JP6092782B2 - 組換えタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2010年11月16日出願の米国仮出願第61/414,225(その開示は、その全体が参照によって本明細書に援用される)の恩典およびそれに対する優先権を主張する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
細胞集団を作製するための方法であって、前記方法は以下の工程:
a)宿主細胞の集団を、前記宿主細胞の集団のサブセットのゲノムDNAへ組み込む、目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一つのコピーを含んでいる少なくとも1つのベクターを用いて形質転換して、それによって目的のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団を生成し、
前記宿主細胞の集団は、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を含み、かつ前記目的のタンパク質を産生できる前記宿主細胞の集団の前記生成は、個々の前駆細胞クローンのクローン選択を必要としない工程と;
b)前記宿主細胞の集団を維持して目的のタンパク質を産生する工程と;
を包含する、方法。
(項目2)
項目1に記載の方法であって、さらに以下の工程:
c)工程(a)および(b)を少なくとも1回繰り返して、複数の細胞集団を生成し、各々の集団が、ポリクローナルタンパク質の組成物の種々の構成要素を産生できる、工程と;
d)工程(a)〜(c)によって生成される前記複数の細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する工程と、
を包含する、方法。
(項目3)
前記宿主細胞の集団が、複数のベクターを用いて形質転換され、各々のベクターが、前記宿主細胞の集団のサブセットのゲノムDNAへ組み込む、目的の2つ以上のタンパク質をコードする核酸配列の異なるコピーを含んでおり、それによって目的の2つ以上のタンパク質を産生できる宿主細胞の集団を生成する、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
目的のタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一つのコピーを用いて形質転換された前記宿主細胞の集団のサブセットを選択する工程をさらに包含する、項目1または2に記載の方法。
(項目5)
目的の2つ以上のタンパク質をコードする核酸配列で形質転換された前記宿主細胞集団のサブセットを選択する工程をさらに包含する、項目3に記載の方法。
(項目6)
前記選択がネガティブ選択工程である、項目4または5に記載の方法。
(項目7)
前記選択がポジティブ選択工程である、項目4または5に記載の方法。
(項目8)
前記選択工程が、前記複数の細胞集団を混合する前に起こる、項目4、6または7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記選択工程が、前記複数の細胞集団を混合した後に起こる、項目4〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、AAVベクター、およびリコンビナーゼまたはインテグラーゼによって認識可能な遺伝子エレメントを担持していないベクターからなる群より選択される、項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記ベクターが、ベクターのライブラリーである、項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記ベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、項目11に記載の方法。
(項目13)
ポリクローナル細胞集団を産生するための方法であって、前記方法は、以下の工程:
a)1つ以上の宿主細胞を、レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含む少なくとも1つのレトロウイルスベクターを用いて形質転換し、前記少なくとも1つのレトロウイルスベクターが前記レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質に結合されるか、またはそれによって結合され得、かつ前記形質転換が個々の細胞のクローン選択を必要としない、工程と;
b)ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;
c)工程(a)〜(b)を少なくとも1回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;
d)工程(a)〜(c)によって生成される少なくとも2つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を産生する工程と、
を包含する、方法。
(項目14)
工程bで生成される前記細胞集団が、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
工程bの後に、形質転換された宿主細胞の細胞集団を選択することをさらに包含する、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
前記選択工程が、個々の前駆細胞の選択も、単一の前駆細胞からの細胞株の産生も必要としない、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記選択工程が、G418、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、およびゼオシンからなる群より選択される少なくとも1つの選択可能なマーカーを使用する、項目15または16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記レトロウイルスのインテグラーゼタンパク質が、パッケージング細胞株中の前記宿主細胞に提供されるインテグラーゼタンパク質、別のDNAベクター上にコードされる前記宿主細胞に提供されるインテグラーゼタンパク質、および組換えタンパク質として前記宿主細胞に提供されるインテグラーゼタンパク質からなる群より選択される、項目13〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記少なくとも1つのレトロウイルスベクターが、レトロウイルスベクターのライブラリーである、項目13〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記レトロウイルスベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、項目19に記載の方法。
(項目21)
ポリクローナル細胞集団を産生するための方法であって、前記方法は以下の工程:
a)1つ以上の宿主細胞を、repタンパク質またはrep様タンパク質を用いて、ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含んでいる少なくとも1つのベクターで形質転換し、前記repタンパク質またはrep様タンパク質が、核酸配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みを媒介し、かつ前記形質転換が個々の細胞のクローン選択を必要としない工程と;
b)ポリクローナルタンパク質の組成物の構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;
c)工程(a)〜(b)を少なくとも1回繰り返して、ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;
d)工程(a)〜(c)によって生成される少なくとも2つの細胞集団を混合して、ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する工程と、
を包含する、方法。
(項目22)
工程bで生成される前記細胞集団が、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
工程bの後に、形質転換された宿主細胞の細胞集団を選択する工程をさらに包含する、項目21または22に記載の方法。
(項目24)
前記選択工程が、個々の細胞の選択も単一の前駆細胞からの細胞株の産生も必要としない、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記選択工程が、G418、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンおよびゼオシンからなる群より選択される少なくとも1つの選択マーカーを用いる、項目23または24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記repタンパク質またはrep様タンパク質が、パッケージング細胞株中の前記宿主細胞に提供されるrepまたはrep様タンパク質、別のDNAベクター上にコードされる前記細胞に提供されるrepまたはrep様タンパク質、および組換えタンパク質として前記細胞に提供されるrepまたはrep様タンパク質からなる群より選択される、項目21〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記ベクターが、一本鎖DNAウイルスベクターおよび二本鎖DNAベクターからなる群より選択される、項目22〜26のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、項目22〜26のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記ベクターが、ベクターのライブラリーである、項目22〜28のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
前記ベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、項目28に記載の方法。
(項目31)
前記単一の多量体タンパク質が、抗体およびT細胞レセプター(TCR)からなる群より選択される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記複数のポリペプチドが、一緒になって特定の抗原性エピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでいるポリペプチドおよび免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでいるポリペプチドを含んでなる、項目12、20または30に記載の方法。
(項目33)
前記複数のポリペプチドが、一緒になってT細胞レセプター(TCR)を形成する2つのポリペプチドを含んでなる、項目12、20または30に記載の方法。
(項目34)
前記一緒になってTCRを形成する2つのポリペプチドが、TCRのα鎖を含んでいるポリペプチド、およびTCRのβ鎖を含んでいるポリペプチドを含んでなる、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記一緒になってTCRを形成する2つのポリペプチドが、TCRのγ鎖を含んでいるポリペプチド、およびTCRのδ鎖を含んでいるポリペプチドを含んでなる、項目33に記載の方法。
(項目36)
前記少なくとも1つのベクターが、一緒になって特定の抗原性エピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の両方をコードする核酸を含む、項目1、13または21に記載の方法。
(項目37)
前記少なくとも1つのベクターが、ワクチンの構成要素をコードする、項目1、13または21に記載の方法。
(項目38)
工程(d)において、工程(c)において生成された細胞の大集団が混合されて、ポリクローナル細胞集団が生成される、項目2、13または21に記載の方法。
(項目39)
工程(d)において生成される前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも一万個の細胞を含む、項目2、13または21に記載の方法。
(項目40)
工程(d)において、生成される前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも10万個の細胞を含む、項目2、13または21に記載の方法。
(項目41)
工程(d)において、生成されるポリクローナル細胞集団が、少なくとも100万個の細胞を含む、項目2、13または21に記載の方法。
(項目42)
工程(d)において、生成されるポリクローナル細胞集団が、少なくとも一千万個の細胞を含む、項目2、13または21に記載の方法。
(項目43)
工程(d)において、少なくとも2つの細胞集団が1:1の比で混合される、項目2、13または21に記載の方法。
(項目44)
工程(d)において、少なくとも2つの細胞集団が1:1とは異なる比で混合される、項目2、13または21に記載の方法。
(項目45)
工程(d)において生成されるポリクローナル細胞集団をバンキングすることをさらに包含する、項目2、13または21に記載の方法。
(項目46)
工程(d)の後、工程(a)〜(b)によって生成される個々の細胞集団がバンキングされない、項目2、13または21に記載の方法。
(項目47)
工程(d)において生成されるポリクローナル細胞集団からポリクローナルタンパク質組成物を精製することをさらに包含する、項目2、13または21に記載の方法。
(項目48)
工程(a)において、宿主細胞が、前記少なくとも1つのベクターを用いて少なくとも2回形質転換される、項目1、2、13または21に記載の方法。
(項目49)
工程(a)において、宿主細胞が、前記少なくとも1つのベクターを用いて少なくとも5回形質転換される、項目1、2、13または21に記載の方法。
(項目50)
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも2つの細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、項目2、13または21に記載の方法。
(項目51)
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも5つの細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、項目2、13または21に記載の方法。
(項目52)
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも10個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、項目2、13または21に記載の方法。
(項目53)
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも15個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、項目2、13または21に記載の方法。
(項目54)
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも20個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、項目2、13または21に記載の方法。
(項目55)
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも25個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、項目2、13または21に記載の方法。
(項目56)
前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも50個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、項目2、13または21に記載の方法。
(項目57)
前記宿主細胞の集団が、少なくとも2つの異なるタンパク質を産生できる、項目3に記載の方法。
(項目58)
前記宿主細胞の集団が、少なくとも5つの異なるタンパク質を産生できる、項目3に記載の方法。
(項目59)
前記宿主細胞の集団が、少なくとも10個の異なるタンパク質を産生できる、項目3に記載の方法。
(項目60)
前記タンパク質が抗体である、項目50〜59のいずれか1項に記載の方法。
(項目61)
前記タンパク質が、T細胞レセプターである、項目50〜59のいずれか1項に記載の方法。
(項目62)
前記タンパク質が、ワクチン中で使用される、項目50〜59のいずれか1項に記載の方法。
(項目63)
前記ポリクローナルタンパク質の組成物が、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群より選択される方法によって精製される、項目47に記載の方法。
(項目64)
前記ポリクローナルタンパク質の組成物の安定性が、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、パパイン消化に続く2−Dゲル分析、マイクロアレイ、qPCR、およびELISAアッセイからなる群より選択される方法によって決定される、項目47に記載の方法。
(項目65)
項目1、2、3、13または21に記載の方法によって産生される、細胞集団。
(項目66)
項目47に記載の方法によって産生される、組換え抗体組成物。
本発明の発現ベクターは、目的の少なくとも1つのポリペプチドをコードするように構築される。本明細書において用いる場合、「目的のポリペプチド」および「目的のタンパク質」という用語は、目的の核酸または遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。本明細書において開示された方法は、組換えのポリクローナル細胞集団によって発現され得るポリペプチドまたはタンパク質の種類によって限定されないと想定されている。目的の例示的なタンパク質としては、抗体(免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む)またはそのフラグメント、T細胞レセプター分子、およびワクチンのタンパク質成分が挙げられる。
LTR−XXXXX−LTR
ここで、LTR配列が隣接するXXXXXは、プロモーター、リーダー配列、目的のタンパク質をコードする核酸配列(例えば、軽鎖配列および/または重鎖配列またはT細胞レセプター配列)、および/またはポリA配列のようなエレメントの組み合わせであってもよい。他の調節性エレメントが必要に応じて含まれてもよい。
LTR−X−軽鎖のプロモーター−κリーダー配列−免疫グロブリン軽鎖配列−軽鎖のポリA配列−重鎖のエンハンサー−重鎖のプロモーター−重鎖リーダー配列−免疫グロブリン重鎖可変配列−重鎖定常領域配列(CH)−重鎖のポリA配列−X−LTR。
この構造を有しているレトロウイルスベクターは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列の両方を同じ方向に含む。このレトロウイルスベクターの例示的なプロモーターとしては、CMVエンハンサーおよび/またはSV40エンハンサーを先行して有するEF1αプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、調節性エレメントの組み合わせ、例えば、CMVエンハンサーを軽鎖配列の前に有するヒトEF−1αプロモーター、および重鎖配列の前にSV40エンハンサーを有するラットまたはマウスのEF−1αプロモーターの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、調節性エレメントの組み合わせ、例えば、1つの核酸の発現を駆動するヒトEF−1αプロモーター、および第二の核酸の発現を駆動するラットまたはマウスのEF−1αプロモーターの組み合わせは、レトロウイルスベクター構築物の安定性を増強し得る。
LTR−X−軽鎖のポリA−軽鎖配列−κリーダー配列−軽鎖のプロモーター−エンハンサー配列−重鎖のプロモーター−重鎖リーダー配列−免疫グロブリン重鎖可変配列−重鎖定常領域配列(CH)−重鎖のポリA配列−X−LTR。
この構造を有しているレトロウイルスベクターは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列の両方を反対方向に含む。このベクターの例示的なプロモーターとしては、CMVエンハンサーおよび/またはSV40エンハンサーをそのプロモーターに先行して有するEF−1αプロモーター、またはそれらの調節性エレメントの組み合わせが挙げられる。
LTR−X−軽鎖のプロモーター−κリーダー配列−免疫グロブリン軽鎖配列−軽鎖のポリA配列−X−LTR。
レトロウイルスベクターの例示的なプロモーターとしては、CMVエンハンサーおよび/またはSV40エンハンサーを先行して有するEF−1αプロモーター、またはそれらの調節性エレメントの組み合わせが挙げられる。
LTR−X−重鎖のプロモーター−重鎖リーダー配列−
免疫グロブリン重鎖可変配列−重鎖定常領域配列(CH)−重鎖のポリA配列
−X−LTR。
レトロウイルスベクターの例示的なプロモーターとしては、CMVエンハンサーおよび/またはSV40エンハンサーを先行して有するEF−1αプロモーター、または調節性エレメントの組み合わせが挙げられる。
ウイルスベクターによる形質導入に適した種々の宿主細胞(例えば、レトロベクター、AAVベクターなど)の使用が想定されている。例示的な宿主細胞株としては、哺乳動物細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(Chinese hamster ovary)(CHO)細胞、サル腎臓CV1(COS)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、ウシ乳腺上皮細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞、ヒト子宮頸癌(HeLa)細胞、マウスセルトリ細胞(TM4)、アフリカ遺伝子サル腎臓細胞(VERO−76)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝臓細胞(BRL3A)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、ヒト肺線維芽細胞(WI−38、IMR−90またはMRC−5)、マウス乳腺腫瘍細胞(MMT060562)、TR1細胞、ラット線維芽細胞、および骨髄腫細胞が挙げられる。
例示的な実施形態では、目的の少なくとも1つのタンパク質または目的のタンパク質のライブラリーをコードするウイルスベクターを用いて、宿主細胞ゲノム(例えば、宿主細胞ゲノムDNA)を形質転換してもよい。例えば、宿主細胞は、レトロウイルスベクターおよびレトロウイルスのインテグラーゼタンパク質を用いて、または一本鎖DNAウイルスベクター(例えば、AAVベクター)およびrepタンパク質を用いて、1細胞あたり少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも5回、少なくとも10回以上のウイルスベクターの多重感染で形質導入してもよい。約10〜約1,000,000という感染の多重度を用いて、組み込まれたベクターの約2〜約100コピーを含んでいる感染した宿主細胞のゲノムを生成してもよい。いくつかの実施形態では、約10〜約10,000という感染の多重度が用いられる。
少なくとも2つの個々の細胞集団(各々が、異なるタンパク質を産生する)は、本明細書に記載の方法工程から生成される場合、細胞のポリクローナル混合物(本明細書においては「ポリクローナル細胞集団」と呼ばれる)を生成するように混合されてもよい。例示的な実施形態では、少なくとも2つの個々の細胞集団を生成して、それを混合し、複数のタンパク質を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する。ポリクローナル細胞集団は、各々が異なるタンパク質を産生できる少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100またはそれ以上の細胞集団を含んでもよい。
組換え細胞集団(例えば、単一の組換えポリペプチドを発現する細胞集団および異なるタンパク質を産生できる少なくとも2つの異なる細胞集団を含んでいるポリクローナルの細胞集団)を、将来の試験、スクリーニング、製造および/または使用のためにバンキング(すなわち、凍結および貯蔵)してもよい。細胞集団は、当該分野で周知の方法を用いて、個々のバイアルまたはアンプル中でアリコートにされて、凍結され得る(例えば、凍結ストックを生成するために)。アリコートのサイズ、1バイアルあたりの細胞の数、およびバイアル(またはアンプル)の数は、細胞集団の所望の用途次第で変化し得る。いくつかの実施形態では、細胞集団は、1バイアルあたり約百万個、約5百万個、約一千万個、または約二千万個の細胞という総細胞カウントでバンキングされ得る。例示的な実施形態では、ポリクローナル細胞集団は、1バイアルあたり約一千万個の細胞という総細胞カウントでバンキングされる。
本明細書に記載の方法によって産生される組換えポリクローナルタンパク質の組成物は、タンパク質の混合物を含む。
本発明の組換えポリクローナルタンパク質の組成物を用いて、癌を含む種々の疾患および障害(例えば、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌および頭頸部癌)を処置してもよい。例えば、癌細胞を、治療上有効な量のポリクローナルタンパク質組成物(例えば、ポリクローナル抗体組成物)に暴露して、癌細胞の増殖を阻害または軽減してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の組換えポリクローナル抗体組成物は、癌細胞増殖を、少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%または100%まで阻害する。
以下の実施例は、単に例示であって、決して本発明の範囲や内容を限定するものではない。
実施例1:外因性DNA配列の安定な発現を促進するための、AAV Repタンパク質を用いる安定なポリクローナル細胞集団の産生
この実施例の目的は、非ウイルスAAV組み込みが安定な抗体発現を生じるか否かを検討することであった。Freestyle 293細胞(30×106)を、30μgのpExcel−ITR:5.55.D2(これは、抗S.aureusδ毒素IgG1を発現する)と150ngのpAAV2−Rep78とともに、293−Fectinを用いて、製造業者の指示に従って同時トランスフェクトし、IgG1産生を経時的にモニターした。トランスフェクションの3日後、細胞を、500μg/mLのG418を含有している増殖培地で継代した。細胞培養上清のFc−特異的ELISAを、1週に2回行った。各々の時点でのIgG1の総pg/mlを、培養物中の1日あたりの平均細胞数で割った。図2に示すとおり、1日あたり1細胞に産生される抗体のピコグラム数(pg/細胞/日)として測定した場合の相対発現は、11週間にわたって4〜8(pg/細胞/日)の間で維持される。細胞の密度および生育可能性は、G418選択期間の間に低下するようであり、これはこの期間に細胞の抗体産生に影響を与えたが、21日(3週)までには、細胞の密度および生育可能性は、トランスフェクション前レベルまで回復した(発現レベルは、G418選択開始の14日後に一過性のトランスフェクションレベル(時間=0)に接近する)。
組換えポリクローナル細胞集団の個々の抗体構成要素を経時的にモニターして、AAV Repタンパク質組み込みを用いて産生される種々のポリクローナル細胞集団の安定性を評価した。
この実験の目的は、安定なポリクローナル細胞混合物は、モノクローナルの安定な細胞集団を選択する前に生成され得るか否かを検討することであった。例えば、この実験では、細胞集団を混合してポリクローナル細胞集団を生成したが、選択マーカー(例えば、G418を含有する培地中で選択され得る、選択マーカーネオマイシン)を用いて、個々の安定な細胞集団を選択することはなかった。
本実施例の目的は、抗体の複雑な混合物が、ポリクローナル細胞集団から継続して精製され得るか否かを決定することであった。抗体42.11.D4、5.55.D2、26.3.E2および42.18.C2を発現するポリクローナル集団の細胞培養上清由来の抗体集団を、プロテインA−ベースの捕獲プロトコールを用いて精製した。精製された抗体集団のIEX HPLC分析を、精製していない培養上清の抗体集団と比較した(図7)。これらの結果、精製によって、ポリクローナル集団内の異なる抗体エレメントの全てが効率的に回収されることが示唆される。サンプルの容量が増大し、相対的なピークの高さが大きくなるとき、サンプル中の相対的な標準偏差が有意に低下することも、観察された。この結果は、これらの全実施例の全データの基礎であるHPLCプロフィールから得られる実測値の小さい相違は、組成物中の真の変化よりもむしろ、相対的な観察誤差である可能性が高いことを示唆している。
細胞集団の安定性を、選択圧の非存在下で試験した。図2に記載されるような細胞集団を確立した。6週後、抗体5.55.D2を発現する細胞集団を2つの培養物に分けた。一方は、選択薬物G418
Freestyle 293細胞(30×106)を、293−Fectinを用いて、150ngのpAAV2−Rep78を含む場合と含まない場合に分けて、30μgのpExcel−ITR:5.55.D2でトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、両方のトランスフェクトされた集団を、500μg/mLのG418を含有する増殖培地中に継代した。細胞培養上清のFc特異的ELISAを、週に2回行った。IgG1の総pg/mlを、各時点で、培養物中の1日あたりの平均細胞数で割った;選択中の各週について、平均pg/細胞/日を、図9に示す。
Freestyle 293細胞(2×106)を、293−Fectinを用いて、10ngのpAAV2−Rep78とともに抗体5.55.D2を発現する2μgの表示されたベクター系でトランスフェクトした。細胞を選択なしに17日間培養した。3〜4日ごとに、抗体5.55.D2を発現する細胞数をFACS分析によって評価した。17日目に抗体5.55.D2を発現する細胞の割合を示す。
A.レトロウイルスインテグラーゼは、培養細胞において、外因性DNA配列の安定な発現を促進する。
この実験の目的は、レトロウイルスインテグラーゼが、培養された細胞で外因性DNA配列の安定な発現を促進することを示すことであった。
本実験の目的は、レトロウイルスのインテグラーゼを用いて抗体を発現する安定なポリクローナル細胞集団を生成することであった。
本明細書で言及される特許文献および科学的文献の各々の全開示は、全ての目的のために参照によって本明細書に援用される。
本発明は、その趣旨からもその本質的な特徴からも逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明に限定されるものではなく、あらゆる点で例示とみなされるべきである。従って本発明の範囲は、前述の説明によるのではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、この特許請求の範囲の意味および等価な範囲に該当するあらゆる変更が、その中に包含されるものとする。
Claims (55)
- ポリクローナル細胞集団を作製するためのインビトロでの方法であって、前記方法は以下の工程:
a)1つ以上の宿主細胞を:
i)アデノ随伴ウイルス(AAV) repタンパク質の存在下で、逆方向末端反復(ITR)配列およびポリクローナルタンパク質の組成物のタンパク質構成要素をコードする核酸配列の少なくとも一つのコピーを含んでいる、少なくとも1種類のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの複数のコピー、または
ii)レトロウイルスのインテグラーゼの存在下で、長末端反復(LTR)配列およびポリクローナルタンパク質の組成物のタンパク質構成要素をコードする核酸配列の少なくとも1つのコピーを含んでいる、少なくとも1種類のレトロウイルスベクターの複数のコピー
を用いて形質転換し、その結果、前記AAV repタンパク質または前記レトロウイルスベクターのインテグラーゼのそれぞれによって認識される複数の位置において前記宿主細胞のゲノムへと、少なくとも1種類のAAVベクターまたは少なくとも1種類のレトロウイルスベクターの複数のコピーを組み込み、それによって前記ポリクローナルタンパク質の組成物の前記構成要素を産生できる細胞集団を生成する工程と;
b)前記細胞集団と、前記工程(a)によって生成された、前記ポリクローナルタンパク質の組成物の異なる構成要素を産生する異なる細胞集団と、を混合して、前記ポリクローナルタンパク質の組成物を産生できるポリクローナル細胞集団を生成する工程と;
を包含する、方法。 - 工程b)で生成される前記ポリクローナル細胞集団が、形質転換された宿主細胞および形質転換されていない宿主細胞を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団から、形質転換された宿主細胞の集団を選択する工程をさらに包含する、請求項2に記載の方法。
- 前記改質転換された宿主細胞の集団から、前記ポリクローナルタンパク質の組成物の2つ以上の構成要素をコードする核酸配列で形質転換された前記形質転換された宿主細胞の集団のサブセットを選択する工程をさらに包含する、請求項3に記載の方法。
- 前記選択がネガティブ選択工程である、請求項3または4に記載の方法。
- 前記選択がポジティブ選択工程である、請求項3または4に記載の方法。
- 前記選択工程が、工程b)の前に起こる、請求項3、5または6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記選択工程が、工程b)の後に起こる、請求項3〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つ以上の宿主細胞の形質転換が、前記少なくとも1種類のレトロウイルスベクターの複数のコピーを用いたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類のAAVベクターまたは少なくとも1種類のレトロウイルスベクターが、それぞれAAVベクターのライブラリーまたはレトロウイルスベクターのライブラリーである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ベクターのライブラリーが、一緒になって単一の多量体タンパク質を形成する複数のポリペプチドをコードする、請求項10に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質の組成物が、一緒になって特定の抗原性エピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでいるポリペプチドおよび免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質の組成物が、一緒になってT細胞レセプター(TCR)を形成する2つのポリペプチドを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記一緒になってTCRを形成する2つのポリペプチドが、TCRのα鎖を含んでいるポリペプチド、およびTCRのβ鎖を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項13に記載の方法。
- 前記一緒になってTCRを形成する2つのポリペプチドが、TCRのγ鎖を含んでいるポリペプチド、およびTCRのδ鎖を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項13に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類のAAVベクターまたは前記少なくとも1種類のレトロウイルスベクターが、一緒になって特定の抗原性エピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の両方をコードする核酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類のAAVベクターまたは前記少なくとも1種類のレトロウイルスベクターが、病原体の感染因子またはそのアイソフォームをコードする、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、工程(a)によって生成された細胞の大集団が混合されて、ポリクローナル細胞集団が生成される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において生成される前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも一万個の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において生成される前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも10万個の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において生成されるポリクローナル細胞集団が、少なくとも100万個の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において生成されるポリクローナル細胞集団が、少なくとも一千万個の細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、前記細胞集団と、前記異なる細胞集団とが1:1の比で混合される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、前記細胞集団と、前記異なる細胞集団とが1:1とは異なる比で混合される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において生成されるポリクローナル細胞集団をバンキングすることをさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)の後、工程(a)によって生成される細胞集団がバンキングされない、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において生成されるポリクローナル細胞集団から前記ポリクローナルタンパク質の組成物を精製することをさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)において、宿主細胞が、前記少なくとも1種類のAAVベクターの複数コピーまたは前記少なくとも1種類のレトロウイルスベクターの複数コピーを用いて少なくとも2回形質転換される、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)において、宿主細胞が、前記少なくとも1種類のAAVベクターの複数コピーまたは前記少なくとも1種類のレトロウイルスベクターの複数コピーを用いて少なくとも5回形質転換される、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも3つの細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも5つの細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも10個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも15個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも20個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも25個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも50個の細胞集団を含み、各々が異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも3つの異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも5つの異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、少なくとも10個の異なるタンパク質を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質の組成物が抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質の組成物が、T細胞レセプターである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質の組成物が、ワクチン中で使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質の組成物が、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群より選択される方法によって精製される、請求項27に記載の方法。
- 前記ポリクローナルタンパク質の組成物の安定性が、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、パパイン消化に続く2−Dゲル分析、マイクロアレイ、qPCR、およびELISAアッセイからなる群より選択される方法によって決定される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって産生される、細胞集団。
- 請求項27に記載の方法によって産生される、組換え抗体組成物。
- 前記ポリクローナル細胞集団が、前記ポリクローナルタンパク質の組成物の少なくとも2つの異なる構成要素を産生できる、請求項1に記載の方法。
- 請求項12に記載の方法によって産生される前記ポリクローナル細胞集団によって産生される、組換え抗体組成物。
- 前記ベクターのライブラリーが、多量体タンパク質をコードする、請求項10に記載の方法。
- 前記多量体タンパク質が、一緒になって特定の抗原性エピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変領域を含んでいるポリペプチドおよび免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでいるポリペプチドを含んでなる、請求項49に記載の方法。
- 前記1つ以上の宿主細胞の形質転換が、前記少なくとも1種類のAAVベクターの複数のコピーを用いるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記AAV repタンパク質が、パッケージング細胞株中で、別のDNAベクター上で、mRNAとして、または、組換えタンパク質として、前記宿主細胞に提供される、請求項51に記載の方法。
- 前記AAV repタンパク質がrep78である、請求項51に記載の方法。
- 各細胞集団が、少なくとも11週の期間にわたってその構成要素を少なくとも3pg/細胞/日で産生する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリクローナル細胞集団中の各細胞集団の割合は、混合から少なくとも35日間にわたって、20%を超えて変化しない、請求項1に記載の方法。
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