WO2020218419A1 - 脳に指向性を有するａａｖ変異体 - Google Patents

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WO2020218419A1
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amino acid
peptide
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敏和 西江
扶有子 高島
榎　竜嗣
峰野　純一
佳典 田中
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タカラバイオ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid encoding a variant of an adeno-associated virus (AAV) capsid protein having brain orientation, AAV particles containing the variant of the capsid protein, and a method for producing a gene-introduced cell using the particle.
  • AAV adeno-associated virus
  • AAV is a virus whose genome is a 4.7 kb single-strand DNA containing two open reading frame rep genes and cap genes.
  • the rep gene encodes four proteins required for genome replication (Rep78, Rep68, Rep52, and Rep40), and the cap gene is a three capsid proteins (VP1, VP2, VP3) that assemble for viral capsid formation. ) And Assembly-Activating Protein (AAP) are expressed.
  • the replication of AAV in nature depends on the presence of helper viruses such as adenovirus and herpesvirus. In the absence of helper viruses, AAVs either maintain their genome in episomes or become integrated into host chromosomes and become latent.
  • helper viruses such as adenovirus and herpesvirus.
  • AAVs either maintain their genome in episomes or become integrated into host chromosomes and become latent.
  • AAV serotypes and clades Non-Patent Document 1
  • AAV2 is being developed as a gene delivery vector.
  • AAV particles Long-term stable gene transfer into various target organs and target cells is possible by administration of AAV particles. To date, it has been shown to introduce genes into skeletal muscle, liver (hepatocytes), heart (myocardial cells), nerve cells, pancreatic gland cells, and islet cells with high efficiency. In addition, AAV has a track record of being used in human clinical trials. On the other hand, attempts have been made to modify the capsid protein of AAV to change the cell directivity of AAV and to avoid removal of AAV particles by neutralizing antibodies.
  • AAV capsids that are directional to specific organs or cells such as glial cells, airway epithelial cells, coronary vascular endothelial cells or lungs, and to tumor cells such as glioblastoma, melanoma, lung cancer or breast cancer.
  • AAV capsids having the above have been produced (Non-Patent Document 2).
  • An object of the present invention is to provide an AAV capsid protein mutant having a directivity to the brain and to provide a method for efficiently introducing a gene into the brain.
  • the present inventors have produced a target AAV particle containing an AAV capsid protein containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62, and the present invention.
  • a target AAV particle containing an AAV capsid protein containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62 and the present invention.
  • a nucleic acid encoding an adeno-associated virus (AAV) capsid protein variant containing a peptide containing the deleted, inserted and / or added amino acid sequence [2] The nucleic acid according to [1], wherein the AAV capsid protein is derived from AAV2.
  • AAV adeno-associated virus
  • Recombinant DNA containing the nucleic acid according to any one of [1] to [3].
  • a cell containing the nucleic acid according to any one of [1] to [3] or the recombinant DNA according to [4].
  • One or several amino acids are substituted in the peptide containing the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62, or in the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62.
  • AAV particles containing an AAV capsid protein variant containing a peptide containing a deleted, inserted and / or added amino acid sequence [7] The AAV particles according to [6], wherein the AAV capsid protein is derived from AAV2. [8] The AAV particle according to [7], wherein the peptide is contained at a position between amino acid number 588 and amino acid number 589 of VP1 of AAV2. [9] One or several amino acids are substituted in the peptide containing the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62, or in the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62.
  • a method for producing transgenic cells comprising contacting the cell with AAV particles comprising an AAV capsid protein variant containing a peptide containing a deleted, inserted and / or added amino acid sequence.
  • AAV capsid protein is derived from AAV2.
  • the peptide is contained at a position between amino acid number 588 and amino acid number 589 of VP1 of AAV2.
  • the present invention provides a gene transfer system useful for gene transfer into the brain.
  • the AAV particles of the present invention have high cell directivity to the brain and can strongly express the introduced gene.
  • Adeno-associated virus refers to a small virus belonging to the genus Parvoviridae, the genus Dependvirus, which infects primate animals including humans and other mammals.
  • Adeno-Associated Virus will be abbreviated as AAV.
  • AAV has an envelopeless icosahedron outer shell (capsid) and a single single-strand DNA inside it.
  • AAV includes wild-type viruses and derivatives thereof, and includes all serotypes and clades unless otherwise specified.
  • vector means a molecule or an aggregate of molecules that may contain or associate with a polynucleotide and be used to mediate the delivery of the polynucleotide to a cell.
  • examples include vector DNAs such as plasmid vectors and phage vectors, viral vector particles, liposomes, and other gene delivery vehicles, all of which are included in the vector unless otherwise noted.
  • the "capsid protein” is a protein encoded by the cap gene existing in the AAV genome, and means a protein constituting the capsid of AAV.
  • the wild-type AAV genome encodes three capsid proteins, with VP1, VP2 and VP3 present. In the present specification, all of VP1, VP2 and VP3 are included in the capsid protein.
  • the term "several" with respect to amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions means, for example, 2, 3, 4, 5, 6, depending on the length of the reference amino acid sequence. Refers to 7, 8, or 9.
  • nucleic Acid Encoding AAV Capsid Protein Variant The nucleic acid of the present invention is a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62, or from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62.
  • the nucleic acid of the present invention is a nucleic acid encoding an AAV capsid protein variant containing a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62.
  • the nucleic acid of the present invention is a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO:
  • One or several amino acids have been substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence selected from the group consisting of 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
  • It is a nucleic acid encoding an AAV capsid protein variant containing a peptide containing an amino acid sequence.
  • a peptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by the above-mentioned SEQ ID NO: is the above-mentioned sequence when the peptide is contained in the AAV capsid protein. It is a peptide that maintains the cell orientation of the AAV capsid protein variant containing a peptide containing the amino acid sequence indicated by the number. That is, the number of amino acids substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NO: is the AAV capsid protein variant in which the peptide containing the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NO: contains the peptide.
  • the cell orientation given to the protein for example, in the case of substitution, deletion and / or insertion, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, and more preferably 1, 2 or 3.
  • the peptide contained in the AAV capsid protein variant is at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, or at least the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62. It may be a peptide containing 90% of the same amino acid sequence.
  • a peptide containing an amino acid sequence that is at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, or at least 90% identical to the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NO: is when the peptide is contained in the AAV capsid protein.
  • the cell orientation of the AAV capsid protein variant containing the peptide containing the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NO: is maintained.
  • the peptide contained in the AAV capsid protein variant is Formula I: X 1 X 2 GX 3 GWV; Formula II: X 4 X 5 X 6 X 7 GWV; Formula III: X 8 X 9 GX 10 X 11 WV; Formula IV: X 12 X 13 GX 14 GX 15 V; Formula V: X 16 X 17 GX 18 GWX 19 ; or formula VI: X 20 X 21 GX 22 REX 23 [In the formula, X 1 to X 23 are any amino acid residues, G represents glycine, W represents tryptophan, V represents valine, R represents arginine, and E represents glutamic acid.
  • X 1 is E (glutamic acid), G (glycine) or T (threonine) and X 2 is R (arginine), T (threonine), S (serine), N (asparagine), E (glutamic acid) or D (aspartic acid), and X 3 is V (valine), H (histidine), R, M (methionine) or L (leucine).
  • X 4 is A (alanine) or E
  • X 5 is D, G or A
  • X 6 is K (lysine)
  • Q glutamine
  • X 7 is V or L
  • X 8 is A, E or G
  • X 9 is S, D, G or R
  • X 10 is T, M, It is D or V
  • X 11 is R, V, S or T.
  • X 12 is D, E, G or R
  • X 13 is A, G, D or V
  • X 14 is I, It is H, D, F (phenylalanine), G or L
  • X 15 is Y (tyrosine), F, R, G or V.
  • X 16 is A, E or G
  • X 17 is G, R or S
  • X 18 is V, H or D.
  • X 19 are T, G, K, I (isoleucine) or A.
  • X 20 is E or A
  • X 21 is Y or H
  • X 22 is F or Y
  • X 23 is G or. It is P (proline).
  • peptides comprising the amino acid sequence represented by Formula I include, but are not limited to, an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 18, 20, 21, 22, 46, 55, 59 and 60.
  • Peptides containing the sequence are included.
  • the peptide containing the amino acid sequence represented by the formula II is not limited to, but is not limited to, a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 25, 29 and 32, or peptides of SEQ ID NOs: 25, 29 and 32.
  • Peptides comprising an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids have been substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence selected from the group consisting of are included.
  • the peptide containing the amino acid sequence represented by the formula III is, but is not limited to, a peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15, 24, 38, 48 and 54, or SEQ ID NO: 15.
  • Peptides comprising an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids have been substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence selected from the group are, but is not limited to, a peptide or sequence containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19, 31, 35, 44, 56 and 58.
  • Peptides comprising an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids have been substituted, deleted, inserted and / or added in an amino acid sequence selected from the group consisting of numbers 19, 31, 35, 44, 56 and 58 are included. ..
  • the peptide containing the amino acid sequence represented by the formula V is not limited to the peptide containing the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 26, 39, 42, 43, 47 and 50, or the sequence.
  • Peptides comprising an amino acid sequence in which 1 to 4 amino acids have been substituted, deleted, inserted and / or added in an amino acid sequence selected from the group consisting of numbers 26, 39, 42, 43, 47 and 50 are included. ..
  • the peptide containing the amino acid sequence represented by the formula VI is not limited to the peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or 17, or 1 to 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 or 17. Peptides containing amino acid sequences in which four amino acids have been substituted, deleted, inserted and / or added are included.
  • the AAV capsid protein variants encoded by the nucleic acids of the invention are type 1 AAV (AAV1), type 2 AAV (AAV2), type 3 AAV (AAV3A, AAV3B, etc.), type 4 AAV (AAV4), type 5 AAV (AAV5).
  • AAV6 6-inch AAV
  • AAV7 7-inch AAV
  • AAV8 8-inch AAV
  • AAV9 9-inch AAV
  • 10-inch AAV AAV
  • AAV10 11-inch AAV (AAV11)
  • tri-AAV bovine AAV
  • Insert the peptide into any wild-type AAV capsid protein such as canine AAV, horse AAV, sheep AAV, or replace part of the amino acid sequence of the AAV capsid protein with the peptide (ie, replace the peptide with the AAV capsid protein).
  • the capsid protein of AAV2 can be used particularly preferably.
  • the AAV capsid protein variant encoded by the nucleic acid of the invention is substituted, deleted, inserted and / or added with one or more amino acids in addition to the above peptide retained in the wild-type AAV capsid protein. It may be a protein.
  • the "protein in which one to several or more amino acids have been substituted, deleted, inserted and / or added in addition to retaining the peptide" is conferred by the properties of the original protein, eg, the peptide.
  • AAV capsid protein A protein that maintains cell orientation, capsid forming ability, capsid protein function (for example, protection of viral genome, unshelling after host cell invasion, etc.).
  • a spacer sequence may be added to the N-terminal and / or C-terminal of the peptide contained in the AAV capsid protein in the present invention.
  • the spacer sequence is preferably 1 to 5 amino acid residues.
  • the amino acid in the spacer sequence is not particularly limited, but for example, an amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine and serine can be used.
  • any of AAV's VP1, VP2 and VP3 can be used.
  • the peptide may be contained only in VP1, only VP2 or only VP3, and all capsid proteins of VP1 to VP3 may contain the peptide.
  • it may be contained in two kinds of capsid proteins such as a combination of VP1 and VP2, VP2 and VP3, VP1 and VP3.
  • VP1 to VP3 are encoded in the cap gene region of the AAV genome.
  • a peptide can be contained in a region common to VP1 to VP3 to introduce a mutation into all of VP1 to VP3.
  • a gene encoding VP1, VP2 or VP3 can be prepared separately from the cap gene region of AAV, and a mutation can be introduced into this gene.
  • treatment may be performed so that the wild-type capsid protein corresponding to the capsid protein encoded by the gene into which the mutation is introduced is not expressed from the cap gene region of AAV.
  • the position where the peptide is contained in the AAV capsid protein variant encoded by the nucleic acid of the present invention is preferably the position between amino acid number 588 and amino acid number 589.
  • Amino acid number 588 of VP1 of AAV2 is arginine
  • amino acid number 589 of VP1 of AAV2 is glutamine.
  • the amino acid number 588 of AAV2 VP1 corresponds to the amino acid number 451 of VP2 of AAV2 and the amino acid number 386 of VP3 of AAV2.
  • a capsid protein derived from a serum type other than AAV2 or AAV of a clade is used as the AAV capsid protein, it is preferably between the amino acids corresponding to amino acids 588 and 589 of VP1 of AAV2 in the AAV capsid protein. Incorporate the peptide at the position.
  • amino acids of AAV capsid proteins of serotypes other than AAV2 or clades that correspond to amino acids number 588 of VP1 of AAV2.
  • Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 99, No. 18, pp. 11854-1859, 2002 Aligning the amino acid sequence of VP1.
  • the amino acid number 588 of VP1 of AAV2 is 589 for AAV1, 590 for AAV7, and 591 for AAV8.
  • the nucleic acid of the present invention may be operably linked to an appropriate control sequence.
  • Control sequences include promoter sequences, polyadenylation signals, transcription termination sequences, upstream regulatory domains, origins of replication, internal ribosome entry sites (IRES), enhancers and the like.
  • the promoter sequence includes an inducible promoter sequence and a constitutive promoter sequence.
  • the control sequence may be specific to the AAV from which the capsid protein is derived, or may be exogenous, and may be a natural sequence or a synthetic sequence. Recombinant DNA capable of expressing such an AAV capsid protein variant is also included in the present invention.
  • the recombinant DNA of the present invention is useful for delivering the nucleic acid of the present invention to cells in vitro, in vitro and in vivo, and imparting the ability to express the AAV capsid protein mutant to the cells.
  • the cells to which the nucleic acids of the invention have been delivered are then useful for producing AAV particles.
  • the recombinant DNA can be used, in particular, to deliver or introduce the nucleic acids of the invention into animal cells, more preferably mammalian cells.
  • the recombinant DNA of the present invention can be prepared by retaining the nucleic acid of the present invention in the DNA used as a vector.
  • plasmid DNA, phage DNA, transposon, cosmid DNA, episomal DNA, viral genome can be used.
  • the present invention also provides a host cell containing the nucleic acid of the present invention, specifically, the recombinant DNA of the above (1), for example, an isolated host cell.
  • the isolated cells are, for example, cell lines maintained in vitro.
  • the host cell of the present invention is useful for producing the AAV particles of the present invention as described below.
  • the host cells of the invention When used to produce AAV particles, they may be referred to as "packaging cells" or "producer cells.”
  • the recombinant DNA of the present invention described in (1) above may be integrated into the genome, and the recombinant DNA is intracellularly expressed so as to transiently express the AAV capsid protein mutant. It may be held in.
  • Introduction of the recombinant DNA of the present invention into a host cell can be carried out by a known method. For example, electroporation, calcium phosphate precipitation, direct microinjection into cells, liposome-mediated gene transfer, nucleic acid delivery using a high-speed microparticle gun, and the like can be used.
  • electroporation calcium phosphate precipitation
  • direct microinjection into cells liposome-mediated gene transfer
  • nucleic acid delivery using a high-speed microparticle gun and the like
  • an infection method suitable for the vector may be selected.
  • the recombinant DNA of the present invention is stably introduced into the chromosome of the host cell or transiently into the cytoplasm of the host cell.
  • neomycin resistance gene encoding neomycin phosphotransferase
  • hygromycin B resistance gene encoding aminoglycoside phosphotransferase (APH)
  • APH aminoglycoside phosphotransferase
  • Suitable mammalian cells include, but are not limited to, primary cells and cell lines, and suitable cell lines include 293 cells, COS cells, HeLa cells, Vero cells, 3T3 mouse fibroblasts, C3H10T1 / 2. Examples include fibroblasts, CHO cells and cells derived from these cells.
  • AAV particles containing an AAV capsid protein containing an amino acid sequence encoded by the nucleic acid of the present invention are AAV capsid protein variants containing the peptide described in (1) above.
  • the AAV particles of the present invention can be produced by the host cell described in (2) above.
  • the AAV particles of the present invention have directivity in the brain and are useful for gene transfer into the brain.
  • the brain contains nerve cells and brain cells such as glial cells (microglia, oligodendrocytes, astrocytes).
  • the gene introduced by the AAV particles of the present invention is strongly expressed in the tissues, organs and cells.
  • AAV particles can be produced by using cells containing some components necessary for producing AAV particles as packaging cells.
  • the first component is a vector genome (also called an expression vector) of recombinant AAV that can be replicated and packaged into AAV particles in the host cell.
  • the vector genome of recombinant AAV has the desired heterologous polynucleotide and the AAV inverse terminal repeat (ITR) sequences on either side of it, i.e. on the 5'and 3'sides, respectively.
  • the desired heterologous polynucleotide may have a regulatory sequence for its expression.
  • the nucleotide sequence of the ITR sequence is known. For example, for the ITR sequence of AAV2, Kotlin R. et al.
  • ITR sequence an ITR sequence derived from any of various AAV serotypes such as AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 can be used.
  • the ITR sequence used in the present invention may be a sequence derived from wild-type AAV, or may be modified by insertion, deletion or substitution of nucleotides.
  • the ITR sequence allows replication of the vector genome of recombinant AAV in the presence of Rep protein and allows integration into capsid particles during AAV particle formation.
  • the desired heterologous polynucleotides that can be loaded into the AAV particles of the invention are generally less than about 5 kilobases (kb) in size, eg, genes encoding desired proteins that are missing or lost in the recipient, desired.
  • Genes encoding proteins with biological or therapeutic effects eg, antibacterial, antiviral or antitumor effects
  • desired nucleotide sequences encoding RNAs that inhibit or reduce the production of harmful or unwanted proteins antigens
  • the nucleotide sequence encoding the sex protein can be appropriately set according to the purpose.
  • the vector genome of the recombinant AAV lacks the cap gene region and / or the rep gene region, and the AAV particles in which the vector genome of the recombinant AAV of this embodiment is packaged are infected cells. It is not replicated to AAV particles by itself within.
  • the second component required for the production of AAV particles is a construct that provides a protein encoded by wild-type AAV.
  • This construct encodes an AAV-derived gene that provides the AAV gene product required for the formation of AAV particles. That is, it contains one or both of the rep gene region and the cap gene region coding region, which are the major AAV ORFs.
  • the cap gene is a nucleic acid encoding an AAV capsid protein variant containing a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of at least SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 62 in the sequence listing. Used as.
  • the host cell of the present invention described in (2) above which has the ability to express this mutant, can be used for producing AAV particles.
  • AAV particles have an outer shell composed of a large number of capsid proteins, but all capsid proteins may be mutants, some of which may be mutants and the rest of which may be wild-type capsid proteins. Further, the capsid protein mutant contained in the AAV particles of the present invention may be one kind of mutant or a plurality of kinds of mutants.
  • the AAV rep gene is contained in the rep gene coding region and contains genes encoding the replication proteins Rep 78, Rep 68, Rep 52 and Rep 40. These Rep expression products have been shown to have many functions, including recognition, binding and nicking of AAV genomic DNA replication origins, DNA helicase activity and transcriptional alterations of AAV-derived promoters.
  • helper virus function also called an accessory function
  • Adenovirus is generally used to introduce the helper function, but viruses such as type 1 or type 2 herpes simplex virus and vaccinia virus can also be used.
  • viruses such as type 1 or type 2 herpes simplex virus and vaccinia virus can also be used.
  • the host cell is infected with the virus as a helper virus.
  • adenoviruses that do not exhibit late gene expression may be used because only the expression of the early gene of the adenovirus is required for packaging the AAV particles.
  • Adenovirus variants lacking late gene expression eg, ts100K or ts149 adenovirus variants) can be used.
  • nucleic acid required for helper virus function isolated from helper virus can be used to prepare a nucleic acid construct that provides helper virus function and be introduced into a host cell.
  • Constructs that provide helper virus function contain a nucleotide sequence that provides one or more helper virus functions and are provided to the host cell in the form of plasmids, phages, transposons, cosmids or other viruses.
  • the host is (a) a step of introducing the vector genome of recombinant AAV, which is the first component, into a host cell, and (b) a structure that provides the AAV helper function, which is the second component.
  • the step of introducing into the cell and (c) the step of introducing the helper virus function, which is the third component, into the host cell are carried out. These steps may be carried out simultaneously or in sequence.
  • the order of the steps (a) to (c) may be any order.
  • the expressed capsid protein forms a capsid, and the vector genome of the recombinant AAV is packaged in the capsid to produce AAV particles.
  • the outer shell of the produced AAV particles contains the AAV capsid protein variant.
  • AAV particles can be isolated and purified from the culture supernatant of a host cell or its cell lysate by using various purification methods such as CsCl density gradient centrifugation.
  • a virus is used in step (c)
  • a step of separating AAV particles and helper virus based on size may be added.
  • AAV particles can also be isolated from helper viruses based on the difference in affinity for heparin.
  • the remaining helper virus can be inactivated using known methods.
  • adenovirus can be inactivated by heating at a temperature of about 60 ° C. for, for example, 20 minutes or more. Since AAV particles are extremely heat stable, this procedure is effective in the selective removal of adenovirus used as a helper virus.
  • AAV particle of the present invention obtained by the above (3) is used for delivery of a desired heterologous polynucleotide to a cell for gene therapy or other purposes. ..
  • AAV particles are introduced into cells either in vivo or in vitro. When introduced in vitro, it is introduced by bringing AAV particles into contact with cells obtained from a living body. These cells can also be transplanted into a living body. When the cells are introduced into a living body, they can be formulated as a pharmaceutical composition and various techniques such as intramuscular, intravenous, subcutaneous and intraperitoneal administration can be used.
  • AAV particles are formulated as a pharmaceutical composition and generally administered parenterally (eg, by route of administration such as intramuscular, subcutaneous, intratumoral, transdermal, intrathecal).
  • the pharmaceutical composition containing the AAV particles may contain a carrier that is acceptable as a drug and, if necessary, other drugs, pharmaceuticals, stabilizers, buffers, carriers, adjuvants, diluents and the like.
  • Example 1 Preparation of AAV2 random peptide plasmid library
  • a plasmid vector pAV1 (ATCC Number: 37215) carrying the AAV2 genome was extracted from Escherichia coli HB101 of a general-purpose host (Distribution host).
  • Genomic DNA (about 4.7 kb) of AAV2 was excised from the extracted plasmid by the restriction enzyme BglII (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • This genomic DNA was inserted into pUC118 BamHI / BAP (manufactured by Takara Bio Inc.), and the obtained plasmid DNA was designated as AAV2WG / pUC118.
  • AAV2WG / pUC118 was treated with the restriction enzyme ScaI (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain a fragment of about 0.8 kb containing the 1190 to 2017 bases of the cap gene. This fragment was inserted into pUC118 HincII / BAP (manufactured by Takara Bio Inc.), and the obtained plasmid DNA was designated as Cap-ScaI / pUC118.
  • the 1759th to 1761st nucleotide sequences AAC (587N) of the Cap gene of Cap-ScaI / pUC118 were converted to CAG (587Q) using the PCR method, and GGC as a spacer between the 1764th and 1765th nucleotides.
  • CAAG as a stuffer, and 10 bases of GCC as a spacer are inserted, and the bases CAA (589Q) GCA (590A) GCT (591A) of the 1765th to 1773th bases are converted to CAG (589Q) GCG (590A) GCC (591A).
  • the letters in parentheses indicate the amino acid number and the amino acid encoding).
  • spacers, stuffers, and spacers sandwiched between two recognition sites for the restriction enzyme SfiI and the SfiI recognition sites were inserted.
  • the base sequences before and after the conversion of the 1756th to 1773th cap genes are shown in FIG.
  • Cap-ScaI-S4 / pUC118 The plasmid DNA after converting the base sequence was designated as Cap-ScaI-S4 / pUC118.
  • the Cap gene portion of Cap-ScaI-S4 / pUC118 was amplified by PCR for In-Fusion Cloning to obtain a fragment of about 0.8 kb, which was used as insert DNA.
  • a sequence not recognized by these restriction enzymes by introducing a mutation into the base sequence of the restriction enzyme ScaI recognition site in the ampicillin resistance gene of AAV2WG / pUC118 and the restriction enzyme SfiI recognition site in the Rep gene by the PCR method. Modified to.
  • the ScaI recognition site the nucleotide sequence GAG (E) at positions 304 to 306 of the ampicillin resistance gene was converted to GAA (E).
  • the base sequence before conversion is shown in SEQ ID NO: 3
  • the base sequence after conversion is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the recognition site of SfiI the nucleotide sequence GCC (A) at positions 217 to 219 of the Rep gene was converted to GCA (A).
  • the base sequence before conversion is shown in SEQ ID NO: 5, and the base sequence after conversion is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the plasmid DNA thus obtained was treated with ScaI (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain a linear vector lacking about 0.8 kb, which is a part of the Cap gene. This was used as a linear vector for In-Fusion Cloning.
  • insert DNA was inserted into the above linear vector using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (manufactured by Cloning) and Cloning Enhancer (manufactured by Cloning), and directional cloning was performed.
  • the plasmid DNA thus obtained was designated as AAV2WG-Cap-ScaI-S4 / pUC118Sx.
  • OligoDNA (SEQ ID NO: 7) containing a nucleotide sequence encoding a 7-amino acid random peptide was prepared by artificial synthesis, and using a primer (SEQ ID NO: 8) and Klenow Fragment (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.) for 3 hours at 37 ° C.
  • Double-stranded DNA was prepared from oligo DNA by reaction.
  • Double-stranded DNA purified using Nucleotide remote kit (manufactured by Qiagen) was digested with the restriction enzyme BglI (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the plasmid inserted into AAV2WG-Cap-ScaI-S4 / pUC118Sx obtained by digesting this DNA with SfiI using a DNA ligation kit ⁇ Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio Inc.) was designated as AAV2WG-RPL / pUC118Sx, and an AAV2 random peptide plasmid library. Used as.
  • Example 2 Preparation of AAV2 Random Peptide Virus Library (1) Seeding of AAV293 cells After recovering cultured AAV293 cells (manufactured by Stratage), 5 with DMEM (manufactured by Sigma) containing 10% FBS and 2 mM sodium L-glutamate. Suspended to x10 4 cells / mL. 40 mL of a solution containing AAV293 cells was added to a T225 cm 2 flask (manufactured by Corning Inc.) for cell culture, and the cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 72 hours.
  • DMEM manufactured by Sigma
  • Example 2 (2) Transfection of plasmid into AAV293 cells AAV2WG-RPL / pUC118Sx 400 ng and pHELP (manufactured by cellbiolabs) obtained in Example 1 were transfected into AAV293 cells by 40 ⁇ g each using a general calcium phosphate method. Six hours after transfection, the medium was completely removed, 40 mL of DMEM containing 2% FBS and 2 mM sodium L-glutamate was added, and the cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 48 hours.
  • DMEM containing 2% FBS and 2 mM sodium L-glutamate
  • AAV2 Random Peptide Virus Library 0.5 mL of 0.5 M EDTA was added to 2 flasks of T225 cm in culture and allowed to stand for several minutes. Then, AAV293 cells were exfoliated by pipetting, collected in a 50 mL tube, centrifuged at 300 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was removed. After resuspending the cells in 2 mL of TBS (Tris buffered saline) per flask, a series of treatments of ethanol / dry ice for 15 minutes, a water bath at 37 ° C for 15 minutes, and vortex for 1 minute were repeated 3 times. , AAV-Random peptide virus library containing cell lysate was collected.
  • TBS Tris buffered saline
  • Example 3 Purification of AAV2 random peptide virus library (1) Purification by cesium chloride density gradient centrifugation 1 In a 40 PA tube for ultracentrifugation (manufactured by Hitachi-KOKI), 4 mL of a cesium chloride solution prepared to have a specific gravity of 1.5 from the bottom, 4 mL of a cesium chloride solution prepared to have a specific gravity of 1.25, and Examples 2- (4) The AAV vector solution prepared in (1) was layered in the order of 28 mL, and centrifuged in an ultracentrifuge HIMAC (manufactured by HIMACHI-KOKI) at 25,000 rpm at 16 ° C. for 3 hours.
  • HIMAC manufactured by HIMACHI-KOKI
  • Example 3- (2) Desalination by dialysis Several fractions having high titers in Example 3- (2) were mixed and added to a Slide-A-lyzer dialysis cassette (manufactured by Pierce).
  • the purified AAV solution was desalted by performing dialysis twice at 4 ° C. for 3 hours with 1 L of phosphate buffered saline (PBS) and overnight dialysis at 4 ° C. with 500 mL of PBS / 5% sorbitol solution. Then, the solution was recovered, sterilized with a 0.22 ⁇ m filter (manufactured by Millipore), and stored at ⁇ 80 ° C. until use.
  • the titer of the purified AAV particles was quantified by the same method as in Example 2- (4).
  • Example 4 Screening of AAV2 Random Peptide Library (1) Tail Vein Administration to Mice
  • the purified AAV particles obtained in Example 3- (3) are 1.5 ⁇ 10 14 virus genome (VG) / kg. As a result, it was administered from the tail vein of BALB / c mice.
  • the brain was collected 72 hours after administration, and genomic DNA was extracted using NucleoSpin (registered trademark) tissue (manufactured by Machray Nagel) (Round 1).
  • PCR was carried out for 30 cycles with 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 15 seconds as one cycle.
  • DNA was purified from this reaction solution using Nucleospin extract II (manufactured by Machray Nagel) and cleaved with the restriction enzyme BglI. After electrophoresis, it was purified using Nucleospin extract II and recloned into AAV2WG-Cap-ScaI-S4 / pUC118Sx prepared in Example 1 using a DNA ligation kit ⁇ Mighty Mix>.
  • Random Peptide Sequencing Sequencing of the AAV random peptide plasmid library at each screening stage (rounds 1 to 3) was performed.
  • Tables 1 and 2 show the peptide sequences encoded by the clones accumulated in the brain in Rounds 2 and 3 and the number of occurrences.
  • GSGVTWV SEQ ID NO: 15
  • AHGYREP SEQ ID NO: 16
  • EYGFREG SEQ ID NO: 17
  • ETGHGWV SEQ ID NO: 18
  • SEQ ID NOs: 63 to 110 which are sequences containing the sequence confirmed in Round 2 and spacers, are sequences that easily infect the brain.
  • GGSGVTWVA SEQ ID NO: 63
  • GAHGYREPA SEQ ID NO: 64
  • GEYGFREGA SEQ ID NO: 65
  • GETGHGWVA SEQ ID NO: 66
  • Example 5 Directional evaluation of AAV vector having acquired peptide sequence
  • the vector fragment thus obtained was ligated using a DNA ligation kit ⁇ Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.), and helper plasmids pRC-GSGVTWV, pRC-AHGYREP, pRC-EYGFREG, pRC-ETGHGWV, pRC-GGGIGYV, And pRC-ERGVGWV were obtained.
  • AAV2-LacZ capsid mutant pAAV-LacZ (manufactured by Takara Bio Inc.), pHELP and pRC helper plasmids (pRC-GSGVTWV, pRC-AHGYREP, pRC-EYGFREG) prepared in Example 5- (1).
  • PRC-ETGHGWV, pRC-GGGIGYV, or pRC-ERGVGGWV was transfected into 293T cells seeded in a T225 cm 2 flask using PEIpro (manufactured by plasmid).
  • a pRC2 vector carrying a wild-type capsid was transfected instead of the pRC helper plasmid having a peptide sequence and used as a control.
  • Transfected 293T cells were cultured in a 37 ° C. CO 2 incubator for 72 hours.
  • the supernatant containing AAV was collected from a T225 cm 2 flask, and AAV was affinity purified using AVB Sepharose (manufactured by GE Healthcare Japan).
  • AAV purification solution was prepared by concentrating and purifying AAV by ultrafiltration.
  • the titer of the AAV vector was quantified by the method shown in Example 2- (4).
  • an AAV capsid protein mutant having a directivity to the brain or an amino acid sequence is provided by systemic administration, and a method for efficiently introducing a gene into the brain is provided.
  • SEQ ID NO: 1 AAV2 capsid 586-591 coding sequence
  • SEQ ID NO: 2 Converted AAV2 capsid coding sequence
  • SEQ ID NO: 3 Ampicillin resistance gene before conversion
  • SEQ ID NO: 4 Ampicillin resistance gene after conversion
  • SEQ ID NO: 5 AAV2 rep gene before conversion
  • SEQ ID NO: 6 AAV2 rep gene after conversion
  • SEQ ID NO: 7 DNA sequence coding random peptide
  • SEQ ID NO: 8 Primer for synthesizing double strand DNA
  • SEQ ID NO: 10 Reverse primer for quantitation of AAV titer
  • SEQ ID NO: 11 Forward primer1 for amplification of random peptide coding region
  • SEQ ID NO: 12 Reverse primer1 for amplification of random peptide coding region
  • SEQ ID NO: 13 Forward primer2 for amplification of random peptide coding region
  • SEQ ID NO: 14

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Abstract

本発明は、配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質変異体をコードする核酸、該核酸を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する細胞、及び該細胞の製造方法を提供する。

Description

脳に指向性を有するＡＡＶ変異体
　本発明は脳に指向性を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質の変異体をコードする核酸、当該キャプシドタンパク質の変異体を含むＡＡＶ粒子及び当該粒子を使用する遺伝子導入細胞の製造方法に関する。
　ＡＡＶは、ふたつのオープンリーディングフレームｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を含む４．７ｋｂの１本鎖ＤＮＡをゲノムとするウイルスである。ｒｅｐ遺伝子は、ゲノム複製に必要な４種のタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）をコードし、ｃａｐ遺伝子は、ウイルスキャプシド形成のために集成する３種のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）及びＡｓｓｅｍｂｌｙ－Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＡＡＰ）を発現する。自然界でのＡＡＶの複製はアデノウイルス、ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在に左右される。ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶは、そのゲノムがエピソームに維持されるか、又は宿主染色体に組込まれ潜伏状態となる。現在、１００を超えるＡＡＶ血清型及びクレード（非特許文献１）が同定されているが、特にＡＡＶ２が遺伝子送達ベクターとして開発が進められている。
　１９８９年にＡＡＶ２を基に遺伝子送達ベクターシステムが初めて開発されている。ＡＡＶを基にしたベクターは、多くの利点を有することが示されている。野生型ＡＡＶは非病原性であり、いずれの既知の疾患とも病原学的関係を有さないので、ＡＡＶを基にしたベクターは極めて安全だと言われている。加えてＡＡＶは、効率の高い遺伝子導入能を有する。
　ＡＡＶ粒子の投与でさまざまな標的臓器、標的細胞に長期的に安定した遺伝子導入が可能である。現在までに、骨格筋、肝臓（肝細胞）、心臓（心筋細胞）、神経細胞、膵腺細胞、膵島細胞に高い効率で遺伝子を導入することが示されている。更にＡＡＶは、ヒト臨床試験において使用された実績を有する。一方で、ＡＡＶのキャプシドタンパク質を改変してＡＡＶの細胞指向性を変化させる試みや、中和抗体によるＡＡＶ粒子の除去を回避する試みが行われている。例えば、神経膠細胞、気道上皮細胞、冠動脈血管内皮細胞又は肺などの特定の臓器や細胞に指向性を有するＡＡＶキャプシドの作製や、膠芽腫、メラノーマ、肺がん又は乳がんなどの腫瘍細胞に指向性を有するＡＡＶキャプシドの作製が行われてきた（非特許文献２）。
Ｇａｏ他、ジャーナル　オブ　ウイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第７８巻、６３８１－６３８８頁、２００４年 Ａｄａｃｈｉ　Ｋ他、ジーン　セラピー　アンド　レギュレーション（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．Ｒｅｇｕｌ．）、第５巻、３１－５５頁、２０１０年
　本発明の目的は、脳に指向性を有するＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を提供し、脳に効率的に遺伝子を導入する方法を提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質を含む目的のＡＡＶ粒子を作製し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明を概説すれば、
［１］配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質変異体をコードする核酸、
［２］ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である［１］記載の核酸、
［３］ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番とアミノ酸番号５８９番との間の位置に前記ペプチドを含有させた［２］記載の核酸、
［４］［１］～［３］のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えＤＮＡ、
［５］［１］～［３］のいずれか１項に記載の核酸又は［４］記載の組換えＤＮＡを含む細胞、
［６］配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子、
［７］ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である［６］記載のＡＡＶ粒子、
［８］ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番とアミノ酸番号５８９番との間の位置に前記ペプチドを含有させた［７］記載のＡＡＶ粒子、
［９］配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子を細胞に接触させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法、
［１０］ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である［９］記載の方法、
［１１］ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番とアミノ酸番号５８９番との間の位置に前記ペプチドを含有させた［１０］記載の方法、に関する。
　本発明により、脳への遺伝子導入に有用な遺伝子導入システムが提供される。本発明のＡＡＶ粒子は脳に対し高い細胞指向性を有し、導入した遺伝子を強く発現させることができる。
キャプシドタンパク質にランダムペプチドを含有させる核酸構築物の作製方法を示す図である。 本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質変異体の指向性評価の結果を示す。
　本明細書において「アデノ随伴ウイルス」は、パルボウイルス科、ディペンドウイルス属に属する、ヒトを含む霊長目の動物やその他の哺乳類に感染する小型のウイルスを示す。以下、Ａｄｅｎｏ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｖｉｒｕｓを省略してＡＡＶと記載する。ＡＡＶはエンベロープを持たない正２０面体の外殻（キャプシド）とその内部に１本の１本鎖ＤＮＡを有する。本明細書において、ＡＡＶは野生型ウイルス及びその派生物を含み、特に記載する場合を除き全ての血清型及びクレードを含む。
　本明細書において「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含む又はポリヌクレオチドに会合して、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用することができる分子又は分子の会合体を意味する。例えば、プラスミドベクターやファージベクターなどのベクターＤＮＡ、ウイルスベクター粒子、リポソーム、及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられ、これらは特に記載する場合を除き全てベクターに含まれる。
　本明細書において「キャプシドタンパク質」は、ＡＡＶのゲノムに存在するｃａｐ遺伝子にコードされるタンパク質で、ＡＡＶのキャプシドを構成するタンパク質を意味する。野生型ＡＡＶゲノムは３種類のキャプシドタンパク質をコードし、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３が存在する。本明細書においては、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のいずれもがキャプシドタンパク質に含まれる。
　本明細書において、アミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加に関して「数個」とは、基準となるアミノ酸配列の長さにもよるが、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個をいう。
（１）ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸
　本発明の核酸は、配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸である。好適には、本発明の核酸は、配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸である。さらに好適には、本発明の核酸は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸である。上記配列番号で示されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドは、該ペプチドをＡＡＶキャプシドタンパク質に含有させた場合に、上記配列番号で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体の細胞指向性が維持されるペプチドである。すなわち、上記配列番号で示されるアミノ酸配列において置換、欠失、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は、上記配列番号で示されるアミノ酸配列を含むペプチドが該ペプチドを含有するＡＡＶキャプシドタンパク質変異体に与える細胞指向性が維持されるかぎり限定されず、例えば、置換、欠失および／または挿入の場合、例えば１～５個、好ましくは１～４個、さらに好ましくは１、２または３個であり、付加の場合、例えば１～９個、好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～７個、さらに好ましくは１～６個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１、２、３または４個であってもよい。
　例えば、前記のＡＡＶキャプシドタンパク質変異体に含有させるペプチドは、配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。上記配列番号で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むペプチドは、該ペプチドをＡＡＶキャプシドタンパク質に含有させた場合に、上記配列番号で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体の細胞指向性が維持される。
　例えば、前記のＡＡＶキャプシドタンパク質変異体に含有させるペプチドは、
式Ｉ：　　　Ｘ１Ｘ２ＧＸ３ＧＷＶ；
式ＩＩ：　　Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＷＶ；
式ＩＩＩ：　Ｘ８Ｘ９ＧＸ１０Ｘ１１ＷＶ；
式ＩＶ：　　Ｘ１２Ｘ１３ＧＸ１４ＧＸ１５Ｖ；
式Ｖ：　　　Ｘ１６Ｘ１７ＧＸ１８ＧＷＸ１９；または
式ＶＩ：　　Ｘ２０Ｘ２１ＧＸ２２ＲＥＸ２３
［式中、Ｘ１～Ｘ２３はいずれかのアミノ酸残基であり、Ｇはグリシンを表し、Ｗはトリプトファンを表し、Ｖはバリンを表し、Ｒはアルギニンを表し、Ｅはグルタミン酸を表す。］
で示されるアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。好適には、式Ｉ（Ｘ１Ｘ２ＧＸ３ＧＷＶ）中、Ｘ１はＥ（グルタミン酸）、Ｇ（グリシン）またはＴ（トレオニン）であり、Ｘ２はＲ（アルギニン）、Ｔ（トレオニン）、Ｓ（セリン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｅ（グルタミン酸）またはＤ（アスパラギン酸）であり、Ｘ３はＶ（バリン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｒ、Ｍ（メチオニン）またはＬ（ロイシン）である。好適には、式ＩＩ（Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＷＶ）中、Ｘ４はＡ（アラニン）またはＥであり、Ｘ５はＤ、ＧまたはＡであり、Ｘ６はＫ（リジン）、Ｑ（グルタミン）またはＮであり、Ｘ７はＶまたはＬである。好適には、式ＩＩＩ（Ｘ８Ｘ９ＧＸ１０Ｘ１１ＷＶ）中、Ｘ８はＡ、ＥまたはＧであり、Ｘ９はＳ、Ｄ、ＧまたはＲであり、Ｘ１０はＴ、Ｍ、ＤまたはＶであり、Ｘ１１はＲ、Ｖ、ＳまたはＴである。好適には、式ＩＶ（Ｘ１２Ｘ１３ＧＸ１４ＧＸ１５Ｖ）中、Ｘ１２はＤ、Ｅ、ＧまたはＲであり、Ｘ１３はＡ、Ｇ、ＤまたはＶであり、Ｘ１４はＩ、Ｈ、Ｄ、Ｆ（フェニルアラニン）、ＧまたはＬであり、Ｘ１５はＹ（チロシン）、Ｆ、Ｒ、ＧまたはＶである。好適には、式Ｖ（Ｘ１６Ｘ１７ＧＸ１８ＧＷＸ１９）中、Ｘ１６はＡ、ＥまたはＧであり、Ｘ１７はＧ、ＲまたはＳであり、Ｘ１８はＶ、ＨまたはＤであり、Ｘ１９はＴ、Ｇ、Ｋ、Ｉ（イソロイシン）またはＡである。好適には、式ＶＩ（Ｘ２０Ｘ２１ＧＸ２２ＲＥＸ２３）中、Ｘ２０はＥまたはＡであり、Ｘ２１はＹまたはＨであり、Ｘ２２はＦまたはＹであり、Ｘ２３はＧまたはＰ（プロリン）である。
　例えば、式Ｉで示されるアミノ酸配列を含むペプチドには、限定するものではないが、配列番号１８、２０、２１、２２、４６、５５、５９および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１８、２０、２１、２２、４６、５５、５９および６０からなる群より選択されるアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドが包含される。例えば、式ＩＩで示されるアミノ酸配列を含むペプチドには、限定するものではないが、配列番号２５、２９および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号２５、２９および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドが包含される。例えば、式ＩＩＩで示されるアミノ酸配列を含むペプチドには、限定するものではないが、配列番号１５、２４、３８、４８および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５、２４、３８、４８および５４からなる群より選択されるアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドが包含される。例えば、式ＩＶで示されるアミノ酸配列を含むペプチドには、限定するものではないが、配列番号１９、３１、３５、４４、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１９、３１、３５、４４、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドが包含される。例えば、式Ｖで示されるアミノ酸配列を含むペプチドには、限定するものではないが、配列番号２６、３９、４２、４３、４７および５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号２６、３９、４２、４３、４７および５０からなる群より選択されるアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドが包含される。例えば、式ＶＩで示されるアミノ酸配列を含むペプチドには、限定するものではないが、配列番号１６または１７で示されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１６または１７で示されるアミノ酸配列において１～４個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドが包含される。
　本発明の核酸がコードするＡＡＶキャプシドタンパク質変異体は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂなど）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ１０）、１１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１１）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶなど、任意の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質に上記ペプチドを挿入するか、又はＡＡＶキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の一部を上記ペプチドで置換する（すなわち、ＡＡＶキャプシドタンパク質に上記ペプチドを含有させる）ことにより調製することができる。本発明においては、ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質が特に好適に使用できる。
　本発明の核酸がコードするＡＡＶキャプシドタンパク質変異体は、野生型のＡＡＶキャプシドタンパク質に上記ペプチドが保持されている以外に、１～数個または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたタンパク質であっても良い。該「上記ペプチドが保持されている以外に、１～数個または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたタンパク質」は、元のタンパク質の性質、例えば、上記ペプチドによって付与されるＡＡＶキャプシドタンパク質変異体の細胞指向性、キャプシド形成能、キャプシドタンパク質の機能（例えば、ウイルスゲノムの保護、宿主細胞侵入後の脱殻等）等を維持するタンパク質である。
　さらに、本発明においてＡＡＶキャプシドタンパク質に含有させるペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端にはスペーサー配列を付加させてもよい。スペーサー配列は１～５アミノ酸残基が好適である。スペーサー配列のアミノ酸は特に限定は無いが、例えばグリシン、アラニン及びセリンからなる群より選択されるアミノ酸が使用できる。
　ペプチドを含有させるＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３のいずれもが使用できる。ＶＰ１のみ、ＶＰ２のみ又はＶＰ３のみにペプチドを含有させても良く、ＶＰ１～ＶＰ３の全てのキャプシドタンパク質にペプチドを含有させても良い。さらに、ＶＰ１及びＶＰ２、ＶＰ２及びＶＰ３、ＶＰ１及びＶＰ３の組合せのように、２種類のキャプシドタンパク質に含有させても良い。ＶＰ１～ＶＰ３は、ＡＡＶゲノムのｃａｐ遺伝子領域にコードされている。本発明の一態様として、ＶＰ１～ＶＰ３に共通した領域にペプチドを含有させて、ＶＰ１～ＶＰ３の全てに変異を導入することができる。また、別の態様として、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子領域とは別に、ＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３をコードする遺伝子を準備し、この遺伝子に変異を導入することができる。この場合、変異を導入した遺伝子にコードされるキャプシドタンパク質に対応する野生型キャプシドタンパク質がＡＡＶのｃａｐ遺伝子領域から発現しないような処置を行っても良い。
　本発明の核酸がコードするＡＡＶキャプシドタンパク質変異体においてペプチドを含有させる位置は、ＡＡＶ２のＶＰ１の場合、アミノ酸番号５８８番とアミノ酸番号５８９番との間の位置が好ましい。ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番はアルギニンであり、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８９番はグルタミンである。また、ＡＡＶ２　ＶＰ１のアミノ酸番号５８８番は、ＡＡＶ２のＶＰ２のアミノ酸番号４５１番、ＡＡＶ２のＶＰ３のアミノ酸番号３８６番に相当する。ＡＡＶキャプシドタンパク質としてＡＡＶ２以外の血清型またはクレードのＡＡＶに由来するキャプシドタンパク質を使用する場合、好ましくは、該ＡＡＶキャプシドタンパク質における、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番と５８９番に対応するアミノ酸の間の位置にペプチドを含有させる。ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番のアミノ酸に対応する、ＡＡＶ２以外の血清型またはクレードのＡＡＶのキャプシドタンパク質のアミノ酸を、当業者は容易に特定することができる。例えば、Ｇａｏら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ．）、第９９巻、第１８号、１１８５４－１１８５９頁、２００２年に記載されるＶＰ１のアミノ酸配列のアライメントを参照することができる。例えば、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番は、ＡＡＶ１では５８９番、ＡＡＶ７では５９０番、ＡＡＶ８では５９１番である。
　本発明の核酸は、適切な制御配列と作動可能に連結してもよい。制御配列には、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流の調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサーなどが含まれる。プロモーター配列には、誘導性プロモーター配列、構成的プロモーター配列が含まれる。制御配列はキャプシドタンパク質の由来となるＡＡＶに固有のものであっても外来性のものであってもよく、天然配列であっても合成配列であってもよい。このような、ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を発現可能な組換えＤＮＡも本発明に包含される。
　本発明の組換えＤＮＡは、試験管内、生体外及び生体内の細胞へ本発明の核酸を送達し、当該細胞にＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を発現する能力を付与するのに有用である。そして、本発明の核酸が送達された細胞はＡＡＶ粒子を製造するのに有用である。当該組換えＤＮＡは特に、動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞へ本発明の核酸を送達又は導入するのに用いることができる。
　本発明では、ベクターとして使用されているＤＮＡに本発明の核酸を保持させて本発明の組換えＤＮＡを作製することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、トランスポゾン、コスミドＤＮＡ、エピソーマルＤＮＡ、ウイルスゲノムが使用できる。
（２）本発明の核酸を含む細胞
　本発明はまた、本発明の核酸、具体的には前記（１）の組換えＤＮＡを含む宿主細胞、例えば単離された宿主細胞を提供する。単離された細胞は、例えばインビトロで維持されている細胞株である。本発明の宿主細胞は、以下に説明するように本発明のＡＡＶ粒子の製造に有用である。本発明の宿主細胞がＡＡＶ粒子を製造するために使用される場合、これは「パッケージング細胞」又は「プロデューサー細胞」と称することがある。本発明の宿主細胞は、前記（１）記載の本発明の組換えＤＮＡがゲノムに組み込まれても良く、ＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を一過性に発現するように前記の組換えＤＮＡが細胞内に保持されていても良い。
　宿主細胞への本発明の組換えＤＮＡの導入は、公知の方法により実施することができる。例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、細胞への直接的微量注入法、リポソーム媒介型遺伝子導入法、高速微粒子銃を使用する核酸送達法などを使用できる。また、ウイルスベクターを使用する場合には、当該ベクターに適した感染法を選択すればよい。このような確立された技術を用いて、本発明の組換えＤＮＡは宿主細胞の染色体に安定的に、又は宿主細胞の細胞質に一過性に導入される。安定した形質転換のために、選択マーカー、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードしている）、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードしている）などの周知の選択マーカーを本発明の組換えＤＮＡに連結することができる。
　宿主細胞には、例えば、マウス細胞、及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）などを含む哺乳類細胞、昆虫細胞などの、様々な細胞が使用できる。適当な哺乳類細胞は、初代細胞及び細胞株を含むがこれらに限定されるものではなく、適当な細胞株として、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞やこれらの細胞から派生した細胞などが挙げられる。
（３）本発明の核酸にコードされるアミノ酸配列を含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子
　本発明のＡＡＶ粒子は、前記（１）に記載されるペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子である。本発明のＡＡＶ粒子は、前記（２）に記載される宿主細胞により製造することができる。本発明のＡＡＶ粒子は、脳に指向性を有し、脳への遺伝子導入に有用である。脳には、神経細胞とグリア細胞（ミクログリア、オリゴデンドロサイト、アストロサイト）などの脳細胞が含まれる。本発明のＡＡＶ粒子により導入された遺伝子は、前記組織、器官及び細胞で強く発現される。
　ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ粒子の製造に必要ないくつかの成分を含む細胞をパッケージング細胞として利用して製造することができる。第１の成分は、宿主細胞内で複製及びＡＡＶ粒子にパッケージングされ得る組換えＡＡＶのベクターゲノム（発現ベクターとも呼ばれる）である。組換えＡＡＶのベクターゲノムは、所望の異種ポリヌクレオチドと、その両側に、すなわち５’及び３’側にそれぞれＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が位置する。所望の異種ポリヌクレオチドは、その発現のための制御配列を有しうる。ＩＴＲ配列の塩基配列は公知であり、例えば、ＡＡＶ２のＩＴＲ配列については、Ｋｏｔｉｎ　Ｒ．Ｍら、ヒューマン　ジーン　セラピー（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、第５巻、７９３－８０１頁、１９９４年を参照することができる。さらに、ＩＴＲ配列として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７など、様々なＡＡＶ血清型のいずれかに由来するＩＴＲ配列を使用することができる。本発明において使用されるＩＴＲ配列は、野生型ＡＡＶ由来の配列でも良く、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換により変更されていても良い。ＩＴＲ配列は、Ｒｅｐタンパク質の存在下で、組換えＡＡＶのベクターゲノムの複製を可能にし、ＡＡＶ粒子形成の際にキャプシド粒子内への組込みを可能にする。
　本発明のＡＡＶ粒子に搭載可能な所望の異種ポリヌクレオチドは、一般にサイズが約５キロベース（ｋｂ）未満であり、例えばレシピエントに欠損した又は失われた所望のタンパク質をコードする遺伝子、所望の生物学的又は治療的作用（例えば、抗菌、抗ウイルス又は抗腫瘍作用）を有するタンパク質をコードする遺伝子、有害な又は望ましくないタンパク質の産生を阻害又は低下するＲＮＡをコードする所望のヌクレオチド配列、抗原性タンパク質をコードするヌクレオチド配列など、目的に応じて適宜設定することができる。
　本発明の一態様として、組換えＡＡＶのベクターゲノムは、ｃａｐ遺伝子領域及び／又はｒｅｐ遺伝子領域を欠いており、この態様の組換えＡＡＶのベクターゲノムがパッケージングされたＡＡＶ粒子は、感染した細胞内で単独で再度ＡＡＶ粒子に複製されない。
　ＡＡＶ粒子の製造に必要な第２の成分は、野生型ＡＡＶにコードされているタンパク質を提供する構築物である。この構築物は、ＡＡＶ粒子の形成のために必要なＡＡＶ遺伝子産物を提供するＡＡＶ由来の遺伝子をコードしている。すなわち、主要なＡＡＶ　ＯＲＦであるｒｅｐ遺伝子領域及びｃａｐ遺伝子領域のコード領域の一方又は両方を含む。本発明のＡＡＶ粒子を製造するために、少なくとも配列表の配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体をコードする核酸をｃａｐ遺伝子として使用する。この変異体を発現する能力を有している、前記（２）に記載される本発明の宿主細胞をＡＡＶ粒子の製造に使用することができる。ＡＡＶ粒子は多数のキャプシドタンパク質から構成される外殻を有するが、全てのキャプシドタンパク質が変異体であっても良く、その一部が変異体で残りが野生型のキャプシドタンパク質でもあっても良い。さらに、本発明のＡＡＶ粒子に含まれるキャプシドタンパク質変異体は１種類の変異体であっても良く、複数種の変異体であっても良い。
　ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐ遺伝子コード領域に含まれ、複製タンパク質Ｒｅｐ　７８、Ｒｅｐ　６８、Ｒｅｐ　５２及びＲｅｐ　４０をコードする遺伝子を含む。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムＤＮＡ複製起点の認識、結合及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性及びＡＡＶ由来プロモーターの転写の変更を含む、多くの機能を有することが示されている。
　ＡＡＶ粒子の製造に必要な第３の成分は、ＡＡＶ複製のためのヘルパーウイルス機能（アクセサリー機能とも呼ばれる）である。ヘルパー機能の導入には一般にアデノウイルスが使用されるが、例えば１型又は２型単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのウイルスも使用することができる。ウイルスを使用する場合は、宿主細胞にウイルスをヘルパーウイルスとして感染させる。例えば、アデノウイルスの初期遺伝子の発現のみがＡＡＶ粒子のパッケージングに必要なので、後期遺伝子発現を呈さないアデノウイルスを用いてもよい。後期遺伝子発現を欠損するアデノウイルス変異体（例えばｔｓ１００Ｋ又はｔｓ１４９アデノウイルス変異体）を使用することができる。あるいは、ヘルパーウイルスから単離したヘルパーウイルス機能に必要な核酸を使用し、ヘルパーウイルス機能を提供する核酸構築物を作製して宿主細胞に導入することができる。ヘルパーウイルス機能を提供する構築物は、１種又は複数のヘルパーウイルス機能を提供するヌクレオチド配列を含み、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド又は他のウイルスの形で宿主細胞に提供される。
　ＡＡＶ粒子を製造するために、前記（ａ）第１の成分である組換えＡＡＶのベクターゲノムを宿主細胞に導入する工程、（ｂ）第２の成分であるＡＡＶヘルパー機能を提供する構築物を宿主細胞に導入する工程、（ｃ）第３の成分であるヘルパーウイルス機能を宿主細胞に導入する工程、を実施する。これらの工程は同時に実施されても良く、順番に実施されても良い。工程（ａ）～（ｃ）の順番はどのような順番であっても良い。宿主細胞に第１～第３の成分が導入されることにより、ｒｅｐ遺伝子の発現産物は、組換えＡＡＶのベクターゲノムを切出し、複製する。発現されたキャプシドタンパク質はキャプシドを形成し、組換えＡＡＶのベクターゲノムがキャプシドにパッケージングされてＡＡＶ粒子が産生される。そして、この宿主細胞がＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を発現する場合、産生されたＡＡＶ粒子の外殻にはＡＡＶキャプシドタンパク質変異体が含まれている。
　ＡＡＶ粒子は、宿主細胞の培養上清やその細胞溶解物から、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離のような様々な精製法を用いてＡＡＶ粒子を単離、精製することができる。前記（ｃ）工程にウイルスが使用される場合、例えば、ＡＡＶ粒子とヘルパーウイルスとを、サイズに基づいて分離する工程を加えてもよい。また、ヘパリンに対する親和性の差に基づいて、ＡＡＶ粒子をヘルパーウイルスから分離することもできる。さらに、残存するヘルパーウイルスは、公知の方法を用いて失活することができる。例えばアデノウイルスは、約６０℃の温度で、例えば２０分間又はそれ以上加熱することにより失活することができる。ＡＡＶ粒子は熱に極めて安定であるため、この処置はヘルパーウイルスとして使用したアデノウイルスの選択的除去に有効である。
（４）本発明の遺伝子導入細胞の製造方法
　前記（３）により得られる本発明のＡＡＶ粒子は、遺伝子治療やその他の目的で、所望の異種ポリヌクレオチドの細胞への送達のために使用される。一般にＡＡＶ粒子は、インビボ又はインビトロのいずれかで細胞へ導入される。インビトロで導入する場合、生体より取得された細胞にＡＡＶ粒子を接触させることにより導入する。この細胞を生体に移植することもできる。細胞を生体に導入する場合は、薬学的組成物として製剤化し、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内投与などの様々な技術を利用できる。インビボで形質導入する場合は、ＡＡＶ粒子を薬学的組成物として製剤化し、一般に非経口投与する（例えば、筋肉内、皮下、腫瘍内、経皮、髄腔内などの投与経路により投与する）。ＡＡＶ粒子を含む薬学的組成物は、薬剤として許容される担体、及び必要に応じて他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈液などを含んでいてもよい。
　以下、実施例にて本願発明を説明するが、本願発明は実施例により特に限定されるものではない。
実施例１　ＡＡＶ２ランダムペプチドプラスミドライブラリーの作製
　ＡＡＶ２のゲノムを搭載したプラスミドベクターｐＡＶ１（ＡＴＣＣ　Ｎｕｍｂｅｒ：３７２１５）を汎用宿主（Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｈｏｓｔ）のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１より抽出した。抽出したプラスミドから制限酵素ＢｇｌＩＩ（タカラバイオ社製）によりＡＡＶ２のゲノムＤＮＡ（約４．７ｋｂ）を切り出した。このゲノムＤＮＡをｐＵＣ１１８　ＢａｍＨＩ／ＢＡＰ（タカラバイオ社製）に挿入し、得られたプラスミドＤＮＡをＡＡＶ２ＷＧ／ｐＵＣ１１８とした。
　ＡＡＶ２ＷＧ／ｐＵＣ１１８を制限酵素ＳｃａＩ（タカラバイオ社製）で処理し、ｃａｐ遺伝子の１１９０番目から２０１７番目の塩基を含む約０．８ｋｂの断片を得た。この断片をｐＵＣ１１８　ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰ（タカラバイオ社製）に挿入し、得られたプラスミドＤＮＡをＣａｐ－ＳｃａＩ／ｐＵＣ１１８とした。次に、ＰＣＲ法を用いてＣａｐ－ＳｃａＩ／ｐＵＣ１１８のＣａｐ遺伝子の１７５９番目から１７６１番目の塩基配列ＡＡＣ（５８７Ｎ）をＣＡＧ（５８７Ｑ）に変換、１７６４番目と１７６５番目の塩基の間にスペーサーとしてＧＧＣ、スタッファーとしてＣＡＡＧ、さらにスペーサーとしてＧＣＣの１０塩基を挿入、１７６５番目から１７７３番目の塩基ＣＡＡ（５８９Ｑ）ＧＣＡ（５９０Ａ）ＧＣＴ（５９１Ａ）をＣＡＧ（５８９Ｑ）ＧＣＧ（５９０Ａ）ＧＣＣ（５９１Ａ）に変換、という一連の改変を実施した（カッコ内の文字はアミノ酸番号及びコードするアミノ酸を示す）。これによりに制限酵素ＳｆｉＩの認識部位が２か所とそのＳｆｉＩ認識部位に挟まれたスペーサー、スタッファー、スペーサーが挿入された。Ｃａｐ遺伝子の１７５６番目から１７７３番目の変換前後の塩基配列を図１に示し、変換前の塩基配列を配列表の配列番号１に、変換後の塩基配列を配列番号２に示す。塩基配列を変換した後のプラスミドＤＮＡをＣａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８とした。Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８のＣａｐ遺伝子部分をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＣｌｏｎｉｎｇのためにＰＣＲ法により増幅し、約０．８ｋｂの断片を得、これをインサートＤＮＡとした。
　ＡＡＶ２ＷＧ／ｐＵＣ１１８のアンピシリン耐性遺伝子内の制限酵素ＳｃａＩの認識部位、及びＲｅｐ遺伝子内にある制限酵素ＳｆｉＩの認識部位を、ＰＣＲ法によって塩基配列に変異を導入することにより、これら制限酵素が認識しない配列に改変した。ＳｃａＩ認識部位についてはアンピシリン耐性遺伝子の３０４番目から３０６番目の塩基配列ＧＡＧ（Ｅ）をＧＡＡ（Ｅ）に変換した。変換前の塩基配列を配列番号３に、変換後の塩基配列を配列番号４に示す。ＳｆｉＩの認識部位についてはＲｅｐ遺伝子の２１７番目～２１９番目の塩基配列ＧＣＣ（Ａ）をＧＣＡ（Ａ）に変換した。変換前の塩基配列を配列番号５に、変換後の塩基配列を配列番号６に示す。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＳｃａＩ（タカラバイオ社製）で処理し、Ｃａｐ遺伝子の一部である約０．８ｋｂが欠落した線状のベクターを得た。これをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇのための線状ベクターとした。
　次にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）とＣｌｏｎｉｎｇ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ（クロンテック社製）を用いて前記の線状ベクターにインサートＤＮＡを挿入し、ディレクショナルクローニングを行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＡＡＶ２ＷＧ－Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘとした。
　７アミノ酸のランダムペプチドをコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ（配列番号７）を人工合成により作製し、プライマー（配列番号８）及びＫｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社製）を用いて、３７℃で３時間反応させることでオリゴＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを調製した。Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩ（タカラバイオ社製）を用いて消化した。このＤＮＡをＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いてＳｆｉＩで消化したＡＡＶ２ＷＧ－Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘに挿入したプラスミドをＡＡＶ２ＷＧ－ＲＰＬ／ｐＵＣ１１８Ｓｘとし、ＡＡＶ２ランダムペプチドプラスミドライブラリーとして使用した。
実施例２　ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの作製
（１）ＡＡＶ２９３細胞の播種
　培養したＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を回収後、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ（シグマ社製）で５×１０４細胞／ｍＬとなるように懸濁した。細胞培養用Ｔ２２５ｃｍ２フラスコ（コーニング社製）にＡＡＶ２９３細胞を含む溶液を４０ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した。
（２）ＡＡＶ２９３細胞へのプラスミド導入
　実施例１で得たＡＡＶ２ＷＧ－ＲＰＬ／ｐＵＣ１１８Ｓｘ　４００ｎｇ及びｐＨＥＬＰ（ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ社製）を４０μｇずつ、一般的なリン酸カルシウム法を用いてＡＡＶ２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの６時間後、培地を完全に除去し、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ　Ｌ－グルタミン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ　４０ｍＬを添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。
（３）ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの回収
　培養中のＴ２２５ｃｍ２フラスコに、０．５Ｍ　ＥＤＴＡを０．５ｍＬ添加して数分間静置した。その後、ピペッティングでＡＡＶ２９３細胞を剥離させて５０ｍＬチューブに回収し、３００×ｇ、１０分間遠心後、上清を除去した。フラスコ１枚あたり２ｍＬのＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）に細胞を再懸濁後、エタノール／ドライアイスで１５分間、３７℃のウォーターバスで１５分間、ボルテックス１分間の一連の処理を３回繰り返し、ＡＡＶ－ランダムペプチドウイルスライブラリーを含む細胞破砕液を回収した。この溶液に、ＴＢＳ　１ｍＬあたり、１Ｍ　ＭｇＣｌ２を５μＬ、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（メルク社製）を終濃度２００Ｕ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で３０分間反応させた。その後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡをＴＢＳ　１ｍＬあたり６．５μＬ添加して反応を停止させた。この細胞破砕液を１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心後、上清を回収しＡＡＶベクター溶液とした。
（４）ＡＡＶベクター溶液のリアルタイムＰＣＲによる力価定量
　ＡＡＶベクター溶液２μＬに、１０×ＤＮａｓｅＩバッファー２μＬ、注射用水（大塚製薬社製）１５．２μＬ、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）０．８μＬを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、遊離のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅＩを不活化するために９９℃、１０分間の熱処理後、注射用水１５μＬ、１０×ＰｒｏＫバッファー［０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ７．８）、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ、５％　ＳＤＳ］４μＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（タカラバイオ社製）１μＬを添加し、５５℃で１時間インキュベートした。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを不活化するために９５℃１０分間処理した。このサンプルに対し、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥｘＴａｑ２（タカラバイオ社製）及びプライマー（配列番号９及び配列番号１０）を用いて、キットに添付の説明書に従いＡＡＶの力価定量を行った。なおサンプルは、注射用水で５０倍希釈した溶液を２μＬ用いた。また、標準品として、ｐＡＶ１を制限酵素で消化し、線状化したＤＮＡを用いた。
実施例３　ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの精製
（１）塩化セシウム密度勾配遠心分離による精製１
　超遠心用の４０ＰＡチューブ（ＨＩＴＡＣＨＩ－ＫＯＫＩ社製）に、底から比重１．５に調製した塩化セシウム溶液を４ｍＬ、比重１．２５に調製した塩化セシウム溶液を４ｍＬ、実施例２－（４）で調製したＡＡＶベクター溶液を２８ｍＬの順に重層し、超遠心機ＨＩＭＡＣ（ＨＩＴＡＣＨＩ－ＫＯＫＩ社製）で２５０００ｒｐｍ、１６℃、３時間遠心した。遠心後、上から２８ｍＬの溶液を除き、続いて上から０．７ｍＬずつ溶液を採取して１．５ｍＬチューブにそれぞれ回収した。実施例２－（４）と同様の方法で、各回収液に含まれるＡＡＶ粒子の力価を定量した。
（２）塩化セシウム密度勾配遠心分離による精製２
　実施例３－（１）で力価の高かった数フラクションに、比重１．３９に調製した塩化セシウム溶液を加えて、１０．５ｍＬにフィルアップした。この溶液を超遠心用１３ＰＡチューブ（ＨＩＴＡＣＨＩ－ＫＯＫＩ社製）に添加し、超遠心機で３８０００ｒｐｍ、１８℃、１６時間遠心した。遠心後、チューブの上から順に０．７ｍＬずつ採取して内容液を回収した。各回収液のＡＡＶ粒子の力価を実施例２－（４）と同様の方法で定量した。
（３）透析による脱塩
　実施例３－（２）で力価の高かった数フラクションを混合し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）に添加した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１Ｌにより４℃で３時間の透析を２回、ＰＢＳ／５％ソルビトール溶液５００ｍＬにより４℃で一晩透析を行うことで精製ＡＡＶ溶液の脱塩を行った。その後、溶液を回収し、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製）で滅菌後、使用するまで－８０℃で保存した。また別途、精製ＡＡＶ粒子の力価を実施例２－（４）と同様の方法で定量した。
実施例４　ＡＡＶ２ランダムペプチドライブラリーのスクリーニング
（１）マウスへの尾静脈投与
　実施例３－（３）で得られた精製ＡＡＶ粒子を、１．５×１０１４ウイルスゲノム（ＶＧ）／ｋｇとなるように、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈から投与した。投与７２時間後に脳を回収し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）　ｔｉｓｓｕｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した（ラウンド１）。
（２）ＰＣＲによるランダムペプチド配列のリクローニング
　実施例４－（１）で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＧＸＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてランダムペプチド配列をコードするＤＮＡを増幅した。プライマーはフォワードプライマー１（配列番号１１）及びリバースプライマー１（配列番号１２）を用いた。ＰＣＲを９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃４０秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。続いて、この反応液の１／２５量を用いてフォワードプライマー２（配列番号１３）及びリバースプライマー２（配列番号１４）を用いて同量の反応液を調製した。ＰＣＲを９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃１５秒を１サイクルとして３０サイクル実施した。この反応液からＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔ　ＩＩ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いてＤＮＡを精製し、制限酵素ＢｇｌＩを用いて切断した。電気泳動後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔ　ＩＩを用いて精製し、ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞を用いて、実施例１で調製したＡＡＶ２ＷＧ－Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘにリクローニングした。
（３）ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの製造と精製
　実施例４－（２）で得たプラスミドを使用し、実施例２及び実施例３と同様の方法で、ＡＡＶ２ランダムペプチドウイルスライブラリーの製造とＡＡＶ粒子の精製を行った。
（４）スクリーニング
　実施例４－（１）と同様の方法でスクリーニング（マウスへのＡＡＶ粒子の投与と脳の回収）を行い、ゲノムＤＮＡを抽出した（ラウンド２）。さらに、抽出したゲノムＤＮＡを使用して、再度リクリーニング、ライブラリー製造と精製及びスクリーニングを行いゲノムＤＮＡを抽出した（ラウンド３）。
（５）ランダムペプチドのシークエンシング
　各スクリーニング段階（ラウンド１～ラウンド３）のＡＡＶランダムペプチドプラスミドライブラリーのシークエンシングを行った。そのうちラウンド２およびラウンド３に脳へ集積したクローンがコードするペプチド配列と出現回数を表１及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１及び表２に示すように、特定のペプチド配列を含有するキャプシドを有するＡＡＶが脳に集積していることがわかった。なかでも、ラウンド3で確認された配列であるＧＳＧＶＴＷＶ（配列番号１５）、ＡＨＧＹＲＥＰ（配列番号１６）、ＥＹＧＦＲＥＧ（配列番号１７）、及びＥＴＧＨＧＷＶ（配列番号１８）は脳に感染しやすい配列であることが示唆された。
　また、ラウンド２で確認された配列とスペーサーとを含む配列である、配列番号６３～配列番号１１０が脳に感染しやすい配列であることが示唆された。特に、ラウンド3で確認された配列とスペーサーとを含む配列である、ＧＧＳＧＶＴＷＶＡ（配列番号６３）、ＧＡＨＧＹＲＥＰＡ（配列番号６４）、ＧＥＹＧＦＲＥＧＡ（配列番号６５）、及びＧＥＴＧＨＧＷＶＡ（配列番号６６）が脳に感染しやすい配列であることが示唆された。
実施例５　取得ペプチド配列を持つＡＡＶベクターの指向性評価
（１）取得ペプチド配列をもつｐＲＣヘルパープラスミドの構築
　実施例４－（５）で得られたペプチド配列（配列番号１５～２０）を持つＡＡＶ２ＷＧ－Ｃａｐ－ＳｃａＩ－Ｓ４／ｐＵＣ１１８Ｓｘクローンを制限酵素ＳｎａＢＩ（タカラバイオ社製）及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で消化して得た断片と、ｐＡＡＶＲＣ２ベクター（ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳ社製）をＳｎａＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して得たベクター断片とを、ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結し、ヘルパープラスミドｐＲＣ－ＧＳＧＶＴＷＶ、ｐＲＣ－ＡＨＧＹＲＥＰ、ｐＲＣ－ＥＹＧＦＲＥＧ、ｐＲＣ－ＥＴＧＨＧＷＶ、ｐＲＣ－ＧＧＧＩＧＹＶ、及びｐＲＣ－ＥＲＧＶＧＷＶを得た。
（２）ＡＡＶ２－ＬａｃＺキャプシド変異体の製造と精製
　ｐＡＡＶ－ＬａｃＺ（タカラバイオ社製）、ｐＨＥＬＰ及び実施例５－（１）で調製したｐＲＣヘルパープラスミド（ｐＲＣ－ＧＳＧＶＴＷＶ、ｐＲＣ－ＡＨＧＹＲＥＰ、ｐＲＣ－ＥＹＧＦＲＥＧ、ｐＲＣ－ＥＴＧＨＧＷＶ、ｐＲＣ－ＧＧＧＩＧＹＶ、又はｐＲＣ－ＥＲＧＶＧＷＶ）を、ＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社製）を用いて、Ｔ２２５ｃｍ２フラスコに播種しておいた２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。なお、ペプチド配列をもつｐＲＣヘルパープラスミドの代わりに野生型キャプシドを搭載したｐＲＣ２ベクターをトランスフェクションし、対照とした。トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞を、３７℃のＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した。Ｔ２２５ｃｍ２フラスコからＡＡＶを含む上清を回収し、ＡＶＢセファロース（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＡＡＶをアフィニティ精製した。その後、限外ろ過によりＡＡＶを濃縮精製することでＡＡＶ精製溶液を調製した。その後、実施例２－（４）に示した方法で、ＡＡＶベクターの力価を定量した。
（３）ＡＡＶ精製溶液のマウスへの投与
　実施例５－（２）で得たＡＡＶ精製溶液を０．２２μｍフィルターろ過を行った後に、マウス一匹当たり０．５×１０１１ＶＧ／マウスとなるように、マウス尾静脈から投与した。
（４）脳及びその他組織からのゲノムＤＮＡ調製及びＡＡＶゲノムの定量
　実施例５－（３）でＡＡＶを投与したマウスを、４週間後に安楽死させ、各組織を回収した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ（マッハライ・ナーゲル社製）を用いて、各組織からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡをサンプルとしてリアルタイムＰＣＲを実施し、各組織中に含まれるＡＡＶベクターゲノム量を定量した。各組織中の全ゲノムＤＮＡ１μｇ当たりのＡＡＶゲノムＤＮＡの分子数を図２に示す。
　図２から、ＧＳＧＶＴＷＶ、ＡＨＧＹＲＥＰ、ＥＹＧＦＲＥＧ、ＥＴＧＨＧＷＶ、ＧＧＧＩＧＹＶ及びＥＲＧＶＧＷＶのペプチド配列を有するキャプシドのＡＡＶベクターは脳に移行しやすいことが示された。さらに、脳だけでなく、肺への指向性も示すＡＡＶベクターもあった。
　本発明により、全身投与により脳に指向性を有するＡＡＶキャプシドタンパク質変異体、あるいはアミノ酸配列を提供され、脳に効率的に遺伝子を導入する方法が提供される。
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Claims (11)

  1. 　配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質変異体をコードする核酸。
  2. 　ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項１記載の核酸。
  3. 　ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番とアミノ酸番号５８９番との間の位置に前記ペプチドを含有させた請求項２記載の核酸。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えＤＮＡ。
  5. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸又は請求項４記載の組換えＤＮＡを含む細胞。
  6. 　配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子。
  7. 　ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項６記載のＡＡＶ粒子。
  8. 　ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番とアミノ酸番号５８９番との間の位置に前記ペプチドを含有させた請求項７記載のＡＡＶ粒子。
  9. 　配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは配列番号１５～配列番号６２からなる群より選択されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むペプチドを含有させたＡＡＶキャプシドタンパク質変異体を含むＡＡＶ粒子を細胞に接触させる工程を含む、遺伝子導入細胞の製造方法。
  10. 　ＡＡＶキャプシドタンパク質がＡＡＶ２由来である請求項９記載の方法。
  11. 　ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸番号５８８番とアミノ酸番号５８９番との間の位置に前記ペプチドを含有させた請求項１０記載の方法。
PCT/JP2020/017495 2019-04-24 2020-04-23 脳に指向性を有するａａｖ変異体 WO2020218419A1 (ja)

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