MX2014013933A - Tratamiento de degeneracion macular relacionada con la edad (amd) usando virus asociados con adeno (aav) sflt-1. - Google Patents

Tratamiento de degeneracion macular relacionada con la edad (amd) usando virus asociados con adeno (aav) sflt-1.

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Abstract

La descripción actual proporciona composiciones y métodos para la prevención o tratamiento de neovascularización ocular, tal como AMD, en un sujeto humano, al administrar subretinalmente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica proteína tirosina cinasa-1 relacionada con Fms (sFlt-1) soluble a un sujeto humano.

Description

TRATAMIENTO DE DEGENERACIÓN MACULAR RELACIONADA CON LA EDAD (AMD) USANDO VIRUS ASOCIADOS CON APENO (AAV) SFLT-1 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una de las causas principales de daño irreversible de la visión en personas mayores de 50 años. La AMD se divide clínicamente en dos tipos como "seca" y "húmeda". La forma húmeda de AMD puede desarrollarse rápidamente y frecuentemente da por resultado ceguera. Los cambios patológicos pueden provocar deterioro visual grave. Las manifestaciones de AMD pueden incluir, pero no se limitan a disfunción de células epiteliales del pigmento de la retina (RPE) y neovascularización coroidea (CNV) en el área macular. La fuga de fluido, RPE o desprendimiento epitelial neural y sangrado de vasos sanguíneos rotos puede presentarse en varios casos. Se ha descubierto que muchos factores celulares desempeñan funciones importantes en la regulación en la generación de CNV, que puede incluir pero no se limita al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el receptor VEGF (VEGFR), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor inducible por hipoxia (HIF), angiopoyetina (Ang) y otras citoquinas, cinasas proteínicas activadas por mitógeno (MAPK) y otros.
Un tratamiento actualmente probado para AMD húmeda es LucentisMR. El LucentisMR es un agente anti-angiogénesis y fija como objetivo todas las isoformas del Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF). Estudios clínicos han mostrado visión mejorada o estable en aproximadamente 95% de pacientes administrados con LucentisMR, comparados con aproximadamente 60% de los pacientes quienes recibieron tratamiento simulado. Aunque LucentisMR es el primer agente aprobado para mejorar la visión requiere administraciones intravitreas cada 4 semanas para beneficio visual óptimo. El EyleaMR es otro inhibidor de VEGF que se ha aprobado para tratar AMD húmeda. EyleaMR también requiere inyecciones intravitreas frecuentes cada 4-8 semanas para beneficio visual óptimo. Las vías intravenosas de administración pueden incrementar los riesgos para complicaciones serias tales como endoftalmitis infecciosa y desprendimiento de retina, por lo cual el riesgo acumulativo se incrementa con administraciones repetidas. La presión intraocular incrementada, catarata traumática, y desgarros de la retina también se han reportado. Finalmente, con un tratamiento que se suministra por un oftalmólogo, la frecuencia de tratamiento determina la carga al paciente, médico y sistema de salud en general y para el grado posible se debe reducir las limitaciones de la terapia actualmente disponible para CNV secundaria a AMD ha creado una necesidad en la téenica por procedimientos alternativos que enfrenten la alta frecuencia requeridos y la invasividad del procedimiento de tratamiento. La neovascularización que implica elevación de VEGF también puede conducir a otras patologías oculares, tal como retinopatía diabética, edema diabético macular (DME), y oclusiones de las venas de la retina (RVO). Estas enfermedades conducen a neovascularización de la retina y pérdida de la visión. Los inhibidores de VEGF tal como LucentísMR han mostrado eficacia en DME y RVO y, similar con la AMD húmeda, requieren administración intravítrea frecuente a fin de mantener el beneficio.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente descripción proporciona composiciones y métodos para tratar CNV, tal como se encuentra en la forma húmeda de AMD, en un sujeto humano.
En un aspecto, la presente descripción proporciona composiciones y métodos para tratar AMD en un sujeto humano, que comprende: administrar subretinianamente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un inhibidor de VEGF a un sujeto humano en necesidad de tratamiento para AMD. En un aspecto, la composición farmacéutica comprende un virus recombinante. En otro aspecto, el inhibidor de VEGF comprende un ácido nucleico que codifica la proteina tirosina cinasa-1 relacionada con F s soluble (sFLT-1).
En un aspecto, la présente descripción proporciona composiciones y métodos para la prevención de CNV en sujetos humanos con AMD, que comprende: administrar subretinianamente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un virus recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica la proteina tirosina cinasa-1 relacionada con Fms soluble (sFLT-1) a un sujeto humano en necesidad de un tratamiento para AMD.
En algunos aspectos, el virus se selecciona de virus asociado con adeno (AAV), adenovirus dependiente de auxiliar, retrovirus, virus de herpes simple, lentivirus, poxvirus, virus de hemaglutinatina de liposoma japonés (HVJ), virus de leucemia de murino Moloncy, y virus basado en V1H. En algunos aspectos, la cápside AAV o repeticiones terminales invertidas (ITRs) se seleccionan del grupo que consiste de: AAVl, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVll, AAVl2, rhlO, e híbridos de los mismos.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende un promotor seleccionado de promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de virus de sarcoma Rous (RSV), promotor MMT, promotor EF-1 alfa, promotor UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor de opsina.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende un potenciador.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende un intrón o intrón quimérico.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende una secuencia SV40 poli A.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende una proteina sFlt-1 humana o un fragmento funcional de la misma.
En algunos aspectos, el virus recombinante se genera a partir de un plásmido que comprende ya sea un marcador de resistencia a la ampicilina o un marcador de resistencia no a ampicilina.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende secuencias reguladoras bacterianas tal como un promotor de T7 ARN polimerasa.
En algunos aspectos, el virus recombinante carece de secuencias reguladoras bacterianas tal como un promotor de T7 ARN polimerasa.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende un fragmento de ácido nucleico regulador que es capaz de dirigir la expresión selectiva de la proteina sFlt-1 o un fragmento funcional de la misma en una célula del ojo.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica comprende de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1015 de genomas de vectores virales recombinantes, aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1014 de genomas de vectores virales recombinantes, aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1013 de genomas de vectores virales recombinantes, aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 3 x 1012 de genomas de vectores virales recombinantes, o de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 3 x 1012 de genomas de vectores virales recombinantes.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra a través de una inyección subretiniana.
En algunos aspectos, el método comprende además administrar al sujeto humano una cantidad farmacéuticamente efectiva de un inhibidor de VEGF. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF comprende un anticuerpo contra VEGF o un fragmento funcional del mismo. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF comprende ranibizumab. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra por lo menos 5, 6, 7, u 8 dias después de la administración del inhibidor de VEGF. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra dentro de 30, 60, o 90 dias de administración del inhibidor de VEGF.
En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra durante una vez antes de la administración de la composición farmacéutica que comprende el virus recombinante y 1 a 2 veces después de la administración. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra durante por lo menos 2 veces antes de la administración de la composición farmacéutica y 1 a 2 veces después de la administración. En algunos aspectos, el inhibidor VEGF se administra durante un periodo de 6 a 7 semanas.
En algunos aspectos el inhibidor VEGF es un anticuerpo anti-VEGF, tal como bevacizumab o ranibizumab. En otros aspectos el inhibidor VEGF es un receptor soluble, proteina de fusión, o fragmento de la misma, tal como aflibercept o sFLTOl.
En algunos aspectos, la AMD es AMD húmeda.
En algunos aspectos, la AMD es AMD seca.
En algunos aspectos, el sujeto humano está en riesgo de AMD húmeda.
En algunos aspectos, el sujeto humano presenta síntomas de AMD humedad de etapa temprana.
En algunos aspectos, por lo menos 3, 5, 10, 15, o 20 de tratamientos de un inhibidor de VEGF diferente para el tratamiento de AMD se ha administrado previamente al sujeto humano.
En algunos aspectos, la mejor agudeza visual corregida (BCVA) no mejoró después del tratamiento con ranibizumab.
En algunos aspectos, la mejora agudeza visual corregida (BCVA), como es medida por las letras ETDRS (Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano), mejora por más de una linea después del tratamiento con ranibizumab.
En algunos aspectos, el sujeto humano presenta síntomas de AMD seca de etapa temprana.
En algunos aspectos, el tratamiento se administra en una frecuencia de por lo menos bianualmente.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en el sujeto humano donde el sujeto es de edad de 20, 40, 50, 55, o 65 años o de más edad.
En algunos aspectos, la administración es a un sitio fuera de la fóvea.
En algunos aspectos, la administración es a una o más células del espacio subretiniano de la retina central.
En algunos aspectos, la administración es una o más células de la macula exterior.
En algunos aspectos, la administración es una o más células de la macula interior.
En algunos aspectos, la administración es a células epiteliales de pigmento de la retina.
En algunos aspectos, la administración no afecta adversamente la función de la retina central o la estructura de la retina central.
En algunos aspectos, la administración no incrementa los niveles sistémicos del inhibidor de VEGF en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la administración no incrementa los niveles sistémicos de sFlt-1 en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo simultánea, o secuencialmente en ambos ojos.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un ojo.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un ojo cuando el ojo contralateral presenta síntomas de AMD.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un sujeto humano resistente a la penicilina.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un sujeto humano sensible a la penicilina.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un sujeto humano alérgico a la penicilina.
En algunos aspectos, la etapa de administración se lleva a cabo en un sujeto humano no alérgico a la penicilina.
En algunos aspectos, la etapa de administración no provoca inflamación del humor vitreo se observa por biomicroscopía (BE) y oftalmoscopía indirecta (IOE) después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la etapa de administración no provoca una célula T citotóxica.
En algunos aspectos, la etapa de administración no provoca una respuesta de células T citotóxicas a la medición por un incremento en las células T citotóxicas de menor que 10% mayor que el intervalo de línea base.
En algunos aspectos, las células T no muestran un fenotipo efector activado después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la mejor agudeza visual corregida (BCVA) mejora por 1, 2, 3, 4 o 5 líneas o más, como es medido por las letras ETDRS (Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano), después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la reducción en la neovascularización se observa utilizando Angiografía de Fluoresceína (FA) después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la frecuencia de administración del ranibizumab se reduce a menor que 12 dosis al año. En algunos aspectos, la frecuencia de administración de aflibercept se reduce a menor que 6 dosis al año.
En algunos aspectos, ranibizumab o aflibercept u otro inhibidor de VEGF se administra con frecuencia reducida o ya no se administra.
En algunos aspectos, el virus comprende un gen sFLT-1 o un fragmento funcional del mismo con >90% de homología de secuencia a la secuencia de genes sFLT-1 humana.
En algunos aspectos, el virus administrado comprende un gen sFLT-1, una variante de gen o fragmento de gen.
En algunos aspectos, no se detecta vector en las muestras de lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano 7, 14, 21 o 30 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la presencia del vector vírico se detecta por qPC o ELISA.
En algunos aspectos, los niveles de proteína sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano es de aproximadamente 500 -5,000 mg/ml, aproximadamente 600 - 4,000 pg/ml, aproximadamente 800 - 3,000 pg/ml aproximadamente 900 -2,000 pg/ml, o aproximadamente 1,000 - 1,800 pg/ml 7, 14, 21 o 30 días después de la administración de la composición farmacéutica. En algunos aspectos, el nivel de proteína sFlt-1, que también se puede llamar la concentración de proteína sFlt-1, en el humor vitreo del sujeto humano se eleva a 7, 14, 31, 30, 60, 90, 180, 270 y 365 días después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, el sujeto humano no muestra toxicidad de la retina clínicamente significativa como es evaluado por exámenes oftálmicos en serie durante por lo menos un período de dos meses.
En algunos aspectos, signos inflamatorios de segmento anterior o vitreo, no superficiales se presentan en el sujeto humano durante por lo menos un periodo de dos meses.
En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate con un inhibidor de VEGF por lo menos 120 dias post-administración de los virus recombinantes. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate con un inhibidor de VEGF por lo menos 180 dias o por lo menos 210 dias post-administración de los virus recombinantes. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate con un inhibidor de VEGF durante por lo menos 270 días después de la administración de los virus recombinantes. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate con un inhibidor de VEGF durante por lo menos 365 dias después de la administración de los virus recombinantes.
En algunos aspectos, no hay evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación IOP, desprendimiento de la retina, o cualquier otra respuesta inmunitaria intraocular o sistémica en el sujeto humano por lo menos 180 dias o por lo menos 210 dias post-administración de los virus recombinantes. En algunos aspectos, no hay evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación IOP, desprendimiento de la retina o cualquier otra respuesta inmunitaria intraocular o sistémica en el sujeto humano por lo menos 365 dias después de la administración de los virus recombinantes.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1015de virus recombinante, en donde cada uno del virus recombinante comprende un ácido nucleico que codifica la proteina tirosina cinasa-1 relacionada con Fms soluble (sFlt-1).
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para el tratamiento o profilaxis de neovascularización ocular en el sujeto humano que comprende: administrar a uno o más sitios subretinianos una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica sFLT-1 a un sujeto humano en necesidad de tratamiento.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un sujeto humano que tiene o se sospecha de tener una o más afecciones seleccionadas del grupo que consiste de: degeneración macular relacionada con la edad (AMD), AMD húmeda, AMD seca, neovascularización de la retina, neovascularización coroidea y retinopatia diabética. En algunos casos, el sujeto humano tiene o se sospecha de tener una o más afecciones seleccionadas del grupo que consiste de: retinopatia diabética proliferativa, oclusión de las venas de la retina, oclusión de las venas de la retina central, oclusión de las venas de la retina ramificadas, edema diabético macular, isquemia diabética de la retina, retinopatía isquémica y edema diabético de la retina.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un virus recombinante, el virus seleccionado del grupo que consiste de: virus asociado con adeno (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de auxiliar, retrovirus, virus de herpes simple, lentivirus, poxvirus, complejo de virus de hemaglutinatina de liposoma japonés (HVJ), virus de leucemia de murino Moloncy, y virus basado en V1H.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un ácido nucleico que codifica la sFLT-1 que se liga operativamente a un promotor seleccionado del grupo que consiste de: promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de virus de sarcoma Rous (RSV), promotor de MMT, promotor de EF-1 alfa, promotor UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor de opsina.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un ácido nucleico sFLT-1 en donde el sFLT-1 codifica por lo menos un dominio de dierización. En algunos casos, el ácido nucleico sFLT-1 no contiene una secuencia reguladora procariota. En algunos casos, el ácido nucleico sFLT-1 no contiene una secuencia reguladora procariota.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un virus o un plásmido.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la administración de uno o más tratamientos de un inhibidor de VEGF al sujeto humano. En algunos casos, el inhibidor VEGF se administra dentro de 30, 90, o 180 dias de administración de la composición farmacéutica. En algunos casos la composición farmacéutica de la descripción y el inhibidor de VEGF se administran por lo menos 24 horas separadas.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica administrada a un sujeto humano de por lo menos 55 años de edad.
En algunos aspectos, la descripción proporciona administrar la composición farmacéutica fuera de la fóvea.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la mejora agudeza visual corregida (BCVA) del sujeto humano, para mejorar por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 lineas como es medido por las letras ETDRS (Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano) después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la mejora agudeza visual corregida (BCVA) para disminuir en menos de 15 letras como es medido por ETDRS (Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano) después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la administración de la composición farmacéutica bajo condiciones seleccionadas del grupo que consiste de: administrar la composición farmacéutica en un ojo, administrar la composición farmacéutica secuencialmente en los dos ojos, y administrar la composición farmacéutica simultáneamente en los dos ojos.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una reducción en la neovascularización como es observada por una Angiografia de Fluoresceina (FA) después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona ningún segmento anterior, superficial o signos inflamatorios vitreos están presentes en el sujeto humano por lo menos 1 semana después de la inyección.
En algunos aspectos, la descripción proporciona ningún segmento anterior, superficial o signos inflamatorios vitreos están presentes en el sujeto humano a una semana o por lo menos 3, 6, 9 o 12 meses después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona al sujeto humano que no requiere tratamiento de rescate durante por lo menos 30, 60, 90, 120, 180, 270 o 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona al sujeto humano que experimente nada de pérdida de agudeza visual, elevación IOP, desprendimiento de la retina, respuesta inmunitaria intraocular o sistémica después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona nada de respuesta de células T citotóxicas anti-AAV incrementada que es medida después de la etapa de administración.
En algunos aspectos, la descripción proporciona nada de virus detectado en las muestras de sangre, salida u orina del sujeto humano, 3, 7, 14, 21 o 30 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona niveles de proteina sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano que sea de aproximadamente 500 - 5,000 mg/ml, 7, 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 o 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la descripción proporciona al sujeto humano para recibir uno o más tratamientos con inhibidores de VEGF antes de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona al sujeto humano como resistente al tratamiento con inhibidores de VEGF.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un sujeto humano quien no ha recibido previamente un inhibidor de VEGF antes de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la administración de la composición farmacéutica en una frecuencia menor que 3 veces al año en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la administración de la composición farmacéutica para reducir la frecuencia de administración de tratamientos de inhibidor VEGF adicionales en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la descripción proporciona la concentración de proteina sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano que es elevada cuando se mide a 7, 14 , 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 o 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un sujeto humano quien tiene el gel vitreo removido antes de o dentro de un día o una semana de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica administrada utilizando un sistema de vitrectomia que es más pequeño que calibre 20.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica administrada utilizando un sistema de vitrectomia que no requiere suturas.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica administrada utilizando una punta de cánula que es más pequeña que calibre 39.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica una composición farmacéutica seguida por intercambio de gas/fluido en la cámara vitrea.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el espesor de la retina central del sujeto que no se incrementa por más de 50 mieras, 100 mieras, o 250 mieras dentro de 12 meses después de tratamiento con el agente farmacológico.
En algunos aspectos, la descripción proporciona atrofia geográfica que no progresa en el ojo enfermo del sujeto humano como es comparado con los ojos enfermos de sujetos humanos no tratados.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende virus o plásmidos recombinantes que comprenden ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia promotora ligada operativamente a una secuencia de transgen sFLT-1. En algunos casos la composición farmacéutica de la descripción comprende una secuencia promotora y la secuencia del transgen sFLT-1 separada por una secuencia mayor que 300 pares base. En algunos casos la composición farmacéutica de la descripción comprende una secuencia promotora y la secuencia de transgen sFLT-1 separada por una secuencia UTR. En algunos casos la secuencia UTR comprende por lo menos 10 pares base. En algunos casos, la composición farmacéutica comprende por lo menos 3 secuencias ligadoras que comprende cada una por lo menos 50 pares base.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica, en donde el ácido nucleico sFLT-1 codifica por lo menos 1 dominio de dimerización.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende una secuencia promotora seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18, SEQ ID No.19, SEQ ID No.20, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No.23, SEQ ID No.24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No.27, SEQ ID No.28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No.30, SEQ ID No.31, SEQ ID No.32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No.34, SEQ ID No.35, SEQ ID No.36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No.38, SEQ ID No.39, SEQ ID No.340, SEQ ID No. 41, SEQ ID No.42, SEQ ID No.43, SEQ ID No.44, SEQ ID No. 45, SEQ ID No. 46, y SEQ ID No. 47; una secuencia que codifica un inhibidor de VEGF seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID No.102, SEQ ID No. 103, SEQ ID No.104, SEQ ID No. 105, SEQ ID No.106, SEQ ID No. 107 y SEQ ID No. 108; una secuencia de intrones que consiste de SEQ ID No.48, SEQ ID No. 115, SEQ ID No. 116, SEQ ID No.117, SEQ ID No. 118, y SEQ ID No.119; una secuencia UTR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.91, SEQ ID No.2, SEQ ID No. 92, SEQ ID No. 93, SEQ ID No.94, SEQ ID No. 95, SEQ ID No. 96, SEQ ID No. 97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99, SEQ ID No.100, y SEQ ID No. 101; y una secuencia de terminación seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.49, SEQ ID No. 50, SEQ ID No.51, SEQ ID No.52, SEQ ID No.53, SEQ ID No. 54, y SEQ ID No.55.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una dosis unitaria de una composición farmacéutica que comprende virus recombinantes de lxlO6 a lxlO15 de vectores, en donde los virus recombinantes comprenden un ácido nucleico que codifica sFLT-1 operativamente ligada a un promotor. En algunos casos la dosis unitaria de la composición farmacéutica comprende lxlO10 a 3xl012 de genomas de vectores.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para generar un virus recombinante en una célula, el método que comprende: introducir en una célula, un ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia promotora ligada operativamente a una secuencia transgen sFLT-1, una secuencia ITR, una secuencia UTR; y purificar el virus recombinante. En algunos casos la secuencia UTR es una secuencia UTR humana. En algunos casos, la secuencia de ácidos nucleicos no contiene una secuencia de resistencia a antibióticos beta-lactama . En algunos casos del virus recombinante produce proteina sFLT-1 en un intervalo de 100-10,000 mg/mL cuando se mide a 72 horas después de la transducción de las células HEK293 en una multiplicidad de infección (MOI) de lxlO6. En algunos casos, el virus recombinante inhibe la proliferación de células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC).
En algunos ejemplos, la descripción proporciona una célula para generar un vector vírico recombinante, la célula que comprende por lo menos 1 secuencia de polinucleótidos promotora operativamente ligada a una secuencia transgen sFLT-1, una secuencia de polinucleótidos ITR, y una secuencia de polinucleótidos UTR.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica sFLT-1 para el uso en el tratamiento o profilaxis de neovascularización ocular en un humano; en donde el uso comprende administrar directamente a un sujeto humano en necesidad del mismo, a uno o más sitios sub-retinianos en el sujeto humano, una cantidad efectiva de una composición farmacéutica; en donde la composición farmacéutica comprende el ácido nucleico.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, en donde la sFLT-1 es un inhibidor de VEGF y en donde el tratamiento o reducción de la probabilidad de neovascularización ocular se presenta como resultado de la inhibición de VEGF.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, en donde la composición farmacéutica es capaz de elevar los niveles de la proteina sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano después de por lo menos 72 horas después de la administración de la composición farmacéutica al sujeto humano, comparados con los niveles de la proteina sFLT-1 en el humor vitreo del humano antes de la administración.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, en donde el ácido nucleico que comprende sFLT-1 comprende un virus recombinante, el virus seleccionado de grupo que consiste de: virus asociado con adeno (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de auxiliar, retrovirus, virus de herpes simple, lentivirus, poxvirus, complejo del virus de hemaglutinatina del liposoma japonés (HVJ), virus de leucemia de murino Moloncy y virus basado en V1H.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, en donde el ácido nucleico que codifica la sFLT-1 se liga operativamente a un promotor seleccionado de grupo que consiste de: promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de virus de sarcoma Rous (RSV), promotor MMT, promotor EF-1-alfa, promotor UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor de opsina.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, en donde el ácido nucleico se empaca por un virus o es ADN plásmido.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, el uso que comprende además la administración de uno o más inhibidores de VEGF adicionales al sujeto humano en necesidad de tratamiento o reducción, opcionalmente en donde el inhibidor de VEGF adicional es ranibizumab o bevacizumab.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, el uso que comprende administrar la composición farmacéutica a un sujeto de por lo menos 50, 55, o 65 años de edad.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, el uso que comprende administrar la composición farmacéutica fuera de la fóvea.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, en donde la mejora la agudeza visual corregida (BCVA) del sujeto humano en necesidad de tratamiento, mejora por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 lineas como es medida por las letras ETDRS (Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano) después de la administración de una cantidad efectiva de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, en donde la administración de la composición farmacéutica se lleva a cabo en una frecuencia por lo menos una vez por 3, 6, 9, 12, 18, o 24 meses en un sujeto humano en necesidad de tratamiento.
En algunos aspectos, la descripción proporciona el ácido nucleico para el uso, en donde la administración de la composición farmacéutica se lleva a cabo en una frecuencia menor que 3 veces al año en el sujeto humano o se lleva a cabo en una frecuencia que reduce la frecuencia de administración de los tratamientos de inhibidores de VEGF adicionales en el sujeto humano.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una dosis aproximadamente lxlO6 a lxlO15 o lxlO10 a 3xl012 de genomas de vectores. En algunos aspectos, los virus recombinantes comprenden un ácido nucleico que codifica sFLT- 1, o un fragmento funcional del mismo, ligador operativamente a un promotor.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para el tratamiento o profilaxis de neovascularización ocular en un sujeto humano que comprende: administrar a uno o más sitios subretinianos una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica un inhibidor de VEGF a un sujeto humano en necesidad de tratamiento. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento funcional del mismo. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF es un receptor soluble, proteínas de fusión, o un fragmento funcional del mismo.
Incorporación A Manera De Referencia Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente a manera de referencia en el mismo grado como si cada publicación, patente, o solicitud de patente individual se indicó específica e individualmente a ser incorporada a manera de referencia.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las características novedosas de la descripción se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas.
Un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente descripción se obtendrán por referencia a la siguiente descripción detallada que expone aspectos ilustrativos, en los cuales los principios de la descripción se utilizan, y las figuras acompañantes de las cuales: La FIGURA 1 representa la representación esquemática de un plásmido ejemplar.
Las FIGURAS 2A y 2B representan la expresión, secreción y actividad biológica de sFLT-1 de células transducidas con rAAV.sFlt-1, (FIGURA 2A) análisis de Western blot del medio acondicionado de células 293 transducidas con Ad.sFlt-1 (linea 1), células D407 transducidas con rAAV.sFlt-1 (linea 2), células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 (línea 3), y células D407 transducidas con AAV.gfp (línea 4). (FIGURA 2B) Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF mediante un medio acondicionado de células transducidas rAAV.sFlt-1. Las HUVECs se cultivaron en un medio de inanición (columna 1), en el medio que contiene VEGF recombínante (columna 2), en el medio que contiene VEGF y 40 pL del medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 (columna 3), en el medio que contiene VEGF 80 pL de medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 (columna 4), en el medio que contiene VEGF y 80 mL del medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.gfp (columna 5). (*P < 0.02, **P <0.005 para diferencias entre rAAV.sFlt-1 mas VEGF, y VEGF solamente.
La FIGURA 3A representa la gráfica que muestra la expresión sFlt-1 (hsFLT-1) humana en el humor vitreo de los monos inyectados en los ojos izquierdos con rAAV.sFlt-1 (Mono 8514, 8530, 8523, 8524 y 999), rAAV.gfp (Mono 8297 y 8532), en ambos ojos con proteina sFLT-1 recombinante (Mono 8294) y mono no inyectado de control (control). El control y los monos 8294 y 999 se sacrificaron a los 3 meses postinyección, el Mono 8524 se sacrificó a los 9 meses post inyección y los monos 8297, 8532, 8514, 8530 y 8523 se sacrificaron a los 12 meses post-inyección. * Indica niveles de proteina sFLT-1 que son significativamente más altos en los ojos inyectados con rAAV.sFlt-1 (p < 0.05). La FIGURA 3B representa gráficas que muestran los niveles de hsFLT-1 en los monos inyectados con rAAV.sFlt-1 (999, 8524, 8523, 8530 y 8514), inyectados con rAAV.gfp (8297 y 8532), inyectados con proteína sFlt-1 recombinante (8294) y no inyectados (control) en diferentes tiempos post-inyección.
FIGURAS 4A, 4B, 4C, 4D, 4E y 4F: Población de Subconjunto de Células Inmunes en ojos de ratón. Las gráficas muestran la población de subconjunto de células inmunes en diferentes tiempos post-inyección.
FIGURAS 5A, 5B, 5C, 5D y 5E: Población de Subconjuntos de Células Inmunes en bazos de ratón. Las gráficas muestran la población de subconjunto de células inmunes en diferentes tiempos post-inyección.
Las FIGURAS 6A y 6B representan diagramas que comparan las respuestas Ki67 en las células CD4+ T en diferentes ratones en diferentes tiempos post-inyección.
Las FIGURAS 7A, 7B, 7C y 7D representan varias secuencias de origen de replicación ejemplares.
Las FIGURAS 8A, 8B, 8C, 8D, 8E y 8F representan las secuencias de varios promotores ejemplares.
Las FIGURAS 9A, 9B, y 9C representan las secuencias de varios intrones ejemplares, secuencias poli A y regiones ITR.
Las FIGURAS 9D, 9E y 9F representan las secuencias de varias secuencias ligadoras ejemplares.
Las FIGURAS 9G y 9H representan la secuencia de varias secuencias UTR ejemplares.
Las FIGURAS 10A, 10B y 10C representan la secuencia que codifica varias proteínas anti-VEGF ejemplares.
La FIGURA 11A representa la secuencia de aminoácidos de sFLT-1. La FIG 11B representa la secuencia de aminoácidos del dominio 2 sFLT-1, un fragmento funcional de sFLT-1. La FIGURA 11C representa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio 2 de sFLT-1.
Las FIGURAS 12A y 12B representan las secuencias de varios genes de resistencia de antibióticos ejemplares.
La FIGURA 13 representa la PK de una composición ejemplar (rAAV.sFlt-1), en donde alcanza la expresión anti-VEGF óptima a las 6-8 semanas. RBZ es un cuidado estándar del anti-VEGF, tal como ranibizumab. "rescate RBZ" significa tratamiento de rescate.
La FIGURA 14 representa la evaluación oftalmológica de los pacientes. La inflamación se evaluó por biomicroscopía (BE) y oftalmoscopia indirecta (IOE). Unrem: inSignificativae.
Las FIGURAS 15A y 15B representan resultado de agudeza visual.
La FIGURA 16 representa la medición del espesor de la retina de un paciente a quién se le administró 24 inyecciones de Lucentis previas.
La FIGURA 17 representa la biodistribución: qPCR para la secuencia sFLT-1 (número de copias detectadas).
La FIGURA 18 representa biodistribución: cápside AAV medida por ELISA, titulo AAV en las cápsidas/mL.
La FIGURA 19 representa la biodistribución de sFLT-1 medida por el ELISA. Se muestra la concentración de sFLT-1 humana (pg/mL).
Las FIGURAS 20A y 20B representan evaluaciones OCT de pacientes administrados con ya sea dosis bajas de rAAV.sFlt-1 (Rl, R2, R4) o dosis alta de rAAV.sFlt-1 (R5, R6 y R8).
Las FIGURAS 21A y 21B representan los resultados de agudeza visual de sujetos humanos tratados con rAAV.sFlt-1 vs. pacientes de control no tratados a 180 días después del tratamiento.
Las FIGURAS 22A y 22B representan resultados de agudeza visual de sujetos humanos tratados con rAAV.sFlt-1 vs. pacientes de control no tratados a 1 año después del tratamiento.
La FIGURA 23 representa una tabla de sujetos humanos quienes recibieron inyecciones de rescate de Lucentis (re administración del inhibidor de VEGF) por semana en un estudio clínico de rAAV.sFlt-1.
La FIGURA 24 representa la agudeza visual y las imágenes SD-OCT por semana para un sujeto humano tratado con rAAV.sFlt-1 en un estudio clínico de rAAV.sFlt-1.
Las FIGURAS 25A y 25B representan datos en la producción de la proteina sFlt-1 humana en células de riñón embriónico humano 293 (HEK293) como es detectado por el ELISA. rAAV.sFlt-1 se produjo utilizando la transfección de plásmido en las células HEK293. Un segundo constructo, rAAV (bv).sFlt-1, se produjo utilizando el baculovirus recombinante en las células de insecto Sf9. La concentración de proteínas sFlt-1 se midió por el ELISA después de 72 en varios MOI.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente descripción proporciona composiciones y métodos para la prevención o tratamiento de neovascularización ocular, tal como AMD, en un sujeto humano, al administrar subcutáneamente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la proteina tirosina cinasa-1 relacionada con Fms soluble (sFlt-1) al sujeto humano.
Varios aspectos de la descripción se describen a continuación con referencia a las aplicaciones ejemplares para ilustración. Se debe entender que numeroso detalles específicos, relaciones y métodos se exponen paras proporcionar un entendimiento completo de la descripción. Una persona que tiene experiencia ordinaria en el campo relevante, sin embargo, reconocerá fácilmente que la descripción se puede practicar sin uno o más de los detalles específicos o con otros métodos. La presente descripción no se limita por el orden ilustrado de actos o eventos, ya que algunos actos pueden presentarse en diferentes órdenes y/o concurrentemente con otros actos o eventos. Adicionalmente, no todos los actos o eventos ilustrados son requeridos para implementar una metodología de acuerdo con la presente descripción.
La terminología de la presente descripción es para el propósito de describir casos particulares solamente y no se propone para ser limitante de las composiciones, métodos y composiciones de esta descripción.
Las composiciones y métodos de esta descripción como se describen en la presente pueden emplear, a menos que se indiqué de otra manera, téenicas y descripciones convencionales de biología molecular (midiendo técnicas recombinantes), biología celular, bioquímica, in unoquímica y técnicas oftálmicas, que están dentro de la experiencia de aquellas personas quienes lo practican en el campo. Tales técnicas convencionales incluyen métodos para observar y analizar la retina, o visión en un sujeto, clonación y propagación del virus recombinante, formulación de una composición farmacéutica, y purificación bioquímica e inmunoquímica. Las ilustraciones específicas de las técnicas adecuadas se pueden tener por referencia a los ejemplos en la presente. Sin embargo, los procedimientos convencionales equivalentes pueden, por supuesto, también ser utilizados. Tales técnicas y descripciones convencionales se pueden encontrar en manuales de laboratorio estándares tales como Green, y colaboradores, Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999); Weiner, y colaboradores, Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007); Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003); Bowtell y Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003); Mount, Bioinformatics: Sequence y Genome Analysis (2004); Sambrook y Russell, Condensed Protocols de Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006); y Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, N.Y. (1995); Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" IRL Press, London (1984); Nelson y Cox, Lehninger, Principies of Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman Pub., New York (2000); y Berg y colaboradores, Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., Nueva York (2002), todos de los cuales se incorporan en la presente a manera de referencia en su totalidad para todos los propósitos. Antes de las presentes composiciones, se describen herramientas y métodos de investigación, se va a entender que esta descripción no se limita a los métodos específicos, composiciones, objetivos y usos descritos, como tal pueden, por supuesto, variar. También se va a entender que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir aspectos particulares solamente y no se proponen para limitar el alcance de la presente descripción, que se limitará solo por las reivindicaciones adjuntas Como se utiliza en la presente, las formas singulares "un/una" y "el/la" se proponen para incluir las formas plurales también, a menos que el contexto lo indiqué claramente de otra manera. Adicionalmente, al grado en que los términos "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con", o variantes de los mismos se utilizan en cualquiera de la descripción detallada y/o las reivindicaciones, tales términos se proponen para ser inclusivos en una manera similar al término "que comprende".
Los intervalos se pueden expresar en la presente como de "aproximadamente" un valor particular y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando tal intervalo se expresa, otro caso incluye de un valor particular y/o al otro valor particular. Similarmente, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otro caso. Se entenderá además que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro punto final, e independientemente del otro punto final. El término "aproximadamente" como se utiliza en la presente se refiere a un intervalo que es 15% más o menos de un valor numérico establecido dentro del contexto del uso particular. Por ejemplo, aproximadamente 10 incluirla un valor de 8.5 a 11.5. El término "aproximadamente" también constituye un error típico o imprecisión en la medición de los valores.
I. AMD La AMD es la causa principal en ceguera en pacientes mayores de 50 años y se caracteriza por la degeneración progresiva de los fotoreceptores, retina exterior, y el epitelio del pigmento de la retina en la macula. La forma "húmeda" avanzada (neovascular o exudativas) de la AMD es menos común, pero puede provocar frecuentemente una pérdida rápida y frecuentemente sustancial la visión central en los pacientes. En la fórmula húmeda de la AMD, la neovascularización coroidea se forma y se desarrolla en una red de vasos gue pueden desarrollarse bajo y a través del epitelio del pigmento de la retina. Ya que esto es acompañado por la fuga de plasma y/o hemorragia en el espacio sub-retiniano, podría haber pérdida súbita grave de la visión central si esto se presenta en la mácula.
El término "AMD" no se específica de otra manera, puede ser ya sea AMD seca o AMD húmeda. La presente descripción contempla el tratamiento o prevención de AMD, AMD húmeda y/o AMD seca.
Como es conocido previamente en la téenica, la AMD ha mostrado que no tiene una causa individual. Esta enfermedad sumamente compleja puede resultar de contribuciones variables incluyendo pero no limitado a la edad, predisposición genética, y medio ambiente o combinación de los mismos. En humanos, por ejemplo, los factores de riesgo epidemiológicos establecidos pueden incluir pero no se limitan a fumar cigarro, dieta, sexo femenino, raza caucásica, e historial familiar del AMD. Debido a que la AMD es rara en individuos más jóvenes de 50 años, el único factor de riesgo requerido es la edad, que implica la multitud de cambios celulares que acompañan el envejecimiento normal en la patogénesis del AMD.
La complejidad etiológica de la AMD se refleja por la escasez relativa de las terapias efectivas, estrategias de prevención, y buenos modelos animales con los cuales se estudia. Debido a la complejidad y caracterización incompleta de la enfermedad, la AMD se modela incompletamente en animales. Esto es en parte debido a las diferencias anatómicas en las retinas de los animales y primates, asi como el tiempo prolongado necesario para que se desarrolle la enfermedad. La evidencia de los estudios genéticos moleculares humanos y animales apoya la noción de que la homeostasis alterada de una multitud de mecanismos responsables por la fisiología del fotoreceptor-RPE normal puede precipitar la enfermedad. Por lo menos en el nivel molecular, la enfermedad se puede explorar en modelos animales y, en algunos casos, aun en aquellos quienes los defectos génicos no son las causas primarias de la AMD en humanos.
Los estudios genéticos previos asi como en análisis patológicos profundos, revelan que no hay patrón de herencia simple para la AMD, y ninguna patología es común a varios modelos animales con AMD. Mientras que los modelos de primates no humanos son conocidos en la téenica para una mejor CNV aproximada en humanos, que los modelos de ratones o ratas, las diferencias fundamentales en la anatomía de la retina, histología, y a una genética de los primates no humanos producen diferentes patologías específicas de especie.
Además, y como se describe en la presente, se puede utilizar fotocoagulación con láser paras inducir la CNV, un síntoma similar a AMD en modelos animales. En algunos casos, el tratamiento con láser rompe la membrana de Bruch y provoca una respuesta proliferativa fibrovascular que se origen en el coroide. Esta respuesta es la base para modelar la neovascularización coroidea en la AMD de etapa tardía y se desarrolló en monos rhesus y cynomolgus.
Utilizando un láser de argón, los puntos se mantienen pequeños y se inducen con suficiente energía para romper la membrana de Bruch. Esto es fundoscópicamente visible como una burbuja en el momento de la fotocoagulación. La fotocoagulación induce la trombosis de los vasos coroides seguido por la re-endotealización 48 horas después y el crecimiento de nuevos vasos en el espacio sub-retiniano por una semana. Debido a que los vasos recientemente formados son más permeables, el desarrollo neovascular se puede monitorear con angiografia de fluoresceina para la evaluar la fuga de los vasos.
La involución neovascular espontanea (indicada por la fuga de fluoresceina disminuida) comienza aproximadamente de 3 a 7 semanas y luego progresa gradualmente (durante un periodo de aproximadamente 2 a 13 meses) hasta que la fuga ya no es evidente en el sitio.
El grado del nuevo crecimiento de vasos comparado con la cicatrización deficientemente vascularizada puede ser variable en todos los modelos y es influida por las especies, ubicación de la lesión en la retina, y la intensidad del haz de láser. La variabilidad inherente en las diferencias del tratamiento de las especie a especies apoya demás la idea de que ningún modelo animal recapitula completamente la AMD en humanos.
Las terapias para la AMD han cambiado durante los últimos años, con la disponibilidad de aptámeros, anticuerpos, y señuelos de receptores solubles que se ligan a la proteina VEGF. La proteina VEGF o ligando VEGF, ha mostrado que estimula la formación de nuevos vasos sanguíneos (es decir angiogénesis) a través de la ligación de los receptores celulares, incluyendo el receptor VEGF. Como se conoce en la téenica, los agentes anti-VEGF pueden prevenir, algún grado, la neovascularización y la angiogénesis que se presenta en la AMD húmeda. La inyección intraocular de MacugenMR o LucentisMR o EyleaMR (agentes anti-VEGF) es costosa, y en la mayoría de casos el tratamiento se debe repetir cada cuatro a seis semanas o cada ocho semanas en el caso de EyleaMR. Por ejemplo, Lucentis es un fragmento de anticuerpo VEGF que cuesta aproximadamente $1950/inj. Mensualmente. La Avastina (anticuerpo VEGF) se utiliza fuera de las indicaciones, y Eylea (rejilla VEGF) cuesta aproximadamente, $1850/inj y se administra cada dos meses. Todos estos medicamentos comparten problemas comunes para degradar el perfil farmacocinético y de esta manera requieren inyecciones oculares repetidas.
Existe una necesidad en el campo por una estrategia del tratamiento de larga duración, económicamente viable, práctica, la descripción proporciona una terapia novedosa para enfrentar algunas de estas necesidades.
La presente descripción proporciona una molécula anti-VEGF, tal como sFLT-1, administrada por cualquier vector adecuado (por ejemplo sistema viral recombinante) a la retina de un sujeto humano que tiene o se sospecha de tener AMD o enfermedad de la retina neovasculares relacionadas. En algunos casos, la sFLT-1 puede ser la proteina de ligación directa potente de VEGF. En algunos casos, la sFLT-1 también puede bloquear o inhibir la actividad de VEGF.
Por ejemplo, como se muestra en el campo, la sFLT-1 (como se describe en la presente adicionalmente) se ha observado que se liga al dimero de la proteina VEGF con una Kd=10 pM.
La presente invención también proporciona composiciones y métodos con relación a la administración del gen mediado por rAAV en el ojo. La expresión del gen a largo plazo en los ojos de perros (>8 años) se ha observado con un sistema basado en AAV. La expresión de sFLT-1 ARNm en la retina se mantiene durante por lo menos 18 meses. Se han conducido tres ensayos humanos para amaurosis congénita de Leber que mostraron la seguridad de un sistema de suministro basado en AAV en el contexto de una enfermedad degenerativa de la retina tal como LCA.
II. VEGF y proteina tirosina cinasa-1 relacionada con Fms (sFLT-1) A. VEGF El factor de crecimiento endotelial vascular (referido en la presente como "VEGF" o "ligando de VEGF") es un mitógeno específico de células endoteliales potentes que desempeñan una función clave en la formación de vasos sanguíneos fisiológicos. En algunos casos, la actividad VEGF resulta de la ligación del ligando VEGF a uno o más receptores VEGF en una célula. La ligación del ligando VEGF al receptor VEGF puede tener numerosos efectos celulares y bioquímicos cadena abajo, incluyendo pero no limitado a la angiogénesis en los tejidos. El VEGF se ha implicado en virtualmente cada tipo de trastorno angiogénico neovascular, incluyendo aquellos asociados con cáncer, isquemia, e inflación. Adicionalmente, el VEGF se ha implicado en enfermedades de los ojos, incluyendo pero no limitado a retinopatía isquémica, neovascularización intraocular, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), AMD húmeda, AMD seca, neovascularización de la retina, edema diabético macular, isquemia diabética de la retina, edema diabético de la retina, retinopatía diabética proliferativa, oclusión de las venas de la retina, oclusión de las venas de la retina central, oclusión de las venas de la retina ramificada. Además, los tratamientos con anti-AVGF, incluyendo las composiciones y métodos de la descripción como se describe en la presente, se pueden utilizar en el tratamiento de una o más de estas enfermedades descritas en la presente.
Los datos recientes sugieren que VEGF es el factor de crecimiento angiogénico principal en la patogénesis de la forma húmeda de la AMD.
El VEGF, un glicopéptido homodimérico de 46-kDa, se expresa por diferentes tipos de células oculares incluyendo pero no limitado a células epiteliales pigmentarias, pericitos, células endoteliales vasculares, células de neuroglia y ganglionares. En algunos casos, el VEGF se expresa en patrones espaciales y temporales específicos durante el desarrollo de la retina. En algunos casos, las isoformas humanas de VEGF pueden incluir las proteínas de 206, 189, 183, 165, 148, 145, y 121 aminoácidos por monómero, sin embargo las isoformas de VEGF humana predominantes incluyen pero no se limitan a VEGF121, VEGF165, VEG 189 y VEGF206. Estas proteínas se producen por empalme alternativo del VEGF ARNm y difieren en su capacidad de ligarse a la heparina y a los receptores o correceptores de VEGF específicos (neuropilinas). El dominio codificado por los exones 1-5 del gen VEGF contiene información requerida para el reconocimiento de los receptores VEGF conocidos KDR/FLK-1 y FLT-1. Este dominio está presente en todas las isoformas VEGF. VEGF actúa a través de estos receptores, que son tirosinas cinasas receptores de alta afinidad, que conducen a la proliferación celular endotelial, migración y vasopermeabilidad incrementada.
El VEGF es uno de los diversos factores implicados en el proceso complejo de angiogénesis y tiene una especificidad muy alta para las células endoteliales vasculares. El VEGF es un regulador de la angiogénesis fisiológica durante los procesos tal como embriogénesis, crecimiento esquelético y función reproductora, pero también se ha implicado en la angiogénesis patológica asociada con la enfermedad tal como en el cáncer, trastornos placentarios y otras condiciones. Los efectos biológicos potenciales del VEGF se pueden mediar por receptores periféricos de membrana similares a fms específicos, FLT-1 y FLK-l/KDR. En algunos casos, estos socios de ligación de origen natural de VEGF pueden afectar la ligación de VEGF a los receptores VEGF, modulando de esta manera la activación del receptor VEGF y las rutas cadena abajo subsecuentes.
Como se relaciona con el cáncer, varios inhibidores de VEGF, incluyendo un anticuerpo monoclonal humanizado a VEGF (rhuMab VEGF), un anticuerpo anti-VEGFR-2, moléculas pequeñas que inhiben la traducción de señal VEGFR-2 y un receptor VEGF soluble han mostrado algunas propiedades terapéuticas.
Como se relaciona con las enfermedades neovasculares intraoculares, tal como retinopatía diabética, oclusiones de las venas de la retina, o degeneración macular relacionada con la edad, algunos antagonistas VEGF han mostrado efectos terapéuticos, a pesar de la necesidad de administración frecuente. b. Anti-VEGF El virus recombinante de la presente descripción comprende la secuencia que codifica una proteina anti-VEGF, incluyendo, pero no limitado a las proteínas de ligación a VEGF o fragmentos funcionales de las mismas descritas en las Patentes de E.U.A. Nos 5,712,380, 5,861,484 y 7,071,159 y las proteínas de fusión a ligación a VEGF descritas en la Patente de E.U.A. No.7,635,474. Una proteína anti-VEGF también puede incluir la proteína sFLT-1 como se describe en la presente.
Los virus o plásmidos recombinantes de la presente descripción pueden comprender la secuencia que codifica una proteína anti-VEGF, incluyendo la proteína de origen natural sFlt-1, como se describe en la Patente de E.U.A.5,861,484 y aquellas secuencia descrita por SEQ ID NO: 109. También incluye, pero no se limita a fragmentos funcionales de los mismos, incluyendo secuencias de dominio 2 de sFlt-1 o aquellas expuestas en SEQ ID NO: 121, así como constructos relacionados, tal como las proteínas de fusión de ligación a VEGF en la Patente de E.U.A. No. 7,635,474. Una proteína anti-VEGF también puede incluir la proteina sFLT-1 como se describe en la presente. Estas secuencias se pueden expresar del ADN que codifica tales secuencias utilizando el código genético, una téenica estándar que es entendida por aquellas personas expertas en el campo. Como se puede apreciar por aquellas personas con experiencia en el campo, debido a la degeneración del código genético, las secuencias de proteínas anti-VEGF se pueden expresar fácilmente de un número de secuencias de ADN diferentes.
"Proteína sFlt-1" en la presente se refiere a una secuencia de polipéptidos, o fragmento funcional del mismo, con por lo menos 90%, o más, de homología a la secuencia sFLT-1 humana de origen natural, tal que la proteína sFlt-1 o polipéptido se liga al VEGF y/o al receptor VEGF. Homología se refiere al % de conservación de los residuos de una alineación entre dos secuencias (por ejemplo, como la proteína sFLT-1 humana de origen Natural puede incluir cualquiera de las variantes adecuadas de sFLT-1, incluyendo, pero no limitado a fragmentos funcionales, secuencias que comprenden inserciones, supresiones, sustituciones, pseudo fragmentos, pseudo genes, variantes de empalme o secuencias artificialmente optimizadas. En algunos casos, "proteína sFLT-1" puede ser por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% o 100% homologa a la secuencia de proteínas sFLT-1 humana de origen natural. En algunos casos, "proteína sFLT-1" puede ser a lo sumo aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% o 100% homologa la secuencia de proteínas sFLT-1 humana de origen natural. En algunos casos, "proteína sFLT-1" puede ser por lo menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% o 100% espacialmente homologa a la conformación de proteína sFLT-1 humana de origen natural. En algunos casos, "proteína sFLT-1" puede ser a lo sumo aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99% o 100% espacialmente homologa a la conformación de proteínas sFLT-1 humana de origen natural.
Además, la forma truncada soluble del receptor VEGF FLT-1, sFLT-1, es el único inhibidor específico endógeno conocido de VEGF. En la naturaleza, se genera por el empalme de ARNm alternativo y carece del dominio similar a inmunoglobulina próximo a la membrana, la región periférica transmembrana y el dominio e tirosina-cinasa intracelular. Estructuralmente, FLT-1 y la proteína sFLT-1 ambos pueden comprender múltiples dominios funcionales. En algunas variantes, FLT y proteínas sFLT comparten comúnmente 6 dominios interligados; 3 dominios implicados en la dimerización de la proteína y 3 dominios implicados en la ligación de un ligando, tal como VEGF. sFLT-1 es una forma truncada soluble de la FLT-1 y se expresa endógenamente. Como se describe en la presente FLT-1 "soluble" o sFLT-1 se refiere a FLT-1 que no se restringe a la membrana celular. La sFLT-1 no ligada puede difundirse libremente en el espacio o solución extracelular. sFLT-1 el único inhibidor especifico endógeno conocido de VEGF. Esta interacción es especifica y se puede completar con un exceso de 100 veces de VEGF no etiquetado. En algunos casos, la actividad angiostática de sFLT-1 puede resultar de la inhibición de VEGF por dos mecanismos: i) secuestro de VEGF, al cual se liga con alta afinidad, y ii) formación de heterodimeros inactivos con isoformas periféricas de membrana de los receptores VEGF FLTt-1 y FLK-l/KDR. Como se conoce en el campo, los ensayos de ligación in vitro han indicado que sFLT-1 se liga a VEGF con alta afinidad y también puede inhibir VEGF conducido por la proliferación de células endoteliales de las venas umbilicales humanas. En modelos animales para el cáncer, el sFLT-1 inhibe el crecimiento tumoral. En algunos casos, sFLT-1 puede funcionar en una manera negativa estequiométrica o dominante, un VEGF en exceso en el espacio extracelular se puede prevenir de la ligación y subsecuentemente activar del receptor VEGF. Estas propiedades del sFLT-1 se han descrito en Kendall y Thomas, 1993; Proc Nati ñcad Sel . 90:10705-10709, que se incorpora en la presente a menare de referencia en su totalidad. Como es conocido en el campo, los fragmentos funcionales de sFLT-1 se pueden utilizar en lugar de la proteina de longitud completa. Más específicamente, el dominio de ligación en la VEGF (dominio 2), o alternativamente dominio 2 de sFLT-1 más dominio 3 de sFLTl, KDR, u otro miembro de la familia, se pueden utilizar para ligar e inactivar el VEGF. Tales fragmentos funcionales se describen en Wiesmann y colaboradores, 1997; Cell, 91:695-704, que se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad. Los términos "sFLT-1" y "un fragmento funcional de sFLT-1" son equivalentes y se utilizan en la presente intercambiablemente.
III. Vectores y Virus Recombinantes Las composiciones y métodos de la descripción proporcionan el suministro de un ácido nucleico que codifica un anti-VEGF (por ejemplo proteínas sFLT-1) a las células en un sujeto humano o paciente en necesidad del mismo. En algunos casos, el suministro del ácido nucleico se puede referir como terapia génica.
La composición y métodos de la descripción proporcionan cualquier método adecuado para el suministro del ácido nucleico anti-VEGF (por ejemplo sFLT-1). En algunos casos, el suministro del ácido nucleico se puede llevar a cabo utilizando cualquier "vector" adecuado (algunas veces también referido como "suministro de genes" o "vehículo de transferencia génica"). El vector, el vehículo de suministro, el vehículo de suministro de genes o el vehículo de transferencia génica, puede referirse a cualquier molécula o complejo adecuado de moléculas que comprenden un polinucleótido que se administra a una célula objetivo. En algunos casos, una célula objetivo puede ser cualquier célula a la cual se administra el ácido nucleico o gen. El polinucleótido que se administra puede comprender una secuencia de codificación de interés en la terapia génica, tal como el gen sFLT-1.
Por ejemplo, vectores adecuados pueden incluir pero no se limitan a, vectores virales tales como adenovirus, virus asociados con adeno (AAV), y retrovirus, liposomas, otros complejos que contienen lípidos, y otros complejos macromoleculares capaces de mediar el suministro de un polinucleótido a una célula objetivo.
En algunos casos, un vector puede ser una molécula orgánica o inorgánica. En algunos casos, un vector puede ser una molécula pequeña (es decir <5 kD), o una macromolécula (es decir >5 kD). Por ejemplo un vector puede incluir pero no se limita a moléculas no biológicamente activas, inertes tales como partículas de metal. En algunos casos, un vector puede ser partículas de oro.
En algunos casos un vector puede comprender una molécula biológicamente activa. Por ejemplo, los vectores pueden comprender macromoléculas polimerizadas tales como dendrimeros.
En algunos casos, un vector puede comprender un vector vírico recombinante que incorpora uno o más ácidos nucleicos. Como se describe en la presente, ácidos nucleicos puede referirse a polinucleótidos . El ácido nucleico y polinucleótido se puede utilizar intercambiablemente. En algunos casos ácidos nucleicos pueden comprender ARN o ADN. En algunos casos, los ácidos nucleicos pueden incluir ADN o ARN para la expresión de sFLT-1. En algunos casos los ácidos nucleicos de ARN pueden incluir pero no se limitan a un transcripto de un gen de interés (por ejemplo sFLT-1), intrones, regiones no traducidas secuencias de terminaciones y similares. En otros casos, los ácidos nucleicos de ADN pueden incluir pero no se limitan a secuencias tales como secuencias de genes promotoras híbridas, secuencias promotoras consecutivas potentes, el gen de interés (por ejemplo sFLT-1), regiones no traducidas, secuencias de terminaciones y similares. En algunos casos, se puede utilizar una combinación de ADN y ARN.
Como se describe en la descripción en la presente, el término "constructo de expresión" se propone para incluir cualquier tipo de constructo genético que contenga un ácido nucleico o polinucleótido que codifiqué productos génicos en los cuales parte o todo de la secuencia de codificación de ácidos nucleicos es capaz de ser transcripta. El transcripto se puede traducir en una proteina. En algunos casos se puede traducir o no traducir parcialmente. En ciertos aspectos, la expresión incluye tanto transcripción de un gen y como traducción de un ARNm en un producto génico. En otros aspectos, la expresión incluye solamente la transcripción del ácido nucleico que codifica genes de interés.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un virus recombinante, tal como virus asociado con adeno (rAAV) como un vector para mediar la expresión de sFLT-1.
En algunos casos, el vector vírico de la descripción se puede medir como pfu (unidades formadoras de placas). En algunos casos, la pfu de los virus recombinantes, o vector vírico de las composiciones y métodos de la descripción puede ser aproximadamente 108 a aproximadamente 5 x 1010 pfu. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son por lo menos aproximadamente lxlO8 , 2xl08, 3xl08, 4xl08, 5xl08, 6xl08, 7xl08, 8xl08, 9xl08, lxlO9, 2xl09, 3xl09, 4xl09, 5xl09, bc?q9, 7xl09, 8xl09, 9xl09, lxlO10, 2xl010, 3xl010, 4xl010, y 5xl010 pfu. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son a lo sumo aproximadamente lxlO8 , 2x10s , 3c108, 4c108 , 5c108, 6c108, 7c108, 8c108, 9c108, lxlO9, 2c109, 3c109, 4x10% 5c109, 6c109, 7c109, 8c109, 9c109, lxlO10, 2c1010, 3c1010, 4c1010, y 5c1010 pfu.
En algunos casos, el vector vírico de la descripción se puede medir como genomas de vectores. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son lxlO10 a 3xl012 genomas de vectores. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son lxlO9 a 3xl013 genomas de vectores. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son lxlO8 a 3xl014 genomas de vectores. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción son por lo menos aproximadamente lxlO1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10, lxlO11, lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17, y lxlO18 genomas de vectores. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son lxlO8 a 3xl014 genomas de vectores. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción son a lo sumo aproximadamente lxlO1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10, lxlO11, lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17, y lxlO18 genomas de vectores.
En algunos casos, el vector vírico de la descripción se puede medir utilizando multiplicidad de infección (MOI). En algunos casos, la MOI puede referirse a la relación, o múltiple de genomas de vectores o virales a las células a las cuales el ácido nucleico se puede administra. En algunos casos, la MOI puede ser lxlO6. En algunos casos, la MOI puede ser lxlO5 - lxlO7. En algunos casos, la MOI puede ser lxlO4 -lxlO8. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción son por lo menos aproximadamente lxlO1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10, lxlO11, lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17, y lxlO18 de MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son lxlO8 a 3xl014 de MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción son a lo sumo aproximadamente lxlO1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10, lxlO11, lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17, y lxlO18 de MOI.
En algunos aspectos el ácido nucleico se puede suministrar sin el uso de un virus (es decir con un vector no viral), y se puede medir como la cantidad de ácido nucleico. Generalmente, cualquier cantidad adecuada de ácido nucleico se puede utilizar con las composiciones y métodos de esta descripción. En algunos casos, el ácido nucleico puede ser por lo menos aproximadamente 1 mg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, o 5g. En algunos casos, el ácido nucleico puede ser a lo sumo aproximadamente 1 mg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, l g, 2 g, 3 g, 4 g, o 5g.
En algunos aspectos, un vector auto complementario (se) se puede utilizar. El uso de vectores AAV auto-complementarios pueden evitar el requisito para la síntesis de ADN de segunda hebra viral y pueden conducir una mayor proporción de expresión de la proteína transgénica, como se proporciona por Wu, Hum Gene Ther. 2007, 18(2): 171-82, incorporada a manera de referencia en la presente.
En algunos aspectos, varios vectores AAV se pueden generar para permitir la selección del serotipo, promotor y transgen más optimo.
En algunos casos, el vector puede ser un vector objetivo, especialmente un vector objetivo que se liga selectivamente a una célula específica, tal como células cancerosas o células de tumor o células del ojo. Los vectores virales para el uso en la descripción pueden incluir aquellos que muestran baja toxicidad a una célula objetivo e inducen la producción de cantidades terapéuticamente útiles de la proteina anti-VEGF en una manera especifica de célula.
Las composiciones y métodos de la descripción proporcionan cualquiera de los sistemas de suministro de ácidos nucleicos virales adecuados incluyendo pero no limitado al uso de por lo menos uno de un virus asociado con adeno (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de auxiliar, retrovirus, virus de herpes simple, lentivirus, poxvirus, complejos del virus de hemaglutinatina de liposoma japonés (HVJ), virus de leucemia de murino Moloncy, y virus basado en V1H. De manera preferente el vector vírico comprende un promotor eucariótico potente ligado operablemente al polinucleótido por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV).
Generalmente, cualquiera de los vectores virales adecuados se puede diseñar para ser optimizados para el uso con las composiciones y métodos de la descripción. Por ejemplo, los vectores virales derivados de adenovirus (Ad) o virus asociado con adeno (AAV) se pueden utilizar. Los vectores virales tanto humanos como no humanos se pueden utilizar y el vector vírico recombinante se puede alterar tal que puede ser defectuoso de replicación en humanos. Donde el vector es un adenovirus, el vector puede comprender un polinucleótido que tiene un promotor ligado operablemente a un gen que codifica la proteina anti-VGEF y es defectuosa de replicación en humanos.
Para combinar las propiedades ventajosas de los dos sistemas de vectores virales, los vectores virales híbridos se pueden utilizar para suministrar un ácido nucleico que codifica una proteína sFLT-1 a una célula o tejido objetivo. Las téenicas estándares para la construcción de vectores híbridos son bien conocidos por aquellas personas expertas en el campo. Tales técnicas se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook, y colaboradores, en Molecular Cloning: A laboratory manual. Coid Spring Harbor, N.Y. o cualquier número de manuales de laboratorio que plantean la tecnología de ADN recombinante. Los genomas AAV de doble hebra en las cápsidas adenovirales que contienen una combinación de AAV e ITRs adenovirales se pueden utilizar para transducir células. En otra variación, un vector AAV se puede colocar en un vector adenoviral "cobarde", "dependiente de auxiliar" o "de alta capacidad". Los vectores híbridos adenovirus/AAV se plantean en Lieber y colaboradores, J. Virol.73:9314-9324, 1999. Los vectores híbrido retrovirus/adenovirus se plantean en Zheng y colaboradores, Nature Biotechnol.18: 176-186, 2000.
Los genomas retrovirales contenidos dentro de un adenovirus pueden integrarse con el genoma de la célula objetivo y llevar a cabo la expresión génica estable.
Los vectores adenovirales recombinantes defectuosos de replicación se pueden producir de acuerdo con téenicas conocidas. Ver, Quantin, y colaboradores, Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 89:2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet, y colaboradores, J. Clin . Invest . , 90:626-630 (1992); y Rosenfeld, y colaboradores , Cell , 68: 143-155 (1992).
Los vectores adicionalmente preferidos pueden incluir pero no se limitan a vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de leucemia de murino Moloncy y virus basados en V1H. En algunos casos un vector vírico basado en V1H se puede utilizar, en donde el vector vírico basado en VIH comprende por lo menos dos vectores en donde los genes gag y pol son de un genoma de VIH y el gen es de otro virus. Se pueden utilizar vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores pox tal como vectores ortopox o avipox, vectores del virus de herpes tal como un vector de virus de herpes simple I (HSV) [Geller, A.I. y colaboradores , J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., y colaboradores, in DNA Cloning: Mam alian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. y colaboradores , Proc Nati . Acad. Sci . : U.S.A.:90 7603 (1993); Geller, A.I., y colaboradores, Proc Nati . Acad. Sel USA: 87: 1149 (1990)], Adenovirus Vectors [LeGal LaSalle y colaboradores, Science, 259:988 (1993); Davidson, y colaboradores, Nat . Genet. 3: 219 (1993); Yang, y colaboradores, J. Virol. 69: 2004 (1995)] y Adeno-associated Virus Vectors [Kaplitt, M.G., y colaboradores, Na t . Genet. 8:148 (1994)], incorporado a manera de referencia en la presente.
Otros vectores virales que se pueden utilizar de acuerdo con la presente descripción incluyen vectores basados en virus de herpes simple (HSV). Los vectores HSV suprimidos de uno o más genes tempranos inmediatos (IE) son ventajosos debido a que son generalmente no citotóxicos, persisten en un estado similar a la latencia en la célula objetivo, y permiten la transducción de células objetivo eficientes. Los vectores HSV recombinantes pueden incorporar aproximadamente 30 kb de ácido nucleico heterólogo.
Los retrovirus, tales como retrovirus tipo C y lentivirus, también se pueden utilizar en la descripción. Por ejemplo, los vectores retrovirales se pueden basar en virus de leucemia de murino (MLV), como se proporciona por Hu y Pathak, Pharmacol. Rev. 52:493511, 2000 y Fong y colaboradores, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.17: 1-60, 2000, incorporada a manera de referencia en la presente. Los vectores basados en MLV pueden contener hasta 8 kb de ADN heterólogo (terapéutico) en lugar de los genes virales. El ADN heterólogo puede incluir un promotor específico de tejido y un ácido nucleico de proteína anti-VEGF. En los métodos de suministro a las células neoplásicas, también puede codificar un ligando a un receptor específico de tejido.
Se pueden utilizar vectores retrovirales adicionales incluyendo pero no limitado a vectores basados en lentivirus defectuosos de replicación, incluyendo vectores basados en inmunodeficiencia humana (V1H), como es proporcionado por Vigna and Naldini, J. Gene ed.5:308-316, 2000 y Miyoshi y colaboradores , J. Virol.72:8150-8157, 1998, incorporada en la presente a manera de referencia. Los vectores lentivirales pueden ser ventajosos en que son capaces de infectar tanto células activamente de división como de no división. También pueden ser sumamente eficientes en la transducción de células epiteliales humanas.
Los vectores lentivirales para el uso en la descripción se pueden derivar de lentivirus humanos y no humanos (incluyendo SIV). Ejemplos de vectores lentivirales incluyen secuencias de ácidos nucleicos requeridos para la propagación de vectores así como un promotor específico de tejido ligado operablemente a un gen de proteína anti-VEGF. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden incluir LTRs virales, un sitio de ligación a cebador, un tracto de polipurina, sitios att, y un sitio de encapsidación.
Un vector vírico se puede empacar en una cápside lentiviral adecuada. La sustitución de una proteina de partículas con otra forma de un virus diferente es referida como "pseudotipificación". La cápside de vector puede contener proteínas de envoltura virales de otros virus, incluyendo virus de leucemia de murino (MLV) o virus de estomatitis vesicular (VSV). El uso de la proteína VSV G produce un titulo de vector alto y da por resultado mayor estabilidad de las partículas de virus de vectores.
Los vectores basados en alfavirus, tales como aquellos fabricados de virus del bosque semliki (SFV) y virus sindbis (SIN), también se pueden utilizar en la descripción. El uso de alfa virus se describe en Lundstrom, K., Intervirology 43:247-257, 2000 y Perri y colaboradores, Journal of Virology 74:9802-9807, 2000, incorporada a manera de referencia en la presente.
Los vectores de alfavirus defectuosos de replicación, recombinantes pueden ser ventajosos debido a que son capaces de la expresión génica heteróloga de alto nivel (terapéutica), y pueden infectar un amplia gama de células objetivo. Los replicones de alfavirus se pueden fijar como objetivo a los tipos de células específicas al mostrar en su superficie del virón un ligando heterólogo funcional o dominio de ligación que permitirá la ligación selectiva a las células objetivo que expresar un socio de ligación cognado. Los replicones de alfavirus pueden establecer la latencia, y por lo tanto la expresión de ácidos nucleicos heteróloga largo plazo en una célula objetivo. Los replicones también pueden mostrar expresión de ácido nucleico heteróloga transciente en la célula objetivo.
Los vectores virales pox pueden introducir un gen en el citoplasma de la célula. Los vectores de virus avipox pueden dar por resultado solo una expresión a corto plazo del gen o ácido nucleico. Los vectores de adenovirus, vectores de virus asociados con adeno y vectores de virus de herpes simple (HSV) se pueden utilizar con las composiciones y métodos de la descripción. El vector de adenovirus puede dar por resultado una expresión a corto plazo (por ejemplo, menor que aproximadamente un mes) que el virus asociado con adeno, en algunos aspectos, y puede mostrar una expresión mucho más prolongada. El vector particular elegido puede depender de la célula objetivo y la afección que se trata.
Los virus asociados con adeno (AAV) son virus de ADN de hebra individual no envueltos pequeños. Son parvovirus humanos no patogénicos y pueden ser dependientes de virus auxiliares, incluyendo adenovirus, virus de herpes simple, virus de vaccinia y CMV, para replicación. La exposición al AAV de tipo natural (tn) no se asocia o se sabe que provoca de cualquiera de las patologías humanas y es común en la población general, usualmente presentándose en la primera década de la vida en asociación con una infección adenoviral.
Como se describe en la presente, "AAV" se refiere a virus asociado con adeno "rAAV" que se refiere a un virus asociado con adeno recombinante.
En algunos casos, el AAV de tipo natural codifica los genes rep y cap. El gen rep es requerido para la replicación viral y el gen cap es requerido para la síntesis de las proteínas de la cápside. A través de una combinación de sitios de inicio y empalme de traducción alternativa, el genoma pequeño puede ser capaz de expresar cuatro productos de gen rep y tres cap. Los productos del gen rep y las secuencias en las repeticiones terminales invertidas (145 bp de ITRs, que flanquean el genoma) pueden ser criticas en este proceso. En la actualidad, 11 serotipos de AAV se han aislado. AAV2 se puede utilizar con la composición y métodos de la descripción. Las composiciones y métodos de la descripción proporcionan el uso de cualquier serotipo AAV adecuado. En algunos aspectos, el AAV se selecciona de grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV2.5, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rhlO, e híbridos de los mismos.
En algunos aspectos, la presente descripción proporciona un virus recombinante que comprende un ácido nucleico que comprende además una forma humana del receptor 1 de VEGF soluble, truncado (sFLT-1) y es nombrado rAAV.sFlt-1. El vector es un vector vírico asociado con adeno (rAAV) deficiente de replicación, recombinante, del serotipo 2. En otro aspecto, el vector es un vector vírico asociado con adeno (rAAV) deficiente de replicación, recombinante, de serotipo 2 nombrado rAAV.sFlt-1.
El AAV2 es el más caracterizado. El rAAV2 ha mostrado que es capaz de mediar la expresión de transgen a largo plazo en los ojos de muchas especies de animales. En las ratas, el gen reportero mediado por rAAV (proteína fluorescente verde) aun estuvo presente en 18 meses post-inyección. En los monos, el mismo gen reportero estuvo presente en los 17 meses post inyección. Similarmente, los niveles de proteínas sFLT-1 altos estuvieron presentes en humor vitreo de ojos de monos inyectados con rAAV.sFlt-1 a los 15 meses post-inyección.
El rAAV.sFlt-1 se ha sometido a pruebas en modelos animales para trastornos neovasculares intraoculares. El rAAV.sFlt-1 pareció que desacelera la progresión de la neovascularización en modelos animales de neovascularización de la cornea y la neovascularización de la retina.
Interesantemente el sFlt-1 mediado por rAAV indicó alguna inhibición de la neovascularización en un modelo de mono de neovascularización coroidea (modelo para la forma húmeda de la degeneración macular relacionada con la edad o AMD). En este estudio, la presencia del constructo rAAV.sFlt-1 mostró bajos niveles de expresión de sFLT-l en los ojos de monos y, no afectó el bienestar o función de la retina de los monos. No hubo evidencia que sugiriera cualquiera de los problemas de seguridad asociados con la exposición sistémica a rAAV.sFlt-1. Los descubrimientos positivos generales y la falta de toxicidad de los vectores rAAV en estos estudios, asi como los descubrimientos con rAAV.sFlt-1 en modelos de mamíferos de neovascularización coroidea / AMD proporcionan datos de apoyo extensivos que los vectores tienen un perfil de seguridad favorable cuando se administran al ojo.
A pesar de la capacidad de rAAV.sFlt-1 para mejorar ciertos síntomas de AMD en el modelo de mono, los niveles de proteínas sFLT-l son inesperadamente bajos en la retina. Los niveles de expresión de sFLT-l conducidos por un promotor de mamífero constitutivamente activo se han mostrado en la téenica que proporcionan altos niveles de expresión de proteínas en los numerosos tipos de células. Mientras que no se limite por la teoría, pueden existir múltiples posibilidades para este nivel de expresión más bajo que el esperado. Como una proteína de multidominio grande, el sFLT-1 puede ser susceptible a la degradación proteolítica prematura, cinética de eficiente de expresión, o clasificación no óptima. Con respecto a lo último, como una proteína secretada, sFLT-1, como se expresa recombinantemente en la célula, entra a la ruta secretora. En las células de retina, incluyendo células RPE, la sFLT-1 se puede secretar ya sea apicalmente o basolateralmente, dependiendo de la clasificación de ya sea el ER o el aparato de Golgi de la proteína. En algunos casos, la clasificación óptima puede secretar la molécula a la membrana basolateral indeseada, disminuyendo de esta manera la concentración de moléculas sFLT-1 disponibles para inhibir la señalización de VEGF y la angiogénesis neovascular en la superficie apical de la capa de las células RPE.
Adicionalmente, fue desconocido en el campo como este nivel inesperado más bajo de sFLT-1 puede afectar la eficacia del fármaco hacia el tratamiento de la enfermedad AMD actual en humanos. Mientras que los niveles escasamente elevados en el modelo de mono mostraron signos prometedores de mejora de los síntomas de la AMD, el modelo animal de mono para la AMD sirve simplemente como un sustituto para la enfermedad AMD. Como se describe en la presente, los síntomas de AMD se inducen artificialmente (a través de láser) en la retina.
Mientras que este modelo es adecuado para varios análisis, la eficacia actual del fármaco en el tratamiento de síntomas en el modelo de mono es difícil de extrapolar al tratamiento de la enfermedad en humanos. Los niveles de proteína inesperadamente más bajos como son generados por el rAAV.sFlt-1 incrementan adicionalmente la dificultad en esta evaluación sin experimentos en humanos.
Además, 3 ensayos clínicos en Lebers Congenital Amaurosis (LCA) están siendo conducidos en UK y USA utilizando la cadena principal de rAAV2. LCA es una enfermedad de los ojos heredad rara que se presenta en el nacimiento o en los primeros meses de vida y se caracteriza por nistagmos, respuestas lentas o sin respuestas pupilares, y pérdida de visión grave o ceguera. En la actualidad, no se han reportado problemas de seguridad después de la inyección del constructo rAAV2 en el espacio subretiniano de 6 participantes en estos dos ensayos. Ambos equipos implicados en los ensayos clínicos concluyeron que sus descubrimientos han soportado estudios de terapia génica adicionales en pacientes con LCA.
Dadas las dificultades téenicas evidentes en la generación de niveles sustancialmente o sostenidos elevados de sFLT-1 en los monos, se pueden tomar varias estrategias de optimización para tratar uno o más de los problemas técnicos que subyacen niveles de proteínas más bajas de sFlt-1 en la retina después de la introducción de rAAV.sFlt-1. En algunos casos, las estrategias de optimización, incluyendo las que se proporcionan por la composición y métodos de esta descripción pueden incluir incrementar la optimización de la secuencia de proteínas sFlt-1, o dominios, introducir elementos de control para la clasificación correcta directa después de la expresión en las células de la retina, o elevar los niveles de la proteína sFlt-1 para compensar cualquiera de estos factores posibles. En algunos casos, la composición y los métodos de la descripción proporcionan estrategias específicas dirigidas hacia lo último, implicando la incorporación de secuencias de ácidos nucleicos específicas dirigidas hacia la mejora de los niveles de proteína elevados en las retinas humanas sobre los niveles de sFlt-1 como es observado previamente en estudios de monos. Como se describe en la presente, varias secuencias, ligadores, UTRs, intrones, variantes de sFLT-1 o combinación de los mismos se pueden utilizar para elevar los niveles de proteínas de la proteína sFlt-1 en la retina después de la exposición a rAAV.sFlt-1.
Los vectores pueden comprender componentes o funcionalidades que modulan en general el suministro de genes y/o la expresión génica, o que de otra manera proporcionan propiedades benéficas a las células objetivo. Tales otros componentes incluyen, por ejemplo, componentes que fluyen en la ligación u orientación a las células (incluyendo componentes que median la ligación de tipo celular o especifica de tejido); los componentes que influyen en la captación del ácido nucleico vector por la célula; los componentes que influyen en la localización del polinucleótido dentro de la célula después de la captación (tales como agentes que median la localización nuclear); y componentes que influyen en la expresión del polinucleótido. Tales componentes también podrían incluir marcadores, tales como marcadores detectables y/o seleccionables que se pueden utilizar para detectar o seleccionar células que se han tomado y están expresando el ácido nucleico suministrado por el vector. Tales componentes se pueden proporcionar como característica natural del vector (tal como el uso de ciertos vectores virales que tienen componentes o funcionalidades que median la ligación y captación), o vectores se pueden modificar para proporcionar tales funcionalidades.
Los marcadores seleccionables pueden ser positivos o negativos o bifuncionales. Los marcadores seleccionables positivos permiten la selección de células que llevan el marcador, mientras que los marcadores seleccionables negativos permiten que las células lleven el marcador que se elimina selectivamente. Una variedad de tales genes marcadores se han descrito, incluyendo marcadores bifuncionales (es decir, positivos/negativos) (ver, por ejemplo, Lupton, S., WO 92/08796, publicado el 29 de Mayo de 1992; y Lupton, S., WO 94/28143, publicado el 8 de Diciembre de 1994). Ejemplos de marcadores seleccionadles negativos pueden incluir la inclusión de genes de resistencia a antibióticos, tales como ampicilina y canamicina. Tales genes marcadores pueden proporcionar una medición agregada del control que puede ser ventajoso en los contextos de terapia génica. Una gran variedad de tales vectores son conocidos en la téenica y son generalmente disponibles.
En algunos casos, los ácidos nucleicos que codifican marcadores de resistencia a antibióticos pueden incluir pero no se limitan a secuencias tales como SEQ ID No.110, SEQ ID No. 111, SEQ ID No.112, SEQ ID No.113 o SEQ ID No.114.
En muchos de los vectores virales compatibles con los métodos de la descripción, uno o más promotores se pueden incluir en el vector para permitir que más de un gen heterólogo se exprese por el vector. Además, el vector puede comprender una secuencia que codifica un péptido señal u otra porción que facilita la expresión de la proteina anti-VEGF de la células objetivo.
El ácido nucleico que codifica un producto génico puede estar bajo control transcripcional por un promotor. Un "promotor", como se proporciona en la presente, se refiere a una secuencia de ADN adecuada requerida para iniciar la transcripción de un gen. La frase "bajo control transcripcional" significa que el promotor está en la ubicación y orientación correcta en relación con el ácido nucleico para controlar el inicio y expresión de la ARN polimerasa del gen. En algunos casos, el promotor puede incluir un promotor "potente" o constitutivamente activo. Por ejemplo, el promotor CMV se puede utilizar como es conocido en el campo como un promotor constitutivamente activo. En algunos casos, el promotor CMV puede comprender elementos reguladores adicionales para promover la expresión. En algunos casos, el promotor CMV puede comprender el promotor CMV inicial-temprano.
En algunos casos un promotor puede referirse como un promotor "débil", o la secuencia que produce niveles más bajos de proteina sFLT-1 que un promotor potente. En algunos casos se puede utilizar un promotor tal que un promotor conduce la expresión selectiva de sFLT-1. En algunos casos un promotor u otros elementos reguladores utilizados en combinación con otras secuencias como se describe en la presente se pueden utilizar para conducir la expresión selectiva de sFLT-1 en una célula del ojo, o tejido del ojo.
Adicionalmente, "promotor", 104 también se puede utilizar en la presente intercambiablemente para referirse a cualquiera de los módulos de control transcripcionales adecuados adicionales que se pueden presentar alrededor del sitio de inicio para ARN polimerasas. Las composiciones y métodos de esta descripción pueden utilizar cualquiera de los promotores adecuados y módulos de control transcripcionales para la expresión de un transgen, 106. Los módulos de control transcripcionales adicionales pueden incluir pero no se limitan a elementos tales como HSV timidina cinasa (tk) y unidad de transcripción tempranas SV40. Generalmente, los promotores se pueden componer de módulos funcionales discretos, que consisten cada uno de aproximadamente 7-20 bp de ADN, o 20-5000 bp de ADN, y contienen uno o más sitios de reconocimiento para las proteínas activadoras o represoras transcripcionales. La composición y métodos de la descripción proporcionan cualquiera de las secuencias reguladoras adecuadas o combinación de las mismas. En algunos casos, estas secuencias de módulos de control transcripcionales se pueden referir para o identificar como secuencias potenciadoras o represoras.
Por lo menos un módulo en cada promotor funciona para colocar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. Un ejemplo es la secuencia TATA. Otro ejemplo puede incluir algunos promotores que carecen de una secuencia TATA, tal como el promotor para el gen de desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor para los genes tardíos SV40, un elemento discreto que traslapa el sito de inicio mismo ayuda a fijar la colocación de inicio.
Los elementos promotores adicionales regulan la frecuencia del inicio transcripcional. Generalmente, esto se sitúa en una región 30-110 bp cadena arriba del sitio de inicio, aunque una variedad de promotores pueden contener elementos funcionales cadena debajo de sito de inicio también. El espaciamiento entre los elementos promotores puede se frecuentemente flexible, de modo que la función promotora se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven relativos entre sí. En el promotor tk por ejemplo, el espaciamiento entre los elementos promotores se puede incrementar a 50 bp aparte antes de que comience la actividad a disminuir. Dependiendo del promotor, los elementos individuales pueden colocarse para funcionar ya sea cooperativamente o independientemente para activar la transcripción.
Las composiciones y métodos de la descripción proporcionan cualquiera de las secuencias adecuadas para el control de la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos de interés en la célula objetivo. De esta manera, donde se fija como objetivo una célula humana, las secuencias pueden hacer que el ácido nucleico que codifica la región se puede diseñar para estar adyacente a y bajo el control de un promotor de ser capaz de ser expresado en una célula humana. Generalmente, tal promotor podría incluir ya sea un promotor humano o viral.
En varios aspectos de la descripción, el promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV) (ie-CMV), el promotor temprano SV40, en la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous, b-actina, el promotor de insulina de rata y la gliceraldehído-3-fosfato de deshidrogenasa se pueden utilizar para obtener un alto nivel de expresión de la secuencia de codificación de interés (por ejemplo sFLT-1). El uso de otros promotores celulares de mamífero o fago bacterianos que son bien conocidos en el campo para lograr la expresión de una secuencia de codificación de interés se contempla también, con la condición de que los niveles sean suficientes para un propósito dado. En algunos aspectos, las secuencias reguladoras procarióticas pueden estar presentes en el vector, tal como la secuencia del promotor de T7 ARN polimerasa. En otros aspectos, el vector está libre de tales secuencias reguladoras. Al emplear un promotor con propiedades conocidas, el nivel y patrón de expresión de la proteína de interés después de la transfección y transformación se puede optimizar.
La selección de un promotor que se regula en respuesta a señales fisiológicas o sintéticas especificas puede permitir la expresión inducible del producto génico. Por ejemplo en el caso donde la expresión de un transgen, o transgenes cuando un vector multicistronico se utiliza, es tóxica a las células en las cuales el vector se produce en, puede ser deseable para prohibir o reducir la expresión de uno o más de los transgenes. Ejemplos de transgenes que pueden ser tóxicos a la linea de células productoras son genes pro-apoptóticos y citoquinas. Varios sistemas promotores inducidles son disponibles para la producción de vectores virales donde el producto transgénico puede ser tóxico. La composición y métodos de la descripción proporcionan cualquier combinación adecuada de secuencia promotora, secuencia reguladora y transgen. En algunos casos, una combinación de secuencias puede dar por resultado una toxicidad a la célula. En algunos casos, una combinación de secuencias puede dar por resultado alta toxicidad a la célula. En algunos casos, una combinación de secuencias puede dar por resultado niveles moderados de toxicidad en la célula.
El sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) es uno de tal sistema para la expresión transgénica. Este sistema se diseña para permitir la expresión regulada de un gen de interés en las células de mamífero. Consiste de un mecanismo de expresión estrechamente regulado que permite poca expresión de nivel basal del transgen, pero una capacidad de inducción de más de 200 veces. El sistema se basa en el receptor de ecdisona heterodimérico de Drosophila, y cuando el ecdisona o un análogo tal como muristerona A se liga al receptor, el receptor activa un promotor para activar la expresión de los altos niveles de transgen cadena abajo de los transcriptos de ARNm. En este sistema, ambos monómeros del receptor heterodimérico se expresan constitutivamente de un vector, mientras que el promotor sensible a la ecdisona que conduce la expresión del gen de interés es otro plásmido. El diseño de este tipo de sistema en el vector de transferencia génica de interés se puede utilizar en las composiciones y métodos de esta descripción. La co-transfección de los plásmidos que contiene el gen de interés y los monómeros receptores en la línea de células productoras entonces permitiría la producción del vector de transferencia génica sin la expresión de un transgen potencialmente tóxico. En el tiempo apropiado, la expresión del transgen se podría activar con la ecdisona o muristerona A.
En algunas circunstancias puede ser deseable regular la expresión de un transgen en un vector de terapia génica. Por ejemplo, los diferentes promotores virales con resistencias variantes de actividad se pueden utilizar dependiendo del nivel de la expresión deseada. En las células de mamífero, el promotor temprano inmediato CMV se puede utilizar para proporcionar la activación transcripcional potente. Las versiones modificadas del promotor CMV que son menos potentes también se han utilizado cuando los niveles reducidos de expresión del transgen se desean. Cuando la expresión de un transgen en las células hematopoyéticas se desea, los promotores retrovirales tales como LTRs (Repetición Terminal Larga) de MLV o MMTV se utilizan frecuentemente. Otros promotores virales que se pueden utilizar dependiendo del efecto deseado incluyen SV40, RSV LTR, HIV-1 y HIV-2 LTR, promotores de adenovirus tales como de la región E1A, E2A, o MLP AAV LTR, Virus del mosaico de la coliflor, HSV-TK, y virus de sarcoma aviar.
En algunos aspectos, los promotores específicos del tejido se utilizan para llevar a cabo la transcripción en tejidos o células específicos para reducir la toxicidad potencial o efectos indeseados a los tejidos no objetivos. Por ejemplo, los promotores tal como PSA, probasina, ácido prostético fosfatasa o calicreína glandular especifica de próstata (hK2) se pueden utilizar para fijar como objetivo la expresión génica en la próstata.
En algunos casos, los promotores o elementos de secuencia reguladoras se pueden utilizar para dirigir la expresión selectiva en las células de los ojos o del tejido del ojo. Por ejemplo, el promotor, elementos de secuencia o secuencias reguladoras encontradas en los tipos de células de los ojos específicos, tales como células epiteliales de pigmento de la retina, se pueden utilizar en un constructo de expresión adecuado (por ejemplo, el promotor RPE65 o VMD2).
La selección de promotores asociados se puede lograr fácilmente. En algunos casos una expresión alta o promotor potente se pueden utilizar. Un ejemplo de un promotor adecuado es el promotor de citomegalovirus (CMV) de 763 pares bases. El virus de sarcoma Rous (RSV) (Davis, y colaboradores, Hum Gene Ther 4: 151 (1993)) y los promotores MMT también se pueden utilizar. Ciertas proteínas se pueden expresar utilizando su promotor nativo. Otros elementos que pueden mejorar la expresión también se pueden incluir tal como un potenciador o un sistema que da por resultado altos niveles de expresión tal como un gen tat y el elemento tar. Este casete luego se puede insertar en un vector, por ejemplo, un vector plásmido tal como, pUC19, pUC118, pBR322, u otros vectores plásmidos conocidos, que incluye, por ejemplo, un origen de E. coli de replicación. Ver, Sambrook, y colaboradores , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory press, (1989). Los promotores se plantean infra. El vector plásmido también puede incluir un marcador seleccionadle tal como el gen b-lactamasa para resistencia a la ampicilina, con la condición de que el polipéptido marcador no afecté adversamente el metabolismo del organismo que se trata. El casete también se puede ligar a una porción de ligación a ácido nucleico en un sistema de suministro sintético, tal como el sistema descrito en WO 95/22618, incorporada a manera de regencia. Generalmente las secuencias promotoras y/o cualquiera de las secuencias reguladoras asociadas pueden comprender aproximadamente por lo menos 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp, 5000 bp o 10000 bp. Las secuencias promotoras y cualquiera de las secuencias reguladoras asociadas, pueden comprender aproximadamente a lo sumo 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp, 5000 bp o 10000 bp.
En algunos aspectos, el virus recombinante o plásmido comprende un promotor seleccionado del promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de virus de sarcoma Rous (RSV), y promotor MMT, promotor EF-1 alfa, promotor UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor de opsina. Generalmente, las secuencias promotoras y las secuencias promotoras/potenciadoras como se proporcionan por la presente descripción pueden incluir pero no se limitan a cualquiera de las secuencias seleccionadas de SEQ ID No. 17, SEQ ID No.18, SEQ ID No. 19, SEQ ID No.20, SEQ ID No. 21, SEQ ID No.22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No.24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No.26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No.28, SEQ ID No. 29, SEQ ID No.30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No.32, SEQ ID No. 33, SEQ ID No.34, SEQ ID No. 35, SEQ ID No.36, SEQ ID No.37, SEQ ID No. 38, SEQ ID No.39, SEQ ID No.340, SEQ ID No. 41, SEQ ID No.42, SEQ ID No. 43, SEQ ID No.44, SEQ ID No.45, SEQ ID No.46, y SEQ ID No.47.
En algunos aspectos, se utiliza un marcador de antibióticos en el proceso para la producción de virus recombinante. Los marcadores de resistencia a antibióticos se pueden utilizar para identificar las células transgénicas positivas en la generación del virus recombinante. En algunos aspectos, el marcador de antibióticos comprende una secuencia que codifica un gen de resistencia a antibióticos, tales como aquellos proporcionados en la presente incluyendo pero no limitados a secuencias conocidas en las Figura 8D y Figura 8B. Por ejemplo los marcadores que confieren resistencia pueden incluir pero no se limitan a canamicina, gentamicina, ampicilina, cloranfenicol, tetracielina, doxiciclina, o higromicina. En algunos aspectos, el gen de resistencia a antibióticos es un gen de resistencia a antibióticos no de beta-lactama tal como canamicina.
En algunos aspectos, el virus y/o plásmido recombinante utilizados para generar el virus recombinante, comprenden una secuencia que codifica una secuencia de origen de replicación, tal como aquellas proporcionadas en la presente. El origen de las secuencias de replicación, proporcionan generalmente secuencias útiles para propagar un plásmido. Generalmente, el origen de las secuencias de replicación como se proporciona por la presente descripción puede incluir pero no se limita a cualquiera de las secuencias seleccionadas de las secuencias como se proporciona en las Figura 7A, Figura 7B, Figura 7C y Figura 7D.
En algunos aspectos, un origen de las secuencias de replicación pueden incluir pero no se limita a las secuencias tales como SEQ ID No. 1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6, SEQ ID No.7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No.9, SEQ ID No.10, SEQ ID No.11, SEQ ID No.12, SEQ ID No.13, SEQ ID No.14, SEQ ID No.15, SEQ ID No.16, o SEQ ID No.17.
En algunos aspectos, el virus y/o plásmido recombinantes utilizados para generar el virus recombinante, comprenden un potenciador, tales como aquellos proporcionados en la presente.
En algunos aspectos, el virus y/o plásmido recombinante utilizado para generar el virus recombinante, comprenden un intrón quimérico o un intrón 105 tales como aquellos proporcionados en la presente y se describen en la Patente de E.U.A. No. 7635474, incorporada a manera de regencia en la presente. El intrón o el intrón quimérico se pueden utilizar intercambiablemente en la presente. En algunos casos, un intrón puede referirse a cualquier secuencia que se pueda transcribir pero no traducir. En algunos casos, un intrón puede referirse a cualquier secuencia que transcribe y se remueve de un transcrito de ARN maduro en una célula. En algunos casos, un intrón puede comprender aproximadamente por lo menos 1 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp o 5000 bp. En algunos casos, un intrón puede comprender aproximadamente por lo menos 1 bp, 50 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 bp o 5000 bp. En algunos casos, en algunos casos un intrón puede ser de aproximadamente 300 bp. En algunos casos, un intrón puede ser de aproximadamente 200-400 bp. En algunos casos, un intrón quimérico puede ser de aproximadamente 100 - 500 bp. En algunos casos, un intrón puede ser de aproximadamente 50 -200 bp. En algunos casos, un intrón puede ser ya sea un intrón de origen natural intacto o un intrón quimérico.
En algunos aspectos, un intrón puede incluir pero no se limita a secuencias tales como SEQ ID No.48, SEQ ID No.115, SEQ ID No.116, SEQ ID No. 117, SEQ ID No.118, SEQ ID No. 119 o SEQ ID No.120.
En algunos aspectos, el virus y/o plásmido recombinante utilizados para generar el virus recombinante, comprenden una secuencia poliA (poliadenilación), 107, tales como aquellas proporcionadas en la presente (por ejemplo, secuencia SV40 poliA). Generalmente, cuando cualquier secuencia poli A adecuada se puede utilizar para la expresión deseada del transgen (es decir sFLT-1). Por ejemplo, en algunos casos, la presente descripción proporciona una secuencia que comprende la secuencia SV40 poliA, o porción de la secuencia SV40 poliA. En algunos casos, las secuencias poliA nativas como son encontradas cadena abajo (3'UTR) del gen sFLT-1 humano como es encontrado en la secuencia genómica humana se puede utilizar. En otros casos, las secuencias poliA como se encuentra cadena debajo de los genes diferentes al sFLT-1 se pueden utilizar. En otros casos, la presente descripción proporciona secuencias poliA que comprenden una combinación de una o más secuencias poliA o elementos de secuencia. En algunos casos, no se utiliza una secuencia poliA. En algunos casos una o más de secuencias poliA se pueden referir como regiones no traducidas (UTRs), 3' UTRs, o secuencias de terminación.
En ciertos aspectos de la descripción, el uso de un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) o elementos de virus de enfermedad de pies-boca (FMDV) se pueden utilizar para crear mensajes de múltiples genes o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de evitar el modelo de escaneo de ribosomas de la traducción dependiente de Etapa metilada 5' y comienza la traducción en los sitios internos. Los elementos IRES de los dos números de la familia de picornavirus (virus de la polio y encefalomiocarditis) se han descrito, asi como un IRES de un mensaje de mamífero. Los elementos IRES se pueden ligar a los marcos de lectura abiertos heterólogos. Los marcos de lectura abiertos múltiples se pueden transcribir conjuntamente, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto puede ser accesible a los ribosomas para la traducción eficiente. Múltiples genes se pueden expresar eficientemente utilizando un solo promotor/potenciador para transcribir un mensaje individual. Un sistema alternativo para co-expresión de las dos proteínas en los vectores de suministro de terapia génica es el sistema FMDV 2A. El sistema FMDV 2A emplea un vector plásmido retroviral en el cual dos genes se pueden ligar a una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia 2A del virus de enfermedad de pies y boca y picornavirus. La transcripción y traducción dan origen a una ARNm bicistrónico y dos productos de proteínas independientes.
Cualquier marco de lectura abierto heterólogo se puede ligar a los elementos IRES. Estos pueden incluir genes para proteínas secretadas, proteínas de múltiples subunidades, codificadas por genes independientes, proteínas intracelulares ligadas a membrana y marcadores seleccionables. De esta manera, la expresión de tales proteínas de pueden diseñar simultáneamente en una célula con un solo constructo y un solo marcador seleccionable.
Una secuencia poliA puede comprender una longitud de 1 -10 bp, 10- 20 bp, 20 - 50 bp, 50 -100 bp, 100 - 500 bp, 500 bp - 1Kb, 1Kb - 2 Kb, 2Kb - 3 Kb, 3Kb - 4 Kb, 4Kb - 5 Kb, 5Kb - 6 Kb, 6Kb -7 Kb, 7Kb - 8 Kb, 8Kb - 9 Kb, y 9Kb - 10 Kb en longitud. Una secuencia poliA puede comprender una longitud de por lo menos 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb, y 10 Kb en longitud. Una secuencia poliA puede comprender una longitud de a lo sumo 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb, y 10 Kb en longitud.
En algunos casos, una secuencia poliA o determinación puede incluir pero no se limita a secuencias tales como SEQ ID No.49, SEQ ID No.50, SEQ ID No.51, SEQ ID No.52, SEQ ID No.53, SEQ ID No.54, y SEQ ID No.55.
En general, las secuencias polyA, como se proporcionan por la presente descripción, pueden incluir, pero no se limitan a cualquiera de las secuencias relacionadas de las Regiones PolyA 1-10 como se proporciona en la Figura 9A y Figura 9B.
En algunos casos, las secuencias polyA se pueden optimizar para varios parámetros que afectan la expresión de la proteína, incluyendo pero no limitado a vida media de ARNm del transgen en la célula, estabilidad del ARNm del transgen o regulación transcrípcional por ejemplo, las secuencias polyA se pueden alterar para incrementar el transcripto de ARNm del transgen, que puede dar por resultado la expresión incrementada de la proteína. En algunos casos, las secuencias polyA se pueden alterar para disminuir la vida media del transcripto de ARNm del transgen, que puede dar por resultado la expresión disminuida de la proteína.
En algunos aspectos, el virus y/o plásmido recombinantes utilizados para generar el virus recombinante, comprende un polinucleótido que codifica una proteina sFLT-1 humana o un fragmento funcional del mismo. En algunos casos, el virus y/o plásmido recombinante utilizados para generar el virus recombinante, comprende un ácido nucleico que codifica otra proteina anti-VEGF o inhibidor de VEGF.
En algunos casos, un inhibidor de VEGF puede incluir pero no se limita a secuencias tales como SEQ ID No.102, SEQ ID No.103, SEQ ID No.104, SEQ ID No. 105, SEQ ID No.106, SEQ ID No.107, SEQ ID No.108, o SEQ ID No.122.
En algunos casos, los ácidos nucleicos de un inhibidor de VEGF pueden codificar las secuencias de polipéptidos que pueden incluir pero no se limitan a secuencias de polipéptidos tales como SEQ ID No.109 o SEQ ID No.121.
En algunos aspectos, el virus y/o plásmido recombinante utilizado para generar el virus recombinante, comprenden un fragmento de ácido nucleico regulador que es capaz de dirigir la expresión selectiva de la proteina sFLT-1 en una célula del ojo. En algunos casos, las células del ojo pueden comprender células epiteliales del pigmento de la retina (RPE).
En algunos aspectos, el virus y/o plásmido recombinante utilizados para generar el virus recombinante, pueden comprender una o más regiones no traducidas (ÜTR) o secuencias. Generalmente, cualquier secuencia UTR adecuada se puede utilizar para la expresión óptima deseada del transgen (es decir sFLT-1). Por ejemplo, en algunos casos, las regiones o secuencias UTR pueden comprender secuencias nativas. En algunos casos, las secuencias UTR pueden ser secuencias como son encontradas cadena arriba (5' UTR) o cadena abajo (3 'UTR) del gen sFLT-1 humano como es encontrado en la secuencia genómica humana o porciones de la misma. En otros casos, las secuencias UTR pueden comprender secuencias no nativas, tales como las encontradas cadena arriba o cadena abajo de los genes diferentes a la sFLT-1 o comprenden secuencias que comprenden además una combinación de uno o más elementos de secuencia UTR como se describe adicionalmente en la presente. En algunos casos, solamente una secuencia 5' UTR se utiliza. En algunos casos, solamente se utiliza una secuencia 3'. En algunos casos, no se utilizan secuencias.
Una secuencia UTR puede comprender una longitud de 1 -10 bp, 10- 20 bp, 20 - 50 bp, 50 -100 bp, 100 - 500 bp, 500 bp - 1Kb, 1Kb - 2 Kb, 2Kb - 3 Kb, 3Kb - 4 Kb, 4Kb - 5 Kb, 5Kb - 6 Kb, 6Kb -7 Kb, 7Kb - 8 Kb, 8Kb - 9 Kb, y 9Kb - 10 Kb en longitud. Una secuencia UTR puede comprender una longitud de por lo menos 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb, y 10 Kb en longitud. Una secuencia UTR puede comprender una longitud a lo sumo 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb, y 10 Kb en longitud.
Generalmente, las secuencias UTR como se proporcionan por la presente descripción pueden incluir pero no se limitan a cualquiera de las secuencias que incluyen pero no se limitan a SEQ ID No.91, SEQ ID No.2, SEQ ID No.92, SEQ ID No. 93, SEQ ID No.94, SEQ ID No.95, SEQ ID No.96, SEQ ID No. 97, SEQ ID No.98, SEQ ID No.99, SEQ ID No.100, y SEQ ID No.101.
En algunos casos, las variaciones de ya sea la 5 'UTR y/o 3 'UTR se pueden optimizar para un nivel deseado de expresión de proteina. En algunos casos, las secuencias 3 'UTR se pueden optimizar para varios parámetros que afectan la expresión de proteínas, incluyendo pero no limitado a vida media del ARNm del transgen en la célula, estabilidad o estructura secundaria del ARNm del transgen o regulación condicional (por ejemplo ligación de varios factores para modular la traducción). Por ejemplo, la secuencia 3 'UTR se puede alterar para implementar la vida media del transcripto de ARNm del transgen, que puede dar por resultado la expresión incrementada de proteínas. En algunos casos, la secuencia 3 'UTR se puede alterar para disminuir la vida media del transcripto de ARNm del transgen, que puede dar por resultado la expresión disminuida de proteínas.
Generalmente, las secuencias 3' UTRs pueden comprender varios elementos de secuencia. La presente descripción proporciona secuencias 3' UTR que pueden incluir pero o se limitan a elementos de secuencia tales como una o más señales de poliadenilación, secuencias ligadoras, secuencias espad adoras, elementos SECIS, secuencias ricas en AU o ARE o secuencias de ligación de ARNmi o ARNi, secuencias terminadoras de transcripción, secuencias de terminación 3' o variantes y/o combinaciones de las mismas.
En algunos casos, las secuencias 5'UTR se pueden optimizar para varios parámetros que afectan la expresión de proteínas, incluyendo pero no limitado a la vida media de ARNm del transgen en la célula, estabilidad o estructura secundaria del ARNm del transgen o regulación transcripcional. Por ejemplo, las secuencias 5 'UTR se pueden alterar para incrementar la eficiencia de traducción del transcripto ARNm del transgen, que puede dar por resultado la expresión incrementada de proteínas. En algunos casos, las secuencias 5'UTR se pueden alterar para disminuir la eficiencia de traducción del transcripto ARNm del transgen, que puede dar por resultado la expresión disminuida de proteínas.
Generalmente, las secuencias 5' UTRs pueden comprender varios elementos de secuencia. La presente descripción proporciona mRNA 5' UTR que se pueden incluir pero no se limitan a elementos de secuencia tal como uno o más sitios de ligación de ribosoma (RBS), secuencias ligadoras, secuencias espaciadoras, secuencias reguladoras, elementos de respuesta reguladora, riboreguladores, secuencias que promueven o inhiben el inicio de la traducción, secuencias reguladoras para el transporte de ARNm o variantes y/o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, el virus recombinante el virus y/o plásmido recombinante utilizados para generar el virus recombinante, pueden comprender uno o más secuencias ligadoras o espaciadoras. Como se describe en la presente, la secuencia ligadora o secuencia espad adora se pueden utilizar intercambiablemente. Generalmente, una secuencia ligadora o secuencia espad adora puede ser cualquier secuencia adecuada utilizada para crear una secuencia no contigua entre por lo menos dos elementos de secuencia. Por ejemplo, en un aspecto de la descripción, una secuencia ligadora se puede encontrar insertada entre una secuencia ITR-1, 108, o ITR-2, 103, y una secuencia de genes de resistencia a antibióticos, 106 como se refleja en la Figura 1A. En otro ejemplo, las secuencias ligadoras se pueden insertar adyacentes a cualquier elemento de secuencia del virus recombinante o el plásmido que codifica el virus recombinante incluyendo las secuencias ITR, el promotor o secuencias promotoras/potenciadoras, la secuencia de intrones, la secuencia de transgen y la secuencia de región poli A. Generalmente, cualquier secuencia ligadora o espad adora adecuada se puede utilizar para crear secuencias no contiguas. Por ejemplo, en algunos casos, las secuencias ligadoras pueden ser secuencias aleatoriamente generadas. En algunos casos, la secuencia ligadora puede ser una secuencia no especifica optimizada para prevenir la formación de la estructura secundaria o interacciones intramoleculares que pueden afectar adversamente la expresión de proteínas. En algunos casos, las secuencias ligadoras pueden comprender cualquiera de elementos de secuencia funcionales adicionales, incluyendo pero no limitado a intrones, secuencias reguladoras, potenciadores o similares. Los elementos funcionales en las secuencias ligadoras se pueden utilizar para la producción óptima deseada de virus y/o expresión de la expresión de transgen. En algunos casos, las secuencias ligadoras son sitios de clonación, remanentes de los sitios de clonación previos u otras secuencias no significativas y es opcional la inserción de tales ligadores entre cualquiera de dos elementos de secuencia.
Generalmente, la secuencia ligadora, como se proporciona por la presente descripción, puede incluir pero no se limita a cualquiera de las secuencias seleccionadas de secuencias como es proporcionado en la Figura 9D, Figura 9E y Figura 9F.
En algunos casos, la longitud de la secuencia ligadora se puede optimizar para la producción óptima desead de virus y/o expresión de la expresión del transgen. En algunos casos, la longitud de una o más secuencias ligadoras situadas en uno o más sitios en el genoma del virus o plásmido se puede variar para producir la expresión de la proteina óptima deseada. Por ejemplo, una secuencia ligadora se puede encontrar entre el intrón, como se describe en la presente en el transgen (es decir sFLT-1). La longitud de las secuencia ligadora se puede variar para producir efectos variantes en la transcripción y la transcripción subsecuente del transgen en la células.
Una secuencia ligadora puede comprender una longitud de 1 - 10 bp, 10- 20 bp, 20 - 50 bp, 50 -100 bp, 100 - 500 bp, 500 bp - 1Kb, 1Kb - 2 Kb, 2Kb - 3 Kb, 3Kb - 4 Kb, 4Kb - 5 Kb, 5Kb - 6 Kb, 6Kb -7 Kb, 7Kb - 8 Kb, 8Kb - 9 Kb, y 9Kb - 10 Kb en longitud. Una secuencia ligadora puede comprende una longitud de por lo menos 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb, y 10 Kb en longitud. Una secuencia ligadora puede comprende una longitud de a lo sumo 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 6 Kb, 7 Kb, 8 Kb, 9 Kb, y 10 Kb en longitud.
En algunos casos, una secuencia ligadora espaciadora puede incluir pero no se limita a SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 62, SEQ ID No.63, SEQ ID No.64, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 66, SEQ ID No.67, SEQ ID No.68, SEQ ID No. 69, SEQ ID No.70, SEQ ID No.71, SEQ ID No.72, SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 74, SEQ ID No.75, SEQ ID No.76, SEQ ID No. 77, SEQ ID No.78, SEQ ID No.79, SEQ ID No.80, SEQ ID No. 81, SEQ ID No.82, SEQ ID No.83, SEQ ID No.84, SEQ ID No. 85, SEQ ID No.86, SEQ ID No.87, SEQ ID No.88, SEQ ID No. 89, y SEQ ID No.90.
En algunos aspectos, el virus recombinante comprende secuencias de repetición terminales invertidas (ITR) utilizadas para empacar el casete de expresión del gen recombinante en el virión del vector vírico. En algunos casos, la ITR es de virus asociado con adeno (AAV). En algunos casos, la ITR es del serotipo 2 de AAV. En algunos casos, una ITR puede incluir pero no se limita a SEQ ID No. 56, SEQ ID No.57, SEQ ID No.58, o SEQ ID No.59.
En algunos aspectos, el virus y/o plásmido recombinante utilizados para generar el virus recombinante comprenden elementos de ácidos nucleicos en el siguiente orden: a) una primera secuencia ITR; b) una secuencia promotora; c) una secuencia de intrones; d) una primera secuencia UTR; e) una secuencia que codifica un inhibidor de VEGF; f) una segunda secuencia UTR; g) una secuencia poli A; y h) una segunda secuencia ITR. En algunos aspectos del virus y/o plásmido recombinante s utilizados para generar el virus recombinante, la secuencia promotora comprende una secuencia promotora/potenciadora. En algunos aspectos, la secuencia que codifica un inhibidor de VEGF comprende una secuencia que codifica la proteína sFLT-1 humana o un fragmento funcional de la misma. En otros aspectos, el plásmido utilizado para generar el virus recombinante comprende además un origen de la secuencia de replicación, 102. En algunos aspectos, el plásmido comprende además una secuencia para un gen de resistencia a antibióticos como se proporciona en la presente.
En algunos aspectos, el virus y/o plásmido recombinantes utilizados para generar el virus recombinante comprende elementos de ácidos nucleicos en el siguiente orden: a) una primera secuencia ITR; b) una primera secuencia ligadora; c) una secuencia promotora; d) una segunda secuencia ligadora; e) una secuencia de intrones; f) una tercera secuencia ligadora; g) una primera secuencia UTR; h) una secuencia que codifica un inhibidor de VEGF; i) una segunda secuencia UTR; j) una cuarta secuencia ligadora; k) una secuencia poli A; 1) una quinta secuencia ligadora; y m) una segunda secuencia ITR. En algunos aspectos del virus y/o plásmido recombinantes utilizados para generar el virus recombinante, la secuencia promotora comprende una secuencia promotora/potenciadora. En algunos aspectos, la secuencia que codifica un inhibidor de VEGF comprende la secuencia que codifica la proteina sFLT-1 humana o un fragmento funcional de la misma. En otros aspectos, el plásmido utilizado para generar el virus recombinante comprende además un origen de secuencia de replicación. En algunos aspectos, el plásmido comprende además una secuencia para un gen de resistencia a antibióticos como se proporciona en la presente.
IV. Composiciones Farmacéuticas Una composición farmacéutica es una formulación que contiene uno o más ingredientes activos asi como uno o más excipientes, portadores, estabilizantes o agentes de volumen, son adecuados para la administración a un paciente humano para lograr un resultado de diagnóstico deseado o un efecto terapéutico profiláctico. Para estabilidad de almacenamiento y conveniencia de manejo, una composición farmacéutica se puede formular como un polvo seco liofilizado (es decir secado por congelación) o por vacio que se puede reconstituir con solución salina o agua antes de la administración a un paciente. Alternativamente, la composición farmacéutica se puede formular como una solución acuosa. Una composición farmacéutica puede contener un ingrediente activo proteinico. Desafortunadamente, las proteínas pueden ser muy difíciles de estabilizar, dando por resultado pérdida de proteína y/o pérdida de actividad de proteína durante la formulación, reconstitución (si es requerida) y durante el almacenamiento antes del uso de una composición farmacéutica que contiene proteínas. Los problemas de estabilidad pueden presentarse debido a la desnaturalización, degradación, dimerización y/o polimerización de la proteína. Varios excipientes, tal como albúmina y gelatina se han utilizado con diferentes grados de éxito para probar y estabilizar un ingrediente activo de proteína presente en una composición farmacéutica. Adicionalmente, los crioprotectores tales como alcoholes se han utilizado para reducir la desnaturalización de la proteina bajo las condiciones de congelación de la liofilización.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso interno incluyen soluciones y dispersiones acuosas estériles y polvos estériles par la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para la administración intravenosa, portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, o solución salina amortiguada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida al grado en que existe fácil capacidad de inyección. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol liquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensoactivos tales como polisorbatos (TweenMR), dodecilsulfato de sodio (laurilsulfato de sodio), laurildimetil óxido de amina, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), alcoholes polietoxilados, sorbitán de polioxietileno sorbitán, octoxinol (Tritón XI 00MR), N,N-dimetildodecilamina-N-óxido, bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB), lauril-éter de polioxil 10, Brij 721MR, sales biliares (deoxicolato de sodio, colato de sodio), ácidos plurónicos (F-68, F-127), aceite de ricino de polioxilo (CremophorMR), etoxilado de nonilfenol (TergitolMR), ciclodextrinas y, cloruro de etilbenzetonio (HyamineMR). La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por varios agentes antimicrobianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones internas se puede llevar a cabo al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Se pueden preparar soluciones estériles al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en lo anterior, como sea requerido, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparar al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados en lo anterior. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secados por vacio y secado por congelación que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril de los mismos.
En un aspecto, compuestos activos se preparan con portadores que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración encapsulados. Los polímeros biocompatibles, biodegradables se pueden utilizar, tales como etilen-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno o poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para preparación de tales formulaciones son evidentes para aquellas personas expertas en el campo. Los materiales también se pueden obtener comercialmente. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos para células infectadas con anticuerpo monoclonales a antígenos virales también se puede utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Esto se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por aquellas personas expertas en el campo, por ejemplo, como se describe en la Patente de E.U.A. No. 4,522,811, incorporada a manera de referencia en la presente.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación como se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto humano que se trata. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la descripción se dictan por y son dependientes directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se logra, y las limitaciones inherentes en el campo de la formación de compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, paquete, o dispensador junto con instrucciones para administración.
Las composiciones farmacéuticas de la descripción abarcan cualquiera de sales farmacéuticamente aceptables, ásteres, o sales de tales ásteres o cualquier otro compuesto que, en administración a un animal que comprende un humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se describe a profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la descripción, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos, y otros bioequivalentes.
El término "profármaco" indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte a una forma activa (es decir, fármaco) dentro del cuerpo o células del mismo por la acción de las enzimas endógenas u otros químicos y/o condiciones.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la descripción: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparten efectos toxicológicos indeseados al mismo.
Las sales de adición base farmacéuticamente aceptable se forman con metales o a minas, tales como metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Los metales utilizados como cationes comprenden sodio, potasio, magnesio, calcio y similares. Las aminas comprenden N-N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina, y procaína (ver, por ejemplo, Berge y colaboradores, "Pharmaceutical Salts," J.
Pharma Sci., 1977, 66, 119). Las sales de adición base de los compuestos ácidos se preparan al poner en contacto la forma ácida libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal en una manera convencional. La forma ácida libre se puede generar al poner en contacto la forma de sal con un ácido y aislar el ácido libre en una manera convencional. Las formas ácidas libres difieren de sus formas de sal respectivas de alguna manera en ciertas propiedades físicas tales como solubilidad en solventes polares, pero de otra manera las sales son equivalentes a su ácido libre respectivo para propósitos de la presente descripción.
Como se utiliza en la presente, una "sal de adición farmacéutica" comprende una sal farmacéuticamente aceptable de una forma ácida de uno de los componentes de las composiciones de la descripción. Estas comprenden sales ácidas orgánicas o inorgánicas de las aminas. Las sales ácidas preferidas son los clorhidratos, acetatos, salicilatos, nitratos y fosfatos. Otras sales farmacéuticamente aceptables adecuadas son bien conocidas por aquellas personas expertas en el campo y comprenden sales básicas de una variedad de ácidos inorgánicos y orgánicos, tales como, por ejemplo, con ácidos inorgánicos, tales como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos carboxilicos, sulfónicos, sulfo o fosfo-orgánicos o ácidos sulfámicos N-sustituidos, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succinico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido mélico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido embónico, ácido nicotínico o ácido isonicotínico; y con aminoácidos, tales como 20 alfa-aminoácidos implicados en la síntesis de las proteínas en la naturaleza, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico, y también con ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido benzenesulfónico, ácido 4-metilbencenosulfoico, ácido naftalen-2-sulfónico, ácido naftalen-1,5-disulfónico, 2- o 3-fosfoglicerato, glucosa-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de cicla atos), o con otros compuestos orgánicos ácidos, tal como ácido ascórbico. Las sales farmacéuticamente aceptables de compuestos también se pueden preparar con un catión farmacéuticamente aceptable. Los cationes farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos por aquellas personas expertas en el campo y comprenden cationes alcalinos, alcalinotérreos, de amonio y de amonio cuaternario. Los carbonatos o carbonatos de hidrógeno también son posibles. Par los oligonucleótidos, ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables comprenden pero no se limitan a: (I) sales formadas con cationes tales como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliamidas tales como espermina y espermidina, y similares; (II) sales de adición ácidas formadas con ácidos orgánicos, por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (III) sales formadas con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido mélico, ácido ascórbico, ácido benoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalensulfonico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido poligalacturónico, y similares; y (IV) sales formadas de aniones elementales tales como cloro, bromo y yodo.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción comprenden, pero no se limitan a soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que comprenden, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos auto-emulsificantes y semísólidos auto-emulsificantes.
Ciertas composiciones de la presente descripción también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se utiliza en la presente, "compuesto portador" o "portador" pueden referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo que es inerte, (es decir, no posee actividad biológica per se) pero es reconocido como un ácido nucleico por procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica al, por ejemplo, degradar el ácido nucleico biológicamente activo al promover su remoción de circulación. La co-administración de un ácido nucleico y un compuesto portador, generalmente con un exceso de la última sustancia, puede dar por resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón u otros depósitos circulatorios extras, presumiblemente debido a la competición entre el compuesto portador y el ácido nucleico para un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente fosforotioato en el tejido hepático se puede reducir cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'disulfónico (Miyao y colaboradores, Antisense Res . Dev. , 1995, 5, 115-121; Takakura y colaboradores, Antisense & Nucí . Acid Drug Dev. , 1996, b, 177-183).
El vector o virus recombinante (viriones) se pueden incorporar en las composiciones farmacéuticas para administración a pacientes mamíferos, particularmente humanos. El vector o viriones se pueden formular en portadores acuosos no tóxicos, inertes, farmacéuticamente aceptables, de manera preferente en un pH que varía de 3 a 8, de manera más preferente que varía de 6 a 8. Tales composiciones estériles comprenderán el vector o virión que contiene el ácido nucleico que codifica la molécula terapéutica disuelta en una solución amortiguadora acuosa que tiene un pH aceptable en la reconstitución.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica proporcionada en la presente comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector o virión en una mezcla con un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, fosfato y aminoácidos, polímeros, polioles, azúcar, soluciones amortiguadoras, conservadores y otras proteínas. Los aminoácidos ejemplares, polímeros y azúcares y los similares son compuestos de octilfenoxi polietoxi etanol, compuestos de monoestearato de polietilenglicol, ésteres de ácidos grasos de sorbitán de polioxietileno, sacarosa, dextrosa, maltosa, glucosa, manitol, dextrano, sorbitol, inositol, galactitol, xilitol, lactosa, trehalosa, albúmina de suero bovino o humano, citrato, acetato, soluciones de Ringer y Hank, cisteina, arginina, carnitina, alanina, glicina, lisina, valina, leucina, polivinilpirrolidona, polietileno y glicol. De manera preferente, esta formulación es estable durante por lo menos seis meses a 4°C.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica proporcionada en la presente comprende una solución amortiguadora, tal como solución salina amortiguada con fosfato (PBS) o fosfato de sodio/sulfato de sodio, solución amortiguadora tris, solución amortiguadora de glicina, agua estéril y otras soluciones amortiguadoras conocidas por el artífice ordinariamente experto tales como agüellas descritas por Good y colaboradores(1966) Biochemistry 5:467. El pH de la solución amortiguadora en la cual la composición farmacéutica que comprende el anti-VEGF contenido en el sistema de suministro de vectores adenoviraies, puede estar en el intervalo de 6.5 a 7.75, 7 a 7.5, o 7.2 a 7.4. El pH de la formulación puede variar de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 12.0. El pH de la composición inmunogénica puede ser por lo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 unidades de pH. El pH de la composición inmunogénica puede ser a lo sumo aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 unidades de pH.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica proporcionada en la presente comprende sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano, en la cantidad de aproximadamente 1-10 por ciento, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 por ciento.
Ciertos aspectos de la descripción proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más virus recombinante y uno o más de otros agentes quimioterapéuticos.
Ejemplos de tales ejemplos quimioterapéuticos comprende, pero no se limitan a, fármacos anti-cáncer, tales como daunorubicina, dactinomicina, doxorubicina, bleomicina, mitomicina, mostaza de nitrógeno, clorambucilo, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA), 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (5-FUdR), metotrexato (MIX), colquicina, vincristina, vinblastina, etoposido, teniposido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Ver, generalmente, Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow y colaboradores, eds . , 1987, Rahway, N.J., páginas 1206-1228).
Los fármacos antiinflamatorios, que comprenden pero no se limitan a fármacos antiinflamatorios no esteroidales y corticosteroides, y fármacos antivirales, que comprenden pero no se limitan a ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también se pueden combinar en composiciones de la descripción (The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow y colaboradores, eds., 1987, Rahway, N.J., páginas 2499-2506 y 46-49, respectivamente). Otros agentes quimioterapéuticos no anti-sentido también están dentro del alcance de esa descripción. Dos o más compuestos combinados se pueden utilizar conjuntamente o secuencialmente.
En otro aspecto relacionado, las composiciones de la descripción pueden contener uno o más virus recombinantes, particularmente sFLT-1 con diferentes secuencias. Dos o más virus combinados se pueden utilizas conjuntamente o secuencialmente.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una dosis unitaria de una composición farmacéutica que comprende aproximadamente 1 x 106 aproximadamente 1 x 1015 genomas virales, en donde los virus comprenden un ácido nucleico que codifica sFLT-1.
En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción se puede medir como pfu (unidades formadoras de plaquetas). En algunos casos, la pfu de dosis unitaria de la composición farmacéutica de la o descripción puede ser de aproximadamente 1x10 a aproximadamente 5xl010 pfu. En algunos casos, la pfu de la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es por lo menos aproximadamente lxlO8, 2xl08, 3xl08, 4xl08, 5xl08, 6xl08, 7xl08, 8xl08, 9x10 lxlO9, 2xl09, 3xl09, 4xl09, 5xl09, 6xl09, 7xl09, 8xl09, 9x10% lxlO10, 2xl010, 3xl010, 4xl010, y 5xl010 pfu. En algunos casos, la pfu de la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es a lo sumo aproximadamente lxlO8, 2xl08, 3xl08, 4xl08, 5xl08, 6xl08, 7xl08, 8xl08, 9xl08, lxlO9, 2xl09, 3xl09, 4xl09, 5xl09, 6xl09, 7xl09, 8xl09, 9xl09, lxlO10, 2xl010, 3xl010, 4xl010, y 5xl010 pfu.
En algunos casos, el vector vírico de la descripción se puede medir como genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es lxlO10 a 3xl012 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es lxlO9 a 3xl013 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es lxlO10 a lxlO11 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es lxlO8 a 3xl014 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es por lo menos aproximadamente 1x10 , 1x10 , lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10, lxlO11, lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17, y lxlO18 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es lxlO8 a 3xl014 genomas de vector. En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción es a lo sumo aproximadamente lxlO1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, 1x10a, lxlO9, lxlO10, lxlO11, lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17, y lxlO18 genomas de vector.
En algunos casos, la dosis unitaria de la composición farmacéutica de la descripción se puede medir utilizando multiplicidad de infección (MOI). En algunos casos, la MOI puede referirse a la relación, o múltiple de vector o genomas virales a las células a las cuales el ácido nucleico se administra. En algunos casos, la MOI puede ser lxlO6. En algunos casos, la MOI puede ser Ixl05-lxl07. En algunos casos, la MOI puede ser Ixl04-lxl08. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción son por lo menos aproximadamente lxlO1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, lxlO8, lxlO9, lxlO10, lxlO11, lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17, y lxlO18 de MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de esta descripción son lxlO8 a 3xl014 de MOI. En algunos casos, los virus recombinantes de la descripción son a lo sumo aproximadamente lxlO1, lxlO2, lxlO3, lxlO4, lxlO5, lxlO6, lxlO7, 1x10a, lxlO9, lxlO10, lxlO11, lxlO12, lxlO13, lxlO14, lxlO15, lxlO16, lxlO17, y lxlO18 de MOI.
En algunos aspectos el ácido nucleico se puede administrar sin el uso de un virus (es decir sin vector no viral), y se puede medir como la cantidad de ácido nucleico.
Generalmente, cualquier cantidad adecuada de ácido nucleico se puede utilizar con las composiciones y métodos de la descripción. En algunos casos, la cantidad de ácido nucleico puede ser por lo menos aproximadamente 1 mg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 mg 1 mg, 10 g, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, o 5 g. En algunos casos, el ácido nucleico puede ser a lo sumo aproximadamente 1 pg, 10 pg, 100 pg, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, 1 pg, 10 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, l g, 2 g, 3 g, 4 g, o 5 g.
En algunos aspectos, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1015 de virus recombinantes, aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1014 de virus recombinantes, aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1013 de virus recombinantes, aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 3 x 1012 de virus recombinantes, o aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 3 x 1012 de virus recombinantes.
Kits Las composiciones y reactivos útiles para la presente descripción se pueden empacar en kits para facilitar la aplicación de la presente descripción. En algunos aspectos, el presente método proporciona un kit que comprende un ácido nucleico recombinante de la descripción. En algunos aspectos, el presente método proporciona un kit que comprende un virus recombinante de la descripción. Las instrucciones podrían ser en cualquier forma deseada, incluyendo pero no limitado a, impresas sobre un inserto del kit, imprimidas sobre uno o más recipientes, así como instrucciones electrónicamente almacenadas proporcionadas en un medio de almacenamiento electrónico, tal como un medio de almacenamiento leíble por computadora. También se incluye opcionalmente un paquete de software en un medio de almacenamiento leíble por computadora que permite que el usuario integre la información y calcule una dosis de control.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un kit que comprende las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente. En todavía otro aspecto, la descripción proporciona kit en el tratamiento de enfermedades tales como, por ejemplo: AMD, DME, RVO, enfermedades relacionadas con angiogénesis, cáncer, enfermedades autoinmunes, organismos de enfermedad infecciosos, y similares.
En un aspecto, un kit comprende: (a) un virus recombinante proporcionado en la presente, y (b) instrucciones para administrar a células o un individuo una cantidad terapéuticamente efectiva del virus recombinante. En unos aspectos, el kit puede comprender sales o soluciones farmacéuticamente aceptables para administrar el virus recombinante. Opcionalmente, el kit puede comprender además instrucciones para parámetros operacionales adecuados en la forma de una etiqueta o un inserto separado. Por ejemplo, el kit puede tener instrucciones estándares que informan a un médico o téenico de laboratorio preparar una dosis del virus recombinante.
Opcionalmente, el kit puede comprender además una información estándar o de control de modo que una muestra de pacientes se puede comparar con el estándar de información de control para determinar si la cantidad de prueba de virus recombinante es una cantidad terapéutica consistente con por ejemplo, una reducción de un tumor. Opcionalmente, el kit podría comprender además dispositivos para la administración, tal como una jeringa, aguja de filtro, tubería de extensión, cánula e inyector subretiniano.
Los virus recombinantes se puede generar por cualquier medio adecuado. Los métodos y composiciones y para la descripción proporcionan generación de un virus recombinante a través de diversos medios, incluyendo el uso de células transgénicas, que pueden incluir células de mamífero, células de insecto, células de animales, o células fúngicas.
Por ejemplo, en algunos aspectos, los virus recombinantes se pueden generar a través de la transfección de células de insecto, a través de baculovirus recombinante. En algunos casos, el baculovirus recombinante se puede generar como un intermediario, mediante el cual el baculovirus puede contener secuencias necesarias para la generación de otros virus tales como virus AAV o rAAV2. En algunos casos uno o más baculovirus se pueden utilizar en la generación de virus recombinantes utilizados para la composición y métodos de tratamiento de esta descripción. En algunos casos, las células de insecto tales como líneas de células Sf9, High-Five o Sf21 se pueden utilizar. En algunos casos, la línea de células se puede generar utilizando métodos transcientes (es decir infección con transgenes no establemente integrador). En otros casos, la línea de células se puede generar a través de la generación de línea de células estables (es decir infección con transgenes integrados establemente en el genoma de las células hospedera). En otros aspectos, la composición farmacéutica proporcionada en la presente se fabrica utilizando células de riñón embriónicas humanas adherentes 293 (HEK293). En un aspecto alternativo, la composición farmacéutica proporcionada en la presente se fabrica utilizando células HEK293 adaptadas a suspensión. En otro aspecto, la composición farmacéutica proporcionada en la presente, se fabrica utilizando el sistema de expresión de baculovirus (BVES) en las células de insecto. En algunos aspectos, el vector se produce utilizando virus auxiliares de herpes. En algunos aspectos, el vector se produce utilizando métodos productores-de clonación. En algunos aspectos, el vector se produce utilizando el Ad-AAV.
Generalmente, cualquier método adecuado se puede utilizar en la purificación bioquímica de los virus recombinantes para el uso en una composición farmacéutica como se describe en la presente. Los virus recombinantes se pueden recolectar directamente de las células, o del medio de cultivo que circunda las células hospederas. El virus se puede purificar utilizando varios medios bioquímicos, tales como filtración en gel, filtración, cromatografía, purificación para afinidad, ultracentrifugación gradiente, o métodos de exclusión de tamaño. El virus recombinante se puede someter a prueba para el contenido (es decir, identidad), pureza, o potencia (es decir, actividad) utilizando cualquier medio adecuado, antes de la formulación en una composición farmacéutica. El método puede incluir pero no se limita a inmunoensayos, ELISA, SDS-PAGE, téenica de western blot, técnica de Northern blot, técnica de Southern blot o PCR, ensayos HUVEC y similares.
V. Método de Tratamiento En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad relacionada con la angiogénesis patológica, que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente a un sujeto humano en necesidad de tal tratamiento. En algunos aspectos, la enfermedad se selecciona del grupo de enfermedades neovasculares oculares que consisten de degeneración macular relacionada con la edad (AMD), AMD húmeda, AMD seca, neovascularización de la retina, retinopatía diabética por neovascularización coroidea, retinopatía diabética proliferativa, oclusión de las venas de la retina, oclusión de las venas de la retina central, oclusión de las venas de la retina ramificada, edema diabético macular, isquemia diabética de la retina, retinopatia isquémica y edema diabético de la retina.
En algunos casos, la AMD seca se puede tratar. En algunos casos, la AMD seca se puede referir como una atrofia geográfica central, caracterizada por la atrofia del pigmento de la retina epitelial posteriormente por debajo de la retina y pérdida subsecuente de los fotoreceptores en la parte central el ojo. La composición y métodos de esta descripción proporcionan el tratamiento de cualquiera y todas las formas de AMD.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para el tratamiento profiláctico de la AMD o enfermedades neovasculares oculares como se describe en la presente, que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente a un sujeto humano en necesidad de tal tratamiento. La presente descripción se puede utilizar para tratar pacientes en riesgo de desarrollar AMD, o que presentan sintomas tempranos de la enfermedad. Esto puede incluir tratamiento de los ojos ya sea simultánea o secuencialmente. El tratamiento simultáneo puede significar que el tratamiento se administra cada ojo al mismo tiempo o que ambos ojos se tratan durante la misma visita a un médico que trata u otro proveedor de cuidado de la salud. Se ha documentado que pacientes que tienen un alto riesgo de desarrollar AMD en el ojo contralateral sano de un ojo que presenta síntomas de AMD, o en pacientes quienes tienen una predisposición genética hacia el desarrollo de AMD. La presente descripción se puede utilizar como un tratamiento profiláctico en prevención de AMD en el ojo contralateral.
Aunque el mecanismo que subyace el riesgo incrementado de la progresión de la enfermedad neovascular ocular en el ojo contralateral es desconocido, existen múltiples estudios en el campo que detallan este riesgo elevado. Por ejemplo, en uno de tal estudio de escala grande de 110 ojos contralaterales observados que progresaron a AMD avanzada, neovascularización coroidea (CNV) desarrollada en 98 ojos y atrofia geográfica de la fóvea (GA) en 15 ojos.
Ophtalmologica_ 2011;226(3): 110-8. doí: 10.1159/000329473.
Curr Opin Ophthalmol. 1998 Jun;9(3):38-46. Ninguna característica no ocular (edad, género, historial de hipertensión o tabaquismo) o característica ocular del ojo de estudio en la línea base (composición de la lesión, tamaño de la lesión, o agudeza visual) fue predictiva de la progresión a la AMD avanzada en este cohorte. Sin embargo, el análisis estadístico indica que los síntomas de AMD del primer ojo, incluyendo el tamaño de las drusas, hiperpigmentación focal, y atrofia geográfica no foveal tuvo relaciones independientes significativas en la evaluación de riesgo del desarrollo de AMD en el ojo contralateral. Estudios recientes han indicado que las características oculares, factores genéticos y ciertos factores ambientales pueden desempeñar una función en el riesgo incrementado de desarrollar AMD en el ojo contralateral. JAMA Ophthal ol. 2013 Apr 1;131(4):448-55. doi: 10.1001/jamaophthalmol.2013.2578. Dado el riesgo elevado bien caracterizado del desarrollo de AMD en los ojos contralaterales no tratados, existe una necesidad en la téenica por métodos para prevenir el inicio y pérdida de la visión subsecuente debido a la enfermedad.
El término "sujeto", o "individuo" o "paciente" como se utilizan en la presente en referencia con individuos que tiene una enfermedad o trastorno o se sospechan de tener una enfermedad o trastorno, y similares. El sujeto, individuo o pacientes se pueden utilizar intercambiablemente en la descripción y abarcan mamíferos y no mamíferos. Ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, cualquier miembro de la clase mamífero: humanos, primates no humanos tales como chimpancés, y otros simios y especies de monos, animales de granja tales como ganado, caballos, oveja, cabras, cerdos, animales domésticos tales como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratas, ratones y cobayos y similares. Ejemplos de no mamífero incluyen, preo no se limitan a, aves, peces y similares. En algunos aspectos de los métodos y composiciones proporcionadas en la presente, el mamífero es un humano.
El término "sujeto" o "individuo" también incluye humanos que sufren del trastorno o enfermedad a la edad de 20 y de más edad. Inesperadamente, la presente descripción se puede utilizar en un intervalo de edades de pacientes. Estos incluyen pacientes más jóvenes no asociados generalmente con la enfermedad de AMD, que se presenta más frecuentemente en pacientes mayores de 65 años. Los sujetos humanos o pacientes de la descripción pueden incluir edades de por lo menos aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100. Los sujetos humanos o pacientes de la descripción pueden incluir edades a lo sumo de aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100.
En algunos aspectos, el término "sujeto" o "individuo" incluye pacientes con respuestas variantes a la penicilina, tal como resistencia o sensibilidad a sus efectos o pacientes quienes muestran o carecen de síntomas de respuesta alérgica al fármaco.
A. Método de Administración En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra a sitios retiñíanos que utilizando cualquier método de dirección. En algunos casos, el método de administración puede ser mediante inyección, tales como aquellas descritas en la publicación de Patente de E.U.A. No. 2010008170, que se incorpora a manera de referencia en su totalidad. En algunos casos, la administración directa a los sitios retiñíanos incluye la inyección de una composición farmacéutica líquida a través de una jeringa. En otro ejemplo, la administración directa puede implicar inyección a través de una cánula u otro instrumento adecuado para la administración de un vector o virus recombinante. En otros ejemplos, la administración directa puede comprender un implante que además comprende un vector adecuado para la administración de transgenes tal como sFLT-1. En algunos casos el implante se puede implantar ya sea directamente en o cerca de la retina.
La retina central, macula, y regiones de la fóvea de la retina son únicas entre los mamíferos a primates. Adicionalmente, existen diferencias distintas en anatomía y patogénesis subsecuente de la AMD entre primates y humanos. La retina central es el área de la retina que circunda el polo posterior entre las arcadas vasculares de un ojo de primate, que incluye la fóvea, macula, y área circundante. La macula está cerca del centro de la retina y tiene un diámetro de aproximadamente 1.5 mm. Esta área contiene la concentración más alta de fotoreceptores tanto de barra como de cono. En el centro de la macula está la fóvea, una cavidad pequeña que contiene la concentración más grande de fotoreceptores de cono. Las regiones de la macula y de la retina también contienen células RPE subyacentes. Estas regiones de la retina son responsables por la percepción del detalle fino (agudeza) y color. Ya que esta región es responsable por la parte más importante de la visión humana (visión fina), la seguridad y orientación efectiva del vector al espacio subretiniano de la macula y la fóvea es deseado. En algunos casos, la composición farmacéutica de la descripción se administra en la retina central. En algunos casos, se administra en la retina central fuera de la fóvea.
Brevemente, el método generar para administrar un vector al espacio subretiniano de la macula y la fóvea se puede ilustrar por la siguiente breve descripción. Este ejemplo es simplemente propuesto para ilustrar ciertas características del método y no se propone de ninguna manera ser limitante.
Generalmente, el vector se puede administrar en la forma de una suspensión inyectada intraocularmente (subretinianamente) bajo observación directa utilizando un microscopio de operación. Este procedimiento puede implicar la vitrectomia seguido por inyección de la suspensión del vector utilizando una cánula fina a través de una o más retinotomías pequeñas en el espacio subretiniano.
Brevemente, una cánula de infusión se puede suturar en su lugar para mantener un volumen de globo ocular normal por infusión (de por ejemplo solución salina) a través de la operación. Una vitrectomia se lleva a cabo utilizando una cánula de tamaño de perforación apropiada (por ejemplo de calibre 20 a 27), en donde el volumen del gen vitreo que se remueve se reemplaza por la infusión de solución salina u otra solución isotónica de la cánula de infusión. La vitrecomia se lleva a cabo ventajosamente debido as (1) la remoción de su corteza (la membrana haloidea posterior) que facilita la penetración de la retina por la cánula; (2) su remoción y reemplazo con fluido (por ejemplo solución salina) crea un espacio para alojar la inyección infraocular del vector, y (3) su remoción controlada reduce la posibilidad de desgarros de la retina y desprendimiento de la retina no planeados.
En algunos aspectos, el vector se inyecta directamente en el espacio subretiniano dentro de la retina central, al utilizar una cánula de tamaño de perforación apropiada (por ejemplo calibre 27-45), creando de esta manera una burbuja en el espacio subretiniano. En otros aspectos, la inyección subretiniana de la suspensión de vector procede por la inyección subretiniana de un volumen pequeño (por ejemplo aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 mi) e un fluido apropiado (tal como solución salina o solución de Ringer) en el espacio subretiniano dentro de la retina central. Esta inyección inicial en el espacio subretiniano establece una burbuja de fluido inicial dentro del espacio subretiniano, provocando la separación localizada de la retina en la ubicación de la burbuja inicial. Esta burbuja de fluido inicial puede facilitar la administración dirigida de la suspensión de vector al espacio subretiniano (al definir el plano de inyección antes de la administración del vector), y minimiza la posible administración del vector en el coroide y la posibilidad de la inyección del vector o reflujo en la cavidad vitrea. En algunos aspectos, esta burbuja de fluido inicial se puede inyectar adicionalmente con fluidos que comprenden una o más suspensiones de vector y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales mediante la administración de estos fluidos directamente a la burbuja de fluido inicial con ya sea la misma o adicionales cánulas de perforación fina.
La administración intraocular de la suspensión de vector y/o el volumen pequeño inicial de fluido se puede llevar a cabo utilizando una cánula de perforación fina (por ejemplo calibre 27-45) unida a una jeringa. En algunos aspectos, el émbolo de esta jeringa se puede accionar por un dispositivo mecanizado, tal como por depresión de un pedal de pie. La cánula de perforación fina se hace avanzar a través de la esclerotomia, a través de la cavidad vitrea y en la retina en un sitio predeterminado en cada sujeto de acuerdo con el área de la retina a ser dirigida (dentro de la retina central). En un aspecto, la administración se lleva a cabo a un sitio fuera de la fóvea. Bajo visualización directa, la suspensión de vector se inyecta mecánicamente bajo la retina neurosensorial provocando un desprendimiento localizado de la retina con una retinotomia no de expansión auto-sellante. Como se indica en lo anterior, el vector se puede inyectar ya sea directamente en el espacio subretiniano creando una burbuja dentro de la retina central o el vector se puede inyectar en una burbuja inicial dentro de la retina central, provocando que se expanda (y expandiendo el área del desprendimiento de la retina). En algunos aspectos, la inyección de la suspensión de vector es seguida por la inyección de otro fluido en la burbuja.
Sin que se desee ser limitado por la teoría, la velocidad y ubicación de la inyección(es) subretiniana puede dar por resultado fuerzas cortantes localizadas que pueden dañar la mácula, fóvea y/o células RPE subyacentes. Las inyecciones subretinianas se pueden llevar a cabo en una velocidad que minimiza o evita las fuerzas cortantes. En algunos aspectos, el vector se inyecta durante aproximadamente 15-17 minutos. En algunos aspectos, el vector se inyecta durante aproximadamente 17-20 minutos. En algunos aspectos, el vector se inyecta durante aproximadamente 20-22 minutos. En algunos aspectos, el vector se inyecta durante aproximadamente 1 minuto o durante aproximadamente 1-3 minutos o en menos de un minuto. En algunos aspectos, el vector se inyecta en una velocidad de aproximadamente 35 a aproximadamente 65 ml/min o 65 ml/min a aproximadamente 150 m?/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta en una velocidad de aproximadamente 35 m?/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta en una velocidad de aproximadamente 40 m?/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta en una velocidad de aproximadamente 45 m?/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta en una velocidad de aproximadamente 50 m?/ml. En algunos aspectos, el vector se inyecta en una velocidad de aproximadamente 55 m?/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta en una velocidad de aproximadamente 60 m?/ml. En algunos aspectos, el vector se inyecta en una velocidad de aproximadamente 65 m?/min. En algunos aspectos, el vector se inyecta en una velocidad de aproximadamente 100 m?/min. Una persona de experiencia ordinaria en el campo reconocería que la velocidad y tiempo de inyección de la burbuja se puede dirigir por, por ejemplo, el volumen de vector o tamaño de la burbuja necesario para crear el desprendimiento suficiente de la retina para acceder a las células de la retina central, el tamaño de la cánula utilizada para administrar el vector, y la capacidad para mantener con seguridad la posición de la cánula de la descripción.
Se pueden crear una o múltiples burbujas (por ejemplo 2, 3, o más) generalmente, el volumen total de la burbuja o burbujas creadas por métodos y sistemas de la descripción no puede exceder el volumen de fluido del ojo, por ejemplo de aproximadamente 4 mi en un sujeto humano típico. El volumen total de cada burbuja individual es de manera preferente a aproximadamente 0.1 - 0.2 mi. Una persona de experiencia ordinaria en el campo apreciará que en la creación de la burbuja de acuerdo con el método y sistemas de la descripción que la presión intraocular apropiada se debe mantener a fin de evitar el daño a las estructuras oculares. El tamaño de cada burbuja individual puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 50 ml a aproximadamente 100 ml, aproximadamente 50 m? a aproximadamente 200 m?, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.2 mi, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.3 mi, o > 0.3 mi.
A fin de transducir con seguridad y eficientemente las áreas de la retina objetivo (por ejemplo la retina central) fuera del borde de la ubicación original de la burbuja, en algunos casos puede ser deseable manipular la burbuja para reposicionar la burbuja al área objetivo para traducción. La manipulación de la burbuja puede presentares por la dependencia de la burbuja que se crea por el volumen de la burbuja, reposicionamiento del ojo que contiene la burbuja, reposiciona iento de la cabeza del humano con un ojo u ojos que contienen una o más burbujas, y/o por medio de un intercambio de fluido-aire. Esto es particularmente relevante a la retina central puesto que esta área resiste generalmente el desprendimiento por la inyección subretiniana En algunos aspectos el intercambio de fluido-aire se utiliza después de la inyección subretiniana; el fluido de la cánula de infusión se reemplaza temporalmente por aire, por ejemplo de aire de soplado de la superficie de la retina. Conforme el volumen del aire desplaza el fluido salino de la cavidad vitrea, la burbuja se mantiene en su lugar sin el flujo en la cavidad vitrea. Al colocar el globo ocular apropiadamente, la burbuja del vector subretiniano en algunos casos se puede manipulara para implicar áreas adyacentes (por ejemplo la y/o fóvea). En algunos casos, la masa de la burbuja es suficiente para provocar que gravite, aún sin el uso de intercambio de fluido-aire. El movimiento de la burbuja se puede facilitar adicionalmente al alterar la posición de la cabeza del sujeto humano, para permitir que la burbuja gravite a la ubicación deseada en el ojo. Una vez que la configuración deseada de la burbuja se logra, el fluido se regresa a la cavidad. El fluido es un fluido apropiado, por ejemplo, solución salina reciente. Generalmente, el vector subretiniano puede dejarse in situ sin retinopexia a la retinotomia y sin taponado intraocular, y la retina se volverá a unir espontáneamente dentro de aproximadamente 48 horas.
La administración subretiniana de AAV-2 para el tratamiento de una enfermedad ocular se ha mostrado en el tratamiento de la enfermedad genética rara, Amaurosis Congénita de Leber ("LCA"). La patología de la LCA y la población de pacientes con LCA son diferentes de aquellas de la AMD húmeda y por lo tanto no se espero que el tratamiento de la AMD húmeda con la terapia génica, y en particular, con el AAV-2, sería segura y efectiva antes del estudio clínico rAAV.sFLT. Específicamente, la LCA es una enfermedad genética degenerativa provocada por expresión insuficiente de la proteína retiniana RPE-65. Provoca deterioro lento de la visión en bebes y niños jóvenes que conduce a ceguera total por la edad adulta, generalmente antes de la edad de 25 a 30. En contraste, como se describe en este punto previamente, la AMD húmeda es provocada por el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en la retina posterior en la vida, generalmente comenzando entre la edad de 65 - 75. La presencia de nuevos vasos aumenta la preocupación de que las partículas de AAV, el transgen o producto transgénico, se transportarían fuera del ojo en mayores cantidades que la que se mostró en el estudio de LCA. Adicionalmente, el sistema inmune y la respuesta inmunitaria para sustancias extrañas cambia en cuanto a la edad del paciente creando resultados inciertos antes del estudio descritos en el Ejemplo 12 el tratamiento de la AMD húmeda con un vector vírico tal como rAAV.sFLT-l sería seguro y efectivo.
B. Efecto del tratamiento En algunos aspectos, una sola inyección de la composición farmacéutica de la presentes descripción en el ojo afectado no solo tiene los beneficios del tratamiento de LucentisMR, sino también puede requerir solamente una inyección individual.
La composición farmacéutica de la presente descripción puede tener la fuga en los vasos sanguíneos existentes y puede inhibir la nueva formación de vasos adicionales en el espacio subretiniano de los pacientes que sufren de CNV secundario a AMD durante por lo menos 18 meses, y en algunos aspectos la actividad continúa durante 3-5 años. La inhibición de la fuga y la formación de nuevos vasos previene el desarrollo de ceguera en pacientes afectados.
En algunos aspectos, los niveles de proteina sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano es de aproximadamente 500 -5,000 mg/ l, aproximadamente 600 - 4,000 pg/ml, aproximadamente 800 - 3,000 pg/ml aproximadamente 900 - 2,000 pg/ml, o aproximadamente 1,000 - 1,800 pg/ml, 500 - 700 pg/ml, 700 - 1,000 pg/ml, 1,000 -1200 pg/ml, 1200 - 1,500 pg/ml, 1,800 - 2000 pg/ml. En algunos casos, los niveles de proteina en el humor vitreo del sujeto humano por lo menos aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700.800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 o 2400 pg/ml. En algunos casos, los niveles de proteina en el humor vitreo del sujeto humano es a lo sumo de aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300 o 2400 pg/ml.
En algunos casos, "niveles" de proteina pueden referirse a cualquier cantidad o calidad relativa de proteina. En algunos casos, el nivel se puede medir como una concentración (por ejemplo pM, nM, uM etc.), una modalidad (por ejemplo m) como una masa (por ejemplo mg, ug, ng etc.) o cualquier medición adecuada. En algunos casos, una medición sin unidades puede indicar un nivel.
En algunos casos, los niveles de proteina se pueden medir por lo menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 o 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o 365 dias después de administrar la composición farmacéutica. En algunos casos, los niveles de proteínas se pueden medir a lo sumo aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 o 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o 365 días después de administrar la composición farmacéutica. En algunos casos, los niveles de proteínas se miden por lo menos 72 horas después de administrar la composición farmacéutica.
La administración de la composición farmacéutica de la presente descripción conduce en general a nada de efectos secundarios o eventos adversos.
En algunos aspectos, no se detecta un vector en las muestras de lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano 7, 14, 21 o 30 días después de administrar la composición farmacéutica. En algunos aspectos, la presencia del vector vírico se detecta por qPCI o ELISA como es conocido en el campo.
En algunos casos, no se detecta vector en las muestras de lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano por lo menos aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.70.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 o 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o 365 dias después de administrar la composición farmacéutica. En algunos casos, no se detecta vector en las muestras de lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano a lo sumo de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 0.8, 0.9, 1.0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 o 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 o 365 dias después de administrar la composición farmacéutica. En algunos casos, no se detecta vector en las muestras lágrimas, sangre, saliva u orina del sujeto humano como son medidas por lo menos 72 horas después de administrar la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, el sujeto humano muestra nada de toxicidad de la retina clínicamente significativa como es evaluada por exámenes oftálmicos en serie durante por lo menos aproximadamente un período de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. En algunos aspectos, el sujeto humano no muestra toxicidad de la retina clínicamente significativa como es evaluada por el examen oftálmico en serie durante a los sumo aproximadamente un período de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses.
En algunos aspectos, nada de signos inflamatorios superficiales, del segmento anterior o vitreos están presentes en el sujeto humano durante por lo menos un período de dos meses. En algunos casos, nada de signos inflamatorios superficiales, del segmento anterior o vitreo están presentes en el sujeto humano a 1 semana o a 3, 6, 9 o 12 meses después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, nada de signos inflamatorios se observan incluyendo una respuesta de células T citotóxicas dentro de aproximadamente un 10% de intervalo normal después de la etapa de administración. En algunos aspectos, no existe un incremento en la respuesta de células T como es medido por el ELISpot. En algunos aspectos, las células T no expresan HLA-DR o Ki67, y no desarrollan un fenotipo de efector activado, como se describe en Lai y colaboradores 2011; Gene Therapy, que se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad. En algunos aspectos, no se observa inflamación del humor vitreo por biomicroscopia (BE) y oftalmoscopia indirecta (IOE) después de la etapa de administración. En algunos aspectos, la inflamación traza del humor vitreo que se resolvió dentro de 10 dias se observa por biomicroscopia (BE) y oftalmoscopia indirecta (IOE) después de la etapa de administración. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate por lo menos 120 dias post-administración. En algunos aspectos, el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate de por lo menos 30 dias, por lo menos 60 dias, por lo menos 90 dias, por lo menos 120 días por lo menos 180 días, por lo menos 270 días o por lo menos 365 días después de la administración.
Como se utiliza en la presente, el tratamiento de rescate se refiere a una administración de una dosis de un inhibidor de VEGF después de la administración inicial de la composición farmacéutica descrita en la presente descripción. Un tratamiento de rescate se administra para reforzar la cantidad de inhibición de VEGF en el joven paciente a fin de detener o revertir los signos y síntomas de la progresión de la enfermedad. La decisión de administrar un tratamiento de rescate puede ser en criterios de diagnóstico predeterminados, como en el estudio clínico descrito en el Ejemplo 12, o en el juicio clínico del médico de que los signos de la enfermedad activa están presentes en un paciente.
En algunos aspectos, no existe evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de IOP, desprendimiento de la retina, o cualquier respuesta inmunitaria intraocular o sistémica en el sujeto humano por lo menos 120 días post administración. En algunos aspectos, no existe evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de IOP, desprendimiento de la retina, o cualquier respuesta inmunitaria intraocular o sistémica en el sujeto humano por lo menos 30 días, por lo menos 60 días, por lo menos 90 días, por lo menos 120 días por lo menos 180 días, por lo menos 270 días o por lo menos 365 días después de la administración. En algunos aspectos, no existe evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de IOP, desprendimiento de la retina, o cualquier respuesta inmunitaria intraocular o sistémica en el sujeto humano a lo sumo 30 días, por lo menos 60 días, por lo menos 90 días, por lo menos 120 días por lo menos 180 días, por lo menos 270 días o por lo menos 365 días después de la administración.
En algunos aspectos, la agudeza visual mejor corregida de un paciente (BCVA) mejora por 1, 23, 4, 5 o más líneas.
En algunos aspectos, una reducción en la neovascularización como es evaluada por la Angiografía de Fluoresceína (FA) sigue la etapa de administración.
En algunos casos, el espesor de la retina se puede medir para examinar los efectos del tratamiento. En algunos casos, el espesor de la retina central del sujeto humano no se incrementa por más de 50 mieras, 100 mieras, o 250 mieras dentro de 12 meses después del tratamiento con la composición farmacéutica de la descripción. En algunos casos, el espesor de la retina central del sujeto humano disminuye por al menos 50 mieras, 100 mieras, 200 mieras, 250 mieras, 300 mieras, 400 mieras, 500 mieras, 600 mieras dentro de 3 meses, 6 meses o 9 meses, 12 meses después del tratamiento con la composición farmacéutica de la descripción. La disminución en el espesor de la retina central del sujeto humano se puede medir comparando el espesor de la retina central en el punto en el tiempo en una medición de linea base tomada en o dentro de 1, 3, 7 o 10 dias de la administración de la composición farmacéutica de la descripción.
C. Tratamiento de Combinación con inhibidores de VEGF En algunos aspectos, el método comprende además administrar al sujeto humano una cantidad farmacéuticamente efectiva de un inhibidor de VEGF.
En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF comprende ua anticuerpo contra VEGF o un fragmento funcional del mismo. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF comprende ranibizumab. En otros aspectos el inhibidor de VEGF es un receptor soluble, proteina de fusión, o fragmento de la misma, tal como aflibercept o sFLTOl. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 dias después de la administración del inhibidor de VEGF. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra a lo sumo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 dias después de la administración del inhibidor VEGF. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se administra dentro de 90 dias después de la administración del inhibidor de VEGF.
En algunos aspectos, el paciente se trata bajo un protocolo tal como se describe en la FIGURA 13. Después de que la proteina expresada por el virus recombinante se expresa en un nivel adecuado, (o "en"), los pacientes son seguidos con retratamiento basado en criterio: a. Si la enfermedad se repite, el retratamiento de ranibizu ab se permite b. Esperar 5-8 retratamientos por año con el grupo de control c. En el grupo de tratamiento, esperar la visión equivalente con disfunción sustancial en el número de retratamientos.
El paciente es elegible para el retratamiento si los signos de CNV activo están presentes: a. Basados en los criterios objetivos como es evaluado por el personal enmascarado (téenico y oftalmólogo) b. Los criterios de retratamiento se basan en la experiencia sustancial con el tratamiento "como sea necesario" (PRN) en ensayos previos con agentes anti-VEGF.
El retratamiento se garantiza basado en los signos de la enfermedad activa; tal como; a. >10 de letra de Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) pérdida de la visita previa del sujeto humano (atribuible a causas de la retina), OR una disminución de >5 de letras ETDRS de varias visitas en conjunción con la precepción del paciente de la pérdida funcional; b. Cualquier fluido incrementado, nuevo, o subsensorial persistente, Epitelial de Pigmentos Sub-Retiniano (RPE), o intraretinal en el OCT; c. Signos de fuga de CNV incrementada a través de FA.
En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra durante por lo menos 1 vez antes de administrar la composición farmacéutica y 1 o 2 veces adicionales en aproximadamente 30 intervalos de 30 dias después de la administración para prevenir la progresión de la enfermedad mientras que la expresión de la proteina se incrementa a niveles adecuados. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra durante por lo menos 2 veces antes de la administración de la composición farmacéutica. En algunos aspectos, el inhibidor de VEGF se administra durante un periodo de 6 a 7 semanas después de la administración de la composición farmacéutica.
En algunos aspectos, la frecuencia de la administración del inhibidor de VEGF se reduce a menor que un año o se detiene por completo.
En algunos aspectos, la presente descripción se utiliza después de 3 o más tratamientos de inhibidores de VEGF. En algunos aspectos, la presente descripción se utiliza después de la observación de que los pacientes con AMD muestran mejora en BCVA después del uso de otros inhibidores de VEGF.
D. Otros Tratamientos de Combinación En otro aspecto preferido, el tratamiento de un paciente comprende la administración de una o más de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente, en conjunción con otras terapias, por ejemplo, quimioterapia, radiación, cirugía, agentes antiinflamatorios, vitaminas seleccionadas y similares. Los otros agentes se pueden administrar, antes de, después o co-administrar con las composiciones farmacéuticas.
Aspectos de la descripción se pueden practicar sin los aspectos teóricos presentados. Por otra parte, los aspectos teóricos se presentan con el entendimiento de que los solicitantes no buscan ser limitados por la teoría presentada.
Aunque aspectos preferidos de la presente descripción se han mostrado y descrito en la presente, será obvio para aquellas personas expertas en el campo que tales aspectos se proporcionan a manera de ejemplos solamente. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones ahora se presentarán para aquellas personas expertas en el campo sin apartarse de la descripción.
Se debe entender que varias alternativas a los aspectos de la descripción descritas en la presente se pueden emplear en la práctica d la descripción. Se propone que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la descripción y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes sean cubiertos de esta manera.
La dosis efectiva del ácido nucleico será una función de la proteina expresada particular, la enfermedad particular que se fija como objetivo, el paciente y su condición clínica, peso, edad, sexo, etc.
EJEMPLOS Será entendido por aquellas personas de experiencia en el campo que numerosas y varias modificaciones se pueden hacer para producir resultados esencialmente similares sin apartarse del espíritu de la presente descripción. Todas las referencias referidas en la presente se incorporan a manera de referencia en su totalidad para el contenido plantado. Los siguientes ejemplos se incluyen para propósitos ilustrativos solamente y no se proponen para limitar el alcance de la descripción.
Se debe explicar, sin no se especifica, que el porcentaje de los siguientes ejemplos todos son contenido por ciento en peso, % p.
Ejemplo 1 rAAV.sFlt-1 Un virus recombinante ejemplar es rAAV.sFlt-1. Codifica un vector y una forma humana del receptor 1 de VEGF soluble (sFLT-1), truncado. El vector es un vector vírico asociado con adeno deficiente de replicación (rAAV), recombinante, del serotipo 2.
El rAAV.sFlt-1 se fabricó bajo Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP). En el sitio de fabricación, el producto final se dividió en alícuotas en tubos de microcentrífuga de baja ligación del virus, estériles (viales de tapa plana esterilizada, de baja retención, individualmente envueltos) de acuerdo con los requisitos del protocolo (es decir 200 DI de 1 X 1010 o 1 X 10u de genomas virales) y se almacenó a -80 DC para esperar la liberación del producto final. Cada vial contuvo suficiente vector para el uso en un solo paciente (100 DI que se administra).
El virus recombinante, rAAV.sFlt-1, es un vector de virus asociado con adeno recombinante 2 (rAAV2) que lleva el receptor VEGFR soluble 1 (VEGFR1) o sFLT-1 conducido por el promotor de citomegalovirus humano (CMV). El vector rAAV.sFlt-1 y el genoma AAV2 intacto utilizado como la cadena principal se preparó como se describe en Lai y colaboradores Gene Therapy 2002 vol. 9 (12) 804-813). El vector rAAV2 está desprovisto de las secuencias de codificación virales, es decir, rep y cap se han reemplazado con un casete de expresión para el gen terapéutico. La porción activa de rAAV.sFlt-1 es sFlt-1. sFLT-1 es la forma truncada soluble del receptor del factor de crecimiento endotelial bascular 1 (VEGFRl o Fit-1) que se presenta naturalmente. sFLT-1 es el único inhibidor especifico endógeno conocido de VEGF. sFLT-1 se genera por el empalme alternativo y carece del dominio similar inmunoglobulina próximo a la membrana, en la región periférica transmembrana y el dominio de tirosina cinasa intracelular. Por consiguiente, contiene solamente los primeros seis bucles similares a inmunoglobulina extracelular seguida por 31 residuos de aminoácidos únicos. sFLT-1 primero se identificó en células endoteliales de la vena umbilical humana (HÜVEC), pero se ha descubierto desde entonces que se presenta naturalmente en la placenta y circula sistemáticamente en mujeres embarazadas. El sFLT-1 utilizado en la generación de rAAV.sFlt-1 contiene un marco de lectura abierto que codifica solo los primeros seis dominios similares a inmunoglobulina extracelular del FLT-1 periférico de membrana de longitud completa, seguido por una extensión Terminal C de 31 aminoácidos de largo, comunica, que representa la isoforma FLT-1 soluble secretada, que se empalma alternativamente descrita en lo anterior.
Mientras que la ITR ha mostrado que posee actividad promotora leve, para niveles máximos de la expresión transgénica, el casete incluye generalmente una combinación de promotor/potenciador, una secuencia de intrones pequeña, el ADNc del gen terapéutico, y una señal de poliadenilación. En el rAAV.sFlt-1, el potenciador/promotor del gen temprano inmediato principal CMV humano y un intrón quimérico se reemplazaron cadena arriba del sFLT-1 ADNc. Una señal de poliadenilación del virus de simio 40 (SV40 poli A) se colocó cadena abajo del sFLT-1 ADNc.
La ligación del sFLT-1 al VEGF in vitro se ha mostrado ampliamente. La capacidad del sFLT-1 para inhibir la angiogénesis conducida por VEGF ha traído una atención considerable por su aplicación clínica potencial, pero no se mostró evidencia de eficacia o adecuación en humanos antes del estudio clínico de rAAV.sFlt-1 descrito en el Ejemplo 12. La actividad angiostática de sFLT-1 resulta de la inhibición de VEGF por dos mecanismos: i) secuestro del VEGF, al cual se liga con alta afinidad, y ii) formación de heterodímeros inactivos con isoformas periféricas de membrana de los receptores de VEGF Flt-1 y KDR/Flk-1.
Secuencia y diagrama de nucleótidos del vector plasmidico utilizado para generar el rAAV.sFlt-1 El rAAV.sFlt-1 se generó por transfección triple de células 293 de riñón embriónico humano con ADN del vector plasmídico pSSV.CI.hsFlt-1 y plásmidos auxiliares, como es conocido en el campo (Xiao y colaboradores, 1998. J Virololgy, 72(3): 2224-2232). El rAAV.sFlt-1 se purificó utilizando un proceso de secuencial de aislamiento de núcleos, centrifugación del gradiente de densidad y cromatografía de columna por afinidad de sulfato de heparina. Una representación diagramática del vector plasmídico sFLT-1 se proporciona en la FIGURA 1.
Formulación El rAAV.sFlt-1 se formuló en solución amortiguada con fosfato estéril (pH7) a 2 concentraciones: 1 X 1010 de genoma de vector / 100 uL (dosis baja) y 1 X 1011 de genoma de vector / 100 uL (dosis alta) en tubos de microcentrífuga de ligación de virus baja estéril. La formulación es conservadores y es para una descongelación, uso individual para solamente inyección sub-retiniana. rAAVCbv Flt-1 Un segundo virus recombinante ejemplar es rAAV (bv).sFlt-1. El rAAV(bv).sFlt-1 es un vector vírico asociado con adeno deficiente de replicación (rAAV), recombinante, del serotipo 2 que se produce utilizando un sistema de expresión de baculovirus (BEVS) en células de insecto Sf9, y codifica una forma humana del receptor de VEGF soluble 1 (sFLT-1) truncado. El vector se produjo utilizando la infección en las células Sf9 con dos baculovirus recombinantes, Bac-inRep-inCap y Bac-sFlt-1. El Bac-sFlt-1 se derivó del ADN bacmido que se generó de la transformación de células electrocompetentes con un plásmido de 8.7 kb, AVAOl-pFB-CMV-sFlt, que se clonó del FragOOlm-BHKan y el V109-pFB-AAV-CMV-SV40pA-Kan de cadena principal plasmídico utilizando téenicas de biología moleculares estándares, como se describe en Maniatis y colaboradores, y como se describe adicionalmente a continuación. El FragOOlm se formó de los siguientes elementos de ácidos nucleicos secuenciales que se sintetizaron químicamente por Blue Heron Biotech, LLC (Bothell, WA) y se clonaron en una cadena principal de BHKan: una ITR (serotipo AAV 2), promotor CMV-IE, intrón quimérico, región no traducida 5' (UTR), secuencia de codificación sFlt-1, región SV40 poliA, ITR (serotipo AAV 2). El Vl09-pFB-AAV-CMV-SV 0pA-Kan plasmídico se obtuvo de Virovek, Inc. (Hayward, CA). El plásmido contuvo un gen de resistencia a antibióticos de canamicina, un origen ColEl y un casete AVV recombinante, que contuvo un promotor CMV-IE, un intrón, múltiples secuencias de clonación y una región SV40 poliA, flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITRs) de serotipo AAV 2. Este casete rAAV se flanqueó por un gen a la resistencia a la gentamicina y los sitios de unión Tn7L. El AVAOl-pFB-CMV-sFlt contuvo un promotor de T7 ARN polimerasa u otra secuencia reguladora procariota. El Bac-inRep-inCap es un baculovirus recombinante que contiene casetes de expresión para los genes rep y cap de serotipo AAV 2.
Producción de rAAV(bv).sFlt-1 en el Baculovirus El rAAV(bv).sFlt-1 se produjo en el baculovirus de acuerdo con los métodos descritos en la Solicitud de Patente de E.U.A. 12/297,958 y más específicamente como sigue: células Sf9 se desarrollaron a 28°C a aproximadamente 107 células/ml en un medio SF900 II SFM que contiene 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina, y se diluyeron a aproximadamente 5 x 106 células/ml antes de la infección. El Bac-inRep-inCap y Bac-sFlt-1, cada uno en m.o.i. de uno se utilizaron para infectar las células a 28°C durante 3 días para producir vectores de tipo 2 AAV. Después de 3 días de infección, las pelotillas celulares se recolectaron por centrifugación a 2,000 rpm durante 15 min en una centrifuga de mesa. Las pelotillas celulares se U saron en solución amortiguadora de lisis como se describe por Urabe y colaboradores Hum Gene Ther. 1; 13(16): 1935-43 (2002) y los ácidos nucleicos celulares (ADN y ARN) se digirieron por benzonasa (Sigma, St. Louis, Mo.). Los U sados celulares se limpiaron por centrifugación a 8,000 rpm durante 30 min en una centrifuga Avanti J-25 (Beckman, Fullerton, Calif.) y luego se cargaron en un tubo de centrifuga SW28 que contiene 5 mi de 1.55 g/cc, y 10 mi de 1.32 g/cc de soluciones CsCl. Después de la centrifugación a 28,000 rp durante aproximadamente 16 horas a 15°C, la fracción que contiene rAAV se recolectó al perforar el tubo de centrifuga utilizando una aguja de jeringa y se sometió a una segunda ronda de ultracentrifugación CsCl. La fracción que contiene rAAV se recolectó nuevamente al perforar el tubo de centrifuga utilizando una aguja de jeringa y se dializó en solución amortiguadora PBS para remover las sales y detergentes. Los títulos de vectores se determinaron por el ensayo de PCR en tiempo real cuantitativo de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, Calif).
Ejemplo 2 Inhibición In vitro de proliferación de células endoteliales inducida por VEGF Se llevaron a cabo estudios para evaluar la inducción de VEGF de proliferación de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y para determinar si la proliferación HUVEC inducida por VEGF se inhibiría por el sFLT.l mediado por rAAV. La presencia de sFLT-1 en las células transducidas primero se confirmó por el análisis de Western blot del medio acondicionado (FIGURA 2, panel a). El medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 y rAAV.gfp- se agregaron a las HUVECs tratadas con VEGF en diluciones de incremento. Un medio de inanición de control (medio de crecimiento de HUVEC normal sin factor de crecimiento endotelial de bovino) también se incluyó solamente. La heparina se agregó a cada pocilio a 100 mg/mL. La proliferación inducida por VEGF relativa de las HUVECS tratadas con VEGF y el medio acondicionado diferente se sometió a ensayo por la adición de 25 mL de bromuro de 3-(4,5-dimetitiazol-2-il)-2,5-difeniltetrozolio (MTT, 5 mg / mL, Sigma) a cada pocilio durante 4 horas a 37°C. El sFLT-1 secretado codificado por el vector rAAV en 40 pL del medio acondicionado de células 293 transducidas con rAAV.sFlt-1 se confirmó para inhibir la proliferación inducida por VEGF de las HUVECS por 32%. El duplicado del volumen del medio acondicionado dio por resultado la inhibición completa con crecimientos celular equivalente a niveles básales similares al cultivo en el medio de inanición (FIGURA 2, panel b).
Evaluación In vitro de la Potencia del Vector rAAV.sFt-1 Vector Se llevaron a cabo estudios para evaluar la potencia de los vectores AAV que codifican el gen sFlt-1 humano recombinante al cuantificar la expresión de la proteina sFlt- 1 humana de las células de riñón embriónicas humanas transducidas 293 (HEK293) por el ELISA. Las células de riñón embriónicas humanas 293 se obtuvieron de la Recolección de Cultivo de Tipo Americano (Rockville, MD, USA) y se cultivaron en un Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco, Grand Island, NY, EUA) con 10% de suero bovino Fetal (FBS, GIBCO) y IX de Penicilina-Estreptomicina-Glutamina. Todos los cultivos se mantuvieron a 37°C y 5% de C02 en una atmosfera humidificada.
Las células HEK293 se sembraron en 8E4 o 1.5E5 células/24 pocilios y se transdujeron en 60-90% de confluencia con los vectores AAV recombinantes en una multiplicidad de infección (MOI) que varia de Ixl03-lxl06 en un medio DMEM complementado con 2% de FBS. Después de 72 horas, post-transducción, se recolectó el medio acondicionado. Las alícuotas del medio acondicionado se prepararon para el ELISA utilizando reactivos y de acuerdo con las instrucciones estándares del kit sVEGF Rl/ sFlt-1 humano ELISA R&D Systems SVR100B Quantikine (R&D Systems, Minneapolis, MN). Las muestras, estándares y controles se prepararon de acuerdo con las instrucciones del kit de ELISA con los reactivos ELISA R&D Systems y luego se transfirieron a una placa ELISA pre-recubierta con un anticuerpo a sVEGF Rl/ sFlt-1 y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente sobre un agitador de microplacas orbital horizontal. Después de la incubación, el Conjugado anti-sVEGF R1 (dos horas), solución de sustrato (30 minutos) y la solución de detención se aplicaron secuencialmente a cada pocilio con aspiración y etapas de lavado entre cada uno de acuerdo con los procedimientos del ensayo ELISA estándar. La densidad óptica (OD) de las muestras, estándares y controles se midieron dentro de 30 minutos de detención de la reacción de sustrato con un lector de placas ELISA. La concentración de sFlt-1 en mg/mL se calculó utilizando el software SoftmaxPro utilizando las mediciones OD del lector de placas ELISA.
Los resultados de los estudios para rAAV.sFlt-1 y rAAV (bv).sFlt-1 se presentan en la FIGURA 25A y la FIGURA 25B. La concentración de la proteina sFlt-1 expresada por las células HEK293 72 horas después de la transducción con rAAV.sFlt-1 y rAAV(bv).sFlt-1 varió de 100-1,000 pg/mL en una MOI de lxlO4, 100-10,000 pg/mL en una MOI de lxlO5 y 1,000-10,000 pg/mL en una MOI de lxlO6.
Ejemplo 3 Estudios de rAAV.sFlt-1 en Ratones Ratones transgénicos (trVEGF029) con neovascularización de la retina lenta, pero estable inducida por la expresión transgénica del VEGF humano de células fotoreceptoras se utilizaron como un modelo para la neovascularización de la retina. Se habían conducido dos estudios separados con estos ratones.
En el primer estudio de ratón, 13 ratones transgénicos se evaluaron para cambios neovasculares oculares antes y después de la administración del vector rAAV.sFlt-1 (1 X 1011 de partículas de vector) en un ojo y el vector de control en el ojo contralateral. Los ojos se evaluaron para cambios neovasculares utilizando angiografía de fluoresceína en uno, tres y ocho meses después de la inyección. El grado, intensidad y etapa de neovascularización se graduó (0 - 4) por tres observadores, enmascarados al tratamiento recibido en los ojos examinados. Hubo una reducción general estadísticamente significativa en la clasificación neovascular de un grado medio de '3' (antes de la inyección) a un grado medio de 1' en un mes después de la inyección (P = 0.012). Esta reducción se mantuvo a tres meses (media = 1; P = 0.001) y a ocho meses (media = 1; P = 0.001) después de la inyección con rAAV.sFlt-1. La inyección del vector rAAV.sFlt-1 dio por resultado la regresión a largo plazo (por lo menos ocho meses) de vasos neovasculares en 85% (11 de 13) de ojos tratados comparados con 8% (1 de 13) en los ojos tratados con vector de control.
La examinación histológica de los ojos en este estudio preclinico reveló que la alteración o pérdida de fotoreceptores fue significativamente (P < 0.01) o más pronunciada en los ojos inyectados con vector de control comparado con los ojos inyectados con rAAV.sFlt-1. La expresión de sFLT-1 también se confirmó por el análisis de reacción en cadena de transcriptasa-polimerasa inversa de muestras de tejido; el ARNm para sFLT-1 se detectó en los cuatro ojos sometidos a prueba. No se notaron efectos adversos específicos del vector rAAV.sFlt-1 en el ojo inyectado con rAAV.sFlt-1 cuando se comparó con el ojo inyectado con el vector de control (rAAV.gfp).
En el segundo estudio, conducido en ratones transgénicos trVEGF02, el objetivo del estudio fue determinar si la inyección sub-retiniana de rAAV.sFlt-1 dio por resultado cualquiera de las respuestas inmunes mediadas por células que podrían impactar negativamente en la expresión a largo plazo del sFLT-1 o provocar daño asociado con la respuesta inmunitaria a la retina. En este estudio, 50 ratones transgénicos trVEGF02 se les administró inyecciones sub-retinianas de rAAV.sFlt-1 (8 X 109 de partículas virales) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en un ojo. L as retinas de 30 ratones de cualquiera de los grupos del tratamiento rAAV.sFlt-1 o de control se evaluaron en una semana y un mes post-inyección para la presencia de células inmunes (leucocitos, macrófagos y linfocitos B y T). El examen citométrico de flujo de la taza del ojo posterior mostró que a una semana post-inyección hubo un incremento estadísticamente significativo en los leucocitos CD45+ (incremento de 6.6 veces comparado con el control; P < 0.05) y los macrófagos CDllb+ (incremento de 5.7 veces comparado con el control; P < 0.036). Sin embargo, no hubo diferencias en CD19+, CD8+ y CD4+ (linfocitos B y T) en este punto de tiempo. D un mes post-inyección, no hubo diferencias en los números de células entre los subconjuntos de leucocitos (es decir, células CD45+, CD19+, CDl lb+, CD8+ o CD4+) en los ojos de los ratones tratados con rAAV.sFlt-1 o el control de PBS, sugiriendo que la infiltración de los leucocitos y los macrófagos fue transciente. La evaluación citométrica de flujo de los subconjuntos de linfocitos de los bazos de estos ratones en los puntos de tiempo de una semana y un mes no mostró diferencias significativas en los números de linfocitos. Este descubrimiento sugiere que no hubo respuesta inmunitaria sistémica observada, aunque una respuesta inmunitaria localizada, transciente se había observado en la retina.
En este segundo estudio, el examen histológico de los ojos de cinco de los ratones inyectados con ya sea rAAV.sFlt-1 o PBS no revelaron una respuesta inmunitaria observable asociada con la destrucción o secuelas en las retinas de cualquiera de los ratones examinados.
Para evaluar el impacto de rAAV.sFlt-1 en el nivel de neovascularización en este modelo de ratón transgénico (trVEGF02) de la neovascularización de la retina, las retinas de los ratones inyectados con ya sea rAAV.sFlt-1 o PBS también se clasificaron independientemente por dos asesores diferentes a dos meses después del tratamiento. En general, no hubo reducción significativa en los grados de neovascularización medios (antes de la inyección: 1.46 ± 0.58; después de la inyección: 0.81 ± 0.57; P < 0.00015) en los ojos inyectados con rAAV.sFlt-1 mientras que hubo un incremento significativo en los grados de neovascularización medios (antes de la inyección: 1.08 ± 0.56; después de la inyección: 1.63 ± 0.96; P < 0.018) en los ojos inyectados con control de PBS.
Los descubrimientos de ese segundo estudio de ratones indican claramente que el tratamiento con rAAV.sFlt-1 pareció que revierte el incremento progresivo o en la neovascularización observada en este modelo de ratón de neovascularización de la retina y AMD. Adicionalmente, solo se observó una respuesta inflamatoria, localizada, limitada en una semana después de la inyección sub-retiniana con rAAV.sFlt-1 y se resolvió en un mes. Esta respuesta inmunitaria no pareció que comprometiera la eficacia terapéutica a largo plazo del rAAV.sFlt-1 en la retina.
Los modelos de ratones transgénicos descritos en este Ejemplo 3 muestran que las composiciones farmacéuticas descritas en la presente se pueden utilizar para el tratamiento y/o profilaxis de otras enfermedades vasculares de la retina en las cuales se implica la inhibición de VEGF. Estos incluyen edema diabético, isquemia diabética de la retina, edema diabético de la retina, retinopatía diabética proliferativa, oclusión de las venas de la retina, oclusión de las venas de la retina central y oclusión de las venas de la retina ramificada. En estudios clínicos algunos inhibidores de VEGF tal como Lucentis, han mostrado que efectivamente ciertas de estas enfermedades incluyendo edema diabético macular y oclusión de las venas de la retina. La eficacia de rAAV.sFlt-1 mostrada en estos modelos de ratón indica que el rAAV.sFlt-1 también es efectivo en el tratamiento de estas enfermedades mediadas por VEGF.
Ejemplo 4 Estudio de rAAV.sFlt-1 en Ratas En el estudio de rAAV.sFlt-1 ratas, se utilizaron dos modelos de neovascularización ocular: neovascularización de la cornea inducida por cauterización y neovascularización coroidea inducida por fotocoagulación por láser (CNV). En el modelo de neovascularización de la cornea, 22 ratas se inyectaron con vector rAAV.sFlt-1 (8 X 10 de partículas virales) en la cámara anterior de un ojo y con el vector de control (rAAV.gfp) en el ojo contralateral, seguido por cauterización de la cornea. Los ojos luego se examinaron para neovascularización cuatro días después de la cauterización utilizando fotografía con lámpara de hendidura. Una velocidad significativamente menor de vascularización de la cornea se encontró en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1 comparados con los ojos tratados con control (27% y 63%, respectivamente; P = 0.009). El examen histológico de los ojos mostró que no se observaron vasos sanguíneos de la cornea en la mayoría de los ojos tratados con rAAV.sFlt-1 cauterizados. El examen histológico también reveló que la infiltración celular de la capa estromal de la cornea fue más pronunciada en los ojos inyectados con vector de control comparado con los ojos tratados con rAAV.sFlt-1. Además, no hubo edema obvio e hinchamiento del estroma de la cornea unos ojos tratados con vector de control mientras que no hubo evidencia de hinchamiento de tejido significativo en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1.
En el modelo CNV inducido por fotocoagulación por láser, 10 ratas se inyectaron subretinianamente con el vector rAAV.sFlt-1 vector (8 X 108 de partículas virales) en un ojo, y un vector de control (rAAV.gfp) en el ojo contralateral. La fotocoagulación por láser se utilizó para inducir la CNV un mes después de la inyección. Cinco semanas después de la fotocoagulación con láser, los ojos se examinaron para CNV utilizando angiografía de fluoresceína. Solamente 41% de las áreas tratadas con láser mostraron fuga en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1 comparados con 60% en los ojos tratados con vector de control (P = 0.002). Dieciséis semanas después de la CNV inducida con láser, los ojos tratados con rAAV.sFlt-1 aun mostraron una neovascularización significativamente menor que los ojos de control. El examen histológico de los ojos en las áreas inmediatamente adyacentes a los sitios de inyección reveló un epitelio pigmentado de la retina normal y segmentos exteriores normales y la capa nuclear exterior. Estos descubrimientos sugirieron que no hubo toxicidad obvia asociada con la expresión sFLT-1. Electroretinogramas también indicaron el funcionamiento normal de los ojos tratados con rAAV.sFlt-1. La mayoría de la lesiones con láser tratadas con rAAV.sFlt-1 y vector de control desarrollaron membranas celulares sub-retinianas. Sin embargo, las lesiones en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1 tuvieron generalmente menos proliferación de células endoteliales, reflejando los descubrimientos de angiografía de fluoresceína, e indicando que la velocidad del angiogénesis (es decir neovascularización) se redujo en los ojos tratados con rAAV.sFlt-1.
Estudio de rAAV.sFlt-1 y rAAVfbvVsFlt-1 en Modelo de Ratas de Diabetes Para evaluar adicionalmente la seguridad y eficacia del rAAV.sFlt-1 y rAAV(bv).sFlt-1 para el tratamiento de retinopatia diabética (DR) y edema diabético macular (DME), se condujo un experimento en un modelo de rata de diabetes.
La pérdida de visión en pacientes diabéticos es mediada por inflamación, conduciendo al rompimiento eventual de la barrera hematoretiniana y fuga vascular subsecuente, dando por resultado edema macular. El modelo de rata diabético de estreptozotocina (STZ) muestra un patrón bien caracterizado de fuga vascular, en la cual el VEGF se regula por incremento en gran medida tan temprano como en 2 semanas. (Miyamoto, K., y colaboradores Proc Nati Acad Sci USA 96, 10836-10841 (1999). Los elementos actuales para tratar modelos animales DR muestran solamente una resolución parcial de la fuga vascular.
La diabetes es inducida en ratas Brown Noruegas por inyección intraperitoneal de estreptozotocina (50 mg/kg). La diabetes se confirma y se monitorea por mediciones de glucosa en la sangre. Las ratas con glucosa en la sangre > 350 mg/dl se consideran diabéticas. Ocho dias después del inicio de la diabetes, las ratas se tratar por inyección sub-retiniana (n = 12 ojos por grupo) con 5 mL conteniendo ya sea lxlO10 o 5xl010 vg de rAAV.sFlt-1 o rAAV (bv).sFlt-1 utilizando téenicas establecidas como se describe en Chalberg, T.W. y colaboradores Invest Ophthalmol Vis Sci 46, 2140-2146 (2005). El AAV2.GFP (5xl010 vg) y el vehículo se inyectaron como controles. Los grupos no de tratamiento no diabéticos y diabéticos también se utilizaron como controles.
El efecto del sFLT-1 gue expresa rAAV(bv).sFlt-1 en la fuga vascular se mide a los 60 días. La fuga vascular de la retina se mide por el método de fuga de FITC-albúmina después de la inyección utilizando la albúmina conjugada con FITC como un trazador. El método de fuga de FITC-albúmina mide directamente la fuga de FITC-albúmina que se fuga en la retina de la circulación y es un método comúnmente utilizado para medir la permeabilidad vascular de la retina. La fuga vascular de la retina en los ojos inyectados se comparará con los controles no diabéticos, los ojos diabéticos no tratados y tratados con vehículo, y los serotipos AAV de tipo natural 2 y 8.
Resultados: sFLT-1 que expresa rAAV(bv).sFlt-1 reduce la fuga vascular en la rata diabética STZ mientras que la inyección de AAV2.GFP y otros controles no lo hace.
Ejemplo 5 Estudio rAAV.sFlt-1 en Monos La eficacia y seguridad del rAAV.sFlt-1 también se examinó en un modelo de primate no humano (macaco) de AMD utilizando fotocoagulación con láser para inducir la CNV. Un reto en el desarrollo del tratamiento para AMD en humanos es que los primates no humanos no desarrollan AMD. La CNV inducida por fotocoagulación con láser simula algunos síntomas de AMD, pero el proceso biológico subyacente es la sanación de una lesión aguda antes que la progresión de una enfermedad crónica y de esta manera puede no ser predictivo del desempeño de cualquier tratamiento particular para la CNV en humanos con AMD u otras enfermedades basadas en CNV. No obstante, debido a que los ojos humanos son anatómicamente más similares a los ojos del primate no humano que los ojos de los no primates, los primates no humanos se estudian frecuentemente para evaluar la toxicidad y la respuesta histológica a un tratamiento potencial o a otra intervención.
En el primer estudio en los primates no humanos, cinco monos macacos se inyectaron subretinianamente con rAAV.sFlt-1 (4 X 1012 de partículas virales) en un ojo, y un vector de control (rAAV.gfp) en el ojo contralateral. La salud del ojo de los monos se avaluó periódicamente después de la inyección sub-retiniana. No hubo complicación evidente relacionada directamente con la inyección sub-retiniana de ya sea el control o el vector rAAVsFlt-1. Una irritación conjuntival transitoria y opacidad del humor vitreo se notó en la semana después de la inyección, el cual se aclaró por la segunda semana. La inyección sub-retiniana no fue exitosa en el ojo derecho de uno de los monos; por lo tanto este animal no se sometió a evaluación adicional.
La inyección sub-retiniana de 40-100 uL de suspensión rAAV levantó la retina, creando una burbuja que alojó el vector entre el epitelio del pigmento y la capa fotoreceptora en una manera localizada. Esta burbuja se auto-corrigió dentro de 24 a 48 horas. Excepto para una alteración menor al epitelio pigmentado de la retina en el punto de la penetración de la aguja, no se observaron anormalidades de la retina durante la duración del seguimiento (3 a 17 meses post-inyección). No se observaron otras anormalidades o eventos adversos; en ningún momento se asoció el desprendimiento de la retina con la cirugía.
Para evaluar la eficacia terapéutica a largo plazo del rAAVsFlt-1, los cuatro monos inyectados luego se sometieron a fotocoagulación con láser intenso 16 meses después del tratamiento con los vectores. Se indujeron ocho lesiones utilizando el láser en cada ojo, y los ojos luego se monitorearon para CNV a dos y cuatro semanas después del tratamiento con láser. Después de la fotocoagulación con láser, solamente tres de los cuatro monos fueron analizables, por lo tanto, los datos de eficacia se recolectaron para tres animales. Ninguno de los ojos de los tres monos tratados con rAAVsFlt-1 desarrollaron lesiones relacionadas con CNV y solamente se observó una tinción de fluoresceina débil, indicando fuga / neovascularización mínima. Todos os ojos contralaterales tratados con el vector de control desarrollaron lesiones relacionadas con CNV.
En un estudio de seguimiento dirigido en la evaluación de la seguridad y toxicidad del rAAV.sFlt-1 inyectado en el espacio sub-retiniano, se utilizaron ocho monos: cinco se inyectaron en sus ojos izquierdos con rAAV.sFlt-1, dos se inyectaron en sus ojos izquierdos con rAAV.gfp, uno se inyectó en ambos ojos con proteína Flt-1 recombinante y uno se mantuvo como control inyectado. Los monos se examinaron pre-inyección y post-inyección por la fotografía de fondo de color, angiografía de fluoresceina y electroretinografxa. La sangre se recolectó de manera rutinaria para someter a ensayo los niveles de sFLT-1 y los linfocitos de sangre periférica se aislaron para citometría de flujo para evaluar la respuesta de sub-conjunto de células inmunes. En el momento del sacrificio (3, 912 meses post-inyección), los tejidos se recolectaron para i) estudios de biodistribución en el vector rAAV.sFlt-1 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real o en ADN genómico extraído; ii) la proteína hsFlt-1 y la cuantificación del nivel de proteína de la cápside AAV2 por el ELISA; y iii) histología de los ojos.
La fotografía de fondo de color, angiografía de fluoresceína y electroretinografía no detectaron ningún efecto adverso en los ojos después de la inyección. El nivel de sFLT-1 en plasma no mostró ningún aumento relacionado con la inyección de rAAV.sFlt-1 en el nivel en cualquiera de los exámenes de monos machos o hembras. Excepto para una muestra del nervio óptico, la secuencia rAAV.sFlt-1 no se detectó en el ADN genómico de cualquiera de los otros tejidos muestreados (nodos linfáticos, bazo, hígado, cerebro, corazón, cornea). Secciones incrustadas en parafina teñidas con hematoxilina y eosina de los ojos parecieron normales.
Mientras que la anatomía del primate no humano es más similar a la anatomía humana que la anatomía de mamíferos más pequeños tales como ratones, existen limitaciones que hacen los estudios en primates no humanos intrigantes, pero no predictivos de los resultados clínicos en humanos. Como se indica en lo anterior, el estudio en este ejemplo usa un modelo de lesión con láser en el cual el animal de otra manera tiene tejido de la retina sano. El tejido de la retina no se degradó a través del tiempo como en el tejido de la retina enfermo tampoco están factores patogénicos específicos de la enfermedad presente. Los primates no humanos difieren frecuentemente de los humanos con respecto a la biodistribución, farmacocinética y dependencias de dosis, titulo de anticuerpo, respuesta inmunitaria y respuesta inflamatoria en formas que no son predecibles. Las diferencias adicionales incluyen la ILM (membrana limitante interior) y el volumen de la cámara vitrea, que es aproximadamente 4 veces más grande en humanos que en los primates no humanos utilizados en este estudio. La membrana limitante interior humana, una barrera que actúa paras limitar el transporte entre la retina y el humor vitreo, es una barrera más profunda y efectiva que la ILM de un mono.
Ejemplo 6 Estudios de Seguridad En estos estudios, la proteína sFLT-1 se midió en el humor vitreo y en el plasma de los animales utilizando un kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para la detección de la proteína sFLT-1. El nivel de proteína sFLT-1 se reguló por incremento en el humor vitreo y en los ojos de los animales inyectados con rAAV.sFlt-1. Las FIGURA 3A muestra el nivel de proteina sFLT-1 en el humor vitreo en los ojos de los monos inyectados con rAAV.sFlt-1 (ojo izquierdo) y el ojo de control inyectado con rAAV.gfp y los ojos no inyectados (ojo derecho). Los niveles de proteina sFLT-1 fueron significativamente más altos en cuatro de los cinco ojos inyectados con rAAV.sFlt-1. La Tabla 5.3.1 muestra el nivel de proteina sFLT-1 en los ojos de ratones que no se inyectaron y que se inyectaron con rAAV.sFlt-1 y se enuclearon en un mes post-inyección. La sobre expresión de el sFLT-1 en los ojos de los ratones y el humor vitreo de los monos no tuvo ningún efecto adverso en su bienestar general. En los monos, la sobre expresión de sFLT-1 en el humor vitreo no tuvo ningún efecto en su función de la retina y no tuvo ninguno de efectos tóxicos clínica o histológicamente evidentes en los ojos. Los niveles de proteina sFLT-1 significativamente más altos en los ojos inyectados con rAAV.sFlt-1 sugiere una expresión hsFLT-1 mediada por rAAV a largo plazo y soporta los datos previos en la detección de la secuencia de ARNm viral y la presencia de la expresión gfp mediada por rAAV en la retina del mono 17 meses postinyección.
La Tabla 1 resume los niveles de proteina hsFLT-1 en los ojos de ratones inyectados con rAAV.sFlt-1 y ojos de ratones no inyectados a 1 mes post-inyección.
Los niveles de hsFLT-1 en el plasma en los monos no mostraron ninguna tendencia en los diferentes tiempos de muestreo (FIGURA 3B). Estos sugieren que la inyección de rAAV.sFlt-1 no tuvo un efecto obvio en el nivel de hsFLT-1 en el plasma. Los niveles fluctiantes no tuvieron ningún efecto en el bienestar de los monos.
Tabla 2 Estudios de Inmunogenicidad Tabla 2: Resumen de la cepa animal, vía de inyección, duración y dosis de rAAV.sFlt-1 utilizado en los estudios de inmunogenicidad Ejemplo 7 Estudios de inmunogenicidad en ratones La respuesta inmunitaria celular a la terapia de rAAV.sFlt-1 se evaluó en el ojo del ratón, uno dos y cuatro semanas post-inyección utilizando citometría de flujo. Se identificaron leucocitos de infiltración sobre la base de la expresión CD45 y se clasificación como monocitos/granulocitos, células B, células CD4+ T, y células CD8+ T sobre la base de expresión de CDllb, CD19, CD4 y CD8, respectivamente. La taza del ojo posterior se recolectó de cinco ratones en cada grupo (inyectados con rAAV.sFlt-1, inyectados con PBS, de control no inyectados) y se acumularon para análisis. Como se muestra en la FIGURA 4A, no hubo diferencia en el número de células recuperadas de cada grupo de ratones durante el curso de este experimento. Sin embargo, no hubo incremento significativo en el número de células CD45+ una y dos semanas post-inyección que desaparecieron por cuatro semanas (FIGURA 4B). Casi todo el incremento observado en una semana podría ser atribuido a un incremento en las células CDllb+ (FIGURA 4C), puesto que no hubo diferencia en el número de células CD4+, CD8+, y CD19+ (FIGURAS 4D-F). A las dos semanas aunque, ya no hubo una diferencia significativa en el número de CDllb+ presentes en los ojos de ratones inyectados con AAV.sFlt-1; en cambio, hubo un incremento significativo en el número de células CD4+ y CD8+ T y una tendencia posible hacia un incremento en las células B. El número de células CD4+ y CD8+ que descendieron en gran medida a las cuatro semanas todavía permanecieron significativamente incrementadas comparadas con los ratones inyectados con PBS y no inyectados. En contraste, no hubo cambio en el número de células CDllb+, CD4+, CD8+ y CD19+ en el bazo durante el curso de este experimento (FIGURAS 5A-E).
La función de las células T que infiltran la retina se examinaron más estrechamente al estimularlas con PMA/ionomicina o anti-CD3 y al medir la producción de IFN-gama intracelular por la citometría de flujo. La FIGURA 6 muestra que comparados con los controles no inyectados, una pequeña porción de células tanto CD4+ como CD8 T se cebaron para producir IFN-gama después de la inyección de rAAV.sFlt-1. La frecuencia de células productoras de IFN-gama no variaron significativamente durante el curso del experimento a pesar de un incremento evidente entre las células CD8+ T en el día 3 (FIGURA 6B). Los niveles más bajos de IFN-gama se midieron cuando las células T se re-estimularon con un epítopo restringido por MHC clase I de la proteína de la cápside rAAV y algún IFN-gama también se detectó en ausencia de cualquier estimulación (datos no mostrados). Tomados conjuntamente, estos resultados indican una proporción pequeña de las células T que infiltran los ojos de los ratones inyectados con rAAV.sFlt-1 que se habían activado recientemente para producir el IFN-gama, pero no esto no varió entre cualquiera del subconjunto de las células T durante el curso de este experimento.
Los datos presentados para estos experimentos en la filtración de células inmunes en los ojos de ratones inyectados con AAV-sFLT-1 muestran claramente dos ondas de infiltración celular. Fue una onda temprana de células CDllb1 a 1 semana seguido por una onda de células T CD4+ y CD8+ a las 2 semanas. De manera importante, ni la onda de infiltración aún estuvo presente a las 4 semanas, sugiriendo la infiltración se había resuelto sola. De manera importante, la producción de proteínas sFLT-1 no declinó en este punto, y de hecho, continuó siendo expresada en niveles muy altos.
Los datos en la producción de IFN-gamma indicaron que aproximadamente 5% de las células T CD4+ y CD8+ se cebaron recientemente, y esta frecuencia no varío durante el curso del experimento. Hu., y colaboradores primero describieron el rompimiento de la barrera hematoretiniana o las células T activadas, y los datos presentados en este punto son consistentes con la infiltración de las células CD4+ y CD8+ activadas. Sin embargo, no hubo evidencia de un incremento en el número de células T específicas de la cápside entre esta población puesto que la re-estimulación con el péptido específico reveló solamente bajos niveles de producción de IFN-gamma que no cambiaron durante el curso del experimento. Tomadas conjuntamente, estas observaciones sugieren que la lesión inicial que se presenta con la inyección de rAAV.sFlt-1 produjo una onda de vida corta de infiltración de células inmunes que se resolvió sola dentro de cuatro semanas, pero no logró inducir una respuesta inmunitaria en curso que podría dañar los tejidos del ojo o afectar la expresión.
Ejemplo 8 Estudios de Inmunoqenicidad en Monos La respuesta inmunitaria después de la inyección subretiniana de rAAV.sFlt-1 o rAAV.gfp se analizó utilizando un panel de anticuerpos que identificarían cambios en las poblaciones de subconjunto de células inmunes. Los resultados se resumen en la FIGURA 4. En algunos monos, cambios muy pequeños en las poblaciones de subconjunto de células inmunes se observaron pero no fueron estadísticamente significativos. A pesar de esto, esto se siguió por un estudio más en profundidad de las células circulantes. Específicamente, se evaluó la posibilidad de que ya sea el vector (rAAV) o el producto génico insertado (sFLT-1) pueden provocar activación inmune. La activación de células B y células T se investigó (FIGURA 5 y FIGURA 6). Otras poblaciones de linfocitos también se analizaron para determinar si la terapia provocó cualquiera de las diferencias observables que pueden ser indicativas de la activación directa o una respuesta a la activación. El análisis se condujo utilizando una combinación de marcadores clásicos (Pitcher, 2002 #129), asi como un análisis fenotipico novedoso descrito en el reporte recientemente publicado (Miller, 2008 #126). La utilización de un subconjunto pequeño de marcadores fenotipicos (HLA-DR, Ki-67, y Bcl-2) se investigó después de la administración de células T rAAV-sFLT-1 CD4+ o CD8+ T y/o células B mostraron signos de activación. En los estudios publicados por Miller y colaboradores, las células T activadas muestran un fenotipo efector activado caracterizado por la expresión del marcador de diferenciación HLA-DR y el ciclo celular asociado con el antigeno nuclear Ki-67, que se utiliza como un marcador para la proliferación. Las células T en reposo no expresan Ki-67, mientras que el ciclado o las células T recientemente divididas regulan por incremento la expresión de Ki-67. Un nivel de expresión Ki-67 se detecta normalmente como parte del ciclado de células homeostáticas.
Ejemplo 9 Biodistribución de rAAV.sFlt-1 El ADN genómico se extrajo de tejidos recolectados (nervio óptico, nodo linfoide, cerebro, corazón, pulmones, bazo, hígado, córnea) inmediatamente después del sacrificio de los monos. La reacción en cadena de la polimerasa en tempo real se llevó a cabo en el ADN genómico para determinar si el constructo del vector rAAV.sFlt-1 inyectado en el espacio subretiniano estaría presente en algún lugar. Basado en la comparación de los valores Ct entre las cantidades conocida del plásmido de control pssv.C 1 .sflt-1 ADN, el constructo rAAV.sFlt-1 se encontró en el número de copias de genes bajo en el nervio óptico de un ojo inyectado y no en cualquiera de las otras muestras de tejido esto sugiere que el rAAV.sFlt-1 inyectado en el espacio subretiniano permanece principalmente dentro del ojo. La Tabla 4 es un resumen de los valores Ct del ADN genómico extraído de monos que no se inyectaron o se inyectaron con rAAV.sFlt-1- y rAAV.gfp.
Tabla 3: Valores Ct y valores de desviación estándares Ct para el ADN genómico diferente y muestras de ADN de plásmido de control analizados Ejemplo 10 Estudios de Eficacia en un Modelo de Ratón de neovascularización de la retina Ratones transgénicos generados a través de la regulación por incremento de VEGF en las células fotoreceptoras se utilizaron en el estudio. Un ojo se inyectó con rAAV.sFlt-1 y el ojo contralateral se inyectó con rAAV.gfp. El grado, intensidad, y etapa de neovascularización se clasificaron por observadores enmascarados basados en una escala acordada. Los resultados mostraron que hubo una reducción general estadísticamente significativa en los grados de neovascularización de un media de 3 (grave) a una media de 1 (leve) en un mes post-inyección (P = 0.012). Este bajo nivel de fuga de fluoresceína se mantuvo a tres (media = 1; P = 0.001) y ocho meses (media 1; P = 0.001) post-inyección de rAAV.sFlt-1 sugiriendo el efecto terapéutico sostenido, a largo plazo del rAAV.sFlt-1.
Tabla 4: Clasificación de los ojos antes y después de la inyección de AAV.sFlt-1 y AAV.gfp y los números/pilas de fotoreceptores a los 8 meses post-inyección.
Gradosen Númerosde Filas de Regresión tiempo (meses) fotoreceptoresfotorecept pos-inyección ores ID del a0 1 3 8 animal 243 L G 0 0 068.8+14.lb 4-8 Moderada 243 R 1 3 3 3 0 0 Ninguna 244 L 2 1 1 1 72.8+1 S.8h 3-7 Moderada 244R 1 3 2 1 5.8+3.1 0-1 Ninguna 247 L 2 2 0 080.8±31.Ob 3-8 Significa tiva 247 R 1 1 1 1 28.3+33.3 0-4 Ninguna 249 L 3 1 1 1 0 0 Significa tiva 249 R 3 3 3 4 7.2±13.10-1 Ninguna 250 L 3 1 1 1 65.1 +24.4b 3-8 Significa tiva 250 R 3 3 3 3 0 0 Ninguna 251L 3 2 1 1 0 O Significa tiva 251R 3 3 3 4 0 O Ninguna 253 L 3 2 i i 73.8±20.39b 5-7 Significa tiva 253 R 3 3 2 20±30.30-2 Moderada 254 L 3 O O 61.8+14.3b 4-6 Significa tiva 254 R 2 2 2 0-1 Ninguna 324 L 1 1 1 1 ND ND Ninguna 324 R 1 1 1 1 ND ND Ninguna 326L 2 1 1 1 ND ND Moderada 326R 2 2 2 2 ND ND Ninguna 327 L 2 2 O 0 ND ND Significa tiva 327 R 2 3 2 2 ND ND Ninguna 329 L 3 2 2 2 ND ND Moderada 329 R 2 2 2 2 ND ND Ninguna 330 L 3 3 2 3 ND ND Ninguna 330 R 3 3 3 3 ND ND Ninguna L= ojo izquierdo inyectado con AAV.sFlt-1, R= ojo derecho inyectado con AAV.GFP, ND= no hecho a3 dias antes de la inyección con vectores AAV. b Diferencia estadísticamente Significativa en los números de fotoreceptores (p<0.01).
Ejemplo 11 Estudios de eficacia en un modelo de mono de neovascularización coloidal inducida por láser Cinco monos se inyectaron en un ojo con rAAV.sFlt-1 y en el otro con rAAV.gfp. La inyección subretiniana fue ineficaz en el ojo derecho de uno de los monos; por lo tanto este animal no se sometió a evaluación adicional. La inyección subretiniana de 40-100 ml de una suspensión de rAAV levantó la retina, creando una burbuja que alojó el vector entre el epitelio pigmentario y la capa fotoreceptora en una manera localizada. Esta burbuja se autocorrigió dentro de 24 a 48 horas. Excepto para una alteración menor al epitelio pigmentario de la retina en el punto de la penetración de la aguja, no se observaron otras anormalidades de la retina por la duración del seguimiento (3 a 17 meses post-inyección). No se observaron otras anormalidades o eventos adversos; en ningún momento el desprendimiento de la retina se asoció con la cirugía.
Para evaluar la eficacia terapéutica a largo plazo del rAAVsFlt-1, los cuatro monos inyectados luego se sometieron a fotocoagulación por láser intensa 16 meses después del tratamiento con los vectores. Se indujeron ocho lesiones utilizando el láser en cada ojo, y los ojos luego se monitorearon para neovascularización coloidal a las dos y cuatro semanas después del tratamiento con láser. Después de la fotocoagulación con láser, solamente tres de los cuatro monos fueron analizables, por lo tanto, los datos de eficacia se recolectaron para los tres animales. Ninguno de los ojos de los tres monos tratados con rAAVsFlt-1 desarrolló lesiones relacionadas con neovascularización coroidea y solamente se observó una tinción de fluoresceina débil, indicando fuga/neovascularización mínima. Todos los O]os contralaterales tratados con el vector de control desarrollaron lesiones relacionadas con neovascularización coroidea. Los datos de eficacia para los tres animales se representan en la Tabla 5.
Tabla 5: Efecto de la administración subretiniana de rAAV.sFlt-1 o el vector de control (rAAV.gfp) en CNV inducida por láser en monos macacos Lesiones por CNV despues de la Angiografía de Fondo de Fluoresceinat Mono Tiempo de CNVOj o Derecho (rAAV . sFlt-1 ) Ojo Izquierdo (rAAV. sFlt- No . inducida por 2 Semanas 4 Semanas 1 ) láser (meses) * 2 Semanas 4 Semanas ? 16 078 078 G/8 678 2 16 0/8 0/8 0/8 3/8 4 16 0/8 0/8 0/8 2/8 *CNV se induj o a los 16 meses después de la inyección subretiniana de rAAVs .
Número de lesiones maculares con neovascularización ( fuga de f luoresceina) después de la fotocoagulación por láser .
La función de la retina de los monos se evaluó por electroretinograf ia . Las amplitudes y tiempos implícitos de las respuestas del oj o inyectado y el ojo contralateral no inyectado se calcularon y se compararon pre-inyección y en diferentes tiempos después de la inyección . Los resultados mostraron que la inyección de rAAV. sFlt-1 , la proteína sFLT-1 recombinante o el rAAV. gfp no tuvieron ningún efecto adverso en la función de la retina de los monos.
Ejemplo 12 El estándar de cuidado en el tratamiento de AMD húmeda implica inyección intraocular frecuente de proteínas anti-VEGF recombinantes cada 4-8 semanas. Un constructo rAAV se había desarrollado para una proteína anti-VEGF potente (Kd ~ 10 pM), de origen natural, tirosina cinasa-1 relacionada con Fms soluble (sFlt-1), para el tratamiento de AMD húmeda. El rAAV.sFlt-1 se produjo de acuerdo con las directrices de la FDA e ICH en el Laboratorio de Aplicación Humana de Núcleo del Vector UNC. Se condujo un estudio controlado de ocho pacientes en la seguridad y eficacia del rAAV.sFlt-1. Los criterios de elegibilidad, inclusión y exclusión para el estudio fueron como sigue: Criterios de Elegibilidad Edades Elegibles para el Estudio: 65 Años y de mayor edad Géneros Elegibles para el Estudio: Ambos Aceptaciones de Voluntarios Sanos: Ninguno Criterios de Inclusión: • Edad mayor que o igual a 65 años; • CNV subfoveal secundaria a la AMD y con mejora agudeza visual corregida de 20/80 - 20/400 o mejor en el ojo contralateral; • Angiograma de fluoresceína del ojo del estudio debe mostrar evidencia de una fuga de lesión neovascular coroidea subfoveal; • Debe ser un candidato para inyecciones intravitreas anti-VEGF; • La dimensión completa de la lesión no debe exceder 12 áreas de disco estudio de fotocoagulación Macular; • Ningún tratamiento de la retina previo de terapia fotodinámica o láser; • Capaz de proporcionar el consentimiento informado; • Los participantes tienen laboratorio clínicamente aceptable y ECG en el momento del enrolamiento; y • Capaces de cumplir con los requisitos del protocolo, incluyendo visitas de seguimiento.
Criterios de exclusión: • Enzimas hepáticas > 2 X límite superior de normal; • Evidencia clínica de infección activa de cualquier tipo, incluyendo adenovirus, hepatitis A, B, o C, o virus de V1H; • Cualquier tratamiento previo para AMD en el ojo de estudio/control, excluyendo inyecciones anti-VEGF; • Un desgarro en el epitelio pigmentado de la retina; • Tejido de cicatrización submacular extensivo; • Enfermedad de la retina Significativa diferente a la CNV AMD, tal como retinopatía diabética u oclusión vascular de la retina; • Enfermedad no de la retina Significativa tal como atrofia ocular o cataratas; • Alergia conocida a la fluoresceina; • Uso actual de prednisolona, otros esteroides anti inflamatorios o fármacos de supresión inmune. Los fármacos no de esteroides tales como aspirina son permitidos; • Cualquier otra enfermedad o trastorno significativo que, en la opinión del investigador, puede poner ya sea los participantes en riesgo debido a la participación en el estudio, o pueden influir en el resultado del estudio, o la capacidad del participante a participar en el estudio; • Los participantes quienes han participado en otro estudio de investigación implicando un producto de investigación en las pasadas 12 semanas; y • Sensibilidad a la Penicilina.
Procedimiento de administración: La composición farmacéutica que contiene rAAV.sFlt-1 se administró a sujetos objetivo en una instalación apropiada para inyección subretiniana de acuerdo con el siguiente procedimiento: 1. La piel periocular y los márgenes del párpado y las pestañas del ojo del sujeto se limpiaron con 5% de povidona yodada antes de la colocación del apósito; 2. Un apósito corporal completo estéril se colocó seguido por un apósito de ojos adicional. 3. Espéculo de párpados insertado, asegurando que esté colocado por debajo de los párpados para dirigir las pestañas lejos del campo y protegerse por el apósito de ojos. 4. Puertos de vitrectomia 3 x 23G o 25G insertados; 5. Infusión de solución salina conectada al 1er puerto; 6. Fibra óptica insertada en el 2nd puerto; 7. Una cánula subretiniana 36G-41G se conectó a la jeringa de fármaco a través de un microconector en el tercer 3rd; 8. Bajo control microscópico, se inyectan 100 microlitros bajo la retina; 9. Después de la inyección, se retiran los instrumentos y los puertos; 10. Se aplicó ungüento de cloranfenicol; 11. Una gota de 1% de atropina de un contenedor de uso individual estéril se instiló; y 12. Se aplicaron una almohadilla de ojos y una protección de ojos.
Los resultados del estudio rAAV.sFlt-1 se resumen en la presente.
Los ocho sujetos enrolados (hombres de 77 años de edad) todos tuvieron neovascularización coroidea subfoveal activa, con agudeza visual de 20/40 a 20/400, y habían recibido previamente entre 1 y 25 inyecciones intravitreas de ranibizumab. Los pacientes se distribuyeron aleatoriamente en los tres grupos, un grupo de control y dos grupos experimentales. Todos los pacientes recibieron inyecciones intravitreas de ranibizumab en el día 1 y el día 30 del estudio. En el día 7, 1 x 1010 de genomas de vector de rAAV.sFlt-1 en 100 ul de volumen se administraron a través de inyección subretiniana al primer grupo experimental y 1 x 1011 de genomas de vector de rAAV.sFlt-1 en 100 ul de volumen se administraron a través de la inyección subretiniana al segundo grupo experimental. En los seis casos para pacientes en los grupos experimentales, la burbuja de fluido subretiniano se resolvió dentro de 4 horas. Después de 24 horas, la mayoría del aire en el humor vitreo se había absorbido y solamente el sitio de la inyección retiníana permaneció visible. Un paciente desarrolló una hemorragia menor asociada con el procedimiento que no afectó la visión. Como se esperabas después de la vitrectomía, hubo un incremento transciente en los conteos de neutrófilos que regresaron a normal a los 14 días post-inyección. La secuencia del vector se descubrió en los desgarros de un sujeto en un día post-inyección que se eliminaron por el día 30. Diferente a esta ocurrencia individual, el AAV2 no se detectó en ninguna de las muestras de sangre, saliva u orina del sujeto, ya sea por qPCR o ELISA hasta la fecha. Los niveles de fondo de la proteina sFLT-1 de origen natural mostraron una variación de linea base alta en la orina, suero y saliva sin incremento después del tratamiento. Los niveles de sFLT-1 en el humor vitreo también variaron entre los sujetos (975-2085pg/ml). La bioquímica de sangre, conteo de sangre completa, y repuestas a células T, permanecieron sin ningún cambio significativo comparado con la línea base. La inyección subretiniana de4 rAAV.sFlt-1 no mostró toxicidad de la retina clínicamente Significativa como es evaluada por exámenes oftálmicos en serie durante un período de dos meses. No estuvieron presentes signos inflamatorios superficiales, de segmentos anteriores o vitreos en cualquiera de los sujetos. No hubo evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de IOP, desprendimiento de la retina, o cualquier otra respuesta inmunitaria intraocular o sistémica en cualquiera de los pacientes. Un resumen de tratamientos anti-VEGF, tanto inicial como de rescate, se resumen para cada paciente en la Tabla 6.
Tabla 6: Resumen de Inyecciones de Ranibizumab por Paciente Nota: protocolo, inyecciones en el Día 0 y Dia 30 fueron obligatorias para todos los pacientes en el estudio.
Notablemente, ninguno de los pacientes en los grupos experimentales requirieron tratamiento de rescate en el dia 60 y la mayoría de los pacientes en el grupo experimental de dosis más baja requirieron 0 tratamientos de rescate en el día 90, día 120, día 150, día 180 o día 210 o día 270 o día 365 (1 año). El paciente de control requirió múltiples tratamientos de rescate. Estos resultados son inesperados y prolongan la promesa de la terapia génica para el cohorte grande de pacientes de edad avanzadas que padecen de AMD húmeda. Generalmente, los pacientes tratados con terapia anti-VEGF actual, tal como inyecciones intravítreas de una proteína inhibidora de VEGF u otro agente anti-VEGF requerirán inyecciones adicionales a 30, 60 o 90 días.
Los niveles de expresión máximos de sFLT-1 en un sujeto de estudio o un paciente se alcanzan seis a ocho semanas después de la administración subretiniana de rAAV.sFLT-1. Durante esto, el así llamado período de "aumento", por lo menos uno, dos a tres inyecciones intravitreas de un agente anti-VEGF se inyectan en intervalos de 15 a 45 dias, y de manera preferente de aproximadamente intervalos de 30 dias, para prevenir la progresión de la enfermedad. Se prefiere administrar la primera inyección intravitrea de un agente anti-VEGF entre 1 a 30 dias, y de manera preferente entre 5 a 10 dias, antes de la administración de rAAV.sFlt-1 para permitir la absorción del agente anti-VEGF intravitreamente inyectado (Lucentis o Avastin o Eylea u otros agentes no de sFLT). Esta primera inyección intravitrea se administra menor que 24 horas de la administración subretiniana de rAAV.sFLT, se puede lavar del humor vitreo durante el procedimiento de inyección subretiniana conduciendo a una concentración de agente anti-VEGF sub-terapéutico y la progresión de la enfermedad.
Después de la terminación del periodo de aumento, los pacientes quienes expresan suficiente sFLT-1 para tratar o prevenir la progresión de su AMD pueden no necesitar inyecciones anti-VEGF intravitreas adicionales aunque se espera que permanezcan bajo el cuidado de un médico. Los pacientes se monitorean y se tratan en una base como sea necesario basado en los criterios objetivos, tal como una medición del espesor de la retina de punto central incrementada con una tomografia de coherencia óptica.
En este estudio, pacientes en el control y en ambos grupos experimentales se evaluaron para signos de neovascularización coroidea activa sobre una base mensual aproximada y se volvieron a tratar con ranibizumab intravitreo si cualquiera de los siguientes criterios se cumplió. - >10 De letras de Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) pérdida de la visita previa del sujeto (atribuible a causas de la retina), OR una disminución de >5 de letras ETDRS de la visita previa en conjunción con la percepción del paciente de la pérdida funcional; - Cualquier fluido incrementado, nuevo, o subsensorial persistente, Epitelial del Pigmento sub-Retiniano (RPE), o intraretinal en el OCT; - Signos de fuga de CNV incrementada a través del FA.
Ejemplo 13 To oqrafía de Coherencia (OCT) La tomografia de Coherencia Óptima de Dominio Espectral (SD-OCT) se llevó a cabo utilizando el equipo aprobado (Heidelberg SpectralisMR SD-OCT) y téenicas estándares para monitorear el espesor de la retina de punto central y la fuga de fluido en la retina de los pacientes.
La Tomografia de Coherencia Óptica (OCT) es una teenología de formación de imágenes médica no de contacto para ultrasonido y MRI. Con la OCT, la luz reflejada se utiliza para producir imágenes transversales detalladas y 3D del ojo. La SPECTRALISMR SD-OCT mide simultáneamente múltiples longitudes de onda de la luz reflejada a través de un espectro, por consiguiente el nombre de dominio espectral. La velocidad incrementada y el número de escaneos se traducen en una resolución más alta y una mejor probabilidad de observar la enfermedad. En los pacientes con AMD húmeda, la detección del nuevo fluido de la retina o un incremento clínicamente significativo en el espesor de la retina se puede detectar por la SD-OCT. (Adhi y colaboradores, Curr Opin Ophthalmol. 2013 May; 24(3):213-21; Malamos y colaboradores, Invest Ophthalmol Vis Sci.2009 Oct; 50(10):4926-33). La detección de estos síntomas en un paciente con AMD indica la progresión de la enfermedad que garantiza el tratamiento con una terapia anti-VEGF tal como Lucentis o Eylea.
La salud de la retina y los síntomas de la progresión de la AMD de cada sujeto en el estudio se monitorearon a través de SD-OCT. Por lo menos 6 escaneos radiales a través de la mácula, cada uno de aproximadamente 6mm en longitud, fueron tomados; y las imágenes/escaneos de OCT se recolectaron en cada visita especificada. Las imágenes de SD-OCT se evaluaron por la presencia de fluido intraretiniano por un lector enmascarado y el espesor de la retina central se midió utilizando el software Heidelberg Hcyex SD-OCT. Los resultados del espesor de la retina central para cada visita para 8 pacientes se presentan a continuación en la Tabla 7.
Tabla 7: Cambio Medio en el Espesor de la Retina Central de la Linea Base en el Dia 0 en mieras por el grupo de dosificación.
Como se muestra en la tabla 7, el espesor de la retina central medio de los sujetos en todos los cohortes de dosificación disminuyeron después de la administración de las inyecciones intravitreas de la proteina anti-VEGF (Lucentis) en el inicio del estudio como es requerido por el protocolo. Como se esperaba, el espesor de la retina central de los pacientes en el grupo de control comenzó a incrementarse y el fluido se puede observar en las imágenes dentro de 30 - 90 dias de la administración de la proteina anti-VEGF. Inesperadamente, el espesor de la retina central de los sujetos en los grupos de dosificación bajos y altos se controla generalmente bien por el rAAV.sFlt-1 y no se incrementa a través del tiempo. No se presenta nuevo fluido intraretiniano en las retinas de los sujetos de grupo de dosis baja o los sujetos de grupo de dosis alta. Esto se muestra por la OCT, por ejemplo, en la Figura 24. A los 12 meses, el espesor de la retina central de los sujetos tratados con rAAV.sFlt-1 no se incrementó por más de 50 mieras, o por más de 100 mieras, o por más de 250 mieras dentro de 12 meses de administración de una composición farmacéutica gue comprende rAAV.sFlt-1. Cuando se compara contra la linea base, el espesor de la retina central de los sujetos humanos tratados con rAAV.sFlt-1 disminuyó por 50 mieras o en algunos casos por 100 mieras o en algunos casos, por 200 mieras. Esta disminución se observó dentro de 8 semanas de administración de sFlt-1 y se mantuvo a 3 meses, 6 meses, 9 meses y 12 meses. Este resultado es sorprendente y es desconocido en el tratamiento clínico de la AMD y la neovascularización ocular en los sujetos humanos. De manera más general, sin administraciones adicionales de una proteína anti-VEGF u otro inhibidor de VEGF, el fluido intraretiniano y un incremento en el espesor de la retina central se observará dentro de 30 días, 60 días, 90 días o 180 días de un tratamiento anti-VEGF inicial.
Angiografía de Fluoresceina (FA) La FA se llevó a cabo utilizando una téenica estándar. Las imágenes de tránsito se tomaron del ojo del estudio. Las imágenes de fase media y tardía se tomaron del ojo del estudio y no del estudio; y la FA se obtiene en cada visita especificada.
Estudios de Biodistribución La diseminación del vector se investigó por la amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los genomas de vector aislados de las muestras de lágrimas, plasma, orina y saliva. La biodistribución del vector y sFLT-1 se investigó por el ELISA para sFLT-1 y las cápsidas AAV2 en el plasma, lágrimas y saliva.
Extracción del ADN Las muestras (100-300 ul) se pipetearon en Tarjetas de Recolección de Muestras (Qiagen, Valencia, CA) o aplicadores de punta de espuma estériles. El ADN se extrajo de cada muestra conforme al protocolo del fabricante. El ADN purificado se disolvió en 50 ul de solución amortiguadora de elución. La cantidad de ADN presente se determinó por espectrofotometría.
Detección del rAAV.sFlt-1 por PCR en Tiempo Real Muestras de ADN genómico (0.5-1 pg) se clasificaron para la presencia del vector AAV.sFlt-1 utilizando los Ensayos de Expresión Génica TaqManMR (Applied Biosystems, U.E.A.). El ensayo consiste de un par de cebadores de PCR no etiquetados que amplifican un fragmento entre el AAV2 y las secuencias sFLT-1, y una sonda TaqManMR con una etiqueta de tinte de FAMMR o VICMR y una porción de ligador de hendidura menor en el extremo 5', y un tinte de enfriamiento rápido no fluorescente en el extremo 3'. Las condiciones de cielado fueron 1 mantenido durante 2 minutos a 50°C y otro mantenido a 95°C durante 20 segundos, seguido por 45 ciclos de 95°C durante 3 segundos y 60°C durante 30 segundos.
Las muestras positivas para el fragmento rAAV.sFlt-1 se sometieron a prueba adicionalmente y el número de copias de genes de rAAV.sFlt-1 presentes se cuantificaron por la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR). Entre 0.5-1.0 ug de ADN extraído se amplificaron en 20-ul de mezclas de reacción que contienen Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) y 0.5 uM de cada cebador utilizando el sistema de PCR en tiempo real IQ5 Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, California, USA). Un conjunto similar de muestras enriquecidas con ADN plásmido que contiene la secuencia objetivo se ajustaron en paralelo como las muestras enriquecidas. El par cebador utilizado (delantero: CACTAGTCCAGTGTGGTGGA; inverso: AGCCAGGAGACAACCACTTC) se designó con la ayuda de Primer3 Output (Whitehead Institute, MA, USA) para amplificar la región del ADNc de vector en el gen sFLT-1 utilizando el Rotorgene (Corbett). La condiciones de cielado que se utilizaron fueron: 2 minutos a 50.0°C, 2 minutos a 95.0°C y 60 ciclos de tres etapas de 95.0°C durante 20 s, 60.0°C durante 20 s y 72.0°C durante 20 s. Se generó una curva estándar en cada corrida de diluciones de 10 veces del ADN plásmido (pSSV.sFlt-1) que tuvieron la misma secuencia de vector objetivo. Cada muestra se analizó en triplicado.
Cuantificación de la Concentración de Proteina sFlt-1 por el ELISA La concentración de sFLT-1 presente en el plasma, lágrimas y saliva se midieron cuantitativamente por el ELISA utilizando un kit Quantikine ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) que se basó en la téenica de inmunoensayo de intercalación. Las muestras (100 ul) se agregaron a las placas de 96 pocilios recubierta con un anticuerpo monoclonal especifico para VEGF Rl/sFLT-1 y se dejaron incubar durante 2 horas. Cualquier sFLT-1 no ligado se removió por lavado con una solución amortiguadora. Después de la incubación con un anticuerpo policlonal ligado a enzimas especifico para VEGF Rl/sFLT-1, el exceso de conjugado de anticuerpo-enzima se lavó y las muestras luego se incubaron con una solución de substrato. La formación de cromonógeno catalizado con enzimas se cuantificó al medir la absorbancia visible a 450 nm. Las concentraciones de sFLT-1 (en mg/ l) en las muestras se calcularon del valor de la absorbancia utilizando una curva de calibración graficada con sFLT-1 humano recombinante.
Detección del AAV2 por el ELISA La presencia de la cápside AAV2 en el plasma, lágrimas, orina y saliva se analizó utilizando el Kit de AAV2 Titration ELISA (American Research Products, Inc., Belmont, Massachusetts, USA). Este kit se basa en una téenica ELISA de intercalación y utiliza un anticuerpo monoclonal de ratón especifico para un epitopo conformacional en las partículas AAV ensambladas. Este anticuerpo monoclonal se recubre en las tiras de microplacas y se utiliza para capturar las partículas de AAV del espécimen. Las partículas AAV capturadas se detectaron en dos etapas. Primera un anticuerpo monoclonal conjugado con biotina AAV se ligó al complejo inmune. En la segunda etapa, el conjugado de estreptavidina-peroxidasa reacciona con las moléculas de biotina. La adición de la solución de substrato da por resultado una reacción de color que fue proporcional a las partículas de virus específicamente ligadas. La absorbancia se midió fotométricamente a 450 nm. El control del kit proporcionado contiene una preparación de partículas AAV de cápsidas vacías y permitió la determinación cuantitativa de las muestras de un título de partículas desconocido. Las muestras (100 ul) se agregaron a las placas y el ensayo se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Detección del Anticuerpo 2 Neutralizante El plasma se sometió a ensayo para la capacidad de bloquear la transducción de las células HEK293 con AAV2.gfp. El plasma del paciente se diluyó en serie en un suero de ratón normal en placas de múltiples pocilios. El AAV2.gfp se agregó a cada pocilio y las placas se incubaron a 37°C durante 1 hora antes de la adición a las células HEK293 en triplicado. El título del anticuerpo neutralizante se expresó como la dilución en plasma que dio por resultado 50% de inhibición de la transducción por el AAV2-gfp. La actividad de gfp máxima se representó por el vector diluido en suero de ratón normal; la inhibición máxima se representó por el medio solamente en el suero de ratón normal. El plasma de línea base de cada sujeto se sometió a ensayo junto con cada muestra después de la operación. Las células verdes de la transducción de las células 293T con AAV2.gfp se contaron en los pocilios de prueba después de 48 horas y se compararon con el número de células verdes en la muestra de suero de línea base.
Detección de los Anticuerpos Anti-AAV2 Para detectar los anticuerpos de plasma a la cápside AAV2, placas ELISA de ligación a proteínas mejorada se recubrieron con 109 vg/ml de AAV2 (Vector Core Facility, North Carolina) a 4°C durante la noche. Las placas se bloquearon a 37°C durante 2 horas y luego se incubaron a 4°C durante la noche con anticuerpo monoclonal anti-AAV2 diluido en serie (Industries International, Concord, MA) o diluciones de 1:50, 1:100, 1:200, o 1:400 de plasma del paciente. Las placas se incubaron con Ig antihumana conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) a 37°C durante 2 horas, luego con substrato de tetrametil-benzidina (TMP) y peróxido de hidrógeno (H202). La reacción se detuvo por ácido fosfórico (H3P04) y se lcyó a 450 nm sobre un lector de placas. El título de los anticuerpos anti-AAV2 se calculó basado en la curva estándar del anticuerpo comercial determinado en paralelo. Cada valor se determinó en triplicado.
Atrofia Geográfica Los sujetos del estudio humano se examinaron para signos de atrofia geográfica en sus ojos tratados y no tratados de acuerdo con las téenicas estándares. Los incrementos de la atrofia geográfica no se observaron en pacientes tratados con rAAV.sFlt-1 a 3 meses, 6 meses, 9 meses, o 12 meses. Se hizo la hipótesis que el tratamiento puede detener la progresión de la atrofia geográfica en un ojo tratado por hasta 15 meses, 18 meses, 24 meses, 36 meses, 5 años y 10 años.
Ejemplo 14 Para probar adicionalmente la seguridad y eficacia del rAAV.sFlt-1 para el tratamiento de la AMD y la neovascularización coroidea, cuarenta (40) sujetos adicionales se enrolaron en un estudio clínico controlado. Como en el Ejemplo 12, el rAAV.sFlt-1 se produjo de acuerdo con las directrices de la FDA e ICH en el Laboratorio de Aplicación Humana del Núcleo de Vector UNC. Los criterios de elegibilidad, inclusión y exclusión para el estudio fueron como sigue: Elegibilidad: Edades Elegibles para el Estudio: 55 Años y de Mayor Edad Géneros Elegibles para el Estudio: Ambos Acepta Voluntarios Sanos: No Criterios de Inclusión: • Edad mayor que o igual a 55 años; • CNV subfoveal secundaria a la AMD y con mejor agudeza visual corregida en el ojo del estudio 20/30 - 20/400 y 20/200 o mejor en el ojo contralateral; • Angiograma de fluoresceína del ojo del estudio debe mostrar evidencia de una fuga de lesión neovascular coroidea subfoveal; o neovascularización coroidea actualmente bajo manejo activo con terapia anti-VEGF; • Debe ser un candidato para inyecciones intravitreas de anti-VEGF; • La dimensión completa de la lesión no debe exceder 12 áreas de disco de Estudio de Fotocoagulación Macular; • Sin tratamiento de la retina previo de terapia fotodinámica o láser; • Capaz de proporcionar consentimiento informado; • El participante tiene parámetros de laboratorio clínicamente aceptables y ECG en el momento del enrolamiento; y • Capaz de cumplir con los requisitos del protocolo, incluyendo visitas de seguimiento.
Criterios de Exclusión a: • Enzimas hepáticas > 2 X límite superior de normal; • Evidencia clínica de infección activa de cualquier tipo, incluyendo adenovirus, hepatitis A, B, o C, o virus de V1H; o historial documentado de hepatitis B o hepatitis C; • Cualquier tratamiento previo para AMD en el ojo del estudio / control, excluyendo inyecciones anti-VEGF; • Un desgarro en el epitelio pigmentado de la retina; • Cicatrización sub-fóvea extensiva, atrofia geográfica extensiva, o sangre subretiniana gruesa en el ojo del estudio como es determinado por el investigador; • Enfermedad de la retina Significativa diferente a la CNV AMD sub-fóvea, tal como retinopatia diabética u oclusión vascular de la retina, que podrían comprometer la visión en el ojo del estudio; • Enfermedad no de la retina Significativa tal como atrofia ocular o cataratas Significativa en el ojo del estudio, incluyendo cicatrización de la córnea central que afecta la agudeza visual, glaucoma con efectos de campo, o cualquier uveítis medible; • Alergia conocida a la fluoresceína; • Uso actual de prednisolona, otros esteroides anti inflamatorios o fármacos de supresión inmunitarios. Esteroides inhalados y fármacos no esferoidales tales como aspirina son permitidos; • Cualquier otra enfermedad o trastorno significativo que, en la opinión del investigador, pueden poner a los participantes en riesgo debido a la participación en el estudio, o pueden incluir en el resultado del estudio, o la capacidad del participante para participar en el estudio; • Los participantes quienes han participado en otro estudio de investigación implican un producto de investigación en los pasadas 12 semanas; y • Sensibilidad a la penicilina confirmada por los registros médicos del participante.
Los sujetos enrolados iniciales tuvieron neovascularización coroidea subfoveal activa, con agudeza visual en el ojo del estudio de 20/30 a 20/400, u habían recibido previamente entre 0 y 25 inyecciones intravítreas de ranibizumab. Los pacientes se distribuyeron aleatoriamente en un grupo de control o un grupo experimental hasta un total de 14 pacientes de control y se enrolaron 26 pacientes experimentos. Todos los pacientes recibieron inyecciones intravítreas de ranibizumab en el día 1 y día 30 del estudio. En el día 7, 1 x 1011 de genomas de vector de f rAAV.sFlt-1 en 100 ul de volumen se administraron a través de inyección subretiniana al grupo experimental.
Como en el estudio en el Ejemplo 12, los niveles de expresión máximos de sFLT-1 en un sujeto de estudio o un paciente se alcanzaron seis a ocho semanas después de la administración subretiniana de rAAV.sFLT-1. Durante esto, el así llamado período de "aumento", por lo menos una, dos o tres inyecciones intravítreas de cualquier agente anti-VEGF se inyectaron en intervalos de 15 a 45 días, y de manera preferente de aproximadamente intervalos de 30 días, para prevenir la progresión de la enfermedad. Se prefiere administrar la primera inyección intravítrea de un agente anti-VEGF entre 1 a 30 días, y de manera preferente entre 5 a 10 días, antes de la administración de rAAV.sFLT-1 para permitir la absorción del agente anti-VEGF intravítreamente inyectado (Lucentis o Avastin o Eylca u otros agentes no de sFLT). Si esta primera inyección intravítrea se administra menor que 24 horas antes de la administración subretiniana de rAAV.sFLT, se puede lavar del humor vitreo durante el procedimiento de inyección subretiniana conduciendo a una concentración de agente anti-VEGF subterapéutico y a progresión de la enfermedad.
Después de la terminación del período de incremento, los pacientes quienes expresaron suficiente sFLT-1 para tratar o prevenir la progresión de su AMD u otros síntomas de neovascularización coroidea no necesitaron inyecciones anti-VEGF intravítreas adicionales aunque se esperó que permanecieran bajo el cuidado de un médico.
En este estudio citado en este ejemplo, los pacientes en los grupos de control y experimentales se evaluaron para signos de vascularización coroidea activa sobre una base de aproximadamente mensual y se volvieron a tratar con ranibizumab intravítreo si cualquiera de los siguientes criterios se cumplieron: - pérdida de >10 letras de Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) de la visita previa del sujeto (atribuible a causas de la retina), OR una disminución de >5 letras ETDRS de la visita previa en conjunción con la percepción del paciente de la pérdida funcional; - Cualquier fluido incrementado, nuevo, o subsensorial persistente, del Epitelio Pigmentario sub-Retiniano (RPE), o intraretiniano en la OCT; - Signos de fuga de CNV incrementada a través de FA.
Ejemplo 15 Para probar la seguridad y eficacia del rAAV.sFlt-1 para la prevención o profilaxis de la enfermedad neovascular ocular degeneración Macular Relacionada con la edad (AMD), se conduce un estudio clínico controlado adicional con cuarenta (150) pacientes. El rAAV (bv).sFlt-1 se produce de acuerdo con las directrices de la FDA e ICH en Lonza Houston, Inc. (Houston, Texas). Los criterios de elegibilidad, inclusión y exclusión para el estudio fueron como sigue: Elegibilidad: • Edades Elegibles para el Estudio: 50 Años y de más edad • Géneros Elegibles para el Estudio: Ambos • Acepta Voluntarios Sanos: Si Criterios de Inclusión: • Pacientes con AMD no exudativa (cualquiera de las categorías 2, 3 o 4 de acuerdo con los criterios AREDS; en el grupo 4 los ojos con AMD no avanzada se incluirán); pacientes con AMD clasificada como ya sea "húmeda" o "seca" se incluyen; • Edad entre 50 y 90 años; • Capaz de entender y cumplir con los requisitos del ensayo; • Agudeza Visual > 0.4; Criterios de Exclusión: • Actualmente enrolado en un ensayo clínico oftálmico; • Ojos con trastornos maculares o coroideas concomitantes diferentes a la AMD y con signos indefinidos de AMD; • Ojos con una diagnosis de AMD exudativa con neovascularización subretiniana activa (SR V) o lesiones por CNV que requieren fotocoagulación con láser en el ojo del estudio; • Sujetos con opacidades del cristalino oculares Significativas que provocan disminución de visión; • Sujetos con ambliopía; • Sujetos con enfermedad nerviosa del nervio óptico (neuropatía, atrofia, papiledema), glaucoma inestable como se define por las presiones infraoculares mayores que 25 m Hg, 3 o más medicamentos de glaucoma, C/D de 0.8 o mayor y campos visuales consistentes con el glaucoma; historial de cirugía retina-vitrea, miopía degenerativa, enfermedad inflamatoria infraocular posterior activa, uso crónico de medicamentos de esferoides oculares tópicos, retinopatías vasoproliferativas (diferentes a la AMD), desprendimiento de la retina regmatogénea, y distrofias maculares heredadas; • Sujetos con marcapasos de tipo de demanda o epilepsia; • Sujetos con hipertensión no controlada (definida como diastólica de 90 o mayor y sistólica de 150 o mayor); • Sujetos con historial reciente (dentro del año anterior) de enfermedad vascular cerebral; • manifestado con ataques isquémicos transcientes (TIA's) o accidentes vasculares cerebrales (CVA's); • Sujetos con un historial de SIDA; • Sujetos quienes han tenido una cirugía infraocular en el ojo del ensayo dentro de 3 meses antes del enrolamiento del ensayo; • Pacientes quienes no están disponibles para pegarse a los programas de examinación de visita; Mediciones de Resultados Primarios El MPOD y electroretinogramas multifocales [Marco de Tiempo: 1 año] [Designado como problema de seguridad: Si] Mediciones de Resultados Secundarios: La seguridad y eficacia del rAAV(bv).sFlt-1 en la reducción del riesgo de desarrollar AMDm avanzada. [Marco de Tiempo: 1 año] [Designado como problema de seguridad: Si] Tabla 9: Brazos de Diseño experimental Ejemplo 16 Para probar la seguridad y eficacia del rAAV.sFlt-1 para el tratamiento de la enfermedad neovascular ocular, Edema diabético macular (DME), se conduce un estudio clínico controlado adicional con cuarenta (40) pacientes. rAAV (bv).sFlt-1 se produce de acuerdo con las directrices de la FDA e ICH en Lonza Houston, Inc. (Houston, Texas). Los criterios de elegibilidad, Exclusión para el estudio fueron como sigue: Elegibilidad: • Edades Elegibles para el Estudio: 18 Años y de más edad • Géneros Elegibles para el Estudio: Ambos • Acepta Voluntarios Sanos: No General Criterios de Inclusión: • Los sujetos son elegibles si se cumplen los siguientes criterios: • Disponibilidad para proporcionar consentimiento informado escrito y, en los sitios de los Estados Unidos, Autorización de Lcy de Portabilidad de Seguro Médico y rendición de cuentas (HIPAA), y en otros países, como sea aplicable de acuerdo con las leyes nacionales.
• Diabetes mellitus (Tipo 1 o 2).
• Espesor de la retina secundaría a la diabetes mellitus (DME) que implica el centro de la fóvea con espesor macular central > 275 mm en el subcampo central como es evaluado en la tomografía de coherencia óptica (OCT).
• Registro de mejor agudeza visual corregida (BCVA) en el ojo del estudio de 20/40 a 20/320 aproximado al equivalente Snellen utilizando el protocolo de Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) en una distancia de prueba inicial de 4 metros.
• Disminución en la visión determinada a ser principalmente el resultado de la DME y no por otras causas.
• Capacidad (en la opinión del investigador) y disponibilidad para regresar para todas las visitas y evaluaciones programadas.
Criterios de Exclusión: • Historia de la cirugía vitreoretiniana en el ojo del estudio.
• Fotocoagulación panretiniana (PRP) o fotocoagulación por láser macular en el ojo del estudio dentro de 3 meses de clasificación.
• Retinopatía diabética proliferativa (PDR) en el ojo del estudio, con excepción de la PDR de regresión.
• Neovascularización del iris, hemorragia vitrea, desprendimiento de la retina por tracción, o fibrosis preretiniana que implica la mácula en el ojo del estudio.
• Tracción vitreomacular o membrana epiretiniana en el ojo del estudio.
• Inflamación ocular (incluyendo trazas o por arriba) en el ojo del estudio.
• Historia de uveitis idiopática o autoinmune en cualquier ojo.
• Daño estructural al centro de la mácula en el ojo del estudio que es probablemente que impida la mejora en VA después de la resolución del edema macular, incluyendo atrofia del epitelio pigmentario de la retina (RPE), fibrosis retiniana, o placa de exudado dura organizada.
• Trastornos oculares en el ojo del estudio que pueden confundir la interpretación de los resultados del estudio, incluyendo oclusión vascular de la retina, desprendimiento de la retina, agujero macular, o neovascularización coroidea (CNV) de cualquier causa (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad (AMD), histoplasmosis ocular, o miopía patológica).
• Cirugía de cataratas en el ojo del estudio dentro de 3 meses, capsulotomía con láser de itrio-aluminio-granate (YAG) dentro de los pasados 2 meses, o cualquier otra cirugía intraocular dentro de los 90 días precedentes al Día 0.
• Glaucoma no controlado o cirugía de filtración previa en el ojo del estudio.
• Presión sanguínea no controlada.
• Historia de accidente vascular cerebral o infarto al miocardio dentro de 3 meses antes del Día 0.
• Diabetes mellitus no controlada.
• Deficiencia renal que requiere diálisis o trasplante renal.
• Historia de otra enfermedad, disfunción metabólica, hallazgo de examen físico, o hallazgo de laboratorio químico dada una sospecha razonable de una enfermedad o afección que contradiga el uso de un fármaco de investigación, podría afectar la interpretación de los resultados del estudio, o hace que el sujeto esté en alto riesgo de complicación de tratamiento.
Mediciones del Resultado Primario: • Porcentaje de Pacientes Quienes Ganan > 15 Letras en su Registro de Mejor Agudeza Visual Corregida (BCVA) de la Línea Base en el Mes 12 [Marco de Tiempo: Línea Base al Mes 12] [Designado como problema de seguridad: No] Mediciones de Resultados Secundarios • Cambio Medio de la Línea Base en el Registro de Mejor Agudeza Visual Corregida (BCVA) en los Meses 12, 24 y 36 • Porcentaje de Pacientes con un equivalente de Snellen de Agudeza Visual (VA) de 20/40 o Mejor en los Meses 12, 24 y 36.
• Cambio Medio de la Línea Base en el espesor de la fóvea central como es medido por SD-OCT en los Meses 12, 24 y 36.
• Reducción en la Frecuencia del tratamiento anti-VEGF concomitante (por ejemplo Lucentis, Avastin, Macugen o Eyelea) [Designado como problema de seguridad: No] Tabla 10 : Brazos de Diseño Experimentales para el Estudio DME Los sujetos enrolados iniciales tienen DME, con agudeza visual en el ojo del estudio de 20/40 a 20/320, y habían recibido previamente entre 0 y 25 inyecciones intravítreas de ranibizumab o aflibercept. Los pacientes se distribuyeron aleatoriamente en un grupo de control o dos grupos experimentales hasta un total de 14 pacientes de control y 13 pacientes experimentales de dosis baja y 13 pacientes experimentales de dosis alta se enrolaron. Todos los pacientes recibieron inyecciones intravitreas de ranibizumab en el día 1 y dia 30 del estudio. En el dia 7, 1 x 1010 o 1 x 1011 de genomas de vector de rAAV(bv).sFlt-1 en un volumen de 100 ul se administraron a través de inyección subretiniana a los grupos experimentales.
Como en el estudio, en el Ejemplo 12, los niveles de expresión máximos de sFLT-1 en un sujeto de estudio o un paciente que se alcanzaron son seis a ocho semanas después de la administración subretiniana de rAAV(bv).sFlt-1. Durante este asi llamado periodo de "incremento", por lo menos uno, dos o tres inyecciones intravitreas de un agente anti-VEGF se inyectaron en intervalos de 15 a 45 dia, y de manera preferente de aproximadamente intervalos de 30 dias, para prevenir la progresión de la enfermedad. Se prefiere administrar la primera inyección intravitrea de un agente anti-VEGF entre 1 a 30 días, y de manera preferente entre 5 a 10 días, antes de la administración de rAAV(bv).sFlt-1 para permitir la absorción del agente anti-VEGF intravitreamente inyectado (Lucentis o Avastin o Eylea u otros agentes no sFLT). Si esta primera inyección intravitrea se administra menor que 24 horas antes de la administración subretiniana de rAAV(bv).sFLT, se puede lavar de humor vitreo durante el procedimiento de inyección subretiniana conduciendo a una concentración de agente anti-VEGF sub-terapéutico y progresión de la enfermedad.
Después de la terminación del periodo de incremento, los pacientes quienes expresan suficiente sFLT-1 para tratar o prevenir la progresión de su DME pueden no necesitar inyecciones anti-VEGF intravitreas adicionales aunque se espera que permanezcan bajo el cuidado del médico.
En este estudio citado en este ejemplo, los pacientes en los grupos de control y experimentales se evalúan para signos de DME activa o nueva y la neovascularización sobre una base aproximadamente mensual y se vuelven a tratar con ranibizumab intravitreo si se cumplieron cualquiera de los siguientes criterios: pérdida de >10 letras de Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) de la visita previa del sujeto (atribuible a las causas de la retina), OR en una disminución de >5 letras ETDRS de la visita previa en conjunción con la percepción del paciente de la pérdida funcional; - Cualquier fluido incrementado, nuevo, o subsensorial persistente, de epitelial pigmentario sub-Retiniano (RPE), o intraretiniano en la OCT; Signos de fuga de CNV incrementada a través de FA.
Ejemplo 17 Para probar la seguridad y eficacia de rAAV.sFlt-1 para el tratamiento de la enfermedad neovascular ocular Oclusión de las venas de la retina (RVO), se conduce un estudio clínico controlado adicional con cuarenta (40) pacientes. El estudio clínico se lleva a cabo con pacientes de 22 cohortes, 1 cohorte que incluye pacientes con Oclusión de las venas de la retina Central (CRVO) y 1 cohorte que incluye Oclusión de las venas de la retina Ramificada (BRVO). Como en el Ejemplo 15, el rAAV (bv).sFlt-1 se produce de acuerdo con las directrices de la FDA e ICH en Lonza Houston, Inc. (Houston, Texas). Los criterios de elegibilidad, inclusión y exclusión para el estudio fueron como sigue: Criterios de Inclusión: • Edema macular implicado central secundario a la oclusión de las venas de la retina central (CRVO) o edema macular implicado ramificado secundario a BRVO por no más de 9 meses con espesor de su campo central medio > 250 mm en la tomografía de coherencia óptica (OCT); • Adultos > 18 años; • Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) mejor agudeza visual corregida (BCVA) de 20/40 a 20/320 (73 a 24 letras) en el ojo del estudio; Criterios de Exclusión: • Cualquier tratamiento previo con agentes anti-VEGF en el ojo del estudio (Pegaptanib sódico, acetato de anecortave, bevacizumab, ranibizumab, etc.) o administración previa de medicamentos anti-angiogénicos isquémicos; • Antes de la fotocoagulación con láser panretiniano o fotocoagulación con láser macular en el ojo del estudio • Duración de la enfermedad CRVO > 9 meses a partir de la fecha de la diagnosis; duración de la enfermedad BRVO > 9 meses a partir de la fecha de la diagnosis; • Uso previo de corticosteroides oculares en el ojo del estudio o uso de corticosteroides perioculares en el ojo del estudio dentro de los 3 meses antes del Dia 1; • Neovascularización del iris, hemorragia vitrea, desprendimiento de la retina por tracción, o fibrosis preretiniana que implica la macula en cualquiera del ojo del estudio o el ojo contralateral; Mediciones del Resultado Primario: • Cambio Medio de la Linea Base en el Registro de Mejor Agudeza Visual Corregida (BCVA) a 6 Meses. [Marco de Tiempo: Linea Base y 6 meses] [Designado como problema de seguridad: No] .
• Intervalo de linea base del estudio definido del Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) Registro de letras de Mejor Agudeza Visual Corregida (BCVA) de 73 a 24 (= Agudeza de 20/40 a 20/320) en el ojo del estudio; un registro más alto representa mejor funcionamiento.
Nominador = (Número de Participantes quienes mantuvieron la visión * 100); Denominador = Número de participantes analizados.
Mediciones de Resultados Secundarios: • Porcentaje de Participantes Quienes Ganaron > 15 Letras en el Registro BCVA en el Mes 6 Comparado con la Linea Base.
• Cambio Medio de la Linea Base en el Espesor de la Retina Central (CRT) a los 6 meses [Marco de Tiempo: Linea base 6 meses] [Designado como prueba de seguridad: No] • Reducción en la frecuencia del tratamiento anti-VEGF concomitante ((por ejemplo Lucentis, Avastin, Macugen o Eyelea) [Designado como problema de seguridad: No] Tabla 11 : Brazos de Diseño Experimentales para el Estudio BRVO/CRVO Los sujetos enrolados iniciales tienen CRVO o BRVO, con agudeza visual en el ojo del estudio de 20/40 a 20/320, y habrán recibido previamente entre 0 y 25 inyecciones intravítreas de ranibizumab o aflibercept. Los pacientes se distribuyen aleatoriamente en un grupo de control o dos grupos experimentales hasta un total de 14 pacientes de control y se enrolaron 13 pacientes experimentales de dosis baja y 13 experimentales de dosis alta. Todos los pacientes recibieron inyecciones intravitreas de ranibizumab en el día 1 y dia 30 del estudio. En el día 7, 1 x 1010 o 1 x 10u de genomas de vector de rAAV (bv).sFlt-1 en un volumen de 100 ul se administran a través de inyección subretiniana a los grupos experimentales.
Como en el estudio en el Ejemplo 14, los niveles de expresión máximos de sFLT-1 en un sujeto de estudio o un paciente que se alcanzan son seis a ocho semanas después de la administración subretiniana de rAAV(bv).sFlt-1. Después de la terminación del periodo de incremento, como se describe en el Ejemplo 14, los pacientes quienes expresan suficiente sFLT-1 para tratar o prevenir la progresión de BRVO o CRVO pueden no necesitar inyecciones anti-VEGF intravitreas adicionales aunque se espera que permanezcan bajo el cuidado de un médico.
En este estudio citado en este ejemplo, los pacientes en los grupos de control y experimentales se evalúan para signos de oclusión de las venas de la retina y neovascularización nueva o activa sobre una base de aproximadamente mensual y se vuelven a tratar con ranibizumab intravitreo si se cumple cualquiera de los siguientes criterios: Pérdida de >10 letras de Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano (ETDRS) de la visita previa del sujeto (atribuible a causas de la retina), OR una disminución de >5 letras ETDRS de la visita previa en conjunción con la percepción del paciente de la pérdida funcional; Cualquier fluido incrementado, nuevo, o sensorial persistente, Epitelial Pigmentario sub-Retiniano (RPE), o intraretiniano en la OCT; - Signos de fuga de CNV incrementada a través de FA.

Claims (199)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico, caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un inhibidor de VEGF para el uso en el tratamiento o profilaxis de neovascularización ocular en un sujeto humano; en donde el uso comprende administrar directamente a un sujeto humano en necesidad del mismo, a uno o más de sitios de la sub-retina en el sujeto humano, una cantidad efectiva de una composición farmacéutica; en donde la composición farmacéutica comprende ácido nucleico.
2. El ácido nucleico para el uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF o fragmento funcional del mismo.
3. El ácido nucleico para el uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de VEGF es receptor soluble, proteina de fusión o fragmento del mismo.
4. Un ácido nucleico, caracterizado porque comprende una secuencia que codifica sFLT-1 para el uso en el tratamiento o profilaxis de neovascularización ocular en un sujeto humano; en donde el uso comprende administrar directamente a un sujeto humano en necesidad del mismo, a uno o más sitios subretinianos en el sujeto humano, una cantidad efectiva de una composición farmacéutica; en donde la composición farmacéutica comprende ácido nucleico.
5. El ácido nucleico para el uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el sFLT-1 es un inhibidor de VEGF y en donde el tratamiento o reducción de la probabilidad de neovascularización ocular se presenta como resultado de la inhibición de VEGF.
6. El ácido nucleico para el uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la composición farmacéutica es capaz de elevar los niveles de la proteína sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano después de por lo menos 72 horas después de la administración de la composición farmacéutica al sujeto humano, comparado con los niveles de la proteína sFLT-1 en el humor vitreo del humano antes de la administración.
7. El ácido nucleico para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ácido nucleico que comprende sFLT-1 comprende un virus recombinante, el virus seleccionado del grupo que consiste de: virus asociado con adeno (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de auxiliar, retrovirus, virus de herpes simple, lentivirus, poxvirus, complejo de virus de hemaglutinatina de liposoma japonés (HVJ), virus de leucemia de murino Moloncy y virus de base V1H.
8. El ácido nucleico para el uso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el virus recombinante es un AAV seleccionado del grupo que consiste de: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos.
9. El ácido nucleico para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica el sFLT-1 se liga operativamente a un promotor seleccionado del grupo que consiste de: promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de virus de sarcoma Rous (RSV), promotor MMT, promotor EF-1 alfa, promotor UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor de opsina.
10. El ácido nucleico para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ácido nucleico es un plásmido o se administra por un vector vírico.
11. El ácido nucleico para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el uso además comprende la administración de uno o más inhibidores de VEGF adicionales al sujeto humano en necesidad de tratamiento o reducción, opcionalmente en donde el inhibidor de VEGF adicional es ranibizumab, bevacizumab o aflibercept.
12. El ácido nucleico para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el uso comprende administrar la composición farmacéutica a un sujeto humano en por lo menos 55 años de edad.
13. El ácido nucleico para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el uso comprende administrar la composición farmacéutica fuera de la fóvea.
14. El ácido nucleico para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la mejora agudeza visual corregida (BCVA) del sujeto humano en necesidad de tratamiento, como es medido por las letras ETDRS (Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano), mejora por al menos 1, 2, 3, 4 o 5 lineas después de la administración de una cantidad efectiva de la composición farmacéutica.
15. El ácido nucleico para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la administración de la composición farmacéutica reduce la frecuencia de administración de otra terapia anti- VEGF.
16. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la administración de otra terapia anti-VEGF es menor que una vez por 3 meses o menor que una vez por 6 meses o menor que una vez por año.
17. El ácido nucleico para el uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la administración de la composición farmacéutica se lleva a cabo en una frecuencia menor que 3 veces al año en el humano.
18. Una dosis unitaria de una composición farmacéutica, caracterizado porque comprende un virus recombinante, en donde la unidad comprende por lo menos lxlO10 a 3xl012 de genomas de vector, y en donde los virus recombinantes comprenden un ácido nucleico que codifica el sFLT-1 operativamente ligado a un promotor y en donde la dosis unitaria es capaz de elevar los niveles de la proteina sFLT-1 en el humor vitreo de un sujeto humano después de por lo menos 7 dias, después de la administración al sujeto humano.
19. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende virus o plásmidos recombinantes en donde cada virus o plásmido recombinante comprende un ácido nucleico en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de transgen sFLT-1 ligado operativamente a una secuencia promotora, y en donde la composición farmacéutica es capaz de incrementar el nivel de la proteina sFLT-1 en el humor vitreo de un sujeto después de por lo menos 7 dias después de la administración al sujeto humano.
20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la secuencia promotora y la secuencia del transgen sFLT-1 se separan por una secuencia mayor que 300 pares base.
21. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la secuencia promotora y la secuencia de transgen sFLT-1 se separan por una secuencia UTR.
22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende elementos de ácido nucleico en el siguiente orden: a. una secuencia promotora seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 17, SEQ ID No.18, SEQ ID No.19, SEQ ID No.20, SEQ ID No.21, SEQ ID No.22, SEQ ID No.23, SEQ ID No.24, SEQ ID No.25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No.27, SEQ ID No.28, SEQ ID No.29, SEQ ID No.30, SEQ ID No.31 y SEQ ID No.32; b. una secuencia que codifica un inhibidor de VEGF seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID No.102, SEQ ID No. 103, SEQ ID No.104, SEQ ID No.105, SEQ ID No.106, SEQ ID No.107 SEQ ID No.108 o SEQ ID No.122; c. una secuencia de intrones que consiste de SEQ ID No. 48, SEQ ID No.115, SEQ ID No. 116, SEQ ID No. 117, SEQ ID No. 118, SEQ ID No.119 o SEQ ID No.120; d. una secuencia UTR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.91, SEQ ID No.2, SEQ ID No.92, SEQ ID No.93, SEQ ID No. 94, SEQ ID No.95, SEQ ID No. 96, SEQ ID No.97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No.99, SEQ ID No.100, y SEQ ID No. 101; y e. una secuencia de terminación seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 49, SEQ ID No.50, SEQ ID No.51, SEQ ID No.52, SEQ ID No.53, SEQ ID No.54, y SEQ ID No.55.
23. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende elementos de ácido nucleico en el siguiente orden: a. una secuencia ITR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No.58, SEQ ID No. 59; b. una secuencia ligadora seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.60, SEQ ID No.63, SEQ ID No.68, SEQ ID No.72, SEQ ID No.76, SEQ ID No.77, y SEQ ID No.84; c. una secuencia promotora seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 17, SEQ ID No.18, SEQ ID No.19, SEQ ID No.20, SEQ ID No.21, SEQ ID No.22, SEQ ID No.23, SEQ ID No.24, SEQ ID No.25, SEQ ID No.26, SEQ ID No.27, SEQ ID No.28, SEQ ID No.29, SEQ ID No.30, SEQ ID No.31 y SEQ ID No.32, SEQ ID No.33, SEQ ID No.34, SEQ ID No.35, SEQ ID No.36, SEQ ID No.37, SEQ ID No.38, SEQ ID No.39, SEQ ID No.40, SEQ ID No.41, SEQ ID No.42, SEQ ID No.43, SEQ ID No.44, SEQ ID No.45, SEQ ID No.46 y SEQ ID No.47; d. una secuencia ligadora seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.60, SEQ ID No.64, SEQ ID No.70, SEQ ID No.71, SEQ ID No.73, SEQ ID No.74, SEQ ID No.87; e. una secuencia de intrones que consiste de SEQ ID No. 48, SEQ ID No.115, SEQ ID No. 116, SEQ ID No. 117, SEQ ID No. 118, SEQ ID No.119 y SEQ ID No.120; f. una secuencia ligadora seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.60, SEQ ID No.64, SEQ ID No.65, SEQ ID No.75, SEQ ID No.79, SEQ ID No.81, SEQ ID No.82, y SEQ ID No.89; g. una secuencia UTR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.91, SEQ ID No.2, SEQ ID No.92, SEQ ID No.93, SEQ ID No. 94, SEQ ID No.95, SEQ ID No. 96, SEQ ID No.97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99, SEQ ID No.100, y SEQ ID No. 101; y h. una secuencia que codifica un inhibidor de VEGF seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID No.102, SEQ ID No. 103, SEQ ID No. 104, SEQ ID No.105, SEQ ID No.107, SEQ ID No.108 y SEQ ID No.122; i. una secuencia UTR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.91, SEQ ID No.2, SEQ ID No.92, SEQ ID No.93, SEQ ID No. 94, SEQ ID No.95, SEQ ID No. 96, SEQ ID No.97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99, SEQ ID No.100, y SEQ ID No. 101; j. una secuencia ligadora seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.60, SEQ ID No.62, SEQ ID No.66, SEQ ID No.67, SEQ ID No.69, SEQ ID No.83, SEQ ID No.84, SEQ ID No.85, SEQ ID No.86; k. una secuencia de terminación seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No. 49, SEQ ID No.50, SEQ ID No.51, SEQ ID No.52, SEQ ID No.53, SEQ ID No.54, y SEQ ID No.55; l. una secuencia ligadora seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.60, SEQ ID No.61, SEQ ID No.80, SEQ ID No.87, SEQ ID No.88, SEQ ID No.89, SEQ ID No.90; y m. una secuencia ITR seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No.56, SEQ ID No. 57, SEQ ID No.58, y SEQ ID No. 59.
24. Un método para generar un virus recombinante en una célula, el método caracterizado porque comprende: a. introducir en una célula, un ácido nucleico que comprende por lo menos 1 secuencia promotora operativamente ligada a una secuencia de transgen sFLT-1, una secuencia ITR y una secuencia UTR; y b. purificar el virus recombinante.
25. Una célula para generar el vector vírico recombinante, la célula caracterizada porque comprende por lo menos 1 secuencia de polinucleótido promotora ligada operativamente a una secuencia de transgen sFLT-1, una secuencia de polinucleótido ITR, y una secuencia polinucleótido UTR.
26. Un método para el tratamiento o profilaxis de neovascularización ocular en un sujeto humano, caracterizado porque comprende: administrar a uno o más sitios subretinianos una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica un inhibidor de VEGF a un sujeto humano en necesidad de tratamiento.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el inhibidor de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF contra VEGF o un fragmento funcional del mismo.
28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el inhibidor de VEGF es un receptor soluble, proteína de fusión o un fragmento funcional del mismo.
29. Un método para el tratamiento o profilaxis de neovascularización ocular en un sujeto humano, caracterizado porque comprende: administrar a uno o más sitios subretinianos una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica sFLT-1 a un sujeto humano en necesidad del tratamiento.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano tiene o se sospecha de tener una o más afecciones seleccionadas del grupo que consiste de: degeneración macular relacionada con la edad (AMD), AMD húmeda, AMD seca, neovascularización de la retina, neovascularización coroidea y retinopatia diabéticas.
31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano tiene o se sospecha de tener una o más afecciones seleccionadas del grupo que consiste de: retinopatia diabética proliferativa, oclusión de las venas de la retina, oclusión de las venas de la retina central, oclusión de las venas de la retina ramificadas, edema diabético macular, isquemia diabética de la retina, retinopatia isquémica y edema diabético de la retina.
32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende un virus recombinante, el virus seleccionado del grupo que consiste de: virus asociado con adeno (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de auxiliar, retrovirus, virus de herpes simple, lentivirus, poxvirus, complejos de virus de hemaglutinatina de liposoma japonés (HVJ), virus de leucemia de murino Moloncy, y virus basado en V1H.
33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica el sFLT-1 se liga operativamente a un promotor seleccionado del grupo que consiste de: Promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de virus de sarcoma Rous (RSV), promotor MMT, promotor EF-1 alfa, promotor UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor de opsina.
34. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido nucleico sFLT-1 codifica por lo menos 1 dominio de dimerización.
35. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido nucleico no contiene una secuencia reguladora procariota.
36. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido nucleico contiene una secuencia reguladora procariota.
37. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido nucleico es un plásmido o se administra por un virus.
38. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque además comprende la administración de uno o más tratamientos de un inhibidor de VEGF al sujeto humano.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el inhibidor de VEGF se administra dentro de 30, 90, o 180 dias de administración de la composición farmacéutica.
40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la composición farmacéutica y el inhibidor de VEGF se administran con por lo menos 24 horas de separación.
41. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la composición farmacéutica se administra a un sujeto humano de por lo menos 55 años de edad.
42. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la administración se lleva a cabo fuera de la fóvea.
43. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la mejor agudeza visual corregida (BCVA) del sujeto humano, como es medida por las letras ETDRS (Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano), mejora por el menos 1, 2, 3, 4 o 5 lineas después de la administración de la composición farmacéutica.
44. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la mejora agudeza visual corregida (BCVA), como es medida por la ETDRS (Estudio de Retinopatía Diabética de Tratamiento Temprano), disminuye por menos de 15 letras después de la administración de la composición farmacéutica.
45. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la administración de la composición farmacéutica se lleva a cabo bajo condiciones seleccionadas del grupo que consiste de: administrar la composición farmacéutica en un ojo, administrar la composición farmacéutica secuencial en los dos ojos, y administrar la composición farmacéutica simultánea en los dos ojos.
46. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la reducción en la neovascularización como es observada por una Angiografía de Fluoresceina (FA) sigue la administración de la composición farmacéutica.
47. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque los signos inflamatorios de segmento anterior o humor vitreo, no superficiales están presentes en el sujeto humano por lo menos 1 semana después de la inyección.
48. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate durante por lo menos 30, 60, 90, 120, 180, 270 o 365 días después de la administración de la composición farmacéutica.
49. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque ninguna respuesta de células T citotóxica anti-AAV incrementada se mide después de la etapa de administración.
50. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque no se detecta virus en las muestras de sangre, saliva u orina del sujeto humano, 3, 7, 14, 21 o 30 dias después de las administración de la composición farmacéutica.
51. El método de conformidad con la reivindicación 29 caracterizado porque el nivel de proteina sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano es de aproximadamente 500 - 5,000 pg/ml, 7, 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 o 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica en el sujeto humano.
52. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano ha recibido uno o más tratamientos con un inhibidor de VEGF antes de la administración de la composición farmacéutica.
53. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano ha recibido previamente el tratamiento con un inhibidor de VEGF antes de la administración de la composición farmacéutica.
54. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la administración de la composición farmacéutica se lleva a cabo en una frecuencia menor que 3 veces al año en el sujeto humano.
55. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la administración de la composición farmacéutica reduce la frecuencia de administración de tratamientos del inhibidor VEGF adicionales en el sujeto humano.
56. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la concentración de la proteina sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano se elevas cuando se mide a 7, 14, 21, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270 o 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
57. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano tiene el gel vitreo removido antes o dentro de una semana de la administración del agente.
58. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agente farmacológico se administra utilizando un sistema de vitrectomia que es más pequeño que calibre 20.
59. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agente farmacológico se administra utilizando una punta de cánula que es más pequeña que calibre 39.
60. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el espesor de la retina central del sujeto no se incrementa por más de 50 mieras, 100 mieras, o 250 mieras dentro de 12 meses después del tratamiento con el agente farmacológico.
61. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la atrofia geográfica no progresa en el ojo enfermo del sujeto humano.
62. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano tiene sensibilidad o alergia a la penicilina.
63. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano no tiene incremento en los niveles sistémicos del inhibidor de VEGF.
64. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende virus o plásmidos recombinantes que comprenden un ácido nucleico que comprende por lo menos 1 secuencia promotora operativamente ligada a una secuencia de transgen sFLT-1, en donde la secuencia promotora y la secuencia de transgen sFLT-1 se separan por una secuencia mayor que 300 pares base.
65. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende virus o plásmidos recombinantes que comprenden un ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia promotora operativamente ligada a una secuencia de transgen sFLT-1, en donde la secuencia promotora y la secuencia del transgen sFLT-1 se separan por una secuencia UTR.
66. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porque la secuencia ÜTR comprende por lo menos 10 pares base.
67. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque el ácido nucleico comprende por lo menos 3 secuencias ligadoras que comprenden cada una por lo menos 50 pares base.
68. Una dosis unitaria de una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende virus recombinantes de lxlO10 a 3xl012 genomas de vector, en donde los virus recombinantes comprenden un ácido nucleico que codifica un sFLT-1 operativamente ligado a un promotor.
69. Un método para generar un vector recombinante en una célula, el método caracterizado porque comprende: a. introducir en una célula, un ácido nucleico que comprende por lo menos 1 secuencia promotora ligada operativamente a una secuencia de transgen sFLT-1, una secuencia ITR, y una secuencia UTR; y b. purificar el virus recombinante.
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la secuencia de ácidos nucleicos no contiene una secuencia de resistencia antibióticos de beta-lactama.
71. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el virus recombinante produce la proteina sFLT-1 en el intervalo de 100-10,000 mg/mL cuando se mide a 72 horas después de la transducción de las células HEK293 en la multiplicidad de la infección de 1c104-1c106.
72. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el virus recombinante inhibe la proliferación de células endoteliales vasculares umbilicales humanas (HUVEC).
73. Una célula para generar un vector vírico recombinante, la célula caracterizada porque comprende por lo menos una secuencia de polinucleótido promotora ligada operativamente a una secuencia de transgen sFLT-1, una secuencia de polinucleótidos ITR, y una secuencia de polinucleótidos UTR.
74. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque ninguno de signos inflamatorios de segmento anterior o humor vitreo, superficiales están presentes en el sujeto humano en 1 semana o en 3, 6, 9 o 12 meses después de la administración de la composición farmacéutica.
75. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano experimenta nada de pérdida de agudeza visual, elevación de IOP, desprendimiento de la retina, respuesta in unitaria intraocular o sistémica después de la administración la composición farmacéutica.
76. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el sujeto humano es resistente con tratamiento con inhibidores de VEGF.
77. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agente farmacológico se administra utilizando un sistema de vitrectomia que no requiere suturas.
78. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la administración del agente farmacológico es seguido por el intercambio de gas/fluido en la cámara vitrea.
79. Un método para tratar o reducir la neovascularización ocular en un sujeto humano, caracterizado porque comprende: administrar subretinianamente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un virus recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un inhibidor de VEGF a un sujeto humano en necesidad de un tratamiento.
80. Un método para tratar o reducir la neovascularización ocular en un sujeto humano, caracterizado porque comprende: administrar subretinianamente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un virus recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteina tirosina cinasa-1 relacionada con Fms soluble (sFLT-1) a un sujeto humano en necesidad de un tratamiento.
81. Un método para prevenir la neovascularización ocular en un sujeto humano, caracterizado porque comprende: administrar subretinianamente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un virus recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína tirosina cínasa-1 relacionada con Fms soluble (sFLT-1) a un sujeto humano.
82. Un método para tratar o reducir la neovascularización coroidea en un sujeto humano con AMD, caracterizado porque comprende: administrar subretinianamente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un virus recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína tirosina cinasa-1 relacionada con Fms soluble (sFLT-1) a un sujeto humano en necesidad de un tratamiento para la AMD.
83. Un método para prevenir la neovascularización coroidea en un sujeto humano con AMD seca, caracterizado porque comprende: administrar subretinianamente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de un virus recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína tirosina cinasa-1 relacionada con Fms soluble a un sujeto humano.
84. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus se selecciona de virus asociado con adeno (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de auxiliar, retrovirus, virus de herpes simple, lentivirus, poxvirus, complejo de virus de hemaglutinatina de liposoma japonés (HVJ), virus de leucemia de murino Moloncy, y virus basado en V1H.
85. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el AAV se selecciona del grupo que consiste de: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVll, AAV12, e híbridos de los mismos.
86. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante se genera de un plásmido que comprende un marcador de resistencia a la canamicina.
87. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante se genera de un plásmido que comprende un marcador de resistencia a la ampicilina.
88. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante se genera de un plásmido que comprende una secuencia promotora de T7 ARN polimerasa.
89. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante se genera de un plásmido que no comprende una secuencia promotora de T7 ARN polimerasa.
90. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante comprende un marcador de resistencia a la ampicilina.
91. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante comprende una secuencia promotora de T7 ARN polimerasa.
92. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante no comprende una secuencia promotora de T7 ANR polimerasa.
93. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante comprende un promotor seleccionado de promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de virus de sarcoma Rous (RSV), promotor MMT, promotor EF-1 alfa, promotor UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor de opsina.
94. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante comprende un potenciador.
95. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante comprende un intrón quimérico.
96. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante comprende una secuencia SV40 poli A.
97. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante comprende una proteina sFLT-1 humana o un fragmento funcional de la misma.
98. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el virus recombinante comprende un fragmento de ácido nucleico regulador que es capaz de dirigir la expresión selectiva de la proteina sFLT-1 en una célula del ojo.
99. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1015 de virus recombinantes.
100. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1014 de virus recombinantes.
101. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1013 de virus recombinantes.
102. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 109 a aproximadamente 1 x 1012 de virus recombinantes.
103. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1012 de virus recombinantes.
104. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la composición farmacéutica se administra a través de inyección subretiniana.
105. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque además comprende administrar al sujeto humano una cantidad farmacéuticamente efectivo de un inhibidor de VEGF.
106. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el inhibidor de VEGF comprende un anticuerpo contra VEGF o un fragmento funcional del mismo.
107. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el inhibidor de VEGF comprende ranibizumab.
108. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la composición farmacéutica se administra dentro de 90 dias de la administración del inhibidor de VEGF.
109. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la composición farmacéutica se administra por lo menos 5, 6, 7, o 8 dias después de la administración del inhibidor VEGF.
110. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el inhibidor de VEGF se administra por lo menos 1 vez antes de la administración de la composición farmacéutica.
111. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el inhibidor de VEGF se administra durante por lo menos 1 vez después de la administración de la composición farmacéutica.
112. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el inhibidor de VEGF se administra por lo menos 2 veces dentro de 90 dias de la administración del inhibidor de VEGF.
113. El método de conformidad con la reivindicación 105 caracterizado porque el inhibidor de VEGF se administra durante un periodo de 6 a 7 semanas.
114. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque la AMD es AMD húmeda.
115. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el sujeto humano está en riesgo para desarrollar degeneración macular relacionada con la edad.
116. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el sujeto humano presenta síntomas de degeneración macular relacionada con la edad de etapa temprana.
117. El método de conformidad con la reivindicación 80 o 82, caracterizado porque el sujeto humano se ha tratado previamente con un inhibidor de VEGF diferente para tratamiento de AMD.
118. El método de conformidad con las reivindicaciones 81 o 83, caracterizado porque el ojo tratado del sujeto humano se ha tratado previamente con un inhibidor de VEGF diferente para el tratamiento de AMD.
119. El método de conformidad con la reivindicación 80 o 82, caracterizado porque por lo menos 5 tratamientos de un inhibidor de VEGF para el tratamiento de AMD se han administrado previamente al sujeto humano.
120. El método de conformidad con la reivindicación 80 o 82, caracterizado porque el por lo menos 10 tratamientos de un inhibidor de VEGF para el tratamiento de AMD se han administrado previamente al sujeto humano.
121. El método de conformidad con la reivindicación 80 o 82, caracterizado porque por lo menos 15 tratamientos de un inhibidor de VEGF para el tratamiento de AMD se han administrado previamente al sujeto humano.
122. El método de conformidad con la reivindicación 80 o 82, caracterizado porque por lo menos 20 tratamientos de un inhibidor de VEGF para el tratamiento de AMD se han administrado previamente al sujeto humano.
123. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la mejor agudeza visual corregida (BCVA), como es medida por las letras ETDRS (Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano), disminuyó por menos de 15 letras después del tratamiento con la composición farmacéutica.
124. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la mejor agudeza visual corregida (BCVA), es medida por las letras ETDRS (Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano), mejoró por menos de dos lineas después del tratamiento con ranibizumab.
125. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el sujeto humano está en riesgo de desarrollar degeneración macular relacionada con la edad seca.
126. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el sujeto humano presenta síntomas de degeneración macular relacionada con la edad seca de etapa temprana.
127. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el tratamiento se administra en una frecuencia de menos de una vez por 12 meses.
128. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el tratamiento se administra en una frecuencia de menos de una vez por 6 meses.
129. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el tratamiento se administra en una frecuencia de menos de una vez por 18 meses.
130. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en el sujeto humano donde el sujeto es de la edad de 20 años o de más edad.
131. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo el sujeto humano donde el sujeto es de la edad de 40 años o de más edad.
132. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en el sujeto humano donde el sujeto es de la edad de 50 años o más edad.
133. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en el sujeto humano donde el sujeto es de la edad de 65 años o de más edad.
134. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la administración es para un sitio que no incluye la fóvea.
135. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la administración es en la retina central adyacente a la fóvea.
136. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la administración es una o más células del espacio subretiniano de la retina central.
137. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la administración es una o más células del espacio subretiniano de la macula exterior.
138. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la administración es a una o más células del espacio subretiniano de la macula interior.
139. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la administración es a las células epiteliales pigmentarias de la retina.
140. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la administración no afecta adversamente la función de la retina central o la estructura de la retina central.
141. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo simultáneamente en ambos ojos.
142. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo secuencialmente en ambos ojos.
143. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en un ojo.
144. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en un ojo cuando el ojo contralateral presenta síntoma de AMD.
145. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en el sujeto humano resistencia a la penicilina.
146. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en el sujeto humano sensible a la penicilina.
147. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en el sujeto humano alérgico a la penicilina.
148. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en el sujeto humano no alérgico a la penicilina.
149. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque no se detecta un vector en las muestras de sangre, saliva u orina del sujeto humano, 3, 7, 14, 21 o 30 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
150. El método de conformidad con la reivindicación 149, caracterizado porque la presencia del vector vírico se detecta por qPCR o ELISA,
151. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque los niveles de proteína sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano es de aproximadamente 500 - 5,000 mg/ml, 7, 14, 21 o 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270, 365 días después de la administración de la composición farmacéutica.
152. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque los niveles de proteína sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano es de aproximadamente 600 - 4,000 pg/ml, 7, 14, 21 o 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270, 365 días después de la administración de la composición farmacéutica.
153. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque los niveles de proteína sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano es de aproximadamente 800 - 3,000 pg/ml, 7, 14, 21 o 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270, 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
154. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque los niveles de proteina sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano es de aproximadamente 900 - 2,000 mg/ml, 7, 14, 21 o 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270, 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
155. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque los niveles de proteina de sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano es de aproximadamente 1,000 - 1,800 pg/ml, 7, 14, 21 o 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270, 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
156. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque los niveles de proteina de sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano es de aproximadamente 4,00 - 1,000 mg mi, 7, 14, 21 o 30, 60, 90, 120, 150, 180, 270, 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
157. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el sujeto humano no muestra de la retina clínicamente Significativa como es evaluado por exámenes oftálmicos en serie durante por lo menos un período de dos meses.
158. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque no están presentes signos inflamatorios del segmento anterior, del humor vitreo, superficiales en el sujeto humano durante por lo menos un periodo de dos meses.
159. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque el sujeto humano no requiere tratamiento de rescate por lo menos 120 dias postadministración.
160. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque no hay evidencia de pérdida de agudeza visual, elevación de IOP, desprendimiento de retina, o cualquier repuesta inmunitaria intraocular o sistémica en el sujeto humano por lo menos 120 dias postadministración.
161. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque no se observa inflamación del humor vitreo por biomicroscopia (BE) y oftalmoscopia indirecta (IOE) después de la etapa de administración.
162. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque nada de respuesta de células T citotóxica sigue la etapa de administración.
163. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque nada de respuesta de células T citotóxicas dentro de 10% del intervalo normal sigue la etapa de administración.
164. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la mejor agudeza visual corregida (BCVA), como es medidas por las letras ETDRS (Estudio de Retinopatia Diabética de Tratamiento Temprano), mejora la siguiente etapa de administración.
165. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la BCVA se mejora por 1 linea o más.
166. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la BCVA se mejora por lo menos 2 lineas o más.
167. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la BCVA se mejora por lo menos 3 lineas o más.
168. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la BCVA se mejora por lo menos 4 lineas o más.
169. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la BCVA se mejora por lo menos 5 lineas o más.
170. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque una reducción en la neovascularización como se observa por una Angiografia de Fluoresceina (FA) sigue la etapa de administración.
171. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la frecuencia de la administración de otra terapia anti-VEGF se reduce.
172. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la frecuencia de administración de otra terapia anti-VEGF es menor que la mensual.
173. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la frecuencia de administración de otra terapia anti-VEGF es menor que 3 meses.
174. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la frecuencia de administración de otra terapia anti-VEGF es menor que 6 meses.
175. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la frecuencia de administración de otra terapia anti-VEGF es menor que 1 año.
176. Una dosis unitaria de la composición farmacéutica, caracterizadas porque comprende aproximadamente 1 x 106 a 1 x 1015 los virus recombinantes, en donde cada virus recombinante comprende un ácido nucleico que codifica la proteina tirosina cinasa-1 relacionada con Fms soluble (sFLT-1).
177. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque comprende aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 3 x 1012 los virus recombinantes.
178. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque comprende de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 1014 los virus recombinantes.
179. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque comprende de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 1013 los virus recombinantes.
180. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque comprende de aproximadamente 1 x 10 a aproximadamente 1 x 1012 los virus recombinantes.
181. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque comprende de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1012 los virus recombinantes.
182. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque la proteina sFLT-1 comprende la proteina sFLT-1 humana o un fragmento funcional de la misma.
183. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus se selecciona de virus asociado con adeno (AAV), adenovirus, adenovirus dependiente de auxiliar, retrovirus, virus de herpes simple, lentivirus, poxvirus, complejo de virus de hemaglutinatina de liposoma japonés (HVJ), virus de leucemia de murino Moloncy, y virus basado en V1H.
184. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el AAV se selecciona del grupo que consiste de: AAVl, AAV2, AAV3, AAV , AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e híbridos de los mismos.
185. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante comprende un promotor seleccionado de promotor de citomegalovirus (CMV), promotor de virus de sarcoma Rous (RSV), promotor MMT, promotor EF-1 alfa, promotor UB6, promotor de beta-actina de pollo, promotor CAG, promotor RPE65 y promotor de opsina.
186. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante comprende un potenciador.
187. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante comprende un intrón.
188. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante comprende un SV40 poli A.
189. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante comprende un fragmento de ácido nucleico regulador que es capaz de dirigir la expresión selectiva de la proteina sFLT-1 en una célula del ojo.
190. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante se formula con un tensoactivo.
191. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 168, caracterizada porque el virus recombinante se fabrica utilizando métodos productores de clones.
192. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 168, caracterizada porque el virus recombinante se fabrica utilizando baculovirus recombinante.
193. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante se fabrica utilizando Ad-AAV.
194. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante se fabrica utilizando las células HEK 293.
195. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante se fabrica utilizando las células de insectos.
196. La dosis unitaria de la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el virus recombinante se fabrica utilizando virus auxiliar de herpes.
197. Un método para tratar, reducir o prevenir la neovascularización ocular o edema macular en un sujeto humano, caracterizado porque comprende administrar subretinianamente una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva de vector de suministro de gen AAV recombinante que dirige la expresión de un factor anti-angiogénico, tal que la administración del vector inhibe la neovascularización en el edema macular en un sujeto humano.
198. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque la etapa de administración se lleva a cabo en el sujeto humano con ningún historial de infección con hepatitis B o hepatitis C.
199. El método de conformidad con la reivindicación 79, 80, 81, 82 o 83, caracterizado porque los niveles de proteina sFLT-1 en el humor vitreo del sujeto humano se eleva cuando se mide a 7, 14, 21 o 30, 60, 90, 1-2-0-, 150, 180, 270 o 365 dias después de la administración de la composición farmacéutica.
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PCT/US2013/040011 WO2013173129A2 (en) 2012-05-15 2013-05-07 Treatment of amd using aav sflt-1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2014013933A true MX2014013933A (es) 2015-06-03
MX362452B MX362452B (es) 2019-01-18

Family

ID=49584435

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014013933A MX362452B (es) 2012-05-15 2013-05-07 Tratamiento de degeneracion macular relacionada con la edad (amd) usando virus asociados con adeno (aav) sflt-1.
MX2019000586A MX2019000586A (es) 2012-05-15 2014-11-14 Virus adenoasociados (aav) sflt-1 para usarse en el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad (amd).

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2019000586A MX2019000586A (es) 2012-05-15 2014-11-14 Virus adenoasociados (aav) sflt-1 para usarse en el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad (amd).

Country Status (27)

Country Link
US (7) US20130323302A1 (es)
EP (3) EP2849802B1 (es)
JP (5) JP6466322B2 (es)
KR (3) KR102218067B1 (es)
CN (2) CN104994882A (es)
AU (3) AU2013263159B2 (es)
BR (1) BR112014028633A8 (es)
CA (1) CA2873628C (es)
CY (1) CY1124495T1 (es)
DK (1) DK3501549T3 (es)
ES (2) ES2967616T3 (es)
HK (1) HK1207568A1 (es)
HR (1) HRP20211453T1 (es)
HU (1) HUE056327T2 (es)
IL (2) IL235679B (es)
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NZ (2) NZ702637A (es)
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RU (1) RU2014150340A (es)
SG (2) SG10201609412QA (es)
SI (1) SI3501549T1 (es)
TW (3) TWI775096B (es)
WO (1) WO2013173129A2 (es)
ZA (1) ZA201409025B (es)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9730790B2 (en) 2009-09-29 2017-08-15 Edwards Lifesciences Cardiaq Llc Replacement valve and method
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
RS60207B1 (sr) 2011-04-22 2020-06-30 Univ California Adeno-povezani virioni virusa sa varijantama kapsida i postupci za njihovu primenu
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
US9681951B2 (en) 2013-03-14 2017-06-20 Edwards Lifesciences Cardiaq Llc Prosthesis with outer skirt and anchors
US11136557B2 (en) 2013-05-31 2021-10-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
KR101591823B1 (ko) * 2013-12-27 2016-02-04 재단법인 목암생명공학연구소 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터
TWI687225B (zh) * 2014-02-06 2020-03-11 美商健臻公司 用於治療及預防黃斑部病變的組成物及方法
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
SG10201810150UA (en) * 2014-03-17 2018-12-28 Adverum Biotechnologies Inc Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
SI3122878T1 (sl) * 2014-03-24 2019-05-31 Translate Bio, Inc. MRNA terapija za zdravljenje očesnih bolezni
US10507232B2 (en) 2014-04-02 2019-12-17 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for the treatment of latent viral infection
IL292951B1 (en) 2014-05-02 2024-06-01 Genzyme Corp AAV vectors for gene therapy in the central nervous system and retina
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
CA2966620A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Voyager Therapeutics, Inc. Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease
US10597660B2 (en) 2014-11-14 2020-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
GB201502137D0 (en) 2015-02-09 2015-03-25 Ucl Business Plc Treatment
AU2016226289B2 (en) 2015-03-02 2021-04-29 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
US20180043034A1 (en) * 2015-03-06 2018-02-15 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Gene augmentation therapies for inherited retinal degeneration caused by mutations in the prpf31 gene
ES2860712T3 (es) 2015-03-24 2021-10-05 Univ California Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas
WO2016179644A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-17 Children's Medical Research Institute Promoters for expression of heterologous genes
JP6929230B2 (ja) * 2015-05-14 2021-09-01 セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル インコーポレイテッド スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法
US10016514B2 (en) 2015-05-15 2018-07-10 New Hope Research Foundation Polynucleotides, vectors and methods for insertion and expression of transgenes
US11230720B2 (en) 2015-10-14 2022-01-25 Audentes Therapeutics, Inc. Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
GB201519086D0 (en) * 2015-10-28 2015-12-09 Syncona Partners Llp Gene Therapy
WO2017075335A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
WO2017093935A1 (en) * 2015-12-03 2017-06-08 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Synp161, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
SG11201805420SA (en) * 2015-12-30 2018-07-30 Kodiak Sciences Inc Antibodies and conjugates thereof
JP7046828B2 (ja) 2016-04-15 2022-04-04 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 滲出型加齢性黄斑変性の治療のための組成物
WO2017181021A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Regenxbio Inc. Treatment of ocular diseases with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
RU2018142273A (ru) * 2016-05-03 2020-06-03 Чжо-хуа Пань Способ улучшения опосредованной вирусами доставки генов в глаз с использованием ингибиторов протеасом
KR102392236B1 (ko) 2016-05-18 2022-05-03 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
SG11201809643UA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
KR102622823B1 (ko) * 2016-06-16 2024-01-10 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 안구 혈관신생을 저하시키기 위한 조성물 및 방법
CN117531025A (zh) * 2016-06-16 2024-02-09 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 使用aav2变体和阿柏西普治疗amd
JP7071332B2 (ja) 2016-07-29 2022-05-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 変異カプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
US11298041B2 (en) 2016-08-30 2022-04-12 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
WO2018075798A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified aav capsids and uses thereof
CN107058315B (zh) * 2016-12-08 2019-11-08 上海优卡迪生物医药科技有限公司 敲减人PD-1的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用
EP3595687A1 (en) * 2017-03-16 2020-01-22 Lineage Cell Therapeutics, Inc. Methods for measuring therapeutic effects of retinal disease therapies
WO2018170473A1 (en) * 2017-03-17 2018-09-20 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression
CN110913866A (zh) 2017-05-05 2020-03-24 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
WO2018204803A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US20210228738A1 (en) 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
WO2019018342A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. NETWORK EQUIPMENT TRACK GUIDE SYSTEM
BR112020003571A2 (pt) 2017-08-28 2020-08-25 The Regents Of The University Of California variantes capsidiais de vírus adenoassociado e métodos de uso das mesmas
CA3076905A1 (en) * 2017-09-27 2019-04-04 The Johns Hopkins University Treatment of ocular diseases with fully-human post-translationally modified anti-vegf fab
JP7502991B2 (ja) 2017-10-16 2024-06-19 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
KR102205830B1 (ko) * 2017-10-26 2021-01-21 주식회사 큐로진생명과학 솔루블 VEGFR-1 변이체 cDNA를 함유하는 rAAV를 포함하는 황반변성 치료용 조성물
EP3727468A4 (en) * 2017-12-19 2021-09-22 Akouos, Inc. AAV-MEDIATED DELIVERY OF THERAPEUTIC ANTIBODIES TO THE INNER EAR
US10610606B2 (en) * 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
US20210010028A1 (en) 2018-03-06 2021-01-14 Voyager Therapeutics, Inc. Insect cell manufactured partial self-complementary aav genomes
AU2019265663B2 (en) * 2018-05-08 2024-06-13 Rutgers, The State University Of New Jersey AAV-compatible laminin-linker polymerization proteins
US20210214749A1 (en) 2018-05-16 2021-07-15 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
WO2019222441A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
US20210254103A1 (en) 2018-07-02 2021-08-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
CN112770812A (zh) 2018-07-24 2021-05-07 沃雅戈治疗公司 产生基因治疗制剂的系统和方法
TW202035689A (zh) 2018-10-04 2020-10-01 美商航海家醫療公司 測量病毒載體粒子的效價及強度之方法
EP3886809A4 (en) 2018-11-28 2022-03-30 Genascence Corporation METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS
WO2020136384A1 (en) * 2018-12-28 2020-07-02 Constable Ian Jeffery Methods of retinal administration
EP3911410A1 (en) 2019-01-18 2021-11-24 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
AU2020231505A1 (en) 2019-03-04 2021-08-19 Adverum Biotechnologies, Inc. Sequential intravitreal administration of AAV gene therapy to contralateral eyes
TW202106699A (zh) 2019-04-26 2021-02-16 美商愛德維仁生物科技公司 用於玻璃體內遞送之變異體aav蛋白殼
EP3962536A1 (en) 2019-04-29 2022-03-09 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors
EP4010465A1 (en) 2019-08-09 2022-06-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
US20220364114A1 (en) 2019-08-26 2022-11-17 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2021055906A1 (en) * 2019-09-20 2021-03-25 Bullseye Therapeutics, Inc. Injection systems and methods of their use
CN112552410A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗体融合蛋白及其制法和在抗肿瘤中的应用
CN114786731A (zh) 2019-10-10 2022-07-22 科达制药股份有限公司 治疗眼部病症的方法
AU2020396699A1 (en) * 2019-12-04 2022-07-14 Cdmogen Co., Ltd Composition for treating diabetic retinopathy, comprising rAAV containing soluble VEGFR-1 variant cDNA
WO2022032153A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
US20220267795A1 (en) * 2021-02-24 2022-08-25 Kinase Pharma Inc. Compositions and methods for regulating production of an angiogensis inhibitor
TW202246516A (zh) 2021-03-03 2022-12-01 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CA3219898A1 (en) 2021-05-28 2023-11-21 Wentao Zhang Recombinant adeno-associated virus having variant capsid, and application thereof
WO2023206134A1 (en) * 2022-04-27 2023-11-02 Beijing Sightnovo Medical Technology Co., Ltd Compositions and methods for eye diseases
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4874237A (en) 1987-05-07 1989-10-17 Lions Eye Inst. Of Western Australia Electroretinogram apparatus
WO1990005538A1 (en) 1988-11-14 1990-05-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce Parvovirus capsids
FR2643252B1 (fr) 1989-02-21 1991-06-07 Technomed Int Sa Appareil de destruction selective de cellules incluant les tissus mous et les os a l'interieur du corps d'un etre vivant par implosion de bulles de gaz
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US6379885B1 (en) 1989-09-14 2002-04-30 Rijksuniversiteit Te Leiden Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines
DE69128037T2 (de) 1990-11-13 1998-05-07 Immunex Corp Bifunktionelle wählbare fusionsgene
US5383917A (en) 1991-07-05 1995-01-24 Jawahar M. Desai Device and method for multi-phase radio-frequency ablation
JP3734262B2 (ja) 1993-03-25 2006-01-11 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 血管内皮細胞増殖因子阻害剤
AU6953394A (en) 1993-05-21 1994-12-20 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
JPH10501681A (ja) 1994-02-22 1998-02-17 ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート 核酸送達システムならびにその合成および使用方法
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
FR2718150B1 (fr) 1994-03-29 1996-04-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique.
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5527533A (en) * 1994-10-27 1996-06-18 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method of retarding and ameliorating central nervous system and eye damage
US20020168342A1 (en) 1994-11-03 2002-11-14 Cell Genesys, Inc. Novel adenoviral vectors, packaging cell lines, recombinant adenoviruses and methods
US6093570A (en) 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6040183A (en) 1995-06-07 2000-03-21 University Of North Carloina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5641749A (en) 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product
WO1998007435A1 (en) * 1996-08-20 1998-02-26 The Regents Of The University Of California Eye treatments using synthetic thyroid hormone compositions
AU738806B2 (en) 1996-09-24 2001-09-27 Merck & Co., Inc. Gene therapy for inhibition of angiogenesis
FR2756297B1 (fr) 1996-11-22 1999-01-08 Centre Nat Rech Scient Procede de production de virus recombinants
US6153436A (en) 1997-01-10 2000-11-28 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method of gene delivery using wildtype adeno associated viral (AAV) vectors with insertions
JP4135120B2 (ja) 1997-04-14 2008-08-20 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 組換えａａｖ生産の効率を上昇させる方法
AU7383298A (en) 1997-05-13 1998-12-08 Regents Of The University Of California, The Novel antiangiogenic peptide agents and their therapeutic and diagnostic use
US6458157B1 (en) * 1997-08-04 2002-10-01 Suaning Gregg Joergen Retinal stimulator
WO1999014354A1 (en) * 1997-09-19 1999-03-25 The Trustees Of The University Of The Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
JPH11100327A (ja) 1997-09-26 1999-04-13 Toray Ind Inc 網膜変性症治療剤
AU9673998A (en) 1997-10-01 1999-04-23 G.D. Searle & Co. Fusion proteins comprising an angiostatin moiety and their use in anti-tumor treatment
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
EP1045921A2 (en) 1998-01-16 2000-10-25 Chiron Corporation Feline immunodeficiency virus gene therapy vectors
ATE226444T1 (de) 1998-03-12 2002-11-15 Genentech Inc Verwendung von fgf-5 polypetiden zur vorbeugung des absterbens retinaler neuronen und behandlung okularer krankheiten
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
CN1342206A (zh) * 1998-08-28 2002-03-27 杜克大学 在IVa2,100K和/或preterminal protein序列上有缺失的腺病毒
EP1114171A1 (en) 1998-09-17 2001-07-11 University of Florida Methods for treatment of degenerative retinal diseases
US20040234505A1 (en) 1998-09-23 2004-11-25 Stuart Naylor Polynucleotide constructs and uses thereof
US6943153B1 (en) * 1999-03-15 2005-09-13 The Regents Of The University Of California Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
EP1183051A2 (en) * 1999-03-15 2002-03-06 Chiron Corporation Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US7306799B2 (en) * 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
EP1229839A4 (en) 1999-10-25 2005-12-07 Therus Corp USING FOCUSED ULTRASOUND FOR VASCULAR SEALING
ATE511784T1 (de) 2000-04-17 2011-06-15 Univ Sydney Verfahren zur objektiven elektrophysiologischen bewertung der visuellen funktion
US6329181B1 (en) 2000-08-07 2001-12-11 Neurologix, Inc. Helper functions for recombinant vector production
ATE554763T1 (de) * 2001-02-06 2012-05-15 Quadra Logic Tech Inc Photodynamische therapie der mit der altersbezogenen makuladegeneration verbundenen okkulten chorioidalen neovaskularisation
EP1372552B1 (de) 2001-03-27 2017-03-01 WaveLight GmbH Vorrichtung zur bearbeitung und diagnose von augengewebe
WO2002082904A2 (en) 2001-04-13 2002-10-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of treating or retarding the development of blindness
JP2002363107A (ja) 2001-06-04 2002-12-18 Noriyuki Azuma 色覚不全動物の色覚復元方法
WO2003012054A2 (en) 2001-08-02 2003-02-13 Institut Clayton De La Recherche Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
EP1490113A4 (en) 2002-03-20 2007-05-02 Univ Florida ADENO-ASSOCIATED RECOMBINANT VIRAL VECTOR (RAAV) COMPOSITIONS AND CORRESPONDING METHODS FOR THE TREATMENT OF CHOROIDAL NEOVASCULARIZATION
AU2003223775A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Duke University Adeno-associated viral vectors and methods for their production from hybrid adenovirus and for their use
US8304233B2 (en) 2002-06-04 2012-11-06 Poetic Genetics, Llc Methods of unidirectional, site-specific integration into a genome, compositions and kits for practicing the same
AU2003265855A1 (en) 2002-08-28 2004-03-19 University Of Florida Modified aav
GB0220467D0 (en) 2002-09-03 2002-10-09 Oxford Biomedica Ltd Composition
WO2004079332A2 (en) * 2003-03-04 2004-09-16 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Composition and method for increasing efficiency of introduction of target substance into cell
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
WO2005072364A2 (en) 2004-01-27 2005-08-11 University Of Florida A modified baculovirus expression system for production of pseudotyped raav vector
NZ596663A (en) * 2004-10-21 2013-07-26 Genentech Inc Use of vegf antagonists in intraocular neovascular disease treatment
SI1809750T1 (sl) 2004-11-08 2012-08-31 Chromagenics Bv Izbira gostiteljskih celic, ki imajo visok nivo izraĹľanja proteina
US7922670B2 (en) 2005-02-24 2011-04-12 Warren Jones System and method for quantifying and mapping visual salience
JP5702519B2 (ja) 2005-04-07 2015-04-15 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖベクターの機能を上げる方法
US20060234347A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Harding Thomas C Targeting multiple angiogenic pathways for cancer therapy using soluble tyrosine kinase receptors
EP2311967B1 (en) 2005-10-20 2017-09-20 UniQure IP B.V. Improved AAV vectors produced in insect cells
US20090191597A1 (en) 2006-01-20 2009-07-30 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Enhanced production of infectious parvovirus vectors in insect cells
US20070190028A1 (en) 2006-02-13 2007-08-16 Jihong Qu Method and apparatus for heat or electromagnetic control of gene expression
US7384145B2 (en) 2006-02-16 2008-06-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mapping retinal function using corneal electrode array
US8118752B2 (en) 2006-02-16 2012-02-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Apparatus and methods for mapping retinal function
US8216575B2 (en) * 2006-03-31 2012-07-10 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains
US20090285826A1 (en) * 2006-05-04 2009-11-19 Fovea Pharmaceuticals Sa Combination drugs comprising vegf inhibitor and serine proteases/thrombolytic compounds for treating neovascular disorders
US20080152654A1 (en) * 2006-06-12 2008-06-26 Exegenics, Inc., D/B/A Opko Health, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR siRNA INHIBITION OF ANGIOGENESIS
GB0612096D0 (en) 2006-06-19 2006-07-26 Greater Glasgow Nhs Board Functional imaging of the retina
RU2457252C2 (ru) 2006-06-21 2012-07-27 Амстердам Молекьюла Терапьютикс (Амт) Ип Б.В. AAV ВЕКТОРЫ С УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫМИ Rep-КОДИРУЮЩИМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫМИ В СИСТЕМАХ ПРОДУКЦИИ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ
US20100008170A1 (en) 2006-06-27 2010-01-14 Shinya Sato Semiconductor tester and testing method of semiconductor memory
US8945918B2 (en) 2006-08-24 2015-02-03 Virovek, Inc. Expression in insect cells of genes with overlapping open reading frames, methods and compositions therefor
WO2008098310A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Objectivision Limited Stimulus method for multifocal visual evoked potential
EP1995309A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
US10696983B2 (en) 2007-05-30 2020-06-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for transducing cells with primary cilia
US8540369B2 (en) 2007-08-16 2013-09-24 The Research Foundation Of State University Of New York Led variable light source
US8518037B2 (en) 2007-10-30 2013-08-27 Boston Scientific Scimed, Inc. Radiofrequency ablation device
US20110053274A1 (en) * 2007-11-30 2011-03-03 Scarab Genomics Llc Lac expression system
WO2009104964A1 (en) 2008-02-19 2009-08-27 Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. Optimisation of expression of parvoviral rep and cap proteins in insect cells
CN101951925A (zh) 2008-02-20 2011-01-19 建新公司 血管发生抑制
WO2009105690A2 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 Targeted Genetics Corporation Devices and methods for delivering polynucleotides into retinal cells of the macula and fovea
ITFI20080081A1 (it) 2008-04-18 2009-10-19 Strumenti Oftalmici C S O S R Procedimento e sistema per la registrazione di risposte elettrofunzionali erg, perg e vep multifocali in tempo reale
US8632764B2 (en) 2008-04-30 2014-01-21 University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
ES2330826B1 (es) 2008-06-04 2010-07-26 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad.
PT2403867T (pt) 2009-03-04 2019-08-29 Deutsches Krebsforsch Proteína de ativação de montagem (aap) e a sua utilização para o fabrico de partículas de parvovírus essenciais consistindo de vp3
WO2010114948A2 (en) 2009-04-02 2010-10-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (raav) vectors
TWI466158B (zh) 2009-07-03 2014-12-21 Univ Lunghwa Sci & Technology 電漿測量裝置、電漿系統及測量電漿特性之方法
EP2287323A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-23 Association Institut de Myologie Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors
EP2292781A1 (en) 2009-08-17 2011-03-09 Genethon Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
WO2011034947A2 (en) 2009-09-15 2011-03-24 University Of Washington Reagents and methods for modulating cone photoreceptor activity
US20110270256A1 (en) 2009-09-24 2011-11-03 Medicinelodge, Inc. Dba Imds Co-Innovation Surgical rasp with radiofrequency ablation
WO2011088081A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors
US9228174B2 (en) 2010-03-11 2016-01-05 Uniqure Ip B.V. Mutated rep encoding sequences for use in AAV production
US20130023033A1 (en) * 2010-03-29 2013-01-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
WO2011122950A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Monomeric duplex aav vectors
CN201704771U (zh) 2010-04-30 2011-01-12 陈福环 无水箱节水型抽水马桶
US9102718B2 (en) * 2010-04-30 2015-08-11 Lpath, Inc. Anti-S1P antibody treatment of patients with ocular disease
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US20110052678A1 (en) * 2010-11-05 2011-03-03 Shantha Totada R Method for treating age related macular degeneration
JP6092782B2 (ja) 2010-11-16 2017-03-08 エクセリミューン， インコーポレイテッド 組換えタンパク質の製造方法
WO2012094560A2 (en) 2011-01-07 2012-07-12 Applied Genetic Technologies Corporation Promoters, expression cassettes, vectors, kits, and methods for the treatment of achromatopsia and other diseases
RS60207B1 (sr) 2011-04-22 2020-06-30 Univ California Adeno-povezani virioni virusa sa varijantama kapsida i postupci za njihovu primenu
WO2013063601A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric promoter for cone photoreceptor targeted gene therapy
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
WO2013188316A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Avalanche Biotechnologies, Inc. Optical regulation of gene expression in the retina
EP3013946B8 (en) 2013-06-28 2019-04-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for expressing a polynucleotide of interest in the retina of a subject
US20150025939A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Somnath Chatterjee Company Centric Social Media Platfonn for Content Sharing aud Tracking
EP3561062A1 (en) 2013-09-13 2019-10-30 California Institute of Technology Selective recovery
EP3633041A3 (en) 2013-09-26 2020-07-29 University of Florida Research Foundation, Inc. Synthetic combinatorial aav capsid library for targeted gene therapy
CA2941640A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors and methods for transduction of photoreceptors and rpe cells
SG10201810150UA (en) 2014-03-17 2018-12-28 Adverum Biotechnologies Inc Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
AU2016226289B2 (en) 2015-03-02 2021-04-29 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods

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