JP6929230B2 - スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法 - Google Patents

スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6929230B2
JP6929230B2 JP2017559315A JP2017559315A JP6929230B2 JP 6929230 B2 JP6929230 B2 JP 6929230B2 JP 2017559315 A JP2017559315 A JP 2017559315A JP 2017559315 A JP2017559315 A JP 2017559315A JP 6929230 B2 JP6929230 B2 JP 6929230B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
length
spacer
vector
itr2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017559315A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018515102A (ja
JP2018515102A5 (ja
Inventor
グレイ，ジョン，ティー．
Original Assignee
セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル インコーポレイテッド
セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル インコーポレイテッド, セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル インコーポレイテッド filed Critical セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル インコーポレイテッド
Publication of JP2018515102A publication Critical patent/JP2018515102A/ja
Publication of JP2018515102A5 publication Critical patent/JP2018515102A5/ja
Priority to JP2021130440A priority Critical patent/JP7316326B2/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6929230B2 publication Critical patent/JP6929230B2/ja
Priority to JP2023115773A priority patent/JP2023138527A/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C12N15/8616—Special methods for targeting systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/38—Vector systems having a special element relevant for transcription being a stuffer

Description

関連出願の相互参照
この出願は、参照によってその開示全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年５月１４日に出願された米国仮出願第６２／１６１，５０５号の優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、減少された夾雑核酸を有するウイルス粒子の生産のためのスペーサーを含む核酸分子に関する。
発明の背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくものなどのパルボウイルス遺伝子治療ベクターは、動物モデルにおける、および患者における、長期遺伝子発現に首尾よく使用されている。パルボウイルス遺伝子治療ベクターの治療的潜在能力が有望であるように見える一方で、ベクターストック中に見出されるコンタミナントなどを含む安全性の問題は、それ以外の点では有効な処置のための耐容用量を制限していた。有効性減少およびベクター毒性の原因の１つは、ウイルスベクター粒子内に存在するベクターからの夾雑核酸（例えば、原核生物性の核酸、抗生物質抵抗性遺伝子および高ＣｐＧ含有率の核酸）である。
本発明は、ウイルス粒子中にパッケージングすることができるスペーサーを含む核酸分子、およびそれらを生産する方法に関する。
第１の側面において、本発明は、５’→３’方向に：ＳＳ１−ＩＴＲ１−ＣＳ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに作動可能に（operably）連結された、第１のスペーサー（ＳＳ１）；第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ１）；クローニング部位（ＣＳ）；第２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ２）；および、真核生物のスペーサーなどの第２のスペーサー（ＳＳ２）；を含む、核酸分子を特徴とする。別の側面において、本発明は、第１のスペーサー（ＳＳ１）；第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ１）；異種ポリヌクレオチド分子（ＨＰＭ）；第２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ２）；および、真核生物のスペーサーなどの第２のスペーサー（ＳＳ２）；を、構成要素が５’→３’方向に：ＳＳ１−ＩＴＲ１−ＨＰＭ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに作動可能に連結されるように含む、核酸分子を特徴とする。
一態様において、核酸分子は、構成要素に対して５’→３’方向に：ＳＳ１−ＩＴＲ１−ＰＥｕｋ−ＣＳ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに作動可能に連結された真核生物プロモーター（ＰＥｕｋ）をさらに含む。核酸分子の真核生物プロモーターは、組織特異的プロモーター（例えば、肝臓特異的プロモーター、筋特異的プロモーターまたは神経特異的プロモーター）または構成的プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーターまたはニワトリβアクチンプロモーター）であってもよい。
他の態様において、核酸分子は、阻害性ＲＮＡ分子（例えば、小もしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小もしくは短干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイム）またはポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド分子を含む。別の態様において、核酸分子は、ポリペプチド（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＧＦＰ）をコードする異種ポリヌクレオチド分子を含み、および、核酸分子はさらに、構成要素に対して５’→３’方向に：ＳＳ１−ＩＴＲ１−ＰＥｕｋ−ＨＰＭ−ｐＡ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに作動可能に連結されたポリアデニル化部位（ｐＡ）（例えば、ヒトβグロビンポリアデニル化部位、ＳＶ４０後期ポリアデニル化部位、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位、またはウシ成長ホルモンポリアデニル化部位）を含む。
いくつかの態様において、第１のスペーサーまたは第２のスペーサーは、長さが１００アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まない。例えば、第１のスペーサーまたは第２のスペーサーは、長さが５０アミノ酸未満であるオープンリーディングフレームを含み得る。別の態様において、第１のスペーサーまたは第２のスペーサーは、原核生物の転写因子結合部位を含むＤＮＡなどの、原核生物起源のＤＮＡを含まない。他の態様において、第１のスペーサーまたは第２のスペーサーは、スペーサーの核酸配列全体の１％未満（例えば、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％）である総ＣｐＧ含有率を含む。本発明の第１のスペーサーまたは第２のスペーサーは、エンハンサーを含み得る。例えば、第１のスペーサーまたは第２のスペーサーは、組織特異的エンハンサー（例えば、肝臓特異的エンハンサー、筋特異的エンハンサーまたは神経特異的エンハンサー）である。例えば、第１のスペーサーまたは第２のスペーサーは、ａｐｏＥ／ａｐｏＣ１エンハンサーまたはａｐｏＣＩＩＩエンハンサーを含む肝臓特異的エンハンサーであってもよい。
本発明の他の態様は、長さ約２．０Ｋｂ〜約５．０Ｋｂ（例えば、長さ約２．５Ｋｂ〜約４．５Ｋｂ；長さ約３．０Ｋｂ〜約４．０Ｋｂ；または長さ約３．０Ｋｂ〜約３．５Ｋｂ）の第１のスペーサーまたは第２のスペーサーを含む。いくつかの態様において、第１のスペーサーおよび第２のスペーサーは、合わせて長さ約４．０Ｋｂ〜約１０．０Ｋｂの範囲であり得る（例えば、長さ約４．０Ｋｂ〜約１０．０Ｋｂ；長さ約５．０Ｋｂ〜約９．０Ｋｂ；長さ約６．０Ｋｂ〜約８．０Ｋｂ；または長さ約６．０Ｋｂ〜約７．０Ｋｂ）。別の態様において、異種ポリヌクレオチド分子と第１のスペーサーまたは第２のスペーサーとを合わせた合計の長さは、長さ約５．０Ｋｂ〜約１０．０Ｋｂ（例えば、長さ約５．５Ｋｂ〜長さ約９．５Ｋｂ；長さ約６．０Ｋｂ〜長さ約９．０Ｋｂ；長さ約６．５Ｋｂ〜長さ約８．５Ｋｂ；または長さ約７．０Ｋｂ〜長さ約８．０Ｋｂ）である。また別の態様において、異種ポリヌクレオチド分子、第１のスペーサー、および第２のスペーサーを合わせた合計の長さは、長さ約１０．０Ｋｂ〜約１５．０Ｋｂ（例えば、長さ約１０．５Ｋｂ〜長さ約１４．５Ｋｂ；長さ約１１．０Ｋｂ〜長さ約１４．０Ｋｂ；長さ約１１．５Ｋｂ〜長さ約１３．５Ｋｂ；または長さ約１２．０Ｋｂ〜長さ約１３．０Ｋｂ）である。
さらなる態様において、第１のスペーサーおよび／または第２のスペーサーは、１以上の（例えば、２、３、４または５の）クローニング部位に隣接している。
いくつかの態様において、ＩＴＲ１および／またはＩＴＲ２は、パルボウイルスＩＴＲである。例えば、パルボウイルスＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲ）である。
一態様において、本発明は、上記の核酸分子のいずれかを含んでなるベクターを特徴とする。本発明のベクターは、第１のスペーサーの５’側および／または第２のスペーサーの３’側に位置する選択可能マーカー遺伝子（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）に対して作動可能に連結された原核生物プロモーターをさらに含んでもよい。別の態様において、ベクターは、第１のスペーサーの５’側および／または第２のスペーサーの３’側に位置する原核生物性の複製起点をさらに含んでもよい。ベクターは、環状であるかまたは直鎖状である核酸分子を含んでもよい。
第３の側面において、本発明は、ＩＴＲ１、異種ポリヌクレオチド分子およびＩＴＲ２を含む核酸分子を含む複数のウイルス粒子であって、ウイルス粒子の１％未満（例えば、０．７５％、０．５％、０．２５％または０．１５％）が、コンタミナント核酸（例えば、原核生物性の核酸（例えば、複製起点、選択可能マーカー遺伝子、および／または、転写因子結合部位を含むプロモーター）および／またはコンタミナント核酸全体の２％を超えるＣｐＧ含有率を含む核酸）を含む核酸分子を含む、前記複数のウイルス粒子を特徴とする。
第４の側面において、本発明は、ＩＴＲ１、異種ポリヌクレオチド分子およびＩＴＲ２を含む核酸分子を含むウイルス粒子；第１のスペーサー、ＩＴＲ１、異種ポリヌクレオチド分子およびＩＴＲ２を含む核酸分子を含むウイルス粒子；ならびにＩＴＲ１、異種ポリヌクレオチド分子、ＩＴＲ２および第２のスペーサーを含む核酸分子を含むウイルス粒子を含む、複数のウイルス粒子を特徴とする。
第５の側面において、本発明は、ＩＴＲ１および第１のスペーサーを含む核酸分子を含むウイルス粒子；ＩＴＲ２および第２のスペーサーを含む核酸分子を含むウイルス粒子；ならびにＩＴＲ１、異種ポリヌクレオチド分子およびＩＴＲ２を含む核酸分子を含むウイルス粒子を含む、複数のウイルス粒子を特徴とする。
本発明はさらに、上記のベクターのいずれかを含む宿主細胞も含む。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。例えば、原核細胞が、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）であってもよい。別の態様においては、真核細胞が、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＨｅＬａ細胞）である。
第６の側面において、本発明は、複数のウイルス粒子を生産するための方法であって、培地中で上述のベクターのいずれかを含む宿主細胞を培養することを含む、前記方法を特徴とする。方法は、複数のウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ粒子）を培地から回収することをさらに含んでもよい。
図１は、第１のスペーサー（スペーサー１）、第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＣＭＶプロモーター、βグロビンイントロン、ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド、βグロビンポリアデニル化（ｐＡ）、第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ、第２のスペーサー（スペーサー２）、原核生物性の複製起点（ｏｒｉＣ）、およびカナマイシン（ｋａｎ）選択遺伝子を含む、ＡＡＶベクターを描写した模式図である。
発明の詳細な説明
Ａ．定義
本明細書において使用する用語「クローニング部位」は、適合する付着または平滑末端を含む核酸のライゲーションによる制限エンドヌクレアーゼ介在クローニングのための制限部位、相同および伸長「オーバーラップＰＣＲスティッチング（overlap PCR stitching）」によるインサートＤＮＡのＰＣＲによるクローニングのためのプライミング部位として働く核酸の領域、または組換え交換反応による標的核酸のリコンビナーゼによる挿入のための組換え部位、または標的核酸のトランスポゾン介在挿入のためのモザイク末端、ならびに当該技術分野でよく知られている他の手法のもの、を含む核酸配列をいう。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」は、交換可能に使用され、その中に外来核酸が導入された１以上の細胞（かかる細胞の子孫を含む）をいう。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これには一次形質転換細胞、および、経路の数に関わらずそれから誘導された子孫が含まれる。
本明細書において使用される「連結される」または「連結する」または「連結」は、２つの核酸がリン酸ジエステル結合を通じて一緒になった共有結合的な繋がりをいうことを意味する。かかる繋がりには、繋げられた２つの核酸の間に、あらゆる数の追加の核酸を含めることができる。
本明細書において交換可能に使用される「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。
用語「異種ポリヌクレオチド」および「異種核酸」は、本明細書において交換可能に使用され、ウイルスにおいて天然には生じない核酸分子をいう。
核酸は、別の核酸と構造的または機能的な関係に置かれている場合、「作動可能に連結され」ている。例えば、ＤＮＡの１つのセグメントは、ＤＮＡの別のセグメントと互いに関連して、連続的な同じＤＮＡ分子上に配置され、かつ、構造的または機能的な関係を有する場合、例えば、コード領域の転写を容易にするようにコード領域に関連して位置するプロモーターまたはエンハンサーなどである場合、ＤＮＡの別のセグメントに対して作動可能に連結されているといってもよい。他の例において、作動可能に連結された核酸は、連続的ではないが、核酸としてまたはそれらによって発現されるタンパク質としてそれらが互いに機能的な関係を有するように位置させられている。エンハンサーは、例えば、連続的である必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより、または合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくはリンカーを使用することにより、成し遂げられてもよい。
用語「ポリアデニル化シグナル」または「ポリアデニル化部位」は、本明細書において、細胞内で発現したＲＮＡ分子へのポリアデノシンリボ核酸の付加を指示するのに十分な核酸配列を意味することに使用される。
「プロモーター」は、メッセンジャーＲＮＡにおける遺伝子の転写開始を可能にする核酸であり、かかる転写は、プロモーター上またはプロモーター近くのＲＮＡポリメラーゼの結合で開始される。
「ＩＴＲ」は、パリンドローム核酸、例えば、逆位末端反復配列であり、長さ約１２０ヌクレオチド〜約２５０ヌクレオチドでありヘアピンを形成することができるものである。用語「ＩＴＲ」には、パルボウイルスタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）が認識して結合することができるウイルスゲノム複製の部位が含まれる。ＩＴＲは、いかなるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からのものであってもよく、血清型２が好ましい。ＩＴＲは、複製タンパク質結合エレメント（ＲＢＥ）および末端分解配列（ＴＲＳ）を含む。用語「ＩＴＲ」は、ＩＴＲがウイルスのパッケージング、複製、統合および／またはプロウイルスのレスキューなどを仲介するために機能する限りにおいて、野生型パルボウイルスＩＴＲである必要はない（例えば、野生型核酸配列が、挿入、欠失、短縮化またはミスセンス変異によって変更されていてもよい）。用語「５’ＩＴＲ」は、核酸分子の５’境界（5’ boundary）に位置するパルボウイルスＩＴＲを意味することを意図し；用語「３’ＩＴＲ」は、核酸分子の３’境界に位置するパルボウイルスＩＴＲを意味することを意図する。
基準ポリヌクレオチド配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列をアラインメントし、必要であれば最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後で、基準ポリヌクレオチド配列中の核酸と同一である、候補配列中の核酸のパーセントとして定義され、保存的置換は配列同一性の一部として考慮しない。パーセント核酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当技術分野の範囲内にある種々の方法、例として、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２またはMegalign（DNASTAR）ソフトウエアなどの、公に利用可能なコンピュータソフトウエアによって達成することができる。当業者は、配列をアラインメントするために、比較する配列の完全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含めた、適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、％核酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成される。所与の核酸配列Ａの、所与の核酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する％核酸配列同一性（これに代えて、所与の核酸酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定の％核酸配列同一性を有するか、または含んでなる所与の核酸配列Ａとして言い表すこともできる）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＢＬＡＳＴにより、ＡおよびＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一性マッチとしてスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｙは、Ｂにおける核酸の総数である。核酸配列Ａの長さが核酸配列Ｂの長さと同等でない場合、ＢへのＡの％核酸配列同一性は、ＡへのＢの％核酸配列同一性と同等でないことが認められるであろう。
本明細書において使用される「キャプシドタンパク質」は、ＡＡＶウイルス粒子の構成要素であるいずれかのＡＡＶキャプシドタンパク質をいい、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９がこれに含まれる。
「スペーサー」は、１００アミノ酸未満のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む少なくとも長さ２．０Ｋｂのポリペプチドであって；核酸配列全体の１％未満であるＣｐＧ含有率を有するものであるか；または、転写因子（ＴＦ）結合部位（例えば、原核生物の転写因子によって認識される部位）を含まないものである、あらゆるポリペプチドである。用語「スペーサー」は、原核生物起源の核酸を含まない。スペーサーは、天然供給源から単離されてもよいし、または、例えばＯＲＦのサイズ、ＣｐＧ含有率もしくは転写因子結合部位の数を低減させるために、改変されてもよい。スペーサーは、ポリヌクレオチドの発現を促進する天然の核酸から選択されてもよく、例えば、転写開始点の近くに見出されるエンハンサーであってもよい。本明細書において定義された「スペーサー」の使用は、ウイルス粒子中にパッケージングされる夾雑核酸の低減をもたらす。
「Ｘ％のＣｐＧ含有率」は、ＸがＣｐＧジヌクレオチドの数を表す場合に、１００のヌクレオチドに対してＸのＣｐＧジヌクレオチドを示すポリヌクレオチドをいう。（Gardiner-Garden and Frommer, J. Mol. Biol., 196: 261-282 (1987）。「ＣｐＧ部位」とは、長さ方向に沿ってヌクレオチドの直鎖状核酸配列においてシトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドの隣に現れるＤＮＡの領域、例えば、−Ｃ−リン酸−Ｇ−、リン酸１つのみによって隔てられたシトシンとグアニン、または、グアニンヌクレオチドの５’側にあるシトシン、を意味する。
用語「コンタミナント」または「夾雑」核酸は、起源が原核生物性である（例えば、原核生物性の転写産物またはそのフラグメント、転写因子結合部位またはプロモーターエレメントを含む）か；２％を超えるＣｐＧ含有率を含むか；または選択可能マーカー遺伝子である、核酸をいう。例えば、「コンタミナント」または「夾雑」核酸には、細菌性複製起点、細菌性選択可能マーカー遺伝子、細菌性抗生物質抵抗性遺伝子、および、転写因子結合部位を含む細菌性プロモーターが含まれる。
本明細書において使用される用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子をいうことを意図する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡのセグメントがその中にライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡのループをいう。ベクターの別のタイプは、さらなるＤＮＡのセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞中において自律的複製を可能とする（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノム中に統合されることができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。あるベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指揮することを可能とする。
本明細書において使用される用語「パルボウイルス」は、自律的に複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルス（dependovirus）を含むパルボウイルス科を包含する。自律性パルボウイルス（autonomous parvovirus）には、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属およびコントラウイルス属(Contravirus)のメンバーが含まれる。例示の自律性パルボウイルスには、これに限定はされないが、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、ヘビパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスが含まれる。他の自律性パルボウイルスは、当業者に知られている。例えば、Fields et al. Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers）を参照。ディペンドウイルス属は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含み、それには、これに限定はされないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶおよびヒツジＡＡＶが含まれる。例えば、Fields et al. Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照。
本明細書において使用する用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）には、これに限定はされないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、および、あらゆる他の現在知られているかまたは後に発見されるＡＡＶが含まれる。例えば、Fields et al. Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照。さらなるＡＡＶ血清型およびクレードも、最近同定されている（例えば、Gao et al. (2004) J. Virol. 78:6381；Moris et al. (2004) Virol. 33: 375-383を参照）。種々の血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびに天然のＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は当技術分野において知られている。かかる配列は、文献において、またはGenBankなどの公共のデータベースに見出され得る。例えば、GenBankアクセッション番号NC-002077、NC-001401、NC-001729、NC-001863、NC-001829、NC-001862、NC-000883、NC-001701、NC-001510、NC-006152、NC-006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、AY631966、AX753250、EU285562、NC-001358、NC-001540、AF513851、AF513852およびAY530579を参照；これらの開示は、ＡＡＶ核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために本明細書に参照によって組み込まれる。また、例えば、Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virol. 73: 939；Chiorini et al. (1997) J. Virol. 71:6823；Chiorini et al. (1999) J. Virol. 73:1309；Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；Moris et al. (2004) Virol. 33: 375；Muramatsu et al, (1996) Virol. 221:208；Ruffing et al. (1994) J. Gen. Virol. 75:3385；Rutledge et al. (1998) J. Virol. 72:309；Schmidt et al. (2008) J. Virol. 82:8911；Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921；Srivastava et al. (1983) J. Virol, 45:555；Xiao et al. (1999) J. Virol. 73:3994；国際公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照；これらの開示は、ＡＡＶ核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために本明細書に参照によって組み込まれる。
Ｂ．核酸分子
ウイルス複製機構は、ウイルスゲノムをコードする核酸分子の複製およびパッケージングの間に、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）で核酸分子の合成を開始させ、核酸分子のウイルス粒子への組み込みを促進させる。いくつかの事例において、隣在するコンタミナント核酸（例えば、原核生物性の複製起点、原核生物プロモーターおよび／または抗生物質抵抗性遺伝子）がウイルス粒子中へと組み込まれ、哺乳動物の宿主細胞に形質導入された場合に、望ましくない影響を生じる可能性がある。この発明は、少なくとも部分的には、核酸分子のＩＴＲに隣接する２つのスペーサーの組み入れによって不慮のコンタミナント核酸のパッケージングが低減されるという発見に基づく。ここで我々は、夾雑核酸を含むウイルス粒子の数を低減させるためのウイルスベクターまたはウイルス粒子中に組み込むことができる２つのスペーサーを有する複数の核酸分子の生成について記載する。本発明に必要な核酸構成要素、ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、およびウイルス粒子を生産する方法は、本明細書に記載されている。
本発明の実施は、他に表示していない限り、当分野の技術の範囲内にある、分子生物学（組み換え手法を含む）、微生物学、ウイルス学および細胞生物学の従来の手法を採用する。
本発明は、ウイルスゲノムのＩＴＲに連結された２つのスペーサーの柔軟なモジュール式の組み入れを可能にする核酸分子を生成する手段を提供する。第１の核酸分子は、５’→３’方向に：ＳＳ１−ＩＴＲ１−ＣＳ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに作動可能に連結されている第１のスペーサー（ＳＳ１）、第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ１）、クローニング部位（ＣＳ）、第２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ２）および第２のスペーサー（ＳＳ２）を含む。第１の核酸分子を、クローニング部位で制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼでの核酸分子の切断によって改変することができる。続いて、異種ポリヌクレオチド分子（ＨＰＭ）、真核生物プロモーター（ＰＥＵＫ）および／またはポリアデニル化部位（ｐＡ）を、核酸分子中のクローニング部位へと導入することができる。以下の節では、本発明の核酸分子中で使用され得るスペーサー、異種ポリヌクレオチド分子、真核生物プロモーターおよびポリアデニル化部位の非限定例を提供する。
スペーサー
本発明のスペーサーは、天然の核酸分子または合成核酸分子を含むことができる。天然のスペーサー分子は、オンラインのウェブツール、例えば、ＵＣＳＣゲノムブラウザなどを使用して同定することができ、および、核酸分子に元々備わっている特徴、例えば、転写開始点に隣在する核酸の自然な出現などに基づいて選択することができる。スペーサーは、ウイルス粒子によって導入された場合に毒性を生じ得るかまたはウイルス粒子の機能性を抑制し得るような潜在的なマイナスの特徴を取り除くように、設計してもよい。例示の毒性源および機能性を抑制する特徴の発生源は、パッケージされるべきウイルスゲノムをコードする核酸に隣在してしばしば見出される夾雑核酸に、見出される。これらの夾雑核酸には、これに限定はされないが、原核生物の（例えば、細菌の）核酸（例えば、複製起点、２％を超えるＣｐＧ含有率を有する核酸、オープンリーディングフレームおよび転写因子結合部位）が含まれる。本発明のスペーサーは、夾雑核酸の組み入れを最小限にするようにデザインされ得る。
例えば、一態様において、スペーサーは、長さが約１００アミノ酸を超えるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含まない。別の態様において、スペーサーは、長さが約５０アミノ酸未満であるＯＲＦを含む。例えば、スペーサーは、長さが５アミノ酸未満；長さが１０アミノ酸未満；長さが１５アミノ酸未満；長さが２０アミノ酸未満；長さが２５アミノ酸未満；長さが３０アミノ酸未満；長さが３５アミノ酸未満；長さが４０アミノ酸未満；長さが４５アミノ酸未満；長さが５０アミノ酸未満；長さが５５アミノ酸未満；長さが６０アミノ酸未満；長さが６５アミノ酸未満；長さが７０アミノ酸未満；長さが７５アミノ酸未満；長さが８０アミノ酸未満；長さが８５アミノ酸未満；長さが９０アミノ酸未満；長さが９５アミノ酸未満；または長さが１００アミノ酸未満であるＯＲＦを含むことができる。ＯＲＦは、オンラインの核酸配列解析ツール、例えばＢＬＡＳＴまたはＵＣＳＣゲノムブラウザを使用して決定することができる。
他の態様において、スペーサーは、スペーサー核酸配列全体の１％未満である総ＣｐＧ含有率（例えば、スペーサー核酸配列全体の０．５％未満のＣｐＧ含有率、０．２％未満のＣｐＧ含有率；０．０５％未満のＣｐＧ含有率；または０．０２％未満のＣｐＧ含有率）を有する。いくつかの態様においてスペーサーは、スペーサー核酸の長さにわたって２％より大きいＣｐＧ含有率を含まない。例えば、３．０Ｋｂの長さを有するスペーサーについては、スペーサー核酸中におけるＣｐＧジヌクレオチドの総数は、６０ＣｐＧジヌクレオチドを越えないものであり得、好ましくは、３０ＣｐＧジヌクレオチド未満である。
別の態様において、スペーサーは、起源が原核生物性であるコンタミナント核酸を含まない。例えば、スペーサーは、原核生物の転写因子のための転写因子結合部位、または原核生物の複製機構によって認識される複製起点を提供する、原核生物性の核酸を含まない。スペーサーは、さらに、原核生物において発現されることができる選択可能マーカー、例えば抗生物質抵抗性遺伝子を含まない。
他の態様において、スペーサーは、エンハンサーである。例えば、スペーサーは、組織特異的エンハンサーまたは普遍的に発現されるエンハンサーである。一態様において、スペーサーは、組織特異的エンハンサー、例えば、筋特異的（心筋特異的、骨格筋特異的および／または平滑筋特異的を含む）、神経組織特異的（脳特異的を含む）、眼に特異的（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的、骨髄特異的、膵臓特異的、脾臓特異的、および肺特異的エンハンサーエレメントである。別の態様において、スペーサーは、肝臓特異的エンハンサー、例えば、ａｐｏＥ／ａｐｏＣ１またはａｐｏＣＩＩＩエンハンサーである。
本発明のスペーサーは、コンタミナント核酸のパッケージングを減少させるかまたは防止することに適切な長さのものである。例えば、スペーサー（例えば、ＳＳ１またはＳＳ２）は、長さ約２．０Ｋｂ〜約５．０Ｋｂ；長さ約２．５Ｋｂ〜約４．５Ｋｂ；長さ約３．０Ｋｂ〜約４．０Ｋｂ；または長さ約３．０Ｋｂ〜約３．５Ｋｂの範囲であり得る。第１のスペーサーおよび第２のスペーサーの長さは、同等であり得る（例えば、ＳＳ１が長さ約３．０Ｋｂであり、ＳＳ２が長さ約３．０Ｋｂである）か、または異なり得る（例えば、ＳＳ１が長さ約４．０Ｋｂであり、ＳＳ２が長さ約５．０Ｋｂである）。第１のスペーサーおよび第２のスペーサーの長さは、ベクターに応じて異なり得る。第１のスペーサーおよび第２のスペーサーを合わせた合計の長さは、長さ約４．０Ｋｂ〜約１０．０Ｋｂの範囲であり得る。例えば、第１のスペーサーおよび第２のスペーサーは、合わせて、長さ約４．０Ｋｂ〜約１０．０Ｋｂ；長さ約５．０Ｋｂ〜約９．０Ｋｂ；長さ約６．０Ｋｂ〜約８．０Ｋｂ；または長さ約６．０Ｋｂ〜約７．０Ｋｂの範囲の範囲であり得る。
スペーサーの長さはさらに、ＩＴＲ１とＩＴＲ２との間に挿入される所望の核酸分子のサイズに対応して選択され得る。例えば、ＡＡＶ粒子は、約４．７Ｋｂの核酸分子のためのパッケージング能力を有する。ＡＡＶ粒子にパッケージングされる核酸分子中に、長さ約３．０Ｋｂの所望の異種ポリヌクレオチドが挿入される場合、第１のスペーサーおよび／または第２のスペーサーは、長さ約２．０Ｋｂであり得る。したがって、異種ポリヌクレオチドと第１のスペーサーまたは第２のスペーサーとは、合わせて長さ約５．０Ｋｂの長さを有するであろう。本発明のスペーサー分子については、第１のスペーサーまたは第２のスペーサーは、異種ポリヌクレオチドと合わせて長さ約５．０Ｋｂ〜長さ約１０．０Ｋｂ；長さ約５．５Ｋｂ〜長さ約９．５Ｋｂ；長さ約６．０Ｋｂ〜長さ約９．０Ｋｂ；長さ約６．５Ｋｂ〜長さ約８．５Ｋｂ；または長さ約７．０Ｋｂ〜長さ約８．０Ｋｂであり得る。第１のスペーサー、第２のスペーサー、および異種ポリヌクレオチドは、合わせて長さ約１０．０Ｋｂ〜長さ約１５．０Ｋｂ；長さ約１０．５Ｋｂ〜長さ約１４．５Ｋｂ；長さ約１１．０Ｋｂ〜長さ約１４．０Ｋｂ；長さ約１１．５Ｋｂ〜約１３．５Ｋｂ；または長さ約１２．０Ｋｂ〜約１３．０Ｋｂであり得る。
クローニング部位
クローニング部位は、核酸分子中の個々の構成要素の即時の除去および／または置換を可能にする。クローニング部位は、制限部位を認識するエンドヌクレアーゼによって切断される制限部位を含む。例えば、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の）クローニング部位は、第１のスペーサー、第２のスペーサー、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、真核生物プロモーター、異種ポリヌクレオチド、および／またはポリアデニル化部位に隣接してもよい。エンドヌクレアーゼによるクローニング部位の切断の後で、所望の核酸分子が挿入された際にクローニング部位が失われてもよい。所望の核酸分子を構築するのに使用するための好適な制限エンドヌクレアーゼは、文献における、またはREBASE（商標）データベースなどの種々のオンラインデータベースにおける、当業者に容易に入手可能な情報を使用して同定され得る。好適な制限エンドヌクレアーゼには、例えば、中でもとりわけ、New England Biolabs, LifeTechnologies, Roche, Clontech, Stratagene, Amersham, Pharmaciaを含む、種々の商業的な入手源から入手可能なものが含まれる。
異種ポリヌクレオチド分子
核酸分子は、制限エンドヌクレアーゼによって制限部位で切断され得、続いて核酸分子の末端を異種ポリヌクレオチド分子（ＨＰＭ）にライゲーションさせ得る。これにより、本発明の核酸分子は、５’→３’方向にＳＳ１−ＩＴＲ１−ＨＰＭ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに作動可能に連結された上記構成要素を含み得る。
本発明の異種ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、阻害性ポリヌクレオチドに転写されるポリヌクレオチド、または転写されないポリヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド分子は、これに限定はされないが：第VIII因子（FVIII）；第IX因子（FIX）；または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。
異種ポリヌクレオチドはまた、阻害性ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡをコードしてもよい。阻害性ＲＮＡの発現は、例えば、特定の標的遺伝子および／またはポリペプチドの発現を弱めることができる。阻害性ＲＮＡ分子は、小もしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小もしくは短干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムを含んでもよい。異種ポリヌクレオチドはまた、転写されないポリヌクレオチド、例えば、プロモーターを欠いたポリヌクレオチドをもコードしてもよい。
上記異種ポリヌクレオチドのいずれかが、天然および非天然のバリアント、例えば、機能獲得型および機能欠損型バリアントをもまた含んでもよい。異種ポリヌクレオチドの核酸配列は、天然のバリアントをコードしてもよく、または、核酸配列は、基準核酸配列と比べて実質的に同じか、それより大きいか、または小さい活性もしくは機能を有し得るが少なくとも基準核酸配列の部分的な活性又は機能を保持する非天然のバリアントを生じるために、改変されてもよい。例えば、ヒトFIXのバリアントをコードする異種ポリヌクレオチドが、バリアント化の結果として、内因性の活性を保持するかまたは増強された治療的効果を提供してもよい。
改変の非限定例には、基準核酸配列の、１以上の核酸置換（例えば、１〜３、３〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、またはそれ以上の核酸の）、付加（例えば、１〜３、３〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜１００、またはそれ以上の核酸の挿入）、および欠失（例えば、部分配列またはフラグメントの）が含まれる。特定の態様において、改変またはバリアント異種ポリヌクレオチドは、未改変異種ポリヌクレオチドの機能または活性の少なくとも一部を保持する。改変異種ポリヌクレオチドおよびそれに続くバリアントは、基準の異種ポリヌクレオチド、例えば、本明細書において記載されているとおりのものと比べて、小さいか、同じであるか、またはそれより大きい活性もしくは機能を有し得るが、少なくとも基準の異種ポリヌクレオチドの部分的な活性又は機能を有する。
天然または非天然のバリアント異種ポリヌクレオチドの核酸配列は、例えば、基準核酸配列に対して少なくとも約５０％の配列同一性、約７０％の配列同一性、約８０％の配列同一性、約９０％の配列同一性、または約９５％の配列同一性を有する。ポリヌクレオチド中にヌクレオチドの変化を導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2007)を参照）。
ＨＰＭはまた、Kozak配列、イントロン、および／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むようにさらに改変されてもよい。
真核生物プロモーターおよびポリアデニル化部位
核酸分子のＨＰＭは、宿主細胞におけるＨＰＭの発現を促進するための真核生物プロモーター（ＰＥｕｋ）（例えば、組織特異的プロモーターまたは普遍的に活性なプロモーター）に対して作動可能に連結されていてもよい。ＰＥｕｋは、ＨＰＭと別々に、または組み合わせられて、核酸分子中のＣＳへと挿入されてもよい。これにより、核酸分子は、５’→３’方向にＳＳ１−ＩＴＲ１−ＰＥｕｋ−ＨＰＭ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに連結された（例えば、作動可能に連結された）上記構成要素を含み得る。
いくつかの事例において、ＰＥｕｋは、特定の細胞または組織において活性である（例えば、中でもとりわけ、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、眼、網膜、骨、筋肉、肺、膵臓、心臓または腎臓の細胞において活性である）組織特異的プロモーターである。事例として、骨格筋における発現が望まれる場合、筋肉において活性なＰＥｕｋが使用され得る。例示の骨格筋プロモーターには、デスミン、骨格α−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのもの、ならびに天然のプロモーターよりも高い活性をもつ合成の筋プロモーターが含まれる（例えば、Li, et al., Nat. Biotech. 17:241-245 (1999)を参照）。肝臓特異的に発現するＰＥｕｋの例は、アルブミン、Miyatake, et al. Virol., 71:5124-32 (1997)；Ｂ型肝炎ウィルスコアプロモーター、Sandig, et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996)；α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7: 1503-14 (1996)；およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、Okuyama, et al., Hum. Gene Ther., 7: 637-645 (1996)である。骨特異的に発現するＰＥｕｋの例は、オステオカルシン、Stein, et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)；および骨シアロタンパク質、Chen, et al., Bone Miner. Res., 11 :654-64 (1996)である。リンパ球特異的に発現するＰＥｕｋの例は、ＣＤ２、Hansal, et al., Immunol., 161:1063-8 (1998)；免疫グロブリン重鎖；およびＴ細胞受容体α鎖である。神経特異的に発現するＰＥｕｋの例は、中でもとりわけ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Andersen, et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Piccioli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5615 (1991)；ニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Piccioli, et al., Neuron, 15:373-384 (1995)；およびシナプシン１（Ｓｙｎ１）、Kugler, et al., Gene Ther., 10: 337-347 (2003)である。
いくつかの事例において、ＰＥｕｋは、多種多様な細胞タイプにおいてポリヌクレオチドの発現を駆動することを可能とする普遍的に活性なプロモーター／エンハンサーである。例示の普遍的に活性なＰＥｕｋには、これに限定はされないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター／エンハンサー；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー；および種々の哺乳動物細胞タイプにおいて活性な他のウイルスプロモーター／エンハンサー、または自然に存在しない合成のエレメント（例えば、Boshart et al, Cell, 41 :521-530 (1985)を参照）；ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター；ニワトリβアクチンプロモーター；およびホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが含まれる。異種ポリヌクレオチドが阻害性ＲＮＡ分子をコードする態様において、ＰＥＵＫには、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーター）が含まれ得る。
ＰＥｕｋが、ポリペプチドをコードするＨＰＭと組み合わせられている場合、核酸分子は、ポリアデニル化部位（ｐＡ）をさらに含み得る。これにより、核酸分子は、５’→３’方向にＳＳ１−ＩＴＲ１−ＰＥｕｋ−ＨＰＭ−ｐＡ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに連結された（例えば、作動可能に連結された）上記構成要素を含み得る。ｐＡは、ヒトβグロビンポリアデニル化部位、ＳＶ４０後期ポリアデニル化部位、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位、またはウシ成長ホルモンポリアデニル化部位を含み得る。
Ｃ．ベクター、宿主細胞、および生産方法
ベクター
本発明は、上記の核酸分子のいずれかを含むベクターを特徴とする。上で詳細に記載された核酸分子の構成要素に加えて、ベクターは、クローニング部位、細菌性または哺乳動物の複製起点、細菌性プロモーターエレメント、および／または、選択のマーカーとして有用なポリペプチドをコードする核酸（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）を含んでもよい。抗生物質抵抗性遺伝子には、これに限定はされないが、カナマイシン、アンピシリン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールが含まれ得る。選択可能マーカー遺伝子は、細菌転写因子結合部位を含むプロモーターから発現され得る。プロモーターおよび選択可能マーカーは、５’→３’方向に作動可能に連結されており、第１のスペーサーの５’側（上流側）および／または第２のスペーサーの３’側（下流側）に位置していてもよい。複製起点もまた、第１のスペーサーの５’側（上流側）および／または第２のスペーサーの３’側（下流側）に位置していてもよい。本発明のベクターには、ウイルス粒子中へとパッケージングすることができる核酸分子を含むウイルスベクターが含まれ得る。ベクターは、環状（例えば、プラスミド）であるかまたは直線状であり得る。
ウイルス粒子
本発明のウイルス粒子は、感染粒子中にキャプシド化された上述の核酸分子のいずれかを含む。本発明の核酸分子は、核酸分子の第１および第２のＩＴＲ（ＩＴＲ１およびＩＴＲ２）に隣接する第１のスペーサーおよび第２のスペーサー（ＳＳ１およびＳＳ２）を含み、これはスペーサー分子のパッケージングという結果をもたらし得る。例えば、複数のウイルス粒子において、いくつかのウイルス粒子は、第１のスペーサー（ＳＳ１）および第１のＩＴＲ（ＩＴＲ１）を有する核酸分子を含み；いくつかのウイルス粒子は、第２のスペーサー（ＳＳ２）および第２のＩＴＲ（ＩＴＲ２）を有する核酸分子を含み；いくつかのウイルス粒子は、ＩＴＲ１、異種ポリヌクレオチドおよびＩＴＲ２を含み；いくつかのウイルス粒子は、第１のスペーサー（ＳＳ１）、ＩＴＲ１、異種ポリヌクレオチドおよびＩＴＲ２を含み；およびいくつかのウイルス粒子は、ＩＴＲ１、異種ポリヌクレオチド、ＩＴＲ２および第２のスペーサー（ＳＳ２）を含む。核酸分子中における第１のスペーサーおよび第２のスペーサーの組み入れは、核酸分子を含むベクター中に存在するさらなる夾雑核酸（例えば、原核生物性の核酸、選択可能マーカー、または２％よりも大きいＣｐＧ含有率を有する核酸）の組み入れを最小限にすることに役立つ。例えば、ＩＴＲ１、異種ポリヌクレオチドおよびＩＴＲ２を有する核酸を含んでなる複数のウイルス粒子においては、複数のウイルス粒子の１％未満（例えば、０．９５％、０．９％、０．８５％、０．８％、０．７５％、０．７％、０．６５％、０．６％、０．５５％、０．５％、０．４５％、０．４％、０．３５％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１５％または０．１％）が、選択可能マーカー（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）、２％を超えるＣｐＧ含有率を有する核酸、および／または原核生物性の核酸（例えば、複製起点、転写因子結合部位および／またはオープンリーディングフレーム）を含む夾雑核酸を含む。
ウイルス粒子を生産する方法
複数のウイルス粒子を生産する方法は、本明細書において記載されているベクターのいずれかを使用して行われ得る。手短にいうと、ベクターは、宿主細胞中へとトランスフェクションされ、そこで一時的に存在し得る。これに代えて、直線状のベクターが、宿主細胞のゲノム中に、染色体上で、またはエピソームとして、安定して統合される。好適なトランスフェクション手法は、当技術分野において知られており、宿主細胞にベクターを送達するために容易に利用され得る。ベクターは、キャプシドタンパク質および／または複製タンパク質を発現する宿主細胞中において培養される。宿主細胞において、ベクター内に含まれる本発明の核酸分子がレスキューされ、キャプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質中にパッケージングされて感染性のウイルス粒子を形成する。
全般的に、核酸を含んでなるベクターをトランスフェクションによって送達する場合、ベクターは、約５μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、例えば、約１０μｇ〜約５０μｇのＤＮＡの量で、約１×１０４個の細胞〜約１×１０１３個の細胞、または約１×１０５個の細胞に対して送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターの相対的な量を、選択したベクター、送達方法、および選択した宿主細胞などの要因を考慮して、調整してもよい。
本発明のベクターは、種々の目的のために有用であるが、本明細書において記載されている核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生産における使用のために特によく適している。ベクターの核酸を含む複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を生成するためには、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質のＡＡＶヘルパー機能が必要であり、アデノウイルスヘルパー機能は、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子の産物によって提供される。当該ベクター、ＡＡＶヘルパーベクターおよびアデノウイルスヘルパー核酸は、宿主細胞に対してトランスに提供されてもよい。２ベクター系において、ベクターを、アデノウイルスに感染したヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞へと、ＡＡＶヘルパー機能を提供するさらなるベクターとともに共トランスフェクションすることができる。３ベクター系において、ＨＥＫ２９３細胞は、核酸分子を含む本発明のベクター、ＡＡＶヘルパー機能を提供するベクター、ならびにウイルス複製を可能にするためのＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡアデノウイルス遺伝子を提供することによって野生型のアデノウイルスの代替となる第３のベクターで、トランスフェクションされる（例えば、Shi et al, Virology J., 6:3 (2009)を参照）。
これに代えて、必要とされる構成要素（例えば、ベクター、ｒｅｐをコードする核酸、ｃａｐをコードする核酸および／またはアデノウイルスヘルパー機能）のいずれか１以上は、必要とされる構成要素の１以上を含むように、当業者に知られている方法を使用して設計された、安定な宿主細胞により提供されてもよい。本発明の方法には、標準トランスフェクションおよび共トランスフェクション手法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿法が含まれる。他の慣用の方法には、中でもとりわけ、ベクター核酸の相同組換え、寒天オーバーレイ（agar overlay）でのウイルスのプラーク形成、シグナル生成を測定する方法が含まれる（例えば、K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第５，４７８，７４５号を参照）。同様に、ＡＡＶビリオンを生成する方法も、当技術分野において知られており、好適な方法の選択は、本発明に対する限定ではない。
本明細書において記載されているＡＡＶおよび構成要素は、学術的な、市販の、または公共の供給源（例えば、American Type Culture Collection, Manassas, VA）から単離するか、または得てもよい。これに代えて、ＡＡＶ核酸配列を、公開された核酸配列、例えば、文献におけるまたは公共のデータベース、例えば、中でもとりわけGenBank（登録商標）、PubMed（登録商標）における入手可能な核酸配列の参照によって、合成または他の好適な手段を通じて得てもよい。
宿主細胞は、ベクターの核酸分子中に見出されるＩＴＲを認識して結合させるキャプシドタンパク質および複製タンパク質の発現を駆動する核酸を含む。例えば、ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐをコードする核酸が、異なるＡＡＶ供給源から独立して得られ、上記のとおりに宿主細胞へと導入されてもよい。さらに、Ｒｅｐ７８／６８をコードする核酸は、ＡＡＶ２からのものであってもよく、それに対してＡＡＶ ｃａｐをコードする核酸は、ＡＡＶ８からのものであってもよい。
したがって、一態様において、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸は、宿主細胞中の単一の核酸分子上にトランスフェクションされ得、細胞中においてエピソームとして安定して存在し得る。別の態様において、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸は、宿主細胞の染色体中に安定して統合される。これに代えて、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸は、宿主細胞において一時的に発現されてもよい。任意に、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする核酸は、宿主細胞中に導入されるべき他の核酸分子、例えば、アデノウイルスタンパク質をコードする核酸を含むベクター上に、供給されてもよい。
パッケージング宿主細胞はまた、本発明のウイルス粒子をパッケージングするために、ヘルパー機能も必要とする。任意に、これらの機能は、ヘルペスウイルスによって供給され得る。最も望ましくは、必要なヘルパー機能は、それぞれ、ヒトまたは非ヒト霊長類のアデノウイルス供給源、例えば、上記のものから提供されるか、および／またはAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Manassas, VA（米国）を含めた種々の供給源から入手可能である。例えば、宿主細胞は、Ｅ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物および／またはＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を与えられるか、および／または含む。宿主細胞は、ＶＡＩ ＲＮＡなどのさらなるアデノウイルス遺伝子を含んでもよいが、これらの遺伝子は必要ではない。別の態様においては、宿主細胞中において他のアデノウイルス遺伝子または遺伝子機能が存在しない。アデノウイルス遺伝子の１以上が、宿主細胞のゲノム中へと安定的に組み入れられ得、エピソームとして安定的に発現されるか、または一時的に発現される。
宿主細胞自体は、あらゆる生物学的有機体から選択されてもよく、原核細胞（例えば、細菌細胞）ならびに昆虫細胞（例えば、ＳＦ９）、酵母細胞および哺乳動物細胞を含めた真核細胞が、これに含まれる。例えば、大腸菌細菌細胞が、本発明のベクターを複製するための宿主細胞として使用され得る。宿主細胞は、あらゆる哺乳動物種の中から選択されてもよく、限定されないが、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨ、ＭＤＣ、ＣＯＳ １、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３細胞、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２などの細胞、および哺乳動物初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞が、これに含まれる。細胞を提供する哺乳動物種の選択も、哺乳動物細胞のタイプ、すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などの選択も、本発明を限定しない。
本発明のベクターの宿主細胞への導入はまた、当技術分野で知られている手法を使用して、および、本明細書全体を通しておよびS. Shi et al, Virol. J., 6:3 (2009)において述べられているとおりに成し遂げられてもよい。上述のあらゆるベクターが、例えば、中でもとりわけ、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合手法、高速ＤＮＡコートペレット（high velocity DNA-coated pellets）、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合によって、宿主細胞に導入され得る。好ましい態様において、標準トランスフェクション手法、例えば、ＣａＰＯ４トランスフェクションまたはエレクトロポレーション、および／またはヒト胎児由来腎臓細胞株ＨＥＫ２９３などの細胞株へのハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染が使用される。
その結果得られた、核酸分子を発現する組換えウイルス粒子は、治療的な目的のための遺伝子送達に特によく適している。さらに、本発明の組成物はまた、in vitroでの所望の遺伝子産物の生産のためにも使用され得る。培地中で上記ベクター（単数または複数）の１以上を含んでなる宿主細胞を培養すること、および任意にウイルス粒子を宿主細胞の培地から回収することを含んでなる、ウイルス粒子を生産するための方法もまた、提供される。
以下は、本発明の例である。上記提供された一般的な説明により、種々の他の態様も実施され得ることが理解される。
例１．スペーサーを有するＡＡＶベクターの生成
スペーサーを、ＡＡＶベクターへの組み入れのためにデザインした。ＡｐｏＥエンハンサーを、ＡＡＶベクター中にスペーサーとして含めるべき候補ゲノム核酸配列として選択した。ＵＣＳＣゲノムブラウザによって提供されたゲノムブラウザツールを、ＡｐｏＥエンハンサーの内に含まれるＣｐＧ含有率、推定転写因子結合部位およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定に利用した。ＡｐｏＥエンハンサー核酸配列の３．０Ｋｂのウィンドウを、その低いＣｐＧ含有率（２％）、限られた推定転写因子結合部位および小さなＯＲＦ（９０アミノ酸）のため、選択した。長さが１９ヌクレオチドのＰＣＲプライマーを、ＰＣＲによりＨＥＫ２９３細胞から単離したゲノムＤＮＡからのＡｐｏＥエンハンサー核酸配列の３．０Ｋｂの領域に結合させて増幅させるためにデザインした。その結果得られた増幅産物を、当該技術分野において知られている方法により、精製し、配列決定した。単離したＡｐｏＥエンハンサー核酸配列を、部位特異的突然変異誘発法（Stratagene）によって、ＣｐＧ含有率を低減させ、転写因子結合部位を取り除き、およびＯＲＦを３０アミノ酸に低減させるために、さらに改変した。
ＡＡＶ ｐＣＡＴ環状親ベクター、ｐＣＡＴ−ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰを、改変ＡｐｏＥエンハンサースペーサーのためのデスティネーションベクターとして使用した。親ベクターは、以下の構成要素を有する核酸分子を含む：第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ１、ＣＭＶプロモーター、βグロビンイントロン、ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド、βグロビンポリアデニル化部位（ｐＡ）、第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ２、原核生物性の複製起点、およびカナマイシン抗生物質選択遺伝子（ＫａｎＲ）。親ベクターはまた、第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ１の５’側にあるＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むクローニング部位；および第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ２の３’側にあるＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むクローニング部位も含む。その結果得られたベクターは、５’→３’方向に：ＣＳ−ＡＡＶ２ ＩＴＲ１−ＣＭＶ−βグロビンイントロン−ＧＦＰ−βグロビンｐＡ−ＡＡＶ２ ＩＴＲ２−ＣＳ−ｏｒｉＣ−ＫａｎＲのとおりに作動可能に連結された核酸構成要素を含んでいた。親ベクターを、第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ２の５’側で平滑末端を導入するためにＰｍｅＩを用いて消化した。ＡｐｏＥエンハンサーのＰＣＲ産物および消化された親ベクターを、１６℃で１時間、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲーションした。その結果得られた、第１のスペーサーの挿入を有する親ベクターを、配列検証し、続いて、第２のＡＡＶ２ ＩＴＲ２の３’側で平滑末端を導入するためにＳｗａＩを用いて消化した。ＡｐｏＥのＰＣＲ産物、および１つのスペーサーを有する親ベクターを、再度ライゲーションし、前に記載されたとおり配列検証した。その結果得られたベクターは、図１にpAAV-CMV-GFPとして示されており、５’→３’方向に作動可能に連結されている以下の核酸構成要素を含む：スペーサー１−ＡＡＶ２ ＩＴＲ１−ＣＭＶ−βグロビンイントロン−ＧＦＰ−βグロビンｐＡ−ＡＡＶ２ ＩＴＲ２−スペーサー２−ｏｒｉＣ−ＫａｎＲ。
コンピテントな大腸菌細胞に２つのスペーサーベクターを形質転換し、これを次に３７℃で終夜培養した。２つのスペーサーベクターをQiagen mini-prep kitによって精製し、配列検証した。精製したスペーサーベクター、および、対照として使用した親ベクターを、ＡＡＶヘルパーベクターおよびアデノウイルスヘルパーベクターとともにＨＥＫ２９３細胞にＣａＰＯ４トランスフェクションによって共トランスフェクションした。ＡＡＶヘルパーベクターは、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ８キャプシドタンパク質をコードする核酸分子を含む。その結果得られたＡＡＶ２／８スペーサーおよび非スペーサーウイルス粒子を、トランスフェクションの４８時間後に採取し、超遠心分離およびカラム濾過により精製した。
ヒト肝細胞HepG2細胞に、精製したＡＡＶ２／８スペーサーまたは非スペーサーウイルス粒子を形質導入し、続いて、形質導入された細胞からゲノムＤＮＡを単離するために溶解させた。精製したＤＮＡを、ＰＣＲによって、夾雑ｏｒｉＣおよびＫａｎＲ核酸について分析した。ＡＡＶ２／８スペーサーウイルス粒子を形質導入した細胞は、１％未満の夾雑ｏｒｉＣまたはＫａｎＲ核酸を含んでおり、一方、ＡＡＶ２／８非スペーサーウイルス粒子を形質導入した細胞は、３％の夾雑ｏｒｉＣまたはＫａｎＲ核酸を含んでいた。
他の態様
前述の発明は、理解を明確にする目的で実例および例によってある程度詳細に説明してきたが、説明および例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。本明細書に引用された全ての特許文献および科学文献の開示は、明示的にそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (22)

  1. 核酸分子を含むベクターであって、
    前記核酸分子は、
    （ｉ）第１のスペーサー（ＳＳ１）；
    （ｉｉ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ１）;
    （ｉｉｉ）異種ポリヌクレオチド分子（ＨＰＭ）;
    （ｉｖ）第２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ２）；および
    （ｖ）第２のスペーサー（ＳＳ２）を含んでなり、
    構成要素が５’→３’方向に：ＳＳ１−ＩＴＲ１−ＨＰＭ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに作動可能に連結されており、
    ＳＳ１が、長さ約２．０Ｋｂ〜約５．０Ｋｂであり、およびＳＳ２が、長さ約２．０Ｋｂ〜約５．０Ｋｂであり、
    ＳＳ１は、ＩＴＲ１に直接隣接してＩＴＲ１の外側にあり、およびＳＳ２は、ＩＴＲ２に直接隣接してＩＴＲ２の外側にあり、
    ＳＳ１およびＳＳ２は、原核生物起源の核酸を含まず、
    ＳＳ１は、長さが１００アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まず、およびＳＳ２は、長さが１００アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まず、
    ＳＳ１およびＳＳ２が、原核生物の転写因子結合部位を含まず、ならびに、
    ＳＳ１が、ＳＳ１の核酸配列全体の１％未満である総ＣｐＧ含有率を含んでなり、およびＳＳ２が、ＳＳ２の核酸配列全体の１％未満である総ＣｐＧ含有率を含んでなる、
    前記ベクター。
  2. 核酸分子を含むベクターであって、
    前記核酸分子は、
    （ｉ）第１のスペーサー（ＳＳ１）；
    （ｉｉ）第１の逆位末端反復配列（ＩＴＲ１）；
    （ｉｉｉ）クローニング部位（ＣＳ）；
    （ｉｖ）第２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ２）；および
    （ｖ）第２のスペーサー（ＳＳ２）を含んでなり、
    構成要素が５’→３’方向に：ＳＳ１−ＩＴＲ１−ＣＳ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに作動可能に連結されており、
    ＳＳ１が、長さ約２．０Ｋｂ〜約５．０Ｋｂであり、およびＳＳ２が、長さ約２．０Ｋｂ〜約５．０Ｋｂであり、
    ＳＳ１は、ＩＴＲ１に直接隣接してＩＴＲ１の外側にあり、およびＳＳ２は、ＩＴＲ２に直接隣接してＩＴＲ２の外側にあり、
    ＳＳ１およびＳＳ２は、原核生物起源の核酸を含まず、
    ＳＳ１は、長さが１００アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まず、およびＳＳ２は、長さが１００アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まず、
    ＳＳ１およびＳＳ２が、原核生物の転写因子結合部位を含まず、ならびに、
    ＳＳ１が、ＳＳ１の核酸配列全体の１％未満である総ＣｐＧ含有率を含んでなり、およびＳＳ２が、ＳＳ２の核酸配列全体の１％未満である総ＣｐＧ含有率を含んでなる、
    前記ベクター。
  3. 請求項１に記載のベクターであって、核酸分子が、
    （ｖｉ）真核生物プロモーター（ＰＥｕｋ）をさらに含んでなり、
    構成要素が５’→３’方向に：ＳＳ１−ＩＴＲ１−ＰＥｕｋ−ＨＰＭ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに作動可能に連結されている、
    前記ベクター。
  4. ＨＰＭが、阻害性ＲＮＡ分子をコードする、請求項３に記載のベクター。
  5. 阻害性ＲＮＡ分子が、小もしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小もしくは短干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムからなる群から選択される、請求項４に記載のベクター。
  6. 請求項３に記載のベクターであって、ＨＰＭが、ポリペプチドをコードしており、および核酸分子が、
    （ｖｉｉ）ポリアデニル化部位（ｐＡ）をさらに含んでなり、
    構成要素が５’→３’方向に：ＳＳ１−ＩＴＲ１−ＰＥｕｋ−ＨＰＭ−ｐＡ−ＩＴＲ２−ＳＳ２のとおりに互いに作動可能に連結されている、
    前記ベクター。
  7. ＳＳ１またはＳＳ２が、長さが５０アミノ酸未満であるオープンリーディングフレームを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
  8. ＳＳ１またはＳＳ２が、ＳＳ１またはＳＳ２の核酸配列全体の０．５％未満である総ＣｐＧ含有率を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
  9. ＳＳ１およびＳＳ２が、合わせて長さ約４．０Ｋｂ〜約１０．０Ｋｂである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクター。
  10. ＨＰＭと、ＳＳ１またはＳＳ２とが、合わせて長さ約５．０Ｋｂ〜約１０．０Ｋｂである、請求項１および３〜９のいずれか一項に記載のベクター。
  11. ＳＳ１、ＳＳ２およびＨＰＭが、合わせて長さ約１０．０Ｋｂ〜約１５．０Ｋｂである、請求項１および３〜９のいずれか一項に記載のベクター。
  12. ＩＴＲ１および／またはＩＴＲ２が、パルボウイルスＩＴＲである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のベクター。
  13. パルボウイルスＩＴＲが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のＩＴＲである、請求項１２に記載のベクター。
  14. ＡＡＶのＩＴＲが、ＡＡＶ血清型２型のＩＴＲである、請求項１３に記載のベクター。
  15. ＳＳ１の５’側および／またはＳＳ２の３’側に位置する選択可能マーカー遺伝子に対して作動可能に連結された原核生物プロモーターをさらに含んでなる、請求項１４に記載のベクター。
  16. 選択可能マーカー遺伝子が、抗生物質抵抗性遺伝子である、請求項１５に記載のベクター。
  17. ＳＳ１の５’側および／またはＳＳ２の３’側に位置する原核生物性の複製起点をさらに含んでなる、請求項１６に記載のベクター。
  18. 核酸分子が、環状である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のベクター。
  19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
  20. 複数のウイルス粒子を生産するための方法であって、培地中で請求項１〜１９のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
  21. 請求項２０に記載の方法であって、複数のウイルス粒子を培地から回収することをさらに含んでなる、前記方法。
  22. 複数のウイルス粒子が、ＡＡＶ粒子を含んでなる、請求項２０または２１に記載の方法。
JP2017559315A 2015-05-14 2016-05-13 スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法 Active JP6929230B2 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021130440A JP7316326B2 (ja) 2015-05-14 2021-08-10 スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法
JP2023115773A JP2023138527A (ja) 2015-05-14 2023-07-14 スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562161505P 2015-05-14 2015-05-14
US62/161,505 2015-05-14
PCT/US2016/032321 WO2016183422A1 (en) 2015-05-14 2016-05-13 Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021130440A Division JP7316326B2 (ja) 2015-05-14 2021-08-10 スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018515102A JP2018515102A (ja) 2018-06-14
JP2018515102A5 JP2018515102A5 (ja) 2019-06-13
JP6929230B2 true JP6929230B2 (ja) 2021-09-01

Family

ID=57249066

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017559315A Active JP6929230B2 (ja) 2015-05-14 2016-05-13 スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法
JP2021130440A Active JP7316326B2 (ja) 2015-05-14 2021-08-10 スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法
JP2023115773A Pending JP2023138527A (ja) 2015-05-14 2023-07-14 スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021130440A Active JP7316326B2 (ja) 2015-05-14 2021-08-10 スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法
JP2023115773A Pending JP2023138527A (ja) 2015-05-14 2023-07-14 スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11103597B2 (ja)
EP (1) EP3294309A4 (ja)
JP (3) JP6929230B2 (ja)
AU (2) AU2016260401B2 (ja)
CA (1) CA2983593A1 (ja)
WO (1) WO2016183422A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016338565B2 (en) 2015-10-14 2021-11-18 Audentes Therapeutics, Inc. Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
JP2021516953A (ja) * 2018-03-15 2021-07-15 インターガラクティック セラピューティクス インコーポレイテッド 合成ｄｎａベクターおよびその使用
TW202124722A (zh) 2019-09-18 2021-07-01 美商英特佳樂帝克醫療公司 合成dna載體及其使用方法
CN115197967B (zh) * 2021-04-08 2023-09-15 广州派真生物技术有限公司 制备重组腺相关病毒的辅助质粒及其应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
EP0950111A1 (en) * 1996-09-06 1999-10-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
US6346415B1 (en) * 1997-10-21 2002-02-12 Targeted Genetics Corporation Transcriptionally-activated AAV inverted terminal repeats (ITRS) for use with recombinant AAV vectors
AU3642601A (en) * 1999-11-05 2001-05-30 Avigen, Inc. Ecdysone-inducible adeno-associated virus expression vectors
US20020182595A1 (en) 2001-04-27 2002-12-05 Weitzman Matthew D. Method of identifying cellular regulators of adeno-associated virus (AAV)
AU2002305778A1 (en) 2001-05-31 2002-12-09 The Rockefeller University Method for generating replication defective viral vectors that are helper free
US7419817B2 (en) 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
US20040137626A1 (en) * 2002-09-26 2004-07-15 Greenville Hospital System AAV ITR-mediated modulation
WO2006036502A2 (en) * 2004-09-22 2006-04-06 St. Jude Children's Research Hospital Improved expression of factor ix in gene therapy vectors
WO2011088081A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors
US9249425B2 (en) * 2011-05-16 2016-02-02 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Proviral plasmids and production of recombinant adeno-associated virus
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
US9124527B2 (en) * 2012-08-29 2015-09-01 International Business Machines Corporation Sliced routing table management
AU2013336601B2 (en) 2012-10-26 2018-01-25 Vrije Universiteit Brussel Vector for liver-directed gene therapy of hemophilia and methods and use thereof
CA2904156C (en) 2013-03-15 2023-01-10 The Children's Hospital Of Philadelphia Vectors comprising stuffer/filler polynucleotide sequences and methods of use
WO2015013313A2 (en) * 2013-07-22 2015-01-29 The Children's Hospital Of Philadelphia Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues
EP3180022A4 (en) * 2014-08-13 2019-02-20 The Children's Hospital of Philadelphia IMPROVED EXPRESSION CASSETTE FOR THE PACKAGING AND EXPRESSION OF VARIANT FACTOR VIII FOR THE TREATMENT OF HEMOSTATIC DISEASES

Also Published As

Publication number Publication date
US11103597B2 (en) 2021-08-31
JP2023138527A (ja) 2023-10-02
EP3294309A4 (en) 2019-01-16
EP3294309A1 (en) 2018-03-21
AU2016260401B2 (en) 2022-05-19
US20180126006A1 (en) 2018-05-10
CA2983593A1 (en) 2016-11-17
WO2016183422A1 (en) 2016-11-17
JP2018515102A (ja) 2018-06-14
AU2016260401A1 (en) 2017-11-02
US20210369869A1 (en) 2021-12-02
AU2022215274A1 (en) 2022-09-01
JP7316326B2 (ja) 2023-07-27
JP2021184734A (ja) 2021-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7316326B2 (ja) スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法
CN109715650B (zh) 新颖腺相关病毒衣壳蛋白
KR102526711B1 (ko) 고효율 게놈 편집을 위한 아데노-관련 바이러스 벡터 변이체 및 이의 방법
US7037713B2 (en) High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
ES2235470T3 (es) Composiciones y metodos para la produccion libre de cooperadores de virus adnoasociados recombinantes.
JP2018535682A (ja) 臨床使用に適した無血清懸濁細胞培養システムにおいて組換えアデノ随伴ウイルス（ａａｖ）ベクターを産生するスケーラブルな方法
WO2018200419A1 (en) Viral vectors comprising engineered aav capsids and compositions containing the same
CN104520421A (zh) 用于生产腺伴随病毒的细胞系
WO2020086881A1 (en) Aav triple-plasmid system
WO2020218419A1 (ja) 脳に指向性を有するａａｖ変異体
US20220411819A1 (en) Nucleic acid molecules containing spacers and methods of use thereof
EP4100538A1 (en) Dna amplification method
US20020177222A1 (en) Replication competent AAV helper functions
WO2001049829A1 (en) Compositions and methods for efficient aav vector production
Smith et al. Transposase-mediated construction of an integrated adeno-associated virus type 5 helper plasmid
JP7227983B2 (ja) パルボウイルスベクターの産生
EP3943512A1 (en) Fusion protein for enhancing gene editing and use thereof
WO2024050547A2 (en) Compact bidirectional promoters for gene expression
CN114736928A (zh) 一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用
Patel Process Design for Scalable Recombinant Adeno-Associated Virus

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190513

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190513

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20200309

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200401

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200630

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201111

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210210

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210708

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210810

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6929230

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150