CN111068072A - 用于治疗和预防黄斑变性的组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗和预防黄斑变性的组合物及方法。本发明公开了用于治疗黄斑变性的组合物和方法。此方法利用基因递送可溶性Flt‑1受体、以及包含可溶性Flt‑1受体的融合蛋白至人眼睛。
Description
本申请是申请日为2015年02月06日、中国申请号为201580017612.4、发明名称为“用于治疗和预防黄斑变性的组合物及方法”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明一般涉及治疗和预防人的黄斑变性的方法。具体而言，本发明涉及使用血管内皮生长因子(VEGF)受体Flt-1治疗或预防黄斑变性的方法。
发明概述
年龄相关的黄斑变性(AMD)是老年人的中枢性不可逆失明的主要原因。AMD的早期临床表达涉及视网膜下的碎片积累(玻璃疣(drusen))。进展发生具有显著变性和黄斑细胞萎缩的地图样萎缩(geographic atrophy,GA)，或具有发生在疾病过程末期的脉络膜新生血管形成的新生血管性AMD(nAMD)的患者，尝试拯救变性中的视网膜。当黄斑视网膜色素上皮(RPE)变性后，光感受器萎缩，则造成失明。
发病取决于老化、环境和遗传风险因子，但造成疾病发作的分子机制大部分仍是未知的。最突出的已知遗传因素是位于免疫调节性补体因子H (CFH)基因内的错义突变。
与眼部病症有关的病理性新生血管形成，例如nAMD，是由血管内皮生长因子(VEGF)的上调所介导的。使用抗体、可溶性受体或适体来抑制VEGF 已证明为管控这些疾病的有前景的临床方法。在已实现了AMD管控的深刻改进的同时，目前的抗-VEGF拮抗剂需要重复的玻璃体内给药，其对于患者和治疗的医师二者可能都是负担。
因此，仍然需要开发负担较低且具商业利益的治疗人黄斑变性的方法。
本发明基于可溶性的Flt-1受体能治疗人受试者中的黄斑变性的发现。当用rAAV-介导的基因递送来递送此可溶性受体时，可在广泛范围的剂量观察到治疗结果。高剂量是可耐受的并产生治疗益处。此外，本发明人已证明，玻璃体内递送单剂低如2x 108载体基因组(vg)以及2x 1010vg，在注射后2个月产生视网膜下液和视网膜内液的显著降低。
因此，在一个实施方案中，本发明要求保护一种治疗人受试者中的黄斑变性的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV) 病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV)病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1或Flt-1)的域，其中将约1x 107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至眼睛。
在进一步的实施方案中，本发明要求保护一种治疗人受试者中的黄斑水肿的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV) 病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV)病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1或Flt-1)的域，其中将约1x 107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至眼睛。
在上述方法的实施方案中，将约1x 107至约1x 1012；1x 108至约1x 1012；约1x 108至约1x 1011；约1x 108至约1x 1010；约1x 108至约1x 109；约2x 107至约2x 1012；约2x 108至约2x 1012；约2x 108至约2x 1011；约2x 108至约2x 1010；约2x 108至约2x 109；2x 109至约2x1010；约1x 1010至约1x 1013；约1 x 1010至约1x 1012；约1x 1010至约1x 1011；约2x 1010至约1x 1013；2x 1010至约1x 1012；约2x 1010至约2x 1012；约2x 1010至约1x 1011；或约2x 1010至约2x 1011个rAAV病毒体施用于眼睛。在一些实施方案中，将约1x 107、约 2x107、约6x 107、约1x 108、约2x108、约6x 108、约1x 109、约2x109、约6x 109、约1x 1010、约2x1010、约6x 1010、约1x 1011、约2x1011、约6x 1011、约 1x 1012、约2x1012、约6x 1012、或约1x 1013个rAAV病毒体施用于眼睛。
在另外的实施方案中，本发明要求保护一种治疗人受试者中的黄斑变性的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV)病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至眼睛。
在另外的实施方案中，本发明要求保护一种治疗人受试者中的黄斑水肿的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV)病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至眼睛。
在上述任何方法中，所述组合物还可包含眼科上可接受的介质(vehicle)。
在上述方法的另外的实施方案中，对眼睛施用rAAV病毒体的单一玻璃体内注射。
在进一步的实施方案中，所述可溶性蛋白包含：
(a)Flt-1的至少一个域；
(b)衍生自免疫球蛋白重链的多聚化域；及
(c)连接(a)和(b)的长度为5-25个氨基酸残基的接头，
其中当可溶性蛋白表达时，产生可溶性蛋白的多聚体。
在任何上述的方法中，所述至少一个域包括Flt-1的域2。
在进一步的实施方案中，所述多聚体是同二聚体。
在另外的实施方案中，所述多聚化域包含IgG的Fc区或其活性片段。
在上述方法的一些实施方案中，所述多聚化域包含IgG的CH3域或其活性片段。
在进一步的实施方案中，所述多聚化域来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，如来自IgG1重链的恒定区。
在另外的实施方案中，所述接头选自下组：
gly9(SEQ ID NO:1)；
glu9(SEQ ID NO:2)；
ser9(SEQ ID NO:3)；
gly5cyspro2cys(SEQ ID NO:4)；
(gly4ser)3(SEQ ID NO:5)；
SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:6)；
ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:7)；
GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ ID NO:8)；和
Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:9)。
在其他的实施方案中，可溶性蛋白系具有式X-Y-Z，其中X包含Flt-1的 IgG样域2，其中Y是Gly9(SEQ ID NO:1)，且其中Z是IgG Fc区或IgG CH3区。
在另外的实施方案中，所述多聚化域是人源化的。
在进一步的的实施方案中，可溶性蛋白包含选自下组的氨基酸序列：(a) 图2A-2B中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)；(b)图6中所示的氨基酸序列 (SEQ ID NO:15)；(c)图8中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)；(d)图12中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)；及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的与其具有至少90％序列同一性的变体。
在任何上述用于治疗黄斑变性的方法的实施方案中，所述黄斑变性是年龄相关的黄斑变性(AMD)，如湿性AMD。
在上述方法之另外的实施方案中，所述方法包括降低眼内压、视网膜厚度、视网膜下液、视网膜内液等。
在任何上述方法之另外的实施方案中，所述rAAV病毒体衍生自选自如下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12。
在任何上述方法的实施方案中，将约2x 108至低于2x 1010个rAAV病毒体递送至眼睛，如多至约2x 108个rAAV病毒体，或多至约2x 109个rAAV病毒体。
本发明涉及下述实施方案。
1.一种治疗人受试者中黄斑变性的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV) 病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将约1x 107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
2.实施方案1的方法，其中所述方法包括降低眼内压、视网膜厚度、视网膜下液或视网膜内液。
3.一种治疗人受试者中黄斑水肿的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV) 病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将约1x 107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
4.实施方案3的方法，其中所述方法包括降低眼内压、视网膜厚度、视网膜下液或视网膜内液。
5.实施方案1-4中任一项的方法，其中将约1x 107至约1x 1012；1x 108至约1x1012；约1x 108至约1x 1011；约1x 108至约1x 1010；约1x 108至约1x 109；约2x 107至约2x1012；约2x 108至约2x 1012；约2x 108至约2x 1011；约 2x 108至约2x 1010；约2x 108至约2x109；2x 109至约2x 1010；约1x 1010至约1x 1013；约1x 1010至约1x 1012；约1x 1010至约1x1011；约2x 1010至约1x 1013；2x 1010至约1x 1012；约2x 1010至约2x 1012；约2x 1010至约1x1011；或约2x 1010至约2x 1011个rAAV病毒体施用于所述眼睛。
6.实施方案1-5中任一项的方法，其中将约1x 107、约2x107、约6x 107、约1x 108、约2x108、约6x 108、约1x 109、约2x109、约6x 109、约1x 1010、约2x1010、约6x 1010、约1x1011、约2x1011、约6x 1011、约1x 1012、约2x1012、约6x 1012、或约1x 1013个rAAV病毒体施用于所述眼睛。
7.一种治疗人受试者中黄斑变性的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV) 病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
8.实施方案7的方法，其中所述方法包括降低眼内压、视网膜厚度、视网膜下液或视网膜内液。
9.一种治疗人受试者中黄斑水肿的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV) 病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
10.实施方案9的方法，其中该方法包括降低眼内压、视网膜厚度、视网膜下液或视网膜内液。
11.实施方案7-10中任一项的方法，其中将约2x 108至低于2x 1010个 rAAV病毒体递送至所述眼睛。
12.实施方案7-10中任一项的方法，其中将多至约2x 108个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
13.实施方案7-10中任一项的方法，其中将多至约2x 109个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
14.实施方案1-13中任一项的方法，其中所述组合物还包含眼科上可接受的介质。
15.实施方案1-14中任一项的方法，其中对所述眼睛施用rAAV病毒体的单一玻璃体内注射。
16.实施方案1-15中任一项的方法，其中所述可溶性蛋白包含：
(a)Flt-1的至少一个域；
(b)衍生自免疫球蛋白重链的多聚化域；及
(c)连接(a)和(b)的长度为5-25个氨基酸残基的接头，
其中当可溶性蛋白表达时，产生可溶性蛋白的多聚体。
17.实施方案1-16中任一项的方法，其中所述至少一个域包括Flt-1的域2。
18.实施方案16或17的方法，其中所述多聚体是同二聚体。
19.实施方案16-18中任一项的方法，其中所述多聚化域包含IgG的Fc区或其活性片段。
20.实施方案16-19中任一项的方法，其中所述多聚化域包含IgG的CH3 域或其活性片段。
21.实施方案16-20中任一项的方法，其中所述多聚化域来自IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4。
22.实施方案21的方法，其中所述多聚化域来自IgG1重链的恒定区。
23.实施方案16-22中任一项的方法，其中所述接头选自下组：
gly9(SEQ ID NO:1)；
glu9(SEQ ID NO:2)；
ser9(SEQ ID NO:3)；
gly5cyspro2cys(SEQ ID NO:4)；
(gly4ser)3(SEQ ID NO:5)；
SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:6)； ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:7)； GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ IDNO:8)；和 Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:9)。
24.实施方案16-23中任一项的方法，其中所述可溶性蛋白具有式X-Y-Z，其中X包含Flt-1的IgG样域2，其中Y是Gly9，且其中Z是IgG Fc区或IgG CH3 区。
25.实施方案16-24中任一项的方法，其中所述多聚化域是人源化的。
26.实施方案16-25中任一项的方法，其中所述可溶性蛋白包含选自下组的氨基酸序列：(a)图2A-2B中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)；(b)图6中所示的氨基酸序列(SEQID NO:15)；(c)图8中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO: 17)；(d)图12中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)；及(e)(a)、(b)、(c)或(d) 的与其具有至少90％序列同一性的变体。
27.实施方案1、2、5-8和11-26中任一项的方法，其中所述黄斑变性是年龄相关的黄斑变性(AMD)。
28.实施方案27的方法，其中所述黄斑变性是湿性AMD。
29.前述实施方案中任一项的方法，其中所述rAAV病毒体衍生自选自如下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12。
30.实施方案29的方法，其中所述rAAV病毒体衍生自AAV2。
31.包含编码可溶性蛋白的多核苷酸的重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体在制造用于治疗人受试者中的黄斑变性的组合物中的用途，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，所述治疗通过将约1 x 107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至眼睛进行。
32.实施方案31的用途，其中眼内压、视网膜厚度、视网膜下液或视网膜内液是降低的。
33.包含编码可溶性蛋白的多核苷酸的重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体在制造用于治疗人受试者中的黄斑水肿的组合物中的用途，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，所述治疗通过将约1 x 107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至眼睛进行。
34.实施方案33的用途，其中眼内压、视网膜厚度、视网膜下液或视网膜内液是降低的。
35.实施方案31-34中任一项的用途，其中将约1x 107至约1x 1012；1x 108至约1x1012；约1x 108至约1x 1011；约1x 108至约1x 1010；约1x 108至约 1x 109；约2x 107至约2x1012；约2x 108至约2x 1012；约2x 108至约2x 1011；约2x 108至约2x 1010；约2x 108至约2x109；2x 109至约2x 1010；约1x 1010至约1x 1013；约1x 1010至约1x 1012；约1x 1010至约1x1011；约2x 1010至约 1x 1013；2x 1010至约1x 1012；约2x 1010至约2x 1012；约2x 1010至约1x1011；或约2x 1010至约2x 1011个rAAV病毒体递送至眼睛。
36.实施方案31-35中任一项的方法，其中将约1x 107、约2x107、约6x 107、约1x108、约2x108、约6x 108、约1x 109、约2x109、约6x 109、约1x 1010、约2x1010、约6x 1010、约1x1011、约2x1011、约6x 1011、约1x 1012、约2x1012、约6x 1012、或约1x 1013个rAAV病毒体递送至眼睛。
37.包含编码可溶性蛋白的多核苷酸的重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体在制造用于治疗人受试者中的黄斑变性的组合物中的用途，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，所述治疗通过将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至眼睛进行。
38.实施方案37的用途，其中眼内压、视网膜厚度、视网膜下液或视网膜内液是降低的。
39.包含编码可溶性蛋白的多核苷酸的重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体在制造用于治疗人受试者中的黄斑水肿的组合物中的用途，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，所述治疗通过将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至眼睛进行。
40.实施方案39的用途，其中眼内压、视网膜厚度、视网膜下液或视网膜内液是降低。
41.实施方案37-40中任一项的用途，其中将约2x 108至低于2x 1010个 rAAV病毒体递送至眼睛。
42.实施方案37-40中任一项的用途，其中将多至约2x 108个rAAV病毒体递送至眼睛。
43.实施方案37-40中任一项的用途，其中将多至约2x 109个rAAV病毒体递送至眼睛。
44.实施方案31-43中任一项的用途，其中所述组合物还包含眼科上可接受的介质。
45.实施方案31-44中任一项的用途，其中对眼睛递送rAAV病毒体的单一玻璃体内注射。
46.实施方案31-45中任一项的用途，其中所述可溶性蛋白包含：
(a)Flt-1的至少一个域；
(b)衍生自免疫球蛋白重链的多聚化域；及
(c)连接(a)和(b)的长度为5-25个氨基酸残基的接头，
其中当可溶性蛋白表达时，产生可溶性蛋白的多聚体。
47.实施方案31-46中任一项的用途，其中所述至少一个域包含Flt-1的域2。
48.实施方案46或47的用途，其中所述多聚体是同二聚体。
49.实施方案46-48中任一项的用途，其中所述多聚化域包含IgG的Fc区或其活性片段。
50.实施方案46-49中任一项的用途，其中所述多聚化域包含IgG的CH3 域或其活性片段。
51.实施方案46-50中任一项的用途，其中所述多聚化域来自IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4。
52.实施方案51的用途，其中所述多聚化域来自IgG1重链的恒定区。
53.实施方案46-52中任一项的用途，其中所述接头选自下组：
gly9(SEQ ID NO:1)；
glu9(SEQ ID NO:2)；
ser9(SEQ ID NO:3)；
gly5cyspro2cys(SEQ ID NO:4)；
(gly4ser)3(SEQ ID NO:5)；
SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:6)； ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:7)； GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ IDNO:8)；和 Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:9)。
54.实施方案46-53中任一项的用途，其中所述可溶性蛋白具有式X-Y-Z，其中X包含Flt-1的IgG样域2，其中Y是Gly9，且其中Z是IgG Fc区或IgG CH3区。
55.实施方案46-54中任一项的用途，其中所述多聚化域是人源化的。
56.实施方案46-55中任一项的用途，其中所述可溶性蛋白包含选自下组的氨基酸序列：(a)图2A-2B中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)；(b)图6中所示的氨基酸序列(SEQID NO:15)；(c)图8中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO: 17)；(d)图12中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)；及(e)(a)、(b)、(c)或(d) 的与其具有至少90％序列同一性的变体。
57.实施方案31、32、35-38及41-56中任一项的用途，其中所述黄斑变性是年龄相关的黄斑变性(AMD)。
58.实施方案57的用途，其中所述黄斑变性是湿性AMD。
59.实施方案31-58中任一项的用途，其中所述rAAV病毒体衍生自选自如下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12。
60.实施方案59的用途，其中所述rAAV病毒体衍生自AAV2。
有鉴于本公开，本领域技术人员会容易地进行本发明的这些和其他实施方案。
附图简述
图1(SEQ ID NO:10)显示了包含Flt-1的融合蛋白(本文称为“sFLT01蛋白”)的DNA序列。
图2A-2B(SEQ ID NO:11)显示了sFLT01蛋白的氨基酸序列。
图3(Genbank登录号NM003376)(SEQ ID NO:12)显示了编码VEGF的 DNA序列。
图4(Genbank登录号CAC19513)(SEQ 5ID NO：13)显示了VEGF的氨基酸序列。
图5(SEQ ID NO:14)显示了额外的融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白包含经Gly9接头连接至VEGF多聚化域Ex3的可溶性Flt-1。
图6(SEQ ID NO:15)显示了由图5的DNA序列(SEQ ID NO:14)编码的氨基酸序列。
图7(SEQ ID NO:16)显示了额外的融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白包括经Gly9连接至VEGF多聚化域Ex3和来自IgG1 CH3区的序列的可溶性 Flt-1。
图8(SEQ ID NO:17)显示了图7的DNA序列(SEQ ID NO:16)所编码的氨基酸序列。
图9A-9B(Genbank登录号NM_002019)(SEQ ID NO:18)显示了编码代表性的Flt-1受体蛋白的DNA序列。
图10A-10E(Genbank登录号P17948)(SEQ ID NO:19)显示了代表性的 Flt-1受体蛋白的氨基酸序列。
图11(SEQ ID NO:20)显示了包含Flt-1的融合蛋白(在本文称为“sFLT02 蛋白”)的DNA序列，所述融合蛋白包含经Gly9(SEQ ID NO:1)连接至来自 IgG1 CH3区的序列的可溶性Flt-1。
图12(SEQ ID NO:21)显示了sFLT02蛋白的氨基酸序列。
图13(Genbank登录号Y14737)(SEQ ID NO:22)显示了IgG1λ重链的核苷酸序列。
图14A-14B(SEQ ID NO:23)显示了IgG1λ重链的氨基酸序列。
图15小图A-B显示了经2x 108rAAV2-sFLT01(图15小图B)的单剂治疗的人眼睛中视网膜下液和视网膜内液(如光学相干断层摄影术所测量的)相较于基线的(图15小图A)的变化。
图16小图A-B显示了经2x 1010rAAV2-sFLT01(图16小图B)的单剂治疗的人眼睛中视网膜下液和视网膜内液(如光学相干断层摄影术所测量的)相较于基线的(图16小图A)的变化。
发明详述
除另有说明外，本发明的实施会采用本领域中的化学、生化、重组DNA 技术和免疫学的常规方法。此类技术系完整地解释于文献中。参见例如 Fundamental Virology，第二版，vol.I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe编)； Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell 编,Blackwell Scientific Publications)；T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman和Company,1993)；A.L.Lehninger, Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,currentaddition)；Methods In Enzymology (S.Colowick and N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等,第4版,Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M. Ausubel等编,2003)；Methods in Enzymology丛书(AcademicPress,Inc.)；PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编,1995)； Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane编,1988)；Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney, 第6版,J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)； Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Cellis编,Academic Press,1998)；Introduction to Celland Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and TissueCulture: Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell,编,J.Wileyand Sons,1993-8)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等编,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Ausubel等编,J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,Oxford University Press,2000)； Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编, Harwood Academic Publishers,1995)；及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编,J.B.LippincottCompany,2011)。
所有本文所引述的出版物、专利和专利申请及登录号，无论在上文或下文中，均通过提述以其整体并入。
1.定义
在描述本发明时会采用如下术语，并意在按照如下予以定义。
须注意的是，除内容中明确指出以外，如本说明书和所附的权利要求书中所用，单数形式“一”、“该”和“所述”也包括复数的指称。因此，例如对“Flt-1受体”的提述包括两个或更多个此类受体的混合物，诸如此类。
如本文所用，“老化-相关的黄斑变性”或“AMD”包括早期、中期和晚期的AMD并包括干性AMD(例如地图样萎缩)和湿性AMD(亦称为新生血管性或渗出性AMD)。这些症状更完整地描述于下文中。
如本文所用，“黄斑水肿”指视网膜内的液体积累，其可能造成眼睛的黄斑区域肿胀或增厚。当视网膜中的血管渗漏液体时，则发生黄斑水肿。病理生理学通常涉及血管不稳定及血液-视网膜屏障的崩解。观察到的最常见的类型，囊样黄斑水肿(CME)，涉及流体累积于外网层中，其继发于异常的凹周视网膜毛细血管渗透。当黄斑肿胀时，其无法正常发挥功能。视力丧失可能是轻度至重度的，但在某些情况下，仍有周边视觉(peripheral vision)。
术语“Flt-1蛋白”和“VEGF-R1蛋白”在文中可交换使用并表示已知结合VEGF的受体蛋白。术语“Flt-1蛋白”和“VEGF-R1蛋白”或编码它的核苷酸序列分别指衍生自任何Flt-1蛋白的蛋白或核苷酸序列，与来源无关。如本文所用，此术语意指能结合VEGF并调节其活性的分子，如以任何已知的 VEGF活性试验所测得的活性，包括本文进一步描述的那些试验。代表性的Flt-1蛋白的全长的核苷酸序列及对应的氨基酸序列分别如图9A-9B(SEQ IDNO:18)和10A-10E(SEQ ID NO:19)中所示。然而，如本文所定义的Flt-1蛋白并不限于所示的序列，因为数个此类受体是已知的并且在物种间会产生这些受体的变体。其他的Flt-1蛋白序列的非限制性例子可见于GenBank登录号 AF063657.2；BC039007.1；U01134.1；HD077716.1；X51602.1；EU360600.1； AK300392.1；EU826561.1；EU368830.1；AB385191.1；AK292936.1； AK309901.1；AB209050.1；BC029849.1；BC039007.1；NM_001160031.1； NM_001160030.1；NM_002019.4；NM_001159920.1。
全长蛋白(有或无信号序列)及其片段，以及相对于天然序列带有修饰(例如删除、添加和取代(无论性质上是保守或非保守的))的蛋白，意欲用于本文中，只要该蛋白保持合意的活性。在本发明上下文中，此类活性变体和片段系视为VEGF1受体。修饰可以是故意的，如经由定点诱变，或可以是偶然的，例如经由产生该蛋白的宿主的突变或由于PCR扩增的错误。因此，涵盖了与亲本序列基本同源的活性蛋白，例如具有70...80...85...90...95...98...99％等同一性且保有调节相应配体活性的能力的蛋白，用于本文中。
“天然”多肽，如Flt-1受体，意指具有与天然来源的相应分子相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列可以是从自然中分离出的，或可以是通过重组或合成手段所产生的。术语“天然”序列具体包含天然生成的截短的或分泌形式的具体分子(例如胞外域序列)，天然生成的变体形式(例如可变剪接形式)和多肽的天然生成的等位基因变体。在本发明的多种实施方案中，本文公开的天然分子是成熟或全长天然序列，其包含如附图中所示的全长氨基酸序列。然而，虽然附图中所公开的一些分子以甲硫氨酸残基起始，在图式中表示为氨基酸位置1，但在附图中位于氨基酸位置1的上游或下游的其他甲硫氨酸残基可以用作特定分子的起始氨基酸残基。或者，根据所用的表达系统，本文所述的分子可能缺乏N端的甲硫氨酸。
“胞外域”意指这样的受体多肽的形式，其包含胞外域的全部或片段并且缺乏跨膜域的全部或部分，并且还可能缺乏胞质域。通常，当用于本发明中，所述胞外域基本上无跨膜域和胞质域二者。一般而言，胞外域包含低于 10％的此种跨膜域和/或胞质域，低于5％的此类域，低于1％或低于0.5％的此类域。本文所述的受体的跨膜域可依照本领域惯用于鉴定疏水域的标准来鉴定，例如使用标准的亲水性图，例如用Kyte-Doolittle技术(Kyte等,J.Mol.Biol. (1982)157:105-132)所计算的那些。
如上文所说明的，本发明所用的受体可包含或可不包含天然信号序列。本文所述的受体的信号肽的大体位置描述于说明书及附图中。然而须注意，信号肽的C端边界可以变化，典型地如本文所述在信号肽C端边界的任一侧有不超过约5个氨基酸的差异。信号肽的C端边界可依照本领域中惯用的标准来鉴定，例如Nielsen等,Prot.Eng.(1997)10:1-6和vonHeinje等,Nucl.Acids. Res.(1986)14:4683-4690中所描述的。此外，还应当理解的是，在某些情况下，从分泌的多肽切割信号序列并非完全一致的，其产生一个以上分泌种类。这些成熟的多肽(如本文所鉴定的，其中信号肽在所述信号肽的C端边界任一侧被切割了不超过5个氨基酸)及编码其的多核苷酸涵盖在本发明中。
“变体”意指如本文所定义的活性多肽，其与对应的全长天然序列、缺乏信号肽的多肽、有或无信号肽的多肽的胞外域，或本文所公开的全长多肽序列的任何其他片段具有至少约80％氨基酸序列同一性。此类多肽变体包括，例如在其全长天然氨基酸序列的N和/或C端添加或删除一个或多个氨基酸残基的多肽。在实施方案中，变体与对应的全长天然序列具有至少约81％氨基酸序列同一性，或者至少约82％氨基酸序列同一性，或者至少约83％氨基酸序列同一性，或者至少约84％氨基酸序列同一性，或者至少约85％氨基酸序列同一性，或者至少约86％氨基酸序列同一性，或者至少约87％氨基酸序列同一性，或者至少约88％氨基酸序列同一性，或者至少约89％氨基酸序列同一性，，或者至少约90％氨基酸序列同一性，或者至少约91％氨基酸序列同一性，或者至少约92％氨基酸序列同一性，或者至少约93％氨基酸序列同一性，或者至少约94％氨基酸序列同一性，或者至少约95％氨基酸序列同一性，或者至少约96％氨基酸序列同一性，或者至少约97％氨基酸序列同一性，或者至少约98％氨基酸序列同一性及或者至少约99％氨基酸序列同一性。在实施方案中，变体多肽长度为至少约10个氨基酸，如长度为至少约20个氨基酸，例如长度为至少约30个氨基酸，或者长度为至少约40个氨基酸，或者长度为至少约50个氨基酸，或者长度为至少约60个氨基酸，或者长度为至少约70个氨基酸，或者长度为至少约80个氨基酸，或者长度为至少约90个氨基酸，或者长度为至少约100个氨基酸，或者长度为至少约150个氨基酸，或者长度为至少约200个氨基酸，或者长度为至少约300个氨基酸或更多。变体包括性质上为保守或非保守的取代。例如，目的多肽可以包含多至约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或甚至多至约15-25或50个保守或非保守氨基酸取代，或 5-50的任何数目，只要所需的分子功能保留完整即可。
“同源性”意指两个多核苷酸或两个多肽基团之间的百分比同一性。当此类序列在限定的分子长度具有至少约50％，至少约75％，至少约80％-85％，至少约90％，至少约95％-98％序列同一性，至少约99％或其间的任何百分比，则两个DNA，或两个多肽序列彼此为“基本同源”。如本文所用，基本同源也指与具体的DNA或多肽序列显示完全同一性的序列。
一般而言，“同一性”分别意指两个核苷酸或多肽序列确切的核苷酸-对 -核苷酸或氨基酸-对-氨基酸一致性。测定百分比同一性的方法已为本领域所已知。例如，百分比同一性可由比对序列通过直接比较两个分子间的序列信息，计算两个比对序列之间的确切匹配数，除以较短序列的长度并将结果乘以100来确定。可使用容易取得的计算机程序来辅助分析，例如Atlas of Protein Sequence and Structure M.O.Dayhoff编,5Suppl.3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,DC中的ALIGN，Dayhoff，M.O.，其将Smith和Waterman,Advances in Appl.Math.2:482-489,1981的局部同源性算法适应于肽分析。用于确定核苷酸序列同一性的程序可获取自Wisconsin 序列分析包,第8版(可获取自Genetics Computer Group,Madison,WI)，例如 BESTFIT、FASTA和GAP程序，其还依赖于Smith和Waterman算法。这些程序可以容易地与制造商所推荐并描述于上文所指的Wisconsin序列分析包中的默认参数一起使用。例如，具体核苷酸序列与参比序列的百分比同一性可以用Smith和Waterman的同源性算法，以默认评分表和六个核苷酸位置的缺口罚分来确定。
在本发明上下文中建立百分比同一性的另一方法是使用由John F.Collins 和Shane S.Sturrok开发，IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)发行，版权为爱丁堡大学所有的MPSRCH程序包。从这套软件包，可运用 Smith-Waterman算法，其中将默认参数用于评分表(例如，12分的缺口开放罚分，一分的缺口延伸罚分及六分的缺口)。从“匹配”值所产生的数据反映“序列同一性”。其他用于计算同一性或相似性百分比的适合的程序是本领域通常已知的，例如另一个算法程序为BLAST，用默认参数来使用。例如 BLASTN和BLASTP可用下列默认参数来使用：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截留＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50序列；排序＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss 蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的详情是本领域已知的。
或者，可通过使多核苷酸在同源区域间形成稳定双链体的条件下杂交，然后用单链特异性核酸酶消化，并确定消化片段的大小，从而确定同源性。基本同源的DNA序列可在Southern杂交实验中于例如严格条件下(如对于具体系统定义的)进行鉴定。定义适当的杂交条件在本领域的技术范围内。参见例如 Sambrook等，前文；DNA Cloning，前文；NucleicAcid Hybridization，前文。
术语“简并变体”意欲为在其核酸序列中含有变化的多核苷酸，其编码多肽，而所述多肽与由衍生该简并变体的多核苷酸所编码的多肽具有相同的氨基酸序列。
“编码序列”或“编码”选择的多肽的序列，是这样的核酸分子，当其被置于适当的调控序列的控制下，其被转录(就DNA的情况而言)及翻译(就 mRNA的情况而言)成多肽。编码序列的边界通过在5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子来确定。转录终止序列可位于编码序列的3’。
“载体”意指任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等，当与适当的控制因子相连时其能复制并且其能将基因序列转移至细胞。因此，此术语包含克隆和表达载体，以及病毒载体。
“重组载体”意指包含能在细胞中表达的异源核酸序列的载体。
“重组的病毒载体”意指包含一个或多个异源序列(即非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。对于重组AAV载体的情况而言，重组的核酸侧翼有至少一个(在实施方案中为二个)反向末端重复序列(ITR)。
“重组AAV载体(rAAV载体)”意指包含一个或多个异源序列(即非AAV 来源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列侧翼有至少一个(在实施方案中为二个)AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于被适当的辅助病毒感染 (或表达适当的辅助功能)且表达AAVrep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，此类rAAV载体能复制并包装至感染性病毒颗粒中。当 rAAV载体被整合至较大的多核苷酸中(例如染色体中或其他载体中，例如用于克隆或转染的质粒)时，则rAAV载体可称为“原载体(pro-vector)”，其能在AAV包装功能及适合的辅助功能的存在下通过复制和衣壳化来“挽救”。 rAAV载体可以是许多形式的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合、包囊于微脂体内以及衣壳化于病毒颗粒中，特别是AAV颗粒。rAAV载体可包装至AAV病毒衣壳中，以产生“重组的腺-相关病毒颗粒(rAAV 颗粒)”。
“重组病毒”意指例如通过将异源性核酸构建体添加或插入至颗粒中，从而已在遗传上改变的病毒。
术语“转染”意指细胞对外来的DNA的吸收，当外源性DNA被导入细胞膜内时，则该细胞被“转染”。本领域普遍已知晓许多的转染技术。参见例如Graham等(1973)Virology,52:456，Sambrook等(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold SpringHarbor Laboratories,New York， Davis等(1986)Basic Methods in MolecularBiology,Elsevier，以及Chu等 (1981)Gene 13:197。此类技术可用于将一个或多个外源性分子导入适合的宿主细胞中。
术语“异源”在涉及核酸序列例如编码序列和控制序列时，表示一般情况下不连结一起，和/或一般情况下不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区是另一核酸分子内的或与其附接的核酸的一个区段，所述区段天然地不会被发现与所述另一分子相关。例如核酸合同的异源区可以包含编码序列，其侧翼是天然地不会被发现与该编码序列相关的序列。异源编码序列的另一实例是其中编码序列本身天然不存在的构建体(例如具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，就本发明而言，用一般不存在于细胞中的构建体转化的细胞可视为是异源性的。如本文所用，等位基因变体或天然发生的突变事件并不产生异源DNA。
“核酸”序列意指DNA或RNA序列。此术语囊括包括DNA或RNA的任何已知碱基类似物的序列，例如但不限于4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤核苷、氮杂环丙基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基-甲基)尿嘧啶、 5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-胺甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假- 尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、 2-甲基鸟嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧丁氧核苷 (oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶及2,6-二氨基嘌呤。
术语DNA“控制序列”共同地意指启动子序列、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，其在受体细胞中共同提供编码序列的复制、转录和翻译。并非所有的这些控制序列都必须总是存在，只要所选的编码序列能在适当的宿主细胞中复制、转录和翻译即可。
术语“启动子”以其一般含义用于本文，意指包含DNA调控序列的核苷酸区，其中所述调控序列来源于能与RNA聚合酶结合并启动下游(3’-方向)编码序列的转录的基因。转录启动子可包括“诱导型启动子”(其中可操作地连接至启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调控蛋白等诱导)，“阻遏型启动子”(其中可操作地连接至启动子的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调控蛋白等诱导)及“组成型启动子”。
“可操作地连接”意指这样的元件排列，其中所描述的组分经配置从而执行其正常的功能。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能影响编码序列的表达。控制序列不必与编码序列相邻，只要它们发挥作用以指导其表达即可。因此，例如，启动子序列和编码序列之间可存在介入的尚未翻译但已转录的序列，而该启动子序列仍可视为“可操作地连接”至编码序列。
如本发明上下文中所用，术语“多聚化域”意指分子直接或经由“接头域”与特定的Flt-1受体连结的部分。多聚化域可以是多肽域，其促进两个或更多个多聚化域和/或sFlt-1受体域的相互作用。
例如，多聚化域可以是免疫球蛋白序列，如免疫球蛋白恒定区、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区、包含游离硫醇的多肽，所述硫醇在两个或更多个多聚化域之间形成分子间二硫键或，例如，“隆突入腔(protuberance-into-cavity)”域，其描述于例如美国专利第5,731,168号中，其在此通过提述以其整体并入本文。隆突是通过例如以较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)从第一多肽的界面替换小的氨基酸侧链来构建的。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)来替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面上任选地生成与此隆突大小相同或相似的弥补性腔体。
因此，在一些方面，多聚化域提供促进或允许从单体域形成二聚体、三聚体等的分子部分。在一些方面，多聚化域是免疫球蛋白恒定区域。
“免疫球蛋白”(Ig)是蛋白，一般而言是糖蛋白，其是缺乏抗原特异性的抗体或抗体样分子。免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二条相同的轻(L)链和二条相同的重(H)链所组成。各轻链通过共价二硫键与重链相连接，而二硫键的数目在不同的免疫球蛋白同种型的重链间变化。每条重链和轻链还具有规则间隔开的链内二硫桥。每条重链具有氨基(N)端可变域(VH)接着是羧基(C)端恒定域。每条轻链具有可变N端域(VL)和C端恒定域；轻链的恒定域(CL)与重链的第一恒定域(CH1)对齐，而轻链可变域与重链可变域对齐。根据免疫球蛋白多肽链的域定义，轻(L)链具有二个构型上相似的域VL和CL；而重链具有四个域(VH、CH1、CH2和CH3)，其各自具有一个链内二硫桥。
依照重链恒定(C)域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分成不同的种类。有5 类主要的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。免疫球蛋白种类可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgA1和IgA2。每条重链在一个末端具有可变域(VH)接着是许多恒定域。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链，以其恒定域的氨基酸序列为基础，可分成2种不同的类型，称为卡帕(κ)或兰姆达(λ)。
术语“Fc”区意指免疫球蛋白重链的C端(恒定)区。该Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。虽然免疫球蛋白Fc区的界限可以变化，但人IgG重链 Fc区可从位置Cys226的氨基酸残基处，或从Pro230处延伸至全长人IgG1的羧基端。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定域CH2和CH3。最后的残基赖氨酸可存在于IgG1的重链中作为成熟蛋白中Fc中的末端残基，但并非必需。人 IgG1重链Fc区定义于NCBI登录号P01857中。
人IgG1 Fc区的“CH2域”(也称为“Cy2”域)通常在全长IgG从约氨基酸 231延伸至约氨基酸340，但在人IgG重链Fc区从Pro111至Lys223。
“CH3域”包含人IgG1 Fc区中C端至CH2域的残基(即在全长IgG从约氨基酸残基341至约氨基酸残基447，但在人IgG重链Fc区从Gly224至Lys330)。
“铰链区”一般定义为在全长人IgG1从Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.immunol.(1985)22:161-206)，但在人IgG重链Fc区从Glu99至Pro110。其他IgG同种型的绞链区可通过如下方式与IgG1序列对齐：将形成重链内S-S 键的第一个和最后一个半胱氨酸置于相同位置。
Fc区的“低铰链区”通常定义为由紧接C端的残基至绞链区的延伸，即全长人IgG1的残基233至239。
“天然Fc区序列”包括与自然界中所发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然人Fc区序列包括但不限于人IgG1 Fc区(非-A和A同种异型 (allotype))；人IgG2 Fc区；人IgG3 Fc区；和人IgG4 Fc区及其天然生成的变体。来自其他物种的天然Fc区例如鼠Fc区也是已知的。
“功能性Fc区”具有天然Fc区的“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合域(即本文的VEGF配体)组合并可使用本领域已知的各种分析来评估。Fc区可以是人Fc区，例如天然序列人Fc 区，如人IgG1(非-A和A同种异型)、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。此类序列是已知的。参见例如PCT公开号WO01/02440，其在此通过提述以其整体并入本文。
术语“转基因”意指导入细胞且能转录至RNA且任选地翻译和/或于适当的条件下表达的多核苷酸。在一些方面，其将合意的特性赋予其所导入的细胞，或是产生合意的治疗或诊断结果(例如转录成分子，其赋予合意的治疗或诊断结果)。
术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组同等物”或“基因组复制物”当用于有关病毒滴度时，意指含有重组AAV DNA基因组的病毒体的数目，与感染性或功能性无关。在具体的载体制备物中的基因组颗粒的数目可通过例如本文实施例，或例如Clark等(1999)Hum.GeneTher.,10:1031-1039；Veldwijk 等(2002)Mol.Ther.,6:272-278中所描述的程序来测量。
术语“感染单位(iu)”、“感染颗粒”或“复制单位”当用于有关病毒滴度时，意指感染性的和有复制能力的重组AAV载体颗粒的数目，如感染中心测定(也称为复制中心测定)所测的，例如描述于McLaughlin等(1988)J.Virol., 62:1963-1973中的那些。
术语“转导单位(tu)”当用于有关病毒滴度时，意指导致产生功能性转基因产物的感染性重组AAV载体颗粒的数目，如功能测定法所测量的，如本申请实施例中所描述的，或例如描述于Xiao等(1997)Exp.Neurobiol., 144:113-124中；或Fisher等(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU assay)中描述的。
“反向末端重复”或“ITR”序列是本领域所已知的术语且意指在病毒基因组末端发现的相对短的序列，其为是相反方向的。
“AAV反向末端重复(ITR)”序列是本领域所已知的术语，其是存在于天然单链AAV基因组两端的大约145个核苷酸的序列。ITR最外面的125个核苷酸能以2种可供选择的方向存在，导致不同AAV基因组之间以及单个AAV 基因组的两端之间的异质性。最外面的125个核苷酸还含有数个较短的自身互补区(称为A、A’、B、B’、C、C’和D区)，其允许在ITR的此部分内发生链内碱基配对。
“末端解析序列”或“trs”是AAV ITR的D区中的序列，其在病毒DNA 复制过程中被AAV rep蛋白切割。AAV rep蛋白难以切割突变的末端解析序列。
AAV的“辅助病毒”意指能让AAV(其是一种缺陷型细小病毒)复制并被宿主细胞包装的病毒。辅助病毒提供能让AAV复制的“辅助功能”。已鉴定出许多的此类辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒例如牛痘。虽然C 亚组的5型腺病毒(Ad5)是最常用的，但腺病毒涵盖许多不同的亚组。已知有许多人、非人哺乳动物和鸟类来源的腺病毒并可从例如ATCC的保藏机构取得。疱疹科的病毒也可从保藏机构例如ATCC得到，其包括例如单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒(Epstein-Barr viruses,EBV)、巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)。用于AAV复制的腺病毒辅助功能的实例包括E1A功能、E1B功能、 E2A功能、VA功能和E4orf6功能。
如果感染性AAV颗粒与感染性辅助病毒颗粒的比率为至少约102:l；至少约 104:l，至少约106:l；或至少约108:l，则认为rAAV的制备物是“基本上没有”辅助病毒的。制备物还可以没有等量的辅助病毒蛋白(即如果上述辅助病毒颗粒杂质以破坏的形式存在时，会因一定水平的辅助病毒而存在的蛋白)。病毒和/ 或细胞蛋白污染物一般可作为SDS凝胶上的考马斯亮蓝染色带的存在(例如，对应于AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的那些之外的条带的出现)而观察到。
术语“调节”意指影响(例如，上调、下调或其他控制)信号传输途径的水平。在信号转导控制下的细胞过程，包括但不限于具体基因的转录，正常细胞功能，例如代谢、增殖、分化、粘附、凋亡和存活，以及异常的过程，例如转化、分化阻断和转移。
出于本发明目的“活性的”或“活性”意指Flt-1受体多肽的形式，其保留了对应的天然或自然生成的多肽的生物活性(抑制性的或刺激性的)。所述活性可以大于、等于或小于以对应的天然或自然生成的多肽所观察到的活性。如上文所说明，活性包含在患有黄斑变性的患者中调节VEGF信号传导途径的水平。
“分离的”在指核苷酸序列时，表示所指的分子以基本上无其他相同类型的生物大分子的状态存在。因此，编码具体多肽的“分离的核酸分子”意指基本上无其他不编码此主体多肽的核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可包含某些对组合物的碱基特性不存在有害影响的其他碱基或基团。
出于描述整个本申请案中具体核酸分子中核苷酸序列的相对位置的目的，例如当具体的核苷酸序列系被描述为位于相对于另一序列的“上游”、“下游”、“3撇端(3’)”或“5撇端(5’)”时，应了解，其是DNA分子的“有义”链或“编码”链中序列的位置，如本领域惯常所指的那样。
术语“纯化的”意指分离物质(化合物、多核苷酸、蛋白、多肽、多肽组合物)而使目的物质占其所在的样品中的多数百分比。通常在样品中，基本纯化的组分包含50％、80％-85％、90-99％，如至少90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％的样品。纯化目的多核苷酸和多肽的技术已为本领域所已知，其包括例如离子交换色谱、亲和色谱以及根据密度的沉降。
术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文可交换使用并意指脊椎动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于鼠、啮齿类、猿猴、人、农场动物、运动动物和宠物。
如本文所提供的，术语组合物或试剂的“有效量”或“治疗上有效量”，意指足以提供所需的反应的组合物或试剂的量，所述反应例如调节眼睛中 VEGF，或降低、防止或延缓眼睛中与黄斑变性有关的生理变化的进展，或降低、防止或延缓由其所显现的症状的进展(例如玻璃疣的积累、眼睛中异常血管生长、眼睛中异常的液体、血液和蛋白渗漏等)。根据物种、年龄和患者的大体病况、要治疗的症状的严重程度以及具体的目的大分子、施用模式等，所需的确切量在患者与患者间变化。在任何个体案例中，适当的“有效”量可由本领域普通技术人员使用惯用的实验来确定。参见例如Lim,J. (2012)Age-Related MacularDegeneration,CRC Press,Boca Raton；Kanski等 (2011)Clinical Ophthalmology:ASystematic Approach,Elsevier Saunders。
“治疗”黄斑变性包括：(1)预防疾病，即预防疾病的发生或使此疾病以较低强度发生于可能暴露于或易罹患此疾病但尚未经历或出现此疾病症状的受试者中，(2)抑制疾病，即遏止发展、预防或延缓进展或逆转疾病状态，(3)减轻疾病症状，即降低受试者经历症状的次数，或(4)降低、预防或延缓眼睛中与黄斑变性有关的眼睛生理变化的进展。治疗包括但不限于降低玻璃疣积累、眼睛中异常血管生长、眼睛中异常的液体、血液和蛋白渗漏等。治疗可以例如通过如下来加以检测：通过监测眼睛中央部份的光感受器(视杆细胞和视锥细胞)丧失的速率和量，通过监测视力丧失的速率和最佳矫正视力(BCVA)，通过监测视网膜下的视网膜色素上皮层(以及脉络膜毛细血管层) 萎缩的速率和量，通过监测在视网膜和脉络膜之间积累的玻璃疣(细胞碎片) 的量，通过监测眼睛中异常血管生长，以及监测眼睛中异常的液体、血液和蛋白渗漏的量。
本文所提供的范围应理解为在该范围的所有值的概述。例如1至50的范围理解为包含选自下组的任何数字或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
除另有说明外，本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员正常理解相同的意义。虽然任何与本文所述的方法和物质类似或等同的方法和材料均可用于实施或测试本发明，本文在此描述的是示例性方法、装置和材料。本文所引述的所有的技术和专利出版物均通过提述以其整体并入本文。本文任一处均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于该公开。
应了解，虽然并未总是明确地陈述，所有数字前面均有术语“约”。也应了解，虽然并未总是明确地陈述，本文所述的所有试剂仅为示例性的，并且此类的等同物是本领域已知的。
2.实施本发明的模式
在详述本发明之前，应了解本发明不限于具体的配方或处理参数，因为其当然是可以变化的。还应了解，本文所用的术语仅出于描述本发明具体实施方案的目的，而非意在限制。
应了解，本发明不应视为限于本文所述的实施例。与本文所述的那些类似或等同的方法和材料均可用于实施本发明，且本发明应理解为包括任何及所有本文所提供的申请及普通技术人员内的所有等同变化。
本发明的中心是发现了使用编码可溶性蛋白的构建体将基因递送至人眼睛能用于调节对应的信号传输途径并显著降低黄斑变性的症状，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域(在此也称为“可溶性Flt-1蛋白”或“可溶性Flt-1受体”)。在一些方面，本发明涉及施用比之前报道为在非人灵长类中有效的剂量更低的剂量。参见例如Lukason等， Molecular Ther.(2011)19:260-265。因此，施用可溶性Flt-1蛋白提供了治疗和预防人中黄斑变性的有用技术。本文所描述的方法可单独或与传统疗法(例如PDGF拮抗剂、PDGF-R拮抗剂、补体途径抑制剂)组合使用。
在实施方案中，用于本发明方法中的可溶性蛋白是融合蛋白，其包含至少一个Flt-1域或其活性部分，其直接或经接头(连接至免疫球蛋白恒定域)连接至多聚化域。在一些实施方案中，可溶性蛋白包含域2或其部分和/或延伸，其直接或经接头连接至多聚化域。接头可包含长度为5-25个残基的氨基酸序列。代表性的多聚化域包括但不限于IgG Fc区或其部分，及IgG CH3区或其部分。
受体可以存在于免疫球蛋白区的上游或下游。通常，融合蛋白在体内表达时，以多聚化形式产生。多聚体可以是二聚体、三聚体等。
为了进一步了解本发明，下文提供有关黄斑变性、Flt-1受体、受体-免疫球蛋白融合物以及本发明所使用的多种基因递送方法的更详细的论述。
黄斑变性
如上文所说明的，本发明利用Flt-1受体来抑制VEGF活性，并由此治疗、预防、减轻和/或预防或延缓黄斑变性的进程。在一些实施方案中，对具有发生黄斑变性风险的个体系经施用有效量以延缓或预防所述疾病。
已鉴定出至少三种黄斑变性的形式。(1)萎缩、非渗出性-干式AMD，也称为中心地图样萎缩(central geographic atrophy)，发生在大约85至90％的黄斑变性患者中。干式的AMD通常由视网膜下方的视网膜色素上皮层萎缩所致(并且推测为脉络膜毛细血管层)，并经眼睛中央部分的光感受器(视杆细胞和视锥细胞)丧失造成视力丧失。另外可能有细胞碎片(称为玻璃疣)积累在视网膜和脉络膜之间。(2)湿式的AMD，也称为新生血管或渗出性AMD，代表更严重的AMD型。湿式的AMD通常特征为眼睛中异常的血管生长，其中错误的血管渗漏出流体和血液。其可因异常的血管生长从脉络膜毛细血管层经布鲁氏膜 (Bruch’smembrane)进入视网膜下间隙，最后导致黄斑下方血液和蛋白渗漏而引起视力丧失。若不治疗，来自这些血管的流血、渗漏和结痂最终会造成对光感受器不可逆的伤害、黄斑的结痂形成及相对快速的视力丧失。(3)色素上皮脱落相关的(PED)ARMD发生在低于5％的患者中，并造成视网膜脱落。
Flt-1分子及融合
本发明利用可溶性形式的Flt-1受体来调节VEGF活性并由此治疗、预防、减轻和/或预防或延缓黄斑变性的进程。在一些方面，本发明中使用Flt-1受体 -免疫球蛋白融合物。保留了结合至VEGF并调节配体活性(如任何已知的各种测定法和动物模型中所测量的)的能力的天然分子，以及其活性片段和类似物，包括进一步于本文所描述的那些，适合用于本发明中。例如VEGF结合测定是已知的并描述于Pechan等,Gene Ther(2009)16:10-16)和美国专利第 7,928,072号中，其通过提述以其整体并入本本文。
编码代表性的全长人Flt-1受体的氨基酸序列和核苷酸序列分别如图9A-9B (SEQID NO:18)和10A-10E(SEQ ID NO:19)所示。Flt-1受体蛋白具有如图 10A-10E的位置27-758所示的胞外区，其包含七个Ig样域。图10A-10E的氨基酸 1-26代表信号序列。七个Ig样域分别位于图10A-10E的残基编号32-123、151-214、 230-327、335-421、428-553、556-654和661-747。所述Flt-1蛋白由如Genbank 登录号NM_002019所示的DNA序列所编码(图9A-9B，SEQ ID NO:18)。
在实施方案中，用于本发明的Flt-1分子包含Flt-1 Ig样域2。Flt-1分子的任何部分均可使用，只要该分子保留调节VEGF活性的能力即可；然而，在一些实施方案中，所述Flt-1分子可能缺乏域1和3的全部或部分。Flt-1域2可见于图10A-10E的位置151-214。然而，本融合物的Flt-1组分可包括例如在 Flt-1的域1和2之间、域2和3之间等所发现的任何氨基酸序列，例如对应于图 10A-10E的位置124-229之间所发现的氨基酸序列的任何氨基酸序列，例如开始于图10A-10E的位置124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、 134、135、136、136...140...145...150、151、152、153、154、155...160...165...170 的任一位置，直至氨基酸210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229等的氨基酸序列。在实施方案中，本文所述的融合蛋白的Flt-1组分包含图10A-10E的氨基酸132-226。Flt-1组分还可包含存在于Flt-1蛋白的胞外区中的任何其他域的部分，包括域1和3的部分，或甚至删除域2，只要保留合意的活性即可。在一些实施方案中，域1和3不是以其整体存在的。
此外，本发明的可溶性蛋白可以包含额外的多肽/基团。例如本发明的可溶性蛋白可以包含所有或部分的VEGFR2，如VEGFR2的任何多种可变域，包括但不限于VEGFR2的域1、2和/或3，以及删除了这些域的一个或多个或部分的构建体。为了说明VEGFR2融合物及来自VEGFR2的域与Flt-1域的杂交融合物，参见例如Holash等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)99:11393-11398和美国专利第7,378,095号，其通过提述以其整体并入本文。
本发明的具体融合物包括Flt-1 Ig样域2，其序列如图2A-2B、6、8和12 的位置24-118所示，其对应于图10A-10E的氨基酸132-226，或所述序列的保留了调节VEGF的能力的部分或变体。在一些实施方案中，所述融合蛋白还结合至胎盘生长因子。
信号序列还可存在于并连接至可溶性蛋白的N端(例如Flt-1 Ig样域2序列)。所述信号序列可以包含全部或部分的天然信号序列，例如全部或部分的图10A-10E的位置1-26所示的序列。在图2A-2B(SEQ ID NO:11)、6(SEQ ID NO:15)、8(SEQ ID NO:17)和12(SEQ IDNO:21)中所示的融合物中，存在 23个氨基酸(图2A-2B、6、8和12的氨基酸1-23)的信号序列。所述序列与Flt-1 蛋白的天然信号序列同源。或者，可以存在异源信号序列。许多此类序列已为本领域所知并可用于本文。信号序列的非限制性例子包括存在于分泌蛋白中的那些，例如人生长激素、牛生长激素、牛白蛋白原、人胰岛素原、人干扰素-γ、人α-纤维蛋白原、人IgG重链、大鼠淀粉酶、鼠甲胎蛋白(α-fetoprotein)、鸡溶菌酶及玉米(Zea mays)Rein蛋白22.1、脑源性神经营养因子、胰岛素生长因子1及β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucoronidase)。
如上文所说明的，融合蛋白的Flt-1部分直接或经接头连接至多聚化域。多聚化域可以是免疫球蛋白序列，如免疫球蛋白恒定区、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区、包含游离硫醇的多肽，所述硫醇在两个或更多个多聚化域之间形成分子间二硫键，或是例如“隆突入腔”域，其描述于例如美国专利第 5,731,168号中，其通过提述以其整体并入本文。该多聚化域提供促进或允许从单体域形成二聚体、三聚体等的分子的部分。
多聚化域会导致至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、 80％、85％、90％或95％的单体融合蛋白以适于多聚体的速率在非变性聚丙烯酰胺凝胶上迁移。糖基化也可影响凝胶中蛋白的迁移。虽然在此显示了具体的序列，但也可使用变体，例如等位基因变体。通常此类变体与公开的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性。
多聚化可以例如使用还原或非还原性凝胶来加以测定。多聚化也可通过检测蛋白对其配体/受体增加的结合亲和力来测定。可以使用BiaCoreTM表面等离子体共振来对此进行测定。这些测定通过如下来检测质量的变化：在接近传感器芯片表面的水性层中测量折射率的变化。任何本领域已知的方法均可用于检测多聚化。
在一些方面，多聚化域衍生自免疫球蛋白分子，包括但不限于来自重链的区、免疫球蛋白恒定域、Fc区等。可使用IgG1或IgG2λ重链的Fc部分的序列，例如单独的CH3，如图14A-14B的氨基酸371-477，或CH3的部分或延伸，或CH2和CH3域二者，如图14A-14B的氨基酸247-477，或其部分或延伸。
获得免疫球蛋白分子的部分的方法已为本领域所已知。例如免疫球蛋白分子的Fc部分可通过以木瓜蛋白酶切割完全抗体分子来获得。也可使用其他的方法来获得这些部分。对IgG1λ重链蛋白序列而言，参见例如Genbank登录号Y14737及图13(SEQ ID NO:22)和14A-14B(SEQ ID NO:23)，其分别显示DNA和氨基酸序列。可以使用其他的Fc区，例如来自其他IgG种类及来自 IgA、IgM、IgD或IgE抗体的那些。还可使用VEGF的多聚化区。编码VEGF 的DNA序列显示于Genbank登录号NM003376和图3(SEQ ID NO:12)。VEGF 的氨基酸序列显示于Genbank登录号CAC19513和图4(SEQ ID NO:13)。由 VEGF外显子3(VEGF Ex3)所编码的VEGF的多聚化区位于VEGF蛋白的大约氨基酸残基75-88(图4)并包含氨基酸序列Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg- Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQ ID NO:7)。
虽然有许多不同的接头基团可使用并且可能在功能上等同，但在一些方面，在本发明中采用9个甘氨酸残基的接头。其他的接头可包含例如5-100个氨基酸残基，5-75个氨基酸残基，5-50个氨基酸残基，5-25个氨基酸残基， 5-20个氨基酸残基，5-15个氨基酸残基，5-10个氨基酸残基，或5-9个氨基酸残基。可使用的接头的例子包括：
gly9(SEQ ID NO:1)；
glu9(SEQ ID NO:2)；
ser9(SEQ ID NO:3)；
gly5cyspro2cys(SEQ ID NO:4)；
(gly4ser)3(SEQ ID NO:5)；
SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:6)；
ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:7)；
GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ ID NO:8)；和
Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO:9)。
可使用的其他多肽接头包含不同长度的聚甘氨酸，包括5、7或30个残基的聚甘氨酸。此外，可使用Flt-1的其他部分作为接头，例如Flt-1的域3或其部分或延伸，例如图10A-10E的氨基酸235-336。
还可以从其他的聚合物制作接头基团，例如聚乙二醇。此类接头可具有 10至1000、10-500、10-250、10-100或10-50个乙二醇单体单元。适合的聚合物大小应与适当的氨基酸残基范围所占据的大小相类似。典型大小的聚合物应提供约10-25埃的间隔。
用于本发明的融合蛋白的示例性形式如图2A-2B(SEQ ID NO:11)、6 (SEQ ID NO:15)、8(SEQ ID NO:17)和12(SEQ ID NO:21)所示，其分别由图 1(SEQ ID NO:10)、5(SEQ IDNO:14)、7(SEQ ID NO:16)和11(SEQ ID NO: 20)所示的多核苷酸序列所编码。此类序列描述于美国专利第7,928,072号中，其通过提述以其整体并入本文。
如图2A-2B(SEQ ID NO:11)所示的融合物，本文称为“sFLT01蛋白”，其按N端至C端的顺序包含：图2A-2B的位置1-23所示的信号序列；Flt-1 Ig样域2加上此域的延伸，示于图2A-2B的位置24-118(对应于图10A-10E的氨基酸 132-226)；九个甘氨酸的序列，示于图2A-2B的位置119-127；及图2A-2B的位置128-358处的IgG1-Fc CH2/CH3残基。
图6(SEQ ID NO:15)所示的融合物按N端至C端的顺序包含：图6的位置 1-23所示的信号序列；Flt-1 Ig样域2加上此域的延伸，示于图6的位置24-118 (对应于图10A-10E的氨基酸132-226)；九个甘氨酸的序列，示于图6的位置 119-127；及图6的位置128-141处的VEGF多聚化域。
图8(SEQ ID NO:17)按N端至C端的顺序包含：图8的位置1-23所示的信号序列；Flt-1 Ig样域2加上此域的延伸，示于图8的位置24-118(对应于图 10A-10E的氨基酸132-226)；九个甘氨酸的序列，示于图8之位置119-127；图 8的位置128-141处的VEGF多聚化域；及来自图8的位置142-247处的IgG CH2/CH3区的序列。
图12(SEQ ID NO:21)显示了本文称为“sFLT02”的融合物，其按N端至 C端的顺序包含：图12的位置1-23所示的信号序列；Flt-1 Ig样域2加上此域的延伸，示于图12的位置24-118(对应于图10A-10E的氨基酸132-226)；九个甘氨酸的序列，示于图12之位置119-127；及示于图12的位置128-233处的IgG CH2/CH3残基。
虽然此处讨论了具体的序列，但变体例如等位基因变体也可以使用。通常此类变体与所公开的序列具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性并保留本文所述的功能，包括多聚化及与VEFG结合的能力。
编码本发明所用的Flt-1受体及其融合蛋白的多核苷酸可使用标准的分子生物技术来制造。例如，编码上述分子的多核苷酸序列可使用如下方法来获得：例如通过从表达该基因的细胞筛选cDNA和基因组文库，或通过从已知包含该基因的载体来得到该基因。目的基因也可根据已知序列通过合成而非克隆来产生。所述分子可用针对具体序列的适当密码子来设计。然后从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸来组装完整序列，并组装成完整的编码序列。参见例如Edge,Nature(1981)292:756；Nambair等，Science(1984)223:1299；和Jay等，J.Biol.Chem.(1984)259:6311。
因此，具体的核苷酸序列可由带有所需序列的载体来获得，或完全或部分使用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术来合成，例如若适当的话，定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。参见例如Sambrook，上文。获得编码所需序列的核苷酸序列的一个方法是通过将常规自动多核苷酸合成仪所产生的重叠的合成寡核苷酸的互补组进行退火，然后以适当的DNA连接酶连接并将连接的核苷酸序列通过PCR扩增。参见例如Jayaraman等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(1991)88:4084-4088。此外，寡核苷酸-定向合成(Jones等，Nature (1986)54:75-82)、预先存在的核苷酸区的寡核苷酸定点诱变(Riechmann等Nature(1988)332:323-327和Verhoeyen等,Science(1988)239:1534-1536)以及使用T4DNA聚合酶的酶促填补寡核苷酸缺口(Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1989)86:10029-10033)可用于提供本方法中所用的分子。
如上所述，一但获得，编码该受体的寡核苷酸可直接或经接头基团连接至多聚化域。如下本文进一步描述的，该构建体可使用重组病毒载体来递送至患者。
基因递送技术
如上文所述的那些，sFlt-1构建体可使用任何数种基因递送技术来递送至所指的受试者。用于基因递送的数种方法是本领域所知的。一般而言，将重组载体系配制为如下述的药物组合物并用体内或体外转导技术导入受试者中。若以体外转导，则将所需的受体细胞从受试者移出，用重组载体转导并重新导入受试者中。另一种选择，可使同系的或异种的细胞，其中所述细胞不在受试者中产生不适当的免疫反应。
用于将经转导的细胞递送和导入受试者中的适合方法已有描述。例如，细胞可在体外通过如下方法来来转导：例如在适当的培养基中将重组载体与受试者的细胞组合，并使用常规技术(如Southern印迹和/或PCR)或通过使用选择性标记来筛选携带目的DNA的那些细胞。
已开发出许多用于体内或离体将基因转移至哺乳动物细胞的基于病毒的系统。例如，逆转录病毒提供了方便于基因递送系统的平台。可以用本领域已知的技术将选择的基因插入载体或包装于逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其体内或离体地递送至受试者细胞。许多逆转录病毒系统已有描述。参见例如美国专利第5,219,740号；Miller和Rosman,BioTechniques (1989)7:980-990；Miller,A.D.,Human Gene Therapy(1990)1:5-14；Scarpa等, Virology(1991)180:849-852；Burns等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:8033-8037；及Boris-Lawrie和Temin,Cur.Opin.Genet.Develop.(1993) 3:102-109。复制缺陷型鼠逆转录病毒载体是广泛利用的基因转移载体。鼠白血病逆转录病毒包含单链RNA，其与核心蛋白以及聚合酶(pol)酶复合，其被蛋白核(gag)包被并由确定宿主范围的糖蛋白外壳(env)环绕。逆转录病毒的基因组结构包含附在5’和3’长末端重复(LTR)处的gag、pol和env基因。逆转录病毒载体系统利用了含有5’和3’LTR及包装信号的最小载体足以允许载体包装和感染及整合至靶细胞的事实，其条件是病毒结构蛋白在包装细胞系中以反式提供。用于基因转移的逆转录病毒载体的基本优点包括在大部分细胞类型中有效感染及基因表达、精准的单一拷贝载体整合至目标细胞染色体DNA 中及逆转录病毒基因组的操作容易。
许多腺病毒载体已有描述。与整合至宿主基因组的逆转录病毒不同，腺病毒留在染色体外，从而将插入突变的相关风险减至最低(Haj-Ahmad和 Graham,J.Virol.(1986)57:267-274；Bett等,J.Virol.(1993)67:5911-5921； Mittereder等,Human Gene Therapy(1994)5:717-729；Seth等,J.Virol.(1994) 68:933-940；Barr等,Gene Therapy(1994)1:51-58；Berkner,K.L.BioTechniques (1988)6:616-629；和Rich等,Human Gene Therapy(1993)4:461-476)。用于主题方法中的腺病毒载体在下文中更详细地加以描述。
此外，已开发了用于基因递送的腺-相关病毒(AAV)载体系统。AAV载体可使用本领域已知的技术容易地构建。参见例如美国专利第5,173,414和 5,139,941号；国际公开号WO92/01070(1992年1月23日公开)和WO 93/03769 (1993年3月4日公开)；Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.(1988)8:3988-3996； Vincent等,Vaccines 90(1990)(Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Carter, B.J.Current Opinion in Biotechnology(1992)3:533-539；Muzyczka,N.Current Topics in Microbiol.and Immunol.(1992)158:97-129；Kotin,R.M.Human Gene Therapy(1994)5:793-801；Shelling和Smith,Gene Therapy(1994)1:165-169；以及Zhou等,J.Exp.Med.(1994)179:1867-1875。AAV载体系统进一步详述于下文中。
可用于递送目的核酸分子的其他的病毒载体包括衍生自痘科病毒的那些，包括牛痘病毒和禽痘病毒。例如，表达此类基因的牛痘病毒重组体可按照如下来构建。首先将编码具体多肽的DNA插入适当的载体中，使其与牛痘启动子相邻并且侧翼是牛痘DNA序列，如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后将该载体用于转染细胞，所述细胞同时经牛痘转染。同源性重组用于将牛痘启动子及编码该蛋白的基因插入病毒的基因组。所产生的TK-重组体可通过在 5-溴脱氧尿苷的存在下培养细胞而加以选择并挑选对其有抗性病毒斑。
或者，禽痘病毒，例如鸡痘和金丝雀痘病毒也可用来递送基因。使用禽痘载体在人和其他哺乳动物物种中是特别有利的，因为禽痘属的成员仅可在易感的鸟类中生产性复制因此在哺乳类细胞中无感染性。用于产生重组禽痘病毒的方法已为本领域所知，并且采用了基因重组，如上文关于牛痘病毒的生产所述的。参见例如WO 91/12882；WO 89/03429；及WO 92/03545。
分子缀合载体，例如描述于Michael等,J.Biol.Chem.(1993) 268:6866-6869及Wagner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:6099-6103中的腺病毒嵌合载体也可用于基因递送。
甲病毒(Alphavirus)属的成员，例如但不限于来源于辛德毕斯(Sindbis)和塞姆利基森林(Semliki Forest)病毒的载体，也可用作递送编码融合物的多核苷酸的病毒载体。关于可用于实施本发明方法的辛德毕斯病毒来源的载体的说明参见Dubensky等，J.Virol.(1996)70:508-519；及国际申请号WO 95/07995 和WO 96/17072。
或者，Flt-1构建体可在不使用病毒载体的情况下进行递送，例如通过以基于质粒的核酸递送系统，如美国专利号6,413,942；6,214,804；5,580,859； 5,589,466；5,763,270；及30 5,693,622中所述，其全部通过提述以其整体并入本文。质粒包含可操作地连接至控制元件的目的基因，所述控制元件指导蛋白产物的体内表达。此类控制元件已为本领域所知。
腺病毒基因递送系统
在本发明的一个实施方案中，将编码Flt-1受体(如上文所述的融合物)的核苷酸序列插入基于腺病毒的载体中。腺病毒基因组是约36,000个碱基对的线性双链DNA分子，其55-kDa末端蛋白共价结合至各链的5’端。腺病毒(“Ad”) DNA含有约100碱基对的相同的反向末端重复(“ITR”)，其确切长度取决于血清型。病毒的复制起点定位于ITR内，确切地位于基因组末端。DNA合成在2个阶段发生。首先，通过链置换进行复制，产生子代双链分子和亲代置换链。置换链为单链且可形成“锅柄状”中间产物，其允许复制开始并产生子代双链分子。或者，复制可同时从基因组的两个末端进行，而不需要形成锅柄结构。
在生产性感染周期期间，病毒基因在两个时期表达：早期，其为直至病毒DNA复制的时期，及晚期，其与病毒DNA复制的起始一致。在早期期间仅表达较早的基因产物(由E1、E2、E3和E4区所编码)，其执行许多功能来使细胞准备好合成病毒结构蛋白。在晚期期间，除了早期基因产物之外，还表达晚期病毒基因产物，且宿主细胞DNA和蛋白合成关闭。因此，细胞变得致力于病毒DNA及病毒结构蛋白的生产。
腺病毒载体的E1区是感染目标细胞后第一个表达的区域。该区由两个转录单位E1A和E1B基因组成。E1A基因产物主要的功能是引发休眠细胞进入细胞周期并重启细胞DNA合成，并转录性地激活E1B基因和其他早期区域 (E2、E3、E4)。单独用E1A基因转染原代细胞能诱导无限增殖(永生化)，但不导致完全转变。然而，E1A的表达在大部分的情况下导致程序性细胞死亡 (细胞凋亡)，且仅有偶发的永生化。需要E1B基因的共表达来防止引发细胞凋亡以及用于完全形态转变的发生。在建立的永生化细胞系中，E1A的高水平表达能引起在缺乏E1B情况下的完全转变。
E1B编码的蛋白帮助E1A重新指导细胞功能以允许病毒复制。E1B 55kD 和E4 33kD蛋白形成基本定位于在核中的复合物，其发挥作用来抑制宿主蛋白的合成及促进病毒基因表达。其主要的影响是建立从细胞核至细胞质的选择性病毒mRNA运输，随之发生的是感染晚期的开始。E1B 21kD蛋白对于正确地暂时性控制生产性感染周期是重要的，由此避免在病毒生命周期完成之前宿主细胞过早死亡。
基于腺病毒的载体以高水平表达基因产物肽。腺病毒载体具有感染高效性，即便在低病毒滴度情况下。此外，此病毒作为无细胞的病毒体时是完全感染性的，因此并不需要注射生产者(producer)细胞系。腺病毒载体在体内进行长期的异源基因表达。腺病毒与严重的人病理无关，此病毒可感染广泛的各种细胞并具有广泛的宿主范围，该病毒可相对容易地大量生产，并且该病毒可通过删除病毒基因组的早期区域1(“E1”)而成为复制缺陷的。因此，来源于人腺病毒的载体(其中至少E1区已被删除并被目的基因替换)已广泛地用于临床前和临床阶段的基因治疗实验。
用于本发明的腺病毒载体来源于任何各种腺病毒血清型，包括但不限于超过40种血清型腺病毒株的任一种，例如血清型2、5、12、40和41。本文所用的腺病毒载体是复制缺陷型的并含有处于适当的启动子(例如任何下文所述与腺-相关病毒相关的启动子)控制下的目的基因。例如，美国专利第 6,048,551号(其通过提述以其整体并入本文)描述了包含抗炎性细胞因子 IL-10的人基因的复制缺陷型腺病毒载体，以及包含抗炎性细胞因子IL-1ra的基因的载体，其处于劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子的控制下，分别称为 Ad.RSVIL-10和Ad.RSVIL-1ra。
来源于任何腺病毒血清型，以及具有不同启动子系统的其他的重组腺病毒可由本领域技术人员所使用。例如，美国专利第6,306,652号(其通过提述以其整体并入本文)描述了具有E2A序列的含有hr突变及ts125突变的腺病毒载体，称为ts400，以防止由E2A过度表达引起的细胞死亡，以及具有E2A序列的仅含有hr突变的处于诱导型启动子的控制下的载体，以及具有E2A序列的含有hr突变和ts125突变(ts400)的处于诱导型启动子的控制下的载体。
产物，描述于美国专利第6,306,652号中的“最小”腺病毒载体可用于本发明。此类载体保留至少部分的病毒基因组，所述部分是基因组衣壳化进入病毒颗粒中所必需的(衣壳化信号)，以及至少ITR的至少功能性部分或衍生物的至少一个拷贝。最小腺病毒载体的包装可通过与辅助病毒共感染来实现，或是用包装缺陷型复制辅助系统来实现，如美国专利第6,306,652号所述。
用于递送目的基因的其他有用的基于腺病毒的载体包括其中大多数的病毒基因组已去除的“无病毒性(gutless)”(辅助依赖的)腺病毒(Wu等， Anesthes.(2001)94:1119-1132)，此类“无病毒性”腺病毒载体基本上不产生病毒蛋白，因此能在单次施用后，在一年内允许病毒驱动的基因治疗成功地随之进行(Parks,R.J.,Clin.Genet.(2000)58:1-11；Tsai等,Curr.Opin.Mol.Ther. (2000)2:515-523)并消除免疫系统的干扰。此外，去除病毒基因组为插入控制序列创造出空间，所述控制序列提供通过全身性施用的药物的表达调控(Burcin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96:355-360)，增加病毒驱动的蛋白表达的安全性和控制。这些和其他的重组腺病毒可用于本发明的方法。
腺-相关病毒基因递送系统
腺-相关病毒(AAV)已成功用于递送基因治疗的基因。该AAV基因组是含有约4681个核苷酸的线性单链DNA分子。AAV基因组通常包含内部、非重复基因组，其各末端的侧翼是反向末端重复(ITR)。所述ITR长度为大约145碱基对(bp)。所述ITR具有多重功能，包括提供DNA的复制起点及包装病毒基因组的信号。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放读框，称为AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。病毒蛋白的rep和cap基因编码允许病毒复制并包装成病毒体的病毒蛋白。具体而言，至少四种病毒蛋白的家族表达自AAV rep 区，Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40，根据其表观分子量来命名。AAV cap 区编码至少三种蛋白，VPI、VP2和VP3。
AAV通过如下方法来工程改造以递送目的基因：删除AAV基因组的内部非重复部分(即rep和cap基因)并在ITR之间插入异源基因(在此情况下是编码 Flt-1受体或融合物的基因)。所述异源性基因通常在功能上连接至能在患者的目标细胞中于适当的条件下驱动基因表达的异源启动子(组成性，细胞特异性或诱导型启动子)。也可包含终止信号，例如多聚腺苷化位点。
AAV是辅助依赖性的病毒；换言之，其需要与辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘)共感染，从而形成AAV病毒体。在缺乏与辅助病毒的共感染情况下，AAV建立潜伏状态，其中病毒基因组插入宿主细胞染色体中，但不产生感染性的病毒体。随后通过辅助病毒感染来“挽救”整合的基因组，使其得以复制并将其基因组包装至感染性的AAV病毒体中。虽然AAV能感染来自不同物种的细胞，但辅助病毒必须是与宿主细胞相同的物种。因此，例如人AAV在经犬腺病毒共感染的犬细胞中复制。
包含目的基因的重组AAV病毒体可使用下本文更完整描述的各种本领域公认的技术来生产。野生型AAV和辅助病毒可用于提供生产rAAV病毒体所必须的复制功能(参见例如美国专利第5,139,941号，其通过提述以其整体并入本文)。或者，含有辅助功能基因的质粒与一个已知的辅助病毒的感染组合，可用作复制功能的来源(参见例如美国专利第5,622,856号和美国专利第5,139,941号，二者均通过提述以其整体并入本文)。类似地，含有附属功能基因的质粒可与野生型AAV的感染组合使用，用以提供必需的复制功能。这三种方法，当与rAAV载体组合使用时，其各自足以产生rAAV病毒体。技术人员还可以使用其他本领域已知的方法来产生rAAV病毒体。
在本发明的一个实施方案中，使用三重转染方法(详细描述于美国专利第 6,001,650号中，其通过提述以其整体并入本文)来产生rAAV病毒体，因为此方法不需要使用感染性的辅助病毒，从而能在无任何可检测的辅助病毒存在下产生rAAV病毒体。此方法通过使用三种用于产生rAAV病毒体的载体来完成： AAV辅助功能载体，附属功能载体和rAAV表达载体。然而，技术人员了解，这些载体所编码的核酸序列可以各种组合提供于两个或更多个载体上。
如上文所说明的，AAV辅助功能载体编码“AAV辅助功能”序列(即rep 和cap)，其以反式对生产性AAV复制和衣壳化发挥功能。AAV辅助功能能在不产生任何可检测的野生型AAV病毒体的情况下支持有效的AAV载体生产 (即含有功能性rep和cap基因的AAV病毒体)。此类载体的一个例子，pHLP19，描述于美国专利第6,001,650号中，其通过提述以其整体并入本文。如上文所述，AAV辅助功能载体的rep和cap基因基因可以来源于任何已知的AAV血清型。例如，AAV辅助功能载体可以具有来源于AAV-2的rep基因和来源于 AAV-6的cap基因；技术人员应了解，其他的rep和cap基因组合也是可能的，其限定的特征是支持rAAV病毒体生产的能力。
附属功能载体编码非AAV来源的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列， AAV依赖于所述功能以进行复制(即附属功能)。附属功能包括AAV复制所需的那些功能，包括但不限于涉及激活AAV基因转录、阶段特异性AAV mRNA 剪接、AAV DNA复制、cap表达产物的合成及AAV衣壳装配的那些模块。基于病毒的附属功能可以来源于任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒 (除单纯疱疹病毒-1型外)及牛痘病毒。在实施方案中，使用附属功能质粒pLadeno5(有关pLadeno5的详描述于美国专利第6,004,797号中，其通过提述以其整体并入本文)。该质粒提供整套用于AAV载体生产的腺病毒附属功能，但缺乏形成能复制的腺病毒所需的组分。
为了进一步了解AAV，关于重组AAV表达载体和AAV辅助和附属功能的更详细的论述提供于下文。
重组的AAV表达载体
使用已知的技术来构建重组的AAV(rAAV)表达载体，以至少提供转录方向上的可操作连接的组件、控制元件(包括转录起始区、目的多核苷酸和转录终止区)。该控制元件经选择在目的细胞(例如哺乳动物细胞)中是有功能的。所得的含有该可操作连接的组分的构建体与功能性AAV ITR序列结合(5’和3’)。
AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。AAV-2序列参见例如Kotin,R.M. (1994)HumanGene Therapy 5:793-801；Berns,K.I.“Parvoviridae and their Replication”inFundamental Virology,第2版,(B.N.Fields和D.M.Knipe编)。用于本发明载体中的AAVITR不需要具有野生型核苷酸序列，并且是可以改变的，例如通过插入、删除或取代核苷酸加以改变。此外，AAV ITR可来源于任何数种的AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R、AAV10、AAVrh10、 AAV11、AAV12等。此外，所选的AAV表达载体中的核苷酸序列侧翼的5’和 3’ITR不一定相同或来源于相同的AAV血清型或隔离种，只要其如所希望的发挥功能即可，即当细胞中存在AAV Rep基因产物时，允许从宿主细胞基因组或载体切除和挽救目的序列，并允许DNA分子整合至受体细胞基因组中。
适用于AAV载体的核苷酸分子大小应小于约5千碱基(kb)。所选的核苷酸序列可操作地连接至在受试者体内指导其转录或表达的控制元件。此类控制元件可包括通常与所选的基因相关的控制序列。或者，可使用异源控制序列。有用的异源控制序列通常包含来源于编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括但不限于神经元特异性烯醇化酶启动子、GFAP启动子、SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区(CMVIE)、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、合成的启动子、杂合启动子等。此外，来源于非病毒基因(例如鼠金属硫蛋白基因)的序列也可用于本文。此类启动子序列是可在商业上购得的，例如从Stratagene(San Diego,CA)购得。
携带与AAV ITR结合的目的多核苷酸分子的AAV表达载体，可以通过直接将所选的序列插入AAV基因组中来构建，所述AAV基因组已删除了主要的开放阅读框(“ORF”)。也可删除AAV基因组的其他部分，只要留下足够的ITR 部分以允许复制和包装功能即可。此类构建体可用本领域已知的技术来设计。参见例如美国专利第5,173,414号和5,139,941号；国际公开号WO 92/01070 (1992年1月23日公开)和WO 93/03769(1993年3月4日公开)；Lebkowski等(1988) Molec.Cell.Biol.8:3988-3996；Vincent等(1990)Vaccines 90(ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Carter(1992)Current Opinion in Biotechnology3:533-539； Muzyczka(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；Kotin (1994)Human Gene Therapy 5:793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1:165-169；及Zhou等(1994)J.Exp.Med.179:1867-1875。
或者，可以从病毒基因组中或从含有病毒基因组的AAV载体中切除AAV ITR并使用标准的连接技术将其融合于另一载体中存在的所选的核酸构建体的5’和3’，如Sambrook等前文中描述的那些。例如，连接可于20mM Tris-Cl pH 7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、33μg/mlBSA、10mM-50mM NaCl和40μM ATP、 0.01-0.02(Weiss)单位T4 DNA连接酶于0℃(用于“粘性末端”连接)完成或于 1mM ATP、0.3-0.6(Weiss)单位T4 DNA连接酶于14℃(用于“平末端”连接) 完成。分子间的“粘性末端”连接通常在30-100μg/ml总DNA浓度处(5-100nM 总末端浓度)进行。含有ITR的AAV载体已描述于例如美国专利第5,139,941号中。具体而言，本文描述了数种AAV载体，其可获取自美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)，登录号为53222、53223、53224、53225和53226。
就本发明而言，适合用于从AAV表达载体制造rAAV病毒体的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可用作或已经用作异源 DNA分子的受体并且其能在例如悬浮培养基、生物反应器等中生长。此术语包括已转染的原代细胞的子代。因此，如本文所用，“宿主”通常意指用外源 DNA序列转染的细胞。来自稳定的人细胞系293的细胞(可获取自例如美国菌种中心登录号ATCC CRL1573)可用于实施本发明。具体而言，人细胞系293 是经腺病毒5型DNA片段转染(Graham等(1977)J.Gen.Virol.36:59)的人胚胎肾细胞系，并且表达腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等(1979)Virology 94:460)。293 细胞系是容易转染的，并且提供产生rAAV病毒体的特别方便的平台。
AAV辅助功能
含有上述AAV表达载体的宿主细胞必须能提供AAV辅助功能以便于复制及衣壳化侧翼为AAV ITR的核苷酸序列，以产生rAAV病毒体。AAV辅助功能通常是AAV来源的编码序列，其可经表达以提供AAV基因产物，其转而以反式对生产性AAV复制发挥作用。AAV辅助细胞用于本文以补充AAV表达载体所缺失的必须的AAV功能。因此，AAV辅助功能包括主要的AAV ORF的一个或两个，即rep和cap编码区，或其功能性同源物。
“AAV rep编码区”意指编码复制蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40 的AAV基因组的本领域公认的区域。这些Rep表达产物已显示出具有许多功能，包括DNA复制的AAV起点的识别、结合及形成切口，DNA解旋酶活性及调节来自AAV(或其他异源性)启动子的转录。Rep表达产物整体上是复制 AAV基因组所需的。对AAV rep编码区的说明参见例如Muzyczka,N.(1992) Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；及Kotin,R.M.(1994) Human Gene Therapy 5:793-801。合适的AAV rep编码区的同源物包括人疱疹病毒6(HHV-6)rep基因，已知其还介导AAV-2DNA复制(Thomson等(1994) Virology 204:304-311)。
“AAV cap编码区”意指编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3或其功能性同源物的AAV基因组的本领域公认的区域。这些Cap表达产物提供包装功能，其整体上是包装病毒基因组所需的。关于AAV cap编码区的说明参见例如 Muzyczka,N.和Kotin,R.M.(前文)。
通过如下方式将AAV辅助功能导入宿主细胞：在用AAV表达载体转染之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞。因此用AAV辅助构建体来提供AAV rep和/或cap基因的至少瞬时表达，以补充生产性AAV转染所必需的缺失的AAV 功能。AAV辅助构建体缺乏AAV ITR且可能既无法复制也无法包装其自身。
这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体形式，许多的AAV辅助构建体已有描述，例如编码Rep和Cap表达产物二者的常用质粒pAAV/Ad和pIM29+45。参见例如Samulski等(1989)J.Virol.63:3822-3828；及McCarty等(1991)J.Virol.65:2936-2945。许多编码Rep和/或Cap表达产物的其他的载体已有描述，参见例如美国专利第5,139,941号。
AAV附属功能
宿主细胞(或包装细胞)也必须能提供非AAV来源的功能或“附属功能”，以产生rAAV病毒体。附属功能是非AAV来源的病毒和/或细胞功能，AAV依赖其用于AAV的复制。因此，附属功能包括至少那些AAV复制中所需的非 AAV蛋白及和RNA，包括涉及AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA 剪接、AAV DNA复制、合成Cap表达产物和AAV衣壳装配的那些。基于病毒的附属功能可以来源于自任何已知的辅助病毒。
具体而言，可以使用本领域技术人员已知的方法导入附属功能然后在宿主细胞中表达。通常，附属功能通过用不相关的辅助病毒感染宿主细胞来提供。有许多已知适合的辅助病毒，包括腺病毒；疱疹病毒例如单纯疱疹病毒第1和2型；及牛痘病毒。非病毒附属功能也可用于本文，例如使用任何各种已知的试剂通过细胞同步化所提供的那些。参见例如Buller等(1981)J.Virol. 40:241-247；McPherson等(1985)Virology 147:217-222；Schlehofer等(1986) Virology 152:110-117。
或者，附属功能可使用上文所定义的附属功能载体来提供。参见例如美国专利第6,004,797号及国际公开号WO 01/83797，其通过提述以其整体并入本文。提供附属功能的核酸序列可获取自天然来源，如获取自腺病毒颗粒的基因组，或使用本领域已知的重组或合成方法来构建。如上文所说明的，已验证了附属辅助功能并不需要完全互补的腺病毒基因。具体而言，不能进行 DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体已显示出对于AAV复制是允许的。 Ito等，(1970)J.Gen.Virol.9:243；Ishibashi等,(1971)Virology 45:317。类似地，E2B和E3区内的突变体已显示出支持AAV复制，说明E2B和E3区可能不涉及提供附属功能。Carter等，(1983)Virology 126:505。然而，缺乏E1区，或删除了E4区的腺病毒无法支持AAV复制。因此，AAV复制可能直接或间接地需要E1A和E4区。Laughlin等，(1982)J.Virol.41:868；Janik等,(1981)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 78:1925；Carter等,(1983)Virology 126:505。其他已表征的Ad突变体包括：E1B(Laughlin等(1982),前文；Janik等(1981),前文； Ostrove等,(1980)Virology 104:502)；E2A(Handa等,(1975)J.Gen.Virol.29:239；Strauss等,(1976)J.Virol.17:140；Myers等,(1980)J.Virol.35:665；Jay 等,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2927；Myers等,(1981)J.Biol.Chem. 256:567)；E2B(Carter,Adeno-Associated Virus Helper Functions,in I CRC Handbook ofParvoviruses(P.Tijssen编,1990))；E3(Carter等(1983),前文)；及 E4(Carter等(1983),前文；Carter(1995))。虽然用在E1B编码区具有突变的腺病毒所提供的附属功能的研究产生了矛盾结果，但Samulski等，(1988)J.Virol. 62:206-210已报道了E1B55k是产生AAV病毒体所需的，而E1B19k则不然。此外，国际公开WO 97/17458和Matshushita等，(1998)GeneTherapy 5:938-945 描述了编码各种Ad基因的附属功能载体。附属功能载体可以包含腺病毒VA RNA编码区、腺病毒E4 ORF6编码区、腺病毒E2A 72kD编码区、腺病毒E1A 编码区、及缺乏完整E1B55k编码区的腺病毒E1B区。此类载体描述于国际公开号WO 01/83797中。
由于用辅助病毒感染宿主细胞或用附属功能载体转染宿主细胞，附属功能得以表达，其反式激活AAV辅助构建体以产生AAV Rep和/或Cap蛋白。Rep 表达产物从AAV表达载体切除重组的DNA(包括目的DNA)。Rep蛋白还用于复制AAV基因组。将表达的Cap蛋白组装至衣壳中，并将重组的AAV基因组包装入衣壳中。从而随之发生了生产性AAV复制，并将DNA包装至rAAV病毒体中。“重组AAV病毒体”或“rAAV病毒体”在本文中定义为感染性的复制缺陷型病毒，其包含AAV蛋白壳、并将两侧侧翼为AAV ITR的目的异源核苷酸序列衣壳化。
在重组AAV复制之后，可使用各种常规纯化方法从宿主细胞纯化rAAV 病毒体，例如柱色谱法、CsCl梯度法等。例如，可使用多个柱纯化步骤，例如在阴离子交换柱、亲和柱和/或阳离子交换柱上纯化。参见例如国际公开号 WO 02/12455。此外，若采用感染来表达附属功能，则可使用已知的方法使残余的辅助病毒失活。例如，可通过加热至约60℃的温度例如20分钟或更久，使腺病毒失活。此处理仅有效地灭活辅助病毒，因为AAV为是极度热稳定的，而辅助腺病毒则是热不稳定的。
然后使用下文所述的技术将所得的含有目的核苷酸序列的rAAV病毒体用于基因递送。
rAAV颗粒
在一些实施方案中，所述病毒颗粒是包含核酸的重组AAV颗粒，所述核酸包含侧翼为一个或两个ITR的转基因。所述核酸被衣壳化于AAV颗粒中。所述AAV颗粒也包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述核酸包含目的蛋白编码序列(例如治疗性的转基因)，其可操作地连接至转录方向上的组件，控制序列(包含转录起始和终止序列)，由此形成表达盒。所述表达盒在5’和3’末端侧翼至少有一个功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”意指ITR序列，其功能为意欲挽救、复制和包装AAV病毒体。参见Davidson等，PNAS, 2000,97(7)3428-32；Passini等,J.Virol.,2003,77(12):7034-40；及Pechan等, Gene Ther.,2009,16:10-16，其全部通过提述以其整体并入本文。对于实施本发明的一些方面而言，所述重组载体包含至少衣壳化所必需的所有AAV序列和用于由rAAV感染的物理结构。用于本发明的载体中的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如Kotin,Hum.Gene Ther.,1994,5:793-801中所述)，且可通过插入、删除或取代核苷酸来加以改变，或AAV ITR可来源于任何数种 AAV血清型。目前已知有超过40种AAV的血清型，并正在继续鉴定新的血清型和现存血清型的变体。参见Gao等，PNAS,2002,99(18):11854-6；Gao等, PNAS,2003,100(10):6081-6；及Bossis等,J.Virol.,2003,77(12):6799-810。使用任何的AAV血清型均视为在本发明的范围内。在一些实施方案中，rAAV 载体是来源于AAV血清型的载体，所述AAV血清型包括但不限于AAV1、 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、 AAVrh.10、AAV11、AAV12等。在一些实施方案中，所述AAV中的核酸包含 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、 AAVrh10、AAV11、AAV12等的ITR。在进一步的实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAVrh.8、AAVrh.10、AAV11、AAV12等的衣壳蛋白。在进一步的实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白(Gao，等J. Virol.2004,78(12):6381)。
使用不同的AAV血清型来优化具体的靶细胞的转导，或用于靶向具体的靶组织(例如患病的组织)内的特定细胞类型。rAAV颗粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。本文提供用于生产rAAV颗粒的AAV血清型的任何组合，如同各组合已于本文明确说明一样。
自身互补的AAV病毒基因组
在一些方面，本发明提供包含重组自身互补基因组的病毒颗粒。具有自身互补基因组的AAV病毒颗粒及使用自身互补的AAV基因组的方法描述于美国专利号6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729； 8,093,054；和8,361,457；以及Wang Z.等，(2003)Gene Ther 10:2105-2111中，其各自通过提述以其整体并入本文。包含自身互补基因组的rAAV利用其部分互补的序列快速形成双链DNA分子(例如转基因的互补编码和非编码链)。在一些实施方案中，本发明提供包含AAV基因组的AAV病毒颗粒，其中所述 rAAV基因组包含第一异源多核苷酸序列(例如治疗性转基因编码链)和第二异源多核苷酸序列(例如治疗性转基因的非编码链或反义链)，其中所述第一异源多核苷酸序列可与第二多核苷酸序列沿其大部分或全长形成链内碱基对。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过促进链内碱基配对的序列(例如发夹DNA结构)相连接。发夹结构是本领域已知的，例如siRNA分子。在一些实施方案中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过突变的ITR(例如右侧ITR)相连接。突变的ITR包括包含末端解析序列的D区的删除。因此，在复制AAV病毒基因组时，rep蛋白不会在突变的ITR处切割该病毒基因组，并且如此，将按5’至3’顺序包含如下的重组病毒基因组包装至病毒衣壳中：AAV ITR、包含调控序列的第一异源多核苷酸序列、突变的AAV ITR、与第一异源多核苷酸反向的第二异源多核苷酸，以及第三AAV ITR。
生产rAAV载体
已知在本领域有许多方法用于生产rAAV载体，包括转染、稳定细胞系生产，以及感染性杂交病毒生产系统，其包括腺病毒-AAV杂交、疱疹病毒 -AAV杂交和杆状病毒-AAV杂交。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养均需要如下：1)适合的宿主细胞，包括例如人来源的细胞系例如HeLa、A549 或293细胞，或昆虫衍生的细胞系例如SF-9(就杆状病毒生产系统而言)；2) 适合的辅助病毒功能，其由野生型或突变的腺病毒(例如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体所提供；3)AAV rep和cap 基因及基因产物；4)侧翼为至少一个AAV ITR序列的转基因(例如治疗性转基因)；及5)合适的培养基和培养基组分以支持rAAV生产。本领域已知的合适的培养基可用于生产rAAV载体。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括改良的伊格尔培养基(MEM)、达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、定制的配制物，如描述于美国专利第 6,566,118号中的那些，以及如描述于美国专利第6,723,551号中的Sf-900 II SFM培养基，其各自通过提述以其整体并入本文，特别是关于用于生产重组 AAV载体的定制培养基配制物。
合适的本发明的rAAV生产培养基可用0.5％-20％(v/v或w/v)量的血清或血清来源的重组蛋白予以补充。或者，如本领域已知的，rAAV载体可在无血清的条件(其也称为无动物来源产物的培养基)下生产。本领域普通技术人员可了解，经设计以支持rAAV载体的生产的商业或定制培养基也可补充一种或多种本领域已知的细胞培养组分，包括但不限于葡萄糖、维生素、氨基酸和/或生长因子，以增加生产培养基中rAAV的滴度。
rAAV生产培养基可以在适合于所要使用的具体宿主细胞的多种条件下生长(在广泛的温度范围，进行不同的时间长度等)。如本领域已知的，rAAV 生产培养包括贴附依赖性的培养，其可在合适的贴附依赖性容器中，如例如转瓶、中空纤维过滤器、微载体和填充床或流化床生物反应器中培养。rAAV 载体生产培养也可包括适应于悬浮的宿主细胞，例如HeLa、293和SF-9细胞，其可以用各种方式来培养，包括例如旋转瓶、搅拌釜生物反应器和一次性系统例如Wave袋系统。
可以通过裂解生产培养基的宿主细胞而从rAAV生产培养基收获本发明的rAAV载体颗粒，或通过从生产培养基收获用过的培养基来进行，其条件是细胞培养于本领域已知的条件下从而使rAAV颗粒从完整的细胞释放至培养基中，如美国专利第6,566,118号中所更完整地描述的)。合适的裂解细胞的方法也是本领域所知的，并包括例如冻/融循环、声处理、微流化及以化学品处理，例如洗涤剂和/或蛋白酶。
纯化rAAV载体
在收获时，本发明的rAAV生产培养物可以含有如下一项或多项：(1)宿主细胞蛋白；(2)宿主细胞DNA；(3)质粒DNA；(4)辅助病毒；(5)辅助病毒蛋白； (6)辅助病毒DNA；及(7)培养基组分，包括例如血清蛋白、氨基酸、转铁蛋白和其他低分子量蛋白。此外，rAAV生产培养还包含具有选自下组的AAV衣壳血清型的rAAV颗粒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12，等。
因此，在一些实施方案中，rAAV生产培养收获物经澄清化以去除宿主细胞碎片。在一些实施方案中，生产培养收获物通过过滤经过一系列深层过滤器，包括例如DOHC级Millipore Millistak+HC Pod过滤器、A1HC级Millipore Millistak+HC Pod过滤器及0.2μmFilter Opticap XL1O Millipore Express SHC 亲水膜过滤器，来进行澄清化。澄清化也可通过本领域已知的各种其他标准技术来进行，例如离心或经本领域已知的任何0.2μm或更大孔径的纤维素乙酸酯滤器过滤。
在一些实施方案中，rAAV生产培养收获物进一步经
处理以消化生产培养物中存在的任何高分子量DNA。在一些实施方案中，所述
消化在本领域已知的标准条件下进行，包括例如终浓度为1-2.5单位/ml的
在环境至37℃的温度范围进行30分钟至数小时的时间。
rAAV颗粒可使用一个或多个如下纯化步骤来分离或纯化：离心、流经式(flow-through)阴离子交换过滤、用于浓缩rAAV颗粒的切向流过滤(TFF)、通过磷灰石色谱的rAAV捕获、辅助病毒的热失活、通过疏水相互作用色谱的rAAV捕获、通过尺寸排阻色谱(SEC)的缓冲剂交换、纳米过滤及通过阴离子交换色谱的rAAV捕获。这些步骤可单独使用、以各种组合或以不同的顺序来使用。在一些实施方案中，此方法包括按下文所述的顺序的所有步骤。纯化rAAV颗粒的方法参见例如美国专利号6,989,264和8,137,948以及WO 2010/148143。
组合物及递送
一旦产生，将sFlt-1受体或编码其的载体(或病毒体)，如上述的融合蛋白，配制成适于直接递送至眼睛的组合物，从而治疗黄斑变性。若基因治疗是所需的，则组合物包含足够的遗传物质以产生治疗有效量的目的Flt-1，例如足以结合并介导相应信号途径的效果的量，或是降低或改善所述疾病状态的症状，或足以赋予所需益处的量。适当的剂量也取决于所治疗的受试者的病况、年龄、所治疗的病况的严重度、施用模式、以及其他因素。技术人员可容易地确定合适的有效量。
因此，“治疗上有效量”落在相当广泛的范围中，其可经临床试验来确定。例如，对于体内注射rAAV病毒体而言，治疗上有效剂量近似于约106至 1015个重组病毒的载体基因组(vg)，如108至1014vg，例如108至1012vg，例如 108至1010vg、108至109vg，或其间的任何整数，如.5x 108vg...1x 108vg...1.5 x 108vg...2x 108vg...5x 108vg...1x 109vg...2x109vg...3x 109vg...5x 109 vg...6x 109vg...1x 1010vg...2x 1010vg...5x 1010vg...1x1011vg...5x 1011vg... 1x 1012vg...5x 1012vg等。
在一些方面，所述组合物还包含眼科上可接受的赋形剂。组合物可配制成溶液、凝胶、软膏、悬浮液、使用前用介质来重建的干粉，或其他适合且耐受良好的眼科递送系统。此类赋形剂包括适于直接递送至眼睛的任何药剂，其可以施用而没有不当毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨醇、任何各种TWEEN化合物、和液体，如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐类可包含在其中，例如无机酸盐类如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐类例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等，可存在于此类介质中。药学上可接受赋形剂的深入论述可参见REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)。
在整个治疗过程中施用可以一个剂量连续或间歇地进行。确定最有效施用方式的方法是技术人员所已知的，且随载体、治疗组合物、靶细胞和所治疗的受试者而变化。可用治疗医师所选择的剂量和模式进行单一和多重施用。
若是施用多重剂量，则施用的第一配制物可与后续的配制物相同或不同。因此，例如第一次施用可以是AAV病毒体的形式而第二次施用是腺病毒载体、质粒DNA、AAV病毒体、亚单位疫苗组合物等的形式。此外，后续递送也可与第二次递送的模式相同或不同。
应了解，可通过递送的重组载体来表达一个以上的转基因。或者，也可如本文所述将各自表达一个或多个不同转基因的分离的载体递送至受试者。因此，许多转基因也可同时或序贯地进行递送。此外，将通过本发明方法递送的载体与其他适合的组合物和治疗进行组合，也是所意欲的。例如，可以存在用于治疗黄斑变性的其他化合物。
如上文所说明的，对于递送sFlt-1受体构建体至眼睛(无论是通过基因治疗或是蛋白治疗)，施用通常是局部的。这具有限制所需施用的物质(蛋白或 DNA)的量和限制全身性副作用的优点。可以使用许多可能的递送模式，包括但不限于：用基因枪局部施用在角膜上；结膜下注射，前房内注射 (intracameral injection)，经由眼睛滴剂滴至角膜，经由颞侧角膜缘注射至前房，基质内注射，与电脉冲组合的角膜施用、角膜内注射、视网膜下注射、玻璃体内注射(例如前、中或后玻璃体注射)及眼内注射。或者，细胞可离体转染或转导并通过眼内植入(implantation)递送。参见Auricchio,Mol.Ther. (2002)6:490-494；Bennett,Nature Med.(1996)2:649-654,1996；Borras, Experimental Eye Research(2003)76:643-652；Chaum,Survey of Ophthalmology(2002)47:449-469；Campochiaro,ExpertOpinions in Biological Therapy(2002)2:537-544；Lai,Gene Therapy(2002)9:804813；Pleyer, Progress in Retinal and Eye Research(2003)22:277-293。
因此，眼用配制物以任何适于眼部药物施用的形式来予以施用，例如适于局部施用的剂型、用于眼睛滴剂施用的溶液或悬浮液、洗眼液、或注射剂、软膏、凝胶、脂质体分散剂、胶体微粒悬浮液等，或眼用嵌入剂(ocular insert)，例如任选的生物可降解的控制释放的聚合物基质。将眼用嵌入剂植入结膜、巩膜、平坦部、眼睛前段或后段中。植入物提供控制释放的配制物至眼睛表面，通常为延长时间的持续释放。此外，在实施方案中，所述配制物整体由包含天然存在的和/或作为美国食品药品监督管理局GRAS(“一般视为安全的”)的组分组成。
可使用蛋白和核酸的组合治疗。例如，可将本发明的融合蛋白施用于患者。若观察到有利的反应，则可以施用编码该融合蛋白的核酸分子以图长期效果。或者，蛋白和核酸可同时或大约同时施用。
剂量治疗可以是单一给药方案或多重给药方案。此外，可对受试者施用适当数目的剂。技术人员可容易地确定剂的适当数目。
在一些方面，本文所述的组合物用于任何本文所述的方法中。
本发明的试剂盒
本发明还提供试剂盒。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含一个或多个容器，所述容器包含纯化的sFlt-1受体、包含sFlt-1受体的融合体、编码 sFlt-1受体的重组载体或编码sFlt-1受体的AAV病毒体/rAAV载体。在实施方案中，此类试剂盒包含眼科上可接受的赋形剂。此类试剂盒也可包含适于眼部递送的递送装置。此类试剂盒还可包含合适的一组说明书，一般是书面说明，其涉及用于任何本文所述方法的试剂盒的使用及其内容物。
此类试剂盒可包括任何方便、适当包装的组分。例如，若核酸、蛋白、载体或病毒体以干燥配制物来提供(例如冷冻干燥的或干燥粉末)，可使用具有弹力塞子的小瓶，使得载体可经弹力塞通过注射流体而重悬。液体配制物可使用具有无弹力、可移除的封盖(例如密封玻璃)或弹力塞的安瓿。亦涵盖与特定装置(例如注射器)组合使用的包装。
说明书通常包含关于意欲使用的方法的剂量、给药方案及施用途径的信息。容器可以是单位剂、大量包装(例如多剂包装)或亚单位剂。本发明的试剂盒中所提供的说明书通常是标签或包装插页(包括在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但也可涵盖机器可读取的说明(例如携带于磁盘或光盘上的说明)。
2.实验
下文是用于进行本发明的具体实施方案的实例。此类实例仅提供来用于说明目的，而非意在于任何方面限制本发明的范围。
尽管已努力确保关于所用的数字的精确性(例如量、温度等)，但当然应可容许某些实验误差和偏差。
材料和方法
可溶性载体构建。
图1(SEQ ID NO:10)和2A-2B(SEQ ID NO:11)显示了称为“sFLT01蛋白”的融合蛋白的DNA和蛋白序列。该构建体按N端至C端的顺序包含：图2A-2B 的位置1-23处所示的信号序列；图2A-2B的位置24-118处所示的Flt-1 Ig样域2 加上此域的延伸；图2A-2B之位置119-127处所示的9个甘氨酸的序列；及图 2A-2B的位置128-358处的IgG1-Fc CH2/CH3残基。
将DNA克隆至质粒pCBA(2)-int-BGH中，其含有杂交鸡β-肌动蛋白(CBA) 启动子及牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列(BGH poly A)。Xu等，Hum.Gene. Ther.(2001)12:563-573。
然后将整个sFLT01表达盒克隆至含有AAV2反向末端重复(ITR)的前病毒(previral)质粒载体pAAVSP70中。Ziegler等，Mol.Ther.(2004)9:231-240。在包含侧翼为ITR的区域的质粒sp70.BR/sFLT01中所得的AAV基因组总大小为4.6kb。
以三重的293细胞转染，使用辅助质粒p5rep-Δ-CMVcap和pHelper (Stratagene,LaJolla,CA,USA)产生重组载体AAV2-sFLT01，并根据该规程使用碘克沙醇(iodixanol)分步梯度及HiTrap Heparin柱(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ,USA)于
FPLC系统(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)上纯化。Vincent等，J.Virol.(1997)71:1897-1905； Zolotukhin et al.,Methods(2002)28:158-167。
使用实时TaqMan PCR测定法(ABI Prism 7700；Applied Biosystems, FosterCity,CA,USA)用特异性针对BGH poly A序列的引物来确定病毒滴度。
玻璃体内注射。
对于实施例1，将雌性长尾猕猴(Macaca fascicularis)2.1-2.8kg以氯胺酮(ketamine)和地西泮(diazepam)镇静。在剂量施用之前，用聚维酮碘 (povidone-iodine)局部消毒剂清洁眼睛并用无菌生理盐水冲洗。将瞳孔放大剂 (1％托吡卡胺(tropicamide))和局部麻醉剂(丙美卡因(proparacaine))缓慢灌输至各注射的眼睛中。插入撑眼器以便在处理期间保持眼皮张开及眼球后缩。经由巩膜和平坦部大约边缘后方4mm插入剂量注射器的27号针。然后将针导向晶状体后方进入三个位置之一：与周围视网膜相邻的前部玻璃体，中部玻璃体或与黄斑部相邻的后部玻璃体。AAV载体以50μl或100μl的总体积注射。
诱导脉络膜新生血管(CNV)。
在测试样品的施用后(以允许足以使转基因达到峰表达的时间)，在灵长类中诱导CNV。使用532nm波长的二极管激光(Iridex Corp.,Mountain View, CA)和裂隙灯适配器来破坏布氏膜(Bruch’s membrane)以诱导CNV。使用相同的类型的激光用75微米大小的点于500-700mW操作100-200毫秒，从而在黄斑区上以3x 3网隔形式放置9个烧灼点。
CNV评估。
在激光诱导后2、3和4周，用荧光血管造影术来评估来自猴CNV病损的渗漏。用荧光素染剂(10％荧光素钠，约0.1mL/kg)注射镇定的动物并在染剂注射后在数个时间点拍摄眼底，以监测动脉和静脉相。收集眼底镜影像并分析各烧灼位置处是否存在CNV渗漏。
实施例1
AAV2-sFLT01在非人灵长类中的效力
在非人灵长类(NHP)中进行了两项研究，用以确定玻璃体内施用 AAV2-sFLT01的效力。在第一项研究(研究A)中，用玻璃体内2x 108或2x 109 vg的AAV2-sFLT01来处理长尾猕猴。对侧的对照眼睛以相同剂量的不编码转基因的AAV2载体(AAV2-空)来处理。在载体施用后6周进行激光CNV诱导。发现CNV的程度在3周荧光血管造影时最大，因此，以此时间点用来评估治疗效力。比较AAV2-sFLT01治疗和对侧对照眼睛之间渗漏病损的数目(表1)。相比于AAV2-空的对照眼睛，在渗漏的CNV病损中，无任何sFLT01治疗组显示出统计学上的显著降低。
在第2个研究(研究B)中，以玻璃体内递送2x 1010vg的AAV2-sFLT01或 AAV2-空，而对侧眼睛则保持未处理。在载体施用后22周进行两眼中的激光 CNV诱导。相比于未处理的对侧对照眼睛，所有6个经AAV2-sFLT01处理的眼睛在CNV渗漏的量上显示出显著降低，其中仅7％的经AAV2-sFLT01处理的烧灼点呈现CNV渗漏，而在对照眼睛中有56％的烧灼点渗漏。如Fisher’s精确检验 (Fisher’s exact test)所确定的，此差异是统计学上显著的(p<0.0001)。相比于未处理的对照眼睛，经AAV2-空的对照载体处理的眼睛并未显示出CNV降低。
表1.来自两个NHP效力研究的结果
在以激光诱导CNV之前6周，来自研究A的同侧眼睛接受了AAV2-sFLT01 载体，而对侧对照眼睛接受了AAV2-空载体。在研究B中，在两眼中用激光诱导CNV之前6周，同侧眼睛接受了AAV2-sFLT01载体，而对侧对照眼睛维持未处理。在激光诱导时的平均sFLT01表达水平如表中所示。
总之，玻璃体内施用编码VEGF的可溶性受体的AAV2基因治疗载体，在非人灵长类眼睛中导致了具有转基因产物的剂量依赖表达的视网膜细胞转导。早在施用后3周首先测量了表达并发现其直至最后的测量时间点(23周) 是相对稳定的。
在NHP模型中观察效力，在8只动物中有7只在水状液(aqueous humor)中其sFLT01表达量高于100ng/mL，说明可能具有sFLT01的阀值，所述阈值必须达到以产生此模型中新血管形成的改变。相比于对照眼睛，在载体施用后 22周，经激光处理的所有6只用2x 1010vg处理的动物均具有降低的CNV。
实施例2
AAV2-sFLT01在人中的效力
在人中进行剂量递增研究，用以评估单一玻璃体内注射AAV2-sFLT01的安全性、耐受性和效力。如上所述生产AAV2-sFLT01。用于本研究的患者是末期新生血管AMD患者。符合本研究资格的标准包括如下：
·继发于AMD之后的脉络膜新生血管膜(CNV)，如患者病史和CNV诊断记录所确认的。
·研究的眼睛中20/100或更差的远距离最佳矫正视力(BCVA)。
·另一眼必须具有20/400或更佳的远距离BCVA。
·研究的眼睛，即接受AAV2-sFLT01的眼睛，具有最差的CVA(相比于另一眼)。
·对于剂量递增部分的研究，研究的眼睛的窝下盘状结疤(subfoveal disciformscarring)。对于第二部分的研究(最大耐受剂量(MTD)期)，患者在研究的眼睛中可具有或可不具有黄斑结痂。此外，招入第二部分研究的患者必须在筛选之前及患者最近的抗-VEGF治疗后12周内，已显示对抗-VEGF有响应性。
·明显存在视网膜内液或视网膜下液。
·适度放大瞳孔以允许彻底的眼睛检查和测试。
排除标准如下：
·研究的眼睛中由于任何AMD以外的因素导致的CNV。
·筛选期间研究的眼睛的病况史，其可能改变视力或干扰研究测试。
·活性的不受控的青光眼。
·招入3个月内研究的眼睛有任何眼内手术，或已知其是或者可能是在 1年的治疗内对研究的眼睛进行眼内手术的候选者(包括白内障手术)。
·研究的眼睛的急性或慢性感染。
·研究的眼睛有发炎病史或任一只眼睛有进行中的发炎。
·任何针对玻璃体内注射的禁忌症。
·研究的眼睛在60天内接受过光动力治疗(Photo Dynamic Therapy)，或在筛选前14天内接受过激光光凝固术(photocoagulation)。
·当前正在使用或在筛选前1个月内已使用兰尼单抗(ranibizumab) 
贝伐单抗(bevacizumab)(Avastin TM)或哌加他尼钠 (pegaptanib sodium)
·当前正使用或在筛选前4个月内已使用阿柏西普(Aflibercept) 
·当前正使用任何眼周(研究的眼睛)、玻璃体内(研究的眼睛)，或在筛选前3个月内使用全身性(口服或静脉内)类固醇。
·任何活性的疱疹感染，特别是眼睛中或脸上的活性病损。
·任何可能会阻碍研究依从性和随访的明显控制不佳的疾病。
·当前或之前使用了任何已知对视网膜或视神经有毒性的药物。
·既往用过任何眼科或全身性基因转移产品治疗。
·在筛选前120天内接受任何试验药品。
在第一部分的研究中，对四组分别的患者组施用了如下的100μL固定体积的不同剂量的AAV2-sFLT01。(1)第1组在一只眼睛接受了2x 108vg的单一玻璃体内注射；(2)第2组在一只眼睛接受了2x 109vg的单一玻璃体内注射； (3)第3组在一只眼睛接受了6x 109vg的单一玻璃体内注射；(4)第4组在一只眼睛接受了2x 1010vg的单一玻璃体内注射。
这些剂量经确定为安全且完全耐受的。具体而言，未观察到剂量限制性毒性(DLT)且未达到MTD。
为了确定AAV2-sFLT01的效力，通过光学相干断层摄影术(OCT)测量了与基线相比的视网膜下液和视网膜内液量的变化。此外，测量了BCVA作为如经前房出口(taps)的水状液中sFLT01蛋白的水平。
令人惊讶地，如OCT所测量的，接受2x 108vg单一玻璃体内注射的患者表现出显著的视网膜下液和视网膜内液降低。参见图15小图A和B。
在第二部分的研究中，将用于第一研究的高剂量单一玻璃体内注射(2x 1010vg)给予不同的患者。如OCT所测量的，此剂在注射后两个月也造成了视网膜下液和视网膜内液量的显著降低。参见图16小图A和B。
表2显示了预期的响应者和无响应者。预期的响应者的特征是：基于其基线特征，预期显示出对抗-VEGF治疗有响应的患者。故而预期的响应者特征如下：完全响应者：显示出稳固响应、干燥的视网膜，且回复到正常视网膜解剖学而不需要额外治疗的患者。部分响应者：显示出一些液体减少的患者。无响应者：未见效果。
表2
生物学活性
| N＝19<sup>a</sup> | 预计的响应者(N＝11) | 预计的无响应者(N＝7) |
| 响应者 | 4<sup>b</sup> | 0 |
| 部分响应者 | 2 | 0 |
| 无响应者 | 5 | 7 |
a.有一名患者是不可评估的。
b.在四名全部响应者中：一名超出(out)三年，一名超出二年，一名超出一年，一名超出18个周。
如表2中所示，11名预期响应者中有6名显示出对治疗至少有部分响应。
由此，描述了用于治疗黄斑变性的方法，以及包含sFlt-1受体及其融合物的组合物。虽然已略加详细地描述了本发明的实施方案，但应了解的是，在不背离本文所定义的本发明精神和范围的情况下，可进行显而易见的变化。
序列表
<110> 建新公司(GENZYME CORPORATION)
<120> 用于治疗和预防黄斑变性的组合物及方法
<130> 0800-0066.40
<150> US 61/936,797
<151> 2014-02-06
<160> 23
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys
1 5
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys
1 5
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser Cys Val Pro Leu Met
1 5 10 15
Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn
20
<210> 10
<211> 1077
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> sFLT01 protein: DNA sequence for a fusion protein including Flt-1
<400> 10
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120
actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180
ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240
agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300
gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360
ggtggaggtg gaggtggagg tcctaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 420
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 480
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 540
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 600
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 660
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 720
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 780
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 840
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 900
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 960
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1020
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatag 1077
<210> 11
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sFLT01蛋白氨基酸序列
<400> 11
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser
20 25 30
Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile
35 40 45
Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe
50 55 60
Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser
65 70 75 80
Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu
85 90 95
Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr
100 105 110
Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro
115 120 125
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145 150 155 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165 170 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180 185 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195 200 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210 215 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245 250 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260 265 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275 280 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290 295 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305 310 315 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325 330 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340 345 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 12
<211> 1188
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<223> 编码VEGF的DNA序列
<400> 12
ctgacggaca gacagacaga caccgccccc agccccagct accacctcct ccccggccgg 60
cggcggacag tggacgcggc ggcgagccgc gggcaggggc cggagcccgc gcccggaggc 120
ggggtggagg gggtcggggc tcgcggcgtc gcactgaaac ttttcgtcca acttctgggc 180
tgttctcgct tcggaggagc cgtggtccgc gcgggggaag ccgagccgag cggagccgcg 240
agaagtgcta gctcgggccg ggaggagccg cagccggagg agggggagga ggaagaagag 300
aaggaagagg agagggggcc gcagtggcga ctcggcgctc ggaagccggg ctcatggacg 360
ggtgaggcgg cggtgtgcgc agacagtgct ccagccgcgc gcgctcccca ggccctggcc 420
cgggcctcgg gccggggagg aagagtagct cgccgaggcg ccgaggagag cgggccgccc 480
cacagcccga gccggagagg gagcgcgagc cgcgccggcc ccggtcgggc ctccgaaacc 540
atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat 600
gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg 660
gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac 720
atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg 780
atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc 840
aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg 900
agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa 960
aaaaaatcag ttcgaggaaa gggaaagggg caaaaacgaa agcgcaagaa atcccggtat 1020
aagtcctgga gcgttccctg tgggccttgc tcagagcgga gaaagcattt gtttgtacaa 1080
gatccgcaga cgtgtaaatg ttcctgcaaa aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag 1140
cttgagttaa acgaacgtac ttgcagatgt gacaagccga ggcggtga 1188
<210> 13
<211> 395
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<223> VEGF的氨基酸序列
<400> 13
Met Thr Asp Arg Gln Thr Asp Thr Ala Pro Ser Pro Ser Tyr His Leu
1 5 10 15
Leu Pro Gly Arg Arg Arg Thr Val Asp Ala Ala Ala Ser Arg Gly Gln
20 25 30
Gly Pro Glu Pro Ala Pro Gly Gly Gly Val Glu Gly Val Gly Ala Arg
35 40 45
Gly Val Ala Leu Lys Leu Phe Val Gln Leu Leu Gly Cys Ser Arg Phe
50 55 60
Gly Gly Ala Val Val Arg Ala Gly Glu Ala Glu Pro Ser Gly Ala Ala
65 70 75 80
Arg Ser Ala Ser Ser Gly Arg Glu Glu Pro Gln Pro Glu Glu Gly Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Lys Glu Glu Glu Arg Gly Pro Gln Trp Arg Leu Gly
100 105 110
Ala Arg Lys Pro Gly Ser Trp Thr Gly Glu Ala Ala Val Cys Ala Asp
115 120 125
Ser Ala Pro Ala Ala Arg Ala Pro Gln Ala Leu Ala Arg Ala Ser Gly
130 135 140
Arg Gly Gly Arg Val Ala Arg Arg Gly Ala Glu Glu Ser Gly Pro Pro
145 150 155 160
His Ser Pro Ser Arg Arg Gly Ser Ala Ser Arg Ala Gly Pro Gly Arg
165 170 175
Ala Ser Glu Thr Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu
180 185 190
Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro
195 200 205
Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met
210 215 220
Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp
225 230 235 240
Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser
245 250 255
Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu
260 265 270
Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg
275 280 285
Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln
290 295 300
His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu
305 310 315 320
Lys Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys
325 330 335
Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu
340 345 350
Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser
355 360 365
Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn
370 375 380
Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg
385 390 395
<210> 14
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 额外的融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白包含通过Gly9接头连接至VEGF多聚化域Ex3的可溶性Flt-1
<400> 14
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120
actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180
ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240
agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300
gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360
ggtggaggtg gaggtggagg tccttcctgt gtgcccctga tgcgatgcgg gggctgctgc 420
aattag 426
<210> 15
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图5的DNA序列所编码的合成的氨基酸序列
<400> 15
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser
20 25 30
Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile
35 40 45
Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe
50 55 60
Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser
65 70 75 80
Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu
85 90 95
Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr
100 105 110
Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro
115 120 125
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn
130 135 140
<210> 16
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 额外的融合蛋白的DNA序列，所述融合蛋白包含通过Gly9连接至VEGF多聚化域Ex3和来自IgG1 CH3区的序列的可溶性Flt-1
<400> 16
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120
actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180
ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240
agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300
gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360
ggtggaggtg gaggtggagg tccttcctgt gtgcccctga tgcgatgcgg gggctgctgc 420
aatcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 480
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 540
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 600
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 660
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 720
ctctccctgt ctccgggtaa atag 744
<210> 17
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 图7的DNA序列所编码的合成的氨基酸序列
<400> 17
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser
20 25 30
Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile
35 40 45
Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe
50 55 60
Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser
65 70 75 80
Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu
85 90 95
Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr
100 105 110
Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro
115 120 125
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Gln Pro Arg
130 135 140
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
145 150 155 160
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
165 170 175
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
180 185 190
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
195 200 205
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
210 215 220
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
245
<210> 18
<211> 7120
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<223> 编码代表性的Flt-1受体蛋白的DNA序列
<400> 18
atcgaggtcc gcgggaggct cggagcgcgc caggcggaca ctcctctcgg ctcctccccg 60
gcagcggcgg cggctcggag cgggctccgg ggctcgggtg cagcggccag cgggcgcctg 120
gcggcgagga ttacccgggg aagtggttgt ctcctggctg gagccgcgag acgggcgctc 180
agggcgcggg gccggcggcg gcgaacgaga ggacggactc tggcggccgg gtcgttggcc 240
gcggggagcg cgggcaccgg gcgagcaggc cgcgtcgcgc tcaccatggt cagctactgg 300
gacaccgggg tcctgctgtg cgcgctgctc agctgtctgc ttctcacagg atctagttca 360
ggttcaaaat taaaagatcc tgaactgagt ttaaaaggca cccagcacat catgcaagca 420
ggccagacac tgcatctcca atgcaggggg gaagcagccc ataaatggtc tttgcctgaa 480
atggtgagta aggaaagcga aaggctgagc ataactaaat ctgcctgtgg aagaaatggc 540
aaacaattct gcagtacttt aaccttgaac acagctcaag caaaccacac tggcttctac 600
agctgcaaat atctagctgt acctacttca aagaagaagg aaacagaatc tgcaatctat 660
atatttatta gtgatacagg tagacctttc gtagagatgt acagtgaaat ccccgaaatt 720
atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc attccctgcc gggttacgtc acctaacatc 780
actgttactt taaaaaagtt tccacttgac actttgatcc ctgatggaaa acgcataatc 840
tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg 900
acctgtgaag caacagtcaa tgggcatttg tataagacaa actatctcac acatcgacaa 960
accaatacaa tcatagatgt ccaaataagc acaccacgcc cagtcaaatt acttagaggc 1020
catactcttg tcctcaattg tactgctacc actcccttga acacgagagt tcaaatgacc 1080
tggagttacc ctgatgaaaa aaataagaga gcttccgtaa ggcgacgaat tgaccaaagc 1140
aattcccatg ccaacatatt ctacagtgtt cttactattg acaaaatgca gaacaaagac 1200
aaaggacttt atacttgtcg tgtaaggagt ggaccatcat tcaaatctgt taacacctca 1260
gtgcatatat atgataaagc attcatcact gtgaaacatc gaaaacagca ggtgcttgaa 1320
accgtagctg gcaagcggtc ttaccggctc tctatgaaag tgaaggcatt tccctcgccg 1380
gaagttgtat ggttaaaaga tgggttacct gcgactgaga aatctgctcg ctatttgact 1440
cgtggctact cgttaattat caaggacgta actgaagagg atgcagggaa ttatacaatc 1500
ttgctgagca taaaacagtc aaatgtgttt aaaaacctca ctgccactct aattgtcaat 1560
gtgaaacccc agatttacga aaaggccgtg tcatcgtttc cagacccggc tctctaccca 1620
ctgggcagca gacaaatcct gacttgtacc gcatatggta tccctcaacc tacaatcaag 1680
tggttctggc acccctgtaa ccataatcat tccgaagcaa ggtgtgactt ttgttccaat 1740
aatgaagagt cctttatcct ggatgctgac agcaacatgg gaaacagaat tgagagcatc 1800
actcagcgca tggcaataat agaaggaaag aataagatgg ctagcacctt ggttgtggct 1860
gactctagaa tttctggaat ctacatttgc atagcttcca ataaagttgg gactgtggga 1920
agaaacataa gcttttatat cacagatgtg ccaaatgggt ttcatgttaa cttggaaaaa 1980
atgccgacgg aaggagagga cctgaaactg tcttgcacag ttaacaagtt cttatacaga 2040
gacgttactt ggattttact gcggacagtt aataacagaa caatgcacta cagtattagc 2100
aagcaaaaaa tggccatcac taaggagcac tccatcactc ttaatcttac catcatgaat 2160
gtttccctgc aagattcagg cacctatgcc tgcagagcca ggaatgtata cacaggggaa 2220
gaaatcctcc agaagaaaga aattacaatc agagatcagg aagcaccata cctcctgcga 2280
aacctcagtg atcacacagt ggccatcagc agttccacca ctttagactg tcatgctaat 2340
ggtgtccccg agcctcagat cacttggttt aaaaacaacc acaaaataca acaagagcct 2400
ggaattattt taggaccagg aagcagcacg ctgtttattg aaagagtcac agaagaggat 2460
gaaggtgtct atcactgcaa agccaccaac cagaagggct ctgtggaaag ttcagcatac 2520
ctcactgttc aaggaacctc ggacaagtct aatctggagc tgatcactct aacatgcacc 2580
tgtgtggctg cgactctctt ctggctccta ttaaccctct ttatccgaaa aatgaaaagg 2640
tcttcttctg aaataaagac tgactaccta tcaattataa tggacccaga tgaagttcct 2700
ttggatgagc agtgtgagcg gctcccttat gatgccagca agtgggagtt tgcccgggag 2760
agacttaaac tgggcaaatc acttggaaga ggggcttttg gaaaagtggt tcaagcatca 2820
gcatttggca ttaagaaatc acctacgtgc cggactgtgg ctgtgaaaat gctgaaagag 2880
ggggccacgg ccagcgagta caaagctctg atgactgagc taaaaatctt gacccacatt 2940
ggccaccatc tgaacgtggt taacctgctg ggagcctgca ccaagcaagg agggcctctg 3000
atggtgattg ttgaatactg caaatatgga aatctctcca actacctcaa gagcaaacgt 3060
gacttatttt ttctcaacaa ggatgcagca ctacacatgg agcctaagaa agaaaaaatg 3120
gagccaggcc tggaacaagg caagaaacca agactagata gcgtcaccag cagcgaaagc 3180
tttgcgagct ccggctttca ggaagataaa agtctgagtg atgttgagga agaggaggat 3240
tctgacggtt tctacaagga gcccatcact atggaagatc tgatttctta cagttttcaa 3300
gtggccagag gcatggagtt cctgtcttcc agaaagtgca ttcatcggga cctggcagcg 3360
agaaacattc ttttatctga gaacaacgtg gtgaagattt gtgattttgg ccttgcccgg 3420
gatatttata agaaccccga ttatgtgaga aaaggagata ctcgacttcc tctgaaatgg 3480
atggctcctg aatctatctt tgacaaaatc tacagcacca agagcgacgt gtggtcttac 3540
ggagtattgc tgtgggaaat cttctcctta ggtgggtctc catacccagg agtacaaatg 3600
gatgaggact tttgcagtcg cctgagggaa ggcatgagga tgagagctcc tgagtactct 3660
actcctgaaa tctatcagat catgctggac tgctggcaca gagacccaaa agaaaggcca 3720
agatttgcag aacttgtgga aaaactaggt gatttgcttc aagcaaatgt acaacaggat 3780
ggtaaagact acatcccaat caatgccata ctgacaggaa atagtgggtt tacatactca 3840
actcctgcct tctctgagga cttcttcaag gaaagtattt cagctccgaa gtttaattca 3900
ggaagctctg atgatgtcag atacgtaaat gctttcaagt tcatgagcct ggaaagaatc 3960
aaaacctttg aagaactttt accgaatgcc acctccatgt ttgatgacta ccagggcgac 4020
agcagcactc tgttggcctc tcccatgctg aagcgcttca cctggactga cagcaaaccc 4080
aaggcctcgc tcaagattga cttgagagta accagtaaaa gtaaggagtc ggggctgtct 4140
gatgtcagca ggcccagttt ctgccattcc agctgtgggc acgtcagcga aggcaagcgc 4200
aggttcacct acgaccacgc tgagctggaa aggaaaatcg cgtgctgctc cccgccccca 4260
gactacaact cggtggtcct gtactccacc ccacccatct agagtttgac acgaagcctt 4320
atttctagaa gcacatgtgt atttataccc ccaggaaact agcttttgcc agtattatgc 4380
atatataagt ttacaccttt atctttccat gggagccagc tgctttttgt gattttttta 4440
atagtgcttt tttttttttg actaacaaga atgtaactcc agatagagaa atagtgacaa 4500
gtgaagaaca ctactgctaa atcctcatgt tactcagtgt tagagaaatc cttcctaaac 4560
ccaatgactt ccctgctcca acccccgcca cctcagggca cgcaggacca gtttgattga 4620
ggagctgcac tgatcaccca atgcatcacg taccccactg ggccagccct gcagcccaaa 4680
acccagggca acaagcccgt tagccccagg gatcactggc tggcctgagc aacatctcgg 4740
gagtcctcta gcaggcctaa gacatgtgag gaggaaaagg aaaaaaagca aaaagcaagg 4800
gagaaaagag aaaccgggag aaggcatgag aaagaatttg agacgcacca tgtgggcacg 4860
gagggggacg gggctcagca atgccatttc agtggcttcc cagctctgac ccttctacat 4920
ttgagggccc agccaggagc agatggacag cgatgagggg acattttctg gattctggga 4980
ggcaagaaaa ggacaaatat cttttttgga actaaagcaa attttagaac tttacctatg 5040
gaagtggttc tatgtccatt ctcattcgtg gcatgttttg atttgtagca ctgagggtgg 5100
cactcaactc tgagcccata cttttggctc ctctagtaag atgcactgaa aacttagcca 5160
gagttaggtt gtctccaggc catgatggcc ttacactgaa aatgtcacat tctattttgg 5220
gtattaatat atagtccaga cacttaactc aatttcttgg tattattctg ttttgcacag 5280
ttagttgtga aagaaagctg agaagaatga aaatgcagtc ctgaggagag gagttttctc 5340
catatcaaaa cgagggctga tggaggaaaa aggtcaataa ggtcaaggga aaaccccgtc 5400
tctataccaa ccaaaccaat tcaccaacac agttgggacc caaaacacag gaagtcagtc 5460
acgtttcctt ttcatttaat ggggattcca ctatctcaca ctaatctgaa aggatgtgga 5520
agagcattag ctggcgcata ttaagcactt taagctcctt gagtaaaaag gtggtatgta 5580
atttatgcaa ggtatttctc cagttgggac tcaggatatt agttaatgag ccatcactag 5640
aagaaaagcc cattttcaac tgctttgaaa cttgcctggg gtctgagcat gatgggaata 5700
gggagacagg gtaggaaagg gcgcctactc ttcagggtct aaagatcaag tgggccttgg 5760
atcgctaagc tggctctgtt tgatgctatt tatgcaagtt agggtctatg tatttatgat 5820
gtctgcacct tctgcagcca gtcagaagct ggagaggcaa cagtggattg ctgcttcttg 5880
gggagaagag tatgcttcct tttatccatg taatttaact gtagaacctg agctctaagt 5940
aaccgaagaa tgtatgcctc tgttcttatg tgccacatcc ttgtttaaag gctctctgta 6000
tgaagagatg ggaccgtcat cagcacattc cctagtgagc ctactggctc ctggcagcgg 6060
cttttgtgga agactcacta gccagaagag aggagtggga cagtcctcta ccaagatcta 6120
aatccaaaca aaagcaggct agagccagaa gagaggacaa atctttgttc ttcctcttct 6180
ttacatacgc aaaccacctg tgacagctgg caattttata aatcaggtaa ctggaaggag 6240
gttaaacaca gaaaaaagaa gacctcagtc aattctctac tttttttttt ttttccaaat 6300
cagataatag cccagcaaat agtgataaca aataaaacct tagctattca tgtcttgatt 6360
tcaataatta attcttaatc attaagagac cataataaat actccttttc aagagaaaag 6420
caaaaccatt agaattgtta ctcagctcct tcaaactcag gtttgtagca tacatgagtc 6480
catccatcag tcaaagaatg gttccatctg gagtcttaat gtagaaagaa aaatggagac 6540
ttgtaataat gagctagtta caaagtgctt gttcattaaa atagcactga aaattgaaac 6600
atgaattaac tgataatatt ccaatcattt gccatttatg acaaaaatgg ttggcactaa 6660
caaagaacga gcacttcctt tcagagtttc tgagataatg tacgtggaac agtctgggtg 6720
gaatggggct gaaaccatgt gcaagtctgt gtcttgtcag tccaagaagt gacaccgaga 6780
tgttaatttt agggacccgt gccttgtttc ctagcccaca agaatgcaaa catcaaacag 6840
atactcgcta gcctcattta aattgattaa aggaggagtg catctttggc cgacagtggt 6900
gtaactgtat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgggtgt atgtgtgttt 6960
tgtgcataac tatttaagga aactggaatt ttaaagttac ttttatacaa accaagaata 7020
tatgctacag atataagaca gacatggttt ggtcctatat ttctagtcat gatgaatgta 7080
ttttgtatac catcttcata taataaactt ccaaaacaca 7120
<210> 19
<211> 1338
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<223> 代表性的Flt-1受体蛋白的氨基酸序列
<400> 19
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr
35 40 45
Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro
50 55 60
Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala
65 70 75 80
Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr
85 90 95
Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val
100 105 110
Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile
115 120 125
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
130 135 140
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
145 150 155 160
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
165 170 175
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
180 185 190
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
195 200 205
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
210 215 220
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val
225 230 235 240
Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr
245 250 255
Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys
260 265 270
Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His
275 280 285
Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys
290 295 300
Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys
305 310 315 320
Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val
325 330 335
Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser
340 345 350
Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val
355 360 365
Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu
370 375 380
Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala
385 390 395 400
Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys
405 410 415
Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu
420 425 430
Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser
435 440 445
Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Thr Ile
450 455 460
Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys
465 470 475 480
Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser
485 490 495
Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala Ile Ile
500 505 510
Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp Ser Arg
515 520 525
Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly Thr Val
530 535 540
Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly Phe His
545 550 555 560
Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser
565 570 575
Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp Ile Leu Leu
580 585 590
Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser Lys Gln Lys
595 600 605
Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met
610 615 620
Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn
625 630 635 640
Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg
645 650 655
Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val
660 665 670
Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro
675 680 685
Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gln Gln Glu
690 695 700
Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg
705 710 715 720
Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln
725 730 735
Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser
740 745 750
Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr Cys Thr Cys Val Ala
755 760 765
Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ile Arg Lys Met Lys
770 775 780
Arg Ser Ser Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp
785 790 795 800
Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp
805 810 815
Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser
820 825 830
Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gln Ala Ser Ala Phe Gly
835 840 845
Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys
850 855 860
Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys
865 870 875 880
Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly
885 890 895
Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Tyr Cys
900 905 910
Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe
915 920 925
Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys
930 935 940
Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val
945 950 955 960
Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gln Glu Asp Lys Ser
965 970 975
Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu
980 985 990
Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg
995 1000 1005
Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys Ile
1025 1030 1035
Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr
1040 1045 1050
Val Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro
1055 1060 1065
Glu Ser Ile Phe Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp
1070 1075 1080
Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser
1085 1090 1095
Pro Tyr Pro Gly Val Gln Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu
1100 1105 1110
Arg Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu
1115 1120 1125
Ile Tyr Gln Ile Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro Lys Glu
1130 1135 1140
Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu
1145 1150 1155
Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Pro Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr Pro Ala
1175 1180 1185
Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala Pro Lys Phe
1190 1195 1200
Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala Phe Lys
1205 1210 1215
Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu Pro
1220 1225 1230
Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr
1235 1240 1245
Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser
1250 1255 1260
Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys
1265 1270 1275
Ser Lys Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys
1280 1285 1290
His Ser Ser Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr
1295 1300 1305
Tyr Asp His Ala Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro
1310 1315 1320
Pro Pro Asp Tyr Asn Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile
1325 1330 1335
<210> 20
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白的DNA 序列，所述融合蛋白包含Flt-1, 在此处称为"sFLT02
蛋白"，其包含经Gly9连接至来自IgG1 CH3区的序列的可溶性Flt-1
<400> 20
atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60
acaggatctg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 120
actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 180
ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 240
agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 300
gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccggtgga 360
ggtggaggtg gaggtggagg tcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 420
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 480
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 540
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 600
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 660
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ag 702
<210> 21
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sFLT02蛋白的氨基酸序列
<400> 21
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser
20 25 30
Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile
35 40 45
Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe
50 55 60
Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser
65 70 75 80
Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu
85 90 95
Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr
100 105 110
Leu Thr His Arg Gln Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 22
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<223> IgG1λ重链的核苷酸序列
<400> 22
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120
tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtaat tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180
ggcaaggggc tggagtgggt ggcagctata tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gttgtatatg 300
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt attgtgcgag agagggtcgg 360
tgggtacgat atactacggt gactactatc ggatactact ttgactactg gggccaggga 420
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1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Met Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Arg Trp Val Arg Tyr Thr Thr Val Thr
115 120 125
Thr Ile Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
145 150 155 160
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
165 170 175
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
195 200 205
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
210 215 220
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
225 230 235 240
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
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Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
Claims (8)
1.一种治疗人受试者中黄斑变性的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV)病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将约1x 107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
2.一种治疗人受试者中黄斑水肿的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV)病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将约1x 107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
3.一种治疗人受试者中黄斑变性的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV)病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
4.一种治疗人受试者中黄斑水肿的方法，包括对所述受试者的患病眼睛施用包含重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体的组合物，所述腺-相关病毒(rAAV)病毒体包含编码可溶性蛋白的多核苷酸，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，其中将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至所述眼睛。
5.包含编码可溶性蛋白的多核苷酸的重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体在制造用于治疗人受试者中的黄斑变性的组合物中的用途，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，所述治疗通过将约1x107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至眼睛进行。
6.包含编码可溶性蛋白的多核苷酸的重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体在制造用于治疗人受试者中的黄斑水肿的组合物中的用途，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，所述治疗通过将约1x107至约1x 1013个rAAV病毒体递送至眼睛进行。
7.包含编码可溶性蛋白的多核苷酸的重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体在制造用于治疗人受试者中的黄斑变性的组合物中的用途，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，所述治疗通过将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至眼睛进行。
8.包含编码可溶性蛋白的多核苷酸的重组腺-相关病毒(rAAV)病毒体在制造用于治疗人受试者中的黄斑水肿的组合物中的用途，所述可溶性蛋白包含至少一个能调节VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)的域，所述治疗通过将低于约2x 1010个rAAV病毒体递送至眼睛进行。
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| 张依等: "基因治疗湿性年龄相关性黄斑变性的研究进展", 《国际眼科杂志》 * |
| 李晓等: "玻璃体内注射Avastin治疗年龄相关性黄斑变性的研究进展", 《眼视光学杂志》 * |
| 肖美春等: "可溶性血管内皮生长因子受体-1在年龄相关性黄斑变性中的作用和应用前景", 《上海交通大学学报(医学版)》 * |
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