TW202122582A - 病毒蛋白之控制表現 - Google Patents

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Abstract

本發明闡述用於產生包含重組腺相關病毒(rAAV)顆粒之腺相關病毒(AAV)顆粒之方法及系統。在某些實施例中，該等產生方法及系統使用草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )昆蟲細胞(例如Sf9或Sf21)作為病毒產生細胞。在某些實施例中，該等產生方法及系統使用桿狀病毒表現載體(BEV)來產生AAV顆粒。在某些實施例中，該等產生方法及系統容許控制表現AAV衣殼蛋白，例如VP1、VP2及VP3。

Description

病毒蛋白之控制表現
本發明闡述用於產生包含重組腺相關病毒(rAAV)顆粒之腺相關病毒(AAV)顆粒之方法及系統。在某些實施例中，該等產生方法及系統使用草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )昆蟲細胞(例如Sf9或Sf21)作為病毒產生細胞。在某些實施例中，該等產生方法及系統使用桿狀病毒表現載體(BEV)來產生AAV顆粒。在某些實施例中，該等產生方法及系統容許控制表現AAV衣殼蛋白、例如VP1、VP2及VP3。
AAV已成為用於將基因轉移至哺乳動物細胞中之最廣泛研究及利用之病毒載體之一。例如參見Tratschin等人，Mol. Cell Biol ., 5(11):3251-3260 (1985)及Grimm等人，Hum. Gene Ther., 10(15):2445-2450 (1999)，其內容以全文引用方式併入本文中。腺相關病毒(AAV)載體係用於治療基因遞送之有前景候選者且已證實在臨床試驗中較為安全及有效。用於此目的之改良AAV顆粒之設計及產生係活躍之研究領域。
隨著AAV領域之發展，仍需要用於產生AAV載體(例如AAV顆粒)及相應基因療法產生材料(例如桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC))之改良之系統及方法。
本發明呈現轉錄調節系統。在某些實施例中，轉錄調節系統包括一或多個調節元件。在某些實施例中，轉錄調節系統包括一或多個調節結合序列。在某些實施例中，轉錄調節系統包括一或多個誘導元件。在某些實施例中，轉錄調節系統包括一或多個調節元件、一或多個調節結合序列及一或多個誘導元件。
在某些實施例中，調節元件具有結合調節結合序列之高親和力。在某些實施例中，轉錄調節系統包括兩個調節結合序列，且其中調節元件具有同時結合兩個調節結合序列之高親和力。在某些實施例中，調節元件同時結合至兩個調節結合序列使得在兩個調節結合序列之間之核苷酸序列中形成環結構。
在某些實施例中，誘導元件可結合至調節元件，由此減小調節元件結合至調節結合序列之親和力。在某些實施例中，誘導元件結合至調節元件使得調節元件產生構形變化，由此減小調節元件結合至調節結合序列之親和力。
在某些實施例中，轉錄調節系統包括至少一個係選自野生型Lac抑制蛋白(wLacR)或經改造Lac抑制蛋白(eLacr)之Lac抑制蛋白(LacR)之調節元件。在某些實施例中，至少一個調節元件係經改造Lac抑制蛋白(eLacr)。在某些實施例中，經改造LacR蛋白係由包括SEQ ID NO: 2之核苷酸序列編碼。在某些實施例中，經改造LacR蛋白係由與SEQ ID NO: 2至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列編碼。在某些實施例中，經改造LacR蛋白係由選自SEQ ID NO: 2之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 2至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列編碼。
在某些實施例中，轉錄調節系統包括至少一個係Lac操縱子(LacO)核苷酸序列之調節結合序列。在某些實施例中，至少一個調節結合序列係包括SEQ ID NO: 4之Lac操縱子(LacO)核苷酸序列。在某些實施例中，至少一個調節結合序列係與SEQ ID NO: 4至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之Lac操縱子(LacO)核苷酸序列。在某些實施例中，至少一個調節結合序列係選自SEQ ID NO: 4之Lac操縱子(LacO)核苷酸序列或與SEQ ID NO: 4至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，至少一個誘導元件係選自乳糖、異乳糖及異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)。在某些實施例中，至少一個誘導元件包括乳糖。在某些實施例中，至少一個誘導元件包括異乳糖。在某些實施例中，至少一個誘導元件包括異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)。
本發明呈現包括本發明之轉錄調節系統之一或多種組分之病毒表現構築體。在某些實施例中，病毒表現構築體包括第一蛋白質編碼區及第一調節區。在某些實施例中，病毒表現構築體之第一蛋白質編碼區包括編碼第一蛋白質之核苷酸序列及可操作地連接至編碼第一蛋白質之核苷酸序列之第一表現控制序列。在某些實施例中，第一表現控制序列包括調節編碼第一蛋白質之核苷酸序列之轉錄之啟動子，且亦包括轉錄調節系統之一或多個調節結合序列。在某些實施例中，病毒表現構築體之第一調節區包括編碼轉錄調節系統之一或多個調節元件之第一調節核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括第一蛋白質編碼區及第一調節區；其中病毒表現構築體之第一蛋白質編碼區包括編碼第一蛋白質之核苷酸序列及可操作地連接至編碼第一蛋白質之核苷酸序列的第一表現控制序列；其中第一表現控制序列包括調節編碼第一蛋白質之核苷酸序列之轉錄之啟動子，且亦包括轉錄調節系統之一或多個調節結合序列；且其中病毒表現構築體之第一調節區包括編碼轉錄調節系統之一或多個調節元件之第一調節核苷酸序列。
在某些實施例中，第一調節區包括含有SEQ ID NO: 5之核苷酸序列。在某些實施例中，第一調節區包括與SEQ ID NO: 5至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第一調節區包括選自SEQ ID NO: 5之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 5至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第一調節區包括含有SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。在某些實施例中，第一調節區包括與SEQ ID NO: 10至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第一調節區包括選自SEQ ID NO: 10之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 10至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第一調節區包括含有SEQ ID NO: 11之核苷酸序列。在某些實施例中，第一調節區包括與SEQ ID NO: 11至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第一調節區包括選自SEQ ID NO: 11之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 11至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括第二調節區。在某些實施例中，第二調節區包括第二調節核苷酸序列，其中第二調節核苷酸序列編碼轉錄調節系統之一或多個調節元件。
在某些實施例中，第二調節區包括含有SEQ ID NO: 12之核苷酸序列。在某些實施例中，第二調節區包括與SEQ ID NO: 12至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第二調節區包括選自SEQ ID NO: 12之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 12至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第二調節區包括含有SEQ ID NO: 22之核苷酸序列。在某些實施例中，第二調節區包括與SEQ ID NO: 22至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第二調節區包括選自SEQ ID NO: 22之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 22至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第一蛋白質編碼區包括含有SEQ ID NO: 25之核苷酸序列。在某些實施例中，第一蛋白質編碼區包括與SEQ ID NO: 25至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第一蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 25之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 25至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第一蛋白質編碼區包括含有SEQ ID NO: 28之核苷酸序列。在某些實施例中，第一蛋白質編碼區包括與SEQ ID NO: 28至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第一蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 28之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 28至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第一表現控制序列之調節結合序列位於自第一表現控制序列之啟動子之一端起5-100個核苷酸內。在某些實施例中，第一表現控制序列包括：第一調節結合序列，其係第一表現控制序列之啟動子之5'端上游之5-100個核苷酸；及第二調節結合序列，其係第一表現控制序列之啟動子之3'端下游之5-100個核苷酸。在某些實施例中，第一調節結合序列與第二調節結合序列之間具有150至300、150至250、150至225或150至210個核苷酸之空間間隔，如自每一調節結合序列之中心核苷酸所量測。
在某些實施例中，由調節核苷酸序列編碼之調節元件結合至第一表現控制序列中之一或多個調節結合序列，且抑制或減小編碼第一蛋白質之核苷酸序列自第一表現控制序列中之啟動子之轉錄。在某些實施例中，由調節核苷酸序列編碼之調節元件結合至第一表現控制序列中之第一調節結合序列及第二調節結合序列，從而形成環繞第一表現控制序列中之啟動子之環結構，且由此抑制或減小編碼第一蛋白質之核苷酸序列自第一表現控制序列中之啟動子之轉錄。
在某些實施例中，編碼第一蛋白質之核苷酸序列編碼選自VP1、僅VP1、僅VP2、僅VP3或其組合之結構性AAV衣殼蛋白。在某些實施例中，編碼第一蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP1。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括第二蛋白質編碼區，該第二蛋白質編碼區包括編碼第二蛋白質之核苷酸序列及可操作地連接至編碼第二蛋白質之核苷酸序列之第二表現控制序列。在某些實施例中，第二表現控制序列包括調節編碼第二蛋白質之核苷酸序列之轉錄之啟動子，且亦包括轉錄調節系統之一或多個調節結合序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括第二蛋白質編碼區，該第二蛋白質編碼區包括編碼第二蛋白質之核苷酸序列及可操作地連接至編碼第二蛋白質之核苷酸序列之第二表現控制序列；其中第二表現控制序列包括調節編碼第二蛋白質之核苷酸序列之轉錄之啟動子，且亦包括轉錄調節系統之一或多個調節結合序列。
在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括含有SEQ ID NO: 41之核苷酸序列。在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括與SEQ ID NO: 41至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 41之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 41至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括含有SEQ ID NO: 43之核苷酸序列。在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括與SEQ ID NO: 43至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 43之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 43至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括含有SEQ ID NO: 44之核苷酸序列。在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括與SEQ ID NO: 44至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 44之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 44至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括含有SEQ ID NO: 52之核苷酸序列。在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括與SEQ ID NO: 52至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第二蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 52之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 52至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，第二表現控制序列之調節結合序列位於自第二表現控制序列之啟動子之一端起5-100個核苷酸內。在某些實施例中，第二表現控制序列包括第一調節結合序列，其係第二表現控制序列之啟動子之5'端上游之5-100個核苷酸；及第二調節結合序列，其係第二表現控制序列之啟動子之3'端下游之5-100個核苷酸。在某些實施例中，第一調節結合序列與第二調節結合序列之間具有150至300、150至250、150至225或150至210個核苷酸之空間間隔，如自每一調節結合序列之中心核苷酸所量測。
在某些實施例中，由調節核苷酸序列編碼之調節元件結合至第二表現控制序列中之一或多個調節結合序列，且抑制或減小編碼第二蛋白質之核苷酸序列自第二表現控制序列中之啟動子之轉錄。在某些實施例中，由調節核苷酸序列編碼之調節元件結合至第二表現控制序列中之第一調節結合序列及第二調節結合序列，從而形成環繞第二表現控制序列中之啟動子之環結構，且由此抑制或減小編碼第二蛋白質之核苷酸序列自第二表現控制序列中之啟動子之轉錄。在某些實施例中，編碼第二蛋白質之核苷酸序列編碼選自VP1、僅VP1、僅VP2、僅VP3或其組合之結構性AAV衣殼蛋白。在某些實施例中，編碼第二蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP2。在某些實施例中，編碼第二蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP3。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括第三蛋白質編碼區，該第三蛋白質編碼區包括編碼第三蛋白質之核苷酸序列及可操作地連接至編碼第三蛋白質之核苷酸序列之第三表現控制序列；其中第三表現控制序列包括調節編碼第三蛋白質之核苷酸序列之轉錄之啟動子。
在某些實施例中，第三蛋白質編碼區包括含有SEQ ID NO: 53之核苷酸序列。在某些實施例中，第三蛋白質編碼區包括與SEQ ID NO: 53至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，第三蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 53之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 53至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
在某些實施例中，編碼第三蛋白質之核苷酸序列編碼選自VP1、僅VP1、僅VP2、僅VP3或其組合之結構性AAV衣殼蛋白。在某些實施例中，編碼第三蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP2。在某些實施例中，編碼第三蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP3。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括含有SEQ ID NO: 56之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體包括與SEQ ID NO: 56至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體包括選自SEQ ID NO: 56之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 56至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
本發明呈現包括本發明之病毒表現構築體之病毒產生細胞。
本發明呈現包括本發明之病毒表現構築體之病毒產生系統。在某些實施例中，病毒產生系統包括本發明之病毒表現構築體及本發明之轉錄調節系統。在某些實施例中，病毒產生系統包括含有本發明之病毒表現構築體之病毒產生細胞。在某些實施例中，病毒產生系統包括含有本發明之病毒表現構築體之病毒產生細胞及本發明之轉錄調節系統。在某些實施例中，轉錄調節系統之一或多個調節結合序列包括於病毒表現構築體中。在某些實施例中，轉錄調節系統之一或多個調節元件由包括於病毒表現構築體中之調節核苷酸序列編碼。
在某些實施例中，一或多個誘導元件結合至一或多個由調節核苷酸序列編碼之調節元件，且減小調節元件結合一或多個調節結合序列之親和力。在某些實施例中，一或多個編碼蛋白質之核苷酸序列之轉錄程度隨病毒產生系統內之誘導元件之濃度成比例地增加或降低。在某些實施例中，一或多個誘導元件結合至一或多個由調節核苷酸序列編碼之調節元件，且減小調節元件結合一或多個調節結合序列之親和力，從而一或多個編碼蛋白質之核苷酸序列之轉錄程度隨病毒產生系統內之誘導元件之濃度成比例地增加或降低。在某些實施例中，一或多個編碼蛋白質之核苷酸序列編碼一或多種結構性AAV衣殼蛋白。
在某些實施例中，一或多個誘導元件以靶濃度存在於病毒產生細胞中；其中病毒產生細胞內靶濃度之誘導元件使得產生VP1:VP2:VP3蛋白質比率為0.5-2:0.5-2:10之AAV衣殼。在某些實施例中，一或多個誘導元件以靶濃度存在於病毒產生細胞中；其中病毒產生細胞內靶濃度之誘導元件使得產生VP1:VP2:VP3蛋白質比率為1-2:1-2:10之AAV衣殼。
在某些實施例中，一或多個編碼蛋白質之核苷酸序列編碼一或多種結構性AAV衣殼蛋白；其中一或多個誘導元件以靶濃度存在於病毒產生細胞中；且其中病毒產生細胞內靶濃度之誘導元件使得產生VP1:VP2:VP3蛋白質比率為0.5-2:0.5-2:10之AAV衣殼。在某些實施例中，一或多個編碼蛋白質之核苷酸序列編碼一或多種結構性AAV衣殼蛋白；其中一或多個誘導元件以靶濃度存在於病毒產生細胞中；且其中病毒產生細胞內靶濃度之誘導元件使得產生VP1:VP2:VP3蛋白質比率為1-2:1-2:10之AAV衣殼。
在某些實施例中，誘導元件係以介於約1.0 µM至約100 µM之間之濃度、較佳地介於約1.0 µM至約35 µM之間之濃度存在。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張以下申請案之優先權權益：2019年8月26日提出申請之美國臨時專利申請案第62/891,621號；2020年2月26日提出申請之美國臨時專利申請案第62/981,796號；及2020年4月30日提出申請之美國臨時專利申請案第63/017,776號；每一者之內容以全文引用方式併入本文中。 序列表之參考
本申請案係與序列表以電子格式一起申請。序列表提供為於2020年8月26日創建且大小為60,605個位元組之標題為20571532TW_SL.txt之文件。序列表之電子格式之資訊之全部內容以引用方式併入本文中。 I.腺相關病毒(AAV)  概述
腺相關病毒(AAV)係特徵在於單鏈DNA病毒基因體之小病毒科(Parvoviridae family)之小非包膜二十面體衣殼病毒。小病毒科病毒由以下兩個亞科組成：細小病毒亞科(Parvovirinae)，其感染脊椎動物；及濃核病毒亞科(Densovirinae)，其感染無脊椎動物。小病毒科包含能夠複製於脊椎動物宿主(包含(但不限於)人類、靈長類動物、牛、犬、馬及羊物種)中之依賴病毒(Dependovirus)屬(包含AAV)。
小病毒科之細小病毒及其他成員通常闡述於Kenneth I. Berns, 「Parvoviridae: The Viruses and Their Replication」，第69章，Fields Virology (第3版，1996)，其內容以全文引用方式併入本文中。
AAV已證實可用作生物工具，此乃因其具有相對簡單結構、其能夠在不整合至宿主基因體中且不複製下感染寬範圍之細胞(包含靜止及分裂細胞)且其具有相對良性之免疫原性特徵。病毒基因體可經操縱以含有用於組裝功能性重組病毒或病毒顆粒之最少組分，該功能性重組病毒或病毒顆粒經加載或改造以靶向特定組織且表現或遞送期望酬載。 AAV病毒基因體
野生型AAV病毒基因體係長度為大約5,000個核苷酸(nt)之線性、單鏈DNA (ssDNA)分子。倒轉末端重複(ITR)傳統上在5'及3'端處皆封端病毒基因體，從而提供病毒基因體之複製起點。不期望受限於理論，AAV病毒基因體通常包括兩個ITR序列。該等ITR具有由ssDNA之5'及3'端處之自互補區(野生型AAV中之145 nt)界定之特徵性T型髮夾結構，從而形成能量穩定之雙鏈區。雙鏈髮夾結構包括多種功能，包括(但不限於)藉由用作宿主病毒複製細胞之內源性DNA聚合酶複合物之引子來用作DNA複製起點。
野生型AAV病毒基因體進一步包括兩個開放閱讀框之核苷酸序列，一個開放閱讀框係針對4種非結構性Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40，由Rep基因編碼)且一個開放閱讀框係針對三種衣殼或結構蛋白(VP1、VP2、VP3，由衣殼基因或Cap基因編碼)。Rep蛋白對於複製及包裝較為重要，而衣殼蛋白經組裝以產生AAV或AAV衣殼之蛋白質殼體。選擇式剪接及交替起始密碼子及啟動子可自單一開放閱讀框生成4種不同Rep蛋白且自單一開放閱讀框生成三種衣殼蛋白。儘管隨AAV血清型有所變化，但(作為一非限制性實例)在AAV9/hu.14 (US 7,906,111之SEQ ID NO: 123，該案件之內容中與AAV9/hu.14相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)中，VP1係指胺基酸1-736，VP2係指胺基酸138-736，且VP3係指胺基酸203-736。換言之，VP1係全長衣殼序列，而VP2及VP3係整體之較短組分。因此，VP3區域中之序列變化亦改變VP1及VP2，然而，VP3中之與親代序列相比之差異百分比最大，此乃因其係三者中之最短序列。儘管針對胺基酸序列進行闡述，但可類似地闡述編碼該等蛋白質之核酸序列。三種衣殼蛋白組裝至一起以產生AAV衣殼蛋白。不期望受限於理論，AAV衣殼蛋白通常包括莫耳比率為1:1:10之VP1:VP2:VP3。如本文中所使用，「AAV血清型」主要係根據AAV衣殼來定義。在一些情況下，ITR亦由AAV血清型特異性闡述(例如AAV2/9)。
在用作生物工具時，野生型AAV病毒基因體可經修飾以使用包括具有至少一個ITR區之酬載區之核酸序列來代替rep/cap序列。通常，在重組AAV病毒基因體中，存在兩個ITR區。rep/cap序列可在產生期間反式提供以生成AAV顆粒。
除所編碼異源性酬載外，AAV載體亦可整體或部分地包括任一天然及/或重組AAV血清型核苷酸序列或變體之病毒基因體。AAV變體可具有在核酸(基因體或衣殼)及胺基酸(衣殼)層面上顯著同源之序列以產生通常係物理及功能等效物、藉由類似機制複製且藉由類似機制組裝之構築體。參見Chiorini等人，J. Vir. 71: 6823-33(1997)；Srivastava等人，J. Vir. 45:555-64 (1983)；Chiorini等人，J. Vir. 73:1309-1319 (1999)；Rutledge等人，J. Vir. 72:309-319 (1998)；及Wu等人，J. Vir. 74: 8635-47 (2000)，每一者之內容中與AAV變體及等效物相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本發明之AAV顆粒、病毒基因體及/或酬載及其使用方法可如WO2017189963中所闡述，該案件之內容中與AAV顆粒、病毒基因體及/或酬載相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
本發明之AAV顆粒可調配為本發明之任一基因療法調配物(包括熟習此項技術者所熟知之該等調配物之任何變化形式)。本申請案中所提及之「AAV顆粒」、「AAV顆粒調配物」及「經調配AAV顆粒」係指可調配之AAV顆粒亦及無限制性調配者。
在某些實施例中，本發明之AAV顆粒係重組AAV (rAAV)病毒顆粒，其具有複製缺陷性且在病毒基因體內缺乏編碼功能性Rep及Cap蛋白之序列。該等缺陷性AAV顆粒可缺乏大部分或所有親代編碼序列且基本上僅攜載一或兩個AAV ITR序列及用於遞送至細胞、組織器、官或生物體之所關注核酸(亦即酬載)。
在某些實施例中，本發明之AAV顆粒之病毒基因體包括至少一種複製、轉錄及轉譯其中所編碼之編碼序列之控制元件。並非所有控制元件皆需要總是存在，只要編碼序列能夠複製、轉錄及/或轉譯於適當宿主細胞中即可。表現控制元件之非限制性實例包括用於轉錄起始及/或終止之序列、啟動子及/或增強子序列、有效RNA處理信號(例如剪接及多聚腺苷酸化信號)、穩定細胞質mRNA之序列、增強轉譯效能之序列(例如科紮克共有序列(Kozak consensus sequence))、增強蛋白質穩定性之序列及/或增強蛋白質處理及/或分泌之序列。
根據本發明，用於治療及/或診斷之AAV顆粒包括已蒸餾或還原至轉導所關注核酸酬載或負荷之病毒所需之最少組分。以此方式，將AAV顆粒改造為用於特定遞送之媒劑，而並無野生型病毒中所發現之有害複製及/或整合特徵。
本發明之AAV顆粒可以重組方式產生且可基於腺相關病毒(AAV)親代或參考序列。如本文中所使用，「載體」係傳輸、轉導本文所闡述之異源性分子(例如核酸)或另外用作其載劑之任一分子或部分。
除單鏈AAV病毒基因體(例如ssAAV)外，本發明亦提供自我互補性AAV (scAAV)病毒基因體。scAAV病毒基因體含有一起退火以形成雙鏈DNA之DNA鏈。藉由跳過第二鏈合成，scAAV容許快速表現於細胞中。
在某些實施例中，本發明之AAV病毒基因體係scAAV。在某些實施例中，本發明之AAV病毒基因體係ssAAV。
產生及/或修飾AAV顆粒之方法揭示於業內，例如假型AAV顆粒(PCT專利公開案第WO200028004號、第WO200123001號、第WO2004112727號、第WO 2005005610號及第WO 2005072364號，每一者之內容中與產生及/或修飾AAV顆粒相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)。
AAV顆粒可經修飾以增強遞送效率。該等經修飾AAV顆粒可有效包裝且用於成功地以高頻率及最小毒性來感染靶細胞。在某些實施例中，根據美國公開案第US 20130195801號中所闡述之方法來改造AAV顆粒之衣殼，該公開案之內容中與修飾AAV顆粒以增強遞送效率相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，AAV顆粒包括編碼本發明之多肽或蛋白質之酬載構築體及/或區域，且可引入哺乳動物細胞中。在某些實施例中，AAV顆粒包括編碼本發明之多肽或蛋白質之酬載構築體及/或區域，且可引入昆蟲細胞中。
在某些實施例中，本發明之AAV顆粒包括具有至少一個ITR區及酬載區之病毒基因體。在某些實施例中，病毒基因體具有兩個ITR。該兩個ITR在5'及3'端處側接於酬載區。ITR用作包括複製識別位點之複製起點。ITR包括可互補及對稱配置之序列區。納入本發明之病毒基因體中之ITR可包括天然多核苷酸序列或以重組方式衍生之多核苷酸序列。
ITR可與衣殼或其衍生物衍生自相同血清型。ITR可與衣殼係不同血清型。在某些實施例中，AAV顆粒具有一個以上之ITR。在一非限制性實例中，AAV顆粒具有包括兩個ITR之病毒基因體。在某些實施例中，ITR彼此係相同血清型。在另一實施例中，ITR係不同血清型。非限制性實例包括零、一或兩個與衣殼具有相同血清型之ITR。在某些實施例中，AAV顆粒之病毒基因體之兩個ITR係AAV2 ITR。
獨立地，每一ITR之長度可為約100至約150個核苷酸。ITR可具有約100-105個核苷酸之長度、106-110個核苷酸之長度、111-115個核苷酸之長度、116-120個核苷酸之長度、121-125個核苷酸之長度、126-130個核苷酸之長度、131-135個核苷酸之長度、136-140個核苷酸之長度、141-145個核苷酸之長度或146-150個核苷酸之長度。在某些實施例中，ITR之長度為140-142個核苷酸。ITR長度之非限制性實例為102、130、140、141、142、145個核苷酸之長度。
在某些實施例中，每一ITR之長度可為141個核苷酸。在某些實施例中，每一ITR之長度可為130個核苷酸。在某些實施例中，每一ITR之長度可為119個核苷酸。病毒基因體大小
在某些實施例中，包含本文所闡述酬載之AAV顆粒可為單鏈或雙鏈病毒基因體。病毒基因體之大小可為較小、中等、較大或最大大小。另外，病毒基因體可包含啟動子及聚A尾部。
在某些實施例中，包含本文所闡述酬載之病毒基因體可為小單鏈病毒基因體。小單鏈病毒基因體之大小可為2.1至3.5 kb，例如約2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4及3.5 kb之大小。作為一非限制性實例，小單鏈病毒基因體之大小可為3.2 kb。作為另一非限制性實例，小單鏈病毒基因體之大小可為2.2 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及聚A尾部。
在某些實施例中，包含本文所闡述酬載之病毒基因體可為小雙鏈病毒基因體。小雙鏈病毒基因體之大小可為1.3至1.7 kb，例如約1.3、1.4、1.5、1.6及1.7 kb之大小。作為一非限制性實例，小雙鏈病毒基因體之大小可為1.6 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及聚A尾部。
在某些實施例中，包含本文所闡述酬載(例如多核苷酸、siRNA或dsRNA)之病毒基因體可為中等單鏈病毒基因體。中等單鏈病毒基因體之大小可為3.6至4.3 kb，例如約3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2及4.3 kb之大小。作為一非限制性實例，中等單鏈病毒基因體之大小可為4.0 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及聚A尾部。
在某些實施例中，包含本文所闡述酬載之病毒基因體可為中等雙鏈病毒基因體。中等雙鏈病毒基因體之大小可為1.8至2.1 kb，例如約1.8、1.9、2.0及2.1 kb之大小。作為一非限制性實例，中等雙鏈病毒基因體之大小可為2.0 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及聚A尾部。
在某些實施例中，包含本文所闡述酬載之病毒基因體可為大單鏈病毒基因體。大單鏈病毒基因體之大小可為4.4至6.0，例如約4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0 kb之大小。作為一非限制性實例，大單鏈病毒基因體之大小可為4.7 kb。作為另一非限制性實例，大單鏈病毒基因體之大小可為4.8 kb。作為又一非限制性實例，大單鏈病毒基因體之大小可為6.0 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及聚A尾部。
在某些實施例中，包含本文所闡述酬載之病毒基因體可為大雙鏈病毒基因體。大雙鏈病毒基因體之大小可為2.2至3.0 kb，例如約2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0 kb之大小。作為一非限制性實例，大雙鏈病毒基因體之大小可為2.4 kb。另外，病毒基因體可包含啟動子及聚A尾部。
在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包含至少一個填充區。在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包含至少一個多選殖位點(MCS)區。在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包含至少一個啟動子區。在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包含至少一個外顯子區。在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包含至少一個內含子區。病毒基因體區 ： 倒轉末端重複 (ITR)
本發明之AAV顆粒包含具有至少一個倒轉末端重複(ITR)區及酬載區之病毒基因體。在某些實施例中，病毒基因體具有兩個ITR。該兩個ITR在5'及3'端處側接於酬載區。ITR用作包含複製識別位點之複製起點。ITR包含可互補及對稱配置之序列區。納入本發明之病毒基因體中之ITR可包含天然多核苷酸序列或以重組方式衍生之多核苷酸序列。
ITR可與衣殼或其衍生物衍生自相同血清型。ITR可與衣殼係不同血清型。在某些實施例中，AAV顆粒具有一個以上之ITR。在一非限制性實例中，AAV顆粒具有包含兩個ITR之病毒基因體。在某些實施例中，ITR彼此係相同血清型。在另一實施例中，ITR係不同血清型。非限制性實例包含零、一或兩個與衣殼具有相同血清型之ITR。在某些實施例中，AAV顆粒之病毒基因體之兩個ITR係AAV2 ITR。
獨立地，每一ITR之長度可為約100至約150個核苷酸。ITR可具有約100-105個核苷酸之長度、106-110個核苷酸之長度、111-115個核苷酸之長度、116-120個核苷酸之長度、121-125個核苷酸之長度、126-130個核苷酸之長度、131-135個核苷酸之長度、136-140個核苷酸之長度、141-145個核苷酸之長度或146-150個核苷酸之長度。在某些實施例中，ITR之長度為140-142個核苷酸。ITR長度之非限制性實例為102、130、140、141、142、145個核苷酸之長度及與其至少95%一致者。
在某些實施例中，每一ITR之長度可為141個核苷酸。在某些實施例中，每一ITR之長度可為130個核苷酸。在某些實施例中，每一ITR之長度可為119個核苷酸。
在某些實施例中，AAV顆粒包含兩個ITR，且一個ITR之長度為141個核苷酸且另一ITR之長度為130個核苷酸。在某些實施例中，AAV顆粒包含兩個ITR且兩個ITR之長度皆為141個核苷酸。
獨立地，每一ITR之長度可為約75至約175個核苷酸。ITR可獨立地具有例如(但不限於) 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174及175個核苷酸之長度。病毒基因體之ITR之長度可為75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175及170-175個核苷酸。作為一非限制性實例，病毒基因體包括長度為約105個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因體包括長度為約141個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因體包括長度為約130個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因體包括長約105個核苷酸至長141個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因體包括長約105個核苷酸至長130個核苷酸之ITR。作為一非限制性實例，病毒基因體包括長約130個核苷酸至長141個核苷酸之ITR。 AAV血清型
本發明之AAV顆粒可包含或衍生自任一天然或重組AAV血清型。根據本發明，AAV顆粒可利用或基於選自下列各項中之任一者之血清型或包含其肽：VOY101、VOY201、AAVPHP.B (PHP.B)、AAVPHP.A (PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2 (PHP.B2)、AAVPHP.B3 (PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3 (G2A3)、AAVG2B4 (G2B4)、AAVG2B5 (G2B5)、PHP.S、 AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T 、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、 AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-miRNA前體-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2 、AAV改組體100-1 、AAV改組體100-3、AAV改組體100-7、AAV改組體10-2、AAV改組體10-6、AAV改組體10-8、AAV改組體100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8 、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV (ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、 AAVF9/HSC9、AAVrh20、AAVrh32/33、AAVrh39、AAVrh46、AAVrh73、 AAVrh74、AAVhu.26或變體或其衍生物。
AAV-DJ序列可包含以下兩個突變：(1) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)；及(2) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。作為另一非限制性實例，可包含三個突變：(1) K406R，其中胺基酸406處之離胺酸(K；Lys)變為精胺酸(R；Arg)；(2) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)；及(3) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。
在某些實施例中，AAV可為由AAV9衣殼庫生成之在胺基酸390-627 (VP1編號)中具有突變之血清型。血清型及相應核苷酸及胺基酸取代可為(但不限於) AAV9.1 (G1594C；D532H)、AAV6.2 (T1418A及T1436X；V473D及I479K)、AAV9.3 (T1238A；F413Y)、AAV9.4 (T1250C及A1617T；F417S)、AAV9.5 (A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6 (T1231A；F411I)、AAV9.9 (G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10 (A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11 (A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13 (A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14 (T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16 (A1775T；Q592L)、AAV9.24 (T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26 (A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33 (A1667C；D556A)、AAV9.34 (A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35 (A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40 (A1694T、E565V)、AAV9.41 (A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44 (A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45 (A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46 (G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47 (G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48 (C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50 (A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53 (G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54 (C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55 (T1605A；F535L)、AAV9.58 (C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59 (T1336C；Y446H)、AAV9.61 (A1493T；N498I)、AAV9.64 (C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65 (C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68 (C1510A；P504T)、AAV9.80 (G1441A、;G481R)、AAV9.83 (C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87 (T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90 (A1196T；Y399F)、AAV9.91 (T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93 (A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94 (A1675T；M559L)及AAV9.95 (T1605A；F535L)。
在本文所提及及/或闡述之DNA及RNA序列中之任一者中，單字母符號具有下列說明：A係腺嘌呤；C係胞嘧啶；G係鳥嘌呤；T係胸腺嘧啶；U係尿嘧啶；W係弱鹼基，例如腺嘌呤或胸腺嘧啶；S係強核苷酸，例如胞嘧啶及鳥嘌呤；M係胺基核苷酸，例如腺嘌呤及胞嘧啶；K係酮基核苷酸，例如鳥嘌呤及胸腺嘧啶；R係嘌呤腺嘌呤及鳥嘌呤；Y係嘧啶胞嘧啶及胸腺嘧啶；B係任一非A鹼基(例如胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶)；D係任一非C鹼基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤及胸腺嘧啶)；H係任一非G鹼基(例如腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶)；V係任一非T鹼基(例如腺嘌呤、胞嘧啶及鳥嘌呤)；N係任一核苷酸(其並非間隙)；且Z係無。
在本文所提及及/或闡述之任一胺基酸序列中，單字母符號具有下列說明：G (Gly)係甘胺酸；A (Ala)係丙胺酸；L (Leu)係白胺酸；M (Met)係甲硫胺酸；F (Phe)係苯丙胺酸；W (Trp)係色胺酸；K (Lys)係離胺酸；Q (Gln)係麩醯胺酸；E (Glu)係麩胺酸；S (Ser)係絲胺酸；P (Pro)係脯胺酸；V (Val)係纈胺酸；I (Ile)係異白胺酸；C (Cys)係半胱胺酸；Y (Tyr)係酪胺酸；H (His)係組胺酸；R (Arg)係精胺酸；N (Asn)係天門冬醯胺酸；D (Asp)係天門冬胺酸；T (Thr)係蘇胺酸；B (Asx)係天門冬胺酸或天門冬醯胺酸；J (Xle)係白胺酸或異白胺酸；O (Pyl)係吡咯離胺酸；U (Sec)係硒半胱胺酸；X (Xaa)係任一胺基酸；且Z (Glx)係麩醯胺酸或麩胺酸。
在某些實施例中，AAV血清型可為或可包含如以下專利公開案中所闡述之序列、插入體、修飾或突變：WO2015038958、WO2017100671、WO2016134375、WO2017083722、WO2017015102、WO2017058892、WO2017066764、US9624274、US9475845、US20160369298、US20170145405，其內容以全文引用方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV可為藉由基於Cre重組之AAV靶向進化(CREATE)生成之血清型，如由Deverman等人(Nature Biotechnology 34(2):204-209 (2016))所闡述，該文獻之內容以全文引用方式併入本文中。在某些實施例中，AAV血清型可如Jackson等人(Frontiers in Molecular Neuroscience 9:154 (2016))中所闡述，該文獻之內容以全文引用方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV血清型係因其對於中樞神經系統之細胞之向性而選擇使用。在某些實施例中，中樞神經系統之細胞係神經元。在另一實施例中，中樞神經系統之細胞係星形細胞。
在某些實施例中，AAV血清型係因其對於肌肉之細胞之向性而選擇使用。
在某些實施例中，用於轉譯AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子可為CTG、TTG或GTG，如美國專利第US8163543號中所闡述，該專利之內容以全文引用方式併入本文中。
本發明提及由衣殼(Cap)基因編碼之結構衣殼蛋白(包含VP1、VP2及VP3)。該等衣殼蛋白形成病毒載體(例如AAV)之外蛋白質結構殼體(亦即衣殼)。自Cap多核苷酸合成之VP衣殼蛋白通常包含作為肽序列中之第一胺基酸(Met1)，該甲硫胺酸與相應Cap核苷酸序列中之起始密碼子(AUG或ATG)締合。然而，第一甲硫胺酸(Met1)殘基或通常任一第一胺基酸(AA1)通常在多肽合成之後或期間由蛋白質處理酶(例如Met-胺基肽酶)裂解掉。此「Met/AA剪切」過程通常與多肽序列中之第二胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸等)之相應乙醯化相關。Met剪切通常發生於VP1及VP3衣殼蛋白內，但亦可發生於VP2衣殼蛋白內。
在Met/AA剪切不完全之情形下，可產生構成病毒衣殼之一或多種(一種、兩種或三種) VP衣殼蛋白之混合物，一些VP衣殼蛋白可包含Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)且一些VP衣殼蛋白可因Met/AA剪切而缺乏Met1/AA1胺基酸(Met-/AA-)。關於衣殼蛋白中之Met/AA剪切之進一步論述，參見Jin等人，Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis for Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Capsid Proteins.Hum Gene Ther Methods . 2017 Oct. 28(5):255-267；Hwang等人，N-Terminal Acetylation of Cellular Proteins Creates Specific Degradation Signals.Science . 2010年2月19日。327(5968): 973-977；每一者之內容各自以全文引用方式併入本文中。
根據本發明，所提及衣殼蛋白並不限於任一經剪切(Met-/AA-)或未剪切(Met+/AA+)者，且可在上下文中係指獨立衣殼蛋白、包含衣殼蛋白混合物之病毒衣殼及/或編碼、闡述、產生或得到本發明衣殼蛋白之多核苷酸序列(或其片段)。直接提及之「衣殼蛋白」或「衣殼多肽」 (例如VP1、VP2或VP2)亦可包含含有Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)之VP衣殼蛋白以及因Met/AA剪切而缺乏Met1/AA1胺基酸(Met-/AA-)之相應VP衣殼蛋白。
另外，根據本發明，所提及分別包含或編碼一或多種包含Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)之衣殼蛋白之具體SEQ ID NO: (不論蛋白質抑或核酸)應理解為教示缺乏Met1/AA1胺基酸之VP衣殼蛋白，此乃因在評審序列時易於明瞭任一僅缺乏第一列示胺基酸(不論是否Met1/AA1)之序列。
作為一非限制性實例，所提及長度為736個胺基酸且包含由AUG/ATG起始密碼子編碼之「Met1」胺基酸(Met+)之VP1多肽序列亦可理解為教示長度為735個胺基酸且不包含736胺基酸Met+序列之「Met1」胺基酸(Met-)的VP1多肽序列。作為第二非限制性實例，所提及長度為736個胺基酸且包含由任一NNN起始密碼子編碼之「AA1」胺基酸(AA1+)之VP1多肽序列亦可理解為教示長度為735個胺基酸且不包含736胺基酸AA1+序列之「AA1」胺基酸(AA1-)的VP1多肽序列。
所提及自VP衣殼蛋白形成之病毒衣殼(例如所提及之特定AAV衣殼血清型)可納入包含Met1/AA1胺基酸(Met+/AA1+)之VP衣殼蛋白、因Met/AA1剪切而缺乏Met1/AA1胺基酸(Met-/AA1-)之相應VP衣殼蛋白及其組合(Met+/AA1+及Met-/AA1-)。
作為一非限制性實例，AAV衣殼血清型可包含VP1 (Met+/AA1+)、VP1 (Met-/AA1-)或VP1 (Met+/AA1+)及VP1 (Met-/AA1-)之組合。AAV衣殼血清型亦可包含VP3 (Met+/AA1+)、VP3 (Met-/AA1-)或VP3 (Met+/AA1+)及VP3 (Met-/AA1-)之組合；且亦可包含VP2 (Met+/AA1)及VP2 (Met-/AA1-)之類似可選組合。 酬載
本發明之AAV顆粒可包括至少一個包括至少一個酬載區之酬載構築體或使用該酬載構築體產生。在某些實施例中，酬載區可位於病毒基因體(例如酬載構築體之病毒基因體)內。在酬載區之5’及/或3’端處，可存在至少一個倒轉末端重複(ITR)。在酬載區內，可存在啟動子區、內含子區及編碼區。
在某些實施例中，AAV顆粒之酬載區包括一或多個編碼一或多種酬載(例如酬載多肽或多核苷酸)之核酸序列。在某些實施例中，AAV顆粒之酬載區包括一或多個編碼一或多種所關注多肽或蛋白質之核酸序列。在某些實施例中，AAV顆粒之酬載區包括一或多個編碼一或多種調節性多核苷酸(例如作為治療劑之RNA或DNA分子)之核酸序列。因此，本發明提供編碼處理成靶向所關注基因之小雙鏈RNA (dsRNA)分子(小干擾RNA、siRNA、miRNA、miRNA前體)之多核苷酸之病毒基因體。本發明亦提供其用於抑制所關注基因之等位基因之基因表現及蛋白質產生、用於治療疾病、病症及/或病狀之方法。
在某些實施例中，酬載區可包含於用於產生AAV顆粒之酬載構築體中。在某些實施例中，本發明之酬載構築體可為桿粒，其亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因體。在某些實施例中，本發明之酬載構築體可為桿狀病毒表現載體(BEV)。在某些實施例中，本發明之酬載構築體可為包含BEV之BIIC。如本文中所使用，術語「酬載Bac」係指包括酬載構築體及/或酬載區之桿粒(例如BEV)。可使用酬載Bac及/或使用包括酬載Bac之BIIC轉染病毒產生細胞(例如Sf9細胞)。
在某些實施例中，本發明之AAV顆粒包括一或多個編碼一或多種酬載(例如酬載多肽或多核苷酸)之核酸序列，該等AAV顆粒可在醫學領域中用於治療、防治、緩解或改善疾病及/或病症(包含神經學疾病及/或病症)。在某些實施例中，本發明之AAV顆粒可在醫學領域中用於治療、防治、緩解或改善弗裡德賴希共濟失調(Friedreich’s ataxia)或任一源於共濟蛋白之損失或部分損失之疾病。在某些實施例中，本發明之AAV顆粒可在醫學領域中用於治療、防治、緩解或改善帕金森氏病(Parkinson’s Disease)。在某些實施例中，本發明之AAV顆粒可在醫學領域中用於治療、防治、緩解或改善肌肉萎縮性脊髓側索硬化症。在某些實施例中，本發明之AAV顆粒可在醫學領域中用於治療、防治、緩解或改善亨廷頓氏病(Huntington’s Disease)。在某些實施例中，本發明之AAV顆粒可在醫學領域中用於治療、防治、緩解或改善阿茲海默氏病(Alzheimer’s Disease)。酬載 ： 多肽及變體
在某些實施例中，AAV顆粒之酬載區包括一或多個編碼所關注多肽或蛋白質之核酸序列。在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼一種以上所關注多肽之核酸序列。在某些實施例中，可複製編碼一或多種多肽之病毒基因體且包裝成病毒顆粒。使用包括病毒基因體之病毒顆粒轉導之靶細胞可表現單一靶細胞中之一或多種多肽中之每一者。
在AAV顆粒酬載區編碼多肽之情形下，多肽可為肽、多肽或蛋白質。作為一非限制性實例，酬載區可編碼至少一種所關注治療蛋白。本文所闡述編碼多肽之AAV病毒基因體可用於人類疾病、病毒、感染獸醫應用之領域及各種活體內及活體外環境中。
在某些實施例中，向受試者投與所調配AAV顆粒(其包括病毒基因體)將增加蛋白質在受試者中之表現。在某些實施例中，增加蛋白質表現將減小與由酬載編碼之多肽有關之疾病或病痛之效應及/或症狀。
在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼所關注蛋白質(亦即酬載蛋白、治療蛋白)之核酸序列。
由本發明病毒基因體之酬載區編碼之胺基酸序列可轉譯為全多肽、複數個多肽或多肽片段(其可獨立地由一或多個核酸編碼)、核酸片段或上文所提及物質中之任一者之變體。如本文中所使用，「多肽」係指最通常由肽鍵連接至一起之胺基酸殘基(天然或非天然)之聚合物。在某些實施例中，多肽可包含具有任一大小、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。在一些情況下，所編碼多肽小於約50個胺基酸(亦即肽)。若多肽係肽，則其長至少約2、3、4或至少5個胺基酸殘基。因此，多肽包括基因產物、天然多肽、合成多肽、同系物、直向同源物、同種同源物、片段及前述物質之其他等效物、變體及類似物。多肽可為單一分子或可為多分子複合物(例如二聚體、三聚體或四聚體)。其亦可包括單鏈或多鏈多肽且可發生締合或連接。術語多肽亦可適用於其中一或多個胺基酸殘基係相應天然胺基酸之人工化學類似物之胺基酸聚合物。
在某些實施例中，多肽可為胺基酸序列與天然或參考序列不同之多肽變體。與天然或參考序列相比，胺基酸序列變體可在胺基酸序列內之某些位置處擁有取代、缺失及/或插入。通常，變體與天然或參考序列擁有至少約50%之一致性(同源性)，且在某些實施例中，其與天然或參考序列至少約80%或至少約90%一致(同源性)。
在某些實施例中，AAV顆粒之酬載區包括一或多個編碼所關注多肽或蛋白質之核酸序列。
在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼一種以上所關注多肽之核酸序列。在某些實施例中，可複製編碼一或多種多肽之病毒基因體且包裝成病毒顆粒。使用包括病毒基因體之病毒顆粒轉導之靶細胞可表現單一靶細胞中之一或多種多肽中之每一者。
在AAV顆粒酬載區編碼多肽之情形下，多肽可為肽、多肽或蛋白質。作為一非限制性實例，酬載區可編碼至少一種所關注治療蛋白。本文所闡述編碼多肽之AAV病毒基因體可用於人類疾病、病毒、感染獸醫應用之領域及各種活體內及活體外環境中。
在某些實施例中，向受試者投與所調配AAV顆粒(其包括病毒基因體)將增加蛋白質在受試者中之表現。在某些實施例中，增加蛋白質表現將減小與由酬載編碼之多肽有關之疾病或病痛之效應及/或症狀。
在某些實施例中，可使用本發明之經調配AAV顆粒來減小功能能力及日常生活活動之下降，如藉由標準評估系統(例如(但不限於)總功能能力(TFC)量表)所量測。
在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼所關注蛋白質(亦即酬載蛋白、治療蛋白)之核酸序列。
在某些實施例中，酬載區包括編碼包含(但不限於)以下各項之蛋白質之核酸序列：抗體、芳香族L-胺基酸去羧酶(AADC)、ApoE2、共濟蛋白、運動神經元存活(SMN)、葡萄糖腦苷脂酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶、N-乙醯基-α-葡萄糖胺酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、棕櫚醯蛋白質硫酯酶1、三肽基肽酶1、巴特因(battenin)、CLN5、CLN6 (林克因(linclin))、MFSD8、CLN8、天門冬胺酸醯酶(ASPA)、前顆粒體蛋白(GRN)、MeCP2、β-半乳糖苷酶(GLB1)及/或巨軸突蛋白(GAN)。
在某些實施例中，AAV顆粒包含具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼AADC或業內已知用於治療帕金森氏病之任一其他酬載之核酸序列。作為一非限制性實例，酬載可包含諸如NM_001082971.1 (GI: 132814447)、NM_000790.3 (GI: 132814459)、NM_001242886.1 (GI: 338968913)、NM_001242887.1 (GI: 338968916)、NM_001242888.1 (GI: 338968918)、NM_001242889.1 (GI: 338968920)、NM_001242890.1 (GI: 338968922)等序列及其片段或變體。
在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼共濟蛋白或業內已知用於治療弗裡德賴希共濟失調之任一其他酬載之核酸序列。作為一非限制性實例，酬載可包括諸如NM_000144.4 (GI: 239787167)、NM_181425.2 (GI: 239787185)、NM_001161706.1 (GI: 239787197)等序列及其片段或變體。
在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼SMN或業內已知用於治療脊髓性肌萎縮(SMA)之任一其他酬載之核酸序列。作為一非限制性實例，酬載可包括諸如NM_001297715.1 (GI: 663070993)、NM_000344.3 (GI: 196115055)、NM_022874.2 (GI: 196115040)等序列及其片段或變體。
在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼美國專利公開案第20180258424號(其內容以全文引用方式併入本文中)中所闡述之任一疾病相關蛋白之核酸序列(及其片段或變體)。
在某些實施例中，AAV顆粒包含具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼下列國際公開案中之任一者中所闡述之任一疾病相關蛋白之核酸序列(及其片段或變體)：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；該等公開案之內容各自以全文引用方式併入本文中。
在某些實施例中，可使用本發明之經調配AAV顆粒來改良用於量測神經退化性病症/疾病之症狀之任一評價之性能。該等評價包括(但不限於) ADAS-cog (阿茲海默氏病評價量表-認知)、MMSE (簡易精神狀態檢驗)、GDS (老年抑鬱症量表)、FAQ (功能活動問卷)、ADL (日常生活活動)、GPCOG (全科醫生認知評價)、簡易認知(Mini-Cog)、AMTS (簡略智力測試評分)、畫鐘測試、6-CIT (6項認知損傷測試)、TYM (記憶測試)、MoCa (蒙特利爾認知評價(Montreal Cognitive Assessment))、ACE-R (艾登布魯克認知評價(Addenbrookes Cognitive Assessment))、MIS (記憶損傷篩選)、BADLS (布裡斯托爾日常生活活動量表(Bristol Activities of Daily Living Scale))、巴氏指數(Barthel Index)、功能獨立性量度、工具性日常生活活動、IQCODE (老年人認知功能下降知情者問卷)、神經精神量表、柯恩-曼斯菲爾德激越情緒行為量表(The Cohen-Mansfield Agitation Inventory)、BEHAVE-AD、EuroQol、簡表36及/或MBR護理者應變儀或如Sheehan B Ther Adv Neurol Disord 5(6):349-358 (2012) (其內容以全文引用方式併入本文中)中所闡述之任何其他測試。
在某些實施例中，提供「變體模擬物」。如本文中所使用，術語「變體模擬物」係含有一或多個模擬活化序列之胺基酸者。舉例而言，麩胺酸鹽可模擬磷-蘇胺酸及/或磷-絲胺酸。或者，變體模擬物可產生含有模擬物之去活化或不活化產物，舉例而言，苯丙胺酸可用作酪胺酸之不活化替代物；或丙胺酸可用作絲胺酸之不活化替代物。
在某些實施例中，提供「胺基酸序列變體」。術語「胺基酸序列變體」係指胺基酸序列與天然或起始序列相比具有一定差異之分子。胺基酸序列變體可在胺基酸序列內之某些位置處擁有取代、缺失及/或插入。「天然」或「起始」序列不應與野生型序列混淆。如本文中所使用，天然或起始序列係提及可與之比較之原始分子之相對術語。「天然」或「起始」序列或分子可代表野生型(該序列發現於自然界中)，但未必係野生型序列。
通常，變體與天然序列擁有至少約70%之同源性，且在某些實施例中，其與天然序列至少約80%或至少約90%同源。應用於胺基酸序列之「同源性」定義為在比對序列且視需要引入空位以達成最大百分比同源性之後，候選胺基酸序列中與第二序列之胺基酸序列中之殘基一致之殘基的百分比。用於比對之方法及電腦程式在業內已眾所周知。應理解，同源性取決於所計算之一致性百分比，但其值可因引入計算中之空位及罰分而有所不同。
應用於胺基酸序列之「同系物」意指與第二物種之第二序列實質上一致之另一物種的相應序列。
「類似物」意欲包括因一或多個胺基酸改變(例如胺基酸殘基之取代、添加或缺失)而有所不同且仍維持親代多肽之性質之多肽變體。
可將序列標籤或胺基酸(例如一或多個離胺酸)添加至本發明之肽序列中(例如在N-末端或C-末端處)。序列標籤可用於肽純化或定位。離胺酸可用於增加肽溶解性或進行生物素化。或者，位於肽或蛋白質之胺基酸序列之羧基及胺基末端區域處之胺基酸殘基可視情況缺失以提供截短序列。某些胺基酸(例如C-末端或N-末端殘基)可替代地端視序列之應用(例如序列表現為可溶或連接至固體載體之較大序列之一部分)而缺失。
在某些實施例中，提供「取代變體」。在提及蛋白質時之「取代變體」係去除天然或起始序列中之至少一個胺基酸殘基且在相同位置處插入不同胺基酸者。取代可為單一取代，其中僅取代分子中之一個胺基酸，或其可為多取代，其中取代相同分子中之兩個或更多個胺基酸。
如本文中所使用，術語「保守胺基酸取代」係指通常存在於序列中之胺基酸經具有類似大小、電荷或極性之不同胺基酸取代。保守取代之實例包括使用非極性(疏水性)殘基(例如異白胺酸、纈胺酸及白胺酸)取代另一非極性殘基。同樣，保守取代之實例包括使用一種極性(親水性)殘基取代另一殘基，例如精胺酸與離胺酸之間、麩醯胺酸與天門冬醯胺酸之間及甘胺酸與絲胺酸之間。另外，使用鹼性殘基(例如離胺酸、精胺酸或組胺酸)取代另一殘基或使用一種酸性殘基(例如天門冬胺酸或麩胺酸)取代另一酸性殘基係保守取代之其他實例。非保守取代之實例包括使用非極性(疏水性)胺基酸殘基(例如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸)取代極性(親水性)殘基(例如半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸或離胺酸)及/或使用極性殘基取代非極性殘基。
在某些實施例中，提供「插入變體」。在提及蛋白質時，「插入變體」係緊鄰天然或起始序列中之特定位置之胺基酸插入一或多個胺基酸者。「緊鄰」胺基酸意指連結至胺基酸之α-羧基或α-胺基官能基。
在某些實施例中，提供「缺失變體」。在提及蛋白質時，「缺失變體」係去除天然或起始胺基酸序列中之一或多個胺基酸者。通常，缺失變體在特定分子區域中缺失一或多個胺基酸。
如本文中所使用，術語「衍生物」與術語「變體」同義使用且係指相對於參考分子或起始分子以任一方式進行修飾或改變之分子。在某些實施例中，衍生物包括已使用有機蛋白質性或非蛋白質性衍生劑修飾及進行轉譯後修飾之天然或起始蛋白質。通常藉由以下方式來引入共價修飾：使蛋白質之靶向胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或末端殘基反應之有機衍生劑進行反應，或利用在所選重組宿主細胞中發揮作用之轉譯後修飾機制。所得共價衍生物可用於旨在鑑別對於生物活性、免疫分析或製備免疫親和力純化重組醣蛋白之抗蛋白質抗體較為重要之殘基之程式。該等修飾為業內所熟知且無需過多實驗即可實施。
某些轉譯後修飾係重組宿主細胞對所表現多肽之作用之結果。通常使麩醯胺醯基及天門冬醯胺醯基殘基在轉譯後去醯胺成相應麩胺醯基及天門冬胺醯基殘基。或者，在弱酸條件下使該等殘基去醯胺。任一形式之該等殘基可存在於本發明所用之蛋白質中。
其他轉譯後修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983))。
在提及蛋白質時，「特徵」定義為分子之基於胺基酸序列之不同組分。本發明蛋白質之特徵包括表面表現、局部構形形狀、摺疊、環、半環、結構域、半結構域、位點、末端或其任一組合。
如本文中所使用，在提及蛋白質時，術語「表面表現」係指出現於最外表面上之蛋白質之基於多肽之組分。
如本文中所使用，在提及蛋白質時，術語「局部構形形狀」意指位於界定蛋白質空間內之蛋白質之基於多肽之結構表現。
如本文中所使用，在提及蛋白質時，術語「摺疊」意指在能量最小化時胺基酸序列之所得構形。摺疊可出現於摺疊過程之二級或三級層面上。二級層面摺疊之實例包括β褶板及α螺旋。三級摺疊之實例包括因能量力之聚集或分離而形成之結構域及區域。以此方式形成之區域包括疏水性及親水性袋以及諸如此類。
如本文中所使用，關於蛋白質構形之術語「轉角」意指改變肽或多肽之主鏈方向之彎部且可涉及一個、兩個、三個或更多個胺基酸殘基。
如本文中所使用，在提及蛋白質時，術語「環」係指肽或多肽中逆轉肽或多肽之主鏈方向之結構特徵且包括4個或更多個胺基酸殘基。Oliva等人已鑑別至少5類蛋白質環(J. Mol Biol 266 (4): 814-830；1997)。
如本文中所使用，在提及蛋白質時，術語「半環」係指所鑑別環中與衍生其之環相比具有至少一半數量之胺基酸殘基之部分。應理解，環並不總是含有偶數個胺基酸殘基。因此，在環含有或經鑑別包括奇數個胺基酸之彼等情形下，奇數環之半環將包括環之整數部分或下一整數部分(環之胺基酸數/2+/-0.5個胺基酸)。舉例而言，鑑別為7胺基酸環之環可產生具有3個胺基酸或4個胺基酸之半環(7/2=3.5+/-0.5為3或4)。
如本文中所使用，在提及蛋白質時，術語「結構域」係指多肽中具有一或多種可鑑別結構或功能特性或性質(例如結合能力、用作蛋白質-蛋白質相互作用之位點)之基序。
如本文中所使用，在提及蛋白質時，術語「半結構域」意指所鑑別結構域中與衍生其之結構域相比具有至少一半數量之胺基酸殘基之部分。應理解，結構域並不總是含有偶數個胺基酸殘基。因此，在結構域含有或經鑑別包括奇數個胺基酸之彼等情形下，奇數結構域之半結構域將包括結構域之整數部分或下一整數部分(結構域之胺基酸數/2+/-0.5個胺基酸)。舉例而言，鑑別為7胺基酸結構域之結構域可產生具有3個胺基酸或4個胺基酸之半結構域(7/2=3.5+/-0.5為3或4)。亦應理解，可在結構域或半結構域內鑑別子結構域，該等子結構域擁有衍生其之結構域或半結構域中所鑑別之非全部之結構或功能性質。亦應理解，包括本文之任一結構域類型之胺基酸未必沿多肽主鏈係鄰接的(亦即，非毗鄰胺基酸可在結構上發生摺疊以產生結構域、半結構域或子結構域)。
如本文中所使用，在提及蛋白質時，關於基於胺基酸之實施例之術語「位點」與「胺基酸殘基」及「胺基酸側鏈」同義使用。位點代表肽或多肽內可在本發明之基於多肽之分子內加以修飾、操縱、改變、衍生或變化之位置。
如本文中所使用，在提及蛋白質時，術語「末端(termini或terminus)」係指肽或多肽之端部。該端部並不僅限於肽或多肽之第一或最終位點，且亦可包括末端區域中之其他胺基酸。本發明之基於多肽之分子可描述為具有N-末端(終止於具有游離胺基(NH2)之胺基酸)及C-末端(終止於具有游離羧基(COOH)之胺基酸)。本發明蛋白質在某些實施例中係由藉由二硫鍵或藉由非共價力結合至一起之多個多肽鏈(例如多聚體、寡聚物)構成。該等種類之蛋白質具有多個N-末端及C-末端。或者，可修飾多肽之末端，從而其視情況始於或止於基於非多肽之部分(例如有機偶聯物)。
在任一特徵已鑑別或定義為本發明分子之組分後，可藉由移動、交換、倒轉、缺失、隨機化或複製實施該等特徵之若干操縱及/或修飾中之任一者。另外，應理解，操縱特徵可與修飾本發明之分子產生相同結果。舉例而言，涉及缺失結構域之操縱將改變分子之長度，此正如修飾核酸以編碼小於全長之分子所達成一般。
可藉由業內已知方法(例如定點誘變)來達成修飾及操縱。然後可使用活體外或活體內分析(例如本文所闡述之分析或業內已知之任一其他適宜篩選分析)來測試所得經修飾分子之活性。 酬載：靶向所關注基因之調節性多核苷酸
本發明包括使用病毒基因體編碼調節性多核苷酸(例如RNA或DNA)分子之經調配AAV顆粒作為治療劑。因此，本發明提供編碼處理成靶向所關注基因之小雙鏈RNA (dsRNA)分子(小干擾RNA、siRNA、miRNA、miRNA前體)之多核苷酸之病毒基因體。本發明亦提供其用於抑制所關注基因之等位基因之基因表現及蛋白質產生、用於治療疾病、病症及/或病狀之方法。
在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼或包括一或多個調節性多核苷酸之核酸序列。在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼所關注調節性多核苷酸之核酸序列。在本發明之某些實施例中，調節性多核苷酸(例如RNA或DNA分子)呈現為治療劑。RNA干擾介導之基因沉默可特異性抑制所靶向基因表現。
在某些實施例中，將編碼該等siRNA分子或siRNA分子之單鏈之核酸序列插入腺相關病毒載體中且引入細胞、具體而言中樞神經系統細胞中。
出於若干獨特特徵，已探究AAV顆粒之siRNA遞送。該等特徵之非限制性實例包括(i)能夠感染分裂及非分裂細胞二者；(ii)感染性之寬宿主範圍，包括人類細胞；(iii)野生型AAV不與任一疾病有關且尚未展示複製於感染細胞中；(iv)並無針對載體之細胞介導之免疫反應；及(v)在宿主染色體中具有非整合性性質，由此減小長期表現之可能。此外，AAV顆粒感染對改變細胞基因表現之模式具有最小影響(Stilwell及Samulski等人，Biotechniques , 2003, 34, 148)。
在某些實施例中，本發明之經編碼siRNA雙螺旋體含有雜交至一起以形成雙螺旋體結構之反義鏈及有義鏈，其中反義鏈與所關注靶向基因之核酸序列互補，且其中有義鏈與所關注靶向基因之核酸序列同源。在其他態樣中，在每一鏈之3’端處存在0、1或2個核苷酸懸突。
本發明之經調配AAV顆粒之酬載可編碼一或多種對基因表現進行RNA干擾(RNAi)誘導性抑制之藥劑。本文提供靶向所關注基因之經編碼siRNA雙螺旋體或經編碼dsRNA (在本文中統稱為「siRNA分子」)。該等siRNA分子(例如經編碼siRNA雙螺旋體、經編碼dsRNA或經編碼siRNA或dsRNA前體)可減小或沉默細胞(例如星形細胞或小神經膠質、皮質、海馬體、內嗅、丘腦、感覺或運動神經元)中之基因表現。
RNAi (亦稱為轉錄後基因沉默(PTGS)、平息或共抑制)係轉錄後基因沉默過程，其中RNA分子通常藉由破壞特定mRNA分子來以序列特異性方式抑制基因表現。RNAi之活性組分係稱為小干擾RNA (siRNA)之短/小雙鏈RNA (dsRNA)，其通常含有15-30個核苷酸(例如19至25、19至24或19至21個核苷酸)及2-核苷酸3’懸突且匹配靶基因之核酸序列。該等短RNA物質可在活體內藉由較大dsRNA之Dicer調介性裂解天然產生且其在哺乳動物細胞中發揮作用。
天然表現之小RNA分子(稱為微RNA (miRNA))藉由調節mRNA之表現來誘發基因沉默。含有RNA誘導沉默複合物(RISC)之miRNA靶向與miRNA之5’區(其稱為種子區)中之核苷酸2-7及其3’區內之其他鹼基對呈現完全序列互補性的mRNA。miRNA調介之基因表現下調可由靶mRNA裂解、靶mRNA之轉譯抑制或mRNA分解引起。miRNA靶向序列通常位於靶mRNA之3’ UTR中。單一miRNA可靶向來自各種基因之100個以上轉錄物，且一個mRNA可由不同miRNA靶向。
靶向特定mRNA之siRNA雙螺旋體或dsRNA可設計為AAV顆粒之酬載且引入細胞中以激活RNAi過程。Elbashir等人證實，21-核苷酸siRNA雙螺旋體(稱為小干擾RNA)能夠實現強效及特異性之基因減弱(knockdown)而不在哺乳動物細胞中誘導免疫反應(Elbashir SM等人，Nature , 2001, 411, 494-498)。自此初始報導開始，藉由siRNA進行轉錄後基因沉默迅速成為哺乳動物細胞中之基因分析之強力工具且可產生新穎治療劑。
與使用單鏈(ss)-siRNA (例如反義鏈RNA或反義寡核苷酸)相比，包括與靶mRNA同源之有義鏈及與靶mRNA互補之反義鏈之siRNA雙螺旋體在靶RNA破壞效率方面提供更多優點。在許多情形下，需要較高濃度之ss-siRNA來達成相應雙螺旋體之有效基因沉默功效。
在某些實施例中，siRNA分子可編碼於亦包括分子架構之調節性多核苷酸中， 如本文中所使用，「分子架構」係形成根據其來設計或製備後續分子之序列或結構之框架或起始分子。
在某些實施例中，包括酬載(例如siRNA、miRNA或本文所闡述之其他RNAi藥劑)之調節性多核苷酸包括含有前導5’側接序列之分子架構，該5’側接序列可為任一長度且可完全或部分地衍生自野生型微RNA序列或完全係人工的。3’側接序列在大小及起源上可與5’側接序列相一致。在某些實施例中，5’及3’側接序列中之一或兩者不存在。
在某些實施例中，分子架構可包括一或多個在業內已知之連接體。連接體可分隔各區域或分隔一個分子架構與另一分子架構。作為一非限制性實例，分子架構可為多順反子性。
在某些實施例中，使用下列性質中之至少一者來設計調節性多核苷酸：環變體、種子失配/膨出/搖擺變體、莖失配、環變體及基莖失配變體、種子失配及基莖失配變體、莖失配及基莖失配變體、種子搖擺及基莖搖擺變體或莖序列變體。
在某些實施例中，本發明呈現經調配AAV顆粒(其病毒基因體編碼調節性多核苷酸(例如RNA或DNA分子))作為治療劑之用途。因此，本發明提供編碼處理成靶向所關注基因之小雙鏈RNA (dsRNA)分子(小干擾RNA、siRNA、miRNA、miRNA前體)之多核苷酸之病毒基因體。本發明亦提供其用於抑制所關注基因之等位基因之基因表現及蛋白質產生、用於治療疾病、病症及/或病狀之方法。
在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼或包括一或多個調節性多核苷酸之核酸序列。在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼所關注調節性多核苷酸之核酸序列。在本發明之某些實施例中，調節性多核苷酸(例如RNA或DNA分子)呈現為治療劑。RNA干擾介導之基因沉默可特異性抑制所靶向基因表現。
在某些實施例中，酬載區包括編碼干擾靶基因表現及/或靶蛋白產生之調節性多核苷酸之核酸序列。在某些實施例中，擬抑制/修飾之基因表現或蛋白質產生可包括(但不限於)超氧化物歧化酶1 (SOD1)、染色體9開放閱讀框72 (C9ORF72)、TAR DNA結合蛋白(TARDBP)、共濟失調蛋白-3 (ATXN3)、杭丁頓蛋白(HTT)、類澱粉前體蛋白(APP)、載脂蛋白E (ApoE)、微管相關蛋白tau (MAPT)、α-突觸核蛋白(SNCA)、電壓門控鈉通道α亞單元9 (SCN9A)及/或電壓門控鈉通道α亞單元10 (SCN10A)。
本發明提供靶向SOD1 mRNA以干擾SOD1之基因表現及/或蛋白質產生之小干擾RNA (siRNA)雙螺旋體(及編碼其之調節性多核苷酸)。本發明亦提供其用於抑制SOD1等位基因之基因表現及蛋白質產生、用於治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)之方法。在某些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體可沿各別核苷酸序列之任一區段靶向SOD1。在某些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體可在核苷酸序列內之SNP或變體位置處靶向SOD1。
本發明提供靶向HTT mRNA以干擾HTT之基因表現及/或蛋白質產生之小干擾RNA (siRNA)雙螺旋體(及編碼其之調節性多核苷酸)。本發明亦提供其用於抑制HTT等位基因之基因表現及蛋白質產生、用於治療亨廷頓氏病(HD)之方法。在某些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體可沿各別核苷酸序列之任一區段靶向HTT。在某些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體可在核苷酸序列內之SNP或變體位置處靶向HTT。
在某些實施例中，AAV顆粒包括具有酬載區之病毒基因體，該酬載區包括編碼下列國際公開案中之任一者中所闡述之調節性多核苷酸、RNAi分子、siRNA分子、dsRNA分子及/或RNA雙螺旋體中之任一者的核酸序列：WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；該等公開案之內容各自以全文引用方式併入本文中。
在某些實施例中，將編碼該等siRNA分子或siRNA分子之單鏈之核酸序列插入腺相關病毒載體中且引入細胞、具體而言中樞神經系統細胞中。
出於若干獨特特徵，已探究AAV顆粒之siRNA遞送。該等特徵之非限制性實例包括(i)能夠感染分裂及非分裂細胞二者；(ii)感染性之寬宿主範圍，包括人類細胞；(iii)野生型AAV不與任一疾病有關且尚未展示複製於感染細胞中；(iv)並無針對載體之細胞介導之免疫反應；及(v)在宿主染色體中具有非整合性性質，由此減小長期表現之可能。此外，AAV顆粒感染對改變細胞基因表現之模式具有最小影響(Stilwell及Samulski等人，Biotechniques , 2003, 34, 148)。
在某些實施例中，本發明之經編碼siRNA雙螺旋體含有雜交至一起以形成雙螺旋體結構之反義鏈及有義鏈，其中反義鏈與所關注靶向基因之核酸序列互補，且其中有義鏈與所關注靶向基因之核酸序列同源。在其他態樣中，在每一鏈之3’端處存在0、1或2個核苷酸懸突。
根據本發明，靶向所關注基因之siRNA雙螺旋體之每一鏈之長度可為約19至25、19至24或19至21個核苷酸，例如長度為約19個核苷酸、20個核苷酸、21個核苷酸、22個核苷酸、23個核苷酸、24個核苷酸或25個核苷酸。
在某些實施例中，siRNA或dsRNA包括至少兩個彼此互補之序列。dsRNA包括具有第一序列之有義鏈及具有第二序列之反義鏈。反義鏈包括與編碼所關注基因之mRNA之至少一部分實質上互補之核苷酸序列，且互補區之長度為30個核苷酸或更短及至少15個核苷酸。通常，dsRNA之長度為19至25、19至24或19至21個核苷酸。在某些實施例中，dsRNA之長度為約15至約25個核苷酸，且在某些實施例中，dsRNA之長度為約25至約30個核苷酸。
在與表現由所關注基因編碼之蛋白質之細胞接觸時，編碼於表現載體中之dsRNA將由所關注基因編碼之蛋白質之表現抑制至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或更多，如藉由業內已知方法或如本文所闡述之方法所分析。
根據本發明，設計siRNA分子且測試其減小經培養細胞中之mRNA含量之能力。
在某些實施例中，設計siRNA分子且測試其減小經培養細胞中所關注基因之含量之能力。
本發明亦提供醫藥組合物，其包括至少一種靶向所關注基因之siRNA雙螺旋體及醫藥上可接受之載劑。在某些實施例中，siRNA雙螺旋體係由AAV顆粒中之病毒基因體編碼。
在某些實施例中，本發明提供抑制/沉默細胞中之基因表現之方法。在一些態樣中，基因表現抑制係指抑制至少約20%，例如至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、35-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在某些實施例中，可使用所編碼siRNA雙螺旋體將由所關注基因編碼之蛋白質或mRNA之表現減小至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、35-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為一非限制性實例，蛋白質或mRNA之表現可減小50-90%。作為一非限制性實例，蛋白質或mRNA之表現可減小30-70%。作為一非限制性實例，蛋白質或mRNA之表現可減小40-70%。
在某些實施例中，可使用所編碼siRNA雙螺旋體來減小至少一個CNS區域中之由所關注基因編碼之蛋白質及/或經轉錄mRNA之表現。作為一非限制性實例，該區域係神經元(例如皮質神經元)。
在某些實施例中，可(例如)藉由輸注至豆狀核殼中來將包括該等經編碼siRNA分子之經調配AAV顆粒直接引入受試者之中樞神經系統中。
在某些實施例中，可(例如)藉由輸注至受試者之丘腦中來將包括該等經編碼siRNA分子之經調配AAV顆粒直接引入受試者之中樞神經系統中。
在某些實施例中，可(例如)藉由輸注至受試者之白質中來將包括該等經編碼siRNA分子之經調配AAV顆粒直接引入受試者之中樞神經系統中。
在某些實施例中，可(例如)藉由經靜脈內投與受試者來將包括該等經編碼siRNA分子之經調配AAV顆粒引入受試者之中樞神經系統中。
在某些實施例中，使用本發明之醫藥組合物作為唯一療法。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物用於組合療法中。組合療法可為與一或多種已測試對於運動神經元退化之神經保護效應之神經保護劑(例如小分子化合物、生長因子及激素)進行組合。
本發明之經調配AAV顆粒之酬載可編碼一或多種對基因表現進行RNA干擾(RNAi)誘導性抑制之藥劑。本文提供靶向所關注基因之經編碼siRNA雙螺旋體或經編碼dsRNA (在本文中統稱為「siRNA分子」)。該等siRNA分子(例如經編碼siRNA雙螺旋體、經編碼dsRNA或經編碼siRNA或dsRNA前體)可減小或沉默細胞(例如星形細胞或小神經膠質、皮質、海馬體、內嗅、丘腦、感覺或運動神經元)中之基因表現。
RNAi (亦稱為轉錄後基因沉默(PTGS)、平息或共抑制)係轉錄後基因沉默過程，其中RNA分子通常藉由破壞特定mRNA分子來以序列特異性方式抑制基因表現。RNAi之活性組分係稱為小干擾RNA (siRNA)之短/小雙鏈RNA (dsRNA)，其通常含有15-30個核苷酸(例如19至25、19至24或19至21個核苷酸)及2-核苷酸3’懸突且匹配靶基因之核酸序列。該等短RNA物質可在活體內藉由較大dsRNA之Dicer調介性裂解天然產生且其在哺乳動物細胞中發揮作用。
在一些實施例中，病毒基因體之調節性多核苷酸可包括至少一個編碼至少一種siRNA分子之核酸序列。核酸序列可獨立地(若存在一個以上)編碼1、2、3、4、5、6、7、8、9或大於9種siRNA分子。
天然表現之小RNA分子(稱為微RNA (miRNA))藉由調節mRNA之表現來誘發基因沉默。含有RNA誘導沉默複合物(RISC)之miRNA靶向與miRNA之5’區(其稱為種子區)中之核苷酸2-7及其3’區內之其他鹼基對呈現完全序列互補性的mRNA。miRNA調介之基因表現下調可由靶mRNA裂解、靶mRNA之轉譯抑制或mRNA分解引起。miRNA靶向序列通常位於靶mRNA之3’ UTR中。單一miRNA可靶向來自各種基因之100個以上轉錄物，且一個mRNA可由不同miRNA靶向。
靶向特定mRNA之siRNA雙螺旋體或dsRNA可設計為AAV顆粒之酬載且引入細胞中以激活RNAi過程。Elbashir等人證實，21-核苷酸siRNA雙螺旋體(稱為小干擾RNA)能夠實現強效及特異性之基因減弱而不在哺乳動物細胞中誘導免疫反應(Elbashir SM等人，Nature , 2001, 411, 494-498)。自此初始報導開始，藉由siRNA進行轉錄後基因沉默迅速成為哺乳動物細胞中之基因分析之強力工具且可產生新穎治療劑。
與使用單鏈(ss)-siRNA (例如反義鏈RNA或反義寡核苷酸)相比，包括與靶mRNA同源之有義鏈及與靶mRNA互補之反義鏈之siRNA雙螺旋體在靶RNA破壞效率方面提供更多優點。在許多情形下，需要較高濃度之ss-siRNA來達成相應雙螺旋體之有效基因沉默功效。
任一前述分子可由AAV顆粒或病毒基因體編碼。 細胞中之引入
本發明之經編碼酬載可藉由由AAV顆粒之病毒基因體編碼來引入細胞中。該等AAV顆粒可經改造及最佳化以促進進入不易於發生轉染/轉導之細胞中。同樣，一些合成病毒載體能夠將酬載整合至細胞基因體中，由此產生穩定酬載表現及長期治療效應。以此方式，將病毒載體改造為用於特定遞送之媒劑，而並無野生型病毒中所發現之有害複製及/或整合特徵。
在某些實施例中，藉由使用包括能夠在處理於細胞中時產生酬載之核酸序列之AAV顆粒轉染、感染或轉導細胞來將經編碼酬載引入細胞中。在某些實施例中，藉由向細胞或組織中注射包括能夠在處理於細胞中時產生酬載之核酸序列之AAV顆粒來將酬載引入細胞中。
引入包括本文所闡述酬載之核酸序列之AAV顆粒之其他方法可包括光化學內化，如美國專利公開案第20120264807號中所闡述，其內容中與光化學內化相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本文所闡述之調配物可含有至少一種包括編碼本文所闡述酬載之核酸序列之AAV顆粒。在某些實施例中，酬載可在一個靶位點處靶向所關注基因。在另一實施例中，該調配物包括複數個AAV顆粒，每一AAV顆粒包括編碼在不同靶位點向靶向所關注基因之酬載之核酸序列。可在2、3、4、5或大於5個位點處靶向所關注基因。
在某些實施例中，可將來自任一相關物種(例如(但不限於)人類、豬、狗、小鼠、大鼠或猴)之AAV顆粒引入細胞中。
在某些實施例中，可將經調配AAV顆粒引入與擬治療疾病相關之細胞或組織中。在某些實施例中，可將經調配AAV顆粒引入靶基因具有高含量之內源性表現之細胞中。在另一實施例中，可將經調配AAV顆粒引入靶基因具有低含量之內源性表現之細胞中。在某些實施例中，細胞可為具有高AAV轉導效率者。
在某些實施例中，可使用包括編碼本發明酬載之核酸序列之經調配AAV顆粒來將酬載遞送至中樞神經系統(例如美國專利第6,180,613號；其內容中與siRNA分子及AAV顆粒之遞送及治療應用相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)。
在某些實施例中，包括編碼本發明酬載之核酸序列之經調配AAV顆粒可進一步包括含有來自非病毒來源之肽的經修飾衣殼。在其他態樣中，AAV顆粒可含有CNS特異性嵌合衣殼以有利於將經編碼siRNA雙螺旋體遞送至腦及脊髓中。舉例而言，可構建來自展現CNS向性之AAV變體之cap核苷酸序列之比對以鑑別可變區(VR)序列及結構。
在某些實施例中，包括本發明siRNA分子之核酸序列之AAV顆粒可經調配以供CNS遞送。可使用穿越腦血障壁之藥劑。舉例而言，可使用可使siRNA分子靶向腦血障壁內皮之一些細胞滲透肽來調配靶向所關注基因之siRNA雙螺旋體。
在某些實施例中，包括編碼本發明酬載之核酸序列之經調配AAV顆粒可直接投與CNS。作為一非限制性實例，載體包括編碼靶向所關注基因之siRNA分子之核酸序列。作為一非限制性實例，載體包括編碼靶向所關注基因之多肽之核酸序列。
在某些實施例中，可以治療有效量將經調配AAV顆粒投與受試者(例如投與受試者之CNS)。 II. AAV產生  一般病毒產生製程
通常使用哺乳動物細胞及/或昆蟲細胞作為用於產生rAAV顆粒之病毒產生細胞。在各個實施例中，本文所揭示之方法及系統採用昆蟲細胞(例如Sf9細胞)。
用於產生rAAV顆粒之病毒產生細胞通常包括哺乳動物細胞類型。然而，哺乳動物細胞在大規模產生rAAV顆粒時會呈現若干難題，包括每一複製細胞中之病毒顆粒產率通常較低以及來自病毒產生細胞中之其他哺乳動物生物物質之不期望污染的高風險。因此，昆蟲細胞已成為大規模產生rAAV顆粒之替代媒劑。
使用昆蟲細胞之AAV產生系統亦呈現多種難題。舉例而言，rAAV顆粒之高產率產生通常需要Rep78表現低於Rep52。控制昆蟲細胞中之Rep78及Rep52之相對表現由此需要Rep操縱子內之精心設計的控制機制。該等控制機制可包括經個別改造之昆蟲細胞啟動子(例如Rep78之ΔIE1啟動子及Rep52之PolH啟動子)或使編碼Rep之核苷酸序列分裂成經獨立改造之序列或構築體。然而，該等控制機制之實施通常會減小rAAV顆粒產率或產生結構不穩定之病毒體。
在另一實例中，rAAV顆粒之產生需要組裝形成AAV衣殼之VP1、VP2及VP3蛋白。rAAV顆粒之高產率產生需要調節比率之VP1、VP2及VP3，該比率應通常分別為約1:1:10，但可相對於10個VP3拷貝在1-2個VP1及/或1-2個VP2中有所變化。此比率對於衣殼品質較為重要，此乃因過多VP1會使衣殼去穩定且過少VP1將降低病毒感染性。
野生型AAV使用缺陷性剪接方法來控制VP1表現；使用具有特殊環境(「科紮克」序列)之弱起始密碼子(ACG)來控制VP2；且使用標準起始密碼子(ATG)來控制VP3表現。然而，在一些桿狀病毒系統中，哺乳動物剪接序列並不總是被識別且不能適當地控制VP1、VP2及VP3之產生。因此，可使用來自VP2之相鄰核苷酸及ACG起始序列來驅動衣殼蛋白產生。不幸的是，對於大部分AAV血清型而言，此方法產生與VP2相比具有較低VP1比率(相對於10個VP3拷貝＜ 1)之衣殼。為更有效地控制VP蛋白之產生，已使用非規範或起始密碼子(如TTG、GTG或CTG)。然而，相對於野生型ATG或ACG起始密碼子，熟習此項技術者可將該等起始密碼子視為次最佳的(參見WO2007046703及WO2007148971，其內容中與AAV衣殼蛋白之產生相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)。
在另一實例中，使用桿狀病毒/Sf9系統來產生rAAV顆粒通常需要廣泛使用之基於桿粒之桿狀病毒表現載體系統(BEV)，該等基於桿粒之桿狀病毒表現載體系統並未針對大規模AAV產生進行最佳化。基於桿粒之BEV中之病毒蛋白之異常蛋白水解降解係一意外問題，其妨礙了使用桿狀病毒/Sf9系統來可靠地大規模產生AAV衣殼蛋白。
持續需要容許在哺乳動物及昆蟲細胞中有效且高效地大規模(商業)產生rAAV顆粒之方法及系統。
本發明之一或多個實施例之細節闡述於下述隨附說明中。根據描述、圖示及申請專利範圍可明瞭本發明之其他特徵、目標及優點。在本說明中，除非上下文另外明確指示，否則單數形式亦包含複數。除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解相同之意義。在與以引用方式併入之揭示內容衝突之情形下，以本說明為準。
在某些實施例中，本發明之構築體、多核苷酸、多肽、載體、血清型、衣殼調配物或顆粒可為、可包括下列國際公開案中之一者中所闡述之任一序列、元件、構築體、系統、靶或製程、可由其修飾、可由其使用、可用於其、可與其一起使用或可使用其產生：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其內容各自以全文引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
本發明之AAV產生包括產生AAV顆粒及病毒載體之製程及方法，該等AAV顆粒及病毒載體可接觸靶細胞以遞送包括編碼酬載分子之核苷酸之酬載(例如重組病毒構築體)。在某些實施例中，病毒載體係腺相關病毒(AAV)載體，例如重組腺相關病毒(rAAV)載體。在某些實施例中，AAV顆粒係腺相關病毒(AAV)顆粒，例如重組腺相關病毒(rAAV)顆粒。
本發明提供藉由以下方式來產生AAV顆粒或病毒載體之方法：(a)使病毒產生細胞與一或多個編碼至少一種AAV衣殼蛋白及/或至少一種AAV複製蛋白之病毒表現構築體及一或多個酬載構築體載體接觸，其中該酬載構築體載體包括編碼選自由轉基因、多核苷酸編碼蛋白及調節性核酸組成之群之酬載分子之酬載構築體；(b)在使得產生至少一種AAV顆粒或病毒載體之條件下培養該病毒產生細胞；及(c)分離該至少一種AAV顆粒或病毒載體。
在該等方法中，病毒表現構築體可編碼至少一種結構蛋白及/或至少一種非結構蛋白。結構蛋白可包括天然或野生型衣殼蛋白VP1、VP2及/或VP3或嵌合蛋白中之任一者。非結構蛋白可包括天然或野生型Rep78、Rep68、Rep52及/或Rep40蛋白或嵌合蛋白中之任一者。
在某些實施例中，如本文所揭示之rAAV產生方法包括瞬時轉染、病毒轉導及/或電穿孔。
在某些實施例中，病毒產生細胞係選自由哺乳動物細胞及昆蟲細胞組成之群。在某些實施例中，昆蟲細胞包括草地貪夜蛾昆蟲細胞。在某些實施例中，昆蟲細胞包括Sf9昆蟲細胞。在某些實施例中，昆蟲細胞包括Sf21昆蟲細胞。
本發明之酬載構築體載體可包括至少一個倒轉末端重複(ITR)且可包括哺乳動物DNA。
亦提供根據本文所闡述方法產生之AAV顆粒及病毒載體。
可使用一或多種可接受之賦形劑將本發明之AAV顆粒調配為醫藥組合物。
在某些實施例中，AAV顆粒或病毒載體可藉由本文所闡述之方法來產生。
在某些實施例中，可藉由使病毒產生細胞(例如昆蟲細胞)與至少一個編碼至少一種衣殼蛋白及至少一種AAV複製蛋白之病毒表現構築體及至少一個酬載構築體載體接觸來產生AAV顆粒。在某些實施例中，可使用編碼至少一種衣殼蛋白及至少一種AAV複製蛋白之單獨病毒表現構築體。可藉由瞬時轉染、病毒轉導及/或電穿孔來接觸病毒產生細胞。酬載構築體載體可包括編碼酬載分子(例如(但不限於)轉基因、多核苷酸編碼蛋白及調節性核酸)之酬載構築體。可在使得產生至少一種AAV顆粒或病毒載體之條件下培養病毒產生細胞，分離(例如使用溫度誘導之裂解、機械裂解及/或化學裂解)及/或純化(例如使用過濾、層析及/或免疫親和純化)。作為一非限制性實例，酬載構築體載體可包括哺乳動物DNA。
在某些實施例中，在昆蟲細胞(例如草地貪夜蛾(Sf9)細胞)中使用本文所闡述之方法來產生AAV顆粒。作為一非限制性實例，使用病毒轉導(其可包括桿狀病毒轉導)來接觸昆蟲細胞。
在另一實施例中，在哺乳動物細胞中使用本文所闡述之方法來產生AAV顆粒。作為一非限制性實例，使用瞬時轉染來接觸哺乳動物細胞。
在某些實施例中，病毒表現構築體可編碼至少一種結構蛋白及至少一種非結構蛋白。作為一非限制性實例，結構蛋白可包括VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白。作為另一非限制性實例，非結構蛋白可包括Rep78、Rep68、Rep52及/或Rep40複製蛋白。
在某些實施例中，本文所闡述之AAV顆粒產生方法在病毒產生細胞中產生大於101 、大於102 、大於103 、大於104 或大於105 個AAV顆粒。
在某些實施例中，本發明製程包括在病毒產生細胞中使用包括至少一個病毒表現構築體及至少一個酬載構築體之病毒產生系統來產生病毒顆粒。至少一個病毒表現構築體及至少一個酬載構築體可共轉染(例如雙重轉染、三重轉染)至病毒產生細胞中。使用由熟習此項技術者已知且按常規實施之標準分子生物學技術來完成轉染。病毒產生細胞提供表現蛋白質所需之細胞機構及產生AAV顆粒所需之其他生物材料(包括複製酬載構築體之Rep蛋白及組裝形成包封經複製酬載構築體之衣殼之Cap蛋白)。自病毒產生細胞提取所得AAV顆粒且處理成投與用醫藥製劑。
在某些實施例中，AAV顆粒(在投與之後)接觸靶細胞且進入胞內體中之細胞中。AAV顆粒自胞內體釋放且隨後接觸靶細胞之細胞核以遞送酬載構築體。將酬載構築體(例如重組病毒構築體)遞送至靶細胞之細胞核，其中可表現由酬載構築體編碼之酬載分子。
在某些實施例中，產生病毒顆粒之製程利用包括一或多種桿狀病毒之病毒產生細胞(例如已經病毒表現構築體(例如包括於表現Bac中)及酬載構築體(例如包括於酬載Bac中)轉染之桿狀病毒表現載體(BEV)或桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC))之種子培養物。在某些實施例中，收穫種子培養物，分成等分試樣且冷凍，且可在後續時間點用於引發幼稚產生細胞群體之感染。
AAV顆粒之大規模產生可利用生物反應器。生物反應器之使用使得可精確地量測及/或控制證實病毒產生細胞之生長及活性之變量，例如質量、溫度、混合條件(葉輪RPM或波振盪)、CO2 濃度、O2 濃度、氣體吹掃速率及體積、氣體覆蓋速率及體積、pH、活細胞密度(VCD)、細胞活力、細胞直徑及/或光學密度(OD)。在某些實施例中，使用生物反應器進行批量產生，其中在實驗確定之時間點收穫全部培養物且純化AAV顆粒。在另一實施例中，使用生物反應器進行連續產生，其中在實驗確定之時間點收穫一部分培養物以用於純化AAV顆粒，且使用其他生長培養基組分更新生物反應器中之剩餘培養物。
在某些實施例中，可以包括細胞裂解、淨化、滅菌及純化之製程自病毒產生細胞提取AAV病毒顆粒。細胞裂解包括破壞病毒產生細胞之結構且由此釋放AAV顆粒之任一過程。在某些實施例中，細胞裂解可包括熱衝擊、化學或機械裂解方法。在一些實施例中，細胞裂解係以化學方式進行。經裂解細胞之淨化可包括粗純化經裂解細胞、培養基組分及AAV顆粒之混合物。在某些實施例中，淨化包括離心及/或過濾(包括(但不限於)深端、切向流及/或空心纖維過濾)。
病毒產生最終得到包括以下兩種組分之AAV顆粒之經純化集合體：(1)酬載構築體(例如重組病毒基因體構築體)及(2)病毒衣殼。
在某些實施例中，本發明之病毒產生系統或製程包括使用病毒產生細胞(VPC)及質體構築體產生桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之步驟。將來自細胞庫(CB)之病毒產生細胞(VPC)解凍且擴增以提供靶工作體積及VPC濃度。將所得VPC池分成Rep/Cap VPC池及酬載VPC池。將一或多個Rep/Cap質體構築體(病毒表現構築體)處理成Rep/Cap桿粒多核苷酸且轉染至Rep/Cap VPC池中。將一或多個酬載質體構築體(酬載構築體)處理成酬載桿粒多核苷酸且轉染至酬載VPC池中。培育兩個VPC池以產生P1 Rep/Cap桿狀病毒表現載體(BEV)及P1酬載BEV。將兩個BEV池擴增成一系列斑塊，其中選擇單一斑塊進行純系斑塊(CP)純化(亦稱為單斑塊擴增)。該製程可包括單一CP純化步驟或可包括多個CP純化步驟(連續或由其他處理步驟分開)。一或多個CP純化步驟提供CP Rep/Cap BEV池及CP酬載BEV池。然後可儲存該兩個BEV池且用於將來之產生步驟，或其可然後轉染至VPC中以產生Rep/Cap BIIC池及酬載BIIC池。
在某些實施例中，本發明之病毒產生系統或製程包括使用病毒產生細胞(VPC)及桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)產生AAV顆粒之步驟。將來自細胞庫(CB)之病毒產生細胞(VPC)解凍且擴增以提供靶工作體積及VPC濃度。此擴增可包含一或多個小體積擴增步驟直至工作體積為2000-5000 mL，隨後在大規模生物反應器(例如Wave及/或N-1生物反應器)中實施一或多個大體積擴增步驟直至工作體積為25-500 L。將工作體積之病毒產生細胞接種至產生生物反應器中且可在靶VPC濃度下進一步擴增至工作體積為200-2500 L以供BIIC感染。
然後使用Rep/Cap BIIC及酬載BIIC (例如)以靶VPC:BIIC比率及靶BIIC:BIIC比率來共感染產生生物反應器中之工作體積之VPC。VCD感染亦可利用BEV。在產生生物反應器中培育共感染VPC且擴增以產生AAV顆粒及VPC之批量收穫液。
在某些實施例中，本發明之病毒產生系統或製程包括藉由處理、淨化及純化AAV顆粒及病毒產生細胞之批量收穫液來產生藥物物質之步驟。經由細胞破壞及裂解(例如化學裂解及/或機械裂解)來處理AAV顆粒及VPC之批量收穫液(在產生生物反應器內)，隨後使用核酸酶處理裂解池，由此產生粗製溶解物池。經由一或多個過濾及淨化步驟(包括深度過濾及微過濾)處理粗製溶解物池以提供經淨化溶解物池。經由一或多個層析及純化步驟(包括親和層析(AFC)及離子交換層析(AEX或CEX))處理經淨化溶解物池以提供經純化產物池。然後視情況經由奈米過濾且然後經由切向流過濾(TFF)來處理經純化產物池。TFF製程連續或交替性地包括一或多個滲濾(DF)步驟及一或多個超濾(UF)步驟。經由病毒滯留過濾(VRF)及另一過濾步驟進一步處理產物池以提供藥物物質池。可進一步過濾藥物物質池，然後等分成小瓶以供儲存及治療。 病毒表現構築體
本發明之病毒產生系統包括一或多個可轉染/轉導至病毒產生細胞(例如Sf9)中之病毒表現構築體。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或酬載構築體可為桿粒，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因體。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為桿狀病毒表現載體(BEV)。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為包含BEV之BIIC。如本文中所使用，術語「表現Bac」或「Rep/Cap Bac」係指包括病毒表現構築體及/或病毒表現區之桿粒(例如BEV)。病毒產生細胞(例如Sf9細胞)可經表現Bac及/或經包括表現Bac之BIIC轉染。
在某些實施例中，病毒表現區包括編碼蛋白質之核苷酸序列及至少一個用於表現於病毒產生細胞中之表現控制序列。在某些實施例中，病毒表現區包括可操作地連接至至少一個用於表現於病毒產生細胞中之表現控制序列之編碼蛋白質之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體含有在一或多個啟動子之控制下之小病毒基因。小病毒基因可包括編碼非結構性AAV複製蛋白之核苷酸序列，例如編碼Rep52、Rep40、Rep68或Rep78蛋白(例如Rep78及Rep52之組合)之Rep基因。小病毒基因可包括編碼結構性AAV蛋白之核苷酸序列，例如編碼VP1、VP2及VP3蛋白之Cap基因。
本發明之病毒產生系統並不受限於用於將小病毒功能引入病毒複製細胞中之病毒表現載體。病毒表現構築體未必永久性存在於病毒複製細胞中。可藉由任一已知方式(例如藉由細胞化學處理、電穿孔或感染)來引入病毒表現構築體。
本發明之病毒表現構築體可包括任一促進使用核酸進行之細胞轉變、轉染或轉導之生物或化學化合物或調配物。實例性生物病毒表現構築體包括質體、線性核酸分子及重組病毒(包括桿狀病毒)。實例性化學載體包括脂質複合物。使用病毒表現構築體將核酸序列納入本發明之病毒複製細胞中。(O'Reilly, David R., Lois K. Miller及Verne A. Luckow. Baculovirus expression vectors: a laboratory manual. Oxford University Press, 1994.)；Maniatis等人編輯，Molecular Cloning. CSH Laboratory, NY, N.Y. (1982)；及Philiport及Scluber編輯，Liposomes as tools in Basic Research and Industry. CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)，其內容中與病毒表現構築體及其應用相關之全部內容各自以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，病毒表現構築體係包括一或多個編碼非結構性AAV複製蛋白、結構性AAV衣殼蛋白或其組合之核苷酸序列之AAV表現構築體。在某些實施例中，病毒表現區係包括一或多個編碼非結構性AAV複製蛋白、結構性AAV衣殼蛋白或其組合之核苷酸序列之表現構築體之AAV表現區。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為質體載體。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為桿狀病毒構築體。
本發明並不受限於用於產生AAV顆粒或病毒載體之病毒表現構築體之數量。在某些實施例中，可採用一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個病毒表現構築體在本發明之病毒產生細胞中產生AAV顆粒。在一非限制性實例中，5個表現構築體可個別地編碼AAV VP1、AAV VP2、AAV VP3、Rep52、Rep78，且伴有包括酬載多核苷酸及至少一個AAV ITR之酬載構築體。在另一實施例中，可採用表現構築體來表現(例如) Rep52及Rep40或Rep78及Rep 68。表現構築體可包括VP1、VP2、VP3、Rep52/Rep40及Rep78/Rep68編碼序列之任一組合。
在本發明之某些實施例中，可使用病毒表現構築體在昆蟲細胞中產生AAV顆粒。在某些實施例中，可修飾衣殼及/或rep基因之野生型AAV序列以(例如)改良病毒顆粒之屬性(例如增加感染性或特異性)或增強產生產率。
在某些實施例中，病毒表現構築體可編碼納入可用作免疫侵襲序列之Gly-Ala重複區之小病毒衣殼之組分，如美國專利申請案20110171262中所闡述，該申請案之內容中與小病毒衣殼蛋白相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在本發明之某些實施例中，可使用病毒表現構築體在昆蟲細胞中產生AAV顆粒。在某些實施例中，可修飾衣殼及/或rep基因之野生型AAV序列以(例如)改良病毒顆粒之屬性(例如增加感染性或特異性)或增強自昆蟲細胞之產生產率。VP 編碼區
在某些實施例中，病毒表現構築體可包括VP編碼區；VP編碼區係包括編碼VP1、VP2、VP3或其組合之VP核苷酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括VP1編碼區；VP1編碼區係包括編碼VP1蛋白之VP1核苷酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括VP2編碼區；VP2編碼區係包括編碼VP2蛋白之VP2核苷酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括VP3編碼區；VP3編碼區係包括編碼VP3蛋之VP3核苷酸序列之核苷酸序列。
在某些實施例中，VP編碼區編碼特定AAV血清型之一或多種AAV衣殼蛋白。VP編碼區之AAV血清型可相同或不同。在某些實施例中，可將VP編碼區密碼子最佳化。在某些實施例中，可將VP編碼區或核苷酸序列針對哺乳動物細胞密碼子最佳化。在某些實施例中，可將VP編碼區或核苷酸序列針對昆蟲細胞密碼子最佳化。在某些實施例中，可將VP編碼區或核苷酸序列針對草地貪夜蛾細胞密碼子最佳化。在某些實施例中，可將VP編碼區或核苷酸序列針對Sf9或Sf21細胞系密碼子最佳化。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括第一VP編碼區，該第一VP編碼區包括編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP編碼區包括編碼一或多種選自VP2及VP3之AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP編碼區包括編碼VP1、VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP編碼區包括編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP編碼區包括僅編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP編碼區包括編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白但不編碼VP1之核苷酸序列。
在某些實施例中，核酸構築體包括第二VP編碼區，該第二VP編碼區包括編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第二VP編碼區包括編碼VP1 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第二VP編碼區包括僅編碼VP1 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第二VP編碼區包括編碼VP1 AAV衣殼蛋白但不編碼VP2或VP3之核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體係經改造核酸構築體。在某些實施例中，病毒表現構築體包括含有第一VP編碼區及第二VP編碼區之第一核苷酸序列。在某些實施例中，第一核苷酸序列包括含有第一VP編碼區之第一開放閱讀框(ORF)及含有第二VP編碼區之第二開放閱讀框(ORF)。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括含有第一VP編碼區之第一核苷酸序列及含有第二VP編碼區之第二核苷酸序列。在某些實施例中，第一核苷酸序列包括含有第一VP編碼區之第一開放閱讀框(ORF)，且第二核苷酸序列包括含有第二VP編碼區之第二開放閱讀框(ORF)。在某些實施例中，第一開放閱讀框與第二開放閱讀框不同。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括：第一VP編碼區，其包括編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白之核苷酸序列；及第二VP編碼區，其包括編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP編碼區包括編碼VP1、VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列；且第二VP編碼區包括僅編碼VP1 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP編碼區包括編碼VP1、VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列；且第二VP編碼區包括編碼VP1 AAV衣殼蛋白但不編碼VP2或VP3之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP編碼區包括僅編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列；且第二VP編碼區包括僅編碼VP1 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP編碼區包括編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白但不編碼VP1之核苷酸序列；且第二VP編碼區包括編碼VP1 AAV衣殼蛋白但不編碼VP2或VP3之核苷酸序列。
在某些實施例中，第一VP編碼區編碼AAV血清型(例如AAV2)之AAV衣殼蛋白。在某些實施例中，第二VP編碼區編碼AAV血清型(例如AAV2)之AAV衣殼蛋白。在某些實施例中，第一VP編碼區之AAV血清型與第二VP編碼區之AAV血清型相同。在某些實施例中，第一VP編碼區之AAV血清型與第二VP編碼區之AAV血清型不同。在某些實施例中，可針對昆蟲細胞將VP編碼區密碼子最佳化。在某些實施例中，可針對草地貪夜蛾細胞將VP編碼區密碼子最佳化。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括：(i)第一核苷酸序列，其包括含有第一啟動子序列之第一表現控制區及含有編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白之核苷酸序列的第一VP編碼區；及(ii)第二核苷酸序列，其包括含有第二啟動子序列之第二表現控制區及含有編碼VP1 AAV衣殼蛋白但不編碼VP2或VP3之核苷酸序列的第二VP編碼區。在某些實施例中，病毒表現構築體包括：(i)第一核苷酸序列，其包括包括第一啟動子序列之第一表現控制區及含有編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白但不編碼VP1之核苷酸序列的第一VP編碼區；及(ii)第二核苷酸序列，其包括區包括第二啟動子序列之第二表現控制及含有編碼VP1 AAV衣殼蛋白但不編碼VP2或VP3之核苷酸序列的第二VP編碼區。在某些實施例中，將第二VP編碼區之核苷酸序列密碼子最佳化。在某些實施例中，將第二VP編碼區之核苷酸序列針對昆蟲細胞或更具體而言針對草地貪夜蛾細胞密碼子最佳化。在某些實施例中，將第二VP編碼區之核苷酸序列密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%、小於90%或小於80%之核苷酸同源性。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括：(i)第一核苷酸序列，其包括含有第一啟動子序列之第一表現控制區、含有第一起始密碼子之第一起始密碼子區、含有編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白之核苷酸序列之第一VP編碼區，及含有第一終止密碼子之第一終止密碼子區；及(ii)第二核苷酸序列，其包括含有第二啟動子序列之第二表現控制區、含有第二起始密碼子之第二起始密碼子區、含有編碼VP1 AAV衣殼蛋白但不編碼VP2或VP3之核苷酸序列之第二VP編碼區，及含有第二終止密碼子之第二終止密碼子區。在某些實施例中，核酸構築體包括：(i)第一核苷酸序列，其包括含有第一啟動子序列之第一表現控制區、含有第一起始密碼子之第一起始密碼子區、含有編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白但不編碼VP1之核苷酸序列之第一VP編碼區，及含有第一終止密碼子之第一終止密碼子區；及(ii)第二核苷酸序列，其包括含有第二啟動子序列之第二表現控制區、含有第二起始密碼子之第二起始密碼子區、含有編碼VP1 AAV衣殼蛋白但不編碼VP2或VP3之核苷酸序列之第二VP編碼區，及含有第二終止密碼子之第二終止密碼子區。在某些實施例中，第一起始密碼子係ATG，第二起始密碼子係ATG，或第一及第二起始密碼子二者皆係ATG。
在某些實施例中，可將編碼VP1衣殼蛋白之核苷酸序列密碼子最佳化。在某些實施例中，可針對昆蟲細胞將編碼VP1衣殼蛋白之核苷酸序列密碼子最佳化。在某些實施例中，可將編碼VP2衣殼蛋白之核苷酸序列密碼子最佳化。在某些實施例中，可針對昆蟲細胞將編碼VP2衣殼蛋白之核苷酸序列密碼子最佳化。在某些實施例中，可將編碼VP3衣殼蛋白之核苷酸序列密碼子最佳化。在某些實施例中，可針對昆蟲細胞將編碼VP3衣殼蛋白之核苷酸序列密碼子最佳化。
在某些實施例中，可將編碼VP1衣殼蛋白之核苷酸序列密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%之核苷酸同源性。在某些實施例中，經密碼子最佳化之VP1核苷酸序列與參考VP1核苷酸序列之間之核苷酸同源性小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
在某些實施例中，可將編碼VP2衣殼蛋白之核苷酸序列密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%之核苷酸同源性。在某些實施例中，經密碼子最佳化之VP1核苷酸序列與參考VP1核苷酸序列之間之核苷酸同源性小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
在某些實施例中，可將編碼VP3衣殼蛋白之核苷酸序列密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%之核苷酸同源性。在某些實施例中，經密碼子最佳化之VP1核苷酸序列與參考VP1核苷酸序列之間之核苷酸同源性小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
病毒表現構築體之結構性VP蛋白VP1、VP2及VP3可編碼於藉由利用替代剪接受體及非規範轉譯起始密碼子二者來調節之單一開放閱讀框中。可自單一轉錄物來轉錄及轉譯VP1、VP2及VP3，其中框內及/或框外起始密碼子二者皆經改造以控制由核苷酸轉錄物產生之VP1:VP2:VP3比率。在某些實施例中，可自僅編碼VP1之序列產生VP1。如本文中所使用，術語「僅針對VP1」或「僅VP1」係指具有以下特徵之核苷酸序列或轉錄物：其編碼VP1衣殼蛋白，且(i)在VP1序列內缺乏自相同序列完全轉錄或轉譯VP2及VP3所需之起始密碼子(亦即缺失或突變)；(ii)在VP1序列內包括防止自相同序列轉錄或轉譯VP2及VP3之其他密碼子；或(iii)包括VP1之起始密碼子(例如ATG)，從而VP1係藉由核苷酸轉錄物產生之主要VP蛋白。
在某些實施例中，可自僅編碼VP2之序列產生VP2。如本文中所使用，術語「僅針對VP2」或「僅VP2」係指具有以下特徵之核苷酸序列或轉錄物：其編碼VP2衣殼蛋白，且(i)核苷酸轉錄物係僅編碼VP2及VP3衣殼蛋白之全VP衣殼序列之截短變體；及(ii)包括VP2之起始密碼子(例如ATG)，從而VP2係藉由核苷酸轉錄物產生之主要VP蛋白。
在某些實施例中，可自僅編碼VP1及VP2之序列產生VP1及VP2。如本文中所使用，術語「僅針對VP1及VP2」或「僅VP1及VP2」係指具有以下特徵之核苷酸序列或轉錄物：其編碼VP1及VP2衣殼蛋白，且(i)在VP序列內缺乏自相同序列完全轉錄或轉譯VP3所需之起始密碼子(亦即缺失或突變)；(ii)在VP序列內包括防止自相同序列轉錄或轉譯VP3之其他密碼子；(iii)包括VP1 (例如ATG)及VP2 (例如ATG)之起始密碼子，從而VP1及VP2係藉由核苷酸轉錄物產生之主要VP蛋白；或(iv)包括藉由連接體(例如IRES區域)連結之僅VP1核苷酸轉錄物及僅VP2核苷酸轉錄物。
在某些實施例中，病毒表現構築體可含有包括起始密碼子區之核苷酸序列，例如編碼包括一或多個起始密碼子區之AAV衣殼蛋白之序列。在某些實施例中，起始密碼子區可位於表現控制序列內。起始密碼子可為ATG或非ATG密碼子(亦即其中AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子係非ATG之次最佳起始密碼子)。在某些實施例中，用於AAV產生之病毒表現構築體可含有編碼AAV衣殼蛋白之核苷酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子係非ATG (亦即次最佳起始密碼子)，從而容許經修正比率之病毒衣殼蛋白表現於產生系統中以提供改良之宿主細胞感染性。在一非限制性實例中，病毒構築體載體可含有包括編碼AAV VP1、VP2及VP3衣殼蛋白之核苷酸序列之核酸構築體，其中用於轉譯AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子係CTG、TTG或GTG，如美國專利第US8,163,543號中所闡述，該專利之內容中與AAV衣殼蛋白及其產生相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。 Rep編碼區
在某些實施例中，病毒表現構築體可包括Rep52編碼區。Rep52編碼區係包括編碼Rep52蛋白之Rep52核苷酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括Rep78編碼區。Rep78編碼區係包括編碼Rep78蛋白之Rep78核苷酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括Rep40編碼區。Rep40編碼區係包括編碼Rep40蛋白之Rep40核苷酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包括Rep68編碼區。Rep68編碼區係包括編碼Rep68蛋白之Rep68核苷酸序列之核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括第一核苷酸序列，該第一核苷酸序列包括：包括編碼Rep52蛋白之Rep52序列之Rep52編碼區、包括編碼Rep78蛋白之Rep78序列之Rep78編碼區或其組合。在某些實施例中，第一核苷酸序列包括Rep52編碼區及Rep78編碼區二者。在某些實施例中，第一核苷酸序列包括單一開放閱讀框、基本上由單一開放閱讀框組成或由單一開放閱讀框組成。在某些實施例中，第一核苷酸序列包括含有Rep52編碼區之第一開放閱讀框及含有Rep78編碼區且不同於第一開放閱讀框之第二開放閱讀框。
在某些實施例中，病毒表現構築體之非結構蛋白Rep52及Rep78可編碼於藉由利用替代剪接受體及非規範轉譯起始密碼子二者來調節之單一開放閱讀框中。
Rep78及Rep52二者皆可轉譯自單一轉錄物：Rep78轉譯始於第一起始密碼子(AUG或非AUG)處且Rep52轉譯始於Rep78序列內之Rep52起始密碼子(例如AUG)處。Rep78及Rep52亦可轉譯自具有獨立起始密碼子之單獨轉錄物。Rep78序列內之Rep52起始密碼子可發生突變、修飾或去除，從而處理經修飾Rep78序列將不產生Rep52蛋白。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為編碼用於表現於昆蟲細胞中之小病毒Rep蛋白之質體載體或桿狀病毒構築體。在某些實施例中，針對Rep78及Rep52蛋白使用單一編碼序列，其中用於轉譯Rep78蛋白之起始密碼子係選自由ACG、TTG、CTG及GTG組成之群之次最佳起始密碼子，其在表現於昆蟲細胞中時可實現部分外顯子跳躍，如美國專利第8,512,981號中所闡述，該專利之內容中與較Rep52促進Rep78之較不豐富表現以促進高載體產率相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，病毒表現構築體可為用於表現以昆蟲細胞中之質體載體或桿狀病毒構築體，其含有具有差別密碼子偏性之重複密碼子以(例如)改良Rep蛋白(例如Rep78及Rep52)之比率，由此改良病毒表現構築體及/或酬載構築體載體在昆蟲細胞中之大規模(商業)產生，如美國專利第8,697,417號中所教示，該專利之內容中與AAV複製蛋白及其產生相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，可使用美國專利第8,642,314號中所闡述之方法及構築體來改良Rep蛋白比率，該專利之內容中與AAV複製蛋白及其產生相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，病毒表現構築體可編碼與相應野生型Rep多肽相比具有一或多種改良性質之突變小病毒Rep多肽(例如針對大規模產生具有較高病毒效價之製劑)。或者，其可能能夠容許產生較佳品質之病毒顆粒或更穩定地產生病毒。在一非限制性實例中，病毒表現構築體可編碼具有突變核定位序列或鋅指結構域之突變Rep多肽，如專利申請案US 20130023034中所闡述，該專利申請案之內容中與AAV複製蛋白及其產生相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，核酸構築體包括第一核苷酸序列及第二核苷酸序列，該第二核苷酸序列與第一核苷酸序列在核酸構築體內係分開的。在某些實施例中，核酸構築體包括含有Rep52編碼區之第一核苷酸序列及含有Rep78編碼區之分開之第二核苷酸序列。在某些實施例中，核酸構築體包括第一核苷酸序列及分開之第二核苷酸序列；其中第一核苷酸序列包括Rep52編碼區及2A序列區；且其中第二核苷酸序列包括Rep78編碼區及2A序列區。
在某些實施例中，第一核苷酸序列包括Rep52編碼區及2A序列區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包括Rep78編碼區及2A序列區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包括Rep52編碼區、Rep78編碼區及2A序列區。在某些實施例中，第一核苷酸序列在核苷酸序列上包括位於Rep52編碼區與Rep78編碼區之間之2A序列區。在某些實施例中，第一核苷酸按自5’端至3’端之順序包括Rep52編碼區、2A序列區及Rep78編碼區。在某些實施例中，第一核苷酸按自5’端至3’端之順序包括Rep78編碼區、2A序列區及Rep52編碼區。
舉例而言，在某些實施例中，第一核苷酸序列包括起始密碼子區、Rep52編碼區、2A序列區及終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包括起始密碼子區、Rep78編碼區、2A序列區及終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包括起始密碼子區、Rep52編碼區、2A序列區、Rep78編碼區及終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸按自5’端至3’端之順序包括起始密碼子區、Rep52編碼區、2A序列區、Rep78編碼區及終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸按自5’端至3’端之順序包括起始密碼子區、Rep78編碼區、2A序列區、Rep52編碼區及終止密碼子區。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括一或多個必需基因區，該等必需基因區包括編碼核酸構築體之必需蛋白之必需基因核苷酸序列。在某些實施例中，必需基因核苷酸序列係編碼必需桿狀病毒蛋白之桿狀病毒序列。在某些實施例中，必需桿狀病毒蛋白係桿狀病毒套膜蛋白或桿狀病毒衣殼蛋白。舉例而言，在某些實施例中，核酸構築體包括第一核苷酸序列及分開之第二核苷酸序列；其中第一核苷酸序列包括Rep52編碼區及第一必需基因區；且其中第二核苷酸序列包括Rep78編碼區及第二必需基因區。在某些實施例中，核酸構築體包括第一核苷酸序列及分開之第二核苷酸序列；其中第一核苷酸序列包括Rep52編碼區、2A序列區及第一必需基因區；且其中第二核苷酸序列包括Rep78編碼區、2A序列區及第二必需基因區。在某些實施例中，核酸構築體包括第一核苷酸序列及分開之第二核苷酸序列；其中第一核苷酸序列按順序包括Rep52編碼區、2A序列區及第一必需基因區；且其中第二核苷酸序列按順序包括Rep78編碼區、2A序列區及第二必需基因區。
在某些實施例中，必需桿狀病毒蛋白係GP64桿狀病毒套膜蛋白。在某些實施例中，必需桿狀病毒蛋白係VP39桿狀病毒衣殼蛋白。
在某些實施例中，第一核苷酸序列包括Rep52編碼區、Rep78編碼區及IRES序列區。在某些實施例中，第一核苷酸序列在核苷酸序列上包括位於Rep52編碼區與Rep78編碼區之間之IRES序列區。在某些實施例中，第一核苷酸按自5’端至3’端之順序包括Rep52編碼區、IRES序列區及Rep78編碼區。在某些實施例中，第一核苷酸按自5’端至3’端之順序包括Rep78編碼區、IRES序列區及Rep52編碼區。
在某些實施例中，第一核苷酸序列包括含有Rep52編碼區之第一開放閱讀框、含有Rep78編碼區之第二開放閱讀框及位於第一開放閱讀框與第二開放閱讀框之間之IRES序列區。在某些實施例中，第一核苷酸序列按自5’端至3’端之順序包括含有Rep52編碼區之第一開放閱讀框、IRES序列區及含有Rep78編碼區之第二開放閱讀框。在某些實施例中，第一核苷酸序列按自5’端至3’端之順序包括含有Rep78編碼區之第一開放閱讀框、IRES序列區及含有Rep52編碼區之第二開放閱讀框。
在某些實施例中，第一核苷酸序列按自5’端至3’端之順序包括：第一開放閱讀框，其包括第一起始密碼子區、Rep52編碼區及第一終止密碼子區；IRES序列區；及第二開放閱讀框，其包括第二起始密碼子區、Rep78編碼區及第二終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸序列按自5’端至3’端之順序包括：第一開放閱讀框，其包括第一起始密碼子區、Rep78編碼區及第一終止密碼子區；IRES序列區；及第二開放閱讀框，其包括第二起始密碼子區、Rep52編碼區及第二終止密碼子區。
在本發明之某些實施例中，Rep52或Rep78轉錄自桿狀病毒衍生之多面體啟動子(polh)。Rep52或Rep78亦可轉錄自較弱啟動子，舉例而言，IE-1啟動子之缺失突變體ΔIE-1啟動子具有該IE-1啟動子之約20%之轉錄活性。可使用與ΔIE-1啟動子實質上同源之啟動子。就啟動子而言，至少50%、60%、70%、80%、90%或更高之同源性可視為實質上同源之啟動子。多核苷酸插入體
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或酬載構築體(例如桿粒)可包含藉由使用由熟習此項技術者已知及實施之標準分子生物學技術同源重組(轉位子供體/受體系統)至桿粒中所納入之多核苷酸。在某些實施例中，納入桿粒中之多核苷酸可包含可操作地連接至編碼蛋白質之核苷酸序列之表現控制序列。在某些實施例中，納入桿粒中之多核苷酸可包含含有啟動子(例如p10或polH)且可操作地連接至編碼結構性AAV衣殼蛋白(例如VP1、VP2、VP3或其組合)之核苷酸序列之表現控制序列。在某些實施例中，納入桿粒中之多核苷酸可包含含有啟動子(例如p10或polH)且可操作地連接至編碼非結構性AAV衣殼蛋白(例如Rep78、Rep52或其組合)之核苷酸序列之表現控制序列。
在某些實施例中，多核苷酸插入體可在桿狀病毒基因之位置處納入桿粒中。在某些實施例中，多核苷酸插入體可在非必需桿狀病毒基因之位置處納入桿粒中。在某些實施例中，可藉由使用多核苷酸插入體代替桿狀病毒基因或桿狀病毒基因之一部分來將多核苷酸插入體納入桿粒中。在某些實施例中，可藉由使用包含多核苷酸插入體及所代替桿狀病毒基因(或其部分)之融合多核苷酸代替桿狀病毒基因或桿狀病毒基因之一部分來將多核苷酸插入體納入桿粒中。
在某些實施例中，多核苷酸可在與桿狀病毒基因有關之限制性內核酸酶(REN)裂解位點(亦即REN切入點)之位置處納入桿粒中。在某些實施例中，可使用一或多種內核酸酶(例如歸巢內核酸酶)將多核苷酸納入桿粒中。例如參見Lihoradova等人，J Virol Methods, 140(1-2):59-65 (2007)，其內容中與將外來DNA直接選殖至桿狀病毒基因體中相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係FseI (對應於全域性反式活化子(gta)桿狀病毒基因) (ggccggcc)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係SdaI (對應於DNA聚合酶桿狀病毒基因) (cctgcagg)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係MauBI (對應於lef-4桿狀病毒基因) (cgcgcgcg)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係SbfI (對應於gp64/gp67桿狀病毒基因) (cctgcagg)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係I-CeuI (對應於v-cath桿狀病毒基因) (SEQ ID NO: 1)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係AvrII (對應於脫皮素UDP-糖基轉移酶(egt)桿狀病毒基因) (cctagg)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係NheI (gctagc)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係SpeI (actagt)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係BstZ17I (gtatac)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係NcoI (ccatgg)。在某些實施例中，桿粒中之REN切入點係MluI (acgcgt)。
可藉由以下方式將多核苷酸納入該等REN切入點中：(i)提供已經改造以包含靶REN裂解序列之多核苷酸插入體(例如經改造以在多核苷酸之兩端包含FseI REN序列之多核苷酸插入體)；(ii)提供包含用於插入多核苷酸之靶REN切入點之桿粒(例如包含FseI裂解位點之AcMNPV桿粒bMON14272之變體；(ii)使用適當REN酶消解經REN改造之多核苷酸(例如使用FseI酶消解在兩端包含FseI區之經REN改造之多核苷酸以產生多核苷酸-FseI插入體)；(iii)使用相同REN酶在REN切入點處消解桿粒以產生單切割桿粒(例如使用FseI酶在FseI位置處產生單切割桿粒)；及(iv)使用適當連接酶(例如T4連接酶)將多核苷酸插入體連接至單切割桿粒中。所得經改造桿粒DNA在靶REN切入點處包含經改造多核苷酸插入體。
可重複插入過程一或多次以將其他經改造多核苷酸插入體在不同REN切入點處納入相同桿粒中(例如在egt中之AvrII REN切入點處插入第一經改造多核苷酸插入體，隨後在cath基因中之I-CeuI REN切入點處插入第二經改造多核苷酸插入體，且隨後在gta基因中之FseI REN切入點處插入第三經改造多核苷酸插入體)。
在某些實施例中，可藉由使用多核苷酸插入體分割桿狀病毒基因來將多核苷酸插入體納入桿粒中(亦即，將多核苷酸插入體納入該基因之中央，從而使該基因之5'部分與桿粒基因之3'部分分開)。在某些實施例中，可藉由使用包含多核苷酸插入體及所分割桿狀病毒基因之一部分之融合多核苷酸分割桿狀病毒基因來將多核苷酸插入體納入桿粒中。在某些實施例中，融合多核苷酸之3'端包含所分割基因之5'部分，從而融合多核苷酸中基因之5'部分及保留於桿粒中之基因之3'部分形成桿狀病毒基因的全部或功能部分。在某些實施例中，融合多核苷酸之5'端包含所分割基因之3'部分,，從而融合多核苷酸中基因之3'部分及保留於桿粒中之基因之5'部分形成桿狀病毒基因的全部或功能部分。一非限制性實例呈現於實例13及14中，其中改造及產生融合多核苷酸以包含來自gta基因ORF之組分(全部/部分Ac-lef12啟動子、全部/部分Ac-gta基因)。本發明之融合多核苷酸之非限制性實例包含SEQ ID NO: 43、44及51之多核苷酸。
在某些實施例中，可使用限制性內核酸酶(REN)裂解自桿粒去除一或多種野生型基因。在某些實施例中，可使用限制性內核酸酶(REN)裂解來去除一或多個先前已插入桿粒中之經改造多核苷酸插入體。在某些實施例中，可使用限制性內核酸酶(REN)裂解來使用包含相同REN裂解序列之不同經改造多核苷酸插入體代替一或多個經改造多核苷酸插入體(舉例而言，可使用包含FseI REN裂解序列之不同經改造多核苷酸插入體代替FseI REN切入點處之經改造多核苷酸插入體)。 表現控制表現控制區
本發明之病毒表現構築體(例如表現Bac)可包括一或多個由表現控制序列編碼之表現控制區。在某些實施例中，表現控制序列係用於表現於病毒產生細胞(例如昆蟲細胞)中。在某些實施例中，表現控制序列可操作地連接至編碼蛋白質之核苷酸序列。在某些實施例中，表現控制序列可操作地連接至編碼VP之核苷酸序列或編碼之Rep核苷酸序列。
在本文中，術語「編碼核苷酸序列」、「蛋白質編碼基因」或「編碼蛋白質之核苷酸序列」係指編碼或轉譯成蛋白質產物(例如VP蛋白或Rep蛋白)之核苷酸序列。
「表現控制序列」係指調節可操作地連接之核苷酸序列之表現之核酸序列。因此，表現控制序列可包含啟動子、增強子、未轉譯區(UTR)、內部核糖體進入位點(IRES)、轉錄終止子、蛋白質編碼基因前部中之起始密碼子、內含子之剪接信號及終止密碼子。術語「表現控制序列」意欲最少包含其存在經設計以影響表現之序列，且亦可包含其他有利組分。舉例而言，前導序列及融合配偶體序列係表現控制序列。該術語亦可包括自序列去除框內外之不期望、潛在起始密碼子之核酸序列設計。其亦可包括去除期望潛在剪接位點之核酸序列設計。其包括引導添加聚A尾部之序列或多聚腺苷酸化序列(pA)，亦即mRNA之3′端處之一串腺嘌呤殘基，該等序列稱為聚A序列。其亦可經設計以增強mRNA穩定性。在昆蟲細胞中已知影響轉錄及轉譯穩定性之表現控制序列(例如啟動子)以及影響轉譯之序列(例如科紮克序列)。表現控制序列可具有此類性質以調節其可操作地連接之核苷酸序列，從而達成較低表現含量或較高表現含量。
在某些實施例中，表現控制序列可包括一或多種啟動子。啟動子可包括(但不限於)桿狀病毒主要晚期啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、核基因啟動子、來自一或多種物種之包括病毒及非病毒元件之嵌合啟動子及/或合成啟動子。在某些實施例中，啟動子可為Ctx、Op-EI、EI、ΔEI、EI-1、pH、PIO、polH (多面體)、ΔpolH、Dmhsp70、Hr1、Hsp70、4xHsp27 EcRE+最小Hsp70、IE、IE-1、ΔIE-1、ΔIE、p10、Δp10 (p10之經修飾變化形式或衍生物)、p5、p19、p35、p40、p6.9及其變化形式或衍生物。在某些實施例中，啟動子係Ctx啟動子。在某些實施例中，啟動子係p10啟動子。在某些實施例中，啟動子係polH啟動子。在某些實施例中，啟動子可選自組織特異性啟動子、細胞類型特異性啟動子、細胞週期特異性啟動子及其變化形式或衍生物。在某些實施例中，啟動子可為CMV啟動子、α 1-抗胰蛋白酶(α1-AT)啟動子、結合甲狀腺激素之球蛋白啟動子、結合甲狀腺素之球蛋白(LPS)啟動子、HCR-ApoCII雜合啟動子、HCR-hAAT雜合啟動子、白蛋白啟動子、載脂蛋白E啟動子、α1-AT+EaIb啟動子、腫瘤選擇性E2F啟動子、單核血液IL-2啟動子及其變化形式或衍生物。在某些實施例中，啟動子係低表現啟動子序列。在某些實施例中，啟動子係表現增強之啟動子序列。在某些實施例中，啟動子可包括如美國專利申請案20110136227中所闡述之Rep或Cap啟動子，該專利申請案中之內容中與表現啟動子相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，病毒表現構築體可在所有核苷酸序列中包括相同啟動子。在某些實施例中，病毒表現構築體可在兩個或更多個核苷酸序列中包括相同啟動子。在某些實施例中，病毒表現構築體可在兩個或更多個核苷酸序列中包括不同啟動子。在某些實施例中，病毒表現構築體可在所有核苷酸序列中包括不同啟動子。
在某些實施例中，病毒表現構築體編碼元件以改良某些細胞類型中之表現。在另一實施例中，表現構築體可包括用於使期望基因表現於哺乳動物或昆蟲細胞中之polh及/或ΔIE-1昆蟲轉錄啟動子、CMV哺乳動物轉錄啟動子及/或p10昆蟲特異性啟動子。
一個以上之表現控制序列可操作地連接至既定核苷酸序列。舉例而言，啟動子序列、轉譯起始序列及終止密碼子可操作地連接至核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體可在編碼蛋白質之核苷酸序列之間包括一或多個表現控制序列。在某些實施例中，表現控制區可包括含有編碼內部核糖體進入位點(IRES)之IRES核苷酸序列之IRES序列區。內部核糖體進入位點(IRES)可選自由以下組成之群：來自口蹄病病毒之FMDV-IRES、來自腦心肌炎病毒之EMCV-IRES及其組合。
在某些實施例中，病毒表現構築體係如PCT/US2019/ 054600及/或美國臨時專利申請案第62/741,855號中所闡述，該等案件之內容各自以全文引用方式併入本文中。
在某些實施例中，病毒表現構築體可含有包括起始密碼子區之核苷酸序列，例如編碼包括一或多個起始密碼子區之AAV衣殼蛋白之序列。在某些實施例中，起始密碼子區可位於表現控制序列內。
在某些實施例中，真核mRNA之轉譯起始位點可部分地由稱為科紮克序列之核苷酸序列控制，如Kozak, M Cell. 1986 Jan 31;44(2):283-92及Kozak, M. J Cell Biol.1989 Feb;108(2):229-41中所闡述，該等文獻中之每一者之內容中與科紮克序列及其應用相關之全部內容以引用方式併入本文中。科紮克形式之天然及合成轉譯起始位點二者皆可用於藉由分子基因技術來產生多肽，Kozak, M. Mamm Genome. 1996 Aug;7(8):563-74，該文獻之內容中與科紮克序列及其應用相關之全部內容以引用方式併入本文中。剪接位點係在轉錄(形成) mRNA之後mRNA上促進去除mRNA序列之部分之序列。通常，剪接發生於細胞核中，然後mRNA傳輸至細胞之細胞質中。
在某些實施例中，病毒表現構築體可含有包括終止密碼子區之核苷酸序列，例如編碼包括一或多個終止密碼子區之AAV衣殼蛋白之序列。在某些實施例中，終止密碼子區可位於表現控制序列內。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括一或多個包含起始密碼子之起始密碼子區。在某些實施例中，病毒表現構築體包括一或多個包含終止密碼子之終止密碼子區。在某些實施例中，病毒表現構築體包括一或多個起始密碼子區及一或多個終止密碼子區。在某些實施例中，起始密碼子區及/或終止密碼子區可位於表現控制序列內。
在某些實施例中，病毒表現構築體包括一或多個包括表現控制序列之表現控制區。在某些實施例中，表現控制區包括一或多個啟動子序列。在某些實施例中，表現控制區包括一或多個選自由以下組成之群之啟動子序列：桿狀病毒主要晚期啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、核基因啟動子、來自一或多種物種之包含病毒及非病毒元件之嵌合啟動子、合成啟動子及其變化形式或衍生物。在某些實施例中，表現控制區包括一或多個選自由以下組成之群之啟動子序列：Ctx啟動子、polh昆蟲轉錄啟動子、ΔIE-1昆蟲轉錄啟動子、p10昆蟲特異性啟動子、Δp10昆蟲特異性啟動子(p10之變化形式或衍生物)、CMV哺乳動物轉錄啟動子及其變化形式或衍生物。在某些實施例中，表現控制區包括一或多個低表現啟動子序列。在某些實施例中，表現控制區包括一或多個表現增強之啟動子序列。
在某些實施例中，表現控制區可包括含有編碼病毒2A肽之2A核苷酸序列之2A序列區。該序列容許在單一開放閱讀框(ORF)內共轉譯多個多肽。隨著ORF發生轉譯，2A序列內之甘胺酸及脯胺酸殘基會防止形成正常肽鍵，此使得在多肽鏈內發生核糖體「跳躍」及「自我裂解」。病毒2A肽可選自由以下組成之群：來自口蹄病病毒之F2A、來自明脈扁刺蛾(Thosea asigna )病毒之T2A、來自馬鼻炎A 病毒之E2A、來自豬捷申病毒(porcine teschovirus )-1 之P2A、來自質型多角體病毒之BmCPV2A、來自家蠶軟化病(B. mori flacherie)病毒之BmIFV 2A及其組合。
在一些實施例中，第一及/或第二核苷酸序列包括起始密碼子及/或終止密碼子及/或內部核糖體進入位點(IRES)。在某些實施例中，IRES核苷酸序列編碼選自由以下組成之群之內部核糖體進入位點(IRES)：來自口蹄病病毒之FMDV-IRES、來自腦心肌炎病毒之EMCV-IRES及其組合。
本發明方法並不受限於特定表現控制序列之使用。然而，在達成某一化學計量學之VP產物(VP1、VP2及VP3分別接近1:1:10)時亦及在Rep52或Rep40 (亦稱為p19 Rep)之含量顯著高於Rep78或Rep68 (亦稱為p5 Rep)時，可在產生細胞(例如昆蟲細胞)中獲得改良產率之AAV。在某些實施例中，p5/p19比率低於0.6、低於0.4或低於0.3，但總是至少為0.03。該等比率可在蛋白質層面下量測或可自特定mRNA之相對含量獲知。
在某些實施例中，AAV顆粒係在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為1:1:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，AAV顆粒係在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為2:2:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，AAV顆粒係在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為2:0:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，AAV顆粒在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為1-2:0-2:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，AAV顆粒在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為1-2:1-2:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，AAV顆粒在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為2-3:0-3:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，AAV顆粒在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為2-3:2-3:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，AAV顆粒係在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為3:3:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，AAV顆粒在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為3-5:0-5:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，AAV顆粒在病毒產生細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)中產生，其中所有三種VP蛋白係以接近、約或為3-5:3-5:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量學來表現。
在某些實施例中，表現控制區經改造以產生選自由以下組成之群之VP1:VP2:VP3比率：約或確切地1:0:10、約或確切地1:1:10、約或確切地2:1:10、約或確切地2:1:10、約或確切地2:2:10、約或確切地3:0:10、約或確切地3:1:10、約或確切地3:2:10、約或確切地3:3:10、約或確切地4:0:10、約或確切地4:1:10、約或確切地4:2:10、約或確切地4:3:10、約或確切地4:4:10、約或確切地5:5:10、約或確切地1-2:0-2:10、約或確切地1-2:1-2:10、約或確切地1-3:0-3:10、約或確切地1-3:1-3:10、約或確切地1-4:0-4:10、約或確切地1-4:1-4:10、約或確切地1-5:1-5:10、約或確切地2-3:0-3:10、約或確切地2-3:2-3:10、約或確切地2-4:2-4:10、約或確切地2-5:2-5:10、約或確切地3-4:3-4:10、約或確切地3-5:3-5:10及約或確切地4-5:4-5:10。 轉錄調節系統
本發明呈現可用於調節編碼蛋白質之核苷酸序列之表現之轉錄調節系統。本發明呈現包含可用於調節編碼蛋白質之核苷酸序列之表現之轉錄調節系統的病毒表現構築體。本發明呈現表現包含可用於調節編碼蛋白質之核苷酸序列之表現之轉錄調節系統的控制區(亦即可調節表現控制區)。
在某些實施例中，轉錄調節系統可用於增加編碼蛋白質之核苷酸序列之表現。在某些實施例中，轉錄調節系統可用於降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列之表現。在某些實施例中，轉錄調節系統可用於增加、降低或沉默編碼一或多種結構性AAV衣殼蛋白(例如VP1、VP2、VP3或其組合)之核苷酸序列之表現。在某些實施例中，轉錄調節系統可用於增加、降低或沉默編碼一或多種非結構性AAV複製蛋白(例如Rep78、Rep52或其組合)之核苷酸序列之表現。在某些實施例中，轉錄調節系統可用於增加、降低或沉默編碼一或多種酬載多肽之核苷酸序列之表現。
在某些實施例中，轉錄調節系統包含至少一個調節元件及至少一個調節結合區。在某些實施例中，調節元件可結合至調節結合區。在某些實施例中，調節元件具有結合調節結合區之高親和力。在某些實施例中，調節元件係可誘導調節元件。在某些實施例中，轉錄調節系統包含至少一個調節元件、至少一個調節結合區及至少一個誘導元件。在某些實施例中，誘導元件可減小調節元件結合調節結合區之親和力。在某些實施例中，調節元件在誘導元件不存在或以低濃度存在時具有結合調節結合區之高親和力，且在誘導元件存在或以高濃度存在時具有結合調節結合區之低親和力。在某些實施例中，誘導元件結合至調節元件且引起調節元件中之構形變化以減小與調節結合區之結合親和力。
在某些實施例中，調節元件係Lac抑制蛋白(LacR)，調節結合區係Lac操縱子(LacO)核苷酸序列，且誘導元件係選自乳糖、異乳糖及異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)之LacR誘導元件。如圖27A中所展示，LacR蛋白係結合至一或多個Lac操縱子(LacO)核苷酸序列之同源四聚體蛋白。四聚體LacR蛋白通常同時結合至兩個LacO序列(例如啟動子之每一側上之一個LacO序列)且在作用於LacO序列時將啟動子(例如p10啟動子)約束至環中。在此情形發生時，啟動子之轉錄起始得以減小或完全抑制。如圖27B中所展示，可藉由誘導元件(例如異乳糖)之存在來控制LacR與LacO之結合。在異乳糖結合至LacR時，其使得LacR發生構形變化且不結合至LacO核苷酸序列。異乳糖之合成類似物係異丙基β-d-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)。在某些實施例中，IPTG優於異乳糖，此乃因其不會代謝且由此在添加至細胞培養物中之後維持LacR之穩定誘導。
在某些實施例中，調節元件係Lac抑制蛋白(LacR)。LacR通常係分子量為38 kDa之具有360個胺基酸之蛋白質，其通常由LacI基因編碼。在某些實施例中，調節元件係由LacR核苷酸序列(亦即LacI基因)編碼之Lac抑制蛋白(LacR)。在某些實施例中，LacR蛋白可為來自LacI基因之野生型大腸桿菌(E.coli) LacR。在某些實施例中，LacR蛋白係用於表現於病毒產生細胞(例如昆蟲細胞)中之經改造LacR蛋白。LacI基因(及相應經改造LacR蛋白)之修飾可包含：將轉譯起始密碼子變為ATG或包含ATG之科紮克序列(或經修飾科紮克序列)；及將SV40核定位信號(NLS)添加至LacR之N-末端。在某些實施例中，經改造LacR蛋白係由包含NLS序列、連接體序列及包含經修飾科紮克序列及ATG起始密碼子之經修飾LacI基因之序列編碼。在某些實施例中，經改造LacR蛋白係由SEQ ID NO: 2編碼。在某些實施例中，經改造LacR蛋白係由與SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性之核苷酸序列編碼。
在某些實施例中，將經改造LacR蛋白密碼子最佳化。在某些實施例中，將經改造LacR蛋白針對昆蟲細胞密碼子最佳化。在某些實施例中，將經改造LacR蛋白針對草地貪夜蛾昆蟲細胞密碼子最佳化。在某些實施例中，經改造LacR蛋白係由SEQ ID NO: 3編碼。在某些實施例中，經改造LacR蛋白係由與SEQ ID NO: 3具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性之核苷酸序列編碼。
在某些實施例中，調節結合區係Lac操縱子(LacO)核苷酸序列(通常係35 bp半回文DNA元件)。在某些實施例中，誘導元件係LacR誘導元件，例如乳糖、異乳糖(乳糖之中間體代謝物)或異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG) (異乳糖類似物)。在某些實施例中，LacR誘導元件(例如IPTG)結合至LacR且引起LacR中之構形變化以減小與LacO之結合親和力。
在某些實施例中，調節元件係Tet抑制蛋白(TetR)或四環素(tetracycline)控制之反式活化蛋白(tTA) (由融合至來自單純皰疹病毒之VP16之強反式活化結構域之TetR構成)。在某些實施例中，調節元件係由TetR核苷酸序列編碼之TetR蛋白。在某些實施例中，調節元件係由tTA核苷酸序列編碼之tTA融合蛋白。在某些實施例中，調節結合區係Tet操縱子(tetO)核苷酸序列(通常係19 bp DNA元件)或Tet反應元件(TRE) (其包含兩種或更多個(例如7個)重複tetO單元之系列)。在某些實施例中，誘導元件係TetR/tTA誘導元件，例如四環素(Tet)或四環素類似物(例如去氧羥四環素(doxycycline) (Dox))。在某些實施例中，調節元件包含TetR蛋白或tTA融合蛋白，調節結合區包含至少一個tetO核苷酸序列(例如包含2-7個重複tetO單元之TRE區)，且誘導元件係選自四環素(Tet)或去氧羥四環素(Dox)之TetR/tTA誘導元件。在某些實施例中，TetR/tTA誘導元件(例如Tet或Dox)結合至TetR蛋白或tTA融合蛋白之TetR組分，且引起TetR多肽中之構形變化以減小與tetO之結合親和力。
在某些實施例中，轉錄調節系統可包含一或多種如US 6,133,027 (其內容中與轉錄調節系統及其組分相關之全部內容以引用方式併入本文中)中所闡述之組分，包含特定調節元件、調節結合區及誘導元件。
在某些實施例中，轉錄調節系統在病毒表現構築體之表現控制區內包含至少一個調節結合區(亦即調節結合序列)。在某些實施例中，表現控制區包含啟動子及至少一個調節結合區。在某些實施例中，調節結合區係與啟動子相距5-150或5-100個核苷酸。在某些實施例中，調節結合區與啟動子相距5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140或140-150個核苷酸。在某些實施例中，調節結合區位於已知對於啟動子功能並非必需之區域中。在某些實施例中，調節結合區係Lac操縱子(LacO)核苷酸序列。在某些實施例中，Lac操縱子(LacO)核苷酸序列係SEQ ID NO: 4。在某些實施例中，Lac操縱子(LacO)核苷酸序列係與SEQ ID NO: 4具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，調節結合區包含至少一個tetO核苷酸序列(例如包含2-7個重複tetO單元之TRE區)。在某些實施例中，啟動子係p10啟動子。在某些實施例中，啟動子係polH啟動子。在某些實施例中，調節結合區係Lac操縱子(LacO)核苷酸序列且啟動子係p10啟動子。
在某些實施例中，表現控制區包含啟動子及2-7個調節結合區。在某些實施例中，表現控制區包含啟動子及兩個調節結合區。在某些實施例中，表現控制區包含啟動子及位於啟動子上游之上游調節結合區以及位於啟動子下游之下游調節結合區。在某些實施例中，兩個調節結合區之間具有100-300個核苷酸之空間間隔(自每一調節結合區之中心核苷酸所量測)。在某些實施例中，兩個調節結合區之間具有150-300、150-250、150-225或150-210個核苷酸之空間間隔(自每一調節結合區之中心核苷酸所量測)。在某些實施例中，兩個調節結合區在啟動子中之空間間隔為100-105、105-110、110-115、115-120、120-125、125-130、130-135、135-140、140-145、145-150、150-155、155-160、160-165、165-170、170-175、175-180、180-185、185-190、190-195、195-200、200-205、200-210、200-215、205-210、205-215、210-215、215-220、220-225、225-230、230-235、235-240、240-245、245-250、250-255、255-260、260-265、265-270、270-275、275-280、280-285、285-290、290-295或295-300個核苷酸。在某些實施例中，兩個調節結合區具有112個核苷酸之空間間隔。在某些實施例中，兩個調節結合區具有148個核苷酸之空間間隔。在某些實施例中，兩個調節結合區具有152個核苷酸之空間間隔。在某些實施例中，兩個調節結合區具有200個核苷酸之空間間隔。在某些實施例中，兩個調節結合區具有208個核苷酸之空間間隔。
在某些實施例中，表現控制區包含啟動子及兩個Lac操縱子(LacO)核苷酸序列。在某些實施例中，表現控制區包含啟動子、位於啟動子上游之上游LacO核苷酸序列及位於啟動子下游之下游LacO核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子係p10啟動子。在某些實施例中，啟動子係polH啟動子。在某些實施例中，表現控制區包含p10啟動子、上游LacO及下游LacO，其中上游LacO及下游LacO具有200-215個核苷酸之空間間隔(自每一LacO序列之中心核苷酸所量測)。
在某些實施例中，轉錄調節系統包含至少一個調節元件。在某些實施例中，轉錄調節系統包含至少一個調節元件。在某些實施例中，調節元件係Lac抑制蛋白(LacR)。在某些實施例中，調節元件係Tet抑制蛋白(TetR)。在某些實施例中，調節元件係四環素控制之反式活化蛋白(tTA)，其由融合至來自單純皰疹病毒之VP16之強反式活化結構域之TetR構成。
在某些實施例中，調節元件係結合至一或多個調節結合序列之多肽。在某些實施例中，調節元件係結合至兩個調節結合序列之多肽。在某些實施例中，調節元件係結合至1-7個調節結合序列之多肽。在某些實施例中，調節元件係結合至一或多個LacO序列之多肽。在某些實施例中，調節元件係結合至兩個LacO序列之多肽。在某些實施例中，調節元件係結合至一或多個(例如兩個) LacO序列之LacR蛋白。在某些實施例中，調節元件係結合至一或多個tetO核苷酸序列(例如包含2-7個重複tetO單元之TRE區)之多肽。在某些實施例中，調節元件係結合至一或多個tetO核苷酸序列之TetR蛋白或tTA融合蛋白。
在某些實施例中，轉錄調節系統包含啟動子、至少一個距啟動子100個核苷酸內之調節結合區及至少一個結合至調節結合區之調節元件。在某些實施例中，在調節元件結合至距啟動子100個核苷酸內之調節結合區時，調節元件可用於降低自啟動子開始之轉錄。在某些實施例中，在調節元件結合至距啟動子100個核苷酸內之調節結合區時，調節元件可用於沉默自啟動子開始之轉錄。在某些實施例中，在調節元件結合至距啟動子100個核苷酸內之調節結合區時，調節元件可用於降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列自啟動子開始之表現。在某些實施例中，調節元件可用於藉由干擾啟動子處之RNA聚合酶活性來降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列自啟動子開始之表現，由此抑制或減小自啟動子開始之轉錄延伸。在某些實施例中，轉錄調節系統包含p10啟動子、至少一個距p10啟動子100個核苷酸內之LacO序列及至少一種結合至LacO序列之LacR蛋白。在某些實施例中，在LacR蛋白結合至距啟動子100個核苷酸內之LacO序列時，LacR蛋白可用於降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列自p10啟動子開始之表現。在某些實施例中，在LacR蛋白結合至LacO序列時，LacR蛋白可用於藉由干擾p10啟動子處之RNA聚合酶活性來降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列自p10啟動子開始之表現，由此抑制或減小自p10啟動子開始之轉錄延伸。
在某些實施例中，表現控制區包含啟動子；至少兩個調節結合區(亦即調節結合序列)，其在距啟動子區之每一端100個核苷酸內且具有200-215個核苷酸之空間間隔(自每一調節結合序列之中心核苷酸所量測)；及至少一個結合至調節結合區之調節元件。在某些實施例中，在調節元件結合至距啟動子100個核苷酸內之調節結合區時，調節元件可用於降低自啟動子開始之轉錄。在某些實施例中，在調節元件結合至距啟動子100個核苷酸內之調節結合區時，調節元件可用於沉默自啟動子開始之轉錄。在某些實施例中，在調節元件結合至距啟動子100個核苷酸內之調節結合區時，調節元件可用於降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列自啟動子開始之表現。在某些實施例中，調節元件可用於藉由干擾啟動子處之RNA聚合酶活性來降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列自啟動子開始之表現，由此抑制或減小自啟動子開始之轉錄延伸。在某些實施例中，轉錄調節系統包含p10啟動子、至少一個在p10啟動子上游100個核苷酸內之LacO序列、至少一個在p10啟動子下游100個核苷酸內之LacO序列及至少一種LacR蛋白(其同時結合至上游LacO序列及下游LacO序列二者)。在某些實施例中，在LacR蛋白結合至上游LacO序列及下游LacO序列二者時，LacR蛋白可用於降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列自p10啟動子開始之表現。在某些實施例中，LacR蛋白同時結合至上游LacO序列及下游LacO序列二者使得在p10啟動子周圍形成環結構。在某些實施例中，形成環結構會干擾p10啟動子處之RNA聚合酶活性，由此抑制或減小自p10啟動子開始之轉錄延伸。
本發明呈現包含編碼調節元件之核苷酸序列之病毒表現構築體。在某些實施例中，病毒表現構築體包含：(i)第一區域或開放閱讀框(ORF)，其包含可操作地連接至表現控制序列之編碼蛋白質之核苷酸序列，其中表現控制序列包含啟動子及至少一個距啟動子100個核苷酸內之調節結合區；及(ii)第二區域或ORF，其包含編碼調節元件之核苷酸序列；且其中由第二區域/ORF中之核苷酸序列編碼之調節元件對第一區域/ORF之表現控制序列內的至少一個調節結合區具有結合親和力。在某些實施例中，在來自第二區域/ORF之調節元件結合至第一區域/ORF之表現控制序列內之調節結合區時，該調節元件可用於降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列自第一區域/ORF中之啟動子開始之表現。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含編碼LacR蛋白(例如野生型LacR蛋白或經改造LacR蛋白)之LacI基因(或其經改造變化形式)。在某些實施例中，病毒表現構築體包含：(i)第一區域或ORF，其包含可操作地連接至表現控制序列之編碼蛋白質之核苷酸序列，其中表現控制序列包含p10啟動子及至少一個距啟動子100個核苷酸內之LacO序列；及(ii)第二區域或ORF，其包含編碼LacR蛋白(例如野生型LacR蛋白或經改造LacR蛋白)之核苷酸序列；且其中由第二區域/ORF中之核苷酸序列編碼之LacR蛋白對第一區域/ORF之表現控制序列內的至少一個LacO序列具有結合親和力。在某些實施例中，在第二區域/ORF中所編碼之LacR蛋白結合至第一區域/ORF之表現控制序列內之LacO序列時，該LacR蛋白可用於降低或沉默編碼蛋白質之核苷酸序列自第一區域/ORF中之p10啟動子開始之表現。。在某些實施例中，第一區域/ORF包含至少一個在p10啟動子上游100個核苷酸內之LacO序列及至少一個在p10啟動子下游100個核苷酸內之LacO序列，其中LacR蛋白可同時結合至上游LacO序列及下游LacO序列二者。在某些實施例中，上游LacO序列及下游LacO序列具有200-215個核苷酸之空間間隔(自每一調節結合序列之中心核苷酸所量測)。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含：(i)第一區域或ORF，其包含可操作地連接至表現控制序列之編碼蛋白質之核苷酸序列，其中編碼蛋白質之核苷酸序列包含編碼一或多種結構性AAV衣殼蛋白(例如VP1、VP2、VP3或其組合)之核苷酸序列，且其中表現控制序列包含p10啟動子及至少一個距啟動子100個核苷酸內之LacO序列；及(ii)第二區域或ORF，其包含編碼LacR蛋白(例如野生型LacR蛋白或經改造LacR蛋白)之核苷酸序列；且其中由第二區域/ORF中之核苷酸序列編碼之LacR蛋白對第一區域/ORF之表現控制序列內的至少一個LacO序列具有結合親和力。在某些實施例中，在第二區域/ORF中所編碼之LacR蛋白結合至第一ORF之表現控制序列內之LacO序列時，該LacR蛋白可用於降低或沉默結構性AAV衣殼蛋白自第一區域/ORF中之p10啟動子開始之表現。在某些實施例中，第一ORF包含至少一個在p10啟動子上游100個核苷酸內之LacO序列及至少一個在p10啟動子下游100個核苷酸內之LacO序列，其中LacR蛋白可同時結合至上游LacO序列及下游LacO序列二者。在某些實施例中，上游LacO序列及下游LacO序列具有200-215個核苷酸之空間間隔(自每一調節結合序列之中心核苷酸所量測)。在某些實施例中，編碼蛋白質之核苷酸序列編碼VP1、VP2及VP3。在某些實施例中，編碼蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP1。在某些實施例中，編碼蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP2。在某些實施例中，編碼蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP3。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含：(i)第一區域或ORF，其包含可操作地連接至表現控制序列之編碼蛋白質之核苷酸序列，其中編碼蛋白質之核苷酸序列包含編碼一或多種非結構性AAV複製蛋白(例如Rep78、Rep52或其組合)之核苷酸序列，且其中表現控制序列包含p10啟動子及至少一個距啟動子100個核苷酸內之LacO序列；及(ii)第二區域或ORF，其包含編碼LacR蛋白(例如野生型LacR蛋白或經改造LacR蛋白)之核苷酸序列；且其中由第二區域/ORF中之核苷酸序列編碼之LacR蛋白對第一區域/ORF之表現控制序列內的至少一個LacO序列具有結合親和力。在某些實施例中，在第二區域/ORF中所編碼之LacR蛋白結合至第一區域/ORF之表現控制序列內之LacO序列時，該LacR蛋白可用於降低或沉默非結構性AAV複製蛋白自第一區域/ORF中之p10啟動子開始之表現。在某些實施例中，第一ORF包含至少一個在p10啟動子上游100個核苷酸內之LacO序列及至少一個在p10啟動子下游100個核苷酸內之LacO序列，其中LacR蛋白可同時結合至上游LacO序列及下游LacO序列二者。在某些實施例中，上游LacO序列及下游LacO序列具有200-215個核苷酸之空間間隔(自每一調節結合序列之中心核苷酸所量測)。在某些實施例中，編碼蛋白質之核苷酸序列編碼Rep78及Rep52。在某些實施例中，編碼蛋白質之核苷酸序列僅編碼Rep78。在某些實施例中，編碼蛋白質之核苷酸序列僅編碼Rep52。
在某些實施例中，轉錄調節系統包含至少一個減小調節元件結合調節結合區之親和力之誘導元件。在某些實施例中，誘導元件係LacR誘導元件。在某些實施例中，LacR誘導元件結合至LacR且引起LacR中之構形變化以減小與LacO之結合親和力。在某些實施例中，LacR誘導元件係乳糖。在某些實施例中，LacR誘導元件係異乳糖(乳糖之中間體代謝物)。在某些實施例中，LacR誘導元件係異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG) (異乳糖類似物)。在某些實施例中，誘導元件係TetR/tTA誘導元件。在某些實施例中，TetR/tTA誘導元件結合至TetR (或tTA之TetR組分)且引起TetR中之構形變化以減小與TetO之結合親和力。在某些實施例中，TetR/tTA誘導元件係四環素(Tet)。在某些實施例中，TetR/tTA誘導元件係四環素類似物。在某些實施例中，TetR/tTA誘導元件係去氧羥四環素(Dox)。
在某些實施例中，誘導元件係以誘導元件靶濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以以下濃度存在：約0.0 µM、約0.5 µM、約1.0 µM、約1.5 µM、約2.0 µM、約2.5 µM、約3.0 µM、約3.5 µM、約4.0 µM、約4.5 µM、約5.0 µM、約5.5 µM、約6.0 µM、約6.5 µM、約7.0 µM、約7.5 µM、約8.0 µM、約8.5 µM、約9.0 µM、約9.5 µM、約10.0 µM、約10.5 µM、約11.0 µM、約11.5 µM、約12.0 µM、約12.5 µM、約13.0 µM、約13.5 µM、約14.0 µM、約14.5 µM、約15.0 µM、約15.5 µM、約16.0 µM、約16.5 µM、約17.0 µM、約17.5 µM、約18.0 µM、約18.5 µM、約19.0 µM、約19.5 µM、約20.0 µM、約20.5 µM、約21.0 µM、約21.5 µM、約22.0 µM、約22.5 µM、約23.0 µM、約23.5 µM、約24.0 µM、約24.5 µM、約25.0 µM、約25.5 µM、約26.0 µM、約26.5 µM、約27.0 µM、約27.5 µM、約28.0 µM、約28.5 µM、約29.0 µM、約29.5 µM或約30 µM。
在某些實施例中，誘導元件係以以下濃度存在：約0.0 µM、約5 µM、約10 µM、約15 µM、約20 µM、約25 µM、約30 µM、約35 µM、約40 µM、約45 µM、約50 µM、約55 µM、約60 µM、約65 µM、約70 µM、約75 µM、約80 µM、約85 µM、約90 µM、約95 µM、約100 µM、約105 µM、約110 µM、約115 µM、約120 µM、約125 µM、約130 µM、約135 µM、約140 µM、約145 µM、約150 µM、約155 µM、約160 µM、約165 µM、約170 µM、約175 µM、約180 µM、約185 µM、約190 µM、約195 µM、約200 µM、約205 µM、約210 µM、約215 µM、約220 µM、約225 µM、約230 µM、約235 µM、約240 µM、約245 µM、約250 µM、約255 µM、約260 µM、約265 µM、約270 µM、約275 µM、約280 µM、約285 µM、約290 µM、約295 µM或約300 µM。
在某些實施例中，誘導元件係以介於約1.0 µM至約200 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約1.0 µM至約100 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約1.0 µM至約50 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約1.0 µM至約40 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約1.0 µM至約35 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約10 µM至約35 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約10 µM至約25 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約12.5 µM至約22.5 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約13 µM至約17 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約5 µM至約15 µM之間之濃度存在。在某些實施例中，誘導元件係以介於約8 µM至約12 µM之間之濃度存在。
在某些實施例中，轉錄調節系統包含控制量或濃度之誘導元件。在某些實施例中，包含於轉錄調節系統內之誘導元件之量與誘導元件對調節元件與調節結合序列之間之結合親和力的效應成正比。在某些實施例中，控制轉錄調節系統內之誘導元件之濃度使得可相應地控制編碼蛋白質之核苷酸序列自啟動子開始的表現。
在某些實施例中，誘導元件不存在或以低濃度存在。因此，調節元件具有結合調節結合區之高親和力且編碼蛋白質之核苷酸序列自啟動子開始之表現發生降低或沉默。在某些實施例中，誘導元件存在或以高濃度存在。因此，調節元件具有結合調節結合區之低親和力且編碼蛋白質之核苷酸序列自啟動子開始之表現並不降低或最小程度地降低。在某些實施例中，存在於轉錄調節系統中之調節元件之濃度與調節元件結合調節結合區之親和力成正比。在某些實施例中，存在於轉錄調節系統中之調節元件之濃度與編碼蛋白質之核苷酸序列之降低的表現含量(因調節元件結合至調節結合區)成正比。在某些實施例中，存在於轉錄調節系統中之調節元件之濃度與藉由自啟動子開始表現編碼蛋白質之核苷酸序列所產生蛋白質物質的量成正比。
在某些實施例中，轉錄調節系統可與編碼一或多種結構性AAV衣殼蛋白(例如VP1、VP2、VP3或其組合)之核苷酸序列一起發揮作用，從而存在於轉錄調節系統中之調節元件之濃度與藉由自啟動子開始表現編碼蛋白質之核苷酸序列所產生AAV衣殼蛋白物質的量成正比。在某些實施例中，轉錄調節系統可與僅編碼VP1之核苷酸序列一起發揮作用。在某些實施例中，轉錄調節系統可與僅編碼VP2之核苷酸序列一起發揮作用。在某些實施例中，轉錄調節系統可與僅編碼VP3之核苷酸序列一起發揮作用。在某些實施例中，在藉由病毒產生細胞處理病毒表現構築體時，轉錄調節系統經改造以提供約1-2:1-2:10之VP蛋白比率(VP1:VP2:VP3)。在某些實施例中，在藉由病毒產生細胞處理病毒表現構築體時，轉錄調節系統經改造以包含產生約1-2:1-2:10之VP蛋白比率(VP1:VP2:VP3)之濃度之調節元件。
在某些實施例中，轉錄調節系統可與編碼一或多種非結構性AAV複製蛋白(例如Rep78、Rep52或其組合)之核苷酸序列一起發揮作用，從而存在於轉錄調節系統中之調節元件之濃度與藉由自啟動子開始表現編碼蛋白質之核苷酸序列所產生AAV複製蛋白物質的量成正比。在某些實施例中，轉錄調節系統可與僅編碼Rep78之核苷酸序列一起發揮作用。在某些實施例中，轉錄調節系統可與僅編碼Rep52之核苷酸序列一起發揮作用。在某些實施例中，在藉由病毒產生細胞處理病毒表現構築體時，轉錄調節系統經改造以提供約1:1-10之p5 Rep蛋白(Rep78及Rep68)對p19 Rep蛋白(Rep52及Rep40)之比率。在某些實施例中，在藉由病毒產生細胞處理病毒表現構築體時，轉錄調節系統經改造以包含產生約1:1-10之p5 Rep蛋白(Rep78及Rep68)對p19 Rep蛋白(Rep52及Rep40)之比率之濃度的調節元件。
在某些實施例中，轉錄調節系統可包含WO2016137949或WO2017075335中所呈現之一或多個可調節元件，該等案件中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。 病毒產生細胞及載體哺乳動物細胞
本發明本文所揭示之病毒產生闡述產生AAV顆粒或病毒載體之製程及方法，該AAV顆粒或病毒載體會接觸靶細胞以遞送包括編碼酬載分子之核苷酸之酬載構築體(例如重組AAV顆粒或病毒構築體)。病毒產生細胞可選自任一生物體，包括原核(例如細菌)細胞及真核細胞(包括昆蟲細胞、酵母細胞及哺乳動物細胞)。
在某些實施例中，本發明之AAV顆粒可產生於包括哺乳動物細胞之病毒產生細胞中。病毒產生細胞可包括哺乳動物細胞，例如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293、HEK293T (293T)、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2及衍生自哺乳動物之原代纖維母細胞、肝細胞及肌母細胞。病毒產生細胞可包括衍生自哺乳動物物種(包括(但不限於)人類、猴、小鼠、大鼠、兔及倉鼠)之細胞或包括一定細胞類型(包括(但不限於)纖維母細胞、肝細胞、腫瘤細胞、細胞系轉變細胞等)。
通常用於產生重組AAV顆粒之AAV病毒產生細胞包括(但不限於) HEK293細胞、COS細胞、C127、3T3、CHO、HeLa細胞、KB細胞、BHK及如以下案件中所闡述之其他哺乳動物細胞系，美國專利第6,156,303號、第5,387,484號、第5,741,683號、第5,691,176號、第6,428,988號及第5,688,676號；美國專利申請案2002/0081721及國際專利公開案第WO 00/47757號、第WO 00/24916號及第WO 96/17947號，其內容各自以全文引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。在某些實施例中，AAV病毒產生細胞係提供自複製缺陷型輔助病毒缺失之功能之反式互補性包裝細胞系，例如HEK293細胞或其他Ea反式互補性細胞。
在某些實施例中，可使用包裝細胞系293-10-3 (ATCC登錄號：PTA-2361)來產生AAV顆粒，如美國專利第US6,281,010號中所闡述，該專利之內容中與293-10-3包裝細胞系及其應用相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在本發明之某些實施例中，可使用用於反式互補性E1缺失之腺病毒載體(其在磷酸甘油酸酯激酶(PGK)啟動子之控制下編碼腺病毒E1a及腺病毒E1b)之細胞系(例如HeLA細胞系)來產生AAV顆粒，如美國專利第6365394號中所闡述，該專利之內容中與HeLA細胞系及其應用相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，在哺乳動物細胞中使用三重轉染方法來產生AAV顆粒，其中酬載構築體、小病毒Rep及小病毒Cap以及病毒表現構築體包括於三個不同構築體內。可利用AAV顆粒產生之三種組分之三重轉染方法來產生小批次病毒以供分析(包括轉導效率、靶組織(向性)評估及穩定性)。
可藉由三重轉染或桿狀病毒調介之病毒產生或業內已知之任一其他方法來產生擬調配AAV顆粒。可採用業內已知之任一適宜允許或包裝細胞來產生載體。在某些實施例中，使用提供自複製缺陷型輔助病毒缺失之功能之反式互補性包裝細胞系，例如293細胞或其他E1a反式互補性細胞。
基因盒可含有一些或所有細小病毒(例如AAV) cap及rep基因。在某些實施例中，藉由將編碼衣殼及/或Rep蛋白之包裝載體引入細胞中來反式提供一些或所有cap及rep功能。在某些實施例中，基因盒不編碼衣殼或Rep蛋白。或者，使用經穩定轉變以表現cap及/或rep基因之包裝細胞系。
在某些實施例中，根據如US2016/0032254中所闡述之程序自培養上清液產生重組AAV病毒顆粒並純化，該案件之內容中與重組AAV病毒顆粒之產生及處理相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。產生亦可涉及業內已知之方法，包括使用293T細胞者、三重轉染或任一適宜產生方法。
在某些實施例中，哺乳動物病毒產生細胞(例如293T細胞)可處於黏附/附著狀態(例如使用磷酸鈣)或懸浮狀態(例如使用聚乙烯亞胺(PEI))。使用產生AAV所需之質體(亦即AAV rep/cap構築體、腺病毒病毒表現構築體及/或側接ITR之酬載構築體)來轉染哺乳動物病毒產生細胞。在某些實施例中，轉染過程可包括可選培養基更換(例如用於黏附形式細胞之培養基更換、懸浮形式細胞之無培養基更換、視需要用於懸浮形成細胞之培養基更換)。在某些實施例中，轉染過程可包括轉染培養基(例如DMEM或F17)。在某些實施例中，轉染培養基可包括血清或可無血清(例如處於使用磷酸鈣及血清之黏附狀態中之細胞、處於使用PEI及不使用血清之懸浮狀態中之細胞)。
隨後可藉由刮擦(黏附形式)及/或粒化(懸浮形式及經刮擦附著形式)收集細胞且轉移至貯器中。可視需要重複收集步驟以完全收集所產生細胞。接下來，可藉由連續冷凍-解凍循環(-80℃至37℃)、化學裂解(例如添加洗滌劑triton)、機械裂解或藉由在達到約0%活力之後使細胞培養物降解來達成細胞裂解。藉由離心及/或深度過濾來去除細胞碎屑。藉由使用DNA qPCR實施DNase抗性基因體滴定來量化試樣之AAV顆粒。
根據基因體拷貝數(基因體顆粒/毫升)來量測AAV顆粒效價。基因體顆粒濃度係基於載體DNA之DNA qPCR，如先前所報告(Clark等人(1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039；Veldwijk等人(2002) Mol. Ther., 6:272-278，其內容中與顆粒濃度量測相關之全部內容各自以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)。昆蟲細胞
本發明之病毒產生包括產生AAV顆粒或病毒載體之製程及方法，該等AAV顆粒或病毒載體接觸靶細胞以遞送包括編碼酬載分子之核苷酸之酬載構築體(例如重組病毒構築體)。在某些實施例中，本發明之AAV顆粒或病毒載體可產生於包括昆蟲細胞之病毒產生細胞中。
用於培養中昆蟲細胞之生長條件及培養中昆蟲細胞之異源性產物產生在業內已眾所周知，參見美國專利第6,204,059號，其內容中與病毒產生中昆蟲細胞之生長及應用相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
任一容許複製細小病毒且可維持於培養物中之昆蟲細胞可用於本發明。通常用於產生重組AAV顆粒之AAV病毒產生細胞包括(但不限於)草地貪夜蛾(包括(但不限於) Sf9或Sf21)細胞系、果蠅屬(Drosophila )細胞系或蚊子細胞系(例如白紋伊蚊(Aedes albopictus )衍生之細胞系)。已充分記載昆蟲細胞用於表現異源性蛋白之用途以及將核酸(例如載體，例如昆蟲細胞相容性載體)引入該等細胞中之方法及將該等細胞維持於培養物中之方法。例如參見Methods in Molecular Biology，由Richard編輯，Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly等人，Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人，J. Vir. 63:3822-8 (1989)；Kajigaya等人，Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)；Ruffing等人，J. Vir. 66:6922-30 (1992)；Kimbauer等人，Vir.219:37-44 (1996)；Zhao等人，Vir.272:382-93 (2000)；及Samulski等人，美國專利第6,204,059號，其內容中與昆蟲細胞在病毒產生中之應用相關之全部內容各自以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在一實施例中，使用WO2015/191508中所闡述之方法來製備AAV顆粒，該案件之內容以全文引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，可使用與桿狀病毒系統組合之昆蟲宿主細胞系統(例如如由Luckow等人，Bio/Technology 6: 47 (1988)所闡述)。在某些實施例中，用於製備嵌合肽之表現系統係粉紋夜蛾(Trichoplusia ni) Tn 5B1-4昆蟲細胞/桿狀病毒系統，該系統可應用於高含量之蛋白質，如美國專利第6660521號中所闡述，其內容以全文引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
昆蟲細胞之擴增、培養、轉染、感染及儲存可實施於業內已知之任一細胞培養基、細胞轉染培養基或儲存培養基中，包含Hyclone SFX昆蟲細胞培養基、Expression System ESF AF昆蟲細胞培養基、ThermoFisher Sf900II培養基、ThermoFisher Sf900III培養基或ThermoFisher Grace昆蟲培養基。本發明之昆蟲細胞混合物亦可包含本發明中所闡述之任一調配添加劑或要素，包含(但不限於)鹽、酸、鹼、緩衝劑、表面活性劑(例如Poloxamer 188/Pluronic F-68)及其他已知培養基要素。調配添加劑可逐漸納入或以「摻料」形式納入(短時間內納入較大體積)。桿狀病毒產生系統
在某些實施例中，本發明製程可包括在桿狀病毒系統中使用病毒表現構築體及酬載構築體載體來產生AAV顆粒或病毒載體。在某些實施例中，桿狀病毒系統包括桿狀病毒表現載體(BEV)及/或桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或酬載構築體可為桿粒，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因體。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或酬載構築體可為藉由使用由熟習此項技術者已知及實施之標準分子生物學技術同源重組(轉位子供體/受體系統)桿粒中所納入之多核苷酸。單獨病毒複製細胞群體之轉染可產生兩個或更多個群組(例如兩個、三個)之桿狀病毒(BEV)，一或多個群組可包括病毒表現構築體(舉例而言，桿狀病毒係「表現BEV」或「表現Bac」)，且一或多個群組可包括酬載構築體(舉例而言，桿狀病毒係「酬載BEV」或「酬載Bac」)。可使用桿狀病毒來感染病毒產生細胞以產生AAV顆粒或病毒載體。
在某些實施例中，該製程包括轉染單一病毒複製細胞群體以產生包括病毒表現構築體及酬載構築體二者之單一桿狀病毒(BEV)群組。可使用該等桿狀病毒來感染病毒產生細胞以產生AAV顆粒或病毒載體。
在某些實施例中，使用桿粒轉染劑(例如Promega FuGENE HD、WFI水或ThermoFisher Cellfectin II試劑)來產生BEV。在某些實施例中，在病毒產生細胞(例如昆蟲細胞)中產生BEV且擴增。
在某些實施例中，該方法利用包括一或多個BEV之病毒產生細胞(包括桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC))之種子培養物。已使用包括病毒表現構築體之表現BEV亦及包括酬載構築體之酬載BEV來轉染/轉導/感染種子BIIC。在某些實施例中，收穫種子培養物，分成等分試樣並冷凍，且隨後可用於引發產生細胞之幼稚群體之轉染/轉導/感染。在某些實施例中，將一組種子BIIC儲存於-80℃下或於LN2 蒸氣中。
桿狀病毒係由對於桿狀病毒之功能及複製至關重要之若干必需蛋白(例如複製蛋白、套膜蛋白及衣殼蛋白)製得。桿狀病毒基因體由此包括若干編碼必需蛋白之必需基因核苷酸序列。作為一非限制性實例，基因體可包括必需基因區，該必需基因區包括編碼桿狀病毒構築體之必需蛋白之必需基因核苷酸序列。必需蛋白可包括：GP64桿狀病毒套膜蛋白、VP39桿狀病毒衣殼蛋白或桿狀病毒構築體之其他類似必需蛋白。
用於在昆蟲細胞(包括(但不限於)草地貪夜蛾(Sf9)細胞)中產生AAV顆粒之桿狀病毒表現載體(BEV)會提供高效價之病毒載體產物。編碼病毒表現構築體及酬載構築體之重組桿狀病毒引發了病毒載體複製細胞之生產性感染。自一級感染釋放之感染性桿狀病毒顆粒會繼續感染培養物中之其他細胞，從而在多個感染週期(隨初始感染複數而變)內以指數方式感染整個細胞培養群體，參見Urabe, M.等人，J Virol. 2006 Feb;80(4):1874-85，其內容中與BEV及病毒顆粒之產生及應用相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本發明之產生系統藉由利用無滴度感染細胞保存及規模化系統來解決了多個傳代中之桿狀病毒不穩定性。使用編碼AAV顆粒之結構及/或非結構組分之病毒表現構築體來轉染病毒產生細胞之小規模種子培養物。將經桿狀病毒感染之病毒產生細胞收穫為可冷凍保存於液氮中之等分試樣；等分試樣保留了用於感染大規模病毒產生細胞培養物之活力及感染性。Wasilko DJ等人，Protein Expr Purif. 2009 Jun;65(2):122-32，其內容中與BEV及病毒顆粒之產生及應用相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
可使用基因穩定之桿狀病毒來產生用於在無脊椎動物細胞中產生AAV顆粒之一或多種組分之來源。在某些實施例中，缺陷性桿狀病毒表現載體可以游離方式維持於昆蟲細胞中。在此一實施例中，使用複製控制元件(包括(但不限於)啟動子、增強子及/或細胞週期調節性複製元件)來改造相應桿粒載體。
在某些實施例中，可使用標記物改造桿狀病毒以重組至幾丁質酶/細胞自溶酶基因座中。chia/v-cath基因座並非在組織培養物中繁殖桿狀病毒所必需，且V-cath (EC 3.4.22.50)係在含有Arg-Arg二肽之受質上最活躍之半胱胺酸內切蛋白酶。Arg-Arg二肽存在於濃核病毒(densovirus)及細小病毒衣殼結構蛋白中，但很少出現於依賴病毒VP1中。
在某些實施例中，使用至少一個穩定整合拷貝之AAV複製及載體產生所需之任一元件來改造允許桿狀病毒感染之穩定病毒產生細胞，該等元件包括(但不限於)整個AAV基因體、Rep及Cap基因、Rep基因、Cap基因、作為單獨轉錄盒之每一Rep蛋白、作為單獨轉錄盒之每一VP蛋白、AAP (組裝活化蛋白)或至少一種具有天然或非天然啟動子之桿狀病毒輔助基因。
在某些實施例中，桿狀病毒表現載體(BEV)係基於苜蓿銀紋夜蛾多衣殼核型多角體病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrosis virus) (AcMNPV桿狀病毒)或BmNPV桿狀病毒。在某些實施例中，本發明桿粒係基於(亦即其經改造變體) AcMNPV桿粒，例如bmon14272、vAce25ko或vAclef11KO。
在某些實施例中，桿狀病毒表現載體(BEV)係其中桿狀病毒v-cath 基因已部分地或完全缺失(「v-cath 缺失之BEV」)或突變之BEV。在某些實施例中，BEV缺乏v-cath 基因或包括v-cath 基因之突變不活化形式。在某些實施例中，BEVs缺乏v-cath 基因。在某些實施例中，BEV包括v-cath 基因之突變不活化形式。
本發明之病毒產生桿粒可缺失某些桿狀病毒基因或基因座。
本發明呈現產生桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC) (例如表現BIIC及/或酬載BIIC)之方法。在某些實施例中，本發明呈現產生桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之方法，其包括下列步驟：(a)將一定體積之細胞培養基引入生物反應器中；(b)將至少一種病毒產生細胞(VPC)引入生物反應器中且將生物反應器中之VPC數量擴增至靶VPC細胞密度；(c)將至少一種桿狀病毒表現載體(BEV)引入生物反應器中，其中BEV包括AAV病毒表現構築體或AAV酬載構築體；(d)將生物反應器中之VPC及BEV之混合物在容許至少一種BEV感染至少一種VPC之條件下一起培育以產生桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)；(e)在使得生物反應器中之BIIC數量達到靶BIIC細胞密度之條件下培育生物反應器；及(f)自生物反應器收穫BIIC。在某些實施例中，生物反應器具有至少5 L、10 L、20 L、50 L、100 L或200 L之體積。在某些實施例中，生物反應器中之細胞培養基之體積(亦即工作體積)為至少5 L、10 L、20 L、50 L、100 L或200 L。
在某些實施例中，BEV引入時之VPC密度係1.0×105 -2.5×105 、2.5×105 -5.0×105 、5.0×105 -7.5×105 、7.5×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、1.0×106 -2.0×106 、1.5×106 -2.5×106 、2.0×106 -3.0×106 、2.5×106 -3.5×106 、3.0×106 -4.0×106 、3.5×106 -4.5×106 、4.0×106 -5.0×106 、4.5×106 -5.5×106 、5.0×106 -1.0×107 、5.0×106 -6.0×106 、5.5×106 -6.5×106 、6.0×106 -7.0×106 、6.5×106 -7.5×106 、7.0×106 -8.0×106 、7.5×106 -8.5×106 、8.0×106 -9.0×106 、8.5×106 -9.5×106 、9.0×106 -1.0×107 、9.5×106 -1.5×107 、1.0×107 -5.0×107 或5.0×107 -1.0×108 個細胞/mL。在某些實施例中，BEV引入時之VPC密度為5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、1.5×106 、2.0×106 、2.5×106 、3.0×106 、3.5×106 、4.0×106 、4.5×106 、5.0×106 、5.5×106 、6.0×106 、6.5×106 、7.0×106 、7.5×106 、8.0×106 、8.5×106 、9.0×106 、9.5×106 、1.0×107 、1.5×107 、2.0×107 、2.5×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 或9.0×107 個細胞/mL。
在某些實施例中，BEV引入時之靶VPC細胞密度為1.5-4.0 × 106 個細胞/mL。在某些實施例中，BEV引入時之靶VPC細胞密度為2.0-3.5 × 106 個細胞/mL。
在某些實施例中，以BEV對VPC之靶感染複數(MOI)將BEV引入生物反應器中。在某些實施例中，BEV MOI為0.0005-0.003或更具體而言0.001-0.002。
在某些實施例中，在特定BIIC細胞密度下自生物反應器收穫BIIC。在某些實施例中，自生物反應器收穫之BIIC具有特定BIIC細胞密度。在某些實施例中，收穫時之BIIC細胞密度為6.0-18.0 × 106 個細胞/mL、8.0-16.5 × 106 個細胞/mL、10.0-16.5 × 106 個細胞/mL。
在某些實施例中，使用BIIC (表現BIIC、酬載BIIC)來轉染病毒產生細胞(例如Sf9細胞)。在一些實施例中，使用包括桿粒(例如BEV)之桿狀病毒(表現Bac、酬載Bac)來轉染病毒產生細胞(例如Sf9細胞)。其他
在某些實施例中，表現宿主包括(但不限於)埃希氏菌(Escherichia )桿狀菌、(Bacillus )、假單胞菌(Pseudomonas )或沙門桿菌(Salmonella )屬內之細菌物種。
在某些實施例中，可使用包括穩定整合於細胞染色體內之AAV rep及cap基因之宿主細胞來產生AAV顆粒。在一非限制性實例中，可根據美國專利第7238526號中所闡述之方法及構築體使用在染色體中穩定整合至少兩個拷貝之AAV rep基因及AAV cap基因之宿主細胞來產生AAV顆粒，該專利之內容中與病毒顆粒產生相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，可在經包括允許調節稀有限制酶在宿主細胞中之表現之核酸序列之分子穩定轉變的宿主細胞中產生AAV顆粒，如US20030092161及EP1183380中所闡述，該等案件之內容中與病毒顆粒產生相關之全部內容各自以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，用以產生AAV顆粒之產生方法及細胞系可包括(但不限於)教示於以下案件中者：PCT/US1996/010245、PCT/US1997/015716、PCT/US1997/015691、PCT/US1998/019479、PCT/US1998/019463、PCT/US2000/000415、PCT/US2000/040872、PCT/US2004/016614、PCT/US2007/010055、PCT/US1999/005870、PCT/US2000/004755、美國專利申請案第US08/549489、US08/462014、US09/659203、US10/246447、US10/465302、美國專利第US6281010號、第US6270996號、第US6261551號、第US5756283號、第US6428988號、第US6274354號、第US6943019號、第US6482634號(指派至NIH：第US7238526號、第US6475769號)、第US6365394號(指派至NIH)、第US7491508號、第US7291498號、第US7022519號、第US6485966號、第US6953690號、第US6258595號、第EP2018421號、第EP1064393號、第EP1163354號、第EP835321號、第EP931158號、第EP950111號、第EP1015619號、第EP1183380號、第EP2018421號、第EP1226264號、第EP1636370號、第EP1163354號、第EP1064393號、第US20030032613號、第US20020102714號、第US20030073232號、第US20030040101號(指派至NIH)、第US20060003451號、第US20020090717號、第US20030092161號、第US20070231303號、第US20060211115號、第US20090275107號、第US2007004042號、第US20030119191號、第US20020019050號，其內容各自以全文引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。 病毒產生系統大規模產生
在某些實施例中，可改良AAV顆粒產生以增加產生規模。本發明之大規模病毒產生方法可包括以下案件中所教示之任一製程或處理步驟：美國專利第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，該等案件中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。
增加AAV顆粒產生規模之方法通常包括增加病毒產生細胞之數量。在某些實施例中，病毒產生細胞包括附著細胞。為增加藉由附著病毒產生細胞產生之AAV顆粒之規模，需要較大細胞培養表面。在某些實施例中，大規模產生方法包括使用滾瓶來增加細胞培養表面。業內已知具有增加之表面積之其他細胞培養基板。具有增加之表面積之其他附著細胞培養產物之實例包括(但不限於) iCELLis (Pall Corp, Port Washington, NY)、CELLSTACK® , CELLCUBE® (Corning Corp., Corning, NY)及NUNCTM CELL FACTORYTM (Thermo Scientific, Waltham, MA)。在某些實施例中，大規模附著細胞表面可包括約1,000 cm2 至約100,000 cm2 。
在某些實施例中，本發明之大規模病毒產生方法可包括使用懸浮細胞培養物。懸浮細胞培養物可容許顯著增加細胞數量。通常，可生長於約10-50 cm2 表面積上之一定數量之附著細胞可以約1 cm3 體積懸浮生長。
在某些實施例中，大規模細胞培養物可包括約107 至約109 個細胞、約108 至約1010 個細胞、約109 至約1012 個細胞或至少1012 個細胞。在某些實施例中，大規模培養可產生約109 至約1012 、約1010 至約1013 、約1011 至約1014 、約1012 至約1015 或至少1015 個AAV顆粒。
可根據業內已知之任何方法以大規模培養形式來轉染複製細胞。對於大規模附著細胞培養物而言，轉染方法可包括(但不限於)使用無機化合物(例如磷酸鈣)、有機化合物(例如聚乙烯亞胺(PEI))或使用非化學方法(例如電穿孔)。使用懸浮生長之細胞，轉染方法可包括(但不限於)使用無機化合物(例如磷酸鈣)、有機化合物(例如聚乙烯亞胺(PEI))或使用非化學方法(例如電穿孔)。在某些實施例中，可根據Feng, L.等人，2008. Biotechnol Appl Biochem. 50:121-32中所闡述標題為「Transfection Procedure」之部分來轉染大規模懸浮培養物，該文獻之內容以全文引用方式併入本文中。根據該等實施例，可形成PEI-DNA複合物以供引入擬轉染質體。在某些實施例中，可在轉染之前「震盪」使用PEI-DNA複合物轉染之細胞。此過程包括將細胞培養溫度降至4℃並保持約1小時之時段。在某些實施例中，可將細胞培養物震盪約10分鐘至約5小時之時段。在某些實施例中，可在約0℃至約20℃之溫度下震盪細胞培養物。
在某些實施例中，轉染可包括一或多個用於表現RNA效應分子之載體以減小核酸自一或多個酬載構築體之表現。該等方法可藉由減少浪費於表現酬載構築體上之細胞資源來增強AAV顆粒產生。在某些實施例中，可根據美國公開案第US2014/0099666號中所教示之方法來實施該等方法，該公開案之內容以全文引用方式併入本文中。生物反應器
在某些實施例中，可使用細胞培養生物反應器來大規模產生AAV顆粒。在某些實施例中，生物反應器包括攪拌罐反應器。該等反應器通常包括具有攪拌器(例如葉輪)之通常為圓柱形形狀之器皿。在某些實施例中，該等生物反應器器皿可置於水夾套內以控制器皿溫度及/或最小化來自環境溫度變化之效應。
生物反應器器皿體積之大小可在以下範圍內：約500 ml至約2 L、約1 L至約5 L、約2.5 L至約20 L、約10 L至約50 L、約25 L至約100 L、約75 L至約500 L、約250 L至約2,000 L、約1,000 L至約10,000 L、約5,000 L至約50,000 L或至少50,000 L。器皿底部可為圓形或扁平的。在某些實施例中，可將動物細胞培養物維持於具有圓形器皿底部之生物反應器中。
在某些實施例中，可經由使用熱循環器來將生物反應器器皿升溫。熱循環器會抽吸水夾套周圍之熱水。在某些實施例中，可經由存在於生物反應器器皿內之管子(例如盤管)來抽吸熱水。在某些實施例中，暖氣可循環於生物反應器周圍(包括(但不限於)培養基正上方之空氣空間)。另外，可維持pH及CO2 含量以最佳化細胞活力。
在某些實施例中，生物反應器可包括空心纖維反應器。空心纖維生物反應器可支持錨著依賴性細胞及錨著獨立性細胞二者之培養。其他生物反應器可包括(但不限於)填充床或固定床生物反應器。該等生物反應器可包括具有玻璃珠粒之器皿以供附著細胞黏附。其他填充床反應器可包括陶瓷珠粒。
在某些實施例中，經由使用可棄式生物反應器來產生病毒顆粒。在某些實施例中，生物反應器可包括GE WAVE生物反應器、GE Xcellerex生物反應器、Sartorius Biostat生物反應器、ThermoFisher Hyclone生物反應器或Pall Allegro生物反應器。
在某些實施例中，可根據以下案件中所教示之方法或系統來實施細胞生物反應器培養物中之AAV顆粒產生：美國專利第5,064,764號、第6,194,191號、第6,566,118號、第8,137,948號或美國專利申請案第US2011/0229971號，該等案件中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。病毒產生細胞 (VPC) 混合物之擴增
在某些實施例中，可在病毒產生細胞(VPC) (例如昆蟲細胞)中產生本發明之AAV顆粒或病毒載體。產生細胞可源自細胞庫(CB)且通常儲存於冷凍細胞庫中。
在某些實施例中，以冷凍形式來提供自細胞庫之病毒產生細胞。將冷凍細胞之小瓶解凍，通常直至冰晶消散為止。在某些實施例中，在介於10-50℃、15-40℃、20-30℃、25-50℃、30-45℃、35-40℃或37-39℃之間之溫度下解凍冷凍細胞。在某些實施例中，使用熱水浴解凍冷凍之病毒產生細胞。
在某些實施例中，解凍之CB細胞混合物具有1.0×104 -1.0×109 個細胞/mL之細胞密度。在某些實施例中，解凍CB細胞混合物之細胞密度為1.0×104 -2.5×104 個細胞/mL、2.5×104 -5.0×104 個細胞/mL、5.0×104 -7.5×104 個細胞/mL、7.5×104 -1.0×105 個細胞/mL、1.0×105 -2.5×105 個細胞/mL、2.5×105 -5.0×105 個細胞/mL、5.0×105 -7.5×105 個細胞/mL、7.5×105 -1.0×106 個細胞/mL、1.0×106 -2.5×106 個細胞/mL、2.5×106 -5.0×106 個細胞/mL、5.0×106 -7.5×106 個細胞/mL、7.5×106 -1.0×107 個細胞/mL、1.0×107 -2.5×107 個細胞/mL、2.5×107 -5.0×107 個細胞/mL、5.0×107 -7.5×107 個細胞/mL、7.5×107 -1.0×108 個細胞/mL、1.0×108 -2.5×108 個細胞/mL、2.5×108 -5.0×108 個細胞/mL、5.0×108 -7.5×108 個細胞/mL或7.5×108 -1.0×109 個細胞/mL。
在某些實施例中，擴增CB細胞混合物之體積。此過程通稱為種子訓練、種子擴增或CB細胞擴增。細胞/種子擴增可包括使用連續較大工作體積接種及擴增細胞混合物(經由多個擴增步驟)之連續步驟。在某些實施例中，細胞擴增可包括一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或多於7個擴增步驟。在某些實施例中，細胞擴增中之工作體積可包括下列工作體積或工作體積範圍中之一或多者：5 mL、10 mL、20 mL、5-20 mL、25 mL、30 mL、40 mL、50 mL、20-50 mL、75 mL、100 mL、125 mL、150 mL、175 mL、200 mL、50-200 mL、250 mL、300 mL、400 mL、500 mL、750 mL、1000 mL、250-1000 mL、1250 mL、1500 mL、1750 mL、2000 mL、1000-2000 mL、2250 mL、2500 mL、2750 mL、3000 mL、2000-3000 mL、3500 mL、4000 mL、4500 mL、5000 mL、3000-5000 mL、5.5 L、6.0 L、7.0 L、8.0 L、9.0 L、10.0 L及5.0-10.0 L。
在某些實施例中，可使用一定體積之來自第一擴增細胞混合物之細胞來接種第二、單獨種子訓練/種子擴增(代替使用解凍CB細胞混合物)。此過程通常稱為滾動接種。在某些實施例中，將滾動接種使用兩個或更多個(例如兩個、三個、四個或五個)單獨種子訓練/種子擴增之系列中。
在某些實施例中，大體積細胞擴增可包括使用生物反應器，例如GE WAVE生物反應器、GE Xcellerex生物反應器、Sartorius Biostat生物反應器、ThermoFisher Hyclone生物反應器或Pall Allegro生物反應器。
在某些實施例中，將工作體積內之細胞密度擴增至靶輸出細胞密度。在某些實施例中，擴增步驟之輸出細胞密度為1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、5.0×106 -1.0×107 、1.0×107 -5.0×107 、5.0×107 -1.0×108 、5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、2.0×106 、3.0×106 、4.0×106 、5.0×106 、6.0×106 、7.0×106 、8.0×106 、9.0×106 、1.0×107 、2.0×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 或9.0×107 個細胞/mL。
在某些實施例中，工作體積中之輸出細胞密度提供了用於較大、連續工作體積之接種細胞密度。在某些實施例中，擴增步驟之接種細胞密度為1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、5.0×106 -1.0×107 、1.0×107 -5.0×107 、5.0×107 -1.0×108 、5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、2.0×106 、3.0×106 、4.0×106 、5.0×106 、6.0×106 、7.0×106 、8.0×106 、9.0×106 、1.0×107 、2.0×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 或9.0×107 個細胞/mL。
在某些實施例中，細胞擴增可持續1-50天。細胞擴增步驟或總細胞擴增可持續1-10天、1-5天、1-3天、2-3天、2-4天、2-5天、2-6天、3-4天、3-5天、3-6天、3-8天、4-5天、4-6天、4-8天、5-6天或5-8天。在某些實施例中，每一細胞擴增步驟或總細胞擴增可持續1-100代、1-1000代、100-1000代、100代或更多或1000代或更多。
在某些實施例中，可以與CB細胞混合物相同之方式來擴增經感染或轉染之產生細胞，如本發明中所陳述。病毒產生細胞之感染
在某些實施例中，在病毒產生細胞(VPC) (例如昆蟲細胞)中藉由使用包括AAV表現構築體之病毒載體及/或包括AAV酬載構築體之病毒載體感染VPC來產生本發明之AAV顆粒。在某些實施例中，使用包括AAV表現構築體之表現BEV及包括AAV酬載構築體之酬載BEV來感染VPC。
在某些實施例中，藉由使用包括AAV表現構築體及AAV酬載構築體二者之病毒載體感染VPC來產生AAV顆粒。在某些實施例中，使用包括AAV表現構築體及AAV酬載構築體二者之單一BEV來感染VPC。
在某些實施例中，使用感染BIIC以包括下列步驟之感染製程來感染VPC (例如昆蟲細胞)：(i)將一系列VPC接種至產生生物反應器中；(ii)可視情況將經接種VPC擴增至靶工作體積及細胞密度；(iii)將包括表現BEV之感染BIIC及包括酬載BEV之感染BIIC注入產生生物反應器中，從而產生經感染病毒產生細胞；及(iv)培育經感染病毒產生細胞以在病毒產生細胞內產生AAV顆粒。
在某些實施例中，感染時之VPC密度為1.0×105 -2.5×105 、2.5×105 -5.0×105 、5.0×105 -7.5×105 、7.5×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、1.0×106 -2.0×106 、1.5×106 -2.5×106 、2.0×106 -3.0×106 、2.5×106 -3.5×106 、3.0×106 -3.4×106 、3.0×106 -4.0×106 、3.5×106 -4.5×106 、4.0×106 -5.0×106 、4.5×106 -5.5×106 、5.0×106 -1.0×107 、5.0×106 -6.0×106 、5.5×106 -6.5×106 、6.0×106 -7.0×106 、6.5×106 -7.5×106 、7.0×106 -8.0×106 、7.5×106 -8.5×106 、8.0×106 -9.0×106 、8.5×106 -9.5×106 、9.0×106 -1.0×107 、9.5×106 -1.5×107 、1.0×107 -5.0×107 或5.0×107 -1.0×108 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、1.5×106 、2.0×106 、2.5×106 、3.0×106 、3.1×106 、3.2×106 、3.3×106 、3.4×106 、3.5×106 、4.0×106 、4.5×106 、5.0×106 、5.5×106 、6.0×106 、6.5×106 、7.0×106 、7.5×106 、8.0×106 、8.5×106 、9.0×106 、9.5×106 、1.0×107 、1.5×107 、2.0×107 、2.5×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 或9.0×107 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為2.0-3.5 × 106 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為3.5-5.0 × 106 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為5.0-7.5 × 106 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為5.0-10.0 × 106 個細胞/mL。
在某些實施例中，感染時之VPC密度為1.0×105 -2.5×105 、2.5×105 -5.0×105 、5.0×105 -7.5×105 、7.5×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、1.0×106 -2.0×106 、1.5×106 -2.5×106 、2.0×106 -3.0×106 、2.5×106 -3.5×106 、3.0×106 -3.4×106 、3.0×106 -4.0×106 、3.5×106 -4.5×106 、4.0×106 -5.0×106 、4.5×106 -5.5×106 、5.0×106 -1.0×107 、5.0×106 -6.0×106 、5.5×106 -6.5×106 、6.0×106 -7.0×106 、6.5×106 -7.5×106 、7.0×106 -8.0×106 、7.5×106 -8.5×106 、8.0×106 -9.0×106 、8.5×106 -9.5×106 、9.0×106 -1.0×107 、9.5×106 -1.5×107 、1.0×107 -5.0×107 或5.0×107 -1.0×108 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、1.5×106 、2.0×106 、2.5×106 、3.0×106 、3.1×106 、3.2×106 、3.3×106 、3.4×106 、3.5×106 、4.0×106 、4.5×106 、5.0×106 、5.5×106 、6.0×106 、6.5×106 、7.0×106 、7.5×106 、8.0×106 、8.5×106 、9.0×106 、9.5×106 、1.0×107 、1.5×107 、2.0×107 、2.5×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 或9.0×107 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為2.0-3.5 × 106 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為3.5-5.0 × 106 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為5.0-7.5 × 106 個細胞/mL。在某些實施例中，感染時之VPC密度為5.0-10.0 × 106 個細胞/mL。
在某些實施例中，將感染BIIC與VPC以VPC對BIIC之靶比率加以組合。在某些實施例中，VPC對BIIC感染比率(體積對體積)介於1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 或5.0×106 -1.0×107 (VPC體積對BIIC體積)之間。在某些實施例中，VPC對BIIC感染比率(體積對體積)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 或約9.5×106 (VPC體積對BIIC體積)。在某些實施例中，VPC對BIIC感染比率(細胞對細胞)介於1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 或5.0×106 -1.0×107 (VPC細胞對BIIC細胞)之間。在某些實施例中，VPC對BIIC感染比率(細胞對細胞)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 或約9.5×106 (VPC細胞對BIIC細胞)。
在某些實施例中，將包括表現BEV之感染BIIC與VPC以VPC對表現BIIC之靶比率加以組合。在某些實施例中，VPC對表現BIIC感染比率(體積對體積)介於1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 或5.0×106 -1.0×107 (VPC體積對表現BIIC體積)之間。在某些實施例中，VPC對表現BIIC感染比率(體積對體積)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 或約9.5×106 (VPC體積對表現BIIC體積)。在某些實施例中，VPC對表現BIIC感染比率(細胞對細胞)介於1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 或5.0×106 -1.0×107 (VPC細胞對表現BIIC細胞)之間。在某些實施例中，VPC對表現BIIC感染比率(細胞對細胞)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 或約9.5×106 (VPC細胞對表現BIIC細胞)。
在某些實施例中，將包括酬載BEV之感染BIIC與VPC以VPC對酬載BIIC之靶比率加以組合。在某些實施例中，VPC對酬載BIIC感染比率(體積對體積)介於1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 或5.0×106 -1.0×107 (VPC體積對酬載BIIC體積)之間。在某些實施例中，VPC對酬載BIIC感染比率(體積對體積)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 或約9.5×106 (VPC體積對酬載BIIC體積)。在某些實施例中，VPC對酬載BIIC感染比率(細胞對細胞)介於1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 或5.0×106 -1.0×107 (VPC細胞對酬載BIIC細胞)之間。在某些實施例中，VPC對酬載BIIC感染比率(細胞對細胞)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 或約9.5×106 (VPC細胞對酬載BIIC細胞)。
在某些實施例中，將包括表現BEV之感染BIIC及包括酬載BEV之感染BIIC與VPC以靶表現BIIC對酬載BIIC比率加以組合。在某些實施例中，表現BIIC對酬載BIIC之比率為10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:9或1:10。在某些實施例中，表現BIIC對酬載BIIC之比率介於6.5-7.5:1、6-7:1、5.5-6.5:1、5-6:1、4.5-5.5:1、4-5:1、3.5-4.5:1、3-4:1、2.5-3.5:1、2-3:1、1.5-2.5:1、1-2:1、1-1.5:1、1:1-1.5、1:1-2、1:1.5-2.5、1:2-3、1:2.5-3.5、1:3-4、1:3.5-4.5、1:4-5、1:4.5-5.5、1:5-6、1:5.5-6.5、1:6-7或1:6.5-7.5之間。
在某些實施例中，在某一溶解氧(DO)含量(DO%)下培育經感染病毒產生細胞。在某些實施例中，在介於10%-50%、20%-40%、10%-20%、15%-25%、20%-30%、25%-35%、30%-40%、35%-45%、40%-50%、10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%或45%-50%之間之DO%下培育經感染病毒產生細胞。在某些實施例中，在約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%之DO%下培育經感染病毒產生細胞。在某些實施例中，在介於20%-30%之間或約25%之DO%下培育經感染病毒產生細胞。在某些實施例中，在介於25%-35%之間或約30%之DO%下培育經感染病毒產生細胞。在某些實施例中，在介於30%-40%之間或約35%之DO%下培育經感染病毒產生細胞。在某些實施例中，在介於35%-45%之間或約40%之DO%下培育經感染病毒產生細胞。細胞裂解
可根據業內已知之任何方法對本發明細胞(包括(但不限於)病毒產生細胞)實施細胞裂解。可實施細胞裂解以獲得一或多種存在於任何本發明細胞內之藥劑(例如病毒顆粒)。在某些實施例中，根據本發明對AAV顆粒及病毒產生細胞之批量收穫液實施細胞裂解。
在某些實施例中，可根據以下案件中所呈現之任一方法或系統來實施細胞裂解：美國專利第7,326,555號、第7,579,181號、第7,048,920號、第6,410,300號、第6,436,394號、第7,732,129號、第7,510,875號、第7,445,930號、第6,726,907號、第6,194,191號、第7,125,706號、第6,995,006號、第6,676,935號、第7,968,333號、第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，該等案件中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。
細胞裂解方法及系統可為化學或機械性的。化學細胞裂解通常包括使一或多種細胞與一或多種化學裂解劑在化學裂解條件下接觸。機械裂解通常包括藉由機械力對一或多種細胞實施細胞裂解。亦可藉由使細胞在達到約0%活力之後降解來完成裂解。
在某些實施例中，可使用化學裂解來裂解細胞。如本文中所使用，術語「化學裂解劑」係指任一可有助於破壞細胞之藥劑。在某些實施例中，將裂解劑引入溶液(稱為裂解溶液或裂解緩衝液)中。如本文中所使用，術語「化學裂解溶液」係指包括一或多種裂解劑之溶液(通常係水性)。除裂解劑外，裂解溶液亦可包括一或多種緩衝劑、增溶劑、表面活性劑、防腐劑、冷凍保護劑、酶、酶抑制劑及/或螯合劑。裂解緩衝液係包括一或多種緩衝劑之裂解溶液。裂解溶液之其他組分可包括一或多種增溶劑。如本文中所使用，術語「增溶劑」係指增強一或多種溶液組分之溶解性及/或施加溶液之一或多種實體之溶解性的化合物。在某些實施例中，增溶劑增強蛋白質溶解性。在某些實施例中，增溶劑係基於其增強蛋白質溶解性而同時維持蛋白質構形及/或活性之能力來選擇。
實例性裂解劑可包括以下美國專利中所闡述之任一者：第8,685,734號、第7,901,921號、第7,732,129號、第7,223,585號、第7,125,706號、第8,236,495號、第8,110,351號、第7,419,956號、第7,300,797號、第6,699,706號及第6,143,567號，該等專利中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。在某些實施例中，裂解劑可選自裂解鹽、兩性試劑、陽離子試劑、離子型洗滌劑及非離子型洗滌劑。裂解鹽可包括(但不限於)氯化鈉(NaCl)及氯化鉀(KCl)。其他裂解鹽可包括以下美國專利中所闡述之任一者：第8,614,101號、第7,326,555號、第7,579,181號、第7,048,920號、第6,410,300號、第6,436,394號、第7,732,129號、第7,510,875號、第7,445,930號、第6,726,907號、第6,194,191號、第7,125,706號、第6,995,006號、第6,676,935號及第7,968,333號，該等專利中之每一者以全文引用方式併入本文中。
在某些實施例中，細胞溶解劑包含胺基酸(例如精胺酸)或酸化胺基酸混合物(例如精胺酸HCl)。
在某些實施例中，細胞溶解物溶液包括穩定添加劑。在某些實施例中，穩定添加劑可包括海藻糖、甘胺酸甜菜鹼、甘露醇、檸檬酸鉀、CuCl2 、脯胺酸、木糖醇、NDSB 201、CTAB及K2 PO4 。在某些實施例中，穩定添加劑可包括胺基酸(例如精胺酸)或酸化胺基酸混合物(例如精胺酸HCl)。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.1 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.2 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.25 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.3 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.4 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.5 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.6 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.7 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.8 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括0.9 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包括1.0M精胺酸或精胺酸HCl。
可增加或降低鹽濃度以獲得用於破裂細胞膜之有效濃度。本文所提及之兩性試劑係能夠作為酸或鹼進行反應之化合物。兩性試劑可包括(但不限於)溶血磷脂醯膽鹼、3-((3-膽醯胺基丙基)二甲基銨)-1-丙烷磺酸酯(CHAPS)、ZWITTERGENT®及諸如此類。陽離子試劑可包括(但不限於)鯨蠟基三甲基溴化銨(C (16) TAB)及苯紮氯銨(Benzalkonium chloride)。包括洗滌劑之裂解劑可包括離子型洗滌劑或非離子型洗滌劑。
洗滌劑可用於斷裂或溶解細胞結構(包括(但不限於)細胞膜、細胞壁、脂質、碳水化合物、脂蛋白及醣蛋白)。實例性離子型洗滌劑包括美國專利第7,625,570號及第6,593,123號或美國公開案第US2014/0087361號中所教示之任一者，該等案件中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。在某些實施例中，裂解溶液包括一或多種離子型洗滌劑。用於裂解溶液中之離子型洗滌劑之實例包括(但不限於)十二烷基硫酸鈉(SDS)、膽酸鹽及去氧膽酸鹽。在某些實施例中，離子型洗滌劑可作為增溶劑包括於裂解溶液中。在某些實施例中，裂解溶液包括一或多種非離子型洗滌劑。用於裂解溶液中之非離子型洗滌劑可包括(但不限於)辛基葡萄糖苷、毛地黃皂苷、蘆布若爾(lubrol)、C12E8、TWEEN®-20、TWEEN®-80、Triton X-100、Triton X-114、Brij-35、Brij-58及Noniodet P-40。非離子型洗滌劑通常係較弱裂解劑，但可包括用於增溶細胞及/或病毒蛋白之增溶劑。在某些實施例中，裂解溶液包括一或多種兩性離子洗滌劑。用於裂解溶液中之兩性離子洗滌劑可包括(但不限於)：月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)；N,N-二甲基-N-十二烷基甘胺酸甜菜鹼(Empigen® BB)；丙烷磺酸3-(N,N-二甲基肉豆蔻基銨基)酯(Zwittergent® 3-10)；正十二烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸酯(Zwittergent® 3-12)；正十四烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸酯(Zwittergent® 3-14)；丙烷磺酸3-(N,N-二甲基棕櫚基銨基)酯(Zwittergent® 3-16)；3-((3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基)-1-丙烷磺酸酯(CHAPS)；及3-([3-膽醯胺基丙基]二甲基銨基)-2-羥基-1-丙烷磺酸酯(CHAPSO)。
在某些實施例中，裂解溶液包括Triton X-100 (辛基苯酚乙氧基化物) (例如0.5% w/v Triton X-100)。在某些實施例中，裂解溶液包括月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO) (例如0.184% w/v (4 x CMC) LDAO)。在某些實施例中，裂解溶液包括種子油表面活性劑(例如EcosurfTM SA-9)。在某些實施例中，裂解溶液包括N,N-二甲基-N-十二烷基甘胺酸甜菜鹼(Empigen® BB)。在某些實施例中，裂解溶液包括Zwittergent®洗滌劑，例如Zwittergent® 3-12 (正十二烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸酯)、Zwittergent® 3-14 (正十四烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸酯)或Zwittergent® 3-16 (丙烷磺酸3-(N,N-二甲基棕櫚基銨基)酯)。
其他裂解劑可包括酶及脲。在某些實施例中，一或多種裂解劑可組合於裂解溶液中以增強細胞裂解及蛋白質溶解性中之一或多者。在某些實施例中，可在裂解溶液中包括酶抑制劑以防止可由細胞膜破壞觸發之蛋白水解。
在某些實施例中，裂解溶液包括介於0.1-1.0% w/v之間、介於0.2-0.8% w/v之間、介於0.3-0.7% w/v之間、介於0.4-0.6% w/v之間或約0.5% w/v之細胞裂解劑(例如洗滌劑)。在某些實施例中，裂解溶液包括介於0.3-0.35% w/v之間、介於0.35-0.4% w/v之間、介於0.4-0.45% w/v之間、介於0.45-0.5% w/v之間、介於0.5-0.55% w/v之間、介於0.55-0.6% w/v之間、介於0.6-0.65% w/v之間或介於0.65-0.7% w/v之間之細胞裂解劑(例如洗滌劑)。
在某些實施例中，可使用一或多種核酸酶(例如全能核酸酶(Benzonase nuclease) (I級，99%純)或c-LEcta Denarase核酸酶(先前之Sartorius Denarase))處理自附著細胞培養物生成之細胞溶解物。在某些實施例中，添加核酸酶以降低由所釋放DNA產生之溶解物之黏度。
在某些實施例中，化學裂解使用單一化學裂解混合物。在某些實施例中，化學裂解使用連續添加之若干裂解劑來提供最終化學裂解混合物。
在某些實施例中，化學裂解混合物包括酸化胺基酸混合物(例如精胺酸HCl)、非離子型洗滌劑(例如Triton X-100)及核酸酶(例如全能核酸酶)。在某些實施例中，化學裂解混合物可包括酸或鹼以提供目標裂解pH。
在某些實施例中，裂解溶液包括0.5% w/v Triton X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽。在某些實施例中，裂解溶液包括0.5% w/v Triton X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽，且不含可檢測之核酸酶。在某些實施例中，裂解溶液由0.5% w/v Triton X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽組成。
在某些實施例中，化學裂解係在化學裂解條件下實施。如本文中所使用，術語「化學裂解條件」係指其中靶細胞可由化學裂解劑裂解之環境條件(例如溫度、壓力、pH等)之任一組合。
在某些實施例中，裂解pH介於3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、4.5-5.0、5.0-5.5、5.5-6.0、6.0-6.5、6.5-7.0、7.0-7.5或7.5-8.0之間。在某些實施例中，裂解pH介於6.0-7.0、6.5-7.0、6.5-7.5或7.0-7.5之間。
在某些實施例中，裂解溫度介於15-35℃之間、介於20-30℃之間、介於25-39℃之間、介於20-21℃之間、介於20-22℃之間、介於21-22℃之間、介於21-23℃之間、介於22-23℃之間、介於22-24℃之間、介於23-24℃之間、介於23-25℃之間、介於24-25℃之間、介於24-26℃之間、介於25-26℃之間、介於25-27℃之間、介於26-27℃之間、介於26-28℃之間、介於27-28℃之間、介於27-29℃之間、介於28-29℃之間、介於28-30℃之間、介於29-30℃之間、介於29-31℃之間、介於30-31℃之間、介於30-32℃之間、介於31-32℃之間或介於31-33℃之間。
在某些實施例中，裂解溶液包括0.5% w/v Triton X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽，且裂解條件包括在26℃-28℃ (例如27℃)下持續至少4小時(例如4-6小時，例如4小時)。在某些實施例中，裂解溶液包括0.5% w/v Triton X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽且不含可檢測之核酸酶，且裂解條件包括在26℃-28℃ (例如27℃)下持續至少4小時(例如4-6小時，例如4小時)。在某些實施例中，裂解溶液由0.5% w/v Triton X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽組成，且裂解條件包括在26℃-28℃ (例如27℃)下持續至少4小時(例如4-6小時，例如4小時)。
在某些實施例中，實施機械細胞裂解。機械細胞裂解方法可包括使用一或多種裂解條件及/或一或多種裂解力。如本文中所使用，術語「裂解條件」係指促進細胞破壞之狀態或環境。裂解條件可包括某些溫度、壓力、滲透純度、鹽度及諸如此類。在某些實施例中，裂解條件包括增加或降低之溫度。根據某些實施例，裂解條件包括溫度變化以促進細胞破壞。根據該等實施例實施之細胞裂解可包括冷凍-解凍裂解。如本文中所使用，術語「冷凍-解凍裂解」係指其中細胞溶液經受一或多個冷凍-解凍循環之細胞裂解。根據冷凍-解凍裂解方法，將溶液中之細胞冷凍以誘導藉由形成及擴增冰晶所引起之細胞膜之機械破壞。用於冷凍-解凍裂解方法之細胞溶液可進一步包括一或多種裂解劑、增溶劑、緩衝劑、冷凍保護劑、表面活性劑、防腐劑、酶、酶抑制劑及/或螯合劑。一旦經受冷凍之細胞溶液得以解凍，該等組分即可增強期望細胞產物之回收。在某些實施例中，一或多種冷凍保護劑包括於發生冷凍-解凍裂解之細胞溶液中。如本文中所使用，術語「冷凍保護劑」係指用於防止一或多種物質因冷凍而受損之試劑 冷凍保護劑可包括美國公開案第US2013/0323302號或美國專利第6,503,888號、第6,180,613號、第7,888,096號、第7,091,030號中所示之任一者，該等案件中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。在某些實施例中，冷凍保護劑可包括(但不限於)二甲基亞碸、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、甲醯胺、甘油、乙二醇、1,3-丙二醇及n-二甲基甲醯胺、聚乙烯基吡咯啶酮、羥乙基澱粉、瓊脂糖、右旋糖酐、肌醇、葡萄糖、羥乙基澱粉、乳糖、山梨醇、甲基葡萄糖、蔗糖及脲。在某些實施例中，可根據美國專利第7,704,721號中所闡述之任一方法來實施冷凍-解凍裂解，該專利之內容以全文引用方式併入本文中。
如本文中所使用，術語「裂解力」係指用於破壞細胞之物理活動。裂解力可包括(但不限於)機械力、音波力、重力、光學力、電力及諸如此類。藉由機械力實施之細胞裂解在本文中稱為「機械裂解」。可用於機械裂解之機械力可包括高剪切流體力。根據該等機械裂解方法，可使用微細流體均質機。微細流體均質機通常包括可施加細胞溶液之入口儲槽。然後可經由幫浦(例如高壓幫浦)以高速度及/或壓力將細胞溶液泵送至相互作用室中以產生剪切流體力。然後可將所得溶解物收集於一或多個輸出儲槽中。可調節幫浦速度及/或壓力以調節細胞裂解且增強產物(例如病毒顆粒)之回收。其他機械裂解方法可包括藉由刮擦來物理破壞細胞。
可基於擬裂解細胞之細胞培養形式來選擇細胞裂解方法。舉例而言，使用附著細胞培養物，可使用一些化學及機械裂解方法。該等機械裂解方法可包括冷凍-解凍裂解或刮擦。在另一實例中，可經由與包括表面活性劑(例如Triton-X-100)之裂解溶液一起培育來化學裂解附著細胞培養物。
在某些實施例中，可使用無裂解地收穫AAV顆粒之方法來有效且規模化地產生AAV顆粒。在一非限制性實例中，可藉由以下方式來產生AAV顆粒：在細胞培養物中培養缺乏肝素結合位點之AAV顆粒以由此容許AAV顆粒進入上清液中；自培養物收集上清液；且自上清液分離AAV顆粒，如美國專利申請案20090275107中所闡述，該申請案之內容以全文引用方式併入本文中。淨化及純化：概述
可對包括病毒顆粒之細胞溶解物實施淨化及純化。淨化通常係指在自細胞溶解物純化病毒顆粒時所採取之初始步驟，且用以製備用於藉由自本體裂解收穫物去除較大、不溶性碎屑來進一步純化之溶解物。病毒產生可在病毒產生製程中之任一點處包括淨化步驟。淨化步驟可包括(但不限於)離心及過濾。在淨化期間，可在低速度下實施離心以僅去除較大碎屑。類似地，可使用具有較大孔徑之過濾器實施過濾，從而僅去除較大碎屑。
純化通常係指在自細胞溶解物純化及濃縮病毒顆粒時所採取之最終步驟，其中自經淨化裂解收穫物去除較小碎屑以製備最終彙集藥物物質。病毒產生可在病毒產生製程中之任一點處包括純化步驟。純化步驟可包括(但不限於)過濾及層析。可使用具有較小孔徑之過濾器實施過濾以自產物去除較小碎屑，或使用較大孔徑以保留來自產物之較大碎屑。可使用過濾來改變病毒產生池或流之濃度及/或含量。可實施層析以自雜質池選擇性分離靶顆粒。
高濃度AAV調配物之大規模產生因高濃度之AAV顆粒往往發生聚集或團聚而變得複雜。小規模淨化及濃縮系統(例如透析盒或旋轉離心)通常不足以規模化地用於大規模產生。本發明提供用於處理大體積之高濃度AAV產生調配物之淨化、純化及濃縮系統之實施例。在某些實施例中，大體積淨化系統包括下列處理步驟中之一或多者：深度過濾、微過濾(例如0.2 µm過濾)、親和層析、離子交換層析(例如陰離子交換層析(AEX)或陽離子交換層析(CEX))、切向流過濾系統(TFF)、奈米過濾(例如病毒截留過濾(VRF))、最終過濾(FF)及填充過濾。
病毒淨化及純化之目標包括高通量處理細胞溶解物及最佳化最終病毒回收。包括本發明之淨化及純化步驟之優點包括可規模化處理較大體積之溶解物。在某些實施例中，可根據以下案件中所呈現之任一方法或系統來實施淨化及純化：美國專利第8,524,446號、第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號、第7,491,508號、美國公開案第US2013/0045186號、第US2011/0263027號、第US2011/0151434號、第US2003/0138772號及國際公開案第WO2002012455號、第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，該等案件中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。
在某些實施例中，可使用美國專利第US 6146874號、第US 6660514號、第US 8283151號或第US 8524446號中所闡述之方法或系統來分離或純化包括至少一種AAV顆粒之組合物，該等專利之內容以全文引用方式併入本文中。淨化及純化：離心
根據某些實施例，可藉由一或多個離心步驟來淨化細胞溶解物。可使用離心來沈澱溶解物中之不溶性顆粒。在淨化期間，離心強度(其可以重力單位(g)形式來表示且代表標準重力之倍數)可低於後續純化步驟。在某些實施例中，可針對細胞溶解物以約200 g至約800 g、約500 g至約1500 g、約1000 g至約5000 g、約1200 g至約10000 g或約8000 g至約15000 g之重力來實施離心。在某些實施例中，在8000 g下實施細胞溶解物離心15分鐘。在某些實施例中，可實施密度梯度離心以根據沉降速率來分配細胞溶解物中之微粒。用於本發明之方法或系統之梯度可包括(但不限於)氯化銫梯度及碘克沙醇(iodixanol)分級步驟梯度。在某些實施例中，離心使用傾析離心系統。在某些實施例中，離心使用疊盤式離心系統。在某些實施例中，離心包括超離心，例如兩循環CsCl梯度超離心或碘克沙醇不連續密度梯度超離心。淨化及純化：過濾
在某些實施例中，可在淨化、純化及/或滅菌期間使用一或多個微過濾、奈米過濾及/或超濾步驟。一或多個微過濾、奈米過濾或超濾步驟可包括使用諸如以下等過濾系統：EMD Millipore Express SHC XL10 0.5/0.2 µm過濾器、EMD Millipore Express SHCXL6000 0.5/0.2 µm過濾器、EMD Millipore Express SHCXL150過濾器、EMD Millipore Millipak Gamma Gold 0.22 µm過濾器(雙排型滅菌級過濾器)、Pall Supor EKV 0.2 µm滅菌級過濾器、Asahi Planova 35N、Asahi Planova 20N、Asahi Planova 75N、Asahi Planova BioEx、Millipore Viresolve NFR或Sartorius Sartopore 2XLG (0.8/0.2 µm)。
在某些實施例中，可在淨化、純化及/或滅菌期間使用一或多個微過濾步驟。微過濾利用孔徑通常介於0.1 µm與10 µm之間之微過濾膜。微過濾通常用於微粒之一般淨化、滅菌及去除。在某些實施例中，使用微過濾來去除病毒顆粒之聚集團塊。在某些實施例中，本發明之產生製程或系統包括至少一個微過濾步驟。一或多個微過濾步驟可包括使用深度過濾系統(例如EMD Millipore Millistak+ POD過濾器(D0HC中效系列)、Millipore MC0SP23CL3過濾器(C0SP中效系列)或Sartorius Sartopore過濾器系列)之深度過濾步驟。可使用熟習此項技術者已知之調配物(包括本發明之AAV醫藥、處理及儲存調配物)來預沖洗、填充、平衡、沖洗、處理、洗脫、洗滌或清洗本發明之微過濾系統。在某些實施例中，淨化包括使用C0SP中效系列過濾器。在一些實施例中，C0SP中效系列過濾器可有效減小或防止0.2微米過濾器阻塞。
在某些實施例中，可在淨化及純化期間使用一或多個超濾步驟。超濾步驟可用於濃縮、調配、去鹽或去水本發明之處理及/或調配溶液。超濾利用孔徑通常介於0.001 µm與0.1 µm之間之超濾膜。超濾膜亦可來根據其截止分子量(MWCO)且可具有1 kD至500 kD之範圍。超濾通常用於濃縮及調配所溶解生物分子(例如蛋白質、肽、質體、病毒顆粒、核酸及碳水化合物)。可使用熟習此項技術者已知之調配物(包括本發明之AAV醫藥、處理及儲存調配物)來預沖洗、填充、平衡、沖洗、處理、洗脫、洗滌或清洗本發明之超濾系統。
在某些實施例中，可在淨化及純化期間使用一或多個奈米過濾步驟。奈米過濾利用孔徑通常小於100 nm之奈米過濾膜。奈米過濾通常用於去除不期望內源性病毒雜質(例如桿狀病毒)。在某些實施例中，奈米過濾可包括病毒去除過濾(VRF)。VRF過濾器可具有通常介於15 nm與100 nm之間之過濾尺寸。VRF過濾器之實例包括(但不限於)：Planova 15N、Planova 20N及Planova 35N (Asahi-Kasei Corp, Tokyo，日本)；以及Viresolve NFP及Viresolve NFR (Millipore Corp, Billerica, MA, USA)。可使用熟習此項技術者已知之調配物(包括本發明之AAV醫藥、處理及儲存調配物)來預沖洗、填充、平衡、沖洗、處理、洗脫、洗滌或清洗本發明之奈米過濾系統。在某些實施例中，使用奈米過濾來去除病毒顆粒之聚集團塊。
在某些實施例中，可在淨化及純化期間使用一或多個切向流過濾(TFF) (亦稱為交叉流過濾)步驟。切向流過濾係一種膜過濾形式，其中進料流(其包括擬淨化及濃縮之靶藥劑/顆粒)自進料罐流入過濾模組或柱中。在TFF過濾模組內，進料流平行於膜表面移動，從而一部分流通過膜(滲透液/濾液)，而剩餘流(滯留液)則經由過濾系統再循環回且進入進料罐中。
在某些實施例中，TFF過濾模組可為平板模組(堆疊式平面盒)、螺旋纏繞模組(螺旋纏繞膜層)或空心纖維模組(膜管束)。用於本發明中之TFF系統之實例包括(但不限於)：Spectrum mPES空心纖維TFF系統(0.5 mm纖維ID，100 kDA MWCO)或具有Pellicon-3盒之Millipore Ultracel PLCTK系統(0.57 m2 , 30 kDA MWCO)。
隨著進料流循環穿過TFF過濾系統，可將新緩衝材料添加至TFF進料罐中。在某些實施例中，隨著流動流循環穿過TFF過濾系統，可完全補充緩衝材料。在此實施例中，向該流中添加與滲透液中所損失之緩衝材料等量之緩衝材料，從而產生恆定濃度。在某些實施例中，隨著流動流循環穿過過濾系統，可減少緩衝材料。在此實施例中，將少於滲透液中所損失之緩衝材料之量之緩衝材料添加至該流中，從而增加濃度。在某些實施例中，隨著流動流循環穿過過濾系統，可更換緩衝材料。在此實施例中，添加至該流中之緩衝液與滲透液中所損失之緩衝材料不同，從而最終更換該流中之緩衝材料。可使用熟習此項技術者已知之調配物(包括本發明之AAV醫藥、處理及儲存調配物)來預沖洗、填充、平衡、沖洗、處理、洗脫、洗滌或清洗本發明之TFF系統。
在某些實施例中，可在過濾之前向TFF負載池中摻加賦形劑或稀釋劑。在某些實施例中，在過濾之前向TFF負載池中摻加高鹽混合物(例如氯化鈉或氯化鉀)。在某些實施例中，在過濾之前向TFF負載池中摻加高糖混合物(例如50% w/v蔗糖)。
TFF處理之有效性可取決於若干因素，包括(但不限於)：來自流動設計之剪切應力、交叉流速率、濾液流控制、跨膜壓力(TMP)、膜條件化、膜組成(例如空心纖維構造)及設計(例如表面積)、系統流程設計、儲槽設計及混合策略。在某些實施例中，過濾膜可暴露於預TFF膜條件化。
在某些實施例中，TFF處理可包括一或多個微過濾階段。在某些實施例中，TFF處理可包括一或多個超濾階段。在某些實施例中，TFF處理可包括一或多個奈米過濾階段。
在某些實施例中，TFF處理可包括一或多個濃縮階段，例如超濾(UF)或微過濾(MF)濃縮階段。在濃縮階段中，隨著該流循環穿過過濾系統，更換減少量之緩衝材料(相對於滲透液中所損失之緩衝材料量)。並不完全更換滲透液中所損失之所有緩衝材料使得過濾流內之病毒顆粒之濃度有所增加。在某些實施例中，隨著該流循環穿過過濾系統，更換增加量之緩衝材料。相對於滲透液中所損失之緩衝材料量納入過量緩衝材料使得過濾流內之病毒顆粒之濃度有所降低。
在某些實施例中，TFF處理可包括一或多個滲濾(DF)階段。滲濾階段包括使用第二緩衝材料(例如低鹽或零鹽材料)更換第一緩衝材料(例如高鹽材料)。在此實施例中，向流動流中添加不同於滲透液中所損失之第一緩衝材料之第二緩衝液，從而最終更換該流中之緩衝材料。
在某些實施例中，TFF處理可包括多個串聯階段。在某些實施例中，TFF處理製程可包括超濾(UF)濃縮階段且隨後包括滲濾階段(DF)。在某些實施例中，相對於包括DF且隨後包括UF之TFF，包括UF且隨後包括DF之TFF可增加rAAV回收。
在某些實施例中，TFF處理可包括滲濾階段，隨後超濾濃縮階段。在某些實施例中，TFF處理可包括第一滲濾階段，隨後超濾濃縮階段，隨後第二滲濾階段。在某些實施例中，TFF處理可包括在流動流中納入高鹽-低糖緩衝物質之第一滲濾階段，隨後在流動流中產生高濃度之病毒物質之超濾/濃縮階段，隨後在流動流中納入低鹽-高糖或零鹽-高糖緩衝物質之第二滲濾階段。在某些實施例中，鹽可為氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀或其組合。在某些實施例中，糖可為蔗糖，例如5% w/v蔗糖混合物或7% w/v蔗糖混合物。
在某些實施例中，一或多個TFF步驟可包括調配物滲濾步驟，其中使用高蔗糖調配緩衝液代替病毒產生池之至少一部分液體介質。在某些實施例中，高蔗糖調配緩衝液包括介於6-8% w/v之間之糖或代糖品及介於90-100 mM之間之鹼性氯鹽。在某些實施例中，高蔗糖調配緩衝液包括7% w/v之蔗糖及介於90-100 mM之間之氯化鈉。在某些實施例中，高蔗糖調配緩衝液包括7% w/v蔗糖、10 mM磷酸鈉、介於95-100 mM之間之氯化鈉，及0.001% (w/v) Poloxamer 188。在某些實施例中，調配物滲濾步驟係一或多個TFF步驟中之最終滲濾步驟。在某些實施例中，調配物滲濾步驟係一或多個TFF步驟中之唯一滲濾步驟。
在某些實施例中，TFF處理可包括多個同時發生之階段。作為一個非限制性實例，TFF淨化製程可包括與濃縮階段同時發生之超濾階段。
細胞溶解物藉由過濾淨化及純化之方法在業內已充分理解且可根據各種可用方法(包括(但不限於)被動過濾及流動過濾)來實施。所用過濾器可包括各種材料及孔徑。舉例而言，細胞溶解物過濾器可包括約1 µM至約5 µM、約0.5 µM至約2 µM、約0.1 µM至約1 µM、約0.05 µM至約0.05 µM、及約0.001 µM至約0.1 µM之孔徑。細胞溶解物過濾器之實例性孔徑可包括(但不限於) 2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001及0.001 µM。在某些實施例中，淨化可包括經由2.0 µM孔徑過濾器過濾以去除大碎屑，隨後通過0.45 µM孔徑過濾器以去除完整細胞。
過濾材料可由各種材料構成。該等材料可包括(但不限於)聚合材料及金屬材料(例如燒結金屬及有孔鋁)。實例性材料可包括(但不限於)耐綸(nylon)、纖維素材料(例如乙酸纖維素)、聚二氟亞乙烯(PVDF)、聚醚碸、聚醯胺、聚碸、聚丙烯及聚對苯二甲酸乙二酯。在某些實施例中，可用於淨化細胞溶解物之過濾器可包括(但不限於) ULTIPLEAT PROFILE™過濾器(Pall Corporation, Washington, NY)、SUPOR™膜過濾器(Pall Corporation, Washington, NY)。
在某些實施例中，可實施流動過濾以增加過濾速度及/或有效性。在某些實施例中，流動過濾可包括真空過濾。根據該等方法，在過濾器中與擬過濾細胞溶解物相對之一側產生真空。在某些實施例中，可藉由離心力使細胞溶解物通過過濾器。在某些實施例中，使用幫浦來迫使細胞溶解物穿過淨化過濾器。可藉由調節通道大小及/或流體壓力中之一者來調節細胞溶解物穿過一或多個過濾器之流速。淨化及純化 ： 層析
在某些實施例中，可經由一或多個層析步驟使用一或多種不同層析方法自細胞溶解物來淨化及純化調配物中之AAV顆粒。層析係指業內已知用於自混合物選擇性分離出一或多種要素之任一數量之方法。該等方法可包括(但不限於)離子交換層析(例如陽離子交換層析及陰離子交換層析)、親和層析(例如免疫親和層析、金屬親和層析、假親和層析(例如Blue Sepharose樹脂))、疏水性相互作用層析(HIC)、粒徑篩析層析及多元層析(MMC) (利用固定相與分析物之間之一種以上形式之相互作用之層析方法)。在某些實施例中，病毒層析之方法或系統可包括以下案件中所教示之任一者：美國專利第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，該等案件中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。
可使用熟習此項技術者已知之調配物(包括本發明之AAV醫藥、處理及儲存調配物)來預沖洗、填充、平衡、沖洗、處理、洗脫、洗滌或清洗本發明之層析系統。
在某些實施例中，可使用一或多個離子交換(IEX)層析步驟來分離病毒顆粒。離子交換步驟可包括陰離子交換(AEX)層析、陽離子交換(CEX)層析或其組合。在某些實施例中，離子交換層析係以結合/洗脫模式來使用。可藉由使病毒顆粒基於病毒顆粒之衣殼蛋白(或其他帶電組分)與存在於固定相上之帶電位點之間的電荷-電荷相互作用結合至固定相來使用結合/洗脫IEX。此製程可包括使用通過病毒製劑(例如經淨化溶解物)之管柱。在將病毒製劑施加至帶電固定相(例如管柱)中之後，然後可藉由施加洗脫溶液以破壞電荷-電荷相互作用自固定相洗脫結合之病毒顆粒。可藉由調節鹽濃度及/或pH來最佳化洗脫溶液以增強結合之病毒顆粒之回收。在某些實施例中，洗脫溶液可包括核酸酶(例如全能核酸酶)。端視所分離病毒衣殼之電荷，可選擇陽離子或陰離子交換層析方法。在某些實施例中，離子交換層析係以流經模式來使用。可藉由以下方式來使用流經IEX：使非病毒雜質或不期望病毒顆粒結合至固定相(基於電荷-電荷相互作用)，且使病毒製劑中之靶病毒顆粒「流經」 IEX系統而進入收集池中。
離子交換層析之方法或系統可包括(但不限於)美國專利第7,419,817號、第6,143,548號、第7,094,604號、第6,593,123號、第7,015,026號及第8,137,948號中所教示之任一者，該等專利中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。
在某些實施例中，IEX製程使用AEX層析系統，例如Sartorius Sartobind Q膜、Sartorius Sartobind STIC膜、Millipore Fractogel TMAE HiCap(m)流經膜、GE Q Sepharose HP膜、Poros XQ或Poros HQ。在某些實施例中，IEX製程使用CEX系統(例如Poros XS膜)。在某些實施例中，AEX系統包括含有三甲基銨乙基(TMAE)官能基之固定相。在某些實施例中，IEX製程使用多元層析(MMC)系統(例如Nuvia Prime 4A膜)。
在某些實施例中，可使用一或多個親和層析步驟(例如免疫親和層析)來分離病毒顆粒。免疫親和層析係利用一或多種免疫化合物(例如抗體或抗體相關結構)來保留病毒顆粒之一種層析形式。免疫化合物可特異性結合至病毒顆粒表面上之一或多種結構(包括(但不限於)一或多種病毒外殼蛋白)。在某些實施例中，免疫化合物可對特定病毒變體具有特異性。在某些實施例中，免疫化合物可結合至多種病毒變體。在某些實施例中，免疫化合物可包括重組單鏈抗體。該等重組單鏈抗體可包括闡述於Smith, R.H.等人，2009. Mol. Ther. 17(11):1888-96中者，該文獻之內容以全文引用方式併入本文中。該等免疫化合物(例如重組蛋白配體)能夠結合至若干AAV衣殼變體(包括(但不限於) AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6及/或AAV8或本文所教示之任一者)。在一些實施例中，該等免疫化合物(例如重組蛋白配體)能夠至少結合至AAV2。在某些實施例中，AFC製程使用GE AVB Sepharose HP管柱樹脂、Poros CaptureSelect AAV8樹脂(ThermoFisher)、Poros CaptureSelect AAV9樹脂(ThermoFisher)及Poros CaptureSelect AAVX樹脂(ThermoFisher)。
在某些實施例中，一或多個親和層析步驟先於一或多個陰離子交換層析步驟。在某些實施例中，一或多個陰離子交換層析步驟先於一或多個親和層析步驟。
在某些實施例中，可使用一或多個粒徑篩析層析(SEC)步驟來分離病毒顆粒。SEC可包括使用凝膠來根據大小分離顆粒。在病毒顆粒純化中，SEC過濾有時稱為「精煉」。在某些實施例中，可實施SEC以生成接近均質之最終產物。該等最終產物可在某些實施例中用於臨床前研究及/或臨床研究中(Kotin, R.M. 2011. Human Molecular Genetics. 20(1):R2-R6，其內容以全文引用方式併入本文中)。在某些實施例中，可根據美國專利第6,143,548號、第7,015,026號、第8,476,418號、第6,410,300號、第8,476,418號、第7,419,817號、第7,094,604號、第6,593,123號及第8,137,948中所教示之任一方法來實施SEC，該等專利中之每一者之內容以全文引用方式併入本文中。 III.定義
在本發明中之各個位置處，於群或範圍中揭示本發明化合物之取代基或性質。本發明明確地意欲包括該等群及範圍之成員之每一個別者或子組合。
除非另外陳述，否則下列術語及片語具有下述含義。該等定義並不意欲具有限制性且用於更清晰地理解本發明之某些態樣。
腺相關病毒 ：本文所用之術語「腺相關病毒」或「AAV」係指依賴病毒屬中包括任一顆粒、序列、基因、蛋白質或自其衍生之組分之成員。
AAV 顆粒 ：如本文中所使用，「AAV顆粒」係包括衣殼及具有至少一個酬載區及至少一個ITR區之病毒基因體之病毒。AAV顆粒可衍生自本文所闡述或業內已知之任一血清型(包括血清型組合，亦即「假型」 AAV)或衍生自各種基因體(例如單鏈或自我互補性)。另外，AAV顆粒可為複製缺陷性及/或靶向性。
活性 ： 如本文中所使用，術語「活性」係指事情正發生或進行之狀態。本發明組合物可具有活性且此活性可涉及一或多種生物事件。
投與 ： 如本文中所使用，術語「投與」係指向受試者提供醫藥藥劑或組合物。
改善 ：如本文中所使用，術語「改善(amelioration或ameliorating)」係指減弱病狀或疾病之至少一種指徵之嚴重程度。舉例而言，在神經退化病症之背景中，改善包括減小神經元損失。
動物 ： 如本文中所使用，術語「動物」係指動物界之任一成員。在某些實施例中，「動物」係指處於任一發育階段之人類。在某些實施例中，「動物」係指處於任一發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物係哺乳動物(例如齧齒類動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。在某些實施例中，動物包括(但不限於)哺乳動物、鳥、爬行動物、兩棲動物、魚及蠕蟲。在某些實施例中，動物係轉基因動物、基因改造動物或純系。
反義鏈 ： 如本文中所使用，術語siRNA分子之「反義鏈」或「第一鏈」或「引導鏈」係指與沉默靶向基因之mRNA中具有約10-50個核苷酸(例如約15-30、16-25、18-23或19-22個核苷酸)之區段實質上互補的鏈。反義鏈或第一鏈具有與期望靶mRNA序列足夠互補以引導靶特異性沉默(例如足以觸發藉由RNAi機制或過程來破壞期望靶mRNA之互補性)之序列。
大約 ： 如本文中所使用，應用於一或多個所關注值之術語「大約」或「約」係指某一值類似於所陳述參考值。該術語可係指所列舉值之+/- 10%。在某些實施例中，除非另外陳述或另外自上下文明顯可見，否則該術語係指在任一方向上(大於或小於)落於所陳述參照值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內之值範圍(該數值將超過可能值之100%之情形除外)。
與…… 締合 ： 如本文中所使用，術語「與……締合」、「偶聯」、「連接」、「附接」及「結合」在用於兩個或更多個部分時意指，該等部分直接或經由一或多個用作連接劑之其他部分彼此物理締合或連結以形成足夠穩定之結構，從而該等部分在使用該結構之條件(例如生理學條件)下保留物理締合。「締合」未必嚴格地經由直接共價化學鍵結。其亦可指示足夠穩定以便「締合」實體保持物理締合之離子型或氫鍵結或基於雜交之連結性。
桿狀病毒表現載體(BEV) ：如本文中所使用，BEV係桿狀病毒表現載體，亦即桿狀病毒來源之多核苷酸載體。桿狀病毒表現載體(BEV)係已經基因修飾以表現外來基因之重組桿狀病毒。使用BEV之系統稱為桿狀病毒表現載體系統(BEVS)。
mBEV 或經修飾BEV ：如本文中所使用，經修飾BEV係已藉由添加及/或缺失及/或複製及/或倒轉以下中之一或多者而自起始BEV (不論野生型抑或人工)發生改變之桿狀病毒來源之表現載體：基因、基因片段、裂解位點、限制位點、序列區、編碼所關注酬載或基因之序列或前述各項之組合。
BIIC ：如本文中所使用，BIIC係桿狀病毒感染之昆蟲細胞。
生物活性 ：如本文中所使用，片語「生物活性」係指在生物系統及/或生物體中具有活性之任一物質之特性。舉例而言，在投與生物體時對生物體具有生物效應之物質可視為具有生物活性。在特定實施例中，若即使所編碼酬載之一部分亦具有生物活性或模擬視為生物相關之活性，則本發明之AAV顆粒可視為具有生物活性。
衣殼 ：如本文中所使用，術語「衣殼」係指病毒顆粒之蛋白質殼體。
密碼子最佳化 ：如本文中所使用，術語「密碼子最佳化(codon optimized或codon optimization)」係指如下經修飾核酸序列：其與親代/參考序列編碼相同胺基酸序列，但已發生改變，從而最佳化或改良經修飾核酸序列之密碼子以表現於特定系統(例如特定物種或物種群組)中。作為一非限制性實例，可將包括AAV衣殼蛋白之核酸序列密碼子最佳化以表現於昆蟲細胞或特定昆蟲細胞(例如草地貪夜蛾細胞)中。可使用熟習此項技術者已知之方法及資料庫來完成密碼子最佳化。
互補及實質上互補 ： 如本文中所使用，術語「互補」係指多核苷酸能夠彼此形成鹼基對。鹼基對通常係藉由反向平行之多核苷酸鏈中之核苷酸單元之間的氫鍵來形成。互補多核苷酸鏈可以沃森-克裡克方式(Watson-Crick manner) (例如A與T、A與U、C與G)或以容許形成雙螺旋體之任一其他方式來形成鹼基對。如熟習此項技術者所知曉，在使用RNA (而非DNA)時，尿嘧啶(而非胸腺嘧啶)係可視為與腺苷互補之鹼基。然而，在本發明背景中指示U時，除非另外陳述，否則亦暗示取代T之能力。完全互補性或100%互補性係指一條多核苷酸鏈之每一核苷酸單元可與第二多核苷酸鏈之核苷酸單元形成氫鍵之情況。小於完全互補性係指兩條鏈之一些(但非所有)核苷酸單元可彼此形成氫鍵之情況。舉例而言，對於兩個20聚體而言，若每一鏈上之僅兩個鹼基對可彼此形成氫鍵，則多核苷酸鏈展現10%之互補性。在相同實例中，若每一鏈上之18個鹼基對可彼此形成氫鍵，則多核苷酸鏈展現90%之互補性。
化合物 ： 本發明化合物包括出現於中間體或最終化合物中之原子之所有同位素。「同位素」係指具有相同原子數但質量數因細胞核中之種子數不同而有所不同之原子。舉例而言，氫同位素包括氚及氘。
可組合使用用以形成溶劑合物及水合物之溶劑或水分子藉由常規方法來製備本發明之化合物及鹽。
保守 ：如本文中所使用，術語「保守」係指多核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基分別出現於所比較兩個或更多個序列之相同位置中而不改變。相對保守之核苷酸或胺基酸在相關序列中之保守性大於出現於序列其他處之核苷酸或胺基酸。
在某些實施例中，若兩個或更多個序列彼此100%一致，則其可視為「完全保守」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列彼此至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則其可視為「高度保守」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列彼此約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%、約98%或約99%一致，則其可視為「高度保守」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列彼此至少30%一致、至少40%一致、至少50%一致、至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則其可視為「保守」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列彼此約30%一致、約40%一致、約50%一致、約60%一致、約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致或約99%一致，則其可視為「保守」。序列保守性可適用於多核苷酸或多肽之整個長度或可適用於其部分、區域或特徵。
控制元件 ： 如本文中所使用，「控制元件」、「調節性控制元件」或「調節序列」係指使編碼序列複製、轉錄及轉譯於接受細胞中之啟動子區、多聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調節結構域、複製起點、內部核糖體進入位點(「IRES」)、增強子及諸如此類。並非所有該等控制元件總是需要存在，只要所選編碼序列能夠複製、轉錄及/或轉譯於適當宿主細胞中即可。
遞送 ： 如本文中所使用，「遞送」係指遞送AAV顆粒、化合物、物質、實體、部分、負荷或酬載之動作或方式。
遞送劑 ：如本文中所使用，「遞送劑」係指至少部分地有利於將AAV顆粒活體內遞送至靶向細胞中之任一物質。
去穩定 ： 如本文中所使用，術語「去穩定」或「去穩定區」意指某一區域或分子之穩定性小於相同區域或分子之起始、野生型或天然形式。
消解 ：如本文中所使用，術語「消解」意指分裂成較小片段或組分。在提及多肽或蛋白質時，消解會產生肽。
投藥方案 ：如本文中所使用，「投藥方案」係投與時間表或醫師所確定之治療、防治或姑息性護理方案。
囊封 ： 如本文中所使用，術語「囊封」意指包封、包圍或包殼。
改造 ： 如本文中所使用，在本發明實施例經設計以具有不同於起點、野生型或天然分子之特徵或性質(不論在結構抑或化學上)時，其「經改造」。
有效量 ： 如本文中所使用，術語藥劑之「有效量」係足以實現有益或期望結果(例如臨床結果)之量，且因此「有效量」取決於施加背景。舉例而言，在投與治療癌症之藥劑之背景中，藥劑之有效量係(例如)與在不投與該藥劑下所獲得之反應相比足以治療(如本文所定義)癌症之量。
表現 ：如本文中所使用，核酸序列之「表現」係指下列事件中之一或多者：(1)自DNA序列產生RNA模板(例如藉由轉錄)；(2)處理RNA轉錄物(例如藉由剪接、編輯、5′帽形成及/或3′端處理)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及(4)轉譯後修飾多肽或蛋白質。
表現Bac ：如本文中所使用，「表現Bac」或「rep/cap bac」係指包括腺相關病毒(AAV)病毒表現構築體及/或區域之桿狀病毒。在一些實施例中，表現Bac之病毒表現構築體包括一或多種編碼AAV (例如(但不限於) AAV2)之衣殼及/或複製基因之多核苷酸。舉例而言，一或多種編碼AAV之衣殼及/或複製基因之多核苷酸可編碼VP1、VP2、VP3、Rep52及/或Rep78，且該等多核苷酸可存在於一或多個開放閱讀框(例如兩個開放閱讀框)中之構築體中。
表現BIIC ：如本文中所使用，「表現BIIC」或「rep/cap BIIC」係指包括一或多種桿狀病毒(例如表現Bac)之昆蟲細胞，該等桿狀病毒包括含有病毒表現構築體之桿粒。在一些實施例中，表現構築體包括一或多種編碼AAV (例如(但不限於) AAV2)之衣殼及/或複製基因之多核苷酸。舉例而言，一或多種編碼AAV之衣殼及/或複製基因之多核苷酸可編碼VP1、VP2、VP3、Rep52及/或Rep78，且該等多核苷酸可存在於一或多個開放閱讀框(例如兩個開放閱讀框)中之構築體中。在一些實施例中，昆蟲細胞係Sf9細胞。
特徵 ： 如本文中所使用，「特徵」係指特性、性質或獨特要素。
調配物 ：如本文中所使用，「調配物」包括至少一種AAV顆粒及遞送劑或賦形劑。
片段 ： 本文所用之「片段」係指部分。舉例而言，蛋白質片段可包括藉由消解自經培養細胞分離之全長蛋白所獲得之多肽。
功能 ：如本文中所使用，「功能」生物分子係呈展現特徵性性質及/或活性之形式之生物分子。
基因表現 ：術語「基因表現」係指核酸序列發生成功轉錄及(在大部分情況下)轉譯以產生蛋白質或肽之過程。為清楚起見，在提及量測「基因表現」時，此應理解為意指，量測可為核酸轉錄產物(例如RNA或mRNA)或胺基酸轉譯產物(例如多肽或肽)之量測。量測RNA、mRNA、多肽及肽之量或含量之方法在業內已眾所周知。
同源性 ：如本文中所使用，術語「同源性」係指聚合分子之間(例如多核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間)之整體相關性。在某些實施例中，若聚合分子之序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致或類似，則其可視為彼此「同源」。術語「同源」必定係指至少兩個序列(多核苷酸或多肽序列)之間之對比。根據本發明，若兩個多核苷酸序列所編碼之多肽於至少一段至少約20個胺基酸至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%一致，則其可視為同源。在某些實施例中，同源多核苷酸序列之特徵在於能夠編碼一段至少4至5個獨異特定胺基酸。對於長度小於60個核苷酸之多核苷酸序列而言，同源性取決於編碼一段至少4至5個獨異特定胺基酸之能力。根據本發明，若兩種蛋白質於至少一段至少約20個胺基酸至少約50%、60%、70%、80%或90%一致，則該等蛋白質序列可視為同源。
一致性 ：如本文中所使用，術語「一致性」係指聚合分子之間(例如多核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間)之整體相關性。舉例而言，可藉由出於最佳對比目的(舉例而言，可將空位引入第一及第二核酸序列中之一者或兩者中以達成最佳比對且出於對比目的可忽視非一致序列)比對兩個序列來計算兩個多核苷酸序列之一致性百分比。在某些實施例中，出於對比目的比對之序列之長度係參考序列之長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。然後比較相應核苷酸位置處之核苷酸。在第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置相同之核苷酸佔據時，則該等分子在該位置處一致。兩個序列之間之一致性%隨該等序列共有之一致位置數而變化，其中考慮到為達成兩個序列之最佳比對而需要引入之空位數及每一空位之長度。兩個序列之間之序列對比及同源性%之測定可使用數學演算法來達成。舉例而言，可使用諸如以下文獻中所闡述之方法等方法來測定兩個核苷酸序列之間之一致性百分比：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.,編輯，Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編輯，Academic Press, New York, 1993；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編輯，Humana Press, New Jersey, 1994；及Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J.編輯，M Stockton Press, New York, 1991；該等文獻之內容各自以全文引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。舉例而言，可使用已納入比對程式(2.0版)中之Meyers及Miller演算法(CABIOS, 1989, 4:11-17)來測定兩個核苷酸序列之間之一致性百分比，其中使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4。或者，可使用GCG軟體包中之GAP程式且使用NWSgapdna.CMP矩陣來測定兩個核苷酸序列之間之一致性百分比。通常用於測定序列之間之一致性百分比之方法包括(但不限於) Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)中所揭示者；該文獻之內容各自以全文引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。將測定一致性之技術編成可公開獲得之電腦程式。用以測定兩個序列之間之同源性之實例性電腦軟體包括(但不限於) GCG程式包(Devereux, J.等人，Nucleic Acids Research , 12(1), 387 (1984))、BLASTP、BLASTN及FASTA (Altschul, S. F.等人，J. Molec. Biol. , 215, 403 (1990))
抑制基因表現 ： 如本文中所使用，片語「抑制基因表現」意指減小基因表現產物之量。表現產物可為自基因轉錄之RNA (例如mRNA)或自轉錄自基因之mRNA轉譯之多肽。通常，減小mRNA含量可減小自其轉譯之多肽之含量。可使用用於量測mRNA或蛋白質之標準技術來測定表現含量。
活體外 ：如本文中所使用，術語「活體外」係指事件發生於人工環境(例如測試管或反應器皿中、細胞培養物中、培養皿中等等)而非發生於生物體(例如動物、植物或微生物)內。
活體內 ：如本文中所使用，術語「活體內」係指事件發生於生物體(例如動物、植物或微生物或其細胞或組織)內。
分離 ：如本文中所使用，術語「分離」係指物質或實體已與至少一些與其締合之組分分離(不論在自然界中抑或在實驗環境中)。經分離物質可具有不同於其締合物質之純度值。經分離物質及/或實體可與至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或更多其最初締合之其他組分分離。在某些實施例中，經分離藥劑大於約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%純。如本文中所使用，若某一物質實質上不含其他組分，則該物質係「純的」。如本文中所使用，術語「實質上分離」意指，物質與形成或檢測其之環境實質上分離。部分分離可包括(例如)富集本發明之物質或AAV顆粒之組合物。實質性分離可包括含有至少約50重量%、至少約60重量%、至少約70重量%、至少約80重量%、至少約90重量%、至少約95重量%、至少約97重量%或至少約99重量%之本發明化合物或其鹽之組合物。分離化合物及其鹽之方法係業內之常規方法。
連接體 ： 本文所用之「連接體」係指連結兩個分子之分子或分子群。連接體可為連結兩個編碼兩種不同多肽之核酸序列之核酸序列。連接體可或可不發生轉譯。連接體可為可裂解連接體。
微RNA (miRNA) 結合位點 ： 如本文中所使用，微RNA (miRNA)結合位點代表至少miRNA之「種子」區所結合之核酸轉錄物之核苷酸位置或區域。
修飾 ： 本文所用之「修飾」係指本發明分子之改變之狀態或結構。可以許多方式(包括以化學方式、以結構方式及以功能方式)來修飾分子。如本文中所使用，在本發明實施例具有或擁有不同於起始點、野生型或天然分子特徵或性質(不論在結構抑或化學上)時，其「經修飾」。
突變 ：如本文中所使用，術語「突變」係指基因結構之任何變化，其會產生可傳遞至後代之變體(亦稱為「突變體」)形式。可藉由改變DNA中之單一鹼基或缺失、插入或重排基因或染色體之較大區段來引起基因突變。
天然 ： 如本文中所使用，「天然」或「野生型」意指在無人工幫助或人為干預下存在於自然界中。
非人類動物 ： 如本文中所使用，「非人類動物」包括除智人外之所有動物( 例如非人類脊椎動物)，包括野生及家養物種。非人類脊椎動物之實例包括(但不限於)哺乳動物，例如羊駝、白臀野牛、美洲野牛、駱駝、貓、牛、鹿、狗、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、馬、美洲駝、騾子、豬、兔、馴鹿、綿羊、水牛及犛牛。非人類動物包含非人類靈長類動物。
核酸 ： 如本文中所使用，術語「核酸」、「多核苷酸」及「寡核苷酸」係指由多去氧核糖核苷酸(含有2-去氧-D-核糖)或多核糖核苷酸(含有D-核糖)或任一其他類型之係嘌呤或嘧啶鹼基或經修飾嘌呤或嘧啶鹼基之N醣苷之多核苷酸構成的任何核酸聚合物。術語「核酸」、「多核苷酸」及「寡核苷酸」之間並無預期長度區別，且該等術語可互換使用。該等術語僅係指分子之一級結構。因此，該等術語包括雙鏈及單鏈DNA以及雙鏈及單鏈RNA。
開放閱讀框 ： 如本文中所使用，「開放閱讀框」或「ORF」係指除在閱讀框末端外不含既定閱讀框內之終止密碼子之序列。
可操作地連接 ： 如本文中所使用，片語「可操作地連接」係指兩個或更多個分子、構築體、轉錄物、實體、部分或諸如此類之間之功能連結。作為一非限制性實例，在啟動子序列控制及/或調節核苷酸序列之轉錄時，啟動子「可操作地連接」至核苷酸序列。
酬載： 如本文中所使用，「酬載」或「酬載區」係指一或多個由病毒基因體編碼或編碼於其內之多核苷酸或多核苷酸區域或該多核苷酸或多核苷酸區域之表現產物(例如轉基因、編碼多肽或多-多肽之多核苷酸或調節性核酸或調節性核酸)。
酬載Bac ：如本文中所使用，「酬載Bac」係指包括酬載構築體及/或區域之桿狀病毒。在一些實施例中，酬載Bac之酬載構築體及/或區域包括編碼酬載之多核苷酸。
酬載BIIC ：如本文中所使用，「酬載BIIC」係指包括一或多種包括酬載構築體及/或區域之桿狀病毒(例如酬載Bac)之昆蟲細胞。在一些實施例中，酬載構築體及/或區域包括編碼酬載之多核苷酸。在一些實施例中，昆蟲細胞係Sf9細胞。
酬載構築體 ：如本文中所使用，「酬載構築體」係一或多個包括編碼或包括酬載之多核苷酸區域之載體構築體，該酬載在一側或兩側側接有倒轉末端重複(ITR)序列。酬載構築體可存在於在病毒產生細胞中發生複製以產生治療性病毒基因體之模板中。
酬載構築體載體 ：如本文中所使用，「酬載構築體載體」係編碼或包括酬載構築體及用於在細菌細胞中複製及表現酬載構築體之調節區之載體。
酬載構築體表現載體 ：如本文中所使用，「酬載構築體表現載體」係編碼或包括酬載構築體且進一步包括一或多個編碼或包括用於病毒複製細胞中之病毒表現之組分之多核苷酸區域的載體。
醫藥上可接受 ：本文所用之片語「醫藥上可接受」係指彼等在合理醫學判斷範圍內適於與人類及動物之組織接觸使用而無過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症且與合理益處/風險比相稱之化合物、材料、組合物及/或劑型。
醫藥上可接受之賦形劑 ： 本文所用之片語「醫藥上可接受之賦形劑」係指除本文所闡述化合物外之任一成分(例如能夠懸浮或溶解活性化合物之媒劑)，其在患者中具有實質上無毒及非發炎性之性質。賦形劑可包括(例如)：抗黏著劑、抗氧化劑、黏合劑、塗覆劑、壓縮助劑、崩解劑、染料(染色劑)、軟化劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、膜形成劑或塗覆劑、矯味劑、芳香劑、助流劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、吸收劑、懸浮劑或分散劑、甜味劑及水合水。實例性賦形劑包括(但不限於)：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸氫鈣、硬脂酸鈣、交聯羧甲基纖維素、交聯聚乙烯基吡咯啶酮、檸檬酸、交聚維酮(crospovidone)、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚維酮(povidone)、預膠凝澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、棕櫚酸視黃基酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、山梨醇、玉米澱粉、硬脂酸、蔗糖、滑石粉、二氧化鈦、維他命A、維他命E、維他命C及木糖醇。
醫藥上可接受之鹽 ：本發明亦包括本文所闡述化合物之醫藥上可接受之鹽。如本文中所使用，「醫藥上可接受之鹽」係指所揭示化合物之衍生物，其中藉由將現有酸或鹼部分轉化成其鹽形式(例如藉由使游離鹼基團與適宜有機酸進行反應)來改質母體化合物。醫藥上可接受之鹽之實例包含(但不限於)鹼性殘基(例如胺)之無機酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基(例如羧酸)之鹼金屬鹽或有機鹽；及諸如此類。代表性酸加成鹽包括乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天門冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚糖酸鹽、已酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖醛酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及諸如此類。代表性鹼及鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及諸如此類；以及無毒銨、四級銨及胺陽離子，包括(但不限於)銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及諸如此類。本發明之醫藥上可接受之鹽包括自(例如)無毒無機或有機酸形成之母體化合物之習用無毒鹽。本發明之醫藥上可接受之鹽可藉由習用化學方法自含有鹼性或酸性部分之母體化合物來合成。通常，該等鹽可藉由在水或有機溶劑或二者之混合物中使該等化合物之游離酸或鹼形式與化學計量量之適當鹼或酸進行反應來製備；通常，可使用非水性介質，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。適宜鹽之清單可參見Remington’s Pharmaceutical Sciences ，第17版，Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418；Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use , P.H. Stahl及C.G. Wermuth (編輯), Wiley-VCH, 2008；及Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science , 66, 1-19 (1977)，其內容各自以全文引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
醫藥上可接受之溶劑合物 ：本文所用之術語「醫藥上可接受之溶劑合物」意指其中將適宜溶劑分子納入晶格中之本發明化合物。適宜溶劑在投與劑量下生理上耐受。舉例而言，可藉由自包括有機溶劑、水或其混合物之溶液結晶、重結晶或沈澱來製備溶劑合物。適宜溶劑之實例係乙醇、水(例如單-、二-及三水合物)、N -甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲基亞碸(DMSO)、N ,N’ -二甲基甲醯胺(DMF)、N ,N’ -二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄基醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苄基酯及諸如此類。在水係溶劑時，溶劑合物稱為「水合物」。
多肽 ： 如本文中所使用，「多肽」係指最通常藉由肽鍵連接至一起之胺基酸殘基(天然或非天然)之聚合物。本文所用之該術語係指具有任一大小、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。在一些情況下，所編碼多肽小於約50個胺基酸且該多肽然後稱為肽。若多肽係肽，則其長至少約2、3、4或至少5個胺基酸殘基。因此，多肽包含基因產物、天然多肽、合成多肽、同系物、直向同源物、同種同源物、片段及前述物質之其他等效物、變體及類似物。多肽可為單一分子或可為多分子複合物(例如二聚體、三聚體或四聚體)。其亦可包括單鏈或多鏈多肽且可發生締合或連接。術語多肽亦可適用於其中一或多個胺基酸殘基係相應天然胺基酸之人工化學類似物之胺基酸聚合物。
預防 ：如本文中所使用，術語「預防(preventing或prevention)」係指部分地或完全延遲感染、疾病、病症及/或病狀之發作；部分地或完全延遲特定感染、疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特徵或臨床表現之發作；部分地或完全延遲特定感染、疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀、特徵或表現之發作；部分地或完全延遲自感染、特定疾病、病症及/或病狀之進展；及/或降低發生與感染、疾病、病症及/或病狀有關之病況之風險。
所關注蛋白質 ： 如本文中所使用，術語「所關注蛋白質」或「期望蛋白質」包括本文所提供者及其片段、突變體、變體及變化形式。
純化 ： 如本文中所使用，「純化(purify、purified、purification)」意指達到實質上純或不含不期望組分、材料污染物、混合物或缺陷。「純化(Purified)」係指純淨狀態。「純化(Purification)」係指達到純淨之過程。
區域 ： 如本文中所使用，術語「區域」係指區或一般區域。在某些實施例中，在提及蛋白質或蛋白質模組時，區域可包括沿蛋白質或蛋白質模組之胺基酸線性序列或可包括三維區域、表位及/或表位團簇。在某些實施例中，區域包括末端區域。如本文中所使用，術語「末端區域」係指位於既定試劑之端部或末端之區域。在提及蛋白質時，末端區域可包括N-末端及/或C-末端。N-末端係指蛋白質中包括具有游離胺基之胺基酸之一端。C-末端係指蛋白質中包括具有游離羧基之胺基酸之一端。N-末端及/或C-末端區域可由此包括N-末端及/或C-末端以及周圍胺基酸。在某些實施例中，N-末端及/或C-末端區域包括約3個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約40個胺基酸、約10個胺基酸至約50個胺基酸、約20個胺基酸至約100個胺基酸及/或至少100個胺基酸。在某些實施例中，N-末端區域可包括任一長度之包括N-末端但不包括C-末端之胺基酸。在某些實施例中，C-末端區域可包括任一長度之包括C-末端但不包括N-末端之胺基酸。
在某些實施例中，在提及多核苷酸時，區域可包括沿多核苷酸之核酸線性序列或可包括三維區域、二級結構或三級結構。在某些實施例中，區域包括末端區域。如本文中所使用，術語「末端區域」係指位於既定試劑之端部或末端之區域。在提及多核苷酸時，末端區域可包括5’末端及3’末端。5’末端係指多核苷酸中包括具有游離磷酸基之核酸之一端。3’末端係指多核苷酸中包括具有游離羥基之核酸之一端。5’區域及3’區域可由此包括5’末端及3’末端以及周圍核酸。在某些實施例中，5’末端及3’末端區域包括約9個核酸至約90個核酸、約15個核酸至約120個核酸、約30個核酸至約150個核酸、約60個核酸至約300個核酸及/或至少300個核酸。在某些實施例中，5’區域可包括任一長度之包括5’末端但不包括3’末端之核酸。在某些實施例中，3’區域可包括任一長度之包括3’末端但不包括5’末端之核酸。
RNA 或RNA 分子 ：如本文中所使用，術語「RNA」或「RNA分子」或「核糖核酸分子」係指核糖核苷酸之聚合物；術語「DNA」或「DNA分子」或「去氧核糖核酸分子」係指去氧核糖核苷酸之聚合物。DNA及RNA可以天然方式合成(例如分別藉由DNA複製及DNA轉錄)；或以化學方式合成。DNA及RNA可為單鏈(亦即分別係ssRNA或ssDNA)或多鏈(例如雙鏈，亦即分別係dsRNA及dsDNA)。本文所用之術語「mRNA」或「信使RNA」係指編碼一或多條多肽鏈之胺基酸序列之單鏈RNA。
RNA 干擾或RNAi ： 如本文中所使用，術語「RNA干擾」或「RNAi」係指由RNA分子調介之序列特異性調節機制，其抑制或干擾或「沉默」相應蛋白質編碼基因之表現。已在許多類型之生物體(包括植物、動物及真菌)中觀察到RNAi。RNAi天然發生於細胞中以去除外來RNA (例如病毒RNA)。天然RNAi經由自游離dsRNA裂解之片段進行，該等片段將降解機制引向其他類似RNA序列。RNAi由RNA誘導之沉默複合物(RISC)控制且由細胞質中之短/小dsRNA分子引發，其中該等分子與催化性RISC組分亞古爾蛋白(argonaute)相互作用。dsRNA分子可以外源性方式引入細胞中。外源性dsRNA藉由活化核糖核酸酶蛋白Dicer來引發RNAi，該Dicer會結合及裂解dsRNA以產生具有21-25個鹼基對且在每一端具有少量未配對懸突鹼基之雙鏈片段。該等短雙鏈片段稱為小干擾RNA (siRNA)。
試樣 ： 如本文中所使用，術語「試樣」或「生物試樣」係指組織、細胞或組成部分(例如體液，包括(但不限於)血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊髓液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿、陰道液及精液)之子組。試樣另外可包括自完整生物體製得之均質物、溶解物或提取物或其組織、細胞或組成部分或其成分或部分(包括(但不限於)例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚外部、呼吸道、腸道及泌尿生殖道、淚液、唾液、乳液、血細胞、腫瘤、器官)之子組。試樣進一步係指可含有細胞組分(例如蛋白質或核酸分子)之介質，例如營養物培養液或凝膠。
自我互補性病毒顆粒 ：如本文中所使用，「自我互補性病毒顆粒」係包括至少兩種以下組分之顆粒：蛋白質衣殼及編碼包封於衣殼內之自我互補性基因體之多核苷酸序列。
有義鏈 ： 如本文中所使用，術語siRNA分子之「有義鏈」或「第二鏈」或「隨從鏈」係指與反義鏈或第一鏈互補之鏈。siRNA分子之反義鏈及有義鏈發生雜交以形成雙螺旋體結構。如本文中所使用，「siRNA雙螺旋體」包括具有與沉默靶向基因之mRNA中具有約10-50個核苷酸之區段足夠互補之siRNA鏈及具有足夠互補性以與另一siRNA鏈形成雙螺旋體的siRNA鏈。
短干擾RNA 或siRNA ： 如本文中所使用，術語「短干擾RNA」、「小干擾RNA」或「siRNA」係指能夠引導或調介RNAi之包括約5-60個核苷酸(或核苷酸類似物)之RNA分子(或RNA類似物)。在某些實施例中，siRNA分子包括約15-30個核苷酸或核苷酸類似物，例如約16-25個核苷酸(或核苷酸類似物)、約18-23個核苷酸(或核苷酸類似物)、約19-22個核苷酸(或核苷酸類似物) (例如19、20、21或22個核苷酸或核苷酸類似物)、約19-25個核苷酸(或核苷酸類似物)及約19-24個核苷酸(或核苷酸類似物)。術語「短」 siRNA係指包括5-23個核苷酸(例如21個核苷酸(或核苷酸類似物)，例如19、20、21或22個核苷酸)之siRNA。術語「長」 siRNA係指包括24-60個核苷酸(例如約24-25個核苷酸，例如23、24、25或26個核苷酸)之siRNA。短siRNA可在一些情況下包括少於19個核苷酸(例如16、17或18個核苷酸)或少至5個核苷酸，條件係較短siRNA保留調介RNAi之能力。同樣，長siRNA可在一些情況下包括多於26個核苷酸(例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60個核苷酸)，條件係較長siRNA保留調介RNAi或轉譯抑制之能力而無需進一步處理(例如酶促處理)成短siRNA。siRNA可為單鏈RNA分子(ss-siRNA)或包括雜交形成稱為siRNA雙螺旋體之雙螺旋體結構之有義鏈及反義鏈之雙鏈RNA分子(ds-siRNA)。
信號序列 ： 如本文中所使用，片語「信號序列」係指可引導蛋白質之傳輸或定位之序列。
類似性 ：如本文中所使用，術語「類似性」係指聚合分子之間(例如多核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間)之整體相關性。可以與計算一致性百分比相同之方式來計算聚合分子彼此之類似性百分比，只是類似性百分比之計算應考慮如業內所理解之保守取代。
穩定 ： 本文所用之「穩定」係指化合物足夠穩健以自反應混合物以有用純度分離且在某些實施例中能夠調配成有效治療劑。
穩定化 ： 如本文中所使用，術語「穩定化」、「經穩定化」、「經穩定化區域」意指使得或變得穩定。
受試者 ： 如本文中所使用，術語「受試者」或「患者」係指可投與本發明組合物以(例如)用於實驗、診斷、防治及/或治療目的之任一生物體。典型受試者包括動物(例如哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物及人類)及/或植物。受試者可尋求或需要治療，要求治療，正接收治療，將接收治療，或由經訓練專業人員針對特定疾病或病狀進行護理。
實質上 ：如本文中所使用，術語「實質上」係指展現全部或接近全部範圍或程度之所關注特性或性質之定性條件。熟習生物技術者應理解，生物及化學現象很少(如果存在)完成及/或進行至完全或達成或避免絕對結果。術語「實質上」由此在本文中用於捕捉許多生物及化學現象中固有的潛在完全性缺失。
患有 ：「患有」疾病、病症及/或病狀之個體已經診斷患有或顯示疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀。
易患 ：「易患」疾病、病症及/或病狀之個體尚未經診斷患有及/或並未展現疾病、病症及/或病狀之症狀，但具有發生疾病或其症狀之傾向。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病狀(例如癌症)之個體之特徵可在於下列各項中之一或多者：(1)與疾病、病症及/或病狀之發生有關之基因突變；(2)與疾病、病症及/或病狀之發生有關之基因多型性；(3)與疾病、病症及/或病狀有關之蛋白質及/或核酸之表現及/或活性增加及/或降低；(4)與疾病、病症及/或病狀之發生有關之習慣及/或生活方式；(5) 疾病、病症及/或病狀之家族史；及(6)暴露於及/或感染與疾病、病症及/或病狀之發生有關之微生物。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病狀之個體將發生該疾病、病症及/或病狀。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病狀之個體將不發生疾病、病症及/或病狀。
持續釋放 ： 如本文中所使用，術語「持續釋放」係指與特定時間段內之釋放速率一致之醫藥組合物或化合物釋放特徵。
合成 ：術語「合成」意指人工產生、製備及/或製造。可以化學或酶促方式來合成本發明之多核苷酸或多肽或其他分子。
靶向 ： 如本文中所使用，「靶向」意指設計及選擇將雜交至靶核酸且誘導期望效應之核酸序列之過程。
靶向細胞 ： 如本文中所使用，「靶向細胞」係指任一或多種所關注細胞。細胞可發現於活體外、活體內、原位或生物體之組織或器官中。生物體可為動物，例如哺乳動物、人類或人類患者。
末端區域 ： 如本文中所使用，術語「末端區域」係指所連接核苷或胺基酸(分別係多核苷酸或多肽)之某一區域之5’或3’端區域。
末端最佳化 ： 術語「末端最佳化」在提及核酸時意指，在天然或野生型末端區域中以一定方式(例如密碼子最佳化)改良核酸之末端區域。
治療劑 ： 術語「治療劑」係指在投與受試者時具有治療、診斷及/或防治效應及/或誘發期望生物及/或藥理學效應之任一藥劑。
治療有效量 ： 如本文中所使用，術語「治療有效量」意指擬遞送藥劑(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、防治劑等)在投與患有或易患感染、疾病、病症及/或病狀之受試者時足以治療、改良(症狀)、診斷、預防及/或延遲(發作)感染、疾病、病症及/或病狀之量。在某些實施例中，以單一劑量來提供治療有效量。在某些實施例中，以包括複數個劑量之劑量方案來投與治療有效量。熟習此項技術者應瞭解，在某些實施例中，若單位劑型包括在作為此一劑量方案之一部分投與時有效之量，則其可視為包括治療有效量之特定藥劑或實體。
治療有效結果 ：如本文中所使用，術語「治療有效結果」意指患有或易患感染、疾病、病症及/或病狀之受試者中足以治療、改良(症狀)、診斷、預防及/或延遲(發作)感染、疾病、病症及/或病狀之結果。
轉染 ：如本文中所使用，術語「轉染」係指向細胞中引入外源性核酸之方法。轉染方法包括(但不限於)化學方法、物理處理及使用陽離子脂質或混合物。
治療 ：如本文中所使用，術語「治療」係指部分地或完全緩解、改善、改良、減輕特定感染、疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、抑制其進展、減小其嚴重程度及/或減少一或多種症狀或特徵之發生。舉例而言，「治療」癌症可係指抑制腫瘤之存活、生長及/或擴散。可治療未展現疾病、病症及/或病狀之體徵之受試者及/或僅展現疾病、病症及/或病狀之早期體徵之受試者，從而降低發生與該疾病、病症及/或病狀有關之病況之風險。
未修飾 ：如本文中所使用，「未修飾」係指在以任一方式改變之前之任一物質、化合物或分子。未修飾可(但不總是)係指野生型或天然形式之生物分子。分子可經受一系列修飾，藉此每一經修飾分子可用作後續修飾之「未修飾」起始分子。
載體 ：如本文中所使用，「載體」係傳輸、轉導異源性分子或另外用作其載劑之任一分子或部分。本發明載體可以重組方式產生且可基於及/或可包括腺相關病毒(AAV)親代或參考序列。該等親代或參考AAV序列可用作改造載體之原始、第二、第三或後續序列。在非限制性實例中，該等親代或參考AAV序列可包括下列序列中之任一者或多者：編碼多肽或多-多肽之多核苷酸序列，該序列可為野生型或自野生型所修飾且該序列可編碼蛋白質、蛋白質結構域或一或多個蛋白質亞單元之全長或部分序列；包括調節性或調控性核酸之多核苷酸，其序列可為野生型或自野生型所修飾；及轉基因，其可或可不自野生型序列所修飾。該等AAV序列可用作一或多種密碼子(在核酸層面上)或胺基酸(在多肽層面上)之「供體」序列或一或多種密碼子(在核酸層面上)或胺基酸(在多肽層面上)之「受體」序列。
病毒基因體 ：如本文中所使用，「病毒基因體(viral genome或vector genome)」係指囊封於AAV顆粒中之核酸序列。
熟習此項技術者僅使用常規實驗即可識別或能夠斷定本文所闡述之本發明之具體實施例之諸多等效形式。本發明範圍並不意欲限於以上說明書，而係如隨附申請專利範圍中所陳述。
在申請專利範圍中，除非上下文明確指示相反含義或其他含義，否則諸如「一個(a、an)」及「該(the)」等冠詞可意指一個或一個以上。除非上下文中指示相反情形或另有說明，否則若一個、一個以上或所有群組成員皆存在、採用或另外相關於既定產物或製程中，則可認為在群組之一或多個成員之間包含「或」之技術方案或說明係適合表述該情形的。本發明包含其中恰好只有一個群組成員存在、採用或另外相關於既定產物或製程中之實施例。本發明亦包含其中一個以上或所有群組成員皆存在、採用或另外相關於既定產物或製程中之實施例。
亦應注意，術語「包括」意欲具有開放性且允許但未必納入其他要素或步驟。在術語「包括」用於本文中時，由此亦涵蓋且揭示術語「由......組成」。
在給出範圍時，包含端點。另外，應理解，除非另外指示或另外自上下文及熟習此項技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值可在本發明之不同實施例中假設表示所陳述範圍內之任一具體值或子範圍，直至該範圍之下限單位之十分之一，除非上下文另外明確指示。
另外，應理解，本發明中屬先前技術內之任一特定實施例可自任一或多個技術方案明確排除。因該等實施例可視為由熟習此項技術者已知，故可將其排除，即使本文並未明確陳述排除。本發明組合物之任一特定實施例(例如任一抗生素、治療劑或活性成分；任一產生方法；任一使用方法；等等)可出於任一原因自任一或多個技術方案排除，不論其是否與所存在之先前技術相關。
應理解，所用詞語係闡述性而非限制性之詞語，且可在隨附申請專利範圍之範圍內作出變化，此並不在較廣泛態樣中背離本發明之真實範圍及精神。
儘管已針對若干所闡述實施例以一定篇幅且使用一定特定性闡述了本發明，但其不應意欲限於任何該等特定情形或實施例或任一特定實施例，但應參照隨附申請專利範圍來予以解釋以鑒於先前技術提供該等申請專利範圍之最廣泛可能詮釋且由此有效地涵蓋本發明之預期範圍。
本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中。倘若出現衝突，則以本說明書(包含定義)為準。另外，部分標題、材料、方法及實例僅為闡釋性而非限制性。 實例  實例1. polH-NLS-LacR多核苷酸
改造多核苷酸以包含polH啟動子(極晚期)、SV40核定位信號(NLS)及Lac抑制(LacR)序列。包含polh啟動子以驅動Lac抑制序列之表現。包含SV40 NLS以改良所表現Lac抑制蛋白在細胞核中之定位。
在表1中給出polH-NLS-LacR多核苷酸之各個組成區域之起始及終止位置。 表1. polH-NLS-LacR區域之組成區域
   polH-NLS-LacR 區域 (SEQ ID NO: 5)
區域 起點 終點 區域長度 區域之 SEQ ID NO
polH啟動子 1 92 92 SEQ ID NO: 6
SV40 NLS區域 93 122 30 SEQ ID NO: 7
連接體 123 137 15 SEQ ID NO: 8
LacR (Lac抑制蛋白) 138 1220 1083 SEQ ID NO: 9
  
NLS-LacR區域 93 1220 1128 SEQ ID NO: 2
改造多核苷酸以插入/選殖至適宜桿狀病毒質體或載體中。在多核苷酸之兩端包含AvrII裂解序列(cctagg)以使得多核苷酸能夠選殖至供體桿狀病毒質體(例如AcMNPV桿粒bMON14272之變體)之非必需egt基因ORF中之AvrII位點中。亦包含NheI (gctagc)、SpeI (actagt)及BstZ17I (gtatac)之裂解序列以使得能夠選殖至供體桿狀病毒質體之其他位點(例如Tn7基因座)中。
polH-NLS-LacR多核苷酸(具有裂解序列)呈現於SEQ ID NO: 10中。亦改造僅具有AvrII、NheI及SpeI裂解序列之polH-NLS-LacR多核苷酸及呈現於SEQ ID NO: 11中。 實例2. Opgp64-polH-NLS-LacR多核苷酸
改造多核苷酸以包含opgp64啟動子(早期/晚期)及polH啟動子(極晚期)二者、SV40核定位信號(NLS)及Lac抑制(LacR)序列。包含opgp64及polh啟動子以驅動Lac抑制序列之表現。包含SV40 NLS以改良所表現Lac抑制蛋白在細胞核中之定位。
在表2中給出opgp64-polH-NLS-LacR多核苷酸之各個組成區域之起始及終止位置。 表2. opgp64-polH-NLS-LacR區域之組成區域
   opgp64-polH-NLS-LacR 區域 (SEQ ID NO: 12)
區域 起點 終點 區域長度 區域之 SEQ ID NO
Opgp64啟動子 1 166 166 SEQ ID NO: 13
polH啟動子 178 270 92 SEQ ID NO: 6
SV40 NLS區域 271 300 30 SEQ ID NO: 7
連接體 301 315 15 SEQ ID NO: 8
LacI (Lac抑制蛋白) 316 1398 1083 SEQ ID NO: 9
藉由將opgp64序列連接於來自實例1之polH-NLS-LacR多核苷酸(具有裂解序列) (SEQ ID NO: 10)之5'端來產生opgp64-polH-NLS-LacR多核苷酸。
藉由自包括OpMNPV gp64啟動子之較大質體進行PCR擴增來產生opgp64序列。PCR擴增使用引子JS146-AvrIIOpgp64promLP (SEQ ID NO: 14)及引子JS147-NheIOpgp64promRP (SEQ ID NO: 15)之組合來提供包含AvrII (5')及NheI (3')裂解序列之JS146-JS147 opgp64序列(SEQ ID NO: 16)。或者，使用引子JS148-NheIOpgp64promLP (SEQ ID NO: 17)及引子JS147來提供在兩端包含NheI裂解序列之JS148-JS147 opgp64序列(SEQ ID NO: 18)。
提供包含來自實例1之polH-NLS-LacR多核苷酸(SEQ ID NO: 10)之質體。使用Nhei酶在水中消解質體，且然後純化。然後將Nhei切割之polH-NLS-LacR質體與JS148-JS147 opgp64序列(SEQ ID NO: 18)組合於包含連接酶緩衝液及T4連接酶之混合物中，且然後在37℃下培育。純化所得質體以提供包含opgp64-polH-NLS-LacR區域(SEQ ID NO: 12)之質體。
在一替代方式中，藉由自來自實例1之polH-NLS-LacR多核苷酸(SEQ ID NO: 10)進行PCR擴增來產生polH-NLS-LacR序列。PCR擴增使用引子JS155-polh-Mut1-NheI (SEQ ID NO: 19)及引子JS156-NLSLacR-RP (SEQ ID NO: 20)之組合來提供包含NheI (5')及AvrII (3')裂解序列之JS155-JS156 polH-NLS-LacR序列(1459 bp) (SEQ ID NO: 21)。然後將JS155-JS156 polH-NLS-LacR序列與JS146-JS147 opgp64序列(SEQ ID NO: 16)組合於包含連接酶緩衝液及T4連接酶之混合物中，且然後在37℃下培育。純化所得多核苷酸以提供插入AvrII裂解序列(SEQ ID NO: 22)且包含opgp64-polH-NLS-LacR區域(SEQ ID NO: 12)之opgp64-polH-NLS-LacR多核苷酸。
可將AvrII-opgp64-polH-NLS-LacR-AvrII多核苷酸插入體(SEQ ID NO: 22)插入靶質體或桿粒內之AvrII REN切入點中。 實例3.polH-NLS-LacR多核苷酸在桿粒之AvrII egt基因座中之選殖消解
使用pUC57產生質體載體(GenScript Biotech Corp)來產生含有實例1之AvrII-polH-NLS-LacR-AvrII多核苷酸(SEQ ID NO: 11)之質體。然後使用10X Cut Smart緩衝液(New England Biolabs, Inc.)及AvrII酶(5U/μL)在水中將polH-NLS-LacR-pUC57 (2,716 bp)消解過夜(最終濃度為20 ng/μL)。使用凝膠純化來純化所得polH-NLS-LacR插入體(1,379 bp)。視需要重複該過程以收集額外polH-NLS-LacR插入體。圖1展示polH-NLS-LacR插入體(1,379 bp)與polH-NLS-LacR-pUC57質體(2,716 bp)之清晰分離。
提供包含AvrII egt區域之供體桿狀病毒質體(亦即桿粒)，例如AcMNPV桿粒bMON14272 (Invitrogen Life Technologies)或其變體。然後使用10X Cut Smart緩衝液(New England Biolabs, Inc.)及AvrII酶(5U/μL)將桿粒在37℃下於水中消解2小時(最終濃度為50 ng/μL)，從而在AvrII egt基因座處產生單切割桿粒。視需要重複該過程以收集額外AvrII切割桿粒。連接
藉由組合10 μL AvrII切割桿粒(500 ng)、30 μL polH-NLS-LacR插入體(600 ng)、5 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育4小時來連接AvrII切割桿粒與polH-NLS-LacR插入體。在一替代方式中，藉由組合10 μL AvrII切割桿粒(500 ng)、10 μL polH-NLS-LacR插入體(200 ng)、25 μL H2 O、5 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育4小時來連接AvrII切割桿粒與polH-NLS-LacR插入體。在一替代方式中，藉由組合20 μL AvrII切割桿粒(1000 ng)、10 μL polH-NLS-LacR插入體(200 ng)、20 μL H2 O、5.5 μL 10X T4連接酶緩衝液、2.5 μL T4連接酶(400U/μL)及2.0 μL 10mM ATP且然後在37℃下培育4小時來連接AvrII切割桿粒與polH-NLS-LacR插入體。
然後組合所得水相與2 μL乙酸鈉及100-120 μL冰冷乙醇。收集沈澱之DNA糰粒且再懸浮於40 μL Tris-EDTA緩衝液中。然後將所得經連接質體DNA轉變至經電穿孔NEB 10-β大腸桿菌(New England Biolabs, Inc.)中。
生長細菌群落且藉由群落挑選式PCR篩選以測試AvrII切割桿粒中之LacR插入。PCR 篩選及分析
使用以下兩種引子之組合來完成群落PCR篩選：上游引子101-JS101-LP-EGT (SEQ ID NO: 23)及下游引子102-JS102-RP-EGT (SEQ ID NO: 24)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約3111 bp。應注意，使用引子102會產生約2kb之假擴增子片段，其出現於若干PCR篩選管柱中。
針對AvrII切割桿粒中之LacR插入之細菌群落之PCR篩選結果展示於圖2A-2F中。PCR篩選展示，群落601 (圖2B)及群落637-639 (圖2F)在3111 bp附近具有強帶，從而指示LacR可能插入該等細菌群落之AvrII切割桿粒中。
然後凝膠純化群落601及群落639之3111 bp JS101-JS102 PCR產物且針對LacR盒方向藉由REN消解分析進行篩選。正向指定為與Ac-egt ORF相同之方向；反向指定為與Ac-egt ORF相反之方向。用於正向LacR插入之REN片段展示於表3及圖3A中；用於反向LacR插入之REN片段展示於表3及圖3B中。在用於兩個方向之EcoRV消解片段(泳道2)及SmaI消解片段(泳道3)之間存在顯著差異。 表3. LacO-p10-LacO表現控制區之組成區域
正向 反向
未切割(1) 3111 bp 3111 bp
EcoRV消解(2) 1413/1698 bp 886/2225 bp
SmaI消解(3) 600/2511 bp 1699/1412 bp
AvrII消解(4) 458/1379/1274 bp 458/1379/1274 bp
BssHII消解(5) 1374/951/786 bp 921/1404/786 bp
群落601 (圖4A)及群落639 (圖4B)二者之REN消解分析展示，群落601及群落639二者皆對應於正向LacR插入及與Ac-egt ORF相同之方向。 實例4. LacO-p10-LacO-VP1-PHPN多核苷酸
改造多核苷酸以包含可調節表現控制區及編碼蛋白質之核苷酸序列(例如VP1序列)。改造表現控制區以包含在每一側側接有Lac操縱子(LacO)區之p10啟動子。包含p10啟動子以驅動相應編碼蛋白質之核苷酸序列(例如具有正常ATG起始密碼子之PHPN VP1序列)之表現。包含側接LacO區以自p10啟動子進行可調節表現。在5' LacO區與p10啟動子之間包含第一橋序列(Ac-p26橋序列)。在p10啟動子與3' LacO區之間包含第二橋序列(ctg核苷酸)。包含兩個橋序列以使5' LacO區與3' LacO區之間間隔208 bp (自每一LacO區之中心所量測)。
在表4中給出LacO-p10-LacO表現控制區之各個組成區域之起始及終止位置。 表4. LacO-p10-LacO表現控制區之組成區域
   LacO-p10-LacO 表現控制區 (SEQ ID NO: 25)
區域 起點 終點 區域長度 區域之 SEQ ID NO
LacO 5' 1 20 20 SEQ ID NO: 4
Ac-p26橋 21 95 75 SEQ ID NO: 26
p10啟動子 96 205 110 SEQ ID NO: 27
LacO 3' 209 228 20 SEQ ID NO: 4
然後使表現控制區可操作地連接至編碼VP1之核苷酸序列(僅VP1)。使用用於AAV.PHPN衣殼之VP1序列作為實例性構築體。在表現控制區與AAV.PHPN VP1序列之間包含小橋序列(ccc)。多核苷酸亦包含HSV TK聚(A)信號。
改造多核苷酸以插入/選殖至適宜桿狀病毒質體或載體中。包含I-CeuI裂解序列(SEQ ID NO: 1)以使得多核苷酸能夠選殖至供體桿狀病毒質體之I-CeuI位點中。亦包含NheI (gctagc)、SpeI (actagt)及BstZ17I (gtatac)之裂解序列以使得能夠選殖至供體桿狀病毒質體之其他位點(例如Tn7基因座)中。定位SpeI (actagt)及NcoI (ccatgg)裂解序列以交換出LacO表現控制區。定位NcoI (ccatgg)及MluI (acgcgt)裂解序列以交換出VP構築體(例如用於使用另一 AAV血清型(例如AAV.PHPB、AAVrh10、AAV9或AAV2)代替AAV.PHPN VP1序列)。
LacO-p10-LacO-VP1-PHPN多核苷酸(具有僅VP1、聚(A)及裂解序列)呈現於SEQ ID NO: 28中。 實例5. LacO-p10-LacO-VP1-PHPN多核苷酸至桿粒之I-CeuI基因座之選殖消解
使用pUC57產生質體載體(Thermo Fisher Scientific Inc)來產生含有來自實例4之LacO-p10-LacO-VP1多核苷酸(SEQ ID NO: 28)之質體。然後使用10X Cut Smart緩衝液(New England Biolabs, Inc.)、I-CeuI酶(5 U/μL)及BsaI酶(20 U/μL)將50 μg LacO-p10-LacO-VP1-pUC57在37℃下於水中消解2小時(最終濃度為167 ng/μL)，隨後暴露於75℃ 10分鐘以不活化酶。使用凝膠純化(於0.8% w/v瓊脂糖中之電泳，1X TAE凝膠，80 min, 120V)純化所得LacO-p10-LacO-VP1插入體(2,679 bp)，且回收7800 ng產物。視需要重複該過程以收集額外LacO-p10-LacO-VP1插入體。圖5中所呈現之凝膠展示LacO-p10-LacO-VP1插入體(2,679 bp)與剩餘LacO-p10-LacO-VP1-pUC57質體(5,365 bp)及pUC57片段(在藉由BsaI酶切割成兩半後為約1300 bp)之清晰分離。
提供實例3中之來自群落639之桿粒，其各自具有I-CeuI區域。使用10X Cut Smart緩衝液(New England Biolabs, Inc.)及I-CeuI酶(5 U/μL)將6 μg 639桿粒在37℃下於水中消解2小時(最終濃度為76 ng/μL)，隨後暴露於75℃ 10分鐘以不活化酶，從而產生在I-CeuI基因座處單切割之639桿粒。視需要重複該過程以收集額外之I-CeuI切割之639桿粒。連接
藉由組合25 μL I-CeuI切割之639桿粒(600 ng)、25 μL LacO-p10-LacO-VP1插入體(1275 ng)、1 μL 100mM ATP、0 μL 1X Cut Smart緩衝液及3 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育來連接I-CeuI切割之639桿粒與LacO-p10-LacO-VP1插入體。在一替代方式中，藉由組合25 μL I-CeuI切割之639桿粒(600 ng)、10 μL LacO-p10-LacO-VP1插入體(500 ng)、1 μL 100 mM ATP、15 μL 1X Cut Smart緩衝液及3 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育來連接I-CeuI切割之639桿粒與LacO-p10-LacO-VP1插入體。在一替代方式中，藉由組合25 μL I-CeuI切割之639桿粒(600 ng)、5 μL LacO-p10-LacO-VP1插入體(250 ng)、1 μL 100 mM ATP、20 μL 1X Cut Smart緩衝液及3 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育來連接I-CeuI切割之639桿粒與LacO-p10-LacO-VP1插入體。在一替代方式中，藉由組合25 μL I-CeuI切割之639桿粒(600 ng)、2 μL LacO-p10-LacO-VP1插入體(100 ng)、1 μL 100 mM ATP、20 μL 1X Cut Smart緩衝液及3 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育來連接I-CeuI切割之601桿粒與LacO-p10-LacO-VP1插入體。
然後混合所得水相與2 μL 3M乙酸鈉及2體積冰冷乙醇，然後在-20℃下冷凍20分鐘。藉由離心收集沈澱之DNA糰粒且再懸浮於80 μL Tris-EDTA緩衝液中。然後將所得經連接質體DNA轉變至經電穿孔NEB 10-β大腸桿菌(New England Biolabs, Inc.)中。
生長細菌群落且藉由群落挑選式PCR篩選以測試I-CeuI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1插入。PCR 篩選及分析
使用以下4種引子之組合來完成群落PCR篩選：引子JS16-Lef7-LP1 (SEQ ID NO: 29)、引子JS17-gp64UTR-RP (SEQ ID NO: 30)、引子JS61-VP3-primer2 (SEQ ID NO: 31)及引子JS92-AAP-RP1 (SEQ ID NO: 32)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約3838 bp (JS16-JS17)、1398 bp (JS16-JS61)或1092 bp (JS92-JS17)。
針對I-CeuI切割之639桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1插入之細菌群落的JS16-JS17 PCR篩選結果展示於圖6A-6C中。PCR篩選展示，群落1085-1086 (圖6A)、群落1095-1096 (圖6B)及群落1099 (圖6B)在3838 bp附近具有強帶，從而指示LacO-p10-LacO-VP1插入體可能插入該等細菌群落之I-CeuI切割之639桿粒中。剩餘群落之1159 bp附近之強帶與I-CeuI切割之639桿粒中之空I-CeuI位點相關。
針對I-CeuI切割之639桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1插入之群落1086、1095、1096及1099的JS16-JS61及JS92-JS17 PCR篩選結果展示於圖6C中。PCR篩選展示，群落1086、1095及1099在1398 bp及1092 bp附近具有強帶，從而指示LacO-p10-LacO-VP1插入體可能插入I-CeuI切割之639桿粒中。群落1096在1398 bp附近具有強帶，但1092 bp附近之帶不可辨別。西方印漬測試
使用抗AAV衣殼ECL西方印漬及抗LacR ECL西方印漬來測試群落1095，其中使用異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)作為誘導元件。將來自群落1095之桿粒在不同IPTG濃度下感染至Sf9細胞中，且使用西方印漬分析感染後3天之總細胞溶解物。結果展示於圖7A及圖7B中。
圖7A中之結果展示，VP1產生係由LacR調節，其中較低濃度之IPTG產生較少VP1且較高濃度之IPTG產生較多VP1。 實例6. PHPN-LacOVP1ICeu -LacRAvrII 桿粒之產生
提供含有AAV病毒表現構築體之供體質體。病毒表現構築體包含在polH啟動子下之AAV Rep序列(編碼Rep78及Rep52蛋白)及在p10啟動子下之AAVPHPN Cap序列(編碼VP1、VP2及VP3)。
提供來自實例5之桿粒1095。藉由Tn7轉位使用熟習此項技術者已知之方法及輔助質體將來自供體質體之AAV病毒表現構築體插入桿粒1095中。生長細菌群落(包含群落1140)且藉由群落挑選式PCR篩選以測試AAV病毒表現構築體在桿粒1095中之插入(產生PHPN-LacOVP1ICeu -LacRAvrII 桿粒)。
使用抗AAV衣殼ECL西方印漬及抗LacR ECL西方印漬來測試群落1140，其中使用異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)作為誘導元件。將來自群落1140之桿粒在不同IPTG濃度下感染至Sf9細胞中，且使用西方印漬分析感染後3天之總細胞溶解物。結果展示於圖8A及圖8B中。
圖8A中之結果展示，VP1產生係由LacR調節，其中較低濃度之IPTG產生較少VP1且較高濃度之IPTG產生較多VP1。VP2及VP3之濃度一致(圖8A)。Rep78及Rep52之濃度亦一致(圖8B)。 實例7. LacO-p10-LacO-VP1-PHPN多核苷酸至桿粒之FseI基因座之選殖PCR 擴增及消解
使用pUC57產生質體載體(Thermo Fisher Scientific Inc)來產生含有來自實例4之完整LacO-p10-LacO-VP1多核苷酸(SEQ ID NO: 28)之質體。所得LacO-p10-LacO-VP1-pUC57質體包含I-CeuI基因座(來自LacO-p10-LacO-VP1多核苷酸)及FseI基因座(來自pUC57質體)二者。
使用來自LacO-p10-LacO-VP1-pUC57質體之PCR擴增且使用以下兩種引子之組合來產生LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體：引子JS134-FseI (SEQ ID NO: 33)及引子JS135-FseI (SEQ ID NO: 34)。該製程產生大約32 μg LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入材料(3,541 bp之靶)。
使用QiaQuick PCR純化套組利用4個180 μL體積(各自包含8 μg LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體)來純化PCR產物。向每一體積中添加900 μL PB緩衝液，隨後添加20 μL 3M乙酸鈉(pH 5.5)。然後離心產物且經由4個QiaQuick管柱處理，使用750 μL PB緩衝液洗滌，且然後使用60 μL TE緩衝液(第1洗脫)及10 μL水(第2洗脫)洗脫。最終體積池為270 μl且含有32 μg產量之LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體。
然後使用30 μL 10X Cut Smart緩衝液及10 μL FseI酶(2U/μL)將270 μl產物池在37℃下消解3小時。針對消解產物使用75 μL FseI REN消解液、375 μL PB緩衝液及20 μL 3M乙酸鈉重複使用QiaQuick PCR純化套組之純化。離心產物且經由4個QiaQuick管柱處理，使用750 μL PB緩衝液洗滌，且然後使用20 μL TE緩衝液(第1洗脫)及20 μL水(第2洗脫)洗脫。最終體積池為160 μl且含有29.3 μg產量之LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體。
LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體產生池之凝膠分析(圖9)在3,541 bp附近展示強帶，從而指示經由PCR擴增自LacO-p10-LacO-VP1-pUC57質體成功產生LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體。
提供實例3中之來自群落639之桿粒，其各自具有FseI區域。使用10X Cut Smart緩衝液(New England Biolabs, Inc.)及FseI酶(5 U/μL)將639桿粒在37℃下於水中消解2小時(最終濃度為50 ng/μL)，隨後暴露於75℃ 10分鐘以不活化酶，從而產生在FseI基因座處單切割之639桿粒。視需要重複該過程以收集額外之FseI切割之639桿粒。連接
藉由組合25 μL FseI切割之639桿粒(1000 ng)、10 μL LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體(1830 ng)、10 μL H2 O、5 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育4小時來連接FseI切割之639桿粒與LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體。在一替代方式中，藉由組合25 μL FseI切割之639桿粒(1000 ng)、20 μL LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體(3660 ng)、5 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育4小時來連接FseI切割之639桿粒與LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體。在一替代方式中，藉由組合25 μL FseI切割之639桿粒(1000 ng)、5 μL LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體(915 ng)、15 μL H2 O、5 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育4小時來連接FseI切割之639桿粒與LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體。在一替代方式中，藉由組合25 μL FseI切割之639桿粒(1000 ng)、2 μL LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體(366 ng)、18 μL H2 O、5 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育4小時來連接FseI切割之639桿粒與LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體。在一替代方式中，藉由組合25 μL FseI切割之639桿粒(1000 ng)、1 μL LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體(183 ng)、19 μL H2 O、5 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育4小時來連接FseI切割之639桿粒與LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體。
組合所得水相與2 μL 3M乙酸鈉及100 μL乙醇。藉由離心收集沈澱之DNA糰粒且再懸浮於60 μL Tris-EDTA緩衝液中。然後將所得經連接質體DNA轉變至經電穿孔NEB 10-β大腸桿菌(New England Biolabs, Inc.)中。
生長細菌群落且藉由群落挑選式PCR篩選以測試FseI切割之639桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入。PCR 篩選及分析
使用以下兩種引子之組合來完成群落PCR篩選：引子JS91-gta-RP1 (SEQ ID NO: 35)及引子JS122-gta-LP9 (SEQ ID NO: 36)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約3,729 bp。針對FseI切割之639桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入之細菌群落的PCR篩選陽性結果展示於圖10中。PCR篩選展示，群落1030 (圖10)在3,729 bp附近具有強帶，從而指示LacO-p10-LacO-VP1-FseI已插入該等細菌群落之FseI切割之639桿粒中。
使用以下兩種引子之組合來完成群落1030之進一步PCR篩選：引子JS138 (SEQ ID NO: 37)及引子JS139 (SEQ ID NO: 38)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約1070 bp。亦使用以下兩種引子之組合來完成群落1030之進一步PCR篩選：引子JS140 (SEQ ID NO: 39)及引子JS141 (SEQ ID NO: 40)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約621 bp。
針對FseI切割之639桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入之群落1030之兩種PCR篩選的結果展示於圖11中。PCR篩選展示，群落1030在1070 bp附近具有強帶(圖11)，從而指示LacO-p10-LacO-VP1-FseI已插入該等細菌群落之FseI切割之639桿粒中。PCR篩選亦展示，群落1030在621 bp附近具有弱帶(圖11)，從而指示LacO-p10-LacO-VP1-FseI可能插入該等細菌群落之FseI切割之639桿粒中。 實例8. LacO-p10-LacO-VP2-PHPN多核苷酸
改造多核苷酸以包含可調節表現控制區及僅VP2編碼序列。使來自實例4之表現控制區(SEQ ID NO: 25)可操作地連接至編碼VP2之核苷酸序列(僅VP2)。使用用於AAV.PHPN衣殼之VP2序列作為實例性構築體。在表現控制區與AAV.PHPN VP2序列之間包含小橋序列(ccc)。多核苷酸亦包含HSV TK聚(A)信號。
改造多核苷酸以插入/選殖至適宜桿狀病毒質體或載體中。包含FseI裂解序列(ggccggcc)以使得多核苷酸能夠選殖至供體桿狀病毒質體之非必需gta基因ORF之FseI位點中。亦包含NheI (gctagc)、SpeI (actagt)及BstZ17I (gtatac)之裂解序列以使得能夠選殖至供體桿狀病毒質體之其他位點(例如Tn7基因座)中。定位SpeI (actagt)及NcoI (ccatgg)裂解序列以交換出LacO表現控制區。定位NcoI (ccatgg)及MluI (acgcgt)裂解序列以交換出VP構築體(例如用於使用另一 AAV血清型(例如AAV.PHPB、AAVrh10、AAV9或AAV2)代替AAV.PHPN VP2序列)。
LacO-p10-LacO-VP2-PHPN多核苷酸(具有僅VP2、聚(A)及裂解序列)呈現於SEQ ID NO: 41中。 實例9. LacO-p10-LacO-VP2-PHPN多核苷酸至桿粒之FseI基因座之選殖消解
使用pUC57產生質體載體(Thermo Fisher Scientific Inc)來產生含有來自實例8之完整LacO-p10-LacO-VP2多核苷酸(SEQ ID NO: 41)之質體。然後使用10X Cut Smart緩衝液(New England Biolabs, Inc.)及FseI酶在37℃下於水中消解LacO-p10-LacO-VP2-pUC57。使用凝膠純化來純化所得LacO-p10-LacO-VP2插入體。視需要重複該過程以收集額外LacO-p10-LacO-VP2插入體。
提供實例3中之來自群落601之桿粒，其各自具有FseI區域。使用10X Cut Smart緩衝液(New England Biolabs, Inc.)及FseI酶(5 U/μL)將6 μg 601桿粒在37℃下於水中消解2小時(最終濃度為50 ng/μL)，隨後暴露於75℃ 10分鐘以不活化酶，從而產生在FseI基因座處單切割之601桿粒。視需要重複該過程以收集額外之FseI切割之601桿粒。連接
藉由組合40 μL FseI切割之601桿粒(3,040 ng)、20 μL LacO-p10-LacO-VP2插入體(800 ng)、30 μL H2 O、4 μL 10mM ATP、10 μL 10X T4連接酶緩衝液及2.5 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育3小時來連接FseI切割之601桿粒與LacO-p10-LacO-VP2插入體。然後組合所得水相與2 μL 3M乙酸鈉及2體積冰冷乙醇，然後在-20℃下冷凍20分鐘。藉由離心收集沈澱之DNA糰粒且再懸浮於80 μL Tris-EDTA緩衝液中。然後將所得經連接質體DNA轉變至經電穿孔NEB 10-β大腸桿菌(New England Biolabs, Inc.)中。
圖12中所呈現之凝膠清晰地展示，FseI切割之601桿粒及LacO-p10-LacO-VP2 (圖12之泳道1)連接成組合LacO-p10-LacO-VP2桿粒(圖12之泳道2)。
生長細菌群落且藉由群落挑選式PCR篩選以測試FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP2插入。 實例10. LacO-p10-LacO-VP1及LacO-p10-LacO-VP2多核苷酸在桿粒中之選殖消解
根據實例5來產生LacO-p10-LacO-VP1插入體。根據實例9來產生LacO-p10-LacO-VP2插入體。
提供實例3中之來自群落601之桿粒，其各自具有FseI區域及I-CeuI區域。使用10X Cut Smart緩衝液(New England Biolabs, Inc.)、I-CeuI酶(5 U/μL)及FseI酶(5 U/μL)將601桿粒在37℃下於水中消解2小時，隨後暴露於75℃ 10分鐘以不活化酶，從而產生在I-CeuI基因座及FseI基因座二者處切割之601桿粒。視需要重複該過程以收集額外之I-CeuI/FseI切割之601桿粒。連接
藉由組合70 μL I-CeuI/FseI切割之601桿粒、20 μL LacO-p10-LacO-VP1插入體、20 μL LacO-p10-LacO-VP2插入體、7 μL 10mM ATP、12 μL 10X T4連接酶緩衝液及2.5 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育3小時來連接I-CeuI/FseI切割之601桿粒與LacO-p10-LacO-VP1-I-CeuI插入體及LacO-p10-LacO-VP2-FseI插入體。然後組合所得水相與2 μL 3M乙酸鈉及2體積冰冷乙醇，然後在-20℃下冷凍20分鐘。藉由離心收集沈澱之DNA糰粒且再懸浮於80 μL Tris-EDTA緩衝液中。然後將所得經連接質體DNA轉變至經電穿孔NEB 10-β大腸桿菌(New England Biolabs, Inc.)中。
圖13中所呈現之凝膠清晰地展示，I-CeuI/FseI切割之601桿粒、LacO-p10-LacO-VP1及LacO-p10-LacO-VP2 (圖13之泳道1)連接成組合LacO-p10-LacO-VP1/LacO-p10-LacO-VP2桿粒(圖13之泳道2)。
生長細菌群落且藉由群落挑選式PCR篩選以測試I-CeuI /FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1-I-CeuI及LacO-p10-LacO-VP2-FseI插入。 實例11.桿粒之PCR篩選及分析用於 LacO-p10-LacO-VP2 之 JS61/JS91 PCR
使用以下兩種引子之組合對來自實例9之群落750-758及來自實例10之群落759-767針對LacO-p10-LacO-VP2-FseI插入來實施群落PCR篩選：引子JS61-VP3-primer2 (SEQ ID NO: 31)及引子JS91-gta-RP1 (SEQ ID NO: 35)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約388 bp。
針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP2插入之細菌群落的PCR篩選結果展示於圖14A及14B中。PCR篩選展示，所有群落750-758 (圖14A)及群落759-767  (圖14B)皆在388 bp附近具有帶，從而指示LacO-p10-LacO-VP2可能插入該等細菌群落之FseI切割之601桿粒中。用於 LacO-p10-LacO-VP2 之 JS90/JS91 PCR
使用以下兩種引子之組合對來自實例9之群落750-758及來自實例10之群落759-767針對LacO-p10-LacO-VP2-FseI插入實施群落PCR篩選：引子JS90-gta-LP1 (SEQ ID NO: 42)及引子JS91-gta-RP1 (SEQ ID NO: 35)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約2,452 bp。
針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP2插入之細菌群落的PCR篩選結果展示於圖15A及圖15B中。PCR篩選展示，群落754 (圖15A)在2452 bp附近具有強集中帶，從而指示LacO-p10-LacO-VP2可能插入該等細菌群落之FseI切割之601桿粒中。用於 LacO-p10-LacO-VP2 之 JS90/JS92 PCR
使用以下兩種引子之組合對來自實例9之群落754及758及來自實例10之群落759-767及795-800針對LacO-p10-LacO-VP2-FseI插入實施群落PCR篩選：引子JS90-gta-LP1 (SEQ ID NO: 42)及引子JS92-AAP-RP1 (SEQ ID NO: 32)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約716 bp。
針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP2插入之細菌群落的PCR篩選結果展示於圖16A及16B中。PCR篩選展示，群落754及760 (圖16A)在716 bp附近具有強帶，從而指示LacO-p10-LacO-VP2可能插入該等細菌群落之FseI切割之601桿粒中。群落764 (圖16A)及群落765 (圖16B)在716 bp附近具有弱帶，從而指示LacO-p10-LacO-VP2可能插入該等細菌群落之FseI切割之601桿粒中。用於 LacO-p10-LacO-VP2 之 JS90/JS61 PCR
使用以下兩種引子之組合對來自實例9之群落754及758及來自實例10之群落759-767及795-800針對LacO-p10-LacO-VP2-FseI插入實施群落PCR篩選：引子JS90-gta-LP1 (SEQ ID NO: 42)及引子JS61-VP3-primer2 (SEQ ID NO: 31)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約516 bp。
針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP2插入之細菌群落的陽性PCR篩選結果展示於圖17中。PCR篩選展示，群落754、758及760 (圖17)在516 bp附近具有強帶，從而指示LacO-p10-LacO-VP2可能插入該等細菌群落之FseI切割之601桿粒中。群落764及795 (圖17)在516 bp附近具有弱帶，從而指示LacO-p10-LacO-VP2可能插入該等細菌群落之FseI切割之601桿粒中。 實例12.藉由去除LacO-p10-LacO-VP2插入體來產生LacO-p10-LacO-VP1桿粒產生及消解
根據實例10產生LacO-p10-LacO-VP1/LacO-p10-LacO-VP2桿粒。使細菌群落生長且藉由群落挑選型PCR篩選(包含群落994)。自群落細胞分離LacOVP1cath -LacOVP2gta -LacRegt 994桿粒。
使用10X Cut Smart緩衝液(New England Biolabs, Inc.)及FseI酶(5 U/μL)將經分離994桿粒在37℃下於水中消解2小時以供FseI切割(最終濃度為50 ng/μL)，從而產生在FseI基因座處切割之994桿粒。自桿粒混合物去除已藉由FseI消解自994桿粒釋放之LacO-p10-LacO-VP2-FseI插入體。然後使用10X T4連接酶緩衝液及T4連接酶(400U/μL)、且然後在37℃下培育3小時來連接閉合994桿粒中之FseI切口。
組合所得水相與3M乙酸鈉及乙醇，且然後藉由離心收集沈澱之DNA糰粒並再懸浮於中Tris-EDTA緩衝液中。將所得LacOVP1cath -LacRegt 桿粒轉變至經電穿孔NEB 10-β大腸桿菌(New England Biolabs, Inc.)中。生長細菌群落且藉由群落挑選式PCR篩選以測試所得桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1。 實例13.包含FseI-LacO-p10-LacO-VP2-FseI之融合多核苷酸插入體第一設計
根據實例8來改造LacO-p10-LacO-VP2-FseI多核苷酸插入體。使來自實例4之表現控制區(SEQ ID NO: 25)可操作地連接至編碼VP2之核苷酸序列(僅VP2)。使用用於AAV.PHPN衣殼之VP2序列作為實例性構築體。在表現控制區與AAV.PHPN VP2序列之間包含小橋序列(ccc)。多核苷酸亦包含HSV TK聚(A)信號。
改造多核苷酸以插入/選殖至適宜桿狀病毒質體或載體中。包含FseI裂解序列(ggccggcc)以使得多核苷酸能夠選殖至供體桿狀病毒質體之gta基因ORF中之FseI位點中。亦包含用於SpeI之裂解序列(actagt)以使得能夠在多核苷酸中納入gta組分(及啟動子)。
然後將來自gta基因ORF之組分(部分Ac-lef12啟動子及部分Ac-gta基因)在多核苷酸插入體之SpeI基因座處納入多核苷酸插入體中，從而形成包含LacO-p10-LacO-VP2多核苷酸插入體及部分-gta基因ORF多核苷酸之融合多核苷酸。兩種組分具有相同轉譯方向或相反轉譯方向。所得融合多核苷酸插入體之實例呈現為SEQ ID NO: 43及SEQ ID NO: 44。第二設計
藉由組合FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI片段與MluI-AClef12-ACgta-FseI片段來改造LacO-p10-LacO-VP2-FseI多核苷酸插入體。
如下所述來產生FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI片段：使用pUC57產生質體載體(Thermo Fisher Scientific Inc)產生含有來自實例8之完整LacO-p10-LacO-VP2多核苷酸(SEQ ID NO: 41)之質體。然後藉由PCR擴增自較大LacO-p10-LacO-VP2-pUC57質體來產生An FseI-FseI-LacO-p10-LacO-VP2-FseI-FseI片段。PCR擴增使用引子JS134-FseI (SEQ ID NO: 33)及引子JS135-FseI (SEQ ID NO: 34)之組合。使用QiaQuick PCR純化來純化PCR產物以提供JS134-JS135 FseI-FseI-LacO-p10-LacO-VP2-FseI-FseI片段(SEQ ID NO: 45)。圖17展示JS134-JS135片段(3106 bp)之清晰產生。
然後使用Cut Smart緩衝液、FseI酶及MluI酶在37℃下消解JS134-JS135 PCR產物。凝膠純化產物池且重複FseI/MluI消解過程。再次凝膠純化產物池以提供FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI插入片段。
如下所述來產生MluI-AClef12-ACgta-FseI片段：提供來自群落1140之桿粒(實例6)。然後藉由PCR擴增自桿粒1140來產生MluI-AClef12-ACgta-FseI-MluI片段。PCR擴增使用引子JS142-gta-UTR-LP-MluI (SEQ ID NO: 46)及引子JS143-gta-RP-MluI (SEQ ID NO: 47)之組合。使用QiaQuick PCR純化來純化PCR產物以提供JS142-JS143 MluI-AClef12-ACgta-FseI-MluI片段(SEQ ID NO: 48)。圖18展示JS142-JS143片段(575 bp)之清晰產生。
然後使用Cut Smart緩衝液、FseI酶及MluI酶在37℃下消解JS142-JS143產物。凝膠純化產物池且重複FseI/MluI消解過程。再次凝膠純化產物池以提供MluI-AClef12-ACgta-FseI插入片段。
在一替代方式中，如下所述來產生MluI-AClef12-ACgta-FseI片段：提供來自群落1140之桿粒(實例6)。然後藉由PCR擴增自桿粒1140來產生MluI-AClef12-ACgta-FseI-MluI片段。PCR擴增使用引子JS142-gta-UTR-LP-MluI (SEQ ID NO: 46)及引子JS145 (SEQ ID NO: 49)之組合。使用QiaQuick PCR純化來純化PCR產物以提供類似MluI-AClef12-ACgta-FseI-MluI片段(SEQ ID NO: 48)。 實例14. PHPN-LacOVP1ICeu -LacOVP2FseI -LacRAvrII 桿粒之產生桿粒 1149-1178
提供來自群落1140之桿粒(實例6)，其各自具有含有gta基因ORF之FseI區域。使用Cut Smart緩衝液及FseI酶在37℃下於水中消解1140桿粒。凝膠純化產物以提供FseI切割之1140桿粒。視需要重複該過程以收集額外之FseI切割之1140桿粒。
藉由組合20 μL FseI切割之1140桿粒(1400 ng)、30 μL經凝膠純化之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI插入體(800 ng)、12 μL經凝膠純化之MluI-AClef12-ACgta-FseI插入片段(408 ng)、7 μL 10X T4連接酶緩衝液及3 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在37℃下培育來連接FseI切割之1140桿粒與FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI插入片段及MluI-AClef12-ACgta-FseI插入片段。然後凝膠純化所得桿粒。在一替代方式中，連接混合物包含20 μL FseI切割之1140桿粒(1400 ng)、15 μL經凝膠純化之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI插入體(400 ng)、6 μL經凝膠純化之MluI-AClef12-ACgta-FseI插入片段(204 ng)、21 μL H2 O、7 μL 10X T4連接酶緩衝液及3 μL T4連接酶(400U/μL)。在一替代方式中，連接混合物包含20 μL FseI切割之1140桿粒(1400 ng)、8 μL經凝膠純化之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI插入體(200 ng)、3 μL經凝膠純化之MluI-AClef12-ACgta-FseI插入片段(102 ng)、30 μL H2 O、7 μL 10X T4連接酶緩衝液及3 μL T4連接酶(400U/μL)。在一替代方式中，連接混合物包含20 μL FseI切割之1140桿粒(1400 ng)、4 μL經凝膠純化之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI插入體(100 ng)、2 μL經凝膠純化之MluI-AClef12-ACgta-FseI插入片段(50 ng)、36 μL H2 O、7 μL 10X T4連接酶緩衝液及3 μL T4連接酶(400U/μL)。
生長細菌群落且藉由群落挑選式PCR篩選以測試FseI切割之1140桿粒中之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI片段及MluI-AClef12-ACgta-FseI片段插入。使用以下兩種引子之組合對群落1149-1178實施群落PCR篩選：引子JS90-gta-LP1 (SEQ ID NO: 42)及引子JS91-gta-RP1 (SEQ ID NO: 35)。基於所用引子，陽性PCR結果之靶為約2779 bp。在一替代方式中，使用以下兩種引子之組合對群落1149-1178實施群落PCR篩選：引子JS124-gta-LP10 (SEQ ID NO: 50)及引子JS125-gta-RP10 (SEQ ID NO: 51)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約3631 bp。
提供陽性PCR結果之所得桿粒由此包含FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI多核苷酸插入體(SEQ ID NO: 52)。桿粒 1210-1224
首先將FseI-LacO-p10-LacO-VP2-MluI插入片段及MluI-AClef12-ACgta-FseI插入片段連接至一起以形成FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI多核苷酸插入體，然後作為單一插入體納入FseI切割之1140桿粒中。 藉由組合25 μL FseI切割之1140桿粒、25 μL經凝膠純化之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI多核苷酸插入體、5.5 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在19℃下培育3小時來連接FseI切割之1140桿粒與FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI插入片段。然後凝膠純化所得桿粒。
生長細菌群落且藉由群落挑選式PCR篩選以測試FseI切割之1140桿粒中之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI插入。使用以下之兩種引子之三個組合對群落1210-1224實施群落PCR篩選：(i)引子JS61-VP3-primer2 (SEQ ID NO: 31)及引子JS91-gta-RP1 (SEQ ID NO: 35)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約715 bp；(ii)引子JS124-gta-LP10 (SEQ ID NO: 50)及引子JS92-AAP-RP1 (SEQ ID NO: 32)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約1199 bp；及(iii) JS124-gta-LP10 (SEQ ID NO: 50)及引子JS91-gta-RP1 (SEQ ID NO: 35)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約3262 bp。
群落1210-1224之JS124-JS91 PCR篩選結果展示於圖19中。PCR篩選展示，群落1210-1224 (圖19)在3262 bp附近皆不具有強帶，從而指示在該等細菌群落中之任一者中不可能將FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI插入I- FseI切割之1140桿粒中。 實例15． LacR-Rep-VP3-LacOVP1ICeu -LacOVP2FseI -LacRAvrII 桿粒之產生桿粒 1186 之產生
根據實例14使用桿粒1095 (實例5)代替桿粒1140 (實例6)來產生LacOVP1ICeu -LacOVP2FseI -LacRAvrII 桿粒。使用Cut Smart緩衝液及FseI酶在37℃下於水中消解1095桿粒。凝膠純化產物以提供FseI切割之1095桿粒。視需要重複該過程以收集額外之FseI切割之1095桿粒。
藉由組合25 μL FseI切割之1095桿粒、25 μL經凝膠純化之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI多核苷酸插入體、5.5 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在19℃下培育3小時來連接FseI切割之1095桿粒與FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI多核苷酸插入體。然後凝膠純化所得桿粒。
生長細菌群落且藉由群落挑選式PCR篩選以測試FseI切割之1095桿粒中之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI插入。使用以下之兩種引子之三個組合對群落1180-1194實施群落PCR篩選：(i)引子JS61-VP3-primer2 (SEQ ID NO: 31)及引子JS91-gta-RP1 (SEQ ID NO: 35)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約715 bp；(ii)引子JS124-gta-LP10 (SEQ ID NO: 50)及引子JS92-AAP-RP1 (SEQ ID NO: 32)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約1199 bp；及(iii) JS124-gta-LP10 (SEQ ID NO: 50)及引子JS91-gta-RP1 (SEQ ID NO: 35)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約3262 bp。
群落1180-1194之JS124-JS91 PCR篩選結果展示於圖20A中。PCR篩選展示，群落1186及1191 (圖20A)在3262 bp附近具有強帶，從而指示FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI可能插入該等細菌群落之I- FseI切割之1095桿粒中。
群落1186及1191之JS61-JS91 (715 bp)、JS124-JS92 (1199 bp)及JS124-JS91 (3262 bp) PCR篩選結果展示於圖20B中。PCR篩選展示，群落1186及1191 (圖20B)二者皆在715 bp、1199 bp及3262 bp附近具有強帶，從而強烈指示FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI可能插入該等細菌群落之桿粒1186及1191中。群落1186之PCR篩選帶略強於群落1191之帶。
提供陽性PCR結果之所得桿粒(包含桿粒1186)由此包含FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI多核苷酸插入體(SEQ ID NO: 52)。僅 VP3 構築體 - 質體 1249
製備含有僅VP3 AAV病毒表現構築體之供體質體。製備包含在polH啟動子下之AAV Rep序列(編碼Rep78及Rep52蛋白)及在p10啟動子下僅編碼VP3之AAVPHPN Cap序列的質體1249。藉由以下方式來產生僅VP3序列：提供包含AAVPHPN VP1序列之穿梭質體，且然後使用SmaI及Bsu36I酶消解以自質體中之VP構築體切除VP1及VP2 ORF 5'端。SmaI係鈍切割限制酶且藉由與Q5聚合酶一起培育來鈍填充Bsu36I位點。將所得經切割質體使用T4激酶磷酸化，凝膠純化並使用T4連接酶再次連接在一起。所得質體1249包含在p10啟動子下僅編碼VP3之AAVPHPN Cap序列(SEQ ID NO: 53)。僅 VP3 構築體 - 質體 1259
製備包含以下各項之質體1259：在polH啟動子下之AAV Rep序列(編碼Rep78及Rep52蛋白)、在p10啟動子下僅編碼VP3之AAVPHPN Cap序列(SEQ ID NO: 53)及實例2之opgp64-polH-NLS-LacR區域(SEQ ID NO: 12)。藉由提供質體1249且然後消解具有AvrII (恰在質體1249中之Rep78序列之後之Tn7L序列內側)之質體來製備質體1259。藉由組合22.5 μL AvrII切割之1249質體、22.5 μL經凝膠純化之AvrII-opgp64-polH-NLS-LacR-AvrII多核苷酸插入體、5.0 μL 10X T4連接酶緩衝液及2 μL T4連接酶(400U/μL)且然後在19℃下培育2小時來連接AvrII切割之1249質體與AvrII-opgp64-polH-NLS-LacR-AvrII多核苷酸插入體(SEQ ID NO: 22)。
組合所得質體相與1 μL 3M乙酸鈉及100 μL乙醇。藉由離心收集沈澱之DNA糰粒且再懸浮於100 μL Tris-EDTA緩衝液中。然後將所得經連接質體DNA轉變至經電穿孔NEB 10-β大腸桿菌(New England Biolabs, Inc.)中。
生長細菌群落1250-1259且藉由群落挑選式PCR篩選以測試AvrII切割之1249質體中之AvrII-opgp64-polH-NLS-LacR-AvrII插入。使用以下兩種引子之組合來完成群落PCR篩選：引子JS95-LacR-RP1 (SEQ ID NO: 54)及引子JS42-Rep78-RP_backwards (SEQ ID NO: 55)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約1037 bp。群落1250-1259之JS95-JS42 PCR篩選結果展示於圖21中。PCR篩選展示，群落1253、1256及1259 (圖21)在1037 bp附近具有強帶，從而指示opgp64-polH-NLS-LacR可能插入該等細菌群落之AvrII切割之1249質體中。
質體1259由此包含SEQ ID NO: 56之opgp64-polH-NLS-LacR-Rep-VP3序列。桿粒 1260 之產生
藉由使用標準Tn7輔助質體及業內已知之選殖程序將來自質體1259之opgp64-polH-NLS-LacR-Rep-VP3構築體(SEQ ID NO: 56)納入桿粒1186之Tn7L區域中來產生LacR-Rep-VP3-LacOVP1ICeu -LacOVP2FseI -LacRAvrII 桿粒。然後凝膠純化所得桿粒且生長細菌群落並測試1186桿粒中之opgp64-polH-NLS-LacR-Rep-VP3插入。選擇細菌群落1260以供進一步驗證及測試。
使用以下之兩種引子之三個組合對群落1260實施群落PCR篩選：(i)引子JS95-LacR-RP1 (SEQ ID NO: 54)及引子JS42-Rep78-RP_backwards (SEQ ID NO: 55)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約1037 bp；(ii)引子JS124-gta-LP10 (SEQ ID NO: 50)及引子JS92-AAP-RP1 (SEQ ID NO: 32)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約1199 bp；及(iii)引子JS17-gp64UTR-RP (SEQ ID NO: 30)及引子JS92-AAP-RP1 (SEQ ID NO: 32)，其中基於所用引子陽性PCR結果之靶為約1092 bp。
群落1260之JS95-JS42、JS124-JS92及JS17-JS92 PCR篩選結果展示於圖22中。PCR篩選展示，群落1260 (圖22)在1037 bp (第一管柱)、1199 bp (第二管柱)及1092 bp (第三管柱)附近具有強帶，從而指示opgp64-polH-NLS-LacR-Rep-VP3可能插入該等細菌群落之1186桿粒中。
桿粒1260中之某些組分及編碼區域之圖示呈現於圖23中，包含(i) opgp64-polH-NLS-LacR區域；(ii)在polh啟動子下之Rep編碼區域；(iii)在p10啟動子下之僅VP3編碼區域；(iv) LacOVP1ICeu 區域；(v) LacOVP2FseI 區域；及(vi)在polh啟動子下之LacRAvrII 區域。
在一替代方式中，可藉由將來自質體1249之Rep-VP3構築體納入桿粒1186之Tn7L區域中來產生Rep-VP3-LacOVP1ICeu -LacOVP2FseI -LacRAvrII 桿粒。桿粒 1260 之測試 - IPTG 濃度
使用抗AAV衣殼ECL西方印漬來測試群落1260，其中使用異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)作為誘導元件。在不同IPTG濃度下將來自群落1260之桿粒感染至Sf9細胞中，且對總細胞溶解物採樣並使用西方印漬在感染後48小時及72小時進行分析。結果展示於圖24A (48小時)及圖24B (72小時)中。
圖24A中之結果展示，在感染後48小時，VP1及VP2產生皆由LacR調節。較低濃度之IPTG產生較少VP1/VP2且較高濃度之IPTG產生較多VP1/VP2。VP2產生略低於VP1產生，且VP3濃度在所測試IPTG濃度範圍內一致。
圖24B中之結果展示，在感染後72小時，VP1及VP2產生仍皆由LacR調節。較低濃度之IPTG繼續產生較少VP1/VP2且較高濃度之IPTG產生較多VP1/VP2。VP2產生略低於VP1產生，且VP3濃度在所測試IPTG濃度範圍內一致。
藉由原始像素計數成像軟體(經調節以扣除局部背景)量化來自感染後72小時之抗AAV衣殼ECL西方印漬之結果(圖24B)。結果展示於表5及圖25中。 表5.西方印漬量化結果(扣除局部背景)
IPTG (μM) VP1 VP1:VP3 VP2 VP2:VP3 VP3
0 18 0.18 26 0.25 102
0.2 15 0.16 24 0.26 94
0.4 17 0.17 27 0.27 100
0.8 18 0.19 27 0.29 93
1.6 19 0.21 27 0.30 89
3.1 22 0.24 30 0.32 93
6.3 29 0.28 38 0.37 102
12.5 36 0.36 43 0.43 101
25 39 0.40 44 0.45 97
50 53 0.53 57 0.57 100
100 46 0.49 53 0.57 93
結果展示，VP1:VP3及VP2:VP3比率一直至約50 μM IPTG時穩定增加，且比率值在介於50-100 μM之間之IPTG濃度下穩定於約0.50-0.60。桿粒 1260 之測試 - 細菌細胞計數
在多個細菌細胞計數下使用抗AAV衣殼ECL西方印漬來測試桿粒1260，其中使用異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)作為誘導元件(0.0 μM IPTG及3.3 μM IPTG)。所測試細菌細胞計數為：125個細胞/μL、250個細胞/μL、500個細胞/μL、1000個細胞/μL、2000個細胞/μL及4000個細胞/μL。結果展示於圖26中。
圖26中之結果展示，所測試所有細菌細胞濃度中之VP1及VP2產生皆由LacR調節，其中3.3 μM IPTG試樣所展示之VP1及VP2產生大於0.0 μM IPTG試樣。VP3產生在3.3 μM IPTG試樣與0.0 μM IPTG試樣之間一致。 實例16.使用ITR-GFP之桿粒1260共感染測試
使用利用ITR-GFP桿粒(桿粒449)作為酬載Bac共感染之桿粒1260作為表現Bac，實施研究以評估IPTG調節對AAV產生之效應。桿粒449包含在酬載區中包含編碼GFP之核苷酸序列之ITR對ITR酬載構築體。使用桿粒420 (包括在p10啟動子下編碼VP1、VP2及VP3之AAVPHPN Cap序列)作為參考。共感染實驗 A
組合40 ml儲備sf9 昆蟲細胞混合物與110 ml ESF培養基以提供約2.0 × 106 個細胞/ml之細胞濃度。然後將5 ml體積之Sf9 細胞分配至50 ml透氣管中且置於28℃及235 rpm下。根據表6將一定濃度之IPTG誘導元件添加至每一管中。然後使用納入桿粒1260之表現BIIC將納入桿粒499之酬載BIIC共感染至每一管中(將10 µl體積之每一類BIIC添加至5 ml體積之Sf9 細胞中)。亦製備類似試樣以供使用納入桿粒420之表現BIIC (參考)共感染納入桿粒499之酬載BIIC。 表6.共感染實驗1稀釋液
試樣 IPTG 1X (μM) IPTG 100X (μM) 25 mM IPTG 體積 (µl) 培養基體積 (µl)
1 1.7 167 7 993
2 2.2 223 9 991
3 3.0 297 12 988
4 4.0 396 16 984
5 5.3 528 21 979
6 7.0 704 28 972
7 9.4 939 38 962
8 12.5 1251 50 950
9 16.7 1669 67 933
10 22.2 2225 89 911
11 29.7 2966 119 881
12 39.6 3955 158 842
13 52.7 5273 211 789
14 70.3 7031 281 719
15 93.8 9375 375 625
16 125 12500 500 500
17 250 25000 1000 0
在感染後48小時及感染後72小時對細胞採樣。藉由西方印漬來分析所得細胞溶解物，其中結果展示於圖28A及圖28B中(影像泳道正規化至VP3)。藉由原始像素計數成像軟體(經調節以扣除局部背景)量化西方印漬結果(圖28A)，其中結果展示於圖28C中。
結果展示，添加IPTG能夠誘導VP1及VP2之額外表現，但整體VP表現因桿粒449之快速複製(使得Bac1260:Bac449比率發生改變)而有限。共感染實驗 B
擴展共感染實驗A之一般方案以包含多個表現BIIC對酬載BIIC比率。BIIC比率條件展示於表7中。 表7.表現BIIC對酬載BIIC比率
BIIC 比率號 靶比率 BIIC 1260 (μl) BIIC 449 (μl) 培養基體積 (µl)
1 16:1 100 6 894
2 8:1 100 13 888
3 4:1 100 25 875
4 2:1 100 50 850
5 1:1 100 100 800
6 1:2 100 200 700
7 1:4 100 400 500
8 1:8 100 800 100
使用下列IPTG濃度測試每一BIIC比率條件：0.00 μM、1.67 μM、2.97 μM、5.28 μM、9.39 μM、17.0 μM、40.0 μM及94.0 μM。在感染後90小時對細胞採樣。藉由西方印漬來分析所得細胞溶解物，其中0.00 μM及94.0 μM試樣之結果展示於圖29中。結果展示，在所有BIIC比率試樣中添加IPTG皆能夠誘導VP1及VP2之額外表現，且整體VP表現及LacR產生因較高濃度之桿粒449而有限。共感染實驗 C
再使用共感染實驗A之一般方案且加以調節，包含使用與100 ml ESF培養基組合之35 ml儲備sf9 昆蟲細胞混合物以提供約2.3 × 106 個細胞/ml之細胞濃度。然後使用138 μl (0.1 MOI)納入桿粒1260之表現BIIC或118 μl (0.1 MOI)納入桿粒420之表現BIIC將577 μl (0.3 MOI)納入桿粒499之酬載BIIC共感染至每一管中。
使用下列IPTG濃度測試每一BIIC條件：0.0 μM、1.0 μM、2.0 μM、3.0 μM、4.0 μM、5.0 μM、7.0 μM、10.0 μM、12.0 μM、15.0 μM、25.0 μM、30.0 μM、40.0 μM、50.0 μM、100.0 μM及200.0 μM。在感染後90小時對細胞採樣。藉由西方印漬來分析所得細胞溶解物，其中Cap表現結果展示於圖30A中，Rep表現結果展示於圖30B中，且GP64表現結果展示於圖30C中。結果展示，在所有BIIC比率試樣及IPTG濃度中，添加IPTG皆能夠誘導VP1及VP2自桿粒1260之額外表現，其中Rep產生係一致的且GP64產生有所減少。亦分析所得細胞溶解物之AAV效價(qPCR)，其中結果展示於表8中。 表8.來自共感染實驗C之細胞溶解物之AAV效價
IPTG (µM) AAV 效價 (×1010 vg/ml)
0 uM 6.63
1 uM 6.63
2 uM 6.66
3 uM 6.41
4 uM 6.17
5 uM 6.11
7 uM 5.77
10 uM 5.48
12 uM 5.15
15 uM 4.49
25 uM 4.10
30 uM 3.92
40 uM 3.63
50 uM 3.53
100 uM 3.10
200 uM 2.86
參考 3.1
然後使用碘克沙醇純化自所得細胞溶解物分離AAV衣殼(參見Buclez等人，Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 3:16035 (Jan 2016)，其內容中與AAV顆粒之碘克沙醇純化相關之全部內容以引用方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)。將所得碘克沙醇梯度分離物緩衝液交換至PBS F-68緩衝液(PBS, 0.001% Pluronic-F68, pH 7.4)中並在Vivaspin 20管柱(20 min, 4000x g)上濃縮。使用銀染色/SDS-PAGE分析所得試樣，其中結果展示於圖31中。亦分析所得碘克沙醇淨化試樣之AAV效價(qPCR)，其中結果展示於表9中。
亦將50 μl等分試樣添加至200 ul覆蓋於96孔形式中之50%鋪滿性HEK 293細胞上之DMEM中。在3天後記錄細胞之相對螢光，其中結果展示於圖32A (對於0.0 μM IPTG)、圖32B (對於5.0 μM)、圖32C (對於15.0 μM)及圖32D (對於3.0 μM)中。對每孔之GFP細胞進行計數，其中結果亦展示於表9中。計算相對於0 uM IPTG之功效(GFP細胞/孔除以AAV效價，正規化至0 uM IPTG)。 表9.碘克沙醇淨化AAV之AAV效價及GFP細胞計數
IPTG (µM) AAV 效價 (×1011 vg/ml) GFP ( 細胞 / 孔 ) 相對功效
0 uM 3.54 79 100.0%
1 uM 4.21 104 110.6%
2 uM 4.69 148 141.1%
3 uM 4.51 85 84.5%
4 uM 2.98 - -
5 uM 5.00 312 279.6%
7 uM 3.88 97 112.0%
10 uM 1.04 - -
12 uM 4.18 446 478.1%
15 uM 3.35 587 785.2%
25 uM 3.10 224 323.8%
30 uM 3.31 7 9.5%
40 uM 0.745 - -
50 uM 0.585 - -
100 uM 1.73 - -
200 uM 0.682 - -
參考 1.50 - -
結果展示，增加IPTG之添加會降低AAV顆粒之濃度(qPCR效價)。然而，結果亦展示，12-25 µM IPTG之間之功效(亦即GFP表現)最強，且在12.5-22.5 µM IPTG之間尤其強，其中峰位於15 µM IPTG下。共感染實驗 D
再使用共感染實驗C之一般方案且加以調節，包含使用在100 ml ESF培養基中製得之sf9 昆蟲細胞儲備液且細胞濃度為約2.5 × 107 個細胞/ml。然後使用175 μl (0.1 MOI)納入桿粒1260之表現BIIC或149 μl (0.1 MOI)納入桿粒420之表現BIIC將727 μl (0.3 MOI)納入桿粒499之酬載BIIC共感染至每一管中。
使用下列IPTG濃度測試每一BIIC條件：0.0 μM、1.0 μM、2.0 μM、4.0 μM、6.0 μM、8.0 μM、10.0 μM、12.0 μM、14.0 μM、16.0 μM、18.0 μM、22.0 μM、28.0 μM、36.0 μM、48.0 μM及80.0 μM。在感染後108小時對細胞採樣。藉由西方印漬來分析所得細胞溶解物之Cap表現(圖33)。結果展示，在所有BIIC比率試樣中添加IPTG皆能夠誘導VP1及VP2自桿粒1260之額外表現。亦分析所得細胞溶解物之AAV效價(qPCR)，其中結果展示於表10中。 表10.來自共感染實驗D之細胞溶解物之AAV效價
IPTG (µM) AAV 效價 (×1011 vg/ml)
0 uM 1.39
1 uM 1.12
2 uM 1.19
4 uM 1.18
6 uM 1.05
8 uM 1.08
10 uM 1.02
12 uM 1.02
14 uM 0.900
16 uM 0.988
18 uM 0.935
22 uM 0.914
28 uM 0.813
36 uM 0.830
48 uM 0.684
80 uM 0.603
參考 0.818
結果展示，增加IPTG之添加會降低AAV顆粒之濃度(qPCR效價)，但共感染實驗D之AAV效價結果高於共感染實驗C之相應AAV效價結果。共感染實驗 E
再使用共感染實驗D之一般方案且加以調節，包含使用在700 ml ESF培養基中製得之sf9 昆蟲細胞儲備液且細胞濃度為約8.15 × 106 個細胞/ml。然後使用221 μl (0.1 MOI)納入桿粒1260之表現BIIC或188 μl (0.1 MOI)納入桿粒420之表現BIIC將920 μl (0.3 MOI)納入桿粒499之酬載BIIC共感染至每一管中。
使用下列IPTG濃度測試每一BIIC條件：0.0 μM、0.1 μM、0.3 μM、1.0 μM、2.0 μM、3.0 μM、4.0 μM、5.0 μM、6.0 μM、8.0 μM、10.0 μM、20.0 μM、30.0 μM、40.0 μM、50.0 μM及100.0 μM。分析所得細胞溶解物之AAV效價(qPCR及ddPCR)，其中結果展示於表11中。 表11.來自共感染實驗E之細胞溶解物之AAV效價
IPTG (µM) AAV 效價 - qPCR (×1011 vg/ml) AAV 效價 - ddPCR (×1011 vg/ml)
0 uM 1.46 2.25
0.1 uM 1.44 2.22
0.3 uM 1.49 2.25
1 uM 1.56 2.32
2 uM 1.75 2.62
3 uM 1.8 2.58
4 uM 1.64 2.37
5 uM 1.60 2.45
6 uM 1.52 2.29
8 uM 1.49 2.23
10 uM 1.48 2.25
20 uM 1.33 1.98
30 uM 1.23 1.89
40 uM 1.17 1.74
50 uM 1.06 1.57
100 uM 0.917 1.31
參考 .0711 0.803
結果展示，在共感染實驗E中，增加IPTG之添加(直至10.0 μM)會產生相對穩定之AAV效價，且AAV顆粒濃度在IPTG濃度高於10.0 μM時穩定降低。 實例17.使用ITR-GFP之桿粒1260之時程研究
使用利用ITR-GFP桿粒(桿粒449)作為酬載Bac共感染之桿粒1260作為表現Bac，實施研究以評估IPTG調節及感染後收穫時刻對AAV產生之效應。桿粒449包含在酬載區中包含編碼GFP之核苷酸序列之ITR對ITR酬載構築體。使用桿粒420 (包括在p10啟動子下編碼VP1、VP2及VP3之AAVPHPN Cap序列)作為參考。
在48孔板中之ESF培養基及TCID50中以約1.4×106 個細胞/孔接種sf9 昆蟲細胞。使用納入桿粒499之酬載BIIC (10 pfu/細胞MOI)及納入桿粒1260之表現BIIC(10 pfu/細胞MOI)共感染兩個管柱(16個孔)；使用納入桿粒499之酬載BIIC (10 pfu/細胞MOI)及納入桿粒420之表現BIIC (10 pfu/細胞MOI)共感染兩個管柱(16個孔)；且僅使用納入桿粒499之酬載BIIC (10 pfu/細胞MOI)感染兩個管柱(16個孔)。然後將IPTG添加至交替管柱(在細胞中100 uM IPTG)中，其中並不將IPTG添加至剩餘交替管柱中。
然後下列感染後時間(感染後小時數，hpi)收穫板之每一列(一種細胞/每一管柱)：5 hpi、17 hpi、24 hpi、31 hpi、49 hpi、73 hpi、87 hpi及101 hpi。藉由西方印漬來分析所得試樣，其中Cap表現結果展示於圖34A中，Rep表現結果展示於圖34B中，且GP64表現結果展示於圖34C中。結果展示，49-87 hpi之間之Cap、Rep及GP64產生最強，且在73-87 hpi之間尤其強。
自本發明之特定實施例之下列說明將明瞭前述及其他目標、特徵及優點，如在附圖中所圖解說明。該等圖未必係按比例或廣泛性的，而係著重於圖解說明本發明之各個實施例之原理。
圖1呈現展示polH-NLS-LacR插入體與polH-NLS-LacR-pUC57質體之分離之凝膠管柱。
圖2A、圖2B、圖2C、圖2D、圖2E及圖2F呈現展示針對AvrII切割桿粒中之LacR插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖3A呈現展示針對AvrII切割桿粒中之正向LacR插入之REN片段分離之凝膠管柱。圖3B呈現展示針對AvrII切割桿粒中之反向LacR插入之REN片段分離之凝膠管柱。
圖4A及圖4B呈現展示針對AvrII切割桿粒中之LacR插入方向之REN消解分析結果之凝膠管柱。
圖5呈現展示LacO-p10-LacO-VP1插入體與LacO-p10-LacO-VP1-pUC57質體及pUC57片段之分離之凝膠管柱。
圖6A、圖6B及圖6C呈現展示針對I-CeuI切割之639桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖7A及圖7B呈現展示群落1095中之LacR抑制之西方印漬(Western Blot)分析結果之凝膠管柱。
圖8A及圖8B呈現展示群落1140中之LacR抑制之西方印漬分析結果之凝膠管柱。
圖9呈現展示經由PCR擴增自LacO-p10-LacO-VP1-pUC57質體成功產生LacO-p10-LacO-VP1-FseI插入體之凝膠管柱。
圖10呈現展示針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖11呈現展示針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖12呈現展示FseI切割之601桿粒及LacO-p10-LacO-VP2插入體連接成組合LacO-p10-LacO-VP2 601桿粒之凝膠管柱。
圖13呈現展示I-CeuI/FseI切割之601桿粒與組合LacO-p10-LacO-VP1/LacO-p10-LacO-VP2 601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP1插入體及LacO-p10-LacO-VP2插入體之連接之凝膠管柱。
圖14A及圖14B呈現展示針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP2插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖15A及圖15B呈現展示針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP2插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖16A及圖16B呈現展示針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP2插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖17呈現展示針對FseI切割之601桿粒中之LacO-p10-LacO-VP2插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖18呈現展示經由PCR擴增自桿粒1140成功產生JS142-JS143片段(泳道1)及經由PCR擴增自LacO-p10-LacO-VP2-pUC57質體成功產生JS134-JS135片段(泳道2)之凝膠管柱。
圖19呈現展示針對FseI切割之1140桿粒中之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖20A呈現展示針對FseI切割之1095桿粒中之FseI-LacO-p10-LacO-VP2-AClef12-ACgta-FseI插入之群落PCR篩選結果之凝膠管柱。圖20B呈現展示群落1186及1191之JS61-JS91 (715 bp)、JS124-JS92 (1199 bp)及JS124-JS91 (3262 bp) PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖21呈現展示針對AvrII切割之1249質體中之opgp64-polH-NLS-LacR插入之群落PCR篩選結果的凝膠管柱。
圖22呈現展示群落1260之JS95-JS42 (1037 bp)、JS124-JS92 (1199 bp)及JS17-JS92 (1092 bp) PCR篩選結果之凝膠管柱。
圖23呈現桿粒1260中之某些組分之圖示。
圖24A及圖24B呈現展示在感染後48小時(圖24A)及72小時(圖24B)群落1260中之LacR抑制之西方印漬分析結果之凝膠管柱。
圖25呈現展示圖24B中所展示西方印漬結果之VP1:VP3及VP2:VP3相對量化結果(原始像素計數成像軟體，經調節以扣除局部背景)之線形圖。
圖26呈現展示在使用不同VPC細胞濃度下針對群落1260中之LacR抑制之抗AAV衣殼ECL西方印漬分析結果之凝膠管柱。
圖27A呈現本發明之轉錄調節系統之圖示，該轉錄調節系統在p10啟動子之每一側包含結合至調節結合區(例如LacO核苷酸序列)之可誘導調節元件(例如同源四聚體LacR蛋白)，由此將p10啟動子約束至轉錄抑制環中。
圖27B呈現本發明之轉錄調節系統之圖示，該轉錄調節系統包含結合至可誘導調節元件(例如同源四聚體LacR蛋白)之誘導元件(例如IPTG)，由此防止調節元件結合至調節結合區(例如LacO)，從而可自p10蛋白進行轉錄。
圖28A及圖28B呈現展示在共感染實驗A (影像泳道正規化至VP3)中共感染桿粒1260與GFP桿粒449之西方印漬分析結果之凝膠管柱。圖28C呈現展示圖28A中所展示西方印漬結果之VP1、VP2及VP3量化結果(原始像素計數成像軟體，經調節以扣除局部背景)之線形圖。
圖29呈現展示在共感染實驗B中使用不同表現BIIC對酬載BIIC比率共感染桿粒1260與GFP桿粒449之西方印漬分析結果之凝膠管柱。
圖30A、圖30B及圖30C呈現展示在共感染實驗C中共感染桿粒1260/桿粒420與GFP桿粒449之西方印漬分析結果之凝膠管柱。 圖30A展示AAV衣殼蛋白之抗Cap西方印漬；圖30B展示AAV複製酶蛋白之抗Rep西方印漬；圖30C展示BV套膜蛋白之抗GP64西方印漬。
圖31呈現展示在共感染實驗C中藉由共感染桿粒1260與GFP桿粒449所分離之AAV顆粒之銀染色/SDS-PAGE分析結果之凝膠管柱。
圖32A、圖32B、圖32C及圖32D呈現在共感染實驗C中藉由共感染桿粒1260與GFP桿粒449所產生之AAV顆粒之HEK細胞中之非正規化轉導功效分析的影像。
圖33呈現展示在共感染實驗D中共感染桿粒1260與GFP桿粒449之抗Cap西方印漬分析結果之凝膠管柱。
圖34A、圖34B及圖34C呈現展示在感染後收穫時刻之時程研究中共感染桿粒1260/桿粒420與GFP桿粒449之西方印漬分析結果之凝膠管柱。圖34A展示AAV衣殼蛋白之抗Cap西方印漬；圖34B展示AAV複製酶蛋白之抗Rep西方印漬；圖34C展示BV套膜蛋白之抗GP64西方印漬。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
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Figure 12_A0101_SEQ_0039

Claims (52)

  1. 一種轉錄調節系統，其包括一或多個調節元件、一或多個調節結合序列及一或多個誘導元件。
  2. 如請求項1之轉錄調節系統，其中該一或多個調節元件具有結合至該一或多個調節結合序列之高親和力。
  3. 如請求項1之轉錄調節系統，其中該轉錄調節系統包括兩個調節結合序列，且其中該一或多個調節元件具有同時結合至兩個調節結合序列之高親和力。
  4. 如請求項3之轉錄調節系統，其中該一或多個調節元件與該兩個調節結合序列之同時結合造成在該兩個調節結合序列之間之核苷酸序列中形成環結構。
  5. 如請求項2之轉錄調節系統，其中該一或多個誘導元件可結合至該一或多個調節元件，由此減小該等調節元件結合至該一或多個調節結合序列之親和力。
  6. 如請求項5之轉錄調節系統，其中該一或多個誘導元件與該一或多個調節元件之結合在該調節元件中引起構形變化，由此減小該調節元件結合至該一或多個調節結合序列之親和力。
  7. 如請求項1之轉錄調節系統，其中至少一個調節元件係選自野生型Lac抑制蛋白(wLacR)或經改造Lac抑制蛋白(eLacr)之Lac抑制蛋白(LacR)。
  8. 如請求項7之轉錄調節系統，其中至少一個調節元件係經改造Lac抑制蛋白(eLacr)。
  9. 如請求項8之轉錄調節系統，其中該經改造LacR蛋白係由包括選自SEQ ID NO: 2之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 2至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列之多核苷酸編碼。
  10. 如請求項7之轉錄調節系統，其中至少一個調節結合序列係Lac操縱子(LacO)序列。
  11. 如請求項10之轉錄調節系統，其中至少一個調節結合序列係包括選自SEQ ID NO: 4之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 4至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列之Lac操縱子(LacO)序列。
  12. 如請求項10之轉錄調節系統，其中至少一個誘導元件係選自乳糖、異乳糖及異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)中之任一者；較佳地其中至少一個誘導元件係IPTG。
  13. 一種病毒表現構築體，其中該病毒表現構築體包括第一蛋白質編碼區及第一調節區；其中該病毒表現構築體之第一蛋白質編碼區包括編碼第一蛋白質之核苷酸序列及第一表現控制序列可操作地連接至該編碼第一蛋白質之核苷酸序列；其中該第一表現控制序列包括調節該編碼第一蛋白質之核苷酸序列轉錄之啟動子，且亦包括一或多個調節結合序列；且其中該病毒表現構築體之第一調節區包括編碼一或多個調節元件之第一調節核苷酸序列。
  14. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該第一調節區包括選自SEQ ID NO: 5之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 5至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  15. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該第一調節區包括選自SEQ ID NO: 10之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 10至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  16. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該第一調節區包括選自SEQ ID NO: 11之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 11至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  17. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該病毒表現構築體包括第二調節區，其含有第二調節核苷酸序列，其中該第二調節核苷酸序列編碼一或多個調節元件。
  18. 如請求項17之病毒表現構築體，其中該第二調節區包括選自SEQ ID NO: 12之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 12至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  19. 如請求項17之病毒表現構築體，其中該第二調節區包括選自SEQ ID NO: 22之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 22至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  20. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該第一蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 25之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 25至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  21. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該第一蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 28之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 28至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  22. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該第一表現控制序列之調節結合序列係自第一表現控制序列之啟動子之一端起5至100個核苷酸內。
  23. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該第一表現控制序列包括第一調節結合序列，其係在該第一表現控制序列之啟動子之5'端上游之5至100個核苷酸；及第二調節結合序列，其係在第一表現控制序列之啟動子之3'端下游之5至100個核苷酸。
  24. 如請求項23之病毒表現構築體，其中該第一調節結合序列與該第二調節結合序列之間具有介於150至300個核苷酸之間、150至250個核苷酸之間、150至225個核苷酸之間或150至210個核苷酸之間之空間間隔，如自每一調節結合序列之中心核苷酸量測。
  25. 如請求項13之病毒表現構築體，其中由該調節核苷酸序列編碼之調節元件結合至該第一表現控制序列中之一或多個調節結合序列，且抑制或減小該編碼第一蛋白質之核苷酸序列自該第一表現控制序列中之啟動子之轉錄。
  26. 如請求項13之病毒表現構築體，其中由該調節核苷酸序列編碼之調節元件結合至該第一表現控制序列中之第一調節結合序列及第二調節結合序列，從而形成環繞該第一表現控制序列中之啟動子之環結構，且由此抑制或減小該編碼第一蛋白質之核苷酸序列自該第一表現控制序列中之啟動子之轉錄。
  27. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該編碼第一蛋白質之核苷酸序列編碼選自VP1、僅VP1、僅VP2、僅VP3或其組合之結構性AAV衣殼蛋白。
  28. 如請求項27之病毒表現構築體，其中該編碼第一蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP1。
  29. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該病毒表現構築體包括第二蛋白質編碼區，該第二蛋白質編碼區包括編碼第二蛋白質之核苷酸序列及第二表現控制序列可操作地連接至該編碼第二蛋白質之核苷酸序列；其中該第二表現控制序列包括調節該編碼第二蛋白質之核苷酸序列之轉錄之啟動子，且亦包括一或多個調節結合序列。
  30. 如請求項29之病毒表現構築體，其中該第二蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 41之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 41至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  31. 如請求項29之病毒表現構築體，其中該第二蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 43之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 43至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  32. 如請求項29之病毒表現構築體，其中該第二蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 44之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 44至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  33. 如請求項29之病毒表現構築體，其中該第二蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 52之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 52至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  34. 如請求項29之病毒表現構築體，其中該編碼第二蛋白質之核苷酸序列編碼選自VP1、僅VP1、僅VP2、僅VP3或其組合之結構性AAV衣殼蛋白。
  35. 如請求項34之病毒表現構築體，其中該編碼第一蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP1，且其中該編碼第二蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP2。
  36. 如請求項34之病毒表現構築體，其中該編碼第一蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP1，且其中該編碼第二蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP3。
  37. 如請求項29之病毒表現構築體，其中該病毒表現構築體包括第三蛋白質編碼區，該第三蛋白質編碼區包括編碼第三蛋白質之核苷酸序列及第三表現控制序列可操作地連接至該編碼第三蛋白質之核苷酸序列；其中該第三表現控制序列包括調節該編碼第三蛋白質之核苷酸序列之轉錄之啟動子。
  38. 如請求項37之病毒表現構築體，其中該第三蛋白質編碼區包括選自SEQ ID NO: 53之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 53至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  39. 如請求項37之病毒表現構築體，其中該編碼第三蛋白質之核苷酸序列編碼選自VP1、僅VP1、僅VP2、僅VP3或其組合之結構性AAV衣殼蛋白。
  40. 如請求項39之病毒表現構築體，其中該編碼第一蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP1，其中該編碼第二蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP2，且其中該編碼第三蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP3。
  41. 如請求項39之病毒表現構築體，其中該編碼第一蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP1，其中該編碼第二蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP3，且其中該編碼第三蛋白質之核苷酸序列僅編碼VP2。
  42. 如請求項13之病毒表現構築體，其中該病毒表現構築體包括選自SEQ ID NO: 56之核苷酸序列或與SEQ ID NO: 56至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之核苷酸序列。
  43. 一種病毒產生細胞，其包括如請求項13至42中任一項之病毒表現構築體；較佳地其中該病毒產生細胞包括昆蟲細胞；更佳地其中該病毒產生細胞包括sf9昆蟲細胞。
  44. 一種病毒產生系統，其包括如請求項13至42中任一項之病毒表現構築體及如請求項1至12中任一項之轉錄調節系統。
  45. 如請求項44之病毒產生系統，其中該轉錄調節系統之一或多個調節結合序列包括於該病毒表現構築體中。
  46. 如請求項44之病毒產生系統，其中該轉錄調節系統之一或多個調節元件係由該病毒表現構築體中所包括之調節核苷酸序列編碼。
  47. 如請求項44之病毒產生系統，其中該轉錄調節系統之一或多個調節結合序列包括於該病毒表現構築體中；且其中該轉錄調節系統之一或多個調節元件係由該病毒表現構築體中所包括之調節核苷酸序列編碼。
  48. 如請求項47之病毒產生系統，其中一或多個誘導元件結合至該一或多個調節元件且減小該等調節元件結合至該病毒表現構築體中之一或多個調節結合序列之親和力。
  49. 如請求項48之病毒產生系統，其中該病毒表現構築體中之一或多個編碼蛋白質之核苷酸序列之轉錄程度隨該病毒產生系統內該等誘導元件之濃度成比例地增加或降低。
  50. 如請求項47之病毒產生系統，其中該病毒表現構築體中之一或多個編碼蛋白質之核苷酸序列編碼一或多種結構性AAV衣殼蛋白；其中一或多個誘導元件以靶濃度存在於該病毒產生系統中；且其中該病毒產生系統內之誘導元件之靶濃度造成產生VP1:VP2:VP3蛋白質比率為0.5至2:0.5至2:10之AAV衣殼。
  51. 如請求項50之病毒產生系統，其中該病毒產生系統內之誘導元件之靶濃度造成產生VP1:VP2:VP3蛋白質比率為1至2:1至2:10之AAV衣殼。
  52. 如請求項47之病毒產生系統，其中誘導元件係以介於約1.0 µM至約100 µM之間之濃度存在於該病毒產生系統中；較佳地其中該誘導元件係以介於約1.0 µM至約35 µM之間之濃度存在。
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