清型的AAV。AAV2可与本公开的组合物和方法一起使用。本公开的组合物和方法提供使用任意适宜的AAV血清型。在一些方面，AAV选自下组：AAV1,AAV2,AAV2.5,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV11,AAV12,rh10，及其杂合体。
在一些方面，本公开提供包含核酸的重组病毒，该核酸还包含截短的可溶性VEGF受体1(sFLT-1)的人形式，该重组病毒称为rAAV.sFlt-1。所述载体是重组的复制缺陷性腺伴随病毒(rAAV)载体，其为血清型2。在另一方面，所述载体是重组的复制缺陷性血清型2腺伴随病毒(rAAV)载体，称为rAAV.sFlt-1。
AAV2是表征最多的。已显示rAAV2能介导在许多动物物种的眼中的长期转基因表达。在大鼠中，rAAV介导的报道基因(绿色荧光蛋白)在注射后18个月时仍存在。在猴中，同一报道基因在注射后17个月时存在。类似地，高sFLT-1蛋白水平在注射后15个月时存在于经rAAV.sFlt-1注射的猴眼的玻璃体中。
已在眼内新血管病症的动物模型中测试了rAAV.sFlt-1。rAAV.sFlt-1表现为延迟角膜新血管化和视网膜新血管化的动物模型中新血管化的进展。有意思的是，rAAV介导的sFlt-1指示在脉络膜新血管化的猴模型(针对年龄相关的黄斑变性或AMD的湿性形式的模型)中对新血管化的一些抑制。在该研究中，rAAV.sFlt-1构建体的存在显示sFLT-1在猴眼中的低表达水平，且不影响猴的健康或视网膜功能。没有证据表明与对rAAV.sFlt-1的系统性暴露有关的任何安全性问题。在这些研究中的总体正面发现和rAAV载体的缺乏毒性，以及关于rAAV.sFlt-1在脉络膜新血管化/AMD的哺乳动物模型中的发现提供了大量支持性数据，即该载体在对眼施用时具有有利的安全性概况。
尽管rAAV.sFlt-1有改善猴模型中AMD的某些症状的能力，但sFLT-1蛋白水平在视网膜中预料不到的低。本领域中已显示由组成型活性哺乳动物启动子驱动的sFLT-1的表达水平在许多细胞类型中提供高水平的蛋白表达。不受理论束缚地，对于这种低于预期的表达水平可能存在多种可能性。作为一种 较大的多域蛋白质，sFLT-1可易受未成熟的蛋白水解降解、较差表达动力学或非最佳分选的影响。对于后者，作为分泌蛋白质的sFLT-1在细胞中重组表达时进入分泌途径。在视网膜细胞(包括RPE细胞)中，根据对该蛋白的ER或高尔基体分选，sFLT-1可以顶端或基底外侧(basolaterally)分泌。在一些情况中，非最佳分选可以将分子分泌到不期望的基底外侧膜，如此降低抑制RPE细胞层的顶表面上的VEGF信号传导和新血管血管发生可用的sFLT-1分子的浓度。
另外，本领域中未知这一预料不到的sFLT-1低水平如何可以影响药物对于治疗人中的实际AMD疾病的功效。尽管猴模型中勉强升高的水平显示改善AMD症状的有前途的迹象，但针对AMD的猴动物模型仅充当AMD疾病的代替物。如本文中描述的，在视网膜中人工诱导(经由激光)AMD症状。尽管该模型适用于各种分析，但药物在治疗猴模型的症状中的实际功效难以外推到治疗人中的疾病。如由rAAV.sFlt-1生成的预料不到的低蛋白水平进一步增加了该评估的难度(没有在人中的实验)。
另外，英国和美国正使用rAAV2主链进行Leber先天性黑朦(LCA)的3项临床试验。LCA是一种罕见的遗传性眼病，其在出生时或在生命的头几个月出现，由眼震颤、迟缓或无瞳孔响应、和严重的视觉丧失或目盲表征。迄今为止，在将rAAV2构建体注射到这2项试验的6名参与者的视网膜下间隙后没有报告安全性问题。参与临床试验的两个小组均推定其发现支持在LCA患者中进一步的基因疗法研究。
鉴于在猴中生成实质性或持续升高水平的sFLT-1的明显技术难度，可采取多种优化策略来解决在引入rAAV.sFlt-1后视网膜中更低的sFlt-1蛋白水平所潜在的一个或多个技术问题。在一些情况中，优化策略(包括由本公开的组合物和方法提供的)可包括提高优化sFlt-1蛋白序列或域，引入控制元件以指导在视网膜细胞中表达后的正确分选，或升高水平的sFlt-1蛋白以补偿这些可能因素的任一个。在一些情况中，本公开的组合物和方法提供针对后者的特定策略，其牵涉掺入特定的核酸序列，该核酸序列针对改进人视网膜中相对于先前在猴研究中观察到的sFlt-1水平升高的蛋白水平。如本文中描述的，可将多种序列、接头、UTR、内含子、sFLT-1变体或其组合用于提高在暴露于rAAV.sFlt-1后视网膜中sFlt-1蛋白的蛋白水平。
载体可包含进一步调控基因投递和/或基因表达的组件或功能性，或者另 外提供对靶向的细胞的有益特性。这类其他组件包括例如，影响对细胞的结合或靶向的组件(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组件)；影响细胞摄取载体核酸的组件；影响摄取后多核苷酸在细胞内定位的组件(如介导核定位的因子)；和影响多核苷酸表达的组件。这类组件还可包括标志物，如可检测或选择已吸收且正表达由载体投递的核酸的细胞的可检测和/或可选择的标志物。这类组件可以以载体的天然特征(如使用特定病毒载体，其具有介导结合和摄取的组件或功能性)，或可经修饰以提供这类功能性的载体提供。
可选择的标志物可以是阳性、阴性或双功能的。阳性可选择标志物允许选择携带该标志物的细胞，而阴性可选择标志物允许将携带该标志物的细胞选择性消除。已描述了多种这类标志物基因，包括双功能(即阳性/阴性)标志物(参见例如Lupton,S.,WO 92/08796，1992年5月29日公开；和Lupton,S.,WO 94/28143，1994年12月8日公开)。阴性可选择标志物的例子可包括纳入对抗生素的抗性基因，如氨苄青霉素或卡那霉素。这类标志物基因可提供添加的控制手段，其在基因治疗背景中可能是有利的。本领域中已知很多种这类载体且是一般性可获的。
在一些情况中，编码抗生素抗性标志物的核酸可包括但不限于以下序列，如SEQ ID No.110,SEQ ID No.111,SEQ ID No.112,SEQ ID No.113或SEQ ID No.114。
在与本公开的方法相容的许多病毒载体中，可将一种或多种启动子包含在载体中以允许超过一种异源基因由载体表达。另外，载体可包含编码信号肽或促进抗VEGF蛋白从靶细胞表达的其他模块的序列。
编码基因产物的核酸可出于启动子的转录控制下。如本文中提供的“启动子”指启动基因转录所需的适宜的DNA序列。短语“处于转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和取向，从而控制RNA聚合酶启动和基因的表达。在一些情况中，启动子可包含“强”或组成型活性启动子。例如，可如本领域已知的使用CMV启动子作为组成型活性启动子。在一些情况中，CMV启动子可包含另外的调控元件用于促进表达。在一些情况中，CMV启动子可包含初始-早期CMV启动子。
在一些情况中，启动子可以指“弱”启动子，或比强启动子得到更低水平sFLT-1蛋白的序列。在一些情况中，可使用启动子从而使启动子驱动sFLT-1 的表达。在一些情况中，与如本文描述的其他序列组合使用的启动子或其他调控元件可用于驱动sFLT-1在眼细胞或眼组织中的选择性表达。
另外，“启动子”，104也可交换地用于本文中指可以存在于RNA聚合酶起始位点周围的任何另外的适宜转录控制模块。本公开的组合物和方法可以使用任何适宜的启动子和转录控制模块来表达转基因，106。另外的转录控制模块可包括但不限于元件如HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元。一般地，启动子可由离散的功能模块构成，其各自由约7-20bp的DNA或20-5000bp的DNA组成，且含有一个或多个用于转录激活或阻遏蛋白的识别位点。本公开的组合物和方法提供任何适宜的调控序列或其组合。在一些情况中，这些转录控制模块序列可称为或鉴定为增强子或阻遏物序列。
每个启动子至少有一个模块作用于安置RNA合成的起始位点。一个例子是TATA盒。其他例子可包括一些缺少TATA盒的启动子，如用于哺乳动物末端脱氧核糖核苷酸基转移酶基因的启动子和用于SV40晚期基因的启动子，叠加起始位点本身的离散元件有助于固定起始位置。
其他启动子元件调控转录启动的频率。一般地，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管许多启动子也可以含有在起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔可以是灵活的，从而使得当元件反向或相对于彼此移动时保留启动子功能。在例如tk启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始衰退前增加至相离50bp。根据启动子，各个元件可安置为协同作用或独立作用来激活转录。
本公开的组合物和方法提供任何适宜的序列用于控制目的核酸序列在靶细胞中的表达。如此，当靶向人细胞时，序列如核酸编码区可工程化为临近于启动子且在启动子的控制下，该启动子能在人细胞中表达。一般地，这类启动子可包括人或病毒启动子。
在本公开的各方面，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子(ie-CMV)、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复、beta-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶可用于获得目的编码序列(例如sFLT-1)的高水平表达。也涵盖使用其他本领域公知的病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子以实现目的编码序列的表达，只要表达水平足以用于给定目的。在一些方面，原核调控序列可存在于载体中，如T7RNA聚合酶启动子序列。在其他方面，载体没有这类调控序列。通过采用具有已知特性的启 动子，可以优化转染或转化后目的蛋白质的表达水平和模式。
对应答特定的生理和合成性信号而调控的启动子的选择可允许基因产物的可诱导表达。例如一种或多种转基因(利用多顺反子载体时)的表达对其中产生载体的细胞有毒性的情况中，可能期望抑制或降低一种或多种转基因的表达。对生产者细胞系可能有毒的转基因的例子是促凋亡和细胞因子基因。存在几种可诱导的启动子系统可用于产生病毒载体，其中转基因产物可能有毒性。本公开的组合物和方法提供任何适宜的启动子序列、调控序列和转基因的组合。在一些情况中，序列的组合可能导致对细胞无毒性。在一些情况中，序列的组合可能导致对细胞有高毒性。在一些情况中，序列的组合可能导致在细胞中有中等毒性水平。
蜕皮激素系统(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)是用于转基因表达的这类系统之一。该系统设计为允许目的基因在哺乳动物细胞中的受控表达。其由紧密调控的表达机制组成，其允许极少的转基因的基础水平表达，但有超过200倍的可诱导性。该系统基于果蝇的异二聚体蜕皮激素受体，且当蜕皮激素或类似物(如muristerone A)结合受体时，受体激活启动子以打开下游转基因的表达，从而获得高水平的mRNA转录本。在该系统中，异二聚体受体的两个单体从一个载体组成型表达，而驱动目的基因表达的蜕皮激素-响应性启动子在另一质粒上。本公开的组合物和方法中可利用将该类型的系统工程化到感兴趣的基因转移载体中。然后，含有感兴趣基因和受体单体的质粒的共转染将允许产生基因转移载体，而不表达潜在有毒性的转基因。在合适的时间，可用蜕皮激素或muristeron A激活转基因的表达。
在一些情况中，可能期望调控基因疗法载体中的转基因的表达。例如，根据期望的表达水平可以利用具有不同活性强度的不同病毒启动子。在哺乳动物细胞中，可使用CMV立即早期启动子以提供强转录激活。当期望降低的转基因表达水平时，也使用效力较低的经修饰的CMV启动子的型式。当期望转基因在造血细胞中表达时，经常使用逆转录病毒启动子，如来自MLV或MMTV的LTR(长末端重复)。根据期望的效果可使用的其他病毒启动子包括SV40,RSV LTR,HIV-1和HIV-2 LTR、腺病毒启动子如来自1E1A,E2A，或MLP区的，AAV LTR，花椰菜花叶病毒，HSV-TK和禽类肉瘤病毒。
在一些方面，使用组织特异性启动子来实现在特定组织或细胞中的转录，从而降低对不靶向的组织的潜在毒性或不想要的效果。例如，可以使用 启动子如PSA、probasin、前列腺酸性磷酸酶或前列腺特异性腺体激肽释放酶(glandular kallikrein)(hK2)来靶向前列腺中的基因表达。
在一些情况中，可以使用启动子或调控序列元件来指导在眼细胞或眼组织中的选择性表达。例如，可将见于特定眼细胞类型(如视网膜色素上皮细胞)的启动子、序列元件或调控序列用于适宜的表达构建体中(例如RPE65或VMD2启动子)。
可以容易地实现适宜启动子的选择。在一些情况中，可以使用高表达或强启动子。适宜启动子的例子是763碱基对的巨细胞病毒(CMV)启动子。还可以使用劳氏肉瘤病毒(RSV)(Davis等,Hum Gene Ther 4:151(1993))和MMT启动子。某些蛋白质可使用其天然启动子表达。还可纳入能增强表达的其他元件，如增强子或导致高表达水平的系统如tat基因和tar元件。然后可将该盒插入载体中，例如质粒载体，如pUC19,pUC118,pBR322，或其他已知的质粒载体，其包含例如大肠杆菌复制起点。参见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory press,(1989)。启动子在下文论述。质粒载体还可包含可选择的标志物如β-内酰胺酶基因用于氨苄青霉素抗性，只要标志物多肽不对所治疗的生物体的代谢有不利影响。所述盒还可结合合成投递系统中的核酸结合模块，如WO 95/22618中披露的系统，其通过提述并入本文中。一般地，启动子序列和/或任何相关调控序列可包含约至少150bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1000bp,2000bp,3000bp,4000bp,5000bp或10000bp。启动子序列和任何相关的调控序列可包含约至多150bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1000bp,2000bp,3000bp,4000bp,5000bp或10000bp。
在一些方面，重组病毒或质粒包含选自以下的启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、和MMT启动子、EF-1alpha启动子、UB6启动子、鸡beta-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。一般地，如本公开提供的启动子序列和启动子/增强子序列可包括但不限于选自以下的任意序列：SEQ ID No.17,SEQ ID No.18,SEQ ID No.19,SEQ ID No.20,SEQ ID No.21,SEQ ID No.22,SEQ ID No.23,SEQ ID No.24,SEQ ID No.25,SEQ ID No.26,SEQ ID No.27,SEQ ID No.28,SEQ ID No.29,SEQ ID No.30,SEQ ID No.31,SEQ ID No.32,SEQ ID No.33,SEQ  ID No.34,SEQ ID No.35,SEQ ID No.36,SEQ ID No.37,SEQ ID No.38,SEQ ID No.39,SEQ ID No.340,SEQ ID No.41,SEQ ID No.42,SEQ ID No.43,SEQ ID No.44,SEQ ID No.45,SEQ ID No.46和SEQ ID No.47。
在一些方面，将抗生素标志物用于生成重组病毒的方法中。抗生素抗性标志物可用于鉴定在重组病毒生成中的阳性转基因细胞。在一些方面，抗生素标志物包含编码抗生素抗性基因的序列，如本文中提供的那些，包括但不限于图8A和图8B中显示的序列。例如赋予抗性的标志物可包括但不限于，卡那霉素、艮他霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、强力霉素、或潮霉素。在一些方面，所述抗生素抗性基因是非beta-内酰胺抗生素抗性基因如卡那霉素。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒包含编码复制起点序列的序列，如本文中提供的那些。复制起点序列通常提供可用于增殖质粒的序列。一般地，如本公开提供的复制起点序列可包括但不限于选自如图7A,图7B,图7C和图7D中提供的序列的任意序列。
在一些方面，起点或复制起点序列可包括但不限于以下序列，如SEQ ID No.1,SEQ ID No.2,SEQ ID No.3,SEQ ID No.4,SEQ ID No.5,SEQ ID No.6,SEQ ID No.7,SEQ ID No.8,SEQ ID No.9,SEQ ID No.10,SEQ ID No.11,SEQ ID No.12,SEQ ID No.13,SEQ ID No.14,SEQ ID No.15,SEQ ID No.16，或SEQ ID No.17。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒包含增强子，如本文中提供的那些。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒包含嵌合内含子或内含子，105，如本文中提供的和美国专利No.7635474(其通过提述并入本文中)中披露的那些。内含子或嵌合内含子可在本文中交换使用。在一些情况中，内含子可以指任何可转录但不翻译的序列。在一些情况中，内含子可以指在细胞中转录并从成熟RNA转录本去除的任意序列。在一些情况中，内含子可包含约至少1bp,50bp,100bp,150bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1000bp,2000bp,3000bp,4000bp或5000bp。在一些情况中，内含子可包含约至少1bp,50bp,100bp,150bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1000bp,2000bp,3000bp,4000bp或5000bp。在一些情况中，内含子可以为约300bp。在一些情况中， 内含子可以为约200-400bp.在一些情况中，嵌合内含子可以为约100–500bp。在一些情况中，内含子可以为约50–200bp。在一些情况中，内含子可以为完整的天然存在的内含子或嵌合内含子。
在一些方面，内含子可包括但不限于以下序列，如SEQ ID No.48,SEQ ID No.115,SEQ ID No.116,SEQ ID No.117,SEQ ID No.118,SEQ ID No.119或SEQ ID No.120。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒包含聚A(聚腺苷酸化)序列，107，如本文中提供的那些(例如SV40聚A序列)。一般地，可将任何适宜的聚A序列用于期望的转基因表达(即sFLT-1)。例如，在一些情况中，本公开提供一种序列，其包含SV40聚A序列或SV40聚A序列的部分。在一些情况中，可以使用见于人基因组序列的人sFLT-1基因下游(3’UTR)发现的天然聚A序列。在其他情况中，可以使用在sFLT-1以外的基因的下游发现的聚A序列。在其他情况中，本公开提供包含一个或多个聚A序列或序列元件的组合的聚A序列。在一些情况中，不使用聚A序列。在一些情况中，一个或多个聚A序列可称为不翻译区(UTR)、3’UTR或终止序列。
在本公开的某些方面，可以利用内部核糖体进入位点(IRES)或口蹄疫病毒(FMDV)元件的使用来创建多基因或多顺反子信息。IRES元件能规避5’甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译。已描述了来自小RNA病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎)以及来自哺乳动物信息的IRES。IRES元件可连接于异源开放阅读框。可以一起转录多个开放阅读框，每个由IRES隔开，从而创建多顺反子信息。通过IRES元件，每个开放阅读框可到达核糖体用于有效翻译。使用转录单一信息的单一启动子/增强子可有效表达多个基因。用于在基因疗法投递载体中共表达两种蛋白质的备选系统是FMDV 2A系统。FMDV 2A系统采用逆转录病毒质粒载体，其中两个基因可连接于编码来自小RNA病毒口蹄疫病毒的2A序列的核苷酸序列。转录和翻译产生双顺反子mRNA和两种独立的蛋白质产物。
任何异源开放阅读框均可连接于IRES元件。这可包括针对分泌蛋白质、多亚基蛋白质(由独立的基因编码)、胞内或膜结合蛋白和可选择标志物的基因。以此种方式，可将几种蛋白质的表达用单一构建体和单一可选择标志物同时工程化到细胞中。
聚A序列可包含1-10bp,10-20bp,20-50bp,50-100bp,100-500bp, 500bp-1Kb,1Kb-2Kb,2Kb-3Kb,3Kb-4Kb,4Kb-5Kb,5Kb-6Kb,6Kb-7Kb,7Kb-8Kb,8Kb-9Kb和9Kb-10Kb的长度。聚A序列可包含至少1bp,2bp,3bp,4bp,5bp,6bp,7bp,8bp,9bp,10bp,20bp,30bp,40bp,50bp,60bp,70bp,80bp,90bp,100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1Kb,2Kb,3Kb,4Kb,5Kb,6Kb,7Kb,8Kb,9Kb和10Kb的长度。聚A序列可包含至多1bp,2bp,3bp,4bp,5bp,6bp,7bp,8bp,9bp,10bp,20bp,30bp,40bp,50bp,60bp,70bp,80bp,90bp,100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1Kb,2Kb,3Kb,4Kb,5Kb,6Kb,7Kb,8Kb,9Kb和10Kb的长度。
在一些情况中，聚A或终止序列可包括但不限于以下序列，如SEQ ID No.49,SEQ ID No.50,SEQ ID No.51,SEQ ID No.52,SEQ ID No.53,SEQ ID No.54和SEQ ID No.55。
一般地，如由本公开提供的聚A序列可包括但不限于，选自如图9A和图9B中提供的聚A区1-10的任意序列。
在一些情况中，可针对影响蛋白质表达的多种参数优化聚A序列，所述参数包括但不限于转基因在细胞中的mRNA半衰期、转基因的mRNA的稳定性或转录调控。例如，可改变聚A序列以增加转基因的mRNA转录本，其可导致增加的蛋白质表达。在一些情况中，可改变聚A序列以降低转基因的mRNA转录本的半衰期，其可导致降低的蛋白质表达。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒包含编码人sFLT-1蛋白或其功能片段的多核苷酸。在一些情况中，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒包含编码另一种抗VEGF蛋白或VEGF抑制剂的核酸。
在一些情况中，VEGF抑制剂可包含但不限于以下序列，如SEQ ID No.102,SEQ ID No.103,SEQ ID No.104,SEQ ID No.105,SEQ ID No.106,SEQ ID No.107,SEQ ID No.108，或SEQ ID No.122
在一些情况中，VEGF抑制剂的核酸可编码多肽序列，其可包括但不限于以下多肽序列，如SEQ ID No.109或SEQ ID No.121。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒包含调控性核酸片段，其能指导sFLT-1蛋白在眼细胞中的选择性表达。在一些情况中，眼细胞可包括视网膜色素上皮细胞(RPE)。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒可包含一种或多种 不翻译区(UTR)或序列。一般地，可将任何适宜的UTR序列用于期望的转基因(即sFLT-1)的最佳表达。例如，在一些情况中，UTR区或序列可包含天然序列。在一些情况中，UTR序列可以是如见于人基因组序列的人sFLT-1基因上游(5’UTR)或下游(3’UTR)发现的序列或其部分。在其他情况中，UTR序列可包含非天然序列，如见于sFLT-1以外的基因的上游或下游，或包含还包括一种或多种如本文中进一步描述的UTR序列元件的组合的序列。在一些情况中，仅使用5’UTR序列。在一些情况中，仅使用3’UTR序列。在一些情况中，不使用UTR序列。
UTR序列可包含1-10bp,10-20bp,20-50bp,50-100bp,100-500bp,500bp-1Kb,1Kb-2Kb,2Kb-3Kb,3Kb-4Kb,4Kb-5Kb,5Kb-6Kb,6Kb-7Kb,7Kb-8Kb,8Kb-9Kb和9Kb-10Kb的长度。UTR序列可包含至少1bp,2bp,3bp,4bp,5bp,6bp,7bp,8bp,9bp,10bp,20bp,30bp,40bp,50bp,60bp,70bp,80bp,90bp,100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1Kb,2Kb,3Kb,4Kb,5Kb,6Kb,7Kb,8Kb,9Kb和10Kb的长度。UTR序列可包含至多1bp,2bp,3bp,4bp,5bp,6bp,7bp,8bp,9bp,10bp,20bp,30bp,40bp,50bp,60bp,70bp,80bp,90bp,100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1Kb,2Kb,3Kb,4Kb,5Kb,6Kb,7Kb,8Kb,9Kb和10Kb的长度。
一般地，如由本公开提供的UTR序列可包括包括但不限于任意以下序列，其包括但不限于SEQ ID No.91,SEQ ID No.2,SEQ ID No.92,SEQ ID No.93,SEQ ID No.94,SEQ ID No.95,SEQ ID No.96,SEQ ID No.97,SEQ ID No.98,SEQ ID No.99,SEQ ID No.100和SEQ ID No.101。
在一些情况中，可优化5’UTR和/或3’UTR的变异用于期望的蛋白质表达水平。在一些情况中，可针对影响蛋白质表达的多种参数优化3’UTR序列，所述参数包括但不限于转基因在细胞中的mRNA半衰期、转基因的mRNA的稳定性或二级结构或条件性调控(例如多种因子的结合以调控翻译)。例如，可改变3’UTR序列以延长转基因的mRNA转录本的半衰期，其可导致增加的蛋白质表达。在一些情况中，可改变3’UTR序列以降低转基因的mRNA转录本的半衰期，其可导致降低的蛋白质表达。
一般地，3’UTR序列可包含多种序列元件。本公开提供3’UTR序列中可包括但不限于以下序列元件，如一种或多种聚腺苷酸化信号、接头序列、间 隔序列、SECIS元件、AU富集或ARE序列、或miRNA或RNAi结合序列、转录终止序列、3’终止序列、或其变体和/或组合。
在一些情况中，可针对影响蛋白质表达的多种参数优化5’UTR序列，所述参数包括但不限于转基因在细胞中的mRNA半衰期、转基因的mRNA的稳定性或二级结构或转录调控。例如，可改变5’UTR序列以增加转基因的mRNA转录本的翻译效率，其可导致增加的蛋白质表达。在一些情况中，可改变5’UTR序列以降低转基因的mRNA转录本的翻译效率，其可导致降低的蛋白质表达。
一般地，5’UTR序列可包含多种序列元件。本公开提供5’UTR序列中可包括但不限于以下序列元件，如一种或多种核糖体进入位点(RBS)、接头序列、间隔序列、调控序列、调控应答元件、核糖开关(riboswitch)、促进或抑制翻译启动的序列、mRNA运输的调控序列、或其变体和/或组合。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒可包含一种或多种接头或间隔序列。如本文中描述的，接头序列或间隔序列可交换使用。一般地，接头序列或间隔序列可以是用于在至少两个序列元件之间创建不毗连序列的任何适宜序列。例如，在本公开的一个方面，可发现接头序列插入于ITR-1(108)序列或ITR-2(103)和抗生素抗性基因序列(106)之间，如图1A中反映的。在另一个例子中，接头序列可插入到临近于重组病毒或编码重组病毒的质粒的任意序列元件，包括ITR序列、启动子或启动子/增强子序列、内含子序列、转基因序列和聚A区序列。一般地，可将任何适宜的接头和间隔序列用于创建不毗连序列。例如，在一些情况中，接头序列可以是随机生成的序列。在一些情况中，接头序列可以是非特定的序列，其经过优化以防止可能不利地影响蛋白质表达的二级结构或分子内相互作用的形成。在一些情况中，接头序列可包含任何别的功能序列元件，包括但不限于内含子、调控序列、增强子等。接头序列中的功能元件可用于期望的病毒的最佳产生和/或转基因表达。在一些情况中，接头序列是克隆位点、先前克隆位点的残余物或其他不重要的序列，而且在任意两个序列元件之间插入这类接头是任选的。
一般地，如本公开提供的接头序列可包括但不限于，选自如图9D,图9E和图9F中提供的序列的任意序列。
在一些情况中，可优化接头序列的长度以用于期望的最佳的病毒产生和/或转基因表达的表达。在一些情况中，可以变化位于病毒基因组或质粒中一 个或多个位点处的一个或多个接头序列的长度以产生期望的最佳蛋白质表达。例如，接头序列可见于在如本文中描述的内含子和转基因(即sFLT-1)之间。可以变化接头序列的长度以对转基因在细胞中的转录和随后翻译产生不同的影响。
接头序列可包含1-10bp,10-20bp,20-50bp,50-100bp,100-500bp,500bp-1Kb,1Kb-2Kb,2Kb-3Kb,3Kb-4Kb,4Kb-5Kb,5Kb-6Kb,6Kb-7Kb,7Kb-8Kb,8Kb-9Kb和9Kb-10Kb的长度。接头序列可包含至少1bp,2bp,3bp,4bp,5bp,6bp,7bp,8bp,9bp,10bp,20bp,30bp,40bp,50bp,60bp,70bp,80bp,90bp,100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1Kb,2Kb,3Kb,4Kb,5Kb,6Kb,7Kb,8Kb,9Kb和10Kb的长度。接头序列可包含至多1bp,2bp,3bp,4bp,5bp,6bp,7bp,8bp,9bp,10bp,20bp,30bp,40bp,50bp,60bp,70bp,80bp,90bp,100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1Kb,2Kb,3Kb,4Kb,5Kb,6Kb,7Kb,8Kb,9Kb和10Kb的长度。
在一些情况中，接头或间隔序列可包括但不限于SEQ ID No.60,SEQ ID No.61,SEQ ID No.62,SEQ ID No.63,SEQ ID No.64,SEQ ID No.65,SEQ ID No.66,SEQ ID No.67,SEQ ID No.68,SEQ ID No.69,SEQ ID No.70,SEQ ID No.71,SEQ ID No.72,SEQ ID No.73,SEQ ID No.74,SEQ ID No.75,SEQ ID No.76,SEQ ID No.77,SEQ ID No.78,SEQ ID No.79,SEQ ID No.80,SEQ ID No.81,SEQ ID No.82,SEQ ID No.83,SEQ ID No.84,SEQ ID No.85,SEQ ID No.86,SEQ ID No.87,SEQ ID No.88,SEQ ID No.89和SEQ ID No.90。
在一些方面，所述重组病毒包含反向末端重复(ITR)序列，其用于将重组基因表达盒包装到病毒载体的病毒粒体中。在一些情况中，ITR来自腺相关的病毒(AAV)。在一些情况中，ITR来自AAV血清型2。在一些情况中，ITR可包括但不限于SEQ ID No.56,SEQ ID No.57,SEQ ID No.58，或SEQ ID No.59。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒包含处于以下次序的核酸元件：a)第一ITR序列；b)启动子序列；c)内含子序列；d)第一UTR序列；e)编码VEGF抑制剂的序列；f)第二UTR序列；g)聚A序列；和h)第二ITR序列。在重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒的一些方面，启动子 序列包含启动子/增强子序列。在一些方面，编码VEGF抑制剂的序列包含编码人sFLT-1蛋白或其功能片段的序列。在其他方面，用于生成重组病毒的质粒还包含复制起点序列，102。在一些方面，所述质粒还包含抗生素抗性基因的序列，如本文提供的。
在一些方面，重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒包含处于以下次序的核酸：a)第一ITR序列；b)第一接头序列；c)启动子序列；d)第二接头序列；e)内含子序列；f)第三接头序列；g)第一UTR序列；h)编码VEGF抑制剂的序列；i)第二UTR序列；j)第四接头序列；k)聚A序列；l)第五接头序列；和m)第二ITR序列。在重组病毒和/或用于生成重组病毒的质粒的一些方面，启动子序列包含启动子/增强子序列。在一些方面，编码VEGF抑制剂的序列包含编码人sFLT-1蛋白或其功能片段的序列。在其他方面，用于生成重组病毒的质粒还包含复制起点序列。在一些方面，所述质粒还包含抗生素抗性基因的序列，如本文提供的。
IV.药物组合物 
药物组合物是含有一种或多种活性成分以及一种或多种赋形剂、载体、稳定剂或填充剂(bulking agent)的制剂，其适用于对人患者施用以实现期望的诊断结果或治疗或预防效果。为了贮存稳定性和便于操作，药物组合物可配置为冻干(即冷冻干燥)或真空干燥的粉末，其可在对患者施用之前用盐水或水重建。或者，药物组合物可配置成水性溶液。药物组合物可以含有蛋白质性活性成分。不幸地是，蛋白质可能非常难以稳定，从而导致在配制、重建(若需要)期间和在使用含有蛋白质的药物组合物之前的贮存期间蛋白质的损失和/或蛋白质活性的损失。稳定性问题可由于蛋白质变性、降解、二聚化和/或聚合而发生。已以不同的成功程度使用了多种赋形剂(如清蛋白和明胶)来试图稳定化药物组合物中存在的蛋白质活性成分。另外，已使用冷冻保护剂如醇来降低冻干冷冻条件下的蛋白质变性。
适用于内部使用的药物组合物包括无菌水溶液或分散物和用于即时制备无菌可注射溶液或分散物的无菌粉末。对于静脉内施用，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物均必须是无菌的而且流动性的程度应当易于注射。它在制造和贮存的条件下必须是稳定的，而且必须针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用提供防护。 载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇、等等)、及其合适混合物。恰当的流动性可以例如通过使用涂层诸如卵磷脂、通过维持所需粒度(在分散的情况中)及通过使用表面活性剂来维持，所述表面活性剂如聚山梨醇酯(TweenTM)、十二烷基硫酸钠(月桂基硫酸钠)、月桂基二甲基氧化胺(lauryl dimethyl amine oxide)、溴化十六烷基三甲铵(cetyltrimethylammonium bromide)(CTAB)、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯山梨聚糖(polyoxyethylene sorbitan)、octoxynol(Triton X100TM),N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物、十六基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide)(HTAB)、聚乙二醇10月桂酯(polyoxyl10 lauryl ether)、Brij 721TM、胆汁盐(脱氧胆酸钠、胆酸钠)、pluronic酸(F-68,F-127)、聚乙二醇蓖麻油(CremophorTM)、壬基苯酚乙氧基化物(nonylphenol ethoxylate)(TergitolTM)、环式糊精和乙基苄索氯铵(ethylbenzethonium chloride)(HyamineTM)。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类(parabens)、chlorobutanol、苯酚、抗坏血酸、thimerosal等实现对微生物作用的预防。在许多情况中，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、聚醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。可通过在组合物中纳入延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)带来延迟的内部组合物的吸收。
无菌溶液可以通过在根据需要具有上文所列一种组分或组分组合的适宜溶剂中掺入所需量的活性化合物，接着过滤除菌来制备。通常，分散体通过将活性化合物掺入含有来自上文所列的基本分散介质和所需其它组分的无菌媒介来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况中，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其自先前无菌过滤的溶液产生活性组分加任何别的期望组分的粉末。
在一个方面，活性化合物与会保护化合物免于从身体内快速消除的载体一起制备，诸如受控释放配制剂，包括植入物和微囊化投递系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯、聚(酸)酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯(polyorthoester)、和聚乳酸。用于制备此类配制剂的方法对于本领域技术人员会是显而易见的。材料也可以商业性获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学可接受载体。这些可以依照本领域技术人员已知的方法来制备，例如如记载于通过提述并入本文的美国专利号4,522,811的。
为了容易施用和剂量的一致性以单位剂量形式配制口服或胃肠外组合物是尤其有利的。如本文中所使用的，剂量单位形式指物理上离散的单元，适合作为要治疗的人受试者的单一剂量；每个单元含有与所需药学载体联合的，预先确定量的活性化合物，其根据计算，产生期望的治疗效果。本公开的剂量单位形式的规格由下述各项规定，并直接依赖于下述各项：活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，及本领域配合此类活性化合物以治疗个体所固有的局限性。
药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包、或分配器中。
本公开的药物组合物涵盖任何药学可接受的盐、酯、或这类酯的盐、或任何其它在对动物(包括人)施用时，能提供(直接或间接)生物学活性代谢物或其残余物的化合物。因此，例如，本公开还涵盖前药(prodrug)和本公开化合物的药学可接受的盐，这类前药的药学可接受的盐，和其他生物等同物。
术语“前药”指以无活性形式制备的治疗剂，其通过内源性酶或其他化学物和/或条件的作用在身体内或其细胞内转化成活性形式(即药物)。
术语“药学可接受的盐”指本公开化合物的生理学和药学可接受的盐：即，保留期望的母体化合物的生物学活性且不对其赋予不想要的毒物学作用的盐。
药学可接受的碱加成盐是与金属或胺，如碱金属和碱土金属或有机胺形成的。用作阳离子的金属包括钠、钾、镁、钙等。胺包括N-N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见例如Berge等,“Pharmaceutical Salts,”J.Pharma Sci.,1977,66,119)。所述酸性化合物的碱加成盐通过使游离酸形式与充足量的期望的碱接触以常规方式产生盐来制备。游离酸形式可通过使盐形式与酸接触并以常规方式分离游离酸来再生。游离酸形式与其相应的盐形式在某些物理特性如极性溶剂中的溶解性中有些差异，但另就本公开目的而言，盐等同于其相应的游离酸。
如本文中使用的，“药学加成盐”包括本公开组合物的组分之一的酸性形式的药学可接受的盐。这些包括胺的有机或无机酸盐。优选的酸盐是盐酸盐、醋酸盐、水杨酸盐、硝酸盐和磷酸盐。其他适宜的药学可接受的盐是本领域技术人员公知的且包括多种无机酸和有机酸的碱性盐，如例如与无机 酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸；与有机羧酸、磺酸、含硫酸或含磷酸(sulfo or phospho acid)或N取代的氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、延胡索酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸(2-acetoxybenzoic acid)、扑酸(embonic acid)、烟碱酸或异烟碱酸；和与氨基酸，如涉及自然界中蛋白质合成的20个alpha氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸，还与苯基乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1,2-二磺酸、苯磺酸、4-甲苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、2-或3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、N-环己基氨基磺酸(形成环磺酸盐(cyclamates))，或与其他酸有机化合物，如抗坏血酸。化合物的药学可接受的盐还可以与药学可接受的阳离子一起制备。适宜的药学可接受的阳离子是本领域技术人员公知的，且包括碱、碱土、铵和季铵阳离子。也可以是碳酸盐或碳酸氢盐。对于寡核苷酸，药学可接受的盐的优选的例子包括但不限于：(I)与阳离子如钠、钾、铵、镁、钙、聚酰胺如精胺和亚精胺等形成的盐；(II)与无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(III)与有机酸如例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐；和(IV)从元素阴离子如氯、溴和碘形成的盐。
本公开的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂、和含脂质体的制剂。这些组合物可从多种组分产生，所述组分包括但不限于，预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体。
本公开的某些组合物还在制剂中纳入载体化合物。如本文中使用的，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，其为惰性的(即本身不拥有生物活性)但被体内过程识别为核酸，该体内过程通过例如降解生物学活性的核酸或促进其从循环除去来降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共施用(通常后一物质过量)可导致在肝、肾或其他另外的循环储库中回收的核酸量的实质性降低，推测是由于载体化合物和核酸之间对共有受体的竞争。例如，当部分硫代磷酸寡核苷酸与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖(dextran sulphate)、聚胞苷酸(polycytidic acid)或4-乙酰胺基-4’异硫氰基-芪-2,2’二磺酸共施用时，其在肝组织中的回收可降低(Miyao等,Antisense Res. Dev.,1995,5,115-121；Takakura等,Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183)。
可将载体或重组病毒(病毒粒体)掺入药物组合物中用于对哺乳动物患者，特别是人施用。载体或病毒粒体可在无毒、惰性、药学可接受的水性载体中配制，优选在范围从3至8的pH，更优选在范围从6至8的pH。这类无菌组合物将包含含有编码治疗分子的核酸的载体或病毒粒体，所述载体或病毒粒体溶解于在重建时具有可接受pH的水性缓冲液中。
在一些方面，本文中提供的药物组合物包含治疗有效量的载体或病毒粒体与药学可接受的载体和/或赋形剂(例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其他蛋白质)混合。例示性的氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸化合物、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露糖醇、葡聚糖、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清清蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏和汉克氏溶液(Ringer's and Hank's solution)、半胱氨酸、精氨酸、肉碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和二醇。优选地，该制剂在4℃稳定达至少6个月。
在一些方面，本文中提供的药物组合物包含缓冲剂，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和其他本领域普通技术人员已知的缓冲剂，如由Good等(1966)Biochemistry 5:467描述的那些。药物组合物在其中包含腺病毒载体投递系统中含有的抗VEGF的缓冲液的pH可以在6.5至7.75,7至7.5，或7.2至7.4的范围内。制剂的pH可以在约3.0至约12.0的范围内。免疫原性组合物的pH可以是至少约3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个pH单位。免疫原性组合物的pH至多可为约3,4,5,6,7,8,9,10,11或12pH个pH单位。
在一些方面，本文中提供的药物组合物包含增加悬浮剂的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖，其量为约1-10个百分比，如1,2,3,4,5,6,7,8,9，或10个百分比。
本公开的某些方面提供包含一种或多种重组病毒和一种或多种其他化疗剂的药物组合物。
这类化疗剂的例子包括但不限于，抗癌药物如道诺霉素(daunorubicin)、 更生霉素(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、氮芥(nitrogen mustard)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(floxuridine)(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MIX)、秋水仙素、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、顺铂和二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)(DES)。一般参见，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,15th Ed.,Berkow等编,1987,Rahway,N.J.,pages 1206-1228)。
还可以将抗炎药物和抗病毒药物组合到本公开的组合物中，所述抗炎药包括但不限于非甾类抗炎药和皮质甾类，所述抗病毒药物包括但不限于ribivirin、阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦(ganciclovir)(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,15th Ed.,Berkow等编,1987,Rahway,N.J.,分别在第2499-2506和第46-49页)。其他非反义化疗剂也在本公开的范围内。可以一起或序贯使用两种或更多种组合的化合物。
在另一个相关方面，本公开的组合物可以含有一种或多种重组病毒，特别是具有不同序列的sFLT-1。可以一起或序贯使用两种或更多种组合的病毒。
在另一个方面，本公开提供包含约1x106至约1x1015个病毒基因组的单位剂量的药物组合物，其中所述病毒包含编码sFLT-1的核酸。
在一些情况中，本公开的单位剂量的药物组合物可以测量为pfu(噬斑形成单位)。在一些情况中，本公开的单位剂量的药物组合物的pfu可以为约1x108至约5x1010pfu。在一些情况中，本公开的单位剂量的药物组合物的pfu至少为约1x108,2x108,3x108,4x108,5x108,6x108,7x108,8x108,9x108,1x109,2x109,3x109,4x109,5x109,6x109,7x109,8x109,9x109,1x1010,2x1010,3x1010,4x1010和5x1010pfu。在一些情况中，本公开的单位剂量的药物组合物的pfu至多为约1x108,2x108,3x108,4x108,5x108,6x108,7x108,8x108,9x108,1x109,2x109,3x109,4x109,5x109,6x109,7x109,8x109,9x109,1x1010,2x1010,3x1010,4x1010和5x1010pfu。
在一些情况中，本公开的病毒载体可测量为载体基因组。在一些情况中，本公开的药物组合物的单位剂量是1x1010至3x1012个载体基因组。在一些情况中，本公开的药物组合物的单位剂量是1x109至3x1013个载体基因组。在一些 情况中，本公开的药物组合物的单位剂量是1x1010至1x1011个载体基因组。在一些情况中，本公开的药物组合物的单位剂量是1x108至3x1014个载体基因组。在一些情况中，本公开的药物组合物的单位剂量至少是约1x101,1x102,1x103,1x104,1x105,1x106,1x107,1x108,1x109,1x1010,1x1011,1x1012,1x1013,1x1014,1x1015,1x1016,1x1017和1x1018个载体基因组。在一些情况中，本公开的药物组合物的单位剂量是1x108至3x1014个载体基因组。在一些情况中，本公开的药物组合物的单位剂量至多是约1x101,1x102,1x103,1x104,1x105,1x106,1x107,1x108,1x109,1x1010,1x1011,1x1012,1x1013,1x1014,1x1015,1x1016,1x1017和1x1018个载体基因组。
在一些情况中，可以使用感染复数(MOI)来测量本公开的药物组合物的单位剂量。在一些情况中，MOI可以指载体或病毒基因组对可投递核酸的细胞的比率或倍数。在一些情况中，MOI可以是1x106。在一些情况中，MOI可以是1x105-1x107。在一些情况中，MOI可以是1x104-1x108。在一些情况中，本公开的重组病毒至少是约1x101,1x102,1x103,1x104,1x105,1x106,1x107,1x108,1x109,1x1010,1x1011,1x1012,1x1013,1x1014,1x1015,1x1016,1x1017和1x1018MOI。在一些情况中，本公开的重组病毒是1x108至3x1014MOI。在一些情况中，本公开的重组病毒至多是约1x101,1x102,1x103,1x104,1x105,1x106,1x107,1x108,1x109,1x1010,1x1011,1x1012,1x1013,1x1014,1x1015,1x1016,1x1017和1x1018MOI。
在一些方面，可不使用病毒来投递核酸(即使用非病毒载体)，且可以测量为核酸的量。一般地，可将任意合适量的核酸与本公开的组合物和方法一起使用。在一些情况中，核酸的量可以是至少约1pg,10pg,100pg,1pg,10pg,100pg,200pg,300pg,400pg,500pg,600pg,700pg,800pg,900pg,1ng,10ng,100ng,200ng,300ng,400ng,500ng,600ng,700ng,800ng,900ng,1μg,10μg,100μg,200μg,300μg,400μg,500μg,600μg,700μg,800μg,900μg,1mg,10mg,100mg,200mg,300mg,400mg,500mg,600mg,700mg,800mg,900mg 1g,2g,3g,4g或5g。在一些情况中，核酸至多可以是约1pg,10pg,100pg,1pg,10pg,100pg,200pg,300pg,400pg,500pg,600pg,700pg,800pg,900pg,1ng,10ng,100ng,200ng,300ng,400ng,500ng,600ng,700ng,800ng,900ng,1μg,10μg,100μg,200μg,300μg,400μg,500μg,600μg,700μg,800μg,900μg,1mg,10mg,100mg,200mg,300mg,400mg,500mg, 600mg,700mg,800mg,900mg,1g,2g,3g,4g或5g。
在一些方面，所述药物组合物包含约1x106至约1x1015个重组病毒、约1x107至约1x1014个重组病毒、约1x108至约1x1013个重组病毒、约1x109至约3x1012个重组病毒、或约1x1010至约3x1012个重组病毒。
试剂盒
本公开可用的组合物和试剂可包装到试剂盒中以易于本公开的应用。在一些方面，所述方法提供包含本公开的重组核酸的试剂盒。在一些方面，所述方法提供包含本公开的重组病毒的试剂盒。使用说明可以以任何期望的形式，包括但不限于，印刷在试剂盒插页上、印刷在一个或多个容器上、以及作为在电子存储介质(如计算机可读存储介质)上提供的电子存储的使用说明。任选地，还包括在计算机可读的存储介质上的软件包，其允许使用者整合信息并计算对照(control)剂量。
在另一方面，本公开提供包含本文中提供的药物组合物的试剂盒。在再一方面，本公开提供用于治疗以下疾病的试剂盒，如例如：AMD、DME、RVO、血管发生相关疾病、癌症、自身免疫性疾病、传染病生物等。
在一个方面，试剂盒包含：(a)本文中提供的重组病毒，和(b)对细胞或个体施用治疗有效量的重组病毒的使用说明。在一些方面，试剂盒可包含用于施用重组病毒的药学可接受的盐或溶液。任选地，试剂盒还可包含用于适宜的操作参数的使用说明，其为标签或分开的插页的形式。例如，试剂盒可具有告知医师或实验室技术员制备一剂重组病毒的标准的使用说明。
任选地，试剂盒还可包含标准或对照信息，从而可将患者样品与对照信息标准比较以确定重组病毒的测试量是否是与例如肿瘤缩小一致的治疗量。任选地，试剂盒还可包含用于施用的装置，如注射器(syringe)、过滤针头、伸缩管、套管和视网膜下注射器(injector)。
可通过任何适宜的手段生成重组病毒。本公开的方法和组合物提供经由多种手段生成重组病毒，包括使用转基因细胞，其可以包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、动物细胞或真菌细胞。
例如，在一些方面，可通过经由重组杆状病毒转染昆虫细胞来生成重组病毒。在一些情况中，重组杆状病毒可作为中间物生成，由此该杆状病毒可含有生成其他病毒如AAV或rAAV2病毒所必需的序列。在一些情况中，可将 一种或多种杆状病毒用于生成重组病毒以用于本公开的组合物和治疗方法。在一些情况中，可以使用昆虫细胞如Sf9、High-Five或Sf21细胞系。在一些情况中，可以使用瞬时方法生成细胞系(即用未稳定整合的转基因转染)。在其他情况中，可以通过生成稳定细胞系来生成细胞系(即用稳定整合到宿主细胞基因组中的转基因转染)。在其他方面，使用贴壁人胚胎肾293(HEK293)细胞来制备本文中提供的药物组合物。在另一方面，使用悬浮适应性的HEK293细胞来制备本文中提供的药物组合物。在另一方面，使用昆虫细胞中的杆状病毒表达系统(BVES)来制备本文中提供的药物组合物。在一些方面，使用疱疹辅助病毒产生载体。在一些方面，使用生产者-克隆方法产生载体。在一些方面，使用Ad-AAV产生载体。
一般地，在用于如本文描述的药物组合物的重组病毒的生物化学纯化中可以使用任何适宜的方法。可从细胞直接收获重组病毒，或从宿主细胞周围的培养基收获。可以使用多种生化手段来纯化病毒，如凝胶过滤、过滤、层析、亲和纯化、梯度超滤、或大小排阻方法。在配制到药物组合物中之前，可以使用任何适宜的手段来测试重组病毒的内容物(即身份)、纯度或效力(即活性)。方法包括但不限于免疫测定、ELISA、SDS-PAGE、western印迹、Northern印迹、Southern印迹或PCR、HUVEC测定等。
V.治疗方法
在另一方面，本公开提供一种用于治疗病理性血管发生相关疾病的方法，包括对需要这类治疗的人受试者施用药学有效量的本文提供的药物组合物。在一些方面，所述疾病选自下组：年龄相关的黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新血管化、脉络膜新血管化、糖尿病视网膜病、增殖性糖尿病视网膜病、视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞、分枝视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病和糖尿病性视网膜水肿。
在一些情况中，可以治疗干性AMD。在一些情况中，干性AMD可称为中央地图状萎缩(central geographic atrophy)，其由视网膜后下方的视网膜色素上皮的萎缩和其后眼中央部分中光感受器的丧失所表征。本公开的组合物和方法提供任意或所有形式的AMD的治疗。
在另一方面，本公开提供一种用于预防性治疗如本文中描述的AMD或 眼部新血管疾病的方法，包括对需要这类治疗的人受试者施用药学有效量的本文提供的药物组合物。本公开可用于治疗有形成AMD的风险，或呈现该疾病的早期症状的患者。这可包括同时或序贯地治疗两眼。同时治疗可指同时对每只眼施用或在对治疗医师或其他医护提供者的同一访问期间治疗两只眼。已记录在患者的呈现AMD症状的眼睛的对侧健康眼睛中，或者在具有倾向形成AMD的遗传素因的患者中有更高的形成AMD的风险。本公开可用作预防对侧眼中的AMD的防护性处理。
尽管在对侧眼中有升高的眼部新血管疾病进展的风险的根本性机制是未知的，但本领域中有多项研究详述了这一升高的风险。例如，在一项此类大规模研究中，在观察到进展成后期AMD的110只对侧眼中，在98只眼中形成脉络膜新血管化(CNV)且在15只眼中形成凹地图状萎缩(foveal geographic atrophy)(GA)。Ophthalmologica.2011；226(3):110-8.doi:10.1159/000329473.Curr Opin Ophthalmol.1998Jun；9(3):38-46。没有非眼部特征(年龄、性别、高血压或吸烟史)或研究眼在基线处的眼部特征(损伤组成、损伤大小或视敏度)能预测在该组中到后期AMD的进展。然而，统计学分析指示第一眼的AMD症状(包括玻璃疣(drusen)大小、病灶性色素沉着过度(focal hyperpigmentation)和非凹性地图状萎缩)在评估对侧眼中形成AMD的风险时具有明显独立关系。最近的研究指示，在眼部特征中，遗传因素和某些环境因素可能在对侧眼中升高的形成AMD的风险中起作用。JAMA Ophthalmol.2013 Apr 1；131(4):448-55.doi:10.1001/jamaophthalmol.2013.2578。鉴于研究较多的在未治疗的对侧眼中有升高的AMD形成风险，本领域中需要预防该疾病开始和随后由其所致的视觉丧失的方法。
如本文中使用的，术语“受试者”或“个体”或“患者”指患有疾病或病症或怀疑患有疾病或病症等的个体。受试者、个体或患者在本公开中可交换使用，且涵盖哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于，哺乳纲的任意成员：人、非人灵长类如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物如牛、马、绵羊、山羊、猪；驯养动物如家兔、犬和猫；实验室动物，包括啮齿类，如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的例子包括但不限于，鸟类、鱼等。在本文中提供的方法和组合物的一些方面，哺乳动物是人。
术语“受试者”或“个体”还包括患有病症或疾病，年龄20岁或更大的人。预料不到地，本公开可用于年龄在一定范围的患者中。这包括与更经常 呈现在超过65岁患者中的AMD疾病一般不相关的更年轻的患者。本公开的人受试者或患者可包括至少约20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100岁。本公开的人受试者或患者可包括至多约20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100岁。
在一些方面，术语“受试者”或“个体”包括对青霉素具有不同反应(如对其作用呈抗性或敏感性)的患者，或显示或缺乏对药物的过敏反应症状的患者。
A.投递方法
在一些方面，使用任何导引方法将药物组合物施用到视网膜下部位。在一些情况中，投递方法可以是通过注射，如记载于美国专利公开号2010008170中的那些，其通过提述完整并入本文。在一些情况中，对视网膜下部位的直接施用包括经由注射器注射液体药物组合物。在另一个例子中，直接施用可能牵涉经由套管或其他适用于投递载体或重组病毒的器具进行注射。在其他例子中，直接施用可包含植入物，其可进一步包含适宜的载体用于投递转基因如sFLT-1。在一些情况中，所述植入物可直接植入到视网膜中或视网膜附近。
中央视网膜、黄斑和视网膜的凹区是哺乳动物到灵长类中所独有的。此外，在灵长类和人之间在AMD的解剖学和随后的发病机制中有截然不同之处。中央视网膜是灵长类眼睛的血管弓(vascular arcade)之间的后极(posterior pole)周围的视网膜区域，其包括凹、黄斑和周围区域。黄斑接近视网膜中央且具有约1.5mm的直径。该区域含有视杆细胞和视锥细胞(rod and cone photoreceptor)两者的最高浓度。在黄斑的中心是凹，一种含有最大浓度的视锥细胞的小凹陷。视网膜的黄斑和凹区还含有在下面的RPE细胞。这些视网膜区域负责感知精细细节(敏度)和色彩。由于该区域负责人视觉的最重要的部分(精细视觉)，因而期望将载体安全且有效地靶向至黄斑和凹的视网膜下间隙处。在一些情况中，将本公开的药物组合物施用到中央视网膜中。在一些情况中，将其施用到凹以外的中央视网膜中。
简言之，可通过以下简要概述例示将载体投递到黄斑和凹的视网膜下间隙的一般方法。该例仅意图例示所述方法的某些特征而不意图以任何方式进行限制。
一般地，所述载体可以悬液的形式使用手术显微镜在直接观察下进行眼内(视网膜下)注射。该规程可涉及玻璃体切除术，接着使用精细套管经由一处或多处视网膜切开将载体悬液注射到视网膜下间隙中。
简言之，可在适宜处缝合输注套管以通过在整个操作中输注(例如盐水)来维持正常的球体积(globe volume)。使用具有适宜孔径(例如20至27号)的套管实施玻璃体切除术，其中切除的玻璃体凝胶的体积被输注的盐水或来自输注套管的其他等渗溶液代替。实施该玻璃体切除术有利，因为(1)切除其皮质(玻璃体后界透明膜)促进套管对视网膜的穿透；(2)其切除和用流体(例如盐水)替换创建了容纳眼内注射载体的空间，和(3)其受控切除降低了视网膜泪和计划外的视网膜脱离的可能性。
在一些方面，通过利用具有适宜孔径(例如27-45号)的套管将载体直接注射到中央视网膜内的视网膜下间隙中，如此创建视网膜下间隙中的泡。在其他方面，在视网膜下注射载体悬液之前，将小体积(例如约0.1至约0.5ml)的适宜流体(如盐水或林格氏溶液)视网膜下注射到中央视网膜中的视网膜下间隙内。这一到视网膜下间隙中的初始注射建立了视网膜下间隙内的初始流体泡，从而导致在初始泡位置处定位的视网膜脱离。这一初始流体泡可促进载体悬液到视网膜下间隙的靶向性投递(通过在载体投递之前限定注射平面)，并使可能的到脉络膜中的载体施用和载体注射或回流到玻璃体腔中的可能性最小化。在一些方面，可使用包含一种或多种载体悬液和/或一种或多种另外的治疗剂的流体进一步注射该初始流体泡，其通过用相同或另外的精细孔套管(fine bore cannula)将这些流体直接施用到初始流体泡。
可使用附接于注射器的精细孔套管(例如27-45号)进行载体悬液和/或初始小体积流体的眼内施用。在一些方面，该注射器的塞可由机械化装置驱动，如通过踩压脚踏板。精细孔套管经由巩膜切开前进，穿过玻璃体腔并进入视网膜中根据要靶向的视网膜区域在每个受试者中预确定的部位(中央视网膜中)。在一个方面，施用对凹以外的部位实施。在直接可视情况下，将载体悬液机械地注射到感觉神经的视网膜下，从而导致使用自密封的非扩展性视网膜切开术(self-sealing non-expanding retinotomy)进行的局部化的视网膜脱离。如上文记载的，载体可直接注射到视网膜下间隙中，从而创建中央视网膜内的泡，或者载体可注射到中央视网膜内的初始泡中，从而导致其扩大(并扩展视网膜脱离区域)。在一些方面，载体悬液的注射之后是另一种流体到 泡中的注射。
不希望受理论束缚地，视网膜下注射的速率和定位可导致局部化的剪切力，其可损失黄斑、凹和/或下面的RPE细胞。视网膜下注射可以使得剪切力最小或避免剪切力的速率进行。在一些方面，在约15-17分钟内注射载体。在一些方面，在约17-20分钟内注射载体。在一些方面，在约20-22分钟内注射载体。在一些方面，在约1分钟内或在约1-3分钟内或在不到1分钟内注射载体。在一些方面，以约35至约65μl/min或65μl/min至约150μl/min的速率注射载体。在一些方面，以约35μl/min的速率注射载体。在一些方面，以约40μl/min的速率注射载体。在一些方面，以约45μl/min的速率注射载体。在一些方面，以约50μl/ml的速率注射载体。在一些方面，以约55μl/min的速率注射载体。在一些方面，以约60μl/ml的速率注射载体。在一些方面，以约65μl/min的速率注射载体。在一些方面，以约100μl/min的速率注射载体。本领域普通技术人员将认可对泡注射的速率和时间可由以下指导，例如，创建充分的视网膜脱离以达到中央视网膜细胞所需的载体体积或泡大小，用于投递载体的套管的尺寸，和安全维持本公开套管位置的能力。
可创建一个或多个(例如2、3或更多个)泡。一般地，通过本公开方法和系统创建的泡的总体积不能超过眼的流体体积，例如在典型的人受试者中为约4ml。每单个泡的总体积优选为约0.1–0.2ml。本领域普通技术人员将领会在依照本公开的方法和系统创建泡时，必须维持适宜的眼内压以避免对眼结构的损伤。每单个泡的大小可以是例如，约50μl至约100μl，约50μl至约200μl，约0.1至约0.2ml，约0.1至约0.3ml，或>0.3ml。
为了安全和有效地将靶视网膜区域(例如中央视网膜)转换到泡的最初位置的边缘外，在一些情况中可能期望操纵泡以将泡重定位到用于转导的靶区域。泡的操纵可通过由泡体积、对含有泡的眼的重定位、对具有含一个或多个泡的眼的人的头部的重定位、和/或通过流体-空气交换所创建的泡的依赖性进行。这与中央视网膜尤其相关，因为该区域一般抵抗通过视网膜下注射的脱离。
在一些方面，在视网膜下注射后利用流体-空气交换；激昂来自输注套管的流体暂时用空气，例如来自到视网膜表面上的鼓吹空气替换。由于空气体积将盐水液体从玻璃体腔置换出去，将泡保持安置在位而没有进入玻璃体腔的流出。通过适当地安置眼球，在一些情况中可将视网膜下载体的泡操作 为牵涉临近区域(例如黄斑和/或凹)。在一些情况中，泡的质量足以导致其即使没有流体-空气交换也会移动。泡的运动可进一步由改变人受试者的头部的位置而促进，从而允许泡移向眼中的期望位置。一旦实现泡的期望配置，就将流体返回玻璃体腔。所述流体是适宜的流体例如新鲜盐水。一般地，可将视网膜下载体留在原位而没有到视网膜切开的视网膜粘结(retinopexy)且没有眼内填塞，而且视网膜将在约48小时内自发在附接。
已在罕见遗传病Leber先天性黑朦("LCA")的治疗中显示了AAV-2的视网膜下施用来治疗眼疾病。LCA的病理学和LCA患者群体不同于湿性AMD的，因此在rAAV.sFLT临床研究之前不预期使用基因疗法对湿性AMD的治疗(尤其是用AAV-2)会是安全且有效的。具体地，LCA是一种变性遗传疾病，其由视网膜蛋白RPE-65的不充分表达所导致。该病导致婴儿和幼儿中视觉的退化，这引起到青年成年期时(一般在25-30岁之前)的完全目盲。相比之下，如本文中先前描述的，湿性AMD由生命后期中视网膜的新血管的生长所致，一般开始于65–75岁。新血管的存在提高了对以下的关注，即AAV颗粒(转基因或转基因产物)将以比LCA研究中显示的更多的量运输到眼外。另外，在实施例12中披露的研究结果之前，免疫系统和对外来物质的免疫应答随着患者年龄增加而变化带来了对使用病毒载体如rAAV.sFLT-1治疗湿性AMD将安全且有效的不确定性。
B.治疗效果
在一些方面，将本公开的药物组合物单次注射到患病的眼中不仅具有 治疗的益处，而且仅需要单次注射。
本公开的药物组合物可停止现有血管中的渗漏且能抑制患有继发于AMD的CNV的患者的视网膜下间隙中的新血管化达至少18个月，而且在一些方面，活性持续3-5年。对渗漏和新血管化的抑制阻止了患病患者中目盲的形成。
在一些方面，所述人受试者的玻璃体中的sFLT-1蛋白水平为约500–5,000pg/ml,约600–4,000pg/ml,约800–3,000pg/ml约900–2,000pg/ml，或约1,000–1,800pg/ml,500–700pg/ml,700–1,000pg/ml,1,000–1200pg/ml,1200–1,500pg/ml,1,800–2000pg/ml。在一些情况中，所述人受试者的玻璃体中的蛋白质水平至少为约100,200,300,400,500,600,700.800,900, 1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2100,2200,2300或2400pg/ml。在一些情况中，所述人受试者的玻璃体中的蛋白质水平至多为约100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000,2100,2200,2300或2400pg/ml。
在一些情况中，蛋白质“水平”可指蛋白质的任意量或相对量。在一些情况中，水平可测量为浓度(例如pM,nM,uM等)、重量摩尔浓度(例如m)、质量(例如pg,ug,ng等)或任何适宜的量度。在一些情况中，无单位的测量可指示水平。
在一些情况中，可在施用所述药物组合物后至少约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.70.8,0.9,1.0,2,3,4,5,6,7,14,21或30,50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300,325,350或365天测量蛋白质水平。在一些情况中，可在施用所述药物组合物后至多约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.70.8,0.9,1.0,2,3,4,5,6,7,14,21或30,50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300,325,350或365天测量蛋白质水平。在一些情况中，在施用所述药物组合物后至少72小时测量蛋白质水平。
本公开的药物组合物的施用一般不产生副作用或不良事件。
在一些方面，在施用所述药物组合物后7,14,21或30天时在人受试者的泪、血液、唾液或尿样品中未检测到载体。在一些方面，通过如本领域中已知的qPCR或ELISA检测病毒载体的存在。
在一些情况中，在施用所述药物组合物后至少约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.70.8,0.9,1.0,2,3,4,5,6,7,14,21或30,50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300,325,350或365天时在人受试者的泪、血液、唾液或尿样品中未检测到载体。在一些情况中，在施用所述药物组合物后至多约0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.70.8,0.9,1.0,2,3,4,5,6,7,14,21或30,50,75,100,125,150,175,200,225,250,275,300,325,350或365天时在人受试者的泪、血液、唾液或尿样品中未检测到载体。在一些情况中，在施用所述药物组合物后至少72小时时在人受试者的泪、血液、唾液或尿样品中未检测到载体。
在一些方面，人受试者显示无临床显著的视网膜毒性，如通过在至少约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月的时段内的连续眼科检查评估的。在一些方面，人受试者显示无临床显著的视网膜毒性，如通过在至多约2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12个月的时段内的连续眼科检查评估的。
在一些方面，所述人受试者中在至少2个月的时段内不存在浅表性的前段或玻璃体炎性病征。在一些情况中，所述人受试者中在施用药物组合物后1周或3,6,9或12个月时不存在浅表性的前段或玻璃体炎性病征。
在一些方面，在施用步骤后没有看到炎性病症，包括在正常范围约10％以内的细胞毒性T细胞应答。在一些方面，没有T细胞应答中的增加，如通过ELISpot测量的。在一些方面，T细胞不表达HLA-DR或Ki67，且不形成激活的效应器表型，如记载于Lai等2011；Gene Therapy的，其通过提述完整并入本文。在一些方面，在施用步骤后通过生物显微术(BE)和间接检眼镜检查(opthalmoscopy)(IOE)未观察到玻璃体的炎症。在一些方面，在施用步骤后通过生物显微术(BE)和间接检眼镜检查(IOE)观察到玻璃体的微量炎症，其在10天内消退。在一些方面，人受试者在施用后至少120天内不需要援救治疗。在一些方面，人受试者在施用后至少30天，至少60天，至少90天，至少120天至少180天，至少270天或至少365天内不需要援救治疗。
如本文中使用的，援救治疗指在本公开中描述的药物组合物的初始施用后施用VEGF抑制剂的剂量。施用援救治疗以加强眼患者中VEGF抑制的量，从而停滞或逆转疾病进展的病征和症状。决定施用援救治疗可以是基于预确定的诊断标准，如实施例12中描述的临床研究中的，或者是基于医师的临床判断，即患者中存在活性疾病的迹象。
在一些方面，在施用后至少120天所述人受试者中没有视敏度丧失、IOP升高、视网膜脱离、或任何眼内或系统性免疫应答的证据。在一些方面，在施用后至少30天、至少60天、至少90天、至少120天、至少180天、至少270天或至少365天所述人受试者中没有视敏度丧失、IOP升高、视网膜脱离、或任何眼内或系统性免疫应答的迹象。在一些方面，在施用后至多30天、至少60天、至少90天、至少120天、至少180天、至少270天或至少365天所述人受试者中没有视敏度丧失、IOP升高、视网膜脱离、或任何眼内或系统性免疫应答的迹象。
在一些方面，患者的最佳矫正视敏度(BCVA)改善了1,23,4,5或更多行。 
在一些方面，在施用步骤后通过荧光素血管造影术(FA)评估有新血管化中的降低。
在一些情况中，可测量视网膜厚度来检查治疗效果。在一些情况中，在施用本公开的药物组合物后12个月内人受试者的中央视网膜厚度增加不超 过50微米、100微米，或250微米。在一些情况中，在施用本公开的药物组合物后3个月、6个月或9个月、12个月内人受试者的中央视网膜厚度降低至少50微米、100微米、200微米、250微米、300微米、400微米、500微米、600微米。可以测量人受试者的中央视网膜厚度的降低，其比较各时间点的中央视网膜厚度与施用本公开的药物组合物1、3、7或10天时或1、3、7或10天内所取的基线测量。
C.使用VEGF抑制剂的组合治疗
在一些方面，所述方法还包括对人受试者施用药学有效量的VEGF抑制剂。
在一些方面，所述VEGF抑制剂包含针对VEGF的抗体或其功能片段。在一些方面，所述VEGF抑制剂包含兰尼单抗。在其他方面，所述VEGF抑制剂是可溶性受体、融合蛋白、或其片段，如阿柏西普或sFLT01。在一些方面，在施用所述VEGF抑制剂后至少1,2,3,4,5,6,7，或8天施用所述药物组合物。在一些方面，在施用所述VEGF抑制剂后至多1,2,3,4,5,6,7，或8天施用所述药物组合物。在一些方面，在施用所述VEGF抑制剂后90天内施用所述药物组合物。
在一些方面，依照如图13中所概述的方案来治疗患者。在重组病毒以适宜水平表达蛋白质后，患者遵循基于标准的再治疗：
a.如果疾病复发，则允许兰尼单抗再治疗
b.预期对照组每年有5-8次再治疗
c.在治疗组中，预期等同的视觉，而且再治疗数中有实质性降低。
如果存在活性CNV的迹象，则患者有再治疗的资格：
a.基于客观标准，如由未显示的人员(技师和眼科医师)评估的
b.再治疗标准基于在使用抗VEGF剂的先前试验中对于“需要”(PRN)治疗的大量经验。
基于活性疾病的迹象批准再治疗；所述迹象如：
a.与人受试者的前一次访问相比>10个早期治疗糖尿病视网膜病变研究(ETDRS)字符减少(可归因于视网膜原因)，或者与前一次访问相比>5个ETDRS字符减少连同患者感知功能丧失；
b.OCT上的任何增加的、新的、或持续的神经下(subsensory)、视网膜 色素上皮下(RPE)或视网膜内流体；
c.通过FA的增加的CNV渗漏的迹象。 
在一些方面，在施用所述药物组合物之前已施用过VEGF抑制剂至少一次，且在所述施用后以约30天时间间隔又施用1或2次以预防疾病进展，而蛋白质表达增加至适宜的水平。在一些方面，在施用所述药物组合物之前已施用VEGF抑制剂至少2次。在一些方面，在所述药物组合物的施用后6至7周的时段内施用VEGF抑制剂。
在一些方面，将VEGF抑制剂的施用频率降低了低于1年或完全停止。
在一些方面，在3次或更多次VEGF抑制剂治疗后使用本公开。在一些方面，在观察到AMD患者使用其他VEGF抑制剂后没有显示BCVA中的改善后使用本公开。
D.其他组合治疗
在另一个优选的方面，对患者的治疗包括施用本文中提供的一种或多种药物组合物，连同其他疗法例如化疗、放射、手术、抗炎剂、选择的维生素等。其他药剂可在药物组合物的之前或之后施用或与其共施用。
可实践本公开的方面而无需呈现理论方面。而且，在理解申请人不寻求受所呈现理论束缚的情况下呈现理论方面。
尽管已显示并在本文中描述了本公开的优选方面，但对本领域技术人员显而易见的是，这类方面的提供仅通过举例。本领域技术人员将可以想到进行大量变化、改变和取代，而不背离本公开。应理解在实践本公开时可对本文描述的公开内容的各方面采用多种备选方案。意图以所附权利要求限定本公开的范围且由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
核酸的有效剂量将是具体表达的蛋白质、具体要靶向的疾病、患者及其临床状况、重量、年龄、性别等的函数。
实施例
本领域技术人员将理解可进行大量和多种修改以得到基本类似的结果，而不背离本公开的精神。本文中引用的所有参考文献通过提述完整并入本文用于所论述的主题。囊括以下实施例以仅用于例示性目的且不意图限制本公开的范围。
当未说明时，以下实施例的百分数均应当解释为重量百分数含量wt％。
实施例1
rAAV.sFlt-1
一个重组病毒的例子是rAAV.sFlt-1。它编码载体和截短的可溶性VEGF受体1(sFLT-1)的人形式。载体是重组的、复制缺陷性、血清型2的腺伴随病毒(rAAV)载体。
依照优良制造实践(Good Manufacturing Practices(cGMP))制备rAAV.sFlt-1。在制备点，根据方案要求((即200μl的1X1010或1X1011个病毒基因组)将最终产物等分到无菌的、低病毒结合微离心管中(分别包装的低截留、无菌化的平盖管形瓶)，并保藏在-80C以等待最终产品释放。每个管形瓶含有足以用于单个患者的载体(待施用的100μl)。
重组病毒rAAV.sFlt-1是重组的腺伴随病毒2(rAAV2)载体，其携带受人巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的可溶性VEGFR受体1(VEGFR1)或sFLT-1。如Lai等.Gene Therapy 2002 vol.9(12)804-813)中描述的，制备rAAV.sFlt-1载体和用作骨架的完整的AAV2基因组。rAAV2载体没有病毒编码序列，即rep和cap已被治疗基因的表达盒替换。rAAV.sFlt-1的活性模块是sFlt-1。sFLT-1是天然存在的血管内皮生长因子受体1(VEGFR1或Flt-1)的可溶性截短形式。sFLT-1是唯一已知的VEGF的内源性特异性抑制剂。sFLT-1通过可变剪接产生且其缺少近膜免疫球蛋白样域、跨膜跨越区和细胞内酪氨酸激酶域。因此，它仅含有头6个胞外免疫球蛋白氧环，接着是31个独特的氨基酸残基。sFLT-1首先在人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)中鉴定，但此后发现它天然存在于胎盘中，且在妊娠女性中系统性循环。用于生成rAAV.sFlt-1的sFLT-1含有仅编码全长跨膜FLT-1的头6个胞外免疫球蛋白样域的开放阅读框，接着是独特的31个氨基酸长的C端延伸，代表可变剪接的、分泌的可溶性FLT-1同等型(前文描述过)。
尽管已显示ITR拥有轻度启动子活性，但为了转基因的最大水平的表达，盒通常包含启动子/增强子组合、小内含子序列、治疗基因的cDNA和聚腺苷酸信号。在rAAV.sFlt-1中，将人CMV主要立即早期基因增强子/启动子和嵌合内含子置于sFLT-1 cDNA上游。将猿病毒40聚腺苷酸化(SV40聚A)信号置于sFLT-1 cDNA下游。
已广泛展示了sFLT-1对VEGF的体外结合。sFLT-1抑制VEGF驱动的血管 发生的能力已吸引了对其潜在的临床应用的大量关注，但在实施例12中描述的rAAV.sFlt-1的临床研究之前没有显示在人中的功效或适用性证据。sFLT-1的血管生成抑制性活性来自通过两种机制对VEGF的抑制：i)扣留其以高亲和力结合的VEGF，和ii)与VEGF受体Flt-1和KDR/Flk-1的跨膜同等型形成无活性异二聚体。
用于生成rAAV.sFlt-1的核苷酸序列和质粒载体图
通过用来自pSSV.CI.hsFlt-1质粒载体和辅助质粒的DNA 3重转染人胚胎肾293细胞来生成rAAV.sFlt-1，如本领域已知的(Xiao等,1998.J Virololgy,72(3):2224-2232)。使用核分离、密度梯度离心和硫酸肝素亲和柱层析的连续过程来纯化rAAV.sFlt-1。sFLT-1质粒载体的图标呈现在图1中给出。
制剂
将rAAV.sFlt-1以2种浓度在无菌、低病毒结合微离心管中配制于无菌磷酸盐缓冲盐水(pH7)：1X 1010载体基因组/100L(低剂量)和1X 1011载体基因组/100L(高剂量)。该制剂是无防腐剂的且仅用于一次冻融、通过视网膜下注射的单次使用。
rAAV(bv).sFlt-1
第二个重组病毒的例子是rAAV(bv).sFlt-1。rAAV(bv).sFlt-1是一种重组的、复制缺陷性、血清型2的腺伴随病毒(rAAV)载体，其使用杆状病毒表达系统(BEVS)在Sf9昆虫细胞中产生，且编码截短的可溶性VEGF受体1(sFLT-1)的人形式。利用用两种重组杆状病毒Bac-inRep-inCap和Bac-sFlt-1在Sf9细胞中感染产生该载体。Bac-sFlt-1源自从用8.7kb质粒AVA01-pFB-CMV-sFlt转化电感受态细胞生成的bacmid DNA，其从Frag001m-BHKan和质粒骨架V109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kan克隆，使用如Maniatis等和如下文进一步描述的标准分子生物学技术。Frag001m从以下连续核酸元件形成，所述元件由Blue Heron Biotech,LLC(Bothell,WA)化学合成并克隆到BHKan骨架中：ITR(AAV血清型2、CMV-IE启动子、嵌合内含子、5’非翻译区(UTR)、sFlt-1编码序列、SV40聚A区、ITR(AAV血清型2)。质粒V109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kan从Virovek,Inc.(Hayward,CA)获得。该质 粒含有卡那霉素抗生素抗性基因、ColE1起点和重组AAV盒，该盒含有CMV-IE启动子、内含子、多克隆序列和SV40聚A区，侧翼是来自AAV血清型2的反向末端重复(ITR)。该rAAV盒侧翼是艮他霉素抗性基因和Tn7L附接位点。AVA01-pFB-CMV-sFlt不含T7RNA聚合酶启动子或其他原核调控序列。Bac-inRep-inCap是含有rep和cap基因的表达盒的来自AAV血清型2的重组杆状病毒。
杆状病毒中的rAAV(bv).sFlt-1产生
依照美国专利申请12/297,958中描述的方法，更具体地如下所述在杆状病毒中产生rAAV(bv).sFlt-1：将Sf9细胞在28℃在含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的SF900II SFM培养基中生长至约107细胞/ml，并在感染前稀释至约5×106细胞/ml。使用各为一m.o.i.的Bac-inRep-inCap和Bac-sFlt-1感染细胞在28℃达3天以产生AAV 2型载体。在感染3天后，通过在桌面离心机中于2,000rpm离心15min收集细胞团粒。如Urabe等,Hum Gene Ther.1；13(16):1935-43(2002)描述的在裂解缓冲液中裂解细胞团粒，并通过benzonase(Sigma,St.Louis,Mo.)消化细胞核酸(DNA和RNA)。通过在AvantiJ-25离心机(Beckman,Fullerton,Calif.)中于8,000rpm离心30min，然后加载到含有5ml 1.55g/cc和10ml 1.32g/cc的CsCl溶液的SW28离心管上来清理细胞裂解物。在15℃以28,000rpm离心约16小时后，收集含有rAAV的级分，其通过使用注射器针头穿刺离心管并进行第二轮CsCl超速离心。再次收集含有rAAV的级分，其通过使用注射器针头穿刺离心管并在PBS缓冲液中透析以除去盐和去污剂。通过定量实时PCR测定法依照制造商方案(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)测定载体效价。
实施例2
对VEGF诱导的内皮细胞增殖的体外抑制
进行研究以评估人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的VEGF诱导和确定VEGF诱导的HUVEC增殖是否会受rAAV介导的sFLT-1抑制。sFLT-1在经转导细胞中的存在首先由对条件培养基的Western印迹分析确认(图2，a幅)。将来自经rAAV.sFlt-1转导和经rAAV.gfp转导的293细胞的条件培养基以增加的稀释添加到用VEGF处理的HUVEC中。还包括仅对照饥饿培养基(正常HUVEC 生长培养基，无牛内皮生长因子)。以100μg/mL向每个孔添加肝素。测定对用VEGF和不同条件培养基处理的HUVECS的相对VEGF诱导增殖，其通过在37℃向每个孔添加25μL的3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT,5mg/mL,Sigma)达4小时。确认来自经rAAV.sFlt-1转导的293细胞的40μL条件培养基中由rAAV载体编码的分泌sFLT-1抑制VEGF诱导的HUVECS增殖达32％。条件培养基的体积加倍导致完全抑制，其细胞生长等同于类似于在饥饿培养基中培养的基底水平(图2，b幅)。
对rAAV.sFt-1载体效力的体外评估
进行研究以评估编码重组人基因的AAV载体的效力，其通过由ELISA量化经转导人胚胎肾293(HEK293)细胞的人sFlt-1蛋白表达。人胚胎肾293细胞获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Rockville,MD,USA)，并在具有10％胎牛血清(FBS,GIBCO)和1X青霉素-链霉素-谷氨酰胺的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM；Gibco,Grand Island,NY,USA)中培养。将所有培养物在37℃和5％CO2维持在湿润气氛中。、
将HEK293细胞以8E4或1.5E5细胞/24孔接种并在60-90％汇合用感染复数(MOI)范围为1x103-1x106的重组AAV载体在补充有2％FBS的DMEM培养基中转导。在72小时后，收集转导后的条件培养基。制备条件培养基的等分试样用于ELISA，其依照来自R&D Systems SVR100B Quantikine ELISA Human sVEGF R1/sFlt-1试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)的标准说明书使用试剂。依照ELISA试剂盒说明书使用R&D Systems ELISA试剂配制样品、标准和对照，然后转移至用针对sVEGF R1/sFlt-1的抗体预包被的ELISA板并在室温在水平轨道微板振荡器上温育2小时。温育后，依照标准ELISA测定规程将抗sVEGF R1缀合物(2小时)、底物溶液(30分钟)和终止溶液连续施加到每个孔中，每一施加之间伴随着抽吸和清洗步骤。在终止底物反应的30分钟内使用ELISA板读数器测量样品、标准和对照的光密度(OD)。使用SoftmaxPro软件利用来自ELISA板读数器的OD测量来计算按pg/mL计的sFlt-1浓度。
对于rAAV.sFlt-1和rAAV(bv).sFlt-1的研究结果呈现在图25A和图25B中。在用rAAV.sFlt-1和rAAV(bv).sFlt-1转导后72小时由HEK293细胞表达的sFlt-1 蛋白浓度范围为在1x104的MOI为100-1,000pg/mL，在1x105的MOI为100-10,000pg/mL和在1x106的MOI为1,000-10,000pg/mL。
实施例3
小鼠中的rAAV.sFlt-1研究
将具有由来自感光细胞的人VEGF的转基因表达所诱导的缓慢但稳定的视网膜新血管化的转基因小鼠(trVEGF029)用作视网膜新血管化的模型。已进行了对这些小鼠的两项分别的研究。
在第一项小鼠研究中，评估13只转基因小鼠在一只眼中施用rAAV.sFlt-1载体(1X1011载体颗粒)和在对侧眼中施用对照载体之前和之后的眼新血管变化。使用荧光素血管造影术在注射后1、3和8个月时评估眼的新血管变化。由3位观察者(对检查的眼所接受的治疗隐藏)对新血管化的程度、强度和阶段评级(0-4)。在从‘3’的中值级(注射前)到注射后1个月时‘1’的中值级中有新血管评级中的统计学显著的总体降低(P＝0.012)。该降低在用rAAV.sFlt-1注射后3个月(中值＝1；P＝0.001)和8个月(中值＝1；P＝0.001)时维持。rAAV.sFlt-1载体的注射导致在85％(13个中有11个)的治疗眼中的新血管的长期(至少8个月)退化，相比之下在用对照载体处理的眼中为8％(13个中有1个)。
在该临床前研究中对眼的组织学检查揭示，在注射对照载体的眼中光感受器的紊乱或丧失比用rAAV.sFlt-1注射的眼显著(P<0.01)更为突出。sFLT-1的表达也通过对组织样品的逆转录酶-聚合酶链式反应分析确认；在测试的所有4只眼中均检测到sFLT-1的mRNA。相比于用对照(rAAV.gfp)载体注射的眼，在用rAAV.sFlt-1注射的眼中未记录有rAAV.sFlt-1载体特异性的不良作用。
在第二项研究中(在trVEGF02转基因小鼠中进行)，研究的目的是确定rAAV.sFlt-1的视网膜下注射是否导致任何细胞介导的免疫应答，其能不利地影响sFLT-1的长期表达或导致对视网膜的免疫应答相关的损伤。在该研究中，对50只trVEGF02转基因小鼠在一只眼中给予rAAV.sFlt-1(8X 109病毒颗粒)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)的视网膜下注射。然后，在注射后一周和一个月时对来自rAAV.sFlt-1或对照处理组的30只小鼠的视网膜评估免疫细胞(白细胞、巨噬细胞及B和T淋巴细胞)的存在。对后端眼杯(posterior eye cup)的流式细胞术检查显示，在注射后一周时，CD45+白细胞(相比于对照增加6.6 倍；P<0.05)和CD11b+巨噬细胞(相比于对照增加5.7倍；P<0.036)中有统计学显著的增加。然而，在该时间点在CD19+,CD8+和CD4+(B-和T淋巴细胞)中没有差异。在注射后一个月时，在用rAAV.sFlt-1或PBS对照处理的鼠眼中的白细胞子集(即CD45+,CD19+,CD11b+,CD8+或CD4+细胞)之间的细胞数目中没有差异，表明白细胞和巨噬细胞的渗入是暂时的。对在一周和一个月时间点时来自这些小鼠的脾的淋巴细胞子集的流式细胞术评估显示，在淋巴细胞数目中没有显著差异。该发现表明尽管在视网膜中显示短暂的局部化的免疫应答，但未观察到系统性的免疫应答。
在这第二项研究中，对来自用rAAV.sFlt-1或PBS注射的5只小鼠的眼的组织学检查揭示，在任意检查的小鼠的视网膜中没有可观察到的免疫应答相关的破坏或后遗症。
为了评估rAAV.sFlt-1对视网膜新血管化的这一转基因小鼠模型(trVEGF02)中的新血管化水平的影响，在治疗后2个月时还由两位不同的评估者独立地对用rAAV.sFlt-1或PBS注射的小鼠的视网膜评级。总体上，在用rAAV.sFlt-1注射的眼中均值新血管化评级有显著降低(注射前：1.46±0.58；注射后：0.81±0.57；P<0.00015)，而在用PBS对照注射的眼中均值新血管化评级有显著升高(注射前：1.08±0.56；注射后：1.63±0.96；P<0.018)。
来自这第二项小鼠研究的发现清楚地指示，用rAAV.sFlt-1治疗似乎逆转了在视网膜新血管化和AMD的这一小鼠模型中观察到的新血管化的进展性增加。此外，在用rAAV.sFlt-1视网膜下注射后一周时仅观察到有限的、局部化的炎性反应，并且在一个月时消退。该免疫应答似乎不损害rAAV.sFlt-1在视网膜中的长期治疗功效。
实施例3中描述的转基因小鼠模型显示，本文中公开的药物组合物能用于治疗和/或预防其中牵连VEGF抑制的其他视网膜血管疾病。这些包括糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、糖尿病性视网膜水肿、增殖性糖尿病视网膜病、视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞和分枝视网膜静脉阻塞。在临床研究中已显示一些VEGF抑制剂如Lucentis有效地治疗其中一些疾病，包括糖尿病性黄斑水肿和视网膜静脉阻塞。在这些小鼠模型中展现的rAAV.sFlt-1的功效指示rAAV.sFlt-1在治疗这些VEGF介导的疾病中也是有效的。
实施例4
在大鼠中的rAAV.sFlt-1研究
在大鼠rAAV.sFlt-1研究中，使用两个眼部新血管化模型：烧灼(cautery)诱导的诱导的角膜新血管化和激光光凝固诱导的脉络膜新血管化(CNV)。在角膜新血管化模型中，将22只大鼠在一只眼的前房中用rAAV.sFlt-1载体(8X108病毒颗粒)而在对侧眼中用对照载体(rAAV.gfp)注射，接着烧灼角膜。然后在烧灼后4天时使用缝灯照相术(slit-lamp photography)检查眼的新血管化。相比于对照处理的眼，在用rAAV.sFlt-1处理的眼中发现显著更低的角膜血管化比率(分别为27％和63％；P＝0.009)。对眼的组织学检查显示在多数烧灼的用rAAV.sFlt-1处理的眼中没有观察到角膜血管。组织学检查还揭示角膜基质层的细胞浸润在用对照载体注射的眼中比用rAAV.sFlt-1处理的眼更突出。另外，在用对照载体注射的眼中有明显的水肿和角膜基质肿胀(swelling)，而在用rAAV.sFlt-1处理的眼中没有显著的组织肿胀的迹象。
在激光光凝固诱导的CNV模型中，将10只大鼠在一只眼中用rAAV.sFlt-1载体(8X 108病毒颗粒)而在对侧眼中用对照载体(rAAV.gfp)视网膜下注射。在注射后1个月时使用激光光凝固来诱导CNV。在激光光凝固后5周，使用荧光素血管造影术检查眼的CNV。在用rAAV.sFlt-1处理的眼中仅41％的激光处理区域显示渗漏，相比之下在用对照载体处理的眼中为60％(P＝0.002)。在激光诱导的CNV后16周时，用rAAV.sFlt-1处理的眼仍显示比对照眼显著更低的新血管化。对眼中直接临近于注射部位的区域的组织学检查揭示正常的视网膜色素化上皮和正常的外部区段(outer segment)和外部核层。这些发现表明没有与sFLT-1表达相关的明显毒性。视网膜电位图还指示用rAAV.sFlt-1处理的眼的正常机能。大多数用rAAV.sFlt-1和对照载体处理的激光损伤形成视网膜下细胞膜。然而，用rAAV.sFlt-1处理的眼中的损伤一般具有更少的增殖性内皮细胞，从而反映了荧光素血管造影术发现，且指示在用rAAV.sFlt-1处理的眼中血管发生(即新血管化)率降低。
在糖尿病大鼠模型中的rAAV.sFlt-1和rAAV(bv).sFlt-1研究
为了进一步评估rAAV.sFlt-1和rAAV(bv).sFlt-1对于治疗糖尿病视网膜病(DR)和糖尿病黄斑水肿(DME)的安全性和功效，进行了一项在大鼠糖尿病模型中的实验。
糖尿病患者中的视觉丧失有炎症介导，导致血-视网膜屏障的最终崩溃和随后的血管渗漏，从而引起黄斑水肿。链脲霉素(streptozotocin)(STZ)-糖尿病大鼠模型显示表征较多的血管渗漏模式，其中VEGF在早达2周时就强烈上调。(Miyamoto,K.等Proc Natl Acad Sci USA 96,10836-10841(1999)。目前治疗DR的动物模型的办法仅展现血管渗漏的部分消退。
通过腹膜内注射链脲霉素(50mg/kg)在Brown Norway大鼠中诱导糖尿病。确认糖尿病并通过血糖测量来监测。具有>350mg/dl血糖的大鼠被视为患有糖尿病。在糖尿病开始后8天，通过用含有1x1010或5x1010vg的rAAV.sFlt-1或rAAV(bv).sFlt-1的5μL进行视网膜下注射来治疗大鼠(n＝12眼每组)，其使用如Chalberg,T.W.等,Invest Ophthalmol Vis Sci 46,2140-2146(2005)中描述的确立技术。注射AAV2.GFP(5x1010vg)和媒介物作为对照。亦将无糖尿病和糖尿病无治疗组用作对照。
在60天时测量表达sFLT-1的rAAV(bv).sFlt-1对血管渗漏的效果。在使用缀合FITC的清蛋白作为示踪剂注射后通过FITC-清蛋白渗漏方法来测量视网膜血管渗漏。FITC-清蛋白渗漏方法直接测量从循环中渗漏到视网膜中的FITC-清蛋白渗漏，且是测量视网膜血管渗透性的一种常用方法。将注射眼中的视网膜血管渗漏与无糖尿病对照、未处理的和用媒介物处理的糖尿病眼，及野生型AAV血清型2和8比较。
结果：表达sFLT-1的rAAV(bv).sFlt-1降低了STZ-糖尿病大鼠中的血管渗漏，而注射AAV2.GFP和其他对照则不这样。
实施例5
猴中的rAAV.sFlt-1研究
还使用激光光凝固诱导CNV在非人灵长类(猕猴)的AMD模型中检查rAAV.sFlt-1的功效和安全性。在人中开发针对AMD的治疗的一项挑战是非人灵长类不形成AMD。激光光凝固诱导的CNV刺激AMD的一些症状，但根本性的生物过程是修复急性损伤而非慢性疾病进展，如此可能不预测任何针对CNV的特定治疗在患有AMD或其他基于CNV疾病的人中的性能。但是，由于人眼在解剖学上更类似于非人灵长类眼而不是非灵长类眼，因此经常研究非人灵长类来评估对潜在治疗或其他干预的毒性和组织学应答。
在对非人灵长类的第一项研究中，将5只猕猴在一只眼中用rAAV.sFlt-1 (4X1012病毒颗粒)而在对侧眼中用对照载体(rAAV.gfp)视网膜下注射。在视网膜下注射后定期评估猴的眼健康。没有与用对照或rAAVsFlt-1载体的视网膜下注射直接相关的明显并发症。在注射后的一周注意到短暂的结膜刺激(irritation)和玻璃体混浊(vitreous haze)，其在第二周澄清。视网膜下注射在其中一只猴的右眼中未成功；因此该动物未进行进一步评估。
视网膜下注射40-100μL的rAAV悬液提升了视网膜，从而以定位方式在色素上皮和光感受器层之间创建了具有载体的泡。该泡在24至48小时内被自身修正(self-corrected)。除了在针头穿透点对视网膜色素上皮的微小扰动外，对于随访期间(注射后3至17个月)没有观察到其他视网膜异常。没有观察到其他异常或不良事件；在任何时候都没有与手术有关的视网膜脱离。
为了评估rAAVsFlt-1的长期治疗功效，在用载体处理后16个月时4只注射的猴接受强烈激光光凝固。使用激光在每只眼中诱导8处损伤，然后在激光处理后2和4周时监测眼的CNV。在激光光凝固后，4只猴中仅3只是可分析的，因此对3只动物收集功效数据。用rAAVsFlt-1处理的3只猴眼中均没有形成CNV相关的损伤且仅观察到微弱的荧光素染色，指示最少的渗漏/新血管化。所有用对照载体处理的对侧眼均形成CNV相关的损伤。
在目标为评估注射到视网膜下间隙中的rAAV.sFlt-1的安全性和毒性的随访研究中，使用8只猴：5只在其左眼用rAAV.sFlt-1注射，2只在其左眼用rAAV.gfp注射，1只在两眼中均用重组Flt-1蛋白注射，而1只保持为未注射的对照。通过眼底彩色成像(color fundus photography)、荧光素血管造影术和视网膜电位图(electroretinography)在注射前和注射后检查猴。常规收集血液以测定sFLT-l水平，并分离外周血淋巴细胞用于流式细胞术以评估免疫细胞子集应答。在杀死时(注射后3、9和12个月)，收集组织用于i)对rAAV.sFlt-1载体的生物分布研究，其利用在提取的基因组DNA上进行的实时聚合酶链式反应；ii)通过ELISA对hsFlt-1蛋白和AAV2壳体蛋白水平定量；和iii)眼的组织学。
眼底彩色成像、荧光素血管造影术和视网膜电位图未检测到注射后对眼的任何不良作用。血浆sFLT-1水平未显示在任意雄猴或雌猴检查中rAAV.sFlt-1注射相关的水平升高。除了眼神经样品外，在取样的任何其他组织(淋巴结、脾、肝、脑、心、脾、角膜)的基因组DNA中均未检测到rAAV.sFlt-1序列。苏木精和曙红染色的石蜡包埋的眼切片表现为正常。
尽管非人灵长类解剖学比更小的哺乳动物(如小鼠)的解剖学更类似于人解剖学，但确实存在限制，其使得在非人灵长类中进行的研究引人兴趣，却不预测在人中的临床结果。如上文记载的，在本实施例中的研究使用激光损伤模型，其中动物具有别样的健康视网膜组织。该视网膜组织不像患病视网膜组织一样随时间降解，也不存在疾病特异性的致病因素。非人灵长类经常就生物分布、药动学和剂量依赖性、抗体效价、免疫应答和炎性应答而言不同于人且是不可预测的。另外的差异包括ILM(内界膜)和玻璃体房的体积，其在人中比在本研究中使用的非人灵长类中约大4倍。人内界膜(作用于限制视网膜和玻璃体之间的运输的屏障)是一种比猴的ILM更深奥和有效的屏障。
实施例6
安全性研究
在这些研究中，使用用于sFLT-1蛋白检测的酶联免疫吸附测定试剂盒来测量动物的玻璃体和血浆中的sFLT-1蛋白。sFLT-1蛋白水平在用rAAV.sFlt-1注射的动物的玻璃体和眼中上调。图3A显示在用rAAV.sFlt-1注射的猴眼(左眼)和用rAAV.gfp注射的对照眼和未注射眼(右眼)中的玻璃体sFLT-1蛋白水平。sFLT-1蛋白水平在5只用rAAV.sFlt-1注射的眼中的4只中显著更高。表5.3.1显示在未注射和用rAAV.sFlt-1注射并在注射后一个月去核(enucleate)的小鼠眼中的sFLT-1蛋白水平。sFLT-1在小鼠的眼和猴的玻璃体中的过表达对其总体健康没有任何不良影响。在猴中，sFLT-1在玻璃体中的过表达对其视网膜功能不具有任何影响且对眼没有任何临床或组织学明显的毒性影响。在用rAAV.sFlt-1注射的眼中显著更高的sFLT-1蛋白水平表明长期rAAV介导的hsFLT-1表达，并支持关于在注射后17个月猴视网膜中病毒mRNA序列的检测和存在rAAV介导的gfp表达的先前数据。
表1.汇总在注射后1个月时用rAAV.sFlt-1注射的小鼠眼和未注射的小鼠眼中的hsFLT-1蛋白水平。
猴中的血浆hsFLT-1水平在不同的取样时间未显示任何趋势(图3B)。这表明rAAV.sFlt-1注射对于血浆hsFLT-1水平没有明显影响。波动的水平对于猴健康没有任何影响。
表2 免疫原性研究
表2：免疫原性研究中使用的动物株系、rAAV.sFlt-1的注射路径、持续时间和剂量的汇总
实施例7
在小鼠上的免疫原性研究
在注射后1、2和4周后使用流式细胞术在小鼠眼中评估对rAAV.sFlt-1治疗的细胞免疫应答。基于CD45表达鉴定渗入的白细胞并基于CD11b,CD19,CD4和CD8表达分别归类为单核细胞/粒细胞、B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞。从每个组(注射rAAV.sFlt-1、注射PBS、未注射对照)的5只小鼠中收集后端眼杯，并合并用于分析。如图4A中显示的，在本实验过程中从每个小鼠 组回收的细胞数中没有差异。然而，在注射后1和2周时在CD45+细胞数目中有显著增加，其到4周时消失(图4B)。在1周时看到的几乎所有增加均可归因于CD11b+细胞中的增加(图4C)，因为在CD4+、CD8+和CD19+细胞的数目中没有差异(图4D-F)。但在2周时，在用AAV.sFlt-1注射的小鼠的眼中不再存在CD11b+数目中的显著差异；相对地，在CD4+和CD8+T细胞的数目中有显著增加，且有朝向B细胞增加的可能趋势。CD4+和CD8+细胞的数目在4周时急剧下降，但相比于用PBS注射和未注射的小鼠仍保持显著增加。相反，在本实验过程期间在脾中CD11b+、CD4+、CD8+和CD19+细胞的数目没有变化(图5A-E)。
更密切地检查渗入视网膜的T细胞的功能，其通过用PMA/伊屋诺霉素(ionomycin)或抗CD3刺激它们并通过流式细胞术测量胞内IFN-γ产生。图6显示，相比于未注射对照，在注射rAAV.sFlt-1后一小部分的CD4+和CD8+T细胞两者被引发以产生IFN-γ。IFN-γ产生细胞的频率在本实验过程中未显著变化，尽管在第3天CD8+T细胞中有明显增加(图6B)。当用rAAV壳体蛋白的I类MHC限制性表位再刺激T细胞时，测量到更低的IFN-γ水平，且在没有任何刺激的情况下也检测到一些(数据未显示)。总之，这些结果指示，渗入用rAAV.sFlt-1注射的小鼠眼中的一小部分的T细胞已新近被激活以产生IFN-γ，但在本实验的过程期间这在任一T细胞子集中并未变化。
对免疫细胞渗入用AAV-sFLT-1注射的小鼠眼中的这些实验所呈现的数据清楚地显示两波细胞渗入。在1周时有早期一波CD11b+细胞，接着是在2周时的一波CD4+和CD8+T细胞。重要地，任一波的渗入在4周时皆不存在，表明该渗入自身消退。重要地，sFLT-1蛋白产生在该点并未降低，实际上持续以非常高的水平表达。
关于IFN-γ产生的数据指示约5％的CD4+和CD8+T最近被引发，且该频率在实验过程中未变化。Hu.等人首先描述了通过激活的T细胞的血-视网膜屏障的崩溃，且本文中呈现的数据与激活的CD4+和CD8+细胞的渗入一致。然而，在该群体中在壳体特异性T细胞的数目中没有增加的迹象，因为用特异性肽再刺激仅揭示低水平的IFN-γ产生，其在实验过程中未变化。总之，这些观察表明用注射rAAV.sFlt-1进行的初始结果产生了一波短暂的免疫细胞渗入，其在4周内自身消退，但未能引发能损害眼组织或影响sFLT-1表达的持续免疫应答。
实施例8
在猴上的免疫原性研究
分析在视网膜下注射rAAV.sFlt-1或rAAV.gfp后的免疫应答，其使用会鉴定免疫细胞子集群体中的变化的一组抗体。结果汇总于图4。在一些猴中，观察到在免疫细胞子集群体中的非常小的变化，但它们不是统计学显著的。尽管如此，其之后对循环的细胞进行深刻的研究。具体地，我们评估了载体(rAAV)或插入的基因产物(sFLT-1)可导致免疫激活的可能性。研究了对B细胞和T细胞的激活(图5和图6)。还分析了其他淋巴细胞群体以确定该治疗是否导致可能指示直接激活或对激活的反应的任何可观察的差异。使用经典标志物(Pitcher,2002#129)的组合，以及在最近发表的一项报告(Miller,2008#126)中描述的新表型分析来进行分析。使用表型标志物的一个小子集(HLA-DR,Ki-67和Bcl-2)，我们研究了在施用rAAV-sFLT-1后，CD4+或CD8+T细胞和/或B细胞是否显示激活的迹象。在由Miller和同事发表的研究中，激活的T细胞展现激活的效应器表型，其由分化标志物HLA-DR和细胞周期相关核抗原Ki-67(用作增殖的标志物)的表达表征。静息T细胞不表达Ki-67，而周期性或最近分裂的T细胞上调Ki-67表达。Ki-67表达水平正常检测为内稳态细胞循环的一部分。
实施例9
rAAV.sFlt-1的生物分布
从猴安乐死后立即收集的组织(眼神经、淋巴结、脑、心、肺、脾、肝、角膜)提取基因组DNA。对基因组DNA实施实时聚合酶链式反应以确定在视网膜下间隙中注射的rAAV.sFlt-1载体构建体是否在别处存在。基于已知量的对照质粒pssv.C1.sflt-1 DNA之间的Ct值的比较，发现rAAV.sFlt-1构建体在一只注射眼的眼神经中为低基因拷贝数而在任何其他组织样品中并非如此。这表明用rAAV.sFlt-1注射到视网膜下间隙中主要保持在眼中。表4是来自从未注射或用rAAV.sFlt-1-和rAAV.gfp注射的猴提取的基因组DNA的Ct值的汇总。
表3：对于分析的不同基因组DNA和对照质粒DNA样品的Ct值和Ct标准偏差值.
实施例10
对视网膜新血管化的小鼠模型的功效研究
在本研究中使用经由在感光细胞中的VEGF上调生成的转基因小鼠。将 一只眼用rAAV.sFlt-1注射而对侧眼用rAAV.gfp注射。由未明示的观察者对新血管化的程度、强度和阶段基于公认的标尺评级。结果显示在，在从中值‘3’(严重)到注射后1个月时中值‘1’(轻度)有新血管化评级中的统计学显著的总体降低(P＝0.012)。这种低水平的荧光素渗漏在rAAV.sFlt-1注射后3个月(中值＝1；P＝0.001)和8个月(中值1；P＝0.001)时维持，表明rAAV.sFlt-1的长期、持续的治疗效果。
表4：在AAV.sFlt-1和AAV.gfp注射之前和之后的眼评级和注射后8个月时的光感受器数目/行数
L＝用AAV.sFlt-1注射的左眼，R＝用AAV.GFP注射的右眼，ND＝未完成
a用AAV载体注射前3天。
b光感受器数目中统计学显著的差异(p<0.01)
实施例11
对激光诱导的脉络膜新血管化的猴模型的功效研究
将5只猴在一只眼中用rAAV.sFlt-1而在另一只眼中用对照载体(rAAV.gfp)视网膜下注射。视网膜下注射在其中一只猴的右眼中未成功；因此该动物未进行进一步评估。视网膜下注射40-100μL的rAAV悬液提升了视网膜，从而以定位方式在色素上皮和光感受器层之间创建了具有载体的泡。该泡在24至48小时内被自身修正。除了在针头穿透点对视网膜色素上皮的微小扰动外，对于随访期间(注射后3至17个月)没有观察到其他视网膜异常。没有观察到其他异常或不良事件；在任何时候都没有与手术有关的视网膜脱离。
为了评估rAAVsFlt-1的长期治疗功效，在用载体处理后16个月时4只注射的猴接受强烈激光光凝固。使用激光在每只眼中诱导8处损伤，然后在激光处理后2和4周时监测眼的脉络膜新血管化。在激光光凝固后，4只猴中仅3只是可分析的，因此对3只动物收集功效数据。用rAAVsFlt-1处理的3只猴眼中均没有形成脉络膜新血管化相关的损伤且仅观察到微弱的荧光素染色，指示最少的渗漏/新血管化。所有用对照载体处理的对侧眼均形成脉络膜新血管化相关的损伤。3只动物的功效数据呈现在表5中。
表5：在猕猴中对激光诱导的CNV视网膜下施用rAAV.sFlt-1或对照(rAAV.gfp)载体的效果
*CNV在视网膜下注射rAAV后16个月时诱导。
激光光凝固后具有新血管化(荧光素渗漏)的黄斑损伤数。
通过视网膜电位图评估猴的视网膜功能。计算来自注射眼和未注射对侧眼的应答的幅度和隐含期(implicit time)并比较注射前和注射后的不同时间。结果显示rAAV.sFlt-1(重组sFLT-1蛋白)或rAAV.gfp的注射对猴的视网膜功能没有任何不良作用。
实施例12
在治疗湿性AMD中的标准医护牵涉每4-8周重组抗VEGF蛋白的频繁眼内注射。已针对有力(Kd～10pM)、天然存在的抗VEGF蛋白(可溶性Fms相关的酪氨酸激酶-1(sFlt-1))开发了rAAV构建体以用于治疗湿性AMD。依照FDA和ICH指南在UNC Vector Core Human Application实验室产生rAAV.sFlt-1。进行一项针对rAAV.sFlt-1安全性和功效的8位患者对照研究。该研究的资格、纳入和排除标准如下：
合格标准
符合研究资格的年  65岁或
龄：更大
符合研究资格的性  男女皆
别：可
接受健康志愿者：否
纳入标准
·年龄超过或等于65岁；
·AMD继发性的凹下CNV，在另一只眼中的最佳矫正视敏度为20/80–20/400或更好；
·研究眼的荧光素血管造影片必须显示渗漏的凹下脉络膜新血管损伤的 证据；
·必须是抗VEGF玻璃体内注射的候选人；
·损伤的整个尺寸不得超过12个黄斑光凝固研究盘(Macular Photocoagulation Study disc)面积；
·没有在前的光力学或激光的视网膜治疗；
·能提供知情同意；
·参与者在登记时具有临床可接受的实验室和ECG；和
·能依从方案需要，包括随访。
排除标准： 
·肝酶>2X正常上限； 
·任何类型的活性感染的临床证据，包括腺病毒、甲乙丙肝、或HIV病毒；在研究/对照眼中的任何针对AMD的在前治疗，抗VEGF注射除外；
·视网膜色素上皮中有破裂；
·大范围黄斑下伤痕组织(submacular scar tissue)；
·凹下CNV AMD以外的重大视网膜疾病，如糖尿病视网膜病或视网膜血管阻塞；
·重大的非视网膜疾病，如眼萎缩或白内障；
·已知对荧光素过敏；
·目前使用强的松龙(prednisolone)、其他抗炎甾类或免疫抑制药物。允许非甾类药物如阿司匹林；
·任何其他重大的、研究者认为可能使参与者由于参与本研究而有危险或可能影响研究结果或参与者参与本研究的能力的疾病或病症；
·在过去12周已参与过另一项涉及研究性产品的调查研究的参与者；和
·青霉素敏感。
施用规程：依照以下规程在施用于视网膜下注射的背景中对研究受试者施用含有rAAV.sFlt-1的药物组合物：
1.在遮盖前将受试者的眼周皮肤和眼睑边缘和眼睫毛用5％聚维酮碘(povidone iodine)清洁；
2.放置无菌全身盖布，接着是另外的眼盖布。
3.插入眼睑诊察镜(speculum)，确保其在眼睑下较佳地放置以将眼睑导向离开视野并由眼盖布保护。
4.插入3x 23G或25G玻璃体切割切口(vitrectomy port)；
5.将盐水输注连接到第一切口；
6.将光纤插入第二切口中；
7.将36G-41G视网膜下插管经由第三切口中的微连接器连接到药物注射器；
8.在显微控制下，将100微升注射到视网膜下；
9.注射后，取下仪器和切口；
10.应用氯霉素软膏；
11.缓慢灌输来自无菌一次性容器的阿托品(Atropine)1％滴剂；并
12.应用眼衬垫(pad)和眼防护(shield)。
rAAV.sFlt-1研究的结果在本文中汇总。
招募的8名受试者(均值年龄77岁)均患有活性凹下脉络膜新血管化，视敏度为20/40至20/400，且先前接受过1至25次兰尼单抗的玻璃体内注射。将患者随机分成3个组，对照组和两个实验组。所有患者在研究的第1和30天接受兰尼单抗的玻璃体内注射。在第7天，经由视网膜下注射对第一实验组施用100ul体积的rAAV.sFlt-1的1x1010载体基因组，经由视网膜下注射对第二实验组施用100ul体积的rAAV.sFlt-1的1x1011载体基因组。在实验组的所有6例患者中，视网膜下流体的泡均在4小时内消退。在24小时后，玻璃体中的大部分空气已吸收，且仅视网膜注射部位保持可见。1名患者形成与规程有关的轻微出血，但不影响视觉。如预期的，在玻璃体切割后，在嗜中性粒细胞计数中有暂时增加，其到注射后14天时回复正常。在注射后1天在1名受试者的泪中发现载体序列，其到第30天时已清除。除了这一个单例外，迄今在任一受试者的血液、唾液或尿中通过qPCR或ELISA均未检测到AAV2。天然存在的sFLT-1蛋白的背景水平显示在尿、血清和唾液中的高基线变化，在治疗后没有升高。玻璃体中的sFLT-1水平在受试者中也不同(975-2085pg/ml)。血液生物化学、全血计数和T细胞应答相比于基线保持没有任何显著变化。rAAV.sFlt-1的视网膜下注射显示没有临床显著的视网膜毒性，如通过在两个月的时段内的连续眼科检查评估的。在任意受试者中均不存在浅表性的前段或玻璃体炎症迹象。在任意患者中均没有视敏度丧失、IOP升高、视网膜脱离或任何眼内或系统性免疫应答的证据。对于每位患者的初始和援救抗VEGF治疗的概况在表6中汇总。
表6：按患者的兰尼单抗注射的汇总
注意：按照方案，在第0天和第30天的注射对于研究中的所有患者是强制性的\\
显然，在第60天实验组中没有患者需要援救治疗，而大多数在更低剂量实验组中的患者在第90天、第120天,第150天,第180天或第210天或第270天或第365天(1年)时需要0次援救治疗。对照患者需要多次援救治疗。这些 结果是预期不到的且扩大了基因治疗对于患有湿性AMD的大组年老患者的前景。一般地，用当前的抗VEGF疗法，如玻璃体内注射VEGF抑制剂蛋白或其他抗VEGF剂将在30、60或90天天内需要另外的注射。
在视网膜下施用rAAV.sFLT-1后6至8周时，研究受试者或患者中的sFLT-1达到最大表达水平。在这一所谓的“爬升(ramp-up)”时期，以15至45天时间间隔，优选约30天时间间隔注射至少1次、2次或3次玻璃体内注射的抗VEGF剂以防止疾病进展。优选在施用rAAV.sFlt-1之前1至30天，优选5至10天施用第一剂玻璃体内注射的抗VEGF剂以允许玻璃体内注射的抗VEGF剂(Lucentis或Avastin或Eylea或其他非sFLT药剂)的吸收。如果在rAAV.sFLT的视网膜下施用之前不到24小时施用这第一剂玻璃体内注射，那么其可能在视网膜下注射规程期间被冲洗出玻璃体外，从而导致亚治疗性(sub-therapeutic)的抗VEGF剂浓度和疾病进展。
在该爬升期完成后，表达充足的sFLT-1以治疗或预防其AMD进展的患者可能不需要另外的玻璃体内抗VEGF注射，尽管预期他们仍将在医师的护理之下。基于客观标准在按需基础上对患者进行监测和治疗，所述标准如使用光学相干断层成像术(optical coherence tomography)增加的中心点视网膜厚度测量。
在本研究中，在大概每月基础上评估对照和两个实验组中的患者的活性脉络膜新血管化的迹象，且如果满足任意一项以下标准则用玻璃体内兰尼单抗再治疗：
-与人受试者的前一次访问相比>10个早期治疗糖尿病视网膜病变研究(ETDRS)字符减少(可归因于视网膜原因)，或者与前一次访问相比>5个ETDRS字符减少连同患者感知功能丧失；
-OCT上的任何增加的、新的、或持续的神经下(subsensory)、视网膜色素上皮下(RPE)或视网膜内流体；
-通过FA的增加的CNV渗漏的迹象。 
实施例13
光学相干断层成像术(OCT)
使用批准的装置(HeidelbergSD-OCT)和标准技术来实施频域光学相干断层成像术(SD-OCT)以监测患者视网膜中的中心点视网膜厚度 和流体渗漏。
光学相干断层成像术(OCT)是一种类似于超声和MRI的非接触性医学成像技术。使用OCT，利用反射光来产生眼的详细横截面和3D图像。 SD-OCT同时测量在一定光谱内的反射光的多个波长，因此称为频域(spectral domain)。扫描的增加的速度和数量反映为更高的分辨率和更好的观察疾病的机会。在患有湿性AMD的患者中，新的视网膜流体的检测或临床显著的视网膜厚度增加可由SD-OCT检出。(Adhi等,Curr Opin Ophthalmol.2013May；24(3):213-21；Malamos等,Invest Ophthalmol Vis Sci.2009Oct；50(10):4926-33)。在患有AMD的患者中检出这些症状指示疾病进展，其使得有正当理由用抗VEGF疗法如Lucentis或Eylea进行好资料。
经由SD-OCT监测研究中每位受试者的视网膜健康和AMD进展的症状。进行经由黄斑的至少6次径向扫描(radial scan)，每个约6mm长；并在每次指定访问时收集OCT图像/扫描。对SD-OCT图像评估视网膜内流体的存在(由不明示的观察者进行)，并使用Heidelberg Heyex SD-OCT软件测量中央视网膜厚度。对8位患者的每次访问的中央视网膜厚度结果呈现在下表7中。
表7：按给药组的中央视网膜厚度从第0天时基线的均值变化，以微米计
如表7中显示的，在方案要求的研究开始时抗VEGF蛋白(Lucentis)的玻璃体内注射的施用后，所有给药组中的受试者的均值中央视网膜厚度均降低。 如预期地，在对照组中患者的中央视网膜厚度开始增加且在抗VEGF蛋白施用的30–90天内可在SD-OCT图像上看到流体。预料不到地，低给药和高给药组中受试者的中央视网膜厚度一般由rAAV.sFlt-1较好地控制且不随时间增加。新的视网膜内流体不出现在低剂量组受试者或高剂量组受试者的视网膜中。这由OCT显示，例如在图24中。在12个月时，用rAAV.sFlt-1处理的受试者的中央视网膜厚度在施用包含rAAV.sFlt-1的药物组合物12个月内增加不超过50微米，或不超过100微米，或不超过250微米。当与基线相比时，用rAAV.sFlt-1处理的人受试者的中央视网膜厚度降低50微米，且在一些情况中降低100微米，或在一些情况中，降低200微米。在施用sFlt-18周内观察到该降低且在3个月、6个月、9个月和12个月时维持。该结果是令人惊讶的且是在人受试者的AMD和眼部新血管化的临床治疗中未知的。更通常地是，在没有抗VEGF蛋白或其他VEGF抑制剂的另外施用的情况下，在初始抗VEGF治疗后30天,60天,90天或180天时将观察到视网膜内流体和中央视网膜厚度的增加。
荧光素血管造影术(FA)
使用标准技术实施FA。对研究眼取移动图像(Transit image)。对研究和非研究眼取中期和后期图像；并要在每次指定访问获得FA。
生物分布研究
通过聚合酶链式反应(PCR)扩增自泪、血浆、尿和唾液样品分离的载体基因组来研究载体的散布。对于血浆、泪和唾液中的sFLT-1和AAV2壳体通过ELISA研究载体和sFLT-1的生物分布。
DNA的提取
将样品(100-300ul)移液到样品收集卡(Qiagen,Valencia,CA)或无菌泡沫尖端应用器(foam tip applicator)上。按照制造商方案从每份样品提取DNA。将纯化的DNA溶解于50ul的洗脱缓冲液。存在的DNA量通过分光光度法测定。
通过实时PCR检测rAAV.sFlt-1
对基因组DNA样品(0.5-1μg)筛选AAV.sFlt-1载体的存在，其使用 Gene Expression Assays(Applied Biosystems,U.S.A.)。该测定由一对未标记的PCR引物(其扩增AAV2和sFLT-1序列之间的片段)，和在5’端具有FAMTM或染料标记和小沟结合模块，而在3’端具有非荧光猝灭染料的探针组成。循环条件为在50℃放置2分钟，在95℃达20秒，接着是45个以下循环：95℃达3秒和60℃达30秒。
进一步测试rAAV.sFlt-1片段阳性的样品，并通过实时聚合酶链式反应(PCR)量化存在的rAAV.sFlt-1的基因拷贝数。使用IQ5Bio-Rad实时PCR系统(Bio-Rad,Hercules,California,USA)，将0.5-1.0ug的提取的DNA在含有Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)和0.5uM每种引物的20-ul反应混合物中扩增。并行设置掺入含有靶序列的质粒DNA的类似样品组，作为有添加的(spiked)样品。使用的引物(前向：CACTAGTCCAGTGTGGTGGA；反向：AGCCAGGAGACAACCACTTC)在Primer3 Output(Whitehead Institute,MA,USA)的辅助下设计以使用Rotorgene(Corbett)将来自载体cDNA的区域扩增到sFLT-1基因中。使用的循环条件为：2min 50.0℃,2min 95.0℃和60个3步循环，即95.0℃20s,60.0℃20s和72.0℃20s。在每次运行中从10倍稀释的具有相同靶载体序列的质粒DNA(pSSV.sFlt-1)中生成标准曲线。一式三份地分析每份样品。
通过ELISA量化sFlt-1蛋白浓度
通过ELISA使用Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)来定量测量血浆、泪和唾液中存在的sFLT-1浓度，其基于夹心免疫测定技术。将样品(100ul)添加到用特异于VEGF R1/sFLT-1的单克隆抗体包被的96孔板，并允许温育2小时。通过用缓冲液清洗除去任何未结合的sFLT-1。在与特异于VEGF R1/sFLT-1的酶联多克隆抗体温育后，冲洗掉过量的抗体-酶缀合物，然后将样品与底物溶液温育。通过测量在450nm的可见吸光度来量化酶催化的色原形成。使用对重组人sFLT-1绘出的校正曲线从吸光度值计算样品中的sFLT-1浓度(按pg/ml计)。
通过ELISA检测AAV2
使用AAV2 Titration ELISA试剂盒(American Research Products,Inc., Belmont,Massachusetts,USA)分析血浆、泪、尿和唾液中AAV2壳体的存在。该试剂盒基于夹心ELISA技术且使用特异于装配的AAV颗粒上的构象性表位的小鼠单克隆抗体。该单克隆抗体被包被到微板条上并用于捕获来自标本的AAV颗粒。以两步骤检测捕获的AAV颗粒。首先，将针对AAV的缀合生物素的单克隆抗体结合至免疫复合物。在第二步，链霉亲合素过氧化物酶缀合物与生物素分子反应。底物溶液的添加导致显色反应，其与特异性结合的病毒颗粒成比例。在450nm用光度计测量吸光度。提供的试剂盒对照含有空壳体的AAV颗粒配制物且其允许对具有未知颗粒效价的样品的定量测定。将样品(100ul)添加至板并依照制造商方案实施该测定。
检测中和性AAV-2抗体
测定血浆阻断用AAV2.gfp转导HEK293细胞的能力。将患者的血浆在正常小鼠血清中在多孔板中连续稀释。将AAV2.gfp添加到每个孔并将板在37℃温育1小时，接着一式三份地添加到HEK293细胞。中和性抗体效价表示为导致对通过AAV2-gfp的转导的50％抑制的血浆稀释。最大gfp活性由在正常小鼠血清中稀释的载体代表；最大抑制由仅在正常小鼠血清中的培养基代表。测定来自每位受试者的基线血浆，连同每份术后样品(post-op sample)。在48小时后对测试孔中来自用AAV2.gfp转导293T细胞的绿色细胞计数并与基线血清样品中的绿色细胞数比较。
检测抗AAV2抗体
为了检测针对AAV2壳体的血浆抗体，将增强的蛋白结合ELISA板用109vg/ml AAV2(Vector Core Facility,North Carolina)在4℃过夜包被。将板在37℃封闭2小时，然后在4℃与系列稀释的抗AAV2单克隆抗体(Industries International,Concord,MA)或患者血浆的1:50,1:100,1:200，或1:400稀释过夜温育。将板与缀合马辣根过氧化物酶(HRP)的抗人Ig在37℃温育2小时，然后与四甲基联苯胺(TMP)底物和过氧化氢(H2O2)温育。通过磷酸(H3PO4)终止反应并在450nm在板读数器上读数。基于并行测定的商业性抗体的标准曲线来计算抗AAV2抗体的效价。一式三份地确定每个值。
地图状萎缩
依照标准技术检查人研究受试者在其经治疗和未经治疗的眼中的地图状萎缩的迹象。在用rAAV.sFlt-1治疗的患者中在3个月,6个月,9个月，或12个月时未观察到增加的地图状萎缩。猜测该治疗可停止经治疗眼中的地图状萎缩的进展达长达15个月,18个月,24个月,36个月,5年和10年。
实施例14
为了进一步测试rAAV.sFlt-1对于治疗湿性AMD和脉络膜新血管化的安全性和功效，在有对照的临床研究中再招募四十位(40)受试者。如实施例12中的，依照FDA和ICH指南在UNC Vector Core Human Application实验室产生rAAV.sFlt-1。进行一项针对rAAV.sFlt-1安全性和功效的8位患者对照研究。该研究的资格、纳入和排除标准如下：
合格性
符合研究资格的年龄：55岁或更大
符合研究资格的性别：男女皆可
接受健康志愿者：否
纳入标准
·年龄超过或等于55岁；
·AMD继发性的凹下CNV，研究眼中的最佳矫正视敏度为20/30–20/400，在另一只眼中为20/200或更好；
·研究眼的荧光素血管造影片必须显示渗漏的凹下脉络膜新血管损伤的证据；或脉络膜新血管化目前处于使用抗VEGF治疗的积极治理中；
·必须是抗VEGF玻璃体内注射的候选人；
·损伤的整个尺寸不得超过12个黄斑光凝固研究盘面积；
·没有在前的光力学或激光的视网膜治疗；
·能提供知情同意；
·参与者在登记时具有临床可接受的实验室参数和ECG；和
·能依从方案需要，包括随访。
排除标准： 
·肝酶>2X正常上限； 
·任何类型的活性感染的临床证据，包括腺病毒、甲乙丙肝、或HIV病毒； 或有记录的乙肝或丙肝史；
·在研究/对照眼中的任何针对AMD的在前治疗，抗VEGF注射除外； 
·视网膜色素上皮中有破裂；
·研究眼中的大范围的凹下伤痕、大范围地图状萎缩、或较厚的视网膜下血，如由研究者测定的；
·凹下CNV AMD以外的重大视网膜疾病，如糖尿病视网膜病或视网膜血管阻塞，其能损害研究眼中的视觉；
·重大的非视网膜疾病，如研究眼中的眼萎缩或显著白内障，包括影响视敏度的中央角膜伤痕，具有视野缺陷的青光眼或任何可测量的葡萄膜炎；
·已知对荧光素过敏；
·目前使用强的松龙、其他抗炎甾类或免疫抑制药物。允许吸入性甾类和非甾类药物如阿司匹林；
·任何其他重大的、研究者认为可能使参与者由于参与本研究而有危险或可能影响研究结果或参与者参与本研究的能力的疾病或病症；
·在过去12周已参与过另一项涉及研究性产品的调查研究的参与者；和
·由参与者医疗档案确认的青霉素敏感。
初始登记的受试者患有活性凹下脉络膜新血管化，研究眼中视敏度为20/30至20/400，且先前接受过0至25次兰尼单抗的玻璃体内注射。将患者随机分到对照组或实验组中，直到总共登记有14名患者对照和26名实验患者。所有患者在研究的第1和30天接受兰尼单抗的玻璃体内注射。在第7天，经由视网膜下注射对实验组施用100ul体积的rAAV.sFlt-1的1x1011载体基因组。
如实施例12中的研究，在视网膜下施用rAAV.sFLT-1后6至8周时，研究受试者或患者中的sFLT-1达到最大表达水平。在这一所谓的“爬升”时期，以15至45天时间间隔，优选约30天时间间隔注射至少1次、2次或3次玻璃体内注射的抗VEGF剂以防止疾病进展。优选在施用rAAV.sFlt-1之前1至30天，优选5至10天施用第一剂玻璃体内注射的抗VEGF剂以允许玻璃体内注射的抗VEGF剂(Lucentis或Avastin或Eylea或其他非sFLT药剂)的吸收。如果在rAAV.sFLT的视网膜下施用之前不到24小时施用这第一剂玻璃体内注射，那么其可能在视网膜下注射规程期间被冲洗出玻璃体外，从而导致亚治疗性的抗VEGF剂浓度和疾病进展。
在该爬升期完成后，表达充足的sFLT-1以治疗或预防其AMD进展或其他 脉络膜新血管化症状的患者不需要另外的玻璃体内抗VEGF注射，尽管预期他们仍将在医师的护理之下。
在本实施例记载的研究中，在大概每月基础上评估对照和实验组中的患者的活性脉络膜新血管化的迹象，且如果满足任意一项以下标准则用玻璃体内兰尼单抗再治疗：
与受试者的前一次访问相比>10个早期治疗糖尿病视网膜病变研究(ETDRS)字符减少(可归因于视网膜原因)，或者与前一次访问相比>5个ETDRS字符减少连同患者感知功能丧失；
OCT上的任何增加的、新的、或持续的神经下、视网膜色素上皮下(RPE)或视网膜内流体；
通过FA的增加的CNV渗漏的迹象。 
实施例15
为了测试rAAV.sFlt-1对于预防或治疗眼部新血管疾病年龄相关的黄斑变性(AMD)的安全性和功效，进行一项另外的与40名患者(150)的对照临床研究。依照FDA和ICH指南在Lonza Houston,Inc.(Houston,Texas)产生rAAV(bv).sFlt-1。该研究的资格、纳入和排除标准如下：
合格性
符合研究资格的年龄：50岁或更大
符合研究资格的性别：男女皆可
接受健康志愿者：是
纳入标准
·患有非渗出性AMD的患者(依照AREDS标准属于2,3或4类；将纳入组4中患有非后期AMD的眼)；纳入患有归类为“湿性”或“干性”的AMD的患者；
·年龄为50至90岁；
·能理解并依从试验要求；
·视敏度>0.4；
排除标准： 
·目前被招募到眼科临床试验中；
·患有AMD以外的伴随性黄斑或脉络膜病症且具有AMD的不确定迹象的眼；
·诊断为渗出性AMD、具有活性视网膜下新血管化(SRNV)或CNV损伤(需要研究眼中的激光光凝固)的眼；
·具有显著的眼晶状体不透明性(导致视力降低)的受试者； 
·有弱视的受试者；
·有眼神经疾病(神经病、萎缩、视神经盘水肿(papilledema))、不稳定的青光眼(由超过25mm Hg的眼内压限定，3种或更多种青光眼药物，C/D为0.8或更大，且视野与青光眼一致)；视网膜-玻璃体手术史，变性近视，活性后段眼内炎性疾病，长期使用局部眼甾类药物，血管增生性视网膜病(除AMD以外)，孔源性视网膜脱离，和遗传性黄斑营养不良(inherited macular dystrophy)的患者；
·有按需式起搏器(demand type pacemaker)或癫痫症的受试者；
·有不受控高血压的受试者(限定为90以上的舒张压和150以上的收缩压)；
·有最近的脑血管疾病史的受试者(在过去一年内)；
·显现有短暂性缺血发作(TIA's)或脑血管意外事件(CVA's)；
·有AIDS病史的受试者；
·在招募到试验中之前3个月内在试验眼中有眼内手术的受试者；
·不愿意坚持访问检测日程安排的患者。
主要结果量度：
MPOD和多焦视网膜电图(multifocal electroretinogram)[时间范围：1年][指定为安全性问题：是]
次要结果量度：
rAAV(bv).sFlt-1在降低形成后期AMD的风险中的安全性和功效[时间范围：1年][指定为安全性问题：是]
表9：实验设计臂
实施例16
为了测试rAAV.sFlt-1对于治疗眼部新血管疾病糖尿病黄斑水肿(DME)的安全性和功效，进行一项另外的有四十名(40)患者的对照临床研究。依照FDA和ICH指南在Lonza Houston,Inc.(Houston,Texas)产生rAAV(bv).sFlt-1。该研究的资格、纳入和排除标准如下：
合格性
符合研究资格的年龄：18岁或更大
符合研究资格的性别：男女皆可
接受健康志愿者：否
一般纳入标准：
·满足以下标准的受试者符合资格：
·愿意提供书面知情同意书，且在美国地点，Health Insurance Portability and Accountability Act(HIPAA)授权，在其他国家，依照该国法律适用。
·糖尿病(1或2型)。
·继发于糖尿病(DME)的牵涉凹中央的视网膜增厚，中央子视野(center subfield)中的中心黄斑厚度≥275μm，如在光学相干断层成像术(OCT)上评估的。
·研究眼中20/40至20/320(近似Snellen当量)的最佳矫正视敏度(BCVA)得分，其使用早期治疗糖尿病视网膜病研究(ETDRS)方案在4米的初始测试距离。
·确定视力降低主要是DME而非其他原因的结果。
·有返回所有规划的访问和评估的能力和意愿(研究者认为)。
排除标准： 
·研究眼中有玻璃体视网膜手术史。
·在筛选3个月内研究眼中有泛视网膜(Panretinal)光凝固(PRP)或黄斑激光光凝固。
·研究眼中的增值性糖尿病视网膜病(PDR)，无活性退行性PDR例外。
·涉及研究眼中的黄斑的Iris新血管化、玻璃体出血、牵引视网膜脱离(traction retinal detachment)或视网膜前纤维化(preretinal fibrosis)。
·研究眼中的玻璃体黄斑牵引或视网膜前(epiretinal)膜。
·研究眼中的眼部炎症(包括微量以上)。
·任一眼中突发性或自身免疫性葡萄膜炎的病史。
·可能阻碍黄斑水肿消退后VA中的改善的研究眼中黄斑中央的结构性损伤，包括视网膜色素上皮(RPE)的萎缩、视网膜下纤维化或有组织的硬渗出物斑(hard-exudate plaque)。
·可能扰乱研究结果解释的研究眼中的眼部病症，包括任何起因的视网膜血管阻塞、视网膜脱离、黄斑孔(macular hole)或脉络膜新血管化(CNV)(例如年龄相关的黄斑变性(AMD)、眼部组织胞浆菌病(ocular histoplasmosis)或病理性近视)。
·研究眼中3个月内的白内障手术、过去2个月内的钇-铝-石榴石(garnet)(YAG)激光晶状体囊切开术(laser capsulotomy)，或在第0天前90天内的任何其他眼内手术。
·研究眼中不受控的青光眼或先前的过滤手术(filtration surgery)。
·不受控的血压。
·在第0天前3个月内的脑血管意外事件或心肌梗塞病史。
·不受控的糖尿病。
·需要透析或肾移植的肾衰竭。
·其他疾病病史，代谢功能障碍，体检发现或临床实验室发现，从而有理由怀疑某种疾病或疾患，其使得使用研究药物为禁忌的、可能影响对研究结果的解释、或使得受试者有来自治疗并发症的高风险。
主要结果测量：
·在第12月时在其最佳矫正视敏度(BCVA)得分中有从基线≥15字符的增加的患者的百分数[时间范围：基线至第12月][指定为安全性问题：否]
次要结果测量：
·在第12、24和36月时最佳矫正视敏度(BCVA)得分中从基线的均值变化
·在第12、24和36月时视敏度(VA)Snellen当量为20/40或更好的患者的百分数。
·在第12、24和36月时中心凹厚度从基线的均值变化，如通过SD-OCT测量的。
·伴随的抗VEGF治疗(例如Lucentis、Avastin、Macugen或eyelea)频率的降低[指定为安全性问题：否]
表10：DME研究的实验设计臂
初始登记的受试者患有DME，研究眼中视敏度为20/40至20/320，且先前接受过0至25次兰尼单抗或阿柏西普的玻璃体内注射。将患者随机分到对照组或两个实验组中，直到总共登记有14名患者为对照患者和13名低剂量实验患者和13名高剂量实验患者。所有患者在研究的第1和30天接受兰尼单抗的玻璃体内注射。在第7天，经由视网膜下注射对实验组施用100ul体积中的rAAV.sFlt-1的1x1010或1x1011载体基因组。
如实施例12中的研究，在视网膜下施用rAAV(bv).sFLT-1后6至8周时，研究受试者或患者中的sFLT-1达到最大表达水平。在这一所谓的“爬升”时期，以15至45天时间间隔，优选约30天时间间隔注射至少1次、2次或3次玻璃体内注射的抗VEGF剂以防止疾病进展。优选在施用rAAV(bv).sFLT-1之前1至30天，优选5至10天施用第一剂玻璃体内注射的抗VEGF剂以允许玻璃体内注射的抗VEGF剂(Lucentis或Avastin或Eylea或其他非sFLT药剂)的吸收。如果在rAAV(bv).sFLT-1的视网膜下施用之前不到24小时施用这第一剂玻璃体内注射，那么其可能在视网膜下注射规程期间被冲洗出玻璃体外，从而导致亚治疗性的抗VEGF剂浓度和疾病进展。
在该爬升期完成后，表达充足的sFLT-1以治疗或预防其DME进展的患者可不需要另外的玻璃体内抗VEGF注射，尽管预期他们仍将在医师的护理之 下。
在本实施例记载的研究中，在大概每月基础上评估对照和实验组中的患者的活性或新DME和新血管化的迹象，且如果满足任意一项以下标准则用玻璃体内兰尼单抗再治疗：
-与受试者的前一次访问相比>10个早期治疗糖尿病视网膜病变研究(ETDRS)字符减少(可归因于视网膜原因)，或者与前一次访问相比>5个ETDRS字符减少连同患者感知功能丧失；
-OCT上的任何增加的、新的、或持续的神经下、视网膜色素上皮下(RPE)或视网膜内流体；
-通过FA的增加的CNV渗漏的迹象。 
实施例17
为了测试rAAV.sFlt-1对于治疗眼部新血管疾病视网膜静脉阻塞(RVO)的安全性和功效，进行一项另外的有四十名(40)患者的对照临床研究。该临床研究用两个患者分组进行，1个分组包括患有中央视网膜静脉阻塞(CRVO)的患者，1个分组包括分枝视网膜静脉阻塞(BRVO)的患者。依照FDA和ICH指南在Lonza Houston,Inc.(Houston,Texas)产生rAAV(bv).sFlt-1。该研究的资格、纳入和排除标准如下：
合格性
纳入标准： 
·长达不超过9个月的继发于中央视网膜静脉阻塞(CRVO)的牵涉中心的黄斑水肿或继发于BRVO的牵涉分枝的黄斑水肿，在光学相干断层成像术(OCT)上均值中央子视野厚度≥250μm；
·成人≥18岁；
·研究眼中的早期治疗糖尿病视网膜病研究(ETDRS)最佳矫正视敏度(BCVA)为20/40至20/320(73至24个字符)；
排除标准： 
·任何使用抗VEGF剂在研究眼中的在前治疗(哌加他尼钠(Pegaptanib sodium)、乙酸阿奈可他(anecortave acetate)、贝伐单抗、兰尼单抗等)或先前施用过系统性抗血管生成药物；
·研究眼中之前有泛视网膜激光光凝固或黄斑激光光凝固
·从诊断日期起CRVO疾病持续>9个月；从诊断日期起BRVO疾病持续>9个月；
·在研究眼中先前使用过眼内皮质甾类或在第1天之前3个月内研究眼中使用过眼周皮质甾类；
·研究眼或对侧眼中的涉及黄斑的Iris新血管化、玻璃体出血、牵引视网膜脱离或视网膜前纤维化；
主要结果测量：
·在6个月时最佳矫正视敏度(BCVA)得分从基线的均值变化[时间范围：基线和6个月][指定为安全性问题：否]
·研究眼中早期治疗糖尿病视网膜病研究(ETDRS)最佳矫正视敏度(BCVA)字符得分的研究基线范围为73至24(＝敏度为20/40至20/320)；更高的得分代表更好的机能。Nominator＝(维持视力的参与者的数目*100)；Denominator＝分析的参与者的数目
次要结果测量：
·在第6个月时BCVA得分中相比于基线增加≥15字符的参与者百分数。
·在第6个月时中央视网膜厚度(CRT)从基线的均值变化[时间范围：基线和6个月][指定为安全性问题：否]
·伴随的抗VEGF治疗(例如Lucentis、Avastin、Macugen或eyelea)频率的降低[指定为安全性问题：否]
表11：用于BRVO/CRVO研究的实验设计臂
初始登记的受试者患有CRVO或BRVO，研究眼中视敏度为20/40至20/320，且先前接受过0至25次兰尼单抗或阿柏西普的玻璃体内注射。将患者随机分到对照组或两个实验组中，直到总共登记有14名患者为对照患者和13名低剂量实验患者和13名高剂量实验患者。所有患者在研究的第1和30天接受兰尼单抗的玻璃体内注射。在第7天，经由视网膜下注射对实验组施用100ul体积中的rAAV(bv).sFlt-1的1x1010或1x1011载体基因组。
如实施例14中的研究，在视网膜下施用rAAV(bv).sFlt-1后6至8周时，研究受试者或患者中的sFLT-1达到最大表达水平。在该爬升期完成后，如实施例14中描述的，表达充足的sFLT-1以治疗或预防其BRVO或CRVO进展的患者可不需要另外的玻璃体内抗VEGF注射，尽管预期他们仍将在医师的护理之下。
在本实施例记载的研究中，在大概每月基础上评估对照和实验组中的患者的活性或新视网膜静脉阻塞和新血管化的迹象，且如果满足任意一项以下标准则用玻璃体内兰尼单抗再治疗：
-与受试者的前一次访问相比>10个早期治疗糖尿病视网膜病变研究(ETDRS)字符减少(可归因于视网膜原因)，或者与前一次访问相比>5个ETDRS字符减少连同患者感知功能丧失；
-OCT上的任何增加的、新的、或持续的神经下、视网膜色素上皮下(RPE)或视网膜内流体；
-通过FA的增加的CNV渗漏的迹象。 

Claims (199)

1.一种包含编码VEGF抑制剂的序列的核酸，其在治疗或预防人受试者中的眼部新血管化中使用；其中所述使用包括对有此需要的人受试者，对所述人受试者中的一个或多个视网膜下部位直接施用有效量的药物组合物；其中所述药物组合物包含所述核酸。
2.依照权利要求1使用的核酸，其中所述VEGF抑制剂是抗VEGF抗体或其功能片段。
3.依照权利要求1使用的核酸，其中所述VEGF抑制剂是可溶性受体、融合蛋白或其片段。
4.一种包含编码sFLT-1的序列的核酸，其在治疗或预防人受试者中的眼部新血管化中使用；其中所述使用包括对有此需要的人受试者，对所述人受试者中的一个或多个视网膜下部位直接施用有效量的药物组合物；其中所述药物组合物包含所述核酸。
5.依照权利要求4使用的核酸，其中所述sFLT-1是VEGF的抑制剂，且其中所述治疗眼部新血管化或降低眼部新血管化的可能性作为VEGF抑制的结果而发生。
6.依照权利要求4使用的核酸，其中在对所述人受试者施用所述药物组合物后至少72小时后，与所述施用前在所述人的玻璃体中的sFLT-1蛋白水平相比，所述药物组合物能升高所述人受试者的玻璃体中的sFLT-1蛋白水平。
7.依照前述权利要求中任一项使用的核酸，其中包含所述sFLT-1的核酸包含重组病毒，所述病毒选自下组：腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、辅助物依赖性腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物、Moloney鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。
8.依照权利要求7使用的核酸，其中所述重组病毒是选自下组的AAV：AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，AAV 12和其杂合体。
9.依照前述权利要求中任一项使用的核酸，其中所述编码sFLT-1的核酸可操作地连接于选自下组的启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、MMT启动子、EF-1alpha启动子、UB6启动子、鸡beta-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。
10.依照前述权利要求中任一项使用的核酸，其中所述核酸是质粒或通过病毒载体投递。
11.依照前述权利要求中任一项使用的核酸，所述使用还包括对需要治疗或降低的人受试者施用一种或多种另外的VEGF抑制剂，任选地其中所述另外的VEGF抑制剂是兰尼单抗(ranibizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)或阿柏西普(aflibercept)。
12.依照前述权利要求中任一项使用的核酸，所述使用包括对至少55岁龄的人受试者施用所述药物组合物。
13.依照前述权利要求中任一项使用的核酸，所述使用包括在小凹外施用所述药物组合物。
14.依照前述权利要求中任一项使用的核酸，其中需要治疗的所述人受试者的最佳矫正视敏度(BCVA,best corrected visual acuity)在施用有效量的所述药物组合物后改进了至少1，2，3，4或5行，如通过ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)字符表测量的。
15.依照前述权利要求中任一项使用的核酸，其中所述药物组合物的施用降低了其他抗VEGF疗法的施用频率。
16.权利要求15的核酸，其中所述其他抗VEGF疗法的施用低于每3个月一次或低于每6个月一次或低于每年一次。
17.依照前述权利要求中任一项使用的核酸，其中所述药物组合物的施用以低于一年三次的频率在人中进行。
18.药物组合物的单位剂量，其包含重组病毒，其中所述单位包含至少l x1010至3x 1012个载体基因组，且其中所述重组病毒包含可操作地连接于启动子的编码所述sFLT-1的核酸，其中所述单位剂量能在对所述人受试者施用后至少7天后升高人受试者的玻璃体中的sFLT-1蛋白水平。
19.包含重组病毒或质粒的药物组合物，其中每种重组病毒或质粒包含核酸，其中所述核酸包含可操作地连接于启动子序列的sFLT-1转基因序列，且其中所述药物组合物能在对所述人受试者施用后至少7天后升高人受试者的玻璃体中的sFLT-1蛋白水平。
20.权利要求19的药物组合物，其中所述启动子序列和所述sFLT-1转基因序列以超过300个碱基对的序列分隔开。
21.权利要求19的药物组合物，其中所述启动子序列和所述sFLT-1转基因序列以UTR序列分隔开。
22.一种药物组合物，其以下列次序包含核酸元件：
a.选自下组的启动子序列：SEQ ID No.17，SEQ ID No.18，SEQ ID No.19，SEQ ID No.20，SEQ ID No.21，SEQ ID No.22，SEQ ID No.23，SEQ IDNo.24，SEQ ID No.25，SEQ ID No.26，SEQ ID No.27，SEQ ID No.28，SEQ ID No.29，SEQ ID No.30，SEQ ID No.31和SEQ ID No.32；
b.选自下组的编码VEGF抑制剂的序列：SEQ ID No.102，SEQ ID No.103，SEQ ID No.104，SEQ ID No.105，SEQ ID No.106，SEQ ID No.107SEQID No.108或SEQ ID No.122；
c.内含子序列，其由SEQ ID No.48，SEQ ID No.115，SEQ ID No.116，SEQ ID No.117，SEQ ID No.118，SEQ ID No.119或SEQ ID No.120组成；
d.选自下组的UTR序列：SEQ ID No.91，SEQ ID No.2，SEQ ID No.92，SEQ ID No.93，SEQ ID No.94，SEQ ID No.95，SEQ ID No.96，SEQ ID No.97，SEQ ID No.98，SEQ ID No.99，SEQ ID No.100和SEQ ID No.101；和
e.选自下组的终止序列：SEQ ID No.49，SEQ ID No.50，SEQ ID No.51，SEQ ID No.52，SEQ ID No.53，SEQ ID No.54和SEQ ID No.55。
23.一种药物组合物，其以下列次序包含核酸元件：
a.选自下组的ITR序列：SEQ ID No.56，SEQ ID No.57，SEQ ID No.58，SEQ ID No.59；
b.选自下组的接头序列：SEQ ID No.60，SEQ ID No.63，SEQ ID No.68，SEQ ID No.72，SEQ ID No.76，SEQ ID No.77和SEQ ID No.84；
c.选自下组的启动子序列：SEQ ID No.17，SEQ ID No.18，SEQ ID No.19，SEQ ID No.20，SEQ ID No.21，SEQ ID No.22，SEQ ID No.23，SEQ IDNo.24，SEQ ID No.25，SEQ ID No.26，SEQ ID No.27，SEQ ID No.28，SEQ ID No.29，SEQ ID No.30，SEQ ID No.31和SEQ ID No.32，SEQ ID No.33，SEQ ID No.34，SEQ ID No.35，SEQ ID No.36，SEQ ID No.37，SEQ IDNo.38，SEQ ID No.39，SEQ ID No.40，SEQ ID No.41，SEQ ID No.42，SEQ ID No.43，SEQ ID No.44，SEQ ID No.45，SEQ ID No.46和SEQ ID No.47；
d.选自下组的接头序列：SEQ ID No.60，SEQ ID No.64，SEQ ID No.70，SEQ ID No.71，SEQ ID No.73，SEQ ID No.74，SEQ ID No.87；
e.内含子序列，其由SEQ ID No.48，SEQ ID No.115，SEQ ID No.116，SEQ ID No.117，SEQ ID No.118，SEQ ID No.119和SEQ ID No.120组成；
f.选自下组的接头序列：SEQ ID No.60，SEQ ID No.64，SEQ ID No.65，SEQ ID No.75，SEQ ID No.79，SEQ ID No.81，SEQ ID No.82和SEQ ID No.89；
g.选自下组的UTR序列：SEQ ID No.91，SEQ ID No.2，SEQ ID No.92，SEQ ID No.93，SEQ ID No.94，SEQ ID No.95，SEQ ID No.96，SEQ ID No.97，SEQ ID No.98，SEQ ID No.99，SEQ ID No.100和SEQ ID No.101；和
h.选自下组的编码VEGF抑制剂的序列：SEQ ID No.102，SEQ ID No.103，SEQ ID No.104，SEQ ID No.105，SEQ ID No.107，SEQ ID No.108和SEQ ID No.122；
i.选自下组的UTR序列：SEQ ID No.91，SEQ ID No.2，SEQ ID No.92，SEQ ID No.93，SEQ ID No.94，SEQ ID No.95，SEQ ID No.96，SEQ ID No.97，SEQ ID No.98，SEQ ID No.99，SEQ ID No.100和SEQ ID No.101；
j.选自下组的接头序列：SEQ ID No.60，SEQ ID No.62，SEQ ID No.66，SEQ ID No.67，SEQ ID No.69，SEQ ID No.83，SEQ ID No.84，SEQ ID No.85，SEQ ID No.86；
k.选自下组的终止序列：SEQ ID No.49，SEQ ID No.50，SEQ ID No.51，SEQ ID No.52，SEQ ID No.53，SEQ ID No.54和SEQ ID No.55；
l.选自下组的接头序列：SEQ ID No.60，SEQ ID No.61，SEQ ID No.80，SEQ ID No.87，SEQ ID No.88，SEQ ID No.89，SEQ ID No.90；和
m.选自下组的ITR序列：SEQ ID No.56，SEQ ID No.57，SEQ ID No.58和SEQ ID No.59。
24.一种在细胞中生成重组病毒的方法，所述方法包括：
a.将包含可操作地连接于sFLT-1转基因序列的至少1个启动子序列、ITR序列和UTR序列的核酸导入细胞，并
b.纯化所述重组病毒。
25.一种用于生成重组病毒载体的细胞，所述细胞包含可操作地连接于sFLT-1转基因序列的至少1个启动子多核苷酸序列、ITR多核苷酸序列和UTR多核苷酸序列。
26.一种用于治疗或预防人受试者中眼部新血管化的方法，包括：对需要治疗的人受试者对一个或多个视网膜下部位施用药学有效量的药物组合物，所述药物组合物包含编码VEGF抑制剂的核酸。
27.权利要求26的方法，其中所述VEGF抑制剂是针对VEGF的抗VEGF抗体或其功能片段。
28.权利要求26的方法，其中所述VEGF抑制剂是可溶性受体、融合蛋白或其功能片段。
29.一种用于治疗或预防人受试者中眼部新血管化的方法，包括：对需要治疗的人受试者对一个或多个视网膜下部位施用药学有效量的药物组合物，所述药物组合物包含编码sFLT-1的核酸。
30.权利要求29的方法，其中所述人受试者患有或怀疑患有选自下组的一种或多种疾患：年龄相关的黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新血管化、脉络膜新血管化和糖尿病视网膜病。
31.权利要求29的方法，其中所述人受试者患有或怀疑患有选自下组的一种或多种疾患：增殖性糖尿病视网膜病、视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞、分枝视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病和糖尿病性视网膜水肿。
32.权利要求29的方法，其中所述药物组合物包含重组病毒，所述病毒选自下组：腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、辅助物依赖性腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物、Moloney鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。
33.权利要求29的方法，其中所述编码sFLT-1的核酸可操作地连接于选自下组的启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、MMT启动子、EF-1alpha启动子、UB6启动子、鸡beta-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。
34.权利要求29的方法，其中所述sFLT-1核酸编码至少1个二聚化域。
35.权利要求29的方法，其中所述核酸不含有原核调控序列。
36.权利要求29的方法，其中所述核酸含有原核调控序列。
37.权利要求29的方法，其中所述核酸是质粒或通过病毒投递。
38.权利要求29的方法，其还包括对所述人受试者施用一次或多次VEGF抑制剂治疗。
39.权利要求38的方法，其中所述VEGF抑制剂在所述药物组合物施用的30，90或180天内施用。
40.权利要求38的方法，其中所述药物组合物和所述VEGF抑制剂的施用相隔至少24小时。
41.权利要求29的方法，其中将所述药物组合物对至少55岁龄的人受试者施用。
42.权利要求29的方法，其中所述施用在小凹外进行。
43.权利要求29的方法，其中所述人受试者的最佳矫正视敏度(BCVA)在施用所述药物组合物后改进了至少1，2，3，4或5行，如通过ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)字符表测量的。
44.权利要求29的方法，其中所述最佳矫正视敏度(BCVA)在施用所述药物组合物后减少了少于15个字母，如通过ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)测量的。
45.权利要求29的方法，其中所述药物组合物的施用在选自下组的条件下进行：在一只眼中施用所述药物组合物、在两只眼中序贯施用所述药物组合物和在两只眼中同时施用所述药物组合物。
46.权利要求29的方法，其中施用所述药物组合物后继之以通过荧光素血管造影术(FA)观察到的新血管化的降低。
47.权利要求29的方法，其中在注射后至少1周在所述人受试者中不存在浅表性的前段或玻璃体炎性病征。
48.权利要求29的方法，其中所述人受试者在施用所述药物组合物后至少30，60，90，120，180，270或365天不需要援救治疗。
49.权利要求32的方法，其中在所述施用步骤后未测量到增加的抗AAV细胞毒性T细胞应答。
50.权利要求32的方法，其中在施用所述药物组合物后3，7，14，21或30天在所述人受试者的血液、唾液或尿液样品中未检测到病毒。
51.权利要求29的方法，其中在所述人受试者中施用所述药物组合物后7，14，21，30，60，90，120，150，180，270或365天，所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白水平为约500–5,000pg/ml。
52.权利要求29的方法，其中所述人受试者在施用所述药物组合物之前已接受一次或多次使用VEGF抑制剂的治疗。
53.权利要求29的方法，其中所述人受试者在施用所述药物组合物之前尚未接受使用VEGF抑制剂的治疗。
54.权利要求29的方法，其中所述药物组合物的施用以低于一年3次的频率在所述人受试者中进行。
55.权利要求29的方法，其中所述药物组合物的施用降低另外的VEGF抑制剂治疗在所述人受试者中的施用频率。
56.权利要求29的方法，其中在施用所述药物组合物后7，14，21，30，60，90，120，150，180，270或365天测量时所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白的浓度升高。
57.权利要求29的方法，其中在施用所述药剂之前或一周内对所述人受试者消除玻璃体凝胶。
58.权利要求29的方法，其中使用小于20号的玻璃体切割术系统施用所述药理学药剂。
59.权利要求29的方法，其中使用小于39号的插管尖端施用所述药理学药剂。
60.权利要求29的方法，其中在用所述药理学药剂治疗后12个月内所述受试者的中央视网膜厚度不增加超过50微米，100微米，或250微米。
61.权利要求29的方法，其中在所述人受试者的患病眼中地图状萎缩(geographic atrophy)没有进展。
62.权利要求29的方法，其中所述人受试者对青霉素具有敏感性或过敏性。
63.权利要求29的方法，其中所述人受试者没有VEGF抑制剂的系统性水平的升高。
64.一种包含重组病毒或质粒的药物组合物，所述重组病毒或质粒包含核酸，该核酸包含可操作地连接于sFLT-1转基因序列的至少1个启动子序列，其中所述启动子序列和所述sFLT-1转基因序列以超过300个碱基对的序列分隔开。
65.一种包含重组病毒或质粒的药物组合物，所述重组病毒或质粒包含核酸，该核酸包含可操作地连接于sFLT-1转基因序列的至少1个启动子序列，其中所述启动子序列和所述sFLT-1转基因序列以UTR序列分隔开。
66.权利要求65的药物组合物，其中所述UTR序列包含至少10个碱基对。
67.权利要求66的药物组合物，其中所述核酸包含至少3个接头序列，该接头序列各包含至少50个碱基对。
68.药物组合物的单位剂量，其包含l x 1010至3x 1012个载体基因组的重组病毒，其中所述重组病毒包含可操作地连接于启动子的编码所述sFLT-1的核酸。
69.一种在细胞中生成重组病毒的方法，所述方法包括：
a.将包含可操作地连接于sFLT-1转基因序列的至少1个启动子序列、ITR序列和UTR序列的核酸导入细胞，并
b.纯化所述重组病毒。
70.权利要求69的方法，其中所述核酸序列不含β-内酰胺抗生素抗性序列。
71.权利要求69的方法，其中在以1x 104-lx106的感染复数转导HEK293细胞后72小时测量时，所述重组病毒产生范围为100-10,000pg/mL的sFLT-1蛋白。
72.权利要求69的方法，其中所述重组病毒抑制人脐带血管内皮(HUVEC)细胞的增殖。
73.一种用于生成重组病毒载体的细胞，所述细胞包含可操作地连接于sFLT-1转基因序列的至少1个启动子多核苷酸序列、ITR多核苷酸序列、和UTR多核苷酸序列。
74.权利要求29的方法，其中在施用所述药物组合物后1周或3，6，9或12个月时所述人受试者中不存在浅表性的前段或玻璃体炎性病征。
75.权利要求29的方法，其中所述人受试者在施用所述药物组合物后不经历视敏度丧失、IOP升高、视网膜脱落、眼内或系统性免疫应答。
76.权利要求29的方法，其中所述人受试者对使用VEGF抑制剂治疗是抗性的。
77.权利要求29的方法，其中使用不需要缝合的玻璃体切割术系统来施用所述药理学药剂。
78.权利要求29的方法，其中所述药理学药剂的施用之后是玻璃体腔中的气体/液体交换。
79.一种用于治疗或降低人受试者中的眼部新血管化的方法，包括：
对需要治疗的人受试者视网膜下施用包含药学有效量的重组病毒的药物组合物，所述重组病毒包含编码VEGF抑制剂的核酸。
80.一种用于治疗或降低人受试者中的眼部新血管化的方法，包括：
对需要治疗的人受试者视网膜下施用包含药学有效量的重组病毒的药物组合物，所述重组病毒包含编码可溶性Fms-相关酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白的核酸。
81.一种用于预防人受试者中的眼部新血管化的方法，包括：
对人受试者视网膜下施用包含药学有效量的重组病毒的药物组合物，所述重组病毒包含编码可溶性Fms-相关酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白的核酸。
82.一种用于治疗或降低患有AMD的人受试者中的脉络膜新血管化的方法，包括：
对需要AMD治疗的人受试者视网膜下施用包含药学有效量的重组病毒的药物组合物，所述重组病毒包含编码可溶性Fms-相关酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白的核酸。
83.一种用于预防患有干性AMD的人受试者中的脉络膜新血管化的方法，包括：
对人受试者视网膜下施用包含药学有效量的重组病毒的药物组合物，所述重组病毒包含编码可溶性Fms-相关酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白的核酸。
84.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述病毒选自以下病毒：腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、辅助物依赖性腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物、Moloney鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。
85.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述AAV选自下组：AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，AAV 12和其杂合体。
86.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒是从包含卡那霉素抗性标志的质粒生成的。
87.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒是从包含氨苄青霉素抗性标志的质粒生成的。
88.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒是从包含T7RNA聚合酶启动子序列的质粒生成的。
89.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒是从不包含T7RNA聚合酶启动子序列的质粒生成的。
90.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒包含氨苄青霉素抗性标志。
91.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒包含T7RNA聚合酶启动子序列。
92.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒不包含T7RNA聚合酶启动子序列。
93.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒包含选自以下的启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、MMT启动子、EF-1alpha启动子、UB6启动子、鸡beta-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。
94.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒包含增强子。
95.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒包含嵌合内含子。
96.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒包含SV40聚A序列。
97.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒包含人sFLT-1蛋白或其功能片段。
98.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述重组病毒包含调控性核酸片段，该调控性核酸片段能指导所述sFLT-1蛋白在眼细胞中的选择性表达。
99.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述药物组合物包含约1x 106至约1x 1015个重组病毒。
100.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述药物组合物包含约1x 107至约1x 1014个重组病毒。
101.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述药物组合物包含约1x 108至约1x 1013个重组病毒。
102.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述药物组合物包含约1x 109至约1x 1012个重组病毒。
103.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述药物组合物包含约1x 1010至约1x 1012个重组病毒。
104.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中经由视网膜下注射施用所述药物组合物。
105.权利要求79，80，81，82或83的方法，其还包括对所述人受试者施用药学有效量的VEGF抑制剂。
106.权利要求105的方法，其中所述VEGF抑制剂包含针对VEGF的抗体或其功能片段。
107.权利要求105的方法，其中所述VEGF抑制剂包含兰尼单抗。
108.权利要求105的方法，其中在施用所述VEGF抑制剂90天内施用所述药物组合物。
109.权利要求105的方法，其中在施用所述VEGF抑制剂后至少5，6，7，或8天时施用所述药物组合物。
110.权利要求105的方法，其中在施用所述药物组合物之前至少1次施用所述VEGF抑制剂。
111.权利要求105的方法，其中在施用所述药物组合物之后至少1次施用所述VEGF抑制剂。
112.权利要求105的方法，其中在施用所述VEGF抑制剂90天内至少2次施用所述VEGF抑制剂。
113.权利要求105的方法，其中在6至7周的时段内施用所述VEGF抑制剂。
114.权利要求82的方法，其中所述AMD是湿性AMD。
115.权利要求81的方法，其中所述人受试者有形成年龄相关的黄斑变性的风险。
116.权利要求81的方法，其中所述人受试者呈现早期年龄相关的黄斑变性的症状。
117.权利要求80或82的方法，其中所述人受试者先前已用供治疗AMD用的不同VEGF抑制剂治疗。
118.权利要求81或83的方法，其中所述人受试者的治疗眼先前尚未用供治疗AMD用的不同VEGF抑制剂治疗。
119.权利要求80或82的方法，其中先前已对所述人受试者施用供治疗AMD用的VEGF抑制剂的至少5次治疗。
120.权利要求80或82的方法，其中先前已对所述人受试者施用供治疗AMD用的VEGF抑制剂的至少10次治疗。
121.权利要求80或82的方法，其中先前已对所述人受试者施用供治疗AMD用的VEGF抑制剂的至少15次治疗。
122.权利要求80或82的方法，其中先前已对所述人受试者施用供治疗AMD用的VEGF抑制剂的至少20次治疗。
123.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中根据ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)字符表测量，所述最佳矫正视敏度(BCVA)在使用所述药物组合物的所述治疗后减少了少于15个字母。
124.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中根据ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)字符表测量，所述最佳矫正视敏度(BCVA)在使用兰尼单抗的所述治疗后改进了小于2行。
125.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述人受试者有形成干性年龄相关的黄斑变性的风险。
126.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述人受试者呈现早期干性年龄相关的黄斑变性的症状。
127.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述治疗以低于每12个月一次的频率施用。
128.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述治疗以低于每6个月一次的频率施用。
129.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述治疗以低于每18个月一次的频率施用。
130.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在所述人受试者中进行，其中受试者年龄为20岁或更大。
131.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在所述人受试者中进行，其中受试者年龄为40岁或更大。
132.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在所述人受试者中进行，其中受试者年龄为50岁或更大。
133.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在所述人受试者中进行，其中受试者年龄为65岁或更大。
134.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中对不包含小凹在内的部位进行施用。
135.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在临近于小凹的中央视网膜中进行施用。
136.权利要求80的方法，其中对所述中央视网膜的视网膜下空间的一个或多个细胞进行施用。
137.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中对外黄斑的视网膜下空间的一个或多个细胞进行施用。
138.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中对内黄斑的视网膜下空间的一个或多个细胞进行施用。
139.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中对视网膜色素上皮细胞进行施用。
140.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用没有不利影响中央视网膜功能或中央视网膜结构。
141.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在两只眼中同时进行。
142.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在两只眼中序贯进行。
143.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在一只眼中进行。
144.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中当一只眼呈现AMD症状时在另一只眼中进行所述施用步骤。
145.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在对青霉素有抗性的所述人受试者中进行。
146.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在对青霉素敏感的所述人受试者中进行。
147.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在对青霉素过敏的所述人受试者中进行。
148.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在不对青霉素过敏的所述人受试者中进行。
149.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在施用所述药物组合物后3，7，14，21或30天在所述人受试者的血液、唾液或尿液样品中未检测到载体。
150.权利要求149的方法，其中通过qPCR或ELISA检测所述病毒载体的存在。
151.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在施用所述药物组合物后7，14，21或30，60，90，120，150，180，270，365天，所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白水平为约500–5,000pg/ml。
152.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在施用所述药物组合物后7，14，21或30，60，90，120，150，180，270，365天，所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白水平为约600–4,000pg/ml。
153.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在施用所述药物组合物后7，14，21或30，60，90，120，150，180，270，365天，所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白水平为约800–3,000pg/ml。
154.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在施用所述药物组合物后7，14，21或30，60，90，120，150，180，270，365天，所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白水平为约900–2,000pg/ml。
155.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在施用所述药物组合物后7，14，21或30，60，90，120，150，180，270，365天，所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白水平为约1,000–1,800pg/ml。
156.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在施用所述药物组合物后7，14，21或30，60，90，120，150，180，270，365天，所述人受试者的玻璃体中sFLT-1蛋白水平为约4,00–1,000pg/ml。
157.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述人受试者不显示临床显著的视网膜毒性，如通过在至少两个月时段内的连续眼检查评估的。
158.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在至少两个月时段内所述人受试者中不存在浅表性的前段或玻璃体炎性病征。
159.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述人受试者在所述施用后至少120天不需要援救治疗。
160.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在所述施用后至少120天在所述人受试者中没有视敏度丧失、IOP升高、视网膜脱落或任何眼内或系统性免疫应答的迹象。
161.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在所述施用步骤后通过生物显微术(BE)和间接检眼镜检查(IOE)未观察到玻璃体的炎症。
162.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在所述施用步骤后没有细胞毒性T细胞应答。
163.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在所述施用步骤后没有在正常范围10％内的细胞毒性T细胞应答。
164.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在所述施用步骤后所述最佳矫正视敏度(BCVA)得到改进，如通过ETDRS(早期治疗糖尿病视网膜病变研究)字符表测量的。
165.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述BCVA改进了1行或更多。
166.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述BCVA改进了至少2行或更多。
167.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述BCVA改进了至少3行或更多。
168.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述BCVA改进了至少4行或更多。
169.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述BCVA改进了至少5行或更多。
170.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在所述施用步骤后继之以根据荧光素血管造影术(FA)观察到的新血管化的降低。
171.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中施用其他抗VEGF疗法的频率降低。
172.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中其他抗VEGF疗法的施用频率低于每月一次。
173.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中其他抗VEGF疗法的施用频率低于3个月。
174.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中其他抗VEGF疗法的施用频率低于6个月。
175.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中其他抗VEGF疗法的施用频率低于1年。
176.药物组合物的单位剂量，其包含约1x 106至1x 1015个重组病毒，其中每种所述重组病毒均包含编码可溶性Fms-相关酪氨酸激酶-1(sFLT-1)蛋白的核酸。
177.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其包含约1x 1010至约3x1012个重组病毒。
178.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其包含约1x 107至约1x1014个重组病毒。
179.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其包含约1x 108至约1x1013个重组病毒。
180.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其包含约1x 109至约1x1012个重组病毒。
181.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其包含约1x 1010至约1x1012个重组病毒。
182.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中所述sFLT-1蛋白包含人sFLT-1蛋白或其功能片段。
183.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中所述病毒选自以下：腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、辅助物依赖性腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合物、Moloney鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。
184.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中所述AAV选自下组：AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，AAV 12和其杂合体。
185.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中所述重组病毒包含选自以下的启动子：巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、MMT启动子、EF-1alpha启动子、UB6启动子、鸡beta-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。
186.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中所述重组病毒包含增强子。
187.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中所述重组病毒包含内含子。
188.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中所述重组病毒包含SV40聚A。
189.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中所述重组病毒包含调控性核酸片段，该调控性核酸片段能指导所述sFLT-1蛋白在眼细胞中的选择性表达。
190.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中所述重组病毒与表面活性剂一起配制。
191.权利要求168的药物组合物的单位剂量，其中使用生产者-克隆方法制造所述重组病毒。
192.权利要求168的药物组合物的单位剂量，其中使用重组杆状病毒制造所述重组病毒。
193.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中使用Ad-AAV制造所述重组病毒。
194.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中使用HEK 293细胞制造所述重组病毒。
195.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中使用昆虫细胞制造所述重组病毒。
196.权利要求176的药物组合物的单位剂量，其中使用疱疹-辅助病毒制造所述重组病毒。
197.一种治疗、降低或预防人受试者中的眼部新血管化或黄斑水肿的方法，包括视网膜下施用包含药学有效量的重组AAV基因投递载体的药物组合物，其中所述重组AAV基因投递载体指导抗血管生成因子的表达，从而使得所述载体的施用抑制人受试者中的新血管化或黄斑水肿。
198.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中所述施用步骤在没有乙肝或丙肝感染史的所述人受试者中进行。
199.权利要求79，80，81，82或83的方法，其中在施用所述药物组合物后7，14，21或30，60，90，120，150，180，270或365天测量时，所述人受试者的玻璃体中的所述sFLT-1蛋白水平升高。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108431030A (zh) * 2015-10-28 2018-08-21 辛科纳投资管理有限公司 基因疗法
CN109641065A (zh) * 2016-06-16 2019-04-16 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 使用aav2变体和阿柏西普治疗amd
CN109789176A (zh) * 2016-05-03 2019-05-21 韦恩州立大学 使用蛋白酶体抑制剂增强眼睛中病毒介导的基因递送的方法
CN110913874A (zh) * 2017-03-16 2020-03-24 谱系细胞疗法公司 用于测量视网膜疾病疗法的疗效的方法
CN111068072A (zh) * 2014-02-06 2020-04-28 建新公司 用于治疗和预防黄斑变性的组合物及方法
CN111936171A (zh) * 2017-12-19 2020-11-13 阿库斯股份有限公司 Aav介导的治疗性抗体到内耳的递送
WO2021057451A1 (zh) * 2019-09-26 2021-04-01 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗体融合蛋白及其制法和在抗肿瘤中的应用

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9730790B2 (en) 2009-09-29 2017-08-15 Edwards Lifesciences Cardiaq Llc Replacement valve and method
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
EP3693025B1 (en) 2011-04-22 2021-10-13 The Regents of The University of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
TWI698240B (zh) 2012-05-15 2020-07-11 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
US9681951B2 (en) 2013-03-14 2017-06-20 Edwards Lifesciences Cardiaq Llc Prosthesis with outer skirt and anchors
US11136557B2 (en) 2013-05-31 2021-10-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
KR101591823B1 (ko) * 2013-12-27 2016-02-04 재단법인 목암생명공학연구소 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
EP3119798B1 (en) * 2014-03-17 2020-08-05 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
TR201900649T4 (tr) * 2014-03-24 2019-02-21 Translate Bio Inc Oküler hastalıkların tedavisi için mrna tedavisi.
WO2015153889A2 (en) * 2014-04-02 2015-10-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for the treatment of latent viral infection
DK3137497T3 (da) * 2014-05-02 2021-07-12 Genzyme Corp Aav-vektorer til retinal- og cns-genterapi
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
BR112017009497A2 (pt) 2014-11-05 2018-02-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos de aadc para o tratamento da doença de parkinson
KR20230145206A (ko) 2014-11-14 2023-10-17 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
BR112017010087A2 (pt) 2014-11-14 2018-06-05 Voyager Therapeutics, Inc. composições e métodos para tratar esclerose lateral amiotrófica (ela)
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
GB201502137D0 (en) 2015-02-09 2015-03-25 Ucl Business Plc Treatment
EA201791939A1 (ru) 2015-03-02 2018-01-31 Адверум Байотекнолоджиз, Инк. Композиции и способы интравитреальной доставки полинуклеотидов в колбочки сетчатки
RS60668B1 (sr) * 2015-03-06 2020-09-30 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Terapije augmentacije gena za naslednu degeneraciju retine uzrokovanu mutacijama u genu prpf31
MX2017012097A (es) 2015-03-24 2018-06-15 Univ California Variantes de virus adenoasociado y métodos de uso de estas.
EP3294890A4 (en) * 2015-05-08 2018-10-03 Children's Medical Research Institute Promoters for expression of heterologous genes
US11103597B2 (en) 2015-05-14 2021-08-31 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Nucleic acid molecules containing spacers outside ITR
US10016514B2 (en) * 2015-05-15 2018-07-10 New Hope Research Foundation Polynucleotides, vectors and methods for insertion and expression of transgenes
CA3001594A1 (en) * 2015-10-14 2017-04-20 Audentes Therapeutics, Inc. Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
EP3383439B1 (en) 2015-12-03 2019-09-25 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Synp161, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
AU2016381964B2 (en) * 2015-12-30 2024-02-15 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
SG11201808426XA (en) 2016-04-15 2018-10-30 Univ Pennsylvania Compositions for treatment of wet age-related macular degeneration
SG10202008378UA (en) * 2016-04-15 2020-10-29 Regenxbio Inc Treatment of ocular diseases with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
RU2764587C2 (ru) 2016-05-18 2022-01-18 Вояджер Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для лечения хореи гентингтона
MX2018014154A (es) 2016-05-18 2019-05-06 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos moduladores.
LT3472317T (lt) * 2016-06-16 2022-06-27 Adverum Biotechnologies, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti neovaskuliarizacijos akyse sumažinimui
KR20230039779A (ko) 2016-07-29 2023-03-21 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변이체 캡시드를 갖는 아데노-관련된 바이러스 비리온 및 이의 사용 방법
EP3831281A1 (en) 2016-08-30 2021-06-09 The Regents of The University of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
WO2018075798A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified aav capsids and uses thereof
CN107058315B (zh) * 2016-12-08 2019-11-08 上海优卡迪生物医药科技有限公司 敲减人PD-1的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用
AU2018234918B2 (en) * 2017-03-17 2023-11-02 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression
EP3619308A4 (en) 2017-05-05 2021-01-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT FOR HUNTINGTON'S MORBUS
AU2018261790A1 (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US20210228738A1 (en) 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
WO2019018342A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. NETWORK EQUIPMENT TRACK GUIDE SYSTEM
CN110709511A (zh) 2017-08-28 2020-01-17 加利福尼亚大学董事会 腺相关病毒衣壳变体及其使用方法
CA3076905A1 (en) * 2017-09-27 2019-04-04 The Johns Hopkins University Treatment of ocular diseases with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
EP4124658A3 (en) 2017-10-16 2023-04-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
KR102205830B1 (ko) * 2017-10-26 2021-01-21 주식회사 큐로진생명과학 솔루블 VEGFR-1 변이체 cDNA를 함유하는 rAAV를 포함하는 황반변성 치료용 조성물
US10610606B2 (en) * 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
US20210010028A1 (en) 2018-03-06 2021-01-14 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
CN112154209A (zh) * 2018-05-08 2020-12-29 罗特格斯新泽西州立大学 Aav相容的层粘连蛋白—连接子聚合蛋白
EP3793615A2 (en) 2018-05-16 2021-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution of aav to improve tropism for cns
US20210207167A1 (en) 2018-05-16 2021-07-08 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
JP2021529513A (ja) 2018-07-02 2021-11-04 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療
JP2021530548A (ja) 2018-07-24 2021-11-11 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics, Inc. 遺伝子治療製剤を生産するための系および方法
TW202035689A (zh) 2018-10-04 2020-10-01 美商航海家醫療公司 測量病毒載體粒子的效價及強度之方法
WO2020112853A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Genascence Corporation Methods and compositions for treating osteoarthritis
WO2020136384A1 (en) * 2018-12-28 2020-07-02 Constable Ian Jeffery Methods of retinal administration
EP3911410A1 (en) 2019-01-18 2021-11-24 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
EP3934698A1 (en) 2019-03-04 2022-01-12 Adverum Biotechnologies, Inc. Sequential intravitreal administration of aav gene therapy to contralateral eyes
TW202106699A (zh) 2019-04-26 2021-02-16 美商愛德維仁生物科技公司 用於玻璃體內遞送之變異體aav蛋白殼
EP3962536A1 (en) 2019-04-29 2022-03-09 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors
WO2021030125A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
TW202122582A (zh) 2019-08-26 2021-06-16 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
KR20220083712A (ko) * 2019-09-20 2022-06-20 메이라지티엑스 테라퓨틱스, 인크. 주입 시스템 및 사용 방법
JP2022553640A (ja) 2019-10-10 2022-12-26 コディアック サイエンシーズ インコーポレイテッド 眼障害を処置する方法
US20230024569A1 (en) * 2019-12-04 2023-01-26 Cdmogen Co., Ltd. Composition for treating diabetic retinopathy, comprising raav containing soluble vegfr-1 variant cdna
WO2022032153A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
US20220267795A1 (en) * 2021-02-24 2022-08-25 Kinase Pharma Inc. Compositions and methods for regulating production of an angiogensis inhibitor
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
TW202246516A (zh) 2021-03-03 2022-12-01 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
TW202313096A (zh) 2021-05-28 2023-04-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 衣殼變異的重組腺相關病毒及其應用
WO2023206134A1 (en) * 2022-04-27 2023-11-02 Beijing Sightnovo Medical Technology Co., Ltd Compositions and methods for eye diseases
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020194630A1 (en) * 1999-03-15 2002-12-19 Manning William C. Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
US20060234347A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Harding Thomas C Targeting multiple angiogenic pathways for cancer therapy using soluble tyrosine kinase receptors

Family Cites Families (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4874237A (en) 1987-05-07 1989-10-17 Lions Eye Inst. Of Western Australia Electroretinogram apparatus
JP2755817B2 (ja) 1988-11-14 1998-05-25 アメリカ合衆国 パルボウイルスキャプシド
FR2643252B1 (fr) 1989-02-21 1991-06-07 Technomed Int Sa Appareil de destruction selective de cellules incluant les tissus mous et les os a l'interieur du corps d'un etre vivant par implosion de bulles de gaz
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6379885B1 (en) 1989-09-14 2002-04-30 Rijksuniversiteit Te Leiden Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines
AU650085B2 (en) 1990-11-13 1994-06-09 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
US5383917A (en) 1991-07-05 1995-01-24 Jawahar M. Desai Device and method for multi-phase radio-frequency ablation
DK0694042T3 (da) * 1993-03-25 2005-02-14 Merck & Co Inc Inhibitor af vaskulær endothelcellevækstfaktor
WO1994028143A1 (en) 1993-05-21 1994-12-08 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
AU1925195A (en) 1994-02-22 1995-09-04 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
FR2718150B1 (fr) 1994-03-29 1996-04-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5527533A (en) * 1994-10-27 1996-06-18 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method of retarding and ameliorating central nervous system and eye damage
US20020168342A1 (en) 1994-11-03 2002-11-14 Cell Genesys, Inc. Novel adenoviral vectors, packaging cell lines, recombinant adenoviruses and methods
US6040183A (en) 1995-06-07 2000-03-21 University Of North Carloina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5641749A (en) 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product
JP3345428B2 (ja) * 1996-08-20 2002-11-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 合成甲状腺ホルマン組成物を使用した眼の処置
EP0928203B1 (en) 1996-09-24 2006-10-25 Merck & Co., Inc. Compounds for the inhibition of angiogenesis by gene therapy
FR2756297B1 (fr) 1996-11-22 1999-01-08 Centre Nat Rech Scient Procede de production de virus recombinants
US6153436A (en) 1997-01-10 2000-11-28 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method of gene delivery using wildtype adeno associated viral (AAV) vectors with insertions
CA2287478C (en) 1997-04-14 2007-06-19 Richard J. Samulski Methods for increasing the efficiency of recombinant aav product
EP1173191A4 (en) 1997-05-13 2004-12-01 Univ California NOVEL ANTI-ANGIOGENIC PEPTIDE AGENTS, USE OF THE SAME FOR THERAPY AND DIAGNOSIS
US6458157B1 (en) * 1997-08-04 2002-10-01 Suaning Gregg Joergen Retinal stimulator
WO1999014354A1 (en) * 1997-09-19 1999-03-25 The Trustees Of The University Of The Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
JPH11100327A (ja) 1997-09-26 1999-04-13 Toray Ind Inc 網膜変性症治療剤
EP1019515A1 (en) 1997-10-01 2000-07-19 G.D. SEARLE &amp; CO. Fusion proteins comprising an angiostatin moiety and their use in anti-tumour treatment
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
WO1999036511A2 (en) 1998-01-16 1999-07-22 Chiron Corporation Feline immunodeficiency virus gene therapy vectors
EP1061943B1 (en) 1998-03-12 2002-10-23 Genentech, Inc. Use of fgf-5 polypeptides for preventing the death of retinal neurons and treating ocular diseases
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
AU764686B2 (en) * 1998-08-28 2003-08-28 Duke University Adenoviruses deleted in the IVa2, 100K, polymerase and/or preterminal protein sequences
CA2346262A1 (en) 1998-09-17 2000-03-23 University Of Florida Methods for treatment of degenerative retinal diseases
US20040234505A1 (en) 1998-09-23 2004-11-25 Stuart Naylor Polynucleotide constructs and uses thereof
AU3755900A (en) * 1999-03-15 2000-10-04 Chiron Corporation Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
US7306799B2 (en) * 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US7070959B1 (en) * 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
CA2387127A1 (en) 1999-10-25 2001-05-17 Therus Corporation Use of focused ultrasound for vascular sealing
NZ521952A (en) 2000-04-17 2004-03-26 Stuart Graham Method and apparatus for electrophysiological assessment of visual function using a head-mounted stereo display
US6329181B1 (en) 2000-08-07 2001-12-11 Neurologix, Inc. Helper functions for recombinant vector production
EP1357912B9 (en) * 2001-02-06 2012-06-13 QLT Inc. Photodynamic therapy of occult choroidal neovascularization linked to age-related macular degeneration
US20040102765A1 (en) 2001-03-27 2004-05-27 Karsten Koenig Method for the minimal-to non-invase optical treatment of tissues of the eye and for diagnosis thereof and device for carrying out said method
WO2002082904A2 (en) 2001-04-13 2002-10-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of treating or retarding the development of blindness
JP2002363107A (ja) 2001-06-04 2002-12-18 Noriyuki Azuma 色覚不全動物の色覚復元方法
AU2002327412A1 (en) 2001-08-02 2003-02-17 Institut Clayton De La Recherche Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
NZ535100A (en) 2002-03-20 2008-04-30 Univ Florida RAAV vector compositions and methods for the treatment of choroidal neovascularization
US7858367B2 (en) 2002-04-30 2010-12-28 Duke University Viral vectors and methods for producing and using the same
US8304233B2 (en) 2002-06-04 2012-11-06 Poetic Genetics, Llc Methods of unidirectional, site-specific integration into a genome, compositions and kits for practicing the same
US7220577B2 (en) 2002-08-28 2007-05-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Modified AAV
GB0220467D0 (en) 2002-09-03 2002-10-09 Oxford Biomedica Ltd Composition
US20100144038A1 (en) * 2003-03-04 2010-06-10 Masato Miyake Composition And Method For Increasing Efficiency Of Introduction Of Target Substance Into Cell
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US20060166363A1 (en) 2004-01-27 2006-07-27 Sergei Zolotukhin Modified baculovirus expression system for production of pseudotyped rAAV vector
NZ596663A (en) * 2004-10-21 2013-07-26 Genentech Inc Use of vegf antagonists in intraocular neovascular disease treatment
SI1809750T1 (sl) 2004-11-08 2012-08-31 Chromagenics Bv Izbira gostiteljskih celic, ki imajo visok nivo izraĹľanja proteina
US7922670B2 (en) 2005-02-24 2011-04-12 Warren Jones System and method for quantifying and mapping visual salience
DK2359867T3 (en) 2005-04-07 2015-01-05 Univ Pennsylvania A method for increasing an AAV vector function
AU2006304997B2 (en) 2005-10-20 2012-03-01 Uniqure Ip B.V. Improved AAV vectors produced in insect cells
WO2007084773A2 (en) 2006-01-20 2007-07-26 University Of North Carolina At Chapel Hill Enhanced production of infectious parvovirus vectors in insect cells
US20070190028A1 (en) 2006-02-13 2007-08-16 Jihong Qu Method and apparatus for heat or electromagnetic control of gene expression
US7384145B2 (en) 2006-02-16 2008-06-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mapping retinal function using corneal electrode array
US8118752B2 (en) 2006-02-16 2012-02-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Apparatus and methods for mapping retinal function
US8216575B2 (en) * 2006-03-31 2012-07-10 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains
JP2009535371A (ja) * 2006-05-04 2009-10-01 フォベア、ファルマスティカル、ソシエテ、アノニム 血管新生性疾患の治療のための方法
EP2029746B1 (en) * 2006-06-12 2012-07-04 Exegenics, Inc., D/b/a Opko Health, Inc. Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
GB0612096D0 (en) 2006-06-19 2006-07-26 Greater Glasgow Nhs Board Functional imaging of the retina
EP3023500B1 (en) 2006-06-21 2020-02-12 uniQure IP B.V. Insect cells for the production of aav vectors
CN101313366A (zh) 2006-06-27 2008-11-26 株式会社爱德万测试 半导体试验装置以及半导体存储器的试验方法
EP2061891B1 (en) 2006-08-24 2012-04-11 Virovek, Inc. Expression in insect cells of genes with overlapping open reading frames, methods and compositions therefor
US8075137B2 (en) 2007-02-16 2011-12-13 Objectivision Limited Stimulus method for multifocal visual evoked potential
EP1995309A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
US10696983B2 (en) 2007-05-30 2020-06-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for transducing cells with primary cilia
US8540369B2 (en) 2007-08-16 2013-09-24 The Research Foundation Of State University Of New York Led variable light source
US8518037B2 (en) 2007-10-30 2013-08-27 Boston Scientific Scimed, Inc. Radiofrequency ablation device
WO2009073551A2 (en) * 2007-11-30 2009-06-11 Scarab Genomics Llc Lac expression system
EA020969B1 (ru) 2008-02-19 2015-03-31 ЮНИКЬЮРЕ АйПи Б.В. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ПАРВОВИРУСНЫХ БЕЛКОВ Rep И Cap В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ
BRPI0908496A2 (pt) 2008-02-20 2019-01-15 Genzyme Corp inibição de angiogênese
WO2009105690A2 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 Targeted Genetics Corporation Devices and methods for delivering polynucleotides into retinal cells of the macula and fovea
ITFI20080081A1 (it) 2008-04-18 2009-10-19 Strumenti Oftalmici C S O S R Procedimento e sistema per la registrazione di risposte elettrofunzionali erg, perg e vep multifocali in tempo reale
WO2009137006A2 (en) 2008-04-30 2009-11-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
ES2330826B1 (es) 2008-06-04 2010-07-26 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad.
US9464119B2 (en) 2009-03-04 2016-10-11 Deutsches Krebsforschungszentrum Assembly activating protein (AAP) and its use for the manufacture of parvovirus particles essentially consisting of VP3
WO2010114948A2 (en) 2009-04-02 2010-10-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (raav) vectors
TWI466158B (zh) 2009-07-03 2014-12-21 Univ Lunghwa Sci & Technology 電漿測量裝置、電漿系統及測量電漿特性之方法
EP2287323A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-23 Association Institut de Myologie Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors
EP2292781A1 (en) 2009-08-17 2011-03-09 Genethon Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
US20120172419A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Medical College Of Wisconsin Research Foundation Inc. Reagents and methods for modulating cone photoreceptor activity
WO2011088081A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors
WO2011112089A2 (en) 2010-03-11 2011-09-15 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Mutated rep encoding sequences for use in aav production
CA2793633A1 (en) * 2010-03-29 2011-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
WO2011122950A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Monomeric duplex aav vectors
US9102718B2 (en) * 2010-04-30 2015-08-11 Lpath, Inc. Anti-S1P antibody treatment of patients with ocular disease
CN201704771U (zh) 2010-04-30 2011-01-12 陈福环 无水箱节水型抽水马桶
WO2011140450A1 (en) 2010-05-07 2011-11-10 Medicinelodge, Inc Dba Imds Co-Innovation Surgical rasp with radiofrequency ablation
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US20110052678A1 (en) * 2010-11-05 2011-03-03 Shantha Totada R Method for treating age related macular degeneration
DK2640743T3 (en) 2010-11-16 2017-01-23 Excelimmune Inc PROCEDURES FOR THE PREPARATION OF RECOMBINANT PROTEINS
EP3591055A1 (en) 2011-01-07 2020-01-08 Applied Genetic Technologies Corporation Promoters derived from the 5' nontranslated region (5'-ntr) of the human cyclic nucleotide gated beta 3 (cngb3) gene, expression cassettes and vectors comprising said promoters, for use treating achromatopsia and other diseases
EP3693025B1 (en) 2011-04-22 2021-10-13 The Regents of The University of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US9375491B2 (en) 2011-10-28 2016-06-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric promoter for cone photoreceptor targeted gene therapy
TWI698240B (zh) 2012-05-15 2020-07-11 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
WO2013188316A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Avalanche Biotechnologies, Inc. Optical regulation of gene expression in the retina
EP3013946B8 (en) 2013-06-28 2019-04-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for expressing a polynucleotide of interest in the retina of a subject
US20150025939A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Somnath Chatterjee Company Centric Social Media Platfonn for Content Sharing aud Tracking
EP3044318B1 (en) 2013-09-13 2019-05-01 California Institute of Technology Selective recovery
WO2015048534A1 (en) 2013-09-26 2015-04-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Synthetic combinatorial aav capsid library for targeted gene therapy
US10308957B2 (en) 2014-03-04 2019-06-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. rAAV vectors and methods for transduction of photoreceptors and RPE cells
EP3119798B1 (en) 2014-03-17 2020-08-05 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
EA201791939A1 (ru) 2015-03-02 2018-01-31 Адверум Байотекнолоджиз, Инк. Композиции и способы интравитреальной доставки полинуклеотидов в колбочки сетчатки
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020194630A1 (en) * 1999-03-15 2002-12-19 Manning William C. Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
US20060234347A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Harding Thomas C Targeting multiple angiogenic pathways for cancer therapy using soluble tyrosine kinase receptors

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LAI C M ET AL: "PRECLINICAL SAFETY EVALUATION OF SURBRETINAL AAV2 SFLT-1 IN NON-HUMAN PRIMATES", 《GENE THERAPY》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111068072A (zh) * 2014-02-06 2020-04-28 建新公司 用于治疗和预防黄斑变性的组合物及方法
CN108431030A (zh) * 2015-10-28 2018-08-21 辛科纳投资管理有限公司 基因疗法
CN108431030B (zh) * 2015-10-28 2023-10-20 辛科纳知识产权控股有限公司 基因疗法
CN109789176A (zh) * 2016-05-03 2019-05-21 韦恩州立大学 使用蛋白酶体抑制剂增强眼睛中病毒介导的基因递送的方法
CN109641065A (zh) * 2016-06-16 2019-04-16 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 使用aav2变体和阿柏西普治疗amd
CN110913874A (zh) * 2017-03-16 2020-03-24 谱系细胞疗法公司 用于测量视网膜疾病疗法的疗效的方法
CN111936171A (zh) * 2017-12-19 2020-11-13 阿库斯股份有限公司 Aav介导的治疗性抗体到内耳的递送
WO2021057451A1 (zh) * 2019-09-26 2021-04-01 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗体融合蛋白及其制法和在抗肿瘤中的应用

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Publication number Publication date
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