JP2023138527A - スペーサーを含む核酸分子およびその使用の方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ウイルス粒子中にパッケージングすることができるスペーサーを含む核酸分子、およびそれらを生産する方法を提供すること。【解決手段】第1の側面において、本発明は、5’→3’方向に:SS1-ITR1-CS-ITR2-SS2のとおりに互いに作動可能に連結された、第1のスペーサー(SS1);第1の逆位末端反復配列(ITR1);クローニング部位(CS);第2の逆位末端反復配列(ITR2);および、真核生物のスペーサーなどの第2のスペーサー(SS2);を含む、核酸分子を特徴とする。一態様において、本発明は、上記の核酸分子のいずれかを含んでなるベクターを特徴とする。別の側面において、本発明は、核酸分子を含む複数のウイルス粒子を特徴とする。本発明は、上記のベクターのいずれかを含む宿主細胞をさらに含む。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
この出願は、参照によってその開示全体が本明細書に組み込まれる、2015年5月14日に出願された米国仮出願第62/161,505号の優先権を主張する。
この出願は、参照によってその開示全体が本明細書に組み込まれる、2015年5月14日に出願された米国仮出願第62/161,505号の優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、減少された夾雑核酸を有するウイルス粒子の生産のためのスペーサーを含む核酸分子に関する。
本発明は、減少された夾雑核酸を有するウイルス粒子の生産のためのスペーサーを含む核酸分子に関する。
発明の背景
アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくものなどのパルボウイルス遺伝子治療ベクターは、動物モデルにおける、および患者における、長期遺伝子発現に首尾よく使用されている。パルボウイルス遺伝子治療ベクターの治療的潜在能力が有望であるように見える一方で、ベクターストック中に見出されるコンタミナントなどを含む安全性の問題は、それ以外の点では有効な処置のための耐容用量を制限していた。有効性減少およびベクター毒性の原因の1つは、ウイルスベクター粒子内に存在するベクターからの夾雑核酸(例えば、原核生物性の核酸、抗生物質抵抗性遺伝子および高CpG含有率の核酸)である。
アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくものなどのパルボウイルス遺伝子治療ベクターは、動物モデルにおける、および患者における、長期遺伝子発現に首尾よく使用されている。パルボウイルス遺伝子治療ベクターの治療的潜在能力が有望であるように見える一方で、ベクターストック中に見出されるコンタミナントなどを含む安全性の問題は、それ以外の点では有効な処置のための耐容用量を制限していた。有効性減少およびベクター毒性の原因の1つは、ウイルスベクター粒子内に存在するベクターからの夾雑核酸(例えば、原核生物性の核酸、抗生物質抵抗性遺伝子および高CpG含有率の核酸)である。
本発明は、ウイルス粒子中にパッケージングすることができるスペーサーを含む核酸分子、およびそれらを生産する方法に関する。
第1の側面において、本発明は、5’→3’方向に:SS1-ITR1-CS-ITR2-SS2のとおりに互いに作動可能に(operably)連結された、第1のスペーサー(SS1);第1の逆位末端反復配列(ITR1);クローニング部位(CS);第2の逆位末端反復配列(ITR2);および、真核生物のスペーサーなどの第2のスペーサー(SS2);を含む、核酸分子を特徴とする。別の側面において、本発明は、第1のスペーサー(SS1);第1の逆位末端反復配列(ITR1);異種ポリヌクレオチド分子(HPM);第2の逆位末端反復配列(ITR2);および、真核生物のスペーサーなどの第2のスペーサー(SS2);を、構成要素が5’→3’方向に:SS1-ITR1-HPM-ITR2-SS2のとおりに互いに作動可能に連結されるように含む、核酸分子を特徴とする。
一態様において、核酸分子は、構成要素に対して5’→3’方向に:SS1-ITR1-PEuk-CS-ITR2-SS2のとおりに作動可能に連結された真核生物プロモーター(PEuk)をさらに含む。核酸分子の真核生物プロモーターは、組織特異的プロモーター(例えば、肝臓特異的プロモーター、筋特異的プロモーターまたは神経特異的プロモーター)または構成的プロモーター(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターまたはニワトリβアクチンプロモーター)であってもよい。
他の態様において、核酸分子は、阻害性RNA分子(例えば、小もしくは短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、小もしくは短干渉(si)RNA、トランススプライシングRNA、アンチセンスRNA、またはリボザイム)またはポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド分子を含む。別の態様において、核酸分子は、ポリペプチド(例えば、FVIII、FIXまたはGFP)をコードする異種ポリヌクレオチド分子を含み、および、核酸分子はさらに、構成要素に対して5’→3’方向に:SS1-ITR1-PEuk-HPM-pA-ITR2-SS2のとおりに作動可能に連結されたポリアデニル化部位(pA)(例えば、ヒトβグロビンポリアデニル化部位、SV40後期ポリアデニル化部位、SV40初期ポリアデニル化部位、またはウシ成長ホルモンポリアデニル化部位)を含む。
いくつかの態様において、第1のスペーサーまたは第2のスペーサーは、長さが100アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まない。例えば、第1のスペーサーまたは第2のスペーサーは、長さが50アミノ酸未満であるオープンリーディングフレームを含み得る。別の態様において、第1のスペーサーまたは第2のスペーサーは、原核生物の転写因子結合部位を含むDNAなどの、原核生物起源のDNAを含まない。他の態様において、第1のスペーサーまたは第2のスペーサーは、スペーサーの核酸配列全体の1%未満(例えば、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%または0.1%)である総CpG含有率を含む。本発明の第1のスペーサーまたは第2のスペーサーは、エンハンサーを含み得る。例えば、第1のスペーサーまたは第2のスペーサーは、組織特異的エンハンサー(例えば、肝臓特異的エンハンサー、筋特異的エンハンサーまたは神経特異的エンハンサー)である。例えば、第1のスペーサーまたは第2のスペーサーは、apoE/apoC1エンハンサーまたはapoCIIIエンハンサーを含む肝臓特異的エンハンサーであってもよい。
本発明の他の態様は、長さ約2.0Kb~約5.0Kb(例えば、長さ約2.5Kb~約4.5Kb;長さ約3.0Kb~約4.0Kb;または長さ約3.0Kb~約3.5Kb)の第1のスペーサーまたは第2のスペーサーを含む。いくつかの態様において、第1のスペーサーおよび第2のスペーサーは、合わせて長さ約4.0Kb~約10.0Kbの範囲であり得る(例えば、長さ約4.0Kb~約10.0Kb;長さ約5.0Kb~約9.0Kb;長さ約6.0Kb~約8.0Kb;または長さ約6.0Kb~約7.0Kb)。別の態様において、異種ポリヌクレオチド分子と第1のスペーサーまたは第2のスペーサーとを合わせた合計の長さは、長さ約5.0Kb~約10.0Kb(例えば、長さ約5.5Kb~長さ約9.5Kb;長さ約6.0Kb~長さ約9.0Kb;長さ約6.5Kb~長さ約8.5Kb;または長さ約7.0Kb~長さ約8.0Kb)である。また別の態様において、異種ポリヌクレオチド分子、第1のスペーサー、および第2のスペーサーを合わせた合計の長さは、長さ約10.0Kb~約15.0Kb(例えば、長さ約10.5Kb~長さ約14.5Kb;長さ約11.0Kb~長さ約14.0Kb;長さ約11.5Kb~長さ約13.5Kb;または長さ約12.0Kb~長さ約13.0Kb)である。
さらなる態様において、第1のスペーサーおよび/または第2のスペーサーは、1以上の(例えば、2、3、4または5の)クローニング部位に隣接している。
いくつかの態様において、ITR1および/またはITR2は、パルボウイルスITRである。例えば、パルボウイルスITRは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ITR(例えば、AAV血清型2のITR)である。
一態様において、本発明は、上記の核酸分子のいずれかを含んでなるベクターを特徴とする。本発明のベクターは、第1のスペーサーの5’側および/または第2のスペーサーの3’側に位置する選択可能マーカー遺伝子(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子)に対して作動可能に連結された原核生物プロモーターをさらに含んでもよい。別の態様において、ベクターは、第1のスペーサーの5’側および/または第2のスペーサーの3’側に位置する原核生物性の複製起点をさらに含んでもよい。ベクターは、環状であるかまたは直鎖状である核酸分子を含んでもよい。
第3の側面において、本発明は、ITR1、異種ポリヌクレオチド分子およびITR2を含む核酸分子を含む複数のウイルス粒子であって、ウイルス粒子の1%未満(例えば、0.75%、0.5%、0.25%または0.15%)が、コンタミナント核酸(例えば、原核生物性の核酸(例えば、複製起点、選択可能マーカー遺伝子、および/または、転写因子結合部位を含むプロモーター)および/またはコンタミナント核酸全体の2%を超えるCpG含有率を含む核酸)を含む核酸分子を含む、前記複数のウイルス粒子を特徴とする。
第4の側面において、本発明は、ITR1、異種ポリヌクレオチド分子およびITR2を含む核酸分子を含むウイルス粒子;第1のスペーサー、ITR1、異種ポリヌクレオチド分子およびITR2を含む核酸分子を含むウイルス粒子;ならびにITR1、異種ポリヌクレオチド分子、ITR2および第2のスペーサーを含む核酸分子を含むウイルス粒子を含む、複数のウイルス粒子を特徴とする。
第5の側面において、本発明は、ITR1および第1のスペーサーを含む核酸分子を含むウイルス粒子;ITR2および第2のスペーサーを含む核酸分子を含むウイルス粒子;ならびにITR1、異種ポリヌクレオチド分子およびITR2を含む核酸分子を含むウイルス粒子を含む、複数のウイルス粒子を特徴とする。
本発明はさらに、上記のベクターのいずれかを含む宿主細胞も含む。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。例えば、原核細胞が、細菌細胞(例えば、大腸菌細胞)であってもよい。別の態様においては、真核細胞が、哺乳動物細胞(例えば、HEK293細胞またはHeLa細胞)である。
第6の側面において、本発明は、複数のウイルス粒子を生産するための方法であって、培地中で上述のベクターのいずれかを含む宿主細胞を培養することを含む、前記方法を特徴とする。方法は、複数のウイルス粒子(例えば、AAV粒子)を培地から回収することをさらに含んでもよい。
発明の詳細な説明
A.定義
本明細書において使用する用語「クローニング部位」は、適合する付着または平滑末端を含む核酸のライゲーションによる制限エンドヌクレアーゼ介在クローニングのための制限部位、相同および伸長「オーバーラップPCRスティッチング(overlap PCR stitching)」によるインサートDNAのPCRによるクローニングのためのプライミング部位として働く核酸の領域、または組換え交換反応による標的核酸のリコンビナーゼによる挿入のための組換え部位、または標的核酸のトランスポゾン介在挿入のためのモザイク末端、ならびに当該技術分野でよく知られている他の手法のもの、を含む核酸配列をいう。
A.定義
本明細書において使用する用語「クローニング部位」は、適合する付着または平滑末端を含む核酸のライゲーションによる制限エンドヌクレアーゼ介在クローニングのための制限部位、相同および伸長「オーバーラップPCRスティッチング(overlap PCR stitching)」によるインサートDNAのPCRによるクローニングのためのプライミング部位として働く核酸の領域、または組換え交換反応による標的核酸のリコンビナーゼによる挿入のための組換え部位、または標的核酸のトランスポゾン介在挿入のためのモザイク末端、ならびに当該技術分野でよく知られている他の手法のもの、を含む核酸配列をいう。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」は、交換可能に使用され、その中に外来核酸が導入された1以上の細胞(かかる細胞の子孫を含む)をいう。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これには一次形質転換細胞、および、経路の数に関わらずそれから誘導された子孫が含まれる。
本明細書において使用される「連結される」または「連結する」または「連結」は、2つの核酸がリン酸ジエステル結合を通じて一緒になった共有結合的な繋がりをいうことを意味する。かかる繋がりには、繋げられた2つの核酸の間に、あらゆる数の追加の核酸を含めることができる。
本明細書において交換可能に使用される「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体をいい、DNAおよびRNAが含まれる。
用語「異種ポリヌクレオチド」および「異種核酸」は、本明細書において交換可能に使用され、ウイルスにおいて天然には生じない核酸分子をいう。
核酸は、別の核酸と構造的または機能的な関係に置かれている場合、「作動可能に連結され」ている。例えば、DNAの1つのセグメントは、DNAの別のセグメントと互いに関連して、連続的な同じDNA分子上に配置され、かつ、構造的または機能的な関係を有する場合、例えば、コード領域の転写を容易にするようにコード領域に関連して位置するプロモーターまたはエンハンサーなどである場合、DNAの別のセグメントに対して作動可能に連結されているといってもよい。他の例において、作動可能に連結された核酸は、連続的ではないが、核酸としてまたはそれらによって発現されるタンパク質としてそれらが互いに機能的な関係を有するように位置させられている。エンハンサーは、例えば、連続的である必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより、または合成オリゴヌクレオチドアダプターもしくはリンカーを使用することにより、成し遂げられてもよい。
用語「ポリアデニル化シグナル」または「ポリアデニル化部位」は、本明細書において、細胞内で発現したRNA分子へのポリアデノシンリボ核酸の付加を指示するのに十分な核酸配列を意味することに使用される。
「プロモーター」は、メッセンジャーRNAにおける遺伝子の転写開始を可能にする核酸であり、かかる転写は、プロモーター上またはプロモーター近くのRNAポリメラーゼの結合で開始される。
「ITR」は、パリンドローム核酸、例えば、逆位末端反復配列であり、長さ約120ヌクレオチド~約250ヌクレオチドでありヘアピンを形成することができるものである。用語「ITR」には、パルボウイルスタンパク質(例えば、Rep78/68)が認識して結合することができるウイルスゲノム複製の部位が含まれる。ITRは、いかなるアデノ随伴ウイルス(AAV)からのものであってもよく、血清型2が好ましい。ITRは、複製タンパク質結合エレメント(RBE)および末端分解配列(TRS)を含む。用語「ITR」は、ITRがウイルスのパッケージング、複製、統合および/またはプロウイルスのレスキューなどを仲介するために機能する限りにおいて、野生型パルボウイルスITRである必要はない(例えば、野生型核酸配列が、挿入、欠失、短縮化またはミスセンス変異によって変更されていてもよい)。用語「5’ITR」は、核酸分子の5’境界(5’ boundary)に位置するパルボウイルスITRを意味することを意図し;用語「3’ITR」は、核酸分子の3’境界に位置するパルボウイルスITRを意味することを意図する。
基準ポリヌクレオチド配列に対する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、配列をアラインメントし、必要であれば最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後で、基準ポリヌクレオチド配列中の核酸と同一である、候補配列中の核酸のパーセントとして定義され、保存的置換は配列同一性の一部として考慮しない。パーセント核酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当技術分野の範囲内にある種々の方法、例として、BLAST、BLAST-2またはMegalign(DNASTAR)ソフトウエアなどの、公に利用可能なコンピュータソフトウエアによって達成することができる。当業者は、配列をアラインメントするために、比較する配列の完全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要なあらゆるアルゴリズムを含めた、適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、%核酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムBLASTを使用して生成される。所与の核酸配列Aの、所与の核酸配列Bへの、それとの、またはそれに対する%核酸配列同一性(これに代えて、所与の核酸酸配列Bへの、それとの、またはそれに対するある特定の%核酸配列同一性を有するか、または含んでなる所与の核酸配列Aとして言い表すこともできる)は、以下のように計算される:
100×分数X/Y
式中、Xは、配列アラインメントプログラムBLASTにより、AおよびBのそのプログラムのアラインメントにおいて同一性マッチとしてスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Yは、Bにおける核酸の総数である。核酸配列Aの長さが核酸配列Bの長さと同等でない場合、BへのAの%核酸配列同一性は、AへのBの%核酸配列同一性と同等でないことが認められるであろう。
100×分数X/Y
式中、Xは、配列アラインメントプログラムBLASTにより、AおよびBのそのプログラムのアラインメントにおいて同一性マッチとしてスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Yは、Bにおける核酸の総数である。核酸配列Aの長さが核酸配列Bの長さと同等でない場合、BへのAの%核酸配列同一性は、AへのBの%核酸配列同一性と同等でないことが認められるであろう。
本明細書において使用される「キャプシドタンパク質」は、AAVウイルス粒子の構成要素であるいずれかのAAVキャプシドタンパク質をいい、AAV8およびAAV9がこれに含まれる。
「スペーサー」は、100アミノ酸未満のオープンリーディングフレーム(ORF)を含む少なくとも長さ2.0Kbのポリペプチドであって;核酸配列全体の1%未満であるCpG含有率を有するものであるか;または、転写因子(TF)結合部位(例えば、原核生物の転写因子によって認識される部位)を含まないものである、あらゆるポリペプチドである。用語「スペーサー」は、原核生物起源の核酸を含まない。スペーサーは、天然供給源から単離されてもよいし、または、例えばORFのサイズ、CpG含有率もしくは転写因子結合部位の数を低減させるために、改変されてもよい。スペーサーは、ポリヌクレオチドの発現を促進する天然の核酸から選択されてもよく、例えば、転写開始点の近くに見出されるエンハンサーであってもよい。本明細書において定義された「スペーサー」の使用は、ウイルス粒子中にパッケージングされる夾雑核酸の低減をもたらす。
「X%のCpG含有率」は、XがCpGジヌクレオチドの数を表す場合に、100のヌクレオチドに対してXのCpGジヌクレオチドを示すポリヌクレオチドをいう。(Gardiner-Garden and Frommer, J. Mol. Biol., 196: 261-282 (1987)。「CpG部位」とは、長さ方向に沿ってヌクレオチドの直鎖状核酸配列においてシトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドの隣に現れるDNAの領域、例えば、-C-リン酸-G-、リン酸1つのみによって隔てられたシトシンとグアニン、または、グアニンヌクレオチドの5’側にあるシトシン、を意味する。
用語「コンタミナント」または「夾雑」核酸は、起源が原核生物性である(例えば、原核生物性の転写産物またはそのフラグメント、転写因子結合部位またはプロモーターエレメントを含む)か;2%を超えるCpG含有率を含むか;または選択可能マーカー遺伝子である、核酸をいう。例えば、「コンタミナント」または「夾雑」核酸には、細菌性複製起点、細菌性選択可能マーカー遺伝子、細菌性抗生物質抵抗性遺伝子、および、転写因子結合部位を含む細菌性プロモーターが含まれる。
本明細書において使用される用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子をいうことを意図する。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらなるDNAのセグメントがその中にライゲーションされ得る環状二本鎖DNAのループをいう。ベクターの別のタイプは、さらなるDNAのセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞中において自律的複製を可能とする(例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター)は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノム中に統合されることができ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。あるベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指揮することを可能とする。
本明細書において使用される用語「パルボウイルス」は、自律的に複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルス(dependovirus)を含むパルボウイルス科を包含する。自律性パルボウイルス(autonomous parvovirus)には、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属およびコントラウイルス属(Contravirus)のメンバーが含まれる。例示の自律性パルボウイルスには、これに限定はされないが、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、H1パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、ヘビパルボウイルス、およびB19ウイルスが含まれる。他の自律性パルボウイルスは、当業者に知られている。例えば、Fields et al. Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照。ディペンドウイルス属は、アデノ随伴ウイルス(AAV)を含み、それには、これに限定はされないが、AAV1型、AAV2型、AAV3型(3A型および3B型を含む)、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型、AAV10型、AAV11型、AAV12型、AAV13型、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ヤギAAV、ヘビAAV、ウマAAVおよびヒツジAAVが含まれる。例えば、Fields et al. Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照。
本明細書において使用する用語「アデノ随伴ウイルス」(AAV)には、これに限定はされないが、AAV1型、AAV2型、AAV3型(3A型および3B型を含む)、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型、AAV10型、AAV11型、AAV12型、AAV13型、ヘビAAV、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAV、ヤギAAV、エビAAV、および、あらゆる他の現在知られているかまたは後に発見されるAAVが含まれる。例えば、Fields et al. Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)を参照。さらなるAAV血清型およびクレードも、最近同定されている(例えば、Gao et al. (2004) J. Virol. 78:6381;Moris et al. (2004) Virol. 33: 375-383を参照)。種々の血清型のAAVのゲノム配列、ならびに天然のITR、Repタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は当技術分野において知られている。かかる配列は、文献において、またはGenBankなどの公共のデータベースに見出され得る。例えば、GenBankアクセッション番号NC-002077、NC-001401、NC-001729、NC-001863、NC-001829、NC-001862、NC-000883、NC-001701、NC-001510、NC-006152、NC-006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、AY631966、AX753250、EU285562、NC-001358、NC-001540、AF513851、AF513852およびAY530579を参照;これらの開示は、AAV核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために本明細書に参照によって組み込まれる。また、例えば、Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virol. 73: 939;Chiorini et al. (1997) J. Virol. 71:6823;Chiorini et al. (1999) J. Virol. 73:1309;Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854;Moris et al. (2004) Virol. 33: 375;Muramatsu et al, (1996) Virol. 221:208;Ruffing et al. (1994) J. Gen. Virol. 75:3385;Rutledge et al. (1998) J. Virol. 72:309;Schmidt et al. (2008) J. Virol. 82:8911;Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921;Srivastava et al. (1983) J. Virol, 45:555;Xiao et al. (1999) J. Virol. 73:3994;国際公開WO00/28061、WO99/61601、WO98/11244;および米国特許第6,156,303号も参照;これらの開示は、AAV核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために本明細書に参照によって組み込まれる。
B.核酸分子
ウイルス複製機構は、ウイルスゲノムをコードする核酸分子の複製およびパッケージングの間に、逆位末端反復配列(ITR)で核酸分子の合成を開始させ、核酸分子のウイルス粒子への組み込みを促進させる。いくつかの事例において、隣在するコンタミナント核酸(例えば、原核生物性の複製起点、原核生物プロモーターおよび/または抗生物質抵抗性遺伝子)がウイルス粒子中へと組み込まれ、哺乳動物の宿主細胞に形質導入された場合に、望ましくない影響を生じる可能性がある。この発明は、少なくとも部分的には、核酸分子のITRに隣接する2つのスペーサーの組み入れによって不慮のコンタミナント核酸のパッケージングが低減されるという発見に基づく。ここで我々は、夾雑核酸を含むウイルス粒子の数を低減させるためのウイルスベクターまたはウイルス粒子中に組み込むことができる2つのスペーサーを有する複数の核酸分子の生成について記載する。本発明に必要な核酸構成要素、ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、およびウイルス粒子を生産する方法は、本明細書に記載されている。
ウイルス複製機構は、ウイルスゲノムをコードする核酸分子の複製およびパッケージングの間に、逆位末端反復配列(ITR)で核酸分子の合成を開始させ、核酸分子のウイルス粒子への組み込みを促進させる。いくつかの事例において、隣在するコンタミナント核酸(例えば、原核生物性の複製起点、原核生物プロモーターおよび/または抗生物質抵抗性遺伝子)がウイルス粒子中へと組み込まれ、哺乳動物の宿主細胞に形質導入された場合に、望ましくない影響を生じる可能性がある。この発明は、少なくとも部分的には、核酸分子のITRに隣接する2つのスペーサーの組み入れによって不慮のコンタミナント核酸のパッケージングが低減されるという発見に基づく。ここで我々は、夾雑核酸を含むウイルス粒子の数を低減させるためのウイルスベクターまたはウイルス粒子中に組み込むことができる2つのスペーサーを有する複数の核酸分子の生成について記載する。本発明に必要な核酸構成要素、ベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、およびウイルス粒子を生産する方法は、本明細書に記載されている。
本発明の実施は、他に表示していない限り、当分野の技術の範囲内にある、分子生物学(組み換え手法を含む)、微生物学、ウイルス学および細胞生物学の従来の手法を採用する。
本発明は、ウイルスゲノムのITRに連結された2つのスペーサーの柔軟なモジュール式の組み入れを可能にする核酸分子を生成する手段を提供する。第1の核酸分子は、5’→3’方向に:SS1-ITR1-CS-ITR2-SS2のとおりに互いに作動可能に連結されている第1のスペーサー(SS1)、第1の逆位末端反復配列(ITR1)、クローニング部位(CS)、第2の逆位末端反復配列(ITR2)および第2のスペーサー(SS2)を含む。第1の核酸分子を、クローニング部位で制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼでの核酸分子の切断によって改変することができる。続いて、異種ポリヌクレオチド分子(HPM)、真核生物プロモーター(PEUK)および/またはポリアデニル化部位(pA)を、核酸分子中のクローニング部位へと導入することができる。以下の節では、本発明の核酸分子中で使用され得るスペーサー、異種ポリヌクレオチド分子、真核生物プロモーターおよびポリアデニル化部位の非限定例を提供する。
スペーサー
本発明のスペーサーは、天然の核酸分子または合成核酸分子を含むことができる。天然のスペーサー分子は、オンラインのウェブツール、例えば、UCSCゲノムブラウザなどを使用して同定することができ、および、核酸分子に元々備わっている特徴、例えば、転写開始点に隣在する核酸の自然な出現などに基づいて選択することができる。スペーサーは、ウイルス粒子によって導入された場合に毒性を生じ得るかまたはウイルス粒子の機能性を抑制し得るような潜在的なマイナスの特徴を取り除くように、設計してもよい。例示の毒性源および機能性を抑制する特徴の発生源は、パッケージされるべきウイルスゲノムをコードする核酸に隣在してしばしば見出される夾雑核酸に、見出される。これらの夾雑核酸には、これに限定はされないが、原核生物の(例えば、細菌の)核酸(例えば、複製起点、2%を超えるCpG含有率を有する核酸、オープンリーディングフレームおよび転写因子結合部位)が含まれる。本発明のスペーサーは、夾雑核酸の組み入れを最小限にするようにデザインされ得る。
本発明のスペーサーは、天然の核酸分子または合成核酸分子を含むことができる。天然のスペーサー分子は、オンラインのウェブツール、例えば、UCSCゲノムブラウザなどを使用して同定することができ、および、核酸分子に元々備わっている特徴、例えば、転写開始点に隣在する核酸の自然な出現などに基づいて選択することができる。スペーサーは、ウイルス粒子によって導入された場合に毒性を生じ得るかまたはウイルス粒子の機能性を抑制し得るような潜在的なマイナスの特徴を取り除くように、設計してもよい。例示の毒性源および機能性を抑制する特徴の発生源は、パッケージされるべきウイルスゲノムをコードする核酸に隣在してしばしば見出される夾雑核酸に、見出される。これらの夾雑核酸には、これに限定はされないが、原核生物の(例えば、細菌の)核酸(例えば、複製起点、2%を超えるCpG含有率を有する核酸、オープンリーディングフレームおよび転写因子結合部位)が含まれる。本発明のスペーサーは、夾雑核酸の組み入れを最小限にするようにデザインされ得る。
例えば、一態様において、スペーサーは、長さが約100アミノ酸を超えるオープンリーディングフレーム(ORF)を含まない。別の態様において、スペーサーは、長さが約50アミノ酸未満であるORFを含む。例えば、スペーサーは、長さが5アミノ酸未満;長さが10アミノ酸未満;長さが15アミノ酸未満;長さが20アミノ酸未満;長さが25アミノ酸未満;長さが30アミノ酸未満;長さが35アミノ酸未満;長さが40アミノ酸未満;長さが45アミノ酸未満;長さが50アミノ酸未満;長さが55アミノ酸未満;長さが60アミノ酸未満;長さが65アミノ酸未満;長さが70アミノ酸未満;長さが75アミノ酸未満;長さが80アミノ酸未満;長さが85アミノ酸未満;長さが90アミノ酸未満;長さが95アミノ酸未満;または長さが100アミノ酸未満であるORFを含むことができる。ORFは、オンラインの核酸配列解析ツール、例えばBLASTまたはUCSCゲノムブラウザを使用して決定することができる。
他の態様において、スペーサーは、スペーサー核酸配列全体の1%未満である総CpG含有率(例えば、スペーサー核酸配列全体の0.5%未満のCpG含有率、0.2%未満のCpG含有率;0.05%未満のCpG含有率;または0.02%未満のCpG含有率)を有する。いくつかの態様においてスペーサーは、スペーサー核酸の長さにわたって2%より大きいCpG含有率を含まない。例えば、3.0Kbの長さを有するスペーサーについては、スペーサー核酸中におけるCpGジヌクレオチドの総数は、60CpGジヌクレオチドを越えないものであり得、好ましくは、30CpGジヌクレオチド未満である。
別の態様において、スペーサーは、起源が原核生物性であるコンタミナント核酸を含まない。例えば、スペーサーは、原核生物の転写因子のための転写因子結合部位、または原核生物の複製機構によって認識される複製起点を提供する、原核生物性の核酸を含まない。スペーサーは、さらに、原核生物において発現されることができる選択可能マーカー、例えば抗生物質抵抗性遺伝子を含まない。
他の態様において、スペーサーは、エンハンサーである。例えば、スペーサーは、組織特異的エンハンサーまたは普遍的に発現されるエンハンサーである。一態様において、スペーサーは、組織特異的エンハンサー、例えば、筋特異的(心筋特異的、骨格筋特異的および/または平滑筋特異的を含む)、神経組織特異的(脳特異的を含む)、眼に特異的(網膜特異的および角膜特異的を含む)、肝臓特異的、骨髄特異的、膵臓特異的、脾臓特異的、および肺特異的エンハンサーエレメントである。別の態様において、スペーサーは、肝臓特異的エンハンサー、例えば、apoE/apoC1またはapoCIIIエンハンサーである。
本発明のスペーサーは、コンタミナント核酸のパッケージングを減少させるかまたは防止することに適切な長さのものである。例えば、スペーサー(例えば、SS1またはSS2)は、長さ約2.0Kb~約5.0Kb;長さ約2.5Kb~約4.5Kb;長さ約3.0Kb~約4.0Kb;または長さ約3.0Kb~約3.5Kbの範囲であり得る。第1のスペーサーおよび第2のスペーサーの長さは、同等であり得る(例えば、SS1が長さ約3.0Kbであり、SS2が長さ約3.0Kbである)か、または異なり得る(例えば、SS1が長さ約4.0Kbであり、SS2が長さ約5.0Kbである)。第1のスペーサーおよび第2のスペーサーの長さは、ベクターに応じて異なり得る。第1のスペーサーおよび第2のスペーサーを合わせた合計の長さは、長さ約4.0Kb~約10.0Kbの範囲であり得る。例えば、第1のスペーサーおよび第2のスペーサーは、合わせて、長さ約4.0Kb~約10.0Kb;長さ約5.0Kb~約9.0Kb;長さ約6.0Kb~約8.0Kb;または長さ約6.0Kb~約7.0Kbの範囲の範囲であり得る。
スペーサーの長さはさらに、ITR1とITR2との間に挿入される所望の核酸分子のサイズに対応して選択され得る。例えば、AAV粒子は、約4.7Kbの核酸分子のためのパッケージング能力を有する。AAV粒子にパッケージングされる核酸分子中に、長さ約3.0Kbの所望の異種ポリヌクレオチドが挿入される場合、第1のスペーサーおよび/または第2のスペーサーは、長さ約2.0Kbであり得る。したがって、異種ポリヌクレオチドと第1のスペーサーまたは第2のスペーサーとは、合わせて長さ約5.0Kbの長さを有するであろう。本発明のスペーサー分子については、第1のスペーサーまたは第2のスペーサーは、異種ポリヌクレオチドと合わせて長さ約5.0Kb~長さ約10.0Kb;長さ約5.5Kb~長さ約9.5Kb;長さ約6.0Kb~長さ約9.0Kb;長さ約6.5Kb~長さ約8.5Kb;または長さ約7.0Kb~長さ約8.0Kbであり得る。第1のスペーサー、第2のスペーサー、および異種ポリヌクレオチドは、合わせて長さ約10.0Kb~長さ約15.0Kb;長さ約10.5Kb~長さ約14.5Kb;長さ約11.0Kb~長さ約14.0Kb;長さ約11.5Kb~約13.5Kb;または長さ約12.0Kb~約13.0Kbであり得る。
クローニング部位
クローニング部位は、核酸分子中の個々の構成要素の即時の除去および/または置換を可能にする。クローニング部位は、制限部位を認識するエンドヌクレアーゼによって切断される制限部位を含む。例えば、1以上の(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10の)クローニング部位は、第1のスペーサー、第2のスペーサー、第1のITR、第2のITR、真核生物プロモーター、異種ポリヌクレオチド、および/またはポリアデニル化部位に隣接してもよい。エンドヌクレアーゼによるクローニング部位の切断の後で、所望の核酸分子が挿入された際にクローニング部位が失われてもよい。所望の核酸分子を構築するのに使用するための好適な制限エンドヌクレアーゼは、文献における、またはREBASE(商標)データベースなどの種々のオンラインデータベースにおける、当業者に容易に入手可能な情報を使用して同定され得る。好適な制限エンドヌクレアーゼには、例えば、中でもとりわけ、New England Biolabs, LifeTechnologies, Roche, Clontech, Stratagene, Amersham, Pharmaciaを含む、種々の商業的な入手源から入手可能なものが含まれる。
クローニング部位は、核酸分子中の個々の構成要素の即時の除去および/または置換を可能にする。クローニング部位は、制限部位を認識するエンドヌクレアーゼによって切断される制限部位を含む。例えば、1以上の(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10の)クローニング部位は、第1のスペーサー、第2のスペーサー、第1のITR、第2のITR、真核生物プロモーター、異種ポリヌクレオチド、および/またはポリアデニル化部位に隣接してもよい。エンドヌクレアーゼによるクローニング部位の切断の後で、所望の核酸分子が挿入された際にクローニング部位が失われてもよい。所望の核酸分子を構築するのに使用するための好適な制限エンドヌクレアーゼは、文献における、またはREBASE(商標)データベースなどの種々のオンラインデータベースにおける、当業者に容易に入手可能な情報を使用して同定され得る。好適な制限エンドヌクレアーゼには、例えば、中でもとりわけ、New England Biolabs, LifeTechnologies, Roche, Clontech, Stratagene, Amersham, Pharmaciaを含む、種々の商業的な入手源から入手可能なものが含まれる。
異種ポリヌクレオチド分子
核酸分子は、制限エンドヌクレアーゼによって制限部位で切断され得、続いて核酸分子の末端を異種ポリヌクレオチド分子(HPM)にライゲーションさせ得る。これにより、本発明の核酸分子は、5’→3’方向にSS1-ITR1-HPM-ITR2-SS2のとおりに互いに作動可能に連結された上記構成要素を含み得る。
核酸分子は、制限エンドヌクレアーゼによって制限部位で切断され得、続いて核酸分子の末端を異種ポリヌクレオチド分子(HPM)にライゲーションさせ得る。これにより、本発明の核酸分子は、5’→3’方向にSS1-ITR1-HPM-ITR2-SS2のとおりに互いに作動可能に連結された上記構成要素を含み得る。
本発明の異種ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、阻害性ポリヌクレオチドに転写されるポリヌクレオチド、または転写されないポリヌクレオチドを含んでもよい。例えば、ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド分子は、これに限定はされないが:第VIII因子(FVIII);第IX因子(FIX);または緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む。
異種ポリヌクレオチドはまた、阻害性ポリヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNAをコードしてもよい。阻害性RNAの発現は、例えば、特定の標的遺伝子および/またはポリペプチドの発現を弱めることができる。阻害性RNA分子は、小もしくは短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、小もしくは短干渉(si)RNA、トランススプライシングRNA、アンチセンスRNA、またはリボザイムを含んでもよい。異種ポリヌクレオチドはまた、転写されないポリヌクレオチド、例えば、プロモーターを欠いたポリヌクレオチドをもコードしてもよい。
上記異種ポリヌクレオチドのいずれかが、天然および非天然のバリアント、例えば、機能獲得型および機能欠損型バリアントをもまた含んでもよい。異種ポリヌクレオチドの核酸配列は、天然のバリアントをコードしてもよく、または、核酸配列は、基準核酸配列と比べて実質的に同じか、それより大きいか、または小さい活性もしくは機能を有し得るが少なくとも基準核酸配列の部分的な活性又は機能を保持する非天然のバリアントを生じるために、改変されてもよい。例えば、ヒトFIXのバリアントをコードする異種ポリヌクレオチドが、バリアント化の結果として、内因性の活性を保持するかまたは増強された治療的効果を提供してもよい。
改変の非限定例には、基準核酸配列の、1以上の核酸置換(例えば、1~3、3~5、5~10、10~15、15~20、20~25、25~30、30~40、40~50、50~100、またはそれ以上の核酸の)、付加(例えば、1~3、3~5、5~10、10~15、15~20、20~25、25~30、30~40、40~50、50~100、またはそれ以上の核酸の挿入)、および欠失(例えば、部分配列またはフラグメントの)が含まれる。特定の態様において、改変またはバリアント異種ポリヌクレオチドは、未改変異種ポリヌクレオチドの機能または活性の少なくとも一部を保持する。改変異種ポリヌクレオチドおよびそれに続くバリアントは、基準の異種ポリヌクレオチド、例えば、本明細書において記載されているとおりのものと比べて、小さいか、同じであるか、またはそれより大きい活性もしくは機能を有し得るが、少なくとも基準の異種ポリヌクレオチドの部分的な活性又は機能を有する。
天然または非天然のバリアント異種ポリヌクレオチドの核酸配列は、例えば、基準核酸配列に対して少なくとも約50%の配列同一性、約70%の配列同一性、約80%の配列同一性、約90%の配列同一性、または約95%の配列同一性を有する。ポリヌクレオチド中にヌクレオチドの変化を導入する方法は、当技術分野で知られている(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2007)を参照)。
HPMはまた、Kozak配列、イントロン、および/または内部リボソーム侵入部位(IRES)を含むようにさらに改変されてもよい。
真核生物プロモーターおよびポリアデニル化部位
核酸分子のHPMは、宿主細胞におけるHPMの発現を促進するための真核生物プロモーター(PEuk)(例えば、組織特異的プロモーターまたは普遍的に活性なプロモーター)に対して作動可能に連結されていてもよい。PEukは、HPMと別々に、または組み合わせられて、核酸分子中のCSへと挿入されてもよい。これにより、核酸分子は、5’→3’方向にSS1-ITR1-PEuk-HPM-ITR2-SS2のとおりに互いに連結された(例えば、作動可能に連結された)上記構成要素を含み得る。
核酸分子のHPMは、宿主細胞におけるHPMの発現を促進するための真核生物プロモーター(PEuk)(例えば、組織特異的プロモーターまたは普遍的に活性なプロモーター)に対して作動可能に連結されていてもよい。PEukは、HPMと別々に、または組み合わせられて、核酸分子中のCSへと挿入されてもよい。これにより、核酸分子は、5’→3’方向にSS1-ITR1-PEuk-HPM-ITR2-SS2のとおりに互いに連結された(例えば、作動可能に連結された)上記構成要素を含み得る。
いくつかの事例において、PEukは、特定の細胞または組織において活性である(例えば、中でもとりわけ、肝臓、脳、中枢神経系、脊髄、眼、網膜、骨、筋肉、肺、膵臓、心臓または腎臓の細胞において活性である)組織特異的プロモーターである。事例として、骨格筋における発現が望まれる場合、筋肉において活性なPEukが使用され得る。例示の骨格筋プロモーターには、デスミン、骨格α-アクチン、ミオシン軽鎖2A、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子からのもの、ならびに天然のプロモーターよりも高い活性をもつ合成の筋プロモーターが含まれる(例えば、Li, et al., Nat. Biotech. 17:241-245 (1999)を参照)。肝臓特異的に発現するPEukの例は、アルブミン、Miyatake, et al. Virol., 71:5124-32 (1997);B型肝炎ウィルスコアプロモーター、Sandig, et al., Gene Ther. 3:1002-9 (1996);α-フェトプロテイン(AFP)、Arbuthnot, et al., Hum. Gene. Ther., 7: 1503-14 (1996);およびアポリポタンパク質E(ApoE)、Okuyama, et al., Hum. Gene Ther., 7: 637-645 (1996)である。骨特異的に発現するPEukの例は、オステオカルシン、Stein, et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997);および骨シアロタンパク質、Chen, et al., Bone Miner. Res., 11 :654-64 (1996)である。リンパ球特異的に発現するPEukの例は、CD2、Hansal, et al., Immunol., 161:1063-8 (1998);免疫グロブリン重鎖;およびT細胞受容体α鎖である。神経特異的に発現するPEukの例は、中でもとりわけ、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター、Andersen, et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993);ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Piccioli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5615 (1991);ニューロン特異的vgf遺伝子、Piccioli, et al., Neuron, 15:373-384 (1995);およびシナプシン1(Syn1)、Kugler, et al., Gene Ther., 10: 337-347 (2003)である。
いくつかの事例において、PEukは、多種多様な細胞タイプにおいてポリヌクレオチドの発現を駆動することを可能とする普遍的に活性なプロモーター/エンハンサーである。例示の普遍的に活性なPEukには、これに限定はされないが、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター/エンハンサー;ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター/エンハンサー;および種々の哺乳動物細胞タイプにおいて活性な他のウイルスプロモーター/エンハンサー、または自然に存在しない合成のエレメント(例えば、Boshart et al, Cell, 41 :521-530 (1985)を参照);SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター;ニワトリβアクチンプロモーター;およびホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーターが含まれる。異種ポリヌクレオチドが阻害性RNA分子をコードする態様において、PEUKには、Pol IIIプロモーター(例えば、U6プロモーターまたはH1プロモーター)が含まれ得る。
PEukが、ポリペプチドをコードするHPMと組み合わせられている場合、核酸分子は、ポリアデニル化部位(pA)をさらに含み得る。これにより、核酸分子は、5’→3’方向にSS1-ITR1-PEuk-HPM-pA-ITR2-SS2のとおりに互いに連結された(例えば、作動可能に連結された)上記構成要素を含み得る。pAは、ヒトβグロビンポリアデニル化部位、SV40後期ポリアデニル化部位、SV40初期ポリアデニル化部位、またはウシ成長ホルモンポリアデニル化部位を含み得る。
C.ベクター、宿主細胞、および生産方法
ベクター
本発明は、上記の核酸分子のいずれかを含むベクターを特徴とする。上で詳細に記載された核酸分子の構成要素に加えて、ベクターは、クローニング部位、細菌性または哺乳動物の複製起点、細菌性プロモーターエレメント、および/または、選択のマーカーとして有用なポリペプチドをコードする核酸(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子)を含んでもよい。抗生物質抵抗性遺伝子には、これに限定はされないが、カナマイシン、アンピシリン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンB、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールが含まれ得る。選択可能マーカー遺伝子は、細菌転写因子結合部位を含むプロモーターから発現され得る。プロモーターおよび選択可能マーカーは、5’→3’方向に作動可能に連結されており、第1のスペーサーの5’側(上流側)および/または第2のスペーサーの3’側(下流側)に位置していてもよい。複製起点もまた、第1のスペーサーの5’側(上流側)および/または第2のスペーサーの3’側(下流側)に位置していてもよい。本発明のベクターには、ウイルス粒子中へとパッケージングすることができる核酸分子を含むウイルスベクターが含まれ得る。ベクターは、環状(例えば、プラスミド)であるかまたは直線状であり得る。
ベクター
本発明は、上記の核酸分子のいずれかを含むベクターを特徴とする。上で詳細に記載された核酸分子の構成要素に加えて、ベクターは、クローニング部位、細菌性または哺乳動物の複製起点、細菌性プロモーターエレメント、および/または、選択のマーカーとして有用なポリペプチドをコードする核酸(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子)を含んでもよい。抗生物質抵抗性遺伝子には、これに限定はされないが、カナマイシン、アンピシリン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンB、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールが含まれ得る。選択可能マーカー遺伝子は、細菌転写因子結合部位を含むプロモーターから発現され得る。プロモーターおよび選択可能マーカーは、5’→3’方向に作動可能に連結されており、第1のスペーサーの5’側(上流側)および/または第2のスペーサーの3’側(下流側)に位置していてもよい。複製起点もまた、第1のスペーサーの5’側(上流側)および/または第2のスペーサーの3’側(下流側)に位置していてもよい。本発明のベクターには、ウイルス粒子中へとパッケージングすることができる核酸分子を含むウイルスベクターが含まれ得る。ベクターは、環状(例えば、プラスミド)であるかまたは直線状であり得る。
ウイルス粒子
本発明のウイルス粒子は、感染粒子中にキャプシド化された上述の核酸分子のいずれかを含む。本発明の核酸分子は、核酸分子の第1および第2のITR(ITR1およびITR2)に隣接する第1のスペーサーおよび第2のスペーサー(SS1およびSS2)を含み、これはスペーサー分子のパッケージングという結果をもたらし得る。例えば、複数のウイルス粒子において、いくつかのウイルス粒子は、第1のスペーサー(SS1)および第1のITR(ITR1)を有する核酸分子を含み;いくつかのウイルス粒子は、第2のスペーサー(SS2)および第2のITR(ITR2)を有する核酸分子を含み;いくつかのウイルス粒子は、ITR1、異種ポリヌクレオチドおよびITR2を含み;いくつかのウイルス粒子は、第1のスペーサー(SS1)、ITR1、異種ポリヌクレオチドおよびITR2を含み;およびいくつかのウイルス粒子は、ITR1、異種ポリヌクレオチド、ITR2および第2のスペーサー(SS2)を含む。核酸分子中における第1のスペーサーおよび第2のスペーサーの組み入れは、核酸分子を含むベクター中に存在するさらなる夾雑核酸(例えば、原核生物性の核酸、選択可能マーカー、または2%よりも大きいCpG含有率を有する核酸)の組み入れを最小限にすることに役立つ。例えば、ITR1、異種ポリヌクレオチドおよびITR2を有する核酸を含んでなる複数のウイルス粒子においては、複数のウイルス粒子の1%未満(例えば、0.95%、0.9%、0.85%、0.8%、0.75%、0.7%、0.65%、0.6%、0.55%、0.5%、0.45%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2%、0.15%または0.1%)が、選択可能マーカー(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子)、2%を超えるCpG含有率を有する核酸、および/または原核生物性の核酸(例えば、複製起点、転写因子結合部位および/またはオープンリーディングフレーム)を含む夾雑核酸を含む。
本発明のウイルス粒子は、感染粒子中にキャプシド化された上述の核酸分子のいずれかを含む。本発明の核酸分子は、核酸分子の第1および第2のITR(ITR1およびITR2)に隣接する第1のスペーサーおよび第2のスペーサー(SS1およびSS2)を含み、これはスペーサー分子のパッケージングという結果をもたらし得る。例えば、複数のウイルス粒子において、いくつかのウイルス粒子は、第1のスペーサー(SS1)および第1のITR(ITR1)を有する核酸分子を含み;いくつかのウイルス粒子は、第2のスペーサー(SS2)および第2のITR(ITR2)を有する核酸分子を含み;いくつかのウイルス粒子は、ITR1、異種ポリヌクレオチドおよびITR2を含み;いくつかのウイルス粒子は、第1のスペーサー(SS1)、ITR1、異種ポリヌクレオチドおよびITR2を含み;およびいくつかのウイルス粒子は、ITR1、異種ポリヌクレオチド、ITR2および第2のスペーサー(SS2)を含む。核酸分子中における第1のスペーサーおよび第2のスペーサーの組み入れは、核酸分子を含むベクター中に存在するさらなる夾雑核酸(例えば、原核生物性の核酸、選択可能マーカー、または2%よりも大きいCpG含有率を有する核酸)の組み入れを最小限にすることに役立つ。例えば、ITR1、異種ポリヌクレオチドおよびITR2を有する核酸を含んでなる複数のウイルス粒子においては、複数のウイルス粒子の1%未満(例えば、0.95%、0.9%、0.85%、0.8%、0.75%、0.7%、0.65%、0.6%、0.55%、0.5%、0.45%、0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2%、0.15%または0.1%)が、選択可能マーカー(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子)、2%を超えるCpG含有率を有する核酸、および/または原核生物性の核酸(例えば、複製起点、転写因子結合部位および/またはオープンリーディングフレーム)を含む夾雑核酸を含む。
ウイルス粒子を生産する方法
複数のウイルス粒子を生産する方法は、本明細書において記載されているベクターのいずれかを使用して行われ得る。手短にいうと、ベクターは、宿主細胞中へとトランスフェクションされ、そこで一時的に存在し得る。これに代えて、直線状のベクターが、宿主細胞のゲノム中に、染色体上で、またはエピソームとして、安定して統合される。好適なトランスフェクション手法は、当技術分野において知られており、宿主細胞にベクターを送達するために容易に利用され得る。ベクターは、キャプシドタンパク質および/または複製タンパク質を発現する宿主細胞中において培養される。宿主細胞において、ベクター内に含まれる本発明の核酸分子がレスキューされ、キャプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質中にパッケージングされて感染性のウイルス粒子を形成する。
複数のウイルス粒子を生産する方法は、本明細書において記載されているベクターのいずれかを使用して行われ得る。手短にいうと、ベクターは、宿主細胞中へとトランスフェクションされ、そこで一時的に存在し得る。これに代えて、直線状のベクターが、宿主細胞のゲノム中に、染色体上で、またはエピソームとして、安定して統合される。好適なトランスフェクション手法は、当技術分野において知られており、宿主細胞にベクターを送達するために容易に利用され得る。ベクターは、キャプシドタンパク質および/または複製タンパク質を発現する宿主細胞中において培養される。宿主細胞において、ベクター内に含まれる本発明の核酸分子がレスキューされ、キャプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質中にパッケージングされて感染性のウイルス粒子を形成する。
全般的に、核酸を含んでなるベクターをトランスフェクションによって送達する場合、ベクターは、約5μg~約100μgのDNA、例えば、約10μg~約50μgのDNAの量で、約1×104個の細胞~約1×1013個の細胞、または約1×105個の細胞に対して送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターの相対的な量を、選択したベクター、送達方法、および選択した宿主細胞などの要因を考慮して、調整してもよい。
本発明のベクターは、種々の目的のために有用であるが、本明細書において記載されている核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)の生産における使用のために特によく適している。ベクターの核酸を含む複数のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を生成するためには、RepおよびCapタンパク質のAAVヘルパー機能が必要であり、アデノウイルスヘルパー機能は、アデノウイルスE2A、E4およびVA遺伝子の産物によって提供される。当該ベクター、AAVヘルパーベクターおよびアデノウイルスヘルパー核酸は、宿主細胞に対してトランスに提供されてもよい。2ベクター系において、ベクターを、アデノウイルスに感染したヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞へと、AAVヘルパー機能を提供するさらなるベクターとともに共トランスフェクションすることができる。3ベクター系において、HEK293細胞は、核酸分子を含む本発明のベクター、AAVヘルパー機能を提供するベクター、ならびにウイルス複製を可能にするためのE2A、E4およびVAアデノウイルス遺伝子を提供することによって野生型のアデノウイルスの代替となる第3のベクターで、トランスフェクションされる(例えば、Shi et al, Virology J., 6:3 (2009)を参照)。
これに代えて、必要とされる構成要素(例えば、ベクター、repをコードする核酸、capをコードする核酸および/またはアデノウイルスヘルパー機能)のいずれか1以上は、必要とされる構成要素の1以上を含むように、当業者に知られている方法を使用して設計された、安定な宿主細胞により提供されてもよい。本発明の方法には、標準トランスフェクションおよび共トランスフェクション手法、例えば、CaPO4沈殿法が含まれる。他の慣用の方法には、中でもとりわけ、ベクター核酸の相同組換え、寒天オーバーレイ(agar overlay)でのウイルスのプラーク形成、シグナル生成を測定する方法が含まれる(例えば、K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第5,478,745号を参照)。同様に、AAVビリオンを生成する方法も、当技術分野において知られており、好適な方法の選択は、本発明に対する限定ではない。
本明細書において記載されているAAVおよび構成要素は、学術的な、市販の、または公共の供給源(例えば、American Type Culture Collection, Manassas, VA)から単離するか、または得てもよい。これに代えて、AAV核酸配列を、公開された核酸配列、例えば、文献におけるまたは公共のデータベース、例えば、中でもとりわけGenBank(登録商標)、PubMed(登録商標)における入手可能な核酸配列の参照によって、合成または他の好適な手段を通じて得てもよい。
宿主細胞は、ベクターの核酸分子中に見出されるITRを認識して結合させるキャプシドタンパク質および複製タンパク質の発現を駆動する核酸を含む。例えば、AAV capおよびrepをコードする核酸が、異なるAAV供給源から独立して得られ、上記のとおりに宿主細胞へと導入されてもよい。さらに、Rep78/68をコードする核酸は、AAV2からのものであってもよく、それに対してAAV capをコードする核酸は、AAV8からのものであってもよい。
したがって、一態様において、repおよびcapをコードする核酸は、宿主細胞中の単一の核酸分子上にトランスフェクションされ得、細胞中においてエピソームとして安定して存在し得る。別の態様において、repおよびcapをコードする核酸は、宿主細胞の染色体中に安定して統合される。これに代えて、repおよびcapをコードする核酸は、宿主細胞において一時的に発現されてもよい。任意に、repおよびcapをコードする核酸は、宿主細胞中に導入されるべき他の核酸分子、例えば、アデノウイルスタンパク質をコードする核酸を含むベクター上に、供給されてもよい。
パッケージング宿主細胞はまた、本発明のウイルス粒子をパッケージングするために、ヘルパー機能も必要とする。任意に、これらの機能は、ヘルペスウイルスによって供給され得る。最も望ましくは、必要なヘルパー機能は、それぞれ、ヒトまたは非ヒト霊長類のアデノウイルス供給源、例えば、上記のものから提供されるか、および/またはAmerican Type Culture Collection(ATCC)、Manassas, VA(米国)を含めた種々の供給源から入手可能である。例えば、宿主細胞は、E1a遺伝子産物、E1b遺伝子産物、E2a遺伝子産物および/またはE4 ORF6遺伝子産物を与えられるか、および/または含む。宿主細胞は、VAI RNAなどのさらなるアデノウイルス遺伝子を含んでもよいが、これらの遺伝子は必要ではない。別の態様においては、宿主細胞中において他のアデノウイルス遺伝子または遺伝子機能が存在しない。アデノウイルス遺伝子の1以上が、宿主細胞のゲノム中へと安定的に組み入れられ得、エピソームとして安定的に発現されるか、または一時的に発現される。
宿主細胞自体は、あらゆる生物学的有機体から選択されてもよく、原核細胞(例えば、細菌細胞)ならびに昆虫細胞(例えば、SF9)、酵母細胞および哺乳動物細胞を含めた真核細胞が、これに含まれる。例えば、大腸菌細菌細胞が、本発明のベクターを複製するための宿主細胞として使用され得る。宿主細胞は、あらゆる哺乳動物種の中から選択されてもよく、限定されないが、A549、WEHI、3T3、10T1/2、BH、MDC、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、HeLa、HEK293細胞、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2などの細胞、および哺乳動物初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞が、これに含まれる。細胞を提供する哺乳動物種の選択も、哺乳動物細胞のタイプ、すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などの選択も、本発明を限定しない。
本発明のベクターの宿主細胞への導入はまた、当技術分野で知られている手法を使用して、および、本明細書全体を通しておよびS. Shi et al, Virol. J., 6:3 (2009)において述べられているとおりに成し遂げられてもよい。上述のあらゆるベクターが、例えば、中でもとりわけ、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合手法、高速DNAコートペレット(high velocity DNA-coated pellets)、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合によって、宿主細胞に導入され得る。好ましい態様において、標準トランスフェクション手法、例えば、CaPO4トランスフェクションまたはエレクトロポレーション、および/またはヒト胎児由来腎臓細胞株HEK293などの細胞株へのハイブリッドアデノウイルス/AAVベクターによる感染が使用される。
その結果得られた、核酸分子を発現する組換えウイルス粒子は、治療的な目的のための遺伝子送達に特によく適している。さらに、本発明の組成物はまた、in vitroでの所望の遺伝子産物の生産のためにも使用され得る。培地中で上記ベクター(単数または複数)の1以上を含んでなる宿主細胞を培養すること、および任意にウイルス粒子を宿主細胞の培地から回収することを含んでなる、ウイルス粒子を生産するための方法もまた、提供される。
以下は、本発明の例である。上記提供された一般的な説明により、種々の他の態様も実施され得ることが理解される。
例1.スペーサーを有するAAVベクターの生成
スペーサーを、AAVベクターへの組み入れのためにデザインした。ApoEエンハンサーを、AAVベクター中にスペーサーとして含めるべき候補ゲノム核酸配列として選択した。UCSCゲノムブラウザによって提供されたゲノムブラウザツールを、ApoEエンハンサーの内に含まれるCpG含有率、推定転写因子結合部位およびオープンリーディングフレーム(ORF)の同定に利用した。ApoEエンハンサー核酸配列の3.0Kbのウィンドウを、その低いCpG含有率(2%)、限られた推定転写因子結合部位および小さなORF(90アミノ酸)のため、選択した。長さが19ヌクレオチドのPCRプライマーを、PCRによりHEK293細胞から単離したゲノムDNAからのApoEエンハンサー核酸配列の3.0Kbの領域に結合させて増幅させるためにデザインした。その結果得られた増幅産物を、当該技術分野において知られている方法により、精製し、配列決定した。単離したApoEエンハンサー核酸配列を、部位特異的突然変異誘発法(Stratagene)によって、CpG含有率を低減させ、転写因子結合部位を取り除き、およびORFを30アミノ酸に低減させるために、さらに改変した。
スペーサーを、AAVベクターへの組み入れのためにデザインした。ApoEエンハンサーを、AAVベクター中にスペーサーとして含めるべき候補ゲノム核酸配列として選択した。UCSCゲノムブラウザによって提供されたゲノムブラウザツールを、ApoEエンハンサーの内に含まれるCpG含有率、推定転写因子結合部位およびオープンリーディングフレーム(ORF)の同定に利用した。ApoEエンハンサー核酸配列の3.0Kbのウィンドウを、その低いCpG含有率(2%)、限られた推定転写因子結合部位および小さなORF(90アミノ酸)のため、選択した。長さが19ヌクレオチドのPCRプライマーを、PCRによりHEK293細胞から単離したゲノムDNAからのApoEエンハンサー核酸配列の3.0Kbの領域に結合させて増幅させるためにデザインした。その結果得られた増幅産物を、当該技術分野において知られている方法により、精製し、配列決定した。単離したApoEエンハンサー核酸配列を、部位特異的突然変異誘発法(Stratagene)によって、CpG含有率を低減させ、転写因子結合部位を取り除き、およびORFを30アミノ酸に低減させるために、さらに改変した。
AAV pCAT環状親ベクター、pCAT-AAV-CMV-GFPを、改変ApoEエンハンサースペーサーのためのデスティネーションベクターとして使用した。親ベクターは、以下の構成要素を有する核酸分子を含む:第1のAAV2 ITR1、CMVプロモーター、βグロビンイントロン、GFPをコードするポリヌクレオチド、βグロビンポリアデニル化部位(pA)、第2のAAV2 ITR2、原核生物性の複製起点、およびカナマイシン抗生物質選択遺伝子(KanR)。親ベクターはまた、第1のAAV2 ITR1の5’側にあるPmeI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むクローニング部位;および第2のAAV2 ITR2の3’側にあるSwaI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むクローニング部位も含む。その結果得られたベクターは、5’→3’方向に:CS-AAV2 ITR1-CMV-βグロビンイントロン-GFP-βグロビンpA-AAV2 ITR2-CS-oriC-KanRのとおりに作動可能に連結された核酸構成要素を含んでいた。親ベクターを、第1のAAV2 ITR2の5’側で平滑末端を導入するためにPmeIを用いて消化した。ApoEエンハンサーのPCR産物および消化された親ベクターを、16℃で1時間、T4 DNAリガーゼによってライゲーションした。その結果得られた、第1のスペーサーの挿入を有する親ベクターを、配列検証し、続いて、第2のAAV2 ITR2の3’側で平滑末端を導入するためにSwaIを用いて消化した。ApoEのPCR産物、および1つのスペーサーを有する親ベクターを、再度ライゲーションし、前に記載されたとおり配列検証した。その結果得られたベクターは、図1にpAAV-CMV-GFPとして示されており、5’→3’方向に作動可能に連結されている以下の核酸構成要素を含む:スペーサー1-AAV2 ITR1-CMV-βグロビンイントロン-GFP-βグロビンpA-AAV2 ITR2-スペーサー2-oriC-KanR。
コンピテントな大腸菌細胞に2つのスペーサーベクターを形質転換し、これを次に37℃で終夜培養した。2つのスペーサーベクターをQiagen mini-prep kitによって精製し、配列検証した。精製したスペーサーベクター、および、対照として使用した親ベクターを、AAVヘルパーベクターおよびアデノウイルスヘルパーベクターとともにHEK293細胞にCaPO4トランスフェクションによって共トランスフェクションした。AAVヘルパーベクターは、AAV2 Repタンパク質およびAAV8キャプシドタンパク質をコードする核酸分子を含む。その結果得られたAAV2/8スペーサーおよび非スペーサーウイルス粒子を、トランスフェクションの48時間後に採取し、超遠心分離およびカラム濾過により精製した。
ヒト肝細胞HepG2細胞に、精製したAAV2/8スペーサーまたは非スペーサーウイルス粒子を形質導入し、続いて、形質導入された細胞からゲノムDNAを単離するために溶解させた。精製したDNAを、PCRによって、夾雑oriCおよびKanR核酸について分析した。AAV2/8スペーサーウイルス粒子を形質導入した細胞は、1%未満の夾雑oriCまたはKanR核酸を含んでおり、一方、AAV2/8非スペーサーウイルス粒子を形質導入した細胞は、3%の夾雑oriCまたはKanR核酸を含んでいた。
他の態様
前述の発明は、理解を明確にする目的で実例および例によってある程度詳細に説明してきたが、説明および例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。本明細書に引用された全ての特許文献および科学文献の開示は、明示的にそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
前述の発明は、理解を明確にする目的で実例および例によってある程度詳細に説明してきたが、説明および例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。本明細書に引用された全ての特許文献および科学文献の開示は、明示的にそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
Claims (54)
- (i)第1のスペーサー(SS1);
(ii)第1の逆位末端反復配列(ITR1);
(iii)クローニング部位(CS);
(iv)第2の逆位末端反復配列(ITR2);および
(v)第2のスペーサー(SS2)を含んでなり、
構成要素が5’→3’方向に:SS1-ITR1-CS-ITR2-SS2
のとおりに互いに作動可能に連結されている、核酸分子。 - (i)第1のスペーサー(SS1);
(ii)第1の逆位末端反復配列(ITR1);
(iii)異種ポリヌクレオチド分子(HPM);
(iv)第2の逆位末端反復配列(ITR2);および
(v)第2のスペーサー(SS2)を含んでなり、
構成要素が5’→3’方向に:SS1-ITR1-HPM-ITR2-SS2
のとおりに互いに作動可能に連結されている、核酸分子。 - (vi)真核生物プロモーター(PEuk)をさらに含んでなり、
構成要素が5’→3’方向に:SS1-ITR1-PEuk-HPM-ITR2-SS2
のとおりに互いに作動可能に連結されている、請求項2に記載の核酸分子。 - PEukが、組織特異的プロモーターまたは構成的プロモーターである、請求項3に記載の核酸分子。
- 組織特異的プロモーターが、肝臓特異的プロモーター、筋特異的プロモーターまたは神経特異的プロモーターを含んでなる、請求項4に記載の核酸分子。
- 構成的プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーターまたはニワトリβアクチンプロモーターを含んでなる、請求項4に記載の核酸分子。
- HPMが、阻害性RNA分子をコードする、請求項3に記載の核酸分子。
- 阻害性RNA分子が、小もしくは短ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、小もしくは短干渉(si)RNA、トランススプライシングRNA、アンチセンスRNAおよびリボザイムからなる群から選択される、請求項7に記載の核酸分子。
- HPMが、ポリペプチドをコードする、請求項3~6のいずれか一項に記載の核酸分子であって、
(vii)ポリアデニル化部位(pA)をさらに含んでなり、
構成要素が5’→3’方向に:SS1-ITR1-PEuk-HPM-pA-ITR2-SS2
のとおりに互いに作動可能に連結されている、前記核酸分子。 - HPMが、FVIII、FIXまたはGFPをコードする、請求項9に記載の核酸分子。
- pA部位が、ヒトβグロビンポリアデニル化部位、SV40後期ポリアデニル化部位、SV40初期ポリアデニル化部位、またはウシ成長ホルモンポリアデニル化部位を含んでなる、請求項9または10に記載の核酸分子。
- SS1またはSS2が、長さが100アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームを含まない、請求項1~11のいずれか一項に記載の核酸分子。
- SS1またはSS2が、長さが50アミノ酸未満であるオープンリーディングフレームを含んでなる、請求項12に記載の核酸分子。
- SS1またはSS2が、原核生物の転写因子結合部位を含まない、請求項1~13のいずれか一項に記載の核酸分子。
- SS1またはSS2が、SS1またはSS2の核酸配列全体の1%未満である総CpG含有率を含んでなる、請求項1~14のいずれか一項に記載の核酸分子。
- SS1またはSS2が、SS1またはSS2の核酸配列全体の0.5%未満である総CpG含有率を含んでなる、請求項15に記載の核酸分子。
- SS1またはSS2が、エンハンサーを含んでなる、請求項1~16のいずれか一項に記載の核酸分子。
- エンハンサーが、組織特異的エンハンサーである、請求項17に記載の核酸分子。
- 組織特異的エンハンサーが、肝臓特異的エンハンサー、筋特異的エンハンサーおよび神経特異的エンハンサーからなる群から選択される、請求項18に記載の核酸分子。
- 組織特異的エンハンサーが、apoE/apoC1エンハンサーまたはapoCIIIを含んでなる肝臓特異的エンハンサーである、請求項19に記載の核酸分子。
- SS1が、長さ約2.0Kb~約5.0Kbである、請求項1~20のいずれか一項に記載の核酸分子。
- SS2が、長さ約2.0Kb~約5.0Kbである、請求項1~21のいずれか一項に記載の核酸分子。
- SS1およびSS2が、合わせて長さ約4.0Kb~約10.0Kbである、請求項1~22のいずれか一項に記載の核酸分子。
- HPMと、SS1またはSS2とが、合わせて長さ約5.0Kb~約10.0Kbである、請求項2~23のいずれか一項に記載の核酸分子。
- SS1、SS2およびHPMが、合わせて長さ約10.0Kb~約15.0Kbである、請求項2~24のいずれか一項に記載の核酸分子。
- SS1が、1以上のクローニング部位に隣接されている、請求項1~25のいずれか一項に記載の核酸分子。
- SS2が、1以上のクローニング部位に隣接されている、請求項1~26のいずれか一項に記載の核酸分子。
- ITR1および/またはITR2が、パルボウイルスITRである、請求項1~27のいずれか一項に記載の核酸分子。
- パルボウイルスITRが、アデノ随伴ウイルス(AAV)のITRである、請求項28に記載の核酸分子。
- AAVのITRが、AAV血清型2型のITRである、請求項29に記載の核酸分子。
- 請求項1~30のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
- SS1の5’側および/またはSS2の3’側に位置する選択可能マーカー遺伝子に対して作動可能に連結された原核生物プロモーターをさらに含んでなる、請求項31に記載のベクター。
- 選択可能マーカー遺伝子が、抗生物質抵抗性遺伝子である、請求項32に記載のベクター。
- SS1の5’側および/またはSS2の3’側に位置する原核生物性の複製起点をさらに含んでなる、請求項33に記載のベクター。
- 核酸分子が、環状であるかまたは直線状である、請求項31~34のいずれか一項に記載のベクター。
- ITR1、HPMおよびITR2を含んでなる核酸分子を含んでなる複数のウイルス粒子であって、ウイルス粒子の1%未満が、コンタミナント核酸を含んでなる核酸分子を含んでなる、前記複数のウイルス粒子。
- ウイルス粒子の0.75%未満が、コンタミナント核酸を含んでなる核酸分子を含んでなる、請求項36に記載の複数のウイルス粒子。
- ウイルス粒子の0.5%未満が、コンタミナント核酸を含んでなる核酸分子を含んでなる、請求項37に記載の複数のウイルス粒子。
- ウイルス粒子の0.25%未満が、コンタミナント核酸を含んでなる核酸分子を含んでなる、請求項38に記載の複数のウイルス粒子。
- ウイルス粒子の0.15%未満が、コンタミナント核酸を含んでなる核酸分子を含んでなる、請求項39に記載の複数のウイルス粒子。
- コンタミナント核酸が、原核生物性の核酸および/またはコンタミナント核酸全体の2%を超えるCpG含有率を含んでなる核酸を含んでなる、請求項37~40のいずれか一項に記載の複数のウイルス粒子。
- 原核生物性の核酸が、複製起点、選択可能マーカー遺伝子、および/または、転写因子結合部位を含んでなるプロモーターである、請求項41に記載の複数のウイルス粒子。
- (i)ITR1、HPMおよびITR2を含んでなる核酸分子を含んでなるウイルス粒子;
(ii)SS1、ITR1、HPMおよびITR2を含んでなる核酸分子を含んでなるウイルス粒子;および
(iii)ITR1、HPM、ITR2およびSS2を含んでなる核酸分子を含んでなるウイルス粒子
を含んでなる、複数のウイルス粒子。 - (i)ITR1およびSS1を含んでなる核酸分子を含んでなるウイルス粒子;
(ii)ITR2およびSS2を含んでなる核酸分子を含んでなるウイルス粒子;および
(iii)ITR1、HPMおよびITR2を含んでなる核酸分子を含んでなるウイルス粒子
を含んでなる、複数のウイルス粒子。 - 請求項31~35のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
- 原核細胞である、請求項45に記載の宿主細胞。
- 原核細胞が、細菌細胞である、請求項46に記載の宿主細胞。
- 細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項47に記載の宿主細胞。
- 真核細胞である、請求項45に記載の宿主細胞。
- 真核細胞が、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、請求項49に記載の宿主細胞。
- 哺乳動物細胞が、HEK293細胞またはHeLa細胞である、請求項50に記載の宿主細胞。
- 複数のウイルス粒子を生産するための方法であって、培地中で請求項31~35のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
- 請求項52に記載の方法であって、複数のウイルス粒子を培地から回収することをさらに含んでなる、前記方法。
- 複数のウイルス粒子が、AAV粒子を含んでなる、請求項52または53に記載の方法。
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