TW201542217A - 用於治療及預防黃斑部病變的組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係揭示用於治療黃斑部病變之組成物和方法。此方法係利用基因遞送可溶性Flt-1受體，以及包括可溶性Flt-1受體之融合蛋白至人類眼睛。

Description

用於治療及預防黃斑部病變的組成物及方法
本發明一般係關於治療及預防人類中之黃斑部病變的方法。特言之，本發明係關於使用血管內皮生長因子(VEGF)受體Flt-1治療或預防黃斑部病變之方法。
老化有關的黃斑部病變(AMD)為老年人中樞性不可逆眼盲之主要原因。AMD早期的臨床表現包括為碎片之視網膜下堆積(脈絡膜疣)。進行性發生具有顯著退化和黃斑部細胞萎縮之地圖樣萎縮，或具有發生在疾病過程末期之脈絡膜新生血管的新生血管性AMD(nAMD)的病患，希望能拯救退化中的視網膜。當黃斑部視網膜色素上皮(RPE)退化後，光受體萎縮，則造成眼盲。
病變係視老化、環境和基因風險因子而定，但分子機制是否造成疾病發作仍一無所知。最明顯已知的基因因素為位於免疫調節補體因子H(CFH)基因內的錯義突變。
與眼部病症有關的病理性新生血管，例如nAMD，係經由血管內皮生長因子(VEGF)之上調所媒介。使用抗體、可溶性受體或適體抑制VEGF已證明為一管理這些疾病之有前景的臨床方法。在已理解AMD管理之深度改良處的同時，目前的抗-VEGF拮抗劑需要重覆的玻璃體內給藥，其對於病患和治療的醫師二者可能都是負擔。
因此，對於開發負擔較低及具商業利益之治療人類黃斑部病變的方法仍有需求。
本發明係基於發現可溶性的Flt-1受體能治療人類患者之黃斑部病變。當此可溶性受體係使用rAAV-媒介的基因遞送來傳遞送，以廣泛範圍的劑量可看到治療結果。高劑量為可耐受的並產生治療利益。此外，本發明人在文中已驗證，玻璃體內遞送一低如2 x 108載體基因體(vg)，以及2 x 1010 vg的單一劑量，在注射後2個月，產生視網膜下液和視網膜內液顯著的降低。
因此，在一實施例中，本發明係關於治療人類患者中黃斑部病變之方法，其係包括將一包含重組的腺-相關病毒(rAAV)病毒體之組成物投予患者患病的眼睛，而該腺-相關病毒(rAAV)病毒體係包括一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸，該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之血管內皮生長因子受體-1(VEGFR-1或Flt-1)的功能域，其中係將從約1 x107至約1 x 1013個rAAV病毒體遞送至眼睛。
在另外的實施例中，本發明係關於治療人類患者中黃斑部水腫之方法，其係包括將一包含重組的腺-相關病毒(rAAV)病毒體之組成物投予患者患病的眼睛，而該腺-相關病毒(rAAV)病毒體係包括一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸，該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之血管內皮生長因子受體-1(VEGFR-1或Flt-1)的功能域，其中係將從約1 x107至約1 x 1013個rAAV病毒體遞送至眼睛。
在上述方法之實施例中，係將從約1 x 107至約1 x 1012；1x 108至約1 x 1012；約1 x 108至約1 x 1011；約1 x 108至約1 x1010；約1 x 108至約1 x 109；約2 x 107至約2 x 1012；約2 x 108至約2 x 1012；約2 x 108至約2 x 1011；約2 x 108至約2 x 1010；約2 x 108至約2 x 109；2 x 109至約2 x 1010；約1 x 1010至約1 x 1013；約1 x 1010至約1 x 1012；約1 x 1010至約1 x 1011；約2 x 1010至約1 x 1013；2 x 1010至約1 x 1012；約2 x 1010至約2 x 1012；約2 x 1010 至約1 x 1011；或約2 x 1010至約2 x 1011個rAAV病毒體遞送至眼睛。在某些實施例中，係將1 x 107，約2x107，約6 x 107，約1 x 108，約2x108，約6 x 108，約1 x 109，約2x109，約6 x 109，約1 x 1010，約2x1010，約6 x 1010，約1 x 1011，約2x1011，約6 x 1011，約1 x 1012，約2x1012，約6 x 1012，或約1 x 1013 rAAV病毒體遞送至眼睛。
在另外的實施例中，本發明係關於治療人類患者中黃斑部病變之方法，其係包括將一包含重組的腺-相關病毒(rAAV)病毒體之組成物投予患者患病的眼睛，而該腺-相關病毒(rAAV)病毒體係包括一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸，該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之VEGFR-1(Flt-1)功能域，其中係將低於1 x 1010個rAAV病毒體遞送至眼睛。
在另外的實施例中，本發明係關於治療人類患者中黃斑部水腫之方法，其係包括將一包含重組的腺-相關病毒(rAAV)病毒體之組成物投予患者患病的眼睛，而該腺-相關病毒(rAAV)病毒體係包括一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸，該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之VEGFR-1(Flt-1)功能域，其中係將低於1 x 1010個rAAV病毒體遞送至眼睛。
在任何上述的方法中，此組成物可進一步包括一眼科可接受的媒劑。
在上述方法之另外的實施例中，係將一單一玻璃體內注射的rAAV病毒體投予眼睛。
在另外的實施例中，此可溶性蛋白係包括：(a)至少一個Flt-1之功能域；(b)一衍生自免疫球蛋白重鏈之多聚化功能域；及(c)連接(a)和(b)之長度5-25個胺基酸殘基的連接子，其中當可溶性蛋白表現時，則產生一可溶性蛋白之多聚體。
在任何上述的方法中，該至少一個功能域係包括Flt-1之2功能域。
在另外的實施例中，此多聚體為一同型二聚體。
在另外的實施例中，此多聚化功能域係包括IgG的Fc區或其活性片段。
在上述方法的特定實施例中，此多聚化功能域係包括IgG的CH3功能域或其活性片段。
在另外的實施例中，此多聚化功能域係來自gG1、IgG2、IgG或IgG4，例如來自IgG1重鏈之恆定區。
在另外的實施例中，此連接子係由下列組成之群中選出：gly9(SEQ ID NO：1)；glu9(SEQ ID NO：2)；ser9(SEQ ID NO：3)；gly5cyspro2cys(SEQ ID NO：4)；(gly4ser)3(SEQ ID NO：5)；SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：6)；ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：7)；GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ ID NO：8)；及Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn 5(SEQ ID NO：9)。
在其他的實施例中，可溶性蛋白係具有式X-Y-Z，其中X係包括Flt-1之類-IgG-功能域2，其中Y為Gly9(SEQ ID NO：1)，及其中Z為一IgG Fc區或IgG CH3區。
在另外的實施例中，此多聚化功能域為人源化的。
在另外的實施例中，可溶性蛋白係包括一由下列組成之群中選出的胺基酸序列：(a)圖2A-2B中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：11)；(b)圖6中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：15)；(c)圖8中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：17)；(d)圖12中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：21)；及(e)具有至少其90%序列相同度之(a)、(b)、(c)或(d)的變體。
在任何上述用於治療黃斑部病變之方法的實施例中，此黃斑部病變為老化有關的黃斑部病變(AMD)，例如濕性AMD。
在上述方法之另外的實施例中，此方法係包括降低眼內壓、視網膜厚度、視網膜下液、視網膜內液等等。
在任何上述方法之另外的實施例中，此rAAV病毒體係由選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVAAVrh8、AAVrh8R、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12之AAV血清型所衍生。
在任何上述方法之實施例中，係將從約2 x 108至低於2x 1010個rAAV病毒體遞送至眼睛，例如至高約2 x 108個rAAV病毒體，或至高約2 x 109個rAAV病毒體。
有鑒於文中之揭示，熟習本項技術者將能容易地進行這些和其他的本發明之實施例。
圖1(SEQ ID NO：10)係顯示包括Flt-1之融合蛋白，文中稱為「sFLT01蛋白」之DNA序列。
圖2A-2B(SEQ ID NO：11)係顯示sFLT01蛋白之胺基酸序列。
圖3(Genbank登錄號NM003376)(SEQ ID NO：12)係顯示編碼VEGF之DNA序列。
圖4(Genbank登錄號CAC19513)(SEQ 5 ID NO：13)係顯示VEGF之胺基酸序列。
圖5(SEQ ID NO：14)係顯示另外融合蛋白之DNA序列，而該融合蛋白係包括一藉由Gly9連接子與VEGF多聚化功能域Ex3相連接之可溶性Flt-1的。
圖6(SEQ ID NO：15)係顯示由圖5(SEQ ID NO：14)之DNA序列所編碼的胺基酸序列。
圖7(SEQ ID NO：16)係顯示一另外的融合蛋白之DNA序列，而該融合蛋白包括一可溶性Flt-1，係藉由Gly9連接子與VEGF多聚化功能域Ex3及一來自IgG1 CH3區之序列相連接。
圖8(SEQ ID NO：17)係顯示由圖7(SEQ ID NO：16)之DNA序列所編碼的胺基酸序列。
圖9A-9B(Genbank登錄號NM_002019)(SEQ ID NO：18)係顯示編碼一代表性Flt-1受體蛋白之DNA序列。
圖10A-10E(Genbank登錄號P17948)(SEQ ID NO：19)係顯示一代表性Flt-1受體蛋白之胺基酸序列。
圖11(SEQ ID NO：20)係顯示一包括Flt-1之融合蛋白的DNA序列，該蛋白在文中稱為「sFLT02蛋白」，其係包括一可溶性Flt-1藉由Gly9(SEQ ID NO：1)與來自IgG1 CH3的序列相連接。
圖12(SEQ ID NO：21)係顯示sFLT02蛋白之胺基酸序列。
圖13(Genbank登錄號Y14737)(SEQ ID NO：22)係顯示IgG1 λ重鏈之核苷酸序列。
圖14A-14B(SEQ ID NO：23)係顯示IgG1 λ重鏈之胺基酸序列。
圖15A-15B係顯示經一2 x 108 rAAV2-sFLT01之單一劑量治療(圖15B)的人類眼睛中視網膜下液和視網膜內液(如光學同調斷層掃描所測)相較於基線的(圖15A)的變化。
圖16A-16B係顯示係顯示經一2 x 1010 rAAV2-sFLT01之單一劑量治療(圖16B)的人類眼睛中視網膜下液和視網膜內液(如光學同調斷層掃描所測)相較於基線的(圖16A)的變化。
除非另有指出，否則本發明之施行將應用本項技術內之生化、重組的DNA技術和免疫學的習用方法。此等技術係完整地說明於文獻中。參見，例如Fundamental Virology，第二版，第I & II冊(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.)；Handbook of Experimental Immunology，第I-IV冊(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.,Blackwell Scientific Publications)；T.E.Creighton,Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current addition)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook等人，第四版.，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel，等人eds.,2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.,1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow and Lane,eds.,1988)；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,6th ed.,J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,Academic Press,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,J.Wiley and Sons,1993-8)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人，eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人，eds.,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，eds.,30 J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等人，2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow and D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)；及Cancer：Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人，eds.,J.B.Lippincott Company,2011)。
所有文中所引述的出版品、專利和專利申請書及登錄號，無論在上文或下文中，係以全文引用的方式併入。
1.定義
在描述本發明時，將會使用下列術語，並希望下係如下所示來定義。
必須注意，除非內容中明確地指出，否則如本說明書和所附的申請專利範圍中所用，單數形式「一」、「該」亦包括複數參照物。因此，例如有關「一Flt-1受體」係包括二或多種此等受體之混合物及其類似物。
如文中所用，「老化-相關的黃斑部病變」或「AMD」包括早期、中期和晚期的AMD並包括乾性AMD例如地圖樣萎縮，和濕性AMD亦稱為新生血管或滲出性AMD。這些症狀係更完整的描述於下文。如文中所用，「黃斑部水腫」係指視網膜內的液體堆積，其可能造成眼睛的黃斑部區域腫脹或增厚。當視網膜中的血管滲漏液體時，則發生黃斑部水腫。病理生理學典型地係涉及血管不穩定及血液-視網膜瓶障崩壞。黃斑部囊狀水腫(CME)，最常見的類型，係涉及液體堆積在外網層，其次異常的凹周視網膜毛細血管滲透。當黃斑部腫脹時，其無法正常作用。視力尚失可能為輕度至重度，但在某些情況下，仍有邊緣視野。
術語「Flt-1蛋白」和「VEGF-R1蛋白」在文中係交換使用並表示與VEGF結合之已知的受體蛋白。術語「Flt-1蛋白」和「VEGF-R1蛋白」或編碼彼等之核苷酸序列分別係指一蛋白或核苷酸序列，其係衍生自任何Flt-1蛋白，與來源無關。此術語，如文中所用，係指能與VEGF結核或調節其活性的分子，如以任何已知的VEGF活性試驗所測，包括該等文中所述的其他試驗。代表性Flt-1蛋白之全長的核苷酸序列及對應的胺基酸序列分別係如圖9A-9B(SEQ ID NO：18)和10A-10E(SEQ ID NO：19)中所示。然而，如文中所定義之Flt-1蛋白並不限於所描繪的序列，因為數個此等受體為已知的且在物種間將會發生這些受體之變體。另外的Flt-1蛋白序列之非限定實例可參見GenBank登錄號AF063657.2；BC039007.1； U01134.1；HD077716.1；X51602.1；EU360600.1；AK300392.1；EU826561.1；EU368830.1；5 AB385191.1；AK292936.1；AK309901.1；AB209050.1；BC029849.1；BC039007.1；NM_001160031.1；NM_001160030.1；NM_002019.4；NM_001159920.1。
全長蛋白(有或無訊號序列)，和其片段以及帶有修飾之蛋白，例如刪除、添加和取代(本質上為保守或非保守)，就天然序列，係希望用於文中，只要該蛋白保持所欲的活性。在本發明內文中，此等活性變體和片段係視為VEGF1受體。修飾作用可能為刻意的，如經由位點突變，或可為偶然的，例如經由產生該蛋白之宿主的突變或由於PCR增幅之錯誤。因此，用於本文中係涵蓋實質上與親代序列為同源的活性蛋白，例如具有70...80...85...90...95...98...99%等相同度之蛋白，其保有調節對應配體活性之能力。
「天然」多肽，例如Flt-1受體，係指具有與天然衍生的對應分子相同之胺基酸序列的多肽。此等天然序列可為自天然分離出的，或可藉由重組或合成方法所製造。術語「天然」序列特定上係涵蓋特定分子之天然生成的截短或隱藏形式(例如胞外功能域序列)，天然生成的變體形式(例如替代地剪接形式)及天然生成的多肽之等位基因變體。在本發明的各種實施例中，文中所揭示的天然分子為成熟或全長天然序列，其係包括如隨附的圖式中所示之全長胺基酸序列。然而，當隨附圖式中所揭示的某些分子係帶有甲硫胺酸，在圖式中稱為胺基酸位置1的同時，在圖式中其他位於胺基酸位置1之上游或下游的甲硫胺酸殘基可能係用作特定分子之起始的胺基酸殘基。另一種選擇，依照所用的表現系統，文中所述的分子可能缺乏一N-端的甲硫胺酸。
「胞外功能域」係指一受體多肽的形式，其包括所有或一片段的胞外功能域及缺乏全部或部份的跨膜功能域，且亦可能無胞漿功能域。典型地，當用於本發明中，該胞外功能域基本上係無跨膜功能域和胞漿功能域二者。一般，胞外功能域係包括低於10%的此跨膜功能域及/或胞漿功能域，低於5%的這些功能域，低於1%或低於0.5%的此等功能域。文 中所述的受體之跨膜功能域可按照例行用於本項技術共鑑別疏水功能域之標準來鑑別，例如使用標準的疏水性圖，例如該等使用Kyte-Doolittle技術，Kyte等人，J.Mol.Biol.(1982)157：105-132所計算。
如上所說明，本發明所用的受體可包括或可不包括天然的訊號序列。文中所述的受體之訊號胜肽的大約位置係描述於說明書及隨附的圖式中。請注意，然而，訊號胜肽的C-端邊界可能不同，典型地如文中所述在訊號胜肽C-端邊界的任一側有不超過約5個胺基酸差異。訊號胜肽的C-端邊界可按照例行用於本項技術之標準來鑑別，例如描述於Nielsen等人，Prot.Eng.(1997)10：1-6及von Heinje等人，20 Nucl.Acids.Res.(1986)14：4683-4690中。再者，亦請理解，在某些情況下，從一隱藏的多肽裂解訊號序列並非全然一致的，而產生一個以上隱藏的種類。這些成熟的多肽，如文中所鑑別，其中訊號胜肽係在訊號胜肽之C-端邊界任一側有不超過5個胺基酸裂解，及編碼彼等之聚核苷酸係涵蓋在本發明中。
「變體」係指如文中所定義的活性多肽，與對應的全長天然序列、缺乏訊號胜肽之多肽、有或無訊號胜肽，或任何其他文中所揭示之全長多肽序列的片段，具有至少約80%胺基酸序列相同度。此等多肽變體包括，例如，其中在全長天然胺基酸序列之N-及/或C-端加入或刪除一或多個胺基酸殘基之多肽。在實施例中，一變體與對應的全長天然序列將具有至少約81%胺基酸序列相同度，替代地至少約82%胺基酸序列相同度，替代地至少約83%胺基酸序列相同度，替代地至少約84%胺基酸序列相同度，替代地至少約85%胺基酸序列相同度，替代地至少約86%胺基酸序列相同度，替代地至少約87%胺基酸序列相同度，替代地至少約88%胺基酸序列相同度，替代地至少約89%胺基酸序列相同度，，替代地至少約90%胺基酸序列相同度，替代地至少約91%胺基酸序列相同度，替代地至少t約92%胺基酸序列相同度，替代地至少約93%胺基酸序列相同度，替代地至少約94%胺基酸序列相同度，替代地至少約95%胺基酸序列相同度，替代地至少約96%胺基酸序列相同度，替代地至少約97%胺基酸序列相同度，替代地至少約98%胺基酸序列相同度及替代地至少約99%胺基酸序列相同 度。在實施例中，變體多肽為長度至少約10個胺基酸，例如長度至少約20個胺基酸，例如長度至少約30個胺基酸，替代地長度至少約40個胺基酸，替代地長度至少約50個胺基酸，替代地長度至少約60個胺基酸，替代地長度至少約70個胺基酸，替代地長度至少約80個胺基酸，替代地長度至少約90個胺基酸，替代地長度至少約100個胺基酸，替代地長度至少約150個胺基酸，替代地長度至少約200個胺基酸，替代地長度至少約300個胺基酸，或更多，變體包括性質上為保守性或非保守性之取代。例如，所指的多肽可包括至高約5-10個保守性或非保守性胺基酸取代，或甚至高達約15-25或50個保守性或非保守性胺基酸取代，或任何介於5-50之間的數目，只要完整保留所欲的分子供能即可。
「同源」係指二個聚苷酸或二個多肽基團之間的相同度百分比。當此等序列在一定義的分子長度中具有至少約50%，至少約75%，至少約80%-85%，至少約90%，至少約95%-98%序列相同度，至少約99%或任何其間的百分比，則二個DNA，或二個多肽序列彼此為「實質上同源」。如文中所用，實質上同源亦指序列顯示與特定的DNA或多肽序列完全相同。
一般而言，「相同度」係指二個核苷酸或多肽序列分別確切的核苷酸-對-核苷酸或胺基酸-對-胺基酸一致性。測定相同度百分比之方法已為本項技術所熟知。例如，相同度百分比可藉由比對序列由直接比較二個分子間的序列資料，計算二個比對序列之確切相符數目，除以較短序列的長度並將結果乘以100來測定。可使用已可取得的電腦程式幫助分析，例如ALIGN，Dayhoff,M.O.於Atlas of Protein Sequence and Structure M.O.Dayhoff ed.,Suppl.3：353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,DC，，其係改編Smith和Waterman Advances in Appl.Math.2：482-489,1981對胜肽分析之局部同源性比對演算法。用於測定核苷酸序列相同度之程式可得自Wisconsin Sequence Analysis Package，第8版(可得自Genetics Computer Group,Madison,WI)，例如BESTFIT、FASTA和GAP程式，其亦係依賴Smith和Waterman比對演算。這些程式係容易地利用製造 商所推薦的內建參數並描述於上文所指的Wisconsin Sequence Analysis Package中。例如，特定核苷酸序列與參照序列之相同度百分比可使用Smith和Waterman的同源比對演算，以六個核苷酸位置的內建評分表和缺位罰分來測定。
在本發明內文中建立相同度百分比之另外的方法係使用由John F.Collins和Shane S.Sturrok所開發，IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)所發行，版權為愛丁堡大學的MPSRCH套裝程式。從這套套裝軟體，可運用Smith-Waterman比對演算，其中係將內建參數用於評分表(例如，12分的缺位開放罰分，一個的缺位延伸罰分及六個中的一個缺位)。從「符合」值所產生的數據係反映「序列相同度」。其他用於計算相同度或類似度百分比之適合的程式一般已為本項技術所知，例如另外的比對演算程式為BLAST，係使用內建參數。例如BLASTN和BLASTP可使用下列內建參數：基因碼=標準；過濾器=無；股=二股；截斷=60；期望=10；矩陣=BLOSUM62；內容=50序列；排序=高分；資料庫=低使用率，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS轉譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。這些程式的詳情已為本項技術所熟知。
另一種選擇，同源性可藉由聚核苷酸在同源區域間形成安定的二倍體之條件下雜交，接著以單股特異性核酸酶消化，並測定消化片段的大小，來加以測定。實質上同源的DNA序列可在南方雜交實驗中，於例如嚴格的條件下，如特定系統所定義，加以鑑別。定義適當的雜交條件係在本項技術中。參見，例如Sambrook等人，前文；DNA Cloning，前文；Nucleic Acid Hybridization，前文。
術語「衰減變體」希望為在其核酸序列中含有變化之多核苷酸，其係編碼一多肽，而該多肽與由衍生該衰減變體的多核苷酸所編碼之多肽具有相同胺基酸序列。
「編碼序列」或「編碼」一選擇多肽的序列，為一核酸分子當被放置在適當的調節序列的控制下，其係轉錄(就DNA的情況)及轉譯(就mRNA的情況)成多肽。編碼序列的分界係藉由一在5’(胺基)端的起始密 碼子和3’(羧基)端的轉譯停止密碼自來決定。轉錄終止序列可位於編碼序列的3’。
「載體」係指任何遺傳因子，例如質體、噬菌體、轉位子、黏接質體、染色體、病毒、病毒體等，當與適當的控制因子結合時其能複製且其可將基因序列轉移到細胞。因此，此術語係包括選殖和表現媒劑，以及病毒載體。
「重組載體」係指包括能在細胞中表現之異源核酸的載體。
「重組的病毒載體」係指包括一或多個異源序列(亦即非病毒來源之核酸序列)之重組的聚核苷酸載體。就重組的AAV載體之情況，重組的核酸係側接至少一個，在實施例中為二個，反轉末端重複序列(ITR)。
「重組的AAV載體(rAAV載體)」係指包括一或多個異源序列(亦即非AAV來源之核酸序列)，其係側接至少一個，在實施例中為二個，AAV反轉末端重複序列(ITR)之聚核苷酸載體。當存在經適當的幫手病毒感染(或其係表現適當的幫手功能)之宿主細胞中，且其係表現AAV rep和cap基因產物(亦即AAV Rep和Cap蛋白)時，該rAAV載體可複製並包裹至感染的病毒粒子中。當rAAV載體併入較大的聚核苷酸(例如，在染色體中或在另外的載體中，例如用於選殖或轉染之質體)時，則rAAV載體可稱為「Pro-載體」，其可藉由在AAV包裹功能及適合的幫手功能的存在下複製和殼體化來「拯救」。rAAV載體可為任何許多的形式，包括(但不限於)質體、直鏈人工染色體、與脂質複合、包膠至微脂體中及體殼化於病毒粒子中，特別是AAV粒子。rAAV載體可包裹至AAV病毒殼體(capsid)，產生一「重組的腺-相關病毒粒子(rAAV粒子)」。
「重組的病毒」係指，例如藉由加入或插入異源性核酸結構至粒子中，遺傳上已改變的病毒。
術語「轉染」係用來指細胞吸收外來的DNA，且當外源性DNA被導入細胞膜內時，則該細胞係經「轉染」。許多的轉染技術已為本 項技術所知。參見，例如Graham等人(1973)Virology,52：456,Sambrook等人.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York,Davis等人(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier,and Chu等人(1981)Gene 13：197。此等技術可用於將一或多個外源性分子導入適合的宿主細胞中。
術語「異源性」當其係關於核酸序列，例如編碼序列和控制序列時，係代表正常不會連結一起，及/或不會與特定細胞結合之序列。因此，核酸結構或載體的「異源」區為在另外的核酸分子內或與其相連接之核酸的一部份，其本質上並不會與另一分子一起發現。例如一核酸結構的異源區可能包括一編碼序列，其係接上一天然上不會與該編碼序列一起發現之序列。另外的異源編碼序列之實例為其中編碼序列本身在天然上不會發現的結構(例如，具有不同於天然基因的密碼子之合成序列)。同樣地，就本發明之目的，經正常不會存在細胞中之結構轉變的細胞可視為異源性。如文中所用，等位基因變體或天然生成的突變事件並不會產生異源性DNA。
「核酸」序列係指DNA或RNA序列。此術語係代表包括任何DNA或RNA之已知鹼基類似物的序列，例如，但不限於4-乙醯基胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺嘌呤核苷、吖丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-胺甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假-尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-胺基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基q核苷、5’-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧丁氧核、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。
術語DNA「控制序列」共同係指啟動子序列、聚腺苷醯化、轉錄終止序列、上游調節功能域、複製源、內核醣體進入位置(“IRES”)、促進劑等等，其在一接受細胞中共同係提供編碼序列之複製、轉錄和轉譯。並非所有的這些控制序列都必須一定存在，只要所選的編碼序列能在適當的宿主細胞中複製、轉錄和轉譯即可。
術語「啟動子」以其一般的意義用於文中，係指包括DNA調節序列之核苷酸區，其中該調節序列係衍生自一能與RNA聚合酶結合及啟發下游(3’-方向)編碼序列轉錄的基因。轉錄啟動子可包括「可誘發的啟動子」(其中操作上連接啟動子之聚核苷酸序列的表現係被分析物、共因子、調節蛋白等所誘發)，「阻抑啟動子」(其中操作上連接啟動子之聚核苷酸序列的表現係被分析物、共因子、調節蛋白等所誘發)及「組成型啟動子」。
「操作上連接」係指元素的安排，其中所描述的組份係經配置使其得以表現其正常的功能。因此，操作上連接編碼序列之控制序列能引起編碼序列的表現。控制基因不需要與編碼序列相鄰，只要其進行引導其表現之功能即可。因此，例如，介於尚未轉譯但轉錄的序列可能存在啟動子序列和編碼序列之間，且此啟動子序列仍可視為「操作上連接」編碼序列。
術語「多聚化功能域」如本發明內文中所用，係指分子直接或經由「連接子功能域」與特定的Flt-1連結之部份。多聚化功能域可為一多肽功能域，其係促進二或多個多聚化功能域及/或sFlt-1受體功能域之相互作用。
例如，多聚化功能域可為一免疫球蛋白序列，例如一免疫球蛋白恆定區、白胺酸拉鏈、疏水區、親水區、包括一游離硫醇之多肽，而該硫醇係在二或多個多聚化功能域之間形成一分子間雙硫鍵或，例如，「腔內突起(protuberance-into-cavity)」功能域，係描述於例如美國專利第5,731,168號中，其係以全文引用的方式併入本文中。突起係由，例如以較大的側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)從一第一多肽之介面置換小的胺基酸側鏈 所建構。補償此突起之相同或類似大小的腔洞係視需要藉由以較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大的胺基酸側鏈，產生在一第二多肽的介面上。
因此，在態樣上，多聚化功能域提供促進或得以從單體功能域形成二聚體、三聚體及其類似物的分子部份。在態樣上，多聚化功能域為免疫球蛋白恆定區功能域。
「免疫球蛋白」(Ig)為蛋白，一般而言為糖蛋白，其為缺乏抗原特異性之抗體或類抗體分子。免疫球蛋白通常為約150,000道爾頓之異源四聚化糖蛋白，係由二條相同的輕(L)鏈和二條相同的重(H)鏈所組成。各輕鏈係藉由一共價雙硫鍵與重鏈相連接，而雙硫鍵連的數目在不同的免疫球蛋白同型之重鏈間各不相同。各重鏈和輕鏈亦具有規則間隔的鏈內雙硫橋。各重鏈具有一胺基(N)端可變功能域(VH)接著羧基(C)端恆定功能域。各輕鏈具有一可變N-端功能域(VL)和一C-端恆定功能域；輕鏈的恆定功能域(CL)係與重鏈的第一恆定功能域(CH1)對齊，而輕鏈可變功能域係與重鏈可變功能域對齊。根據免疫球蛋白多肽鏈之功能域定義，輕(L)鏈具有二個形態上類似功能域VL和CL；而重鏈具有四個功能域(VH、CH1、CH2和CH3)，其各自具有一個鏈內雙硫橋。
依照重鏈恆定功能域(C)的胺基酸序列，免疫球蛋白可分成不同的種類。有5類主要的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。免疫球蛋白種類可進一步分為子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5、IgA1和IgA2。各重鏈在末端具有一個可變功能域(VH)接著許多恆定功能域。來自脊椎動物類的抗體之輕鏈，以其恆定功能域的胺基酸序列為基礎，可分成二種不同的類型，稱為卡帕(κ)或蘭姆達(λ)。
術語「Fc」區係指免疫球蛋白重鏈的C-端(恆定)區。該Fc區可為天然序列Fc區或變體Fc區。雖然免疫球蛋白Fc區的界限可不同，但人類IgG重鏈Fc區可從在位置Cys226的一胺基酸殘基，或從Pro230，延伸至全長人類IgG1之羧基-端。免疫球蛋白的Fc區一般係包括二個恆定功能域CH2和CH3。最後的殘基，離胺酸，在IgG1的重鏈可存在但並非必需，作 為成熟蛋白中Fc之端點殘基。一人類IgG1重鏈Fc區係以NCBI登錄號P01857來定義。
人類IgG1 Fc區之「CH2功能域」(亦稱為「Cy2」功能域)通常係從全長IgG的約胺基酸231延伸至約胺基酸340，但人類IgG重鏈Fc區之Pro111至Lys22。
「CH3功能域」係包括C-端殘基至人類IgG1 Fc區中CH2功能域(亦即全長IgG之從約胺基酸殘基341至約胺基酸殘基447，但人類IgG重鏈Fc區之Gly224至Lys330)。
「絞鏈區」一般係定義為從全長人類IgG1之Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.immunol.(1985)22：161-206)，但人類IgG重鏈Fc區之Glu99至Pro110。其他IgG同型的絞鏈區可藉由將形成重鏈內S-S鍵之第一和最後的半胱胺酸放置在相同位置，與IgG1序列對齊。
Fc區之「低絞鏈區」一般係定義為由緊接C-端的殘基延伸至絞鏈區，亦即全長人類IgG1之殘基233至239。
「天然的Fc區序列」包括與自然界中所發現的Fc區之胺基酸序列相同之胺基酸序列。天然的人類Fc區序列包括(但不限於)人類IgG1 Fc區(非-A和A同種異型)；人類gG2 Fc區；人類IgG3 Fc區；和人類IgG4 Fc區以及其自然生成的變體。來自其他物種之天然的Fc區，例如鼠科Fc區，亦已熟知。
「功能性Fc區」係具有天然Fc區之「效應子功能」。示例的「效應子功能」包括C1q結合；補體-依賴的細胞毒性；Fc受體結合；抗體-依賴的細胞媒介之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體之下調(例如B細胞受體；BCR)等。此等效應子功能典型地需要Fc區與一結合區(亦即文中VEGF配體)組合並可使用本項技術中已知的各種分析來評估。Fc區可為一人類Fc區，例如天然序列人類Fc區，如人類IgG1(非-A和A同種異型)、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區。此等序列為已知的。參見，例如PCT公開案號WO01/02440，其係以全文引用的方式併入本文中。
術語「轉殖基因」係指一導入細胞且能轉錄至RNA及視需要轉譯及/或於適當的條件下表現之聚核苷酸。在態樣中，其係賦予其所導入的細胞一所欲的性質，或另外產生所欲的治療或診斷結果(例如轉錄至一分子，其給予一所欲的治療或診斷結果)。
術語「基因體粒子」、「基因體同等物」或「基因體複製物」當用於有關病毒效價時，係指含有重組AAV DNA基因體之病毒體的數目，與感染性或功能性無關。在特定載體製備物中基因體粒子的數目可藉由例如文中實例，或例如Clark等人(1999)Hum.Gene Ther.,10：1031-1039；Veldwijk等人(2002)Mol.Ther.,6：272-10278中所描述的程序來測量。
術語「感染單位(iu)」、「感染粒子」或「複製單位」當用於有關病毒效價時，係指具感染性和有複製能力之重組AAV載體粒子數目，如感染中心分析，亦稱為複製中心分析所測，例如，描述於McLaughlin等人(1988)J.Virol.,62：1963-1973中。
術語「轉導單位(tu)」當用於有關病毒效價時，係指造成功能性基因轉殖產物產生之感染的重組AAV受體粒子之數目，如功能分析所測，例如描述於Xiao等人(1997)Exp.Neurobiol.,20 144：113-124；或Fisher等人(1996)J.Virol.,70：520-532(LFU分析)中。
「反轉末端重複」或「ITR」序列為本項技術中熟知之術語且係指在病毒基因體末端發現之相當短的序列，其為相反向位的。
「AAV反轉末端重複(ITR)」序列，本項技術中熟知之術語，為一存在天然單股AAV基因體二端之大約145-個核甘酸序列。ITR最外面的125個核苷酸可以二種選擇性向位存在，產生不同AAV基因體之間以及單一AAV基因體二端之間的異質性。最外面的125個核苷酸亦含有數個較短的自我互補區(稱為A、A’、B、B’、C、C’和D區)，而得以在ITR的此部分內發生股間的鹼基配對。
「端點解析序列」或「trs」為AAV ITR之D區中的序列，其係在病毒DNA複製期間以AAV rep蛋白裂解。AAV rep蛋白難以裂解突變的端點解析序列。
AAV之「幫手病毒」係指能讓AAV(其為一缺陷細小病毒)複製並被宿主細胞包裹之病毒。幫手病毒提供能讓AAV複製之「幫手功能」。已鑑別出許多的此等幫手病毒，其包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒例如牛痘。雖然C亞族之第5型腺病毒(Ad5)為最常使用的，但腺病毒係涵蓋許多不同的亞族。已知有許多人類、非人類哺乳動物和鳥類的腺病毒並可由例如ATCC的儲存庫取得。疱疹科之病毒，其亦可由例如ATCC的儲存庫取得，包括，例如單純皰疹病毒(HSV)、EB(Epstein-Barr viruses)(EBV)、巨細胞病毒(CMV)和假性狂犬病毒(PRV)。用於AAV複製之腺病毒幫手功能的實例包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4orf6功能。
若感染的AAV粒子與感染的幫手病毒粒子的比率為至少約102：1；至少約104：1，至少約106：1；或至少約108：1，則rAAV之製備物被認為是「實質上無」幫手病毒。製備物亦可無等量的幫手病毒蛋白(亦即若上述的幫手病毒粒子雜質係以擾亂形式存在時，可能因該量的幫手病毒而存在之蛋白)。當在SDS凝膠上有考瑪斯染色帶存在時，一般可能觀察到病毒及/或細胞蛋白汙染物(例如，該等相當於AAV殼體蛋白VP1、VP2和VP3以外的條帶出現)。
術語「調節」係指影響(例如，上調、下調或其他控制)訊號傳遞路徑的程度。在訊號轉導控制下的細胞處理，包括(但不限於)特定基因的轉錄、正常細胞功能，例如代謝、增生、分化、黏附、雕王和存活，以及異常的處理，例如轉變、阻斷分化和代謝。
就本發明之目的「活化的」或「活性」係指Flt-1受體多肽的形式，其保留對應的天然或自然生成多肽之生物活性(抑制或刺激)。該活性可大於、等於或小於以對應的天然或自然生成多肽所觀察的活性。如 上所說明，活性係包括在患有黃斑部病變之患者中調節VEGF訊號傳遞路徑的程度。
「分離」當指核苷酸時，係表示所指的分子係以實質上無其他相同類型之生物大分子存在。因此，編碼特定多肽之「分離的核酸分子」係指一核酸分子其實質上無其他未編碼此主體多肽之核酸分子；然而，此分子可包括某些對組成物之鹼基特性無有害影響的額外鹼基或基團。
整個本申請案，就描述在一特定核酸分子中核苷酸序列的相對位置之目的，例如當一特定的核苷酸序列係描述為位於相對於另外序列之「上游」、「下游」、「3-prime(3’)」或「5-prime(5’)」，應了解，其為DNA分子的「意義」股或「編碼」股中序列的位置，如本項技術中習用上所指。
術語「純化的」係指分離物質(化合物、聚核苷酸、蛋白、多肽、多肽組成物)使得所指的物質包括其中其所在的樣本之多數百分比。典型地在一樣本中，實質上純化的組份係包括50%、80%-85%、20 90-99%，例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的樣本。純化指定之聚核苷酸和多肽的技術已為本項技術所熟知，並包括，例如離子交換層析、親和力層析和根據密度之沉降。
「患者」、「個體」或「病患」在文中係交換使用並係指脊椎動物，例如哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)鼠科、嚙齒類、猿猴、人類、農用動物、運動動物和寵物。
術語組成物或試劑之「有效量」或「治療上有效量」，如文中所提供，係指提供所欲的反應，例如調節眼睛中VEGF，或降低、防止或延緩眼睛中與黃斑部病變有關的生理變化之進程，或降低、防止或延緩由其所顯現的癥狀之進程(例如脈絡膜疣堆積、眼睛中異常血管生長、眼睛中異常的液體、血液和蛋白滲漏等等)之足夠的組成物或試劑量。依照物種、年齡和患者的一般症狀、所欲治療症狀之嚴重度以及相關的特定大分子、給藥模式等等，所需確切的量在患者間各不相同。就任何個別的案例， 適當的「有效」量可由熟習本項技術之一般技術者使用例行的實驗來決定。參見，例如Lim,J.(2012)Age-Related Macular Degeneration,CRC 5 Press,Boca Raton；Kanski等人(2011)Clinical Ophthalmology：A Systematic Approach,Elsevier Saunders。
「治療」黃斑部病變包括：(1)防止疾病，亦即防止疾病的發生或使此疾病較低度發生在可能暴露或易罹患此疾病但尚未經歷或出現此疾病癥狀之患者中，(2)抑制該疾病，亦即遏止發生、防止或延緩進程或反轉疾病狀態(3)減輕疾病癥狀，亦即降低患者經歷症狀的次數，或(4)降低、防止或延緩眼睛中與黃斑部病變有關的眼睛生理變化。治療包括(但不限於)降低脈絡膜疣堆積、眼睛中異常血管生長、眼睛中異常的液體、血液和蛋白滲漏等等。治療可，例如藉由監測眼睛中央部份之光受體(桿細胞和錐細胞)喪失的速率和量，藉由監測視力喪失的速率和最佳矯正視力(BCVA)，藉由監測視網膜下之視網膜色素上皮層(以及脈絡膜毛細管層)萎縮的速率和量，藉由監測眼睛中異常血管生長，及監測眼睛中異常的液體、血液和蛋白滲漏之量，加以偵測。
文中所提供的範圍請了解為在該範圍的所有值之概述。例如1至50之範圍請了解係包括由下列組成之群中選出的任何數字或子範圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
如本發明所屬的技術之一般技術者正常之理解，除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語具有相同意義。雖然任何類似或相當文中所述之方法和物質皆可用於施行或試驗本發明，而文中僅描述示例性方法、裝置和物質。文中所引述之所有的技術和專利公開案係以全文引用的方式併入本文中。然而，其在文中不應解釋為承認本發明無權藉由先前發明而先於此揭示。
應了解，雖然並未一直明確地陳述所有數字前面的術語「大約」。亦應了解，雖然並未一直明確地陳述，文中所述的所有試劑僅為示例性，但此等之同等物已為本項技術所知
2.進行本發明之模式
在詳述本發明之前，應了解，本發明不限於特定的調配物或處理參數，因為此等，當然可改變。亦應了解，文中所用的術語僅供描述本發明特定實施例之目的，且不希望受限制。
應了解，本發明不應視為受限於文中所述的實例。該等與文中所述者類似或相當的方法和物質皆可用於施行本發明，且本發明應理解為包括任何及所有文中所提供的申請案及一般技術者之技術內的所有同等變化。
本發明的中心係發現使用編碼可溶性蛋白之結構，基因遞送至眼睛，而該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之VEGFR-1(Flt-1)的功能域(亦稱為「可溶性Flt-1蛋白」或「可溶性Flt-1受體」)，用以調節對應的訊號傳遞路徑，及顯著地降低黃斑部病變之癥狀。在態樣上，本發明係涉及投予比之前提出在非人類靈長類中為有效的更低劑量。參見，例如Lukason等人，Molecular Ther.(2011)19：260-265。因此，投予可溶性Flt-1蛋白提供一治療和預防人類黃斑部病變之有用技術。文中所描述的方法可單獨或與習用的治療組合使用(例如PDGF拮抗劑、PDGF-R拮抗劑、補體路徑抑制劑)。
在實施例中，用於本發明方法中之可溶性蛋白為一融合蛋白，其包括至少一Flt-1功能域或其活性部份，直接或經由一免疫球蛋白恆定功能域與多聚化功能域相連接。在某些實施例中，可溶性蛋白係包括第2功能域或其部份及/或其延伸，直接或經由一連接子與多聚化功能域相連接。連接子可包括長度5-25個殘基之胺基酸序列。代表性多聚化功能域包括(但不限於)IgG Fc區或其部份，及IgG CH3區或其部份。
受體可存在免疫球蛋白區的上游或下游。典型地，融合蛋白當表現在活體中時，係以多聚化形式產生。多聚體可為二聚體、三聚體等。
為了進一步了解本發明，下文係提供有關黃斑部病變、Flt-1受體、受體-免疫球蛋白融合以及本發明所使用之各種基因遞送方法的更詳細論述。
黃斑部病變
如上所說明，本發明係利用Flt-1受體以抑制VEGF活性，並藉此治療、預防、減輕及/或防止或延緩黃斑部病變之進程。在特定實施例中，處於發生黃斑部病變風險之個體係經投予一有效量，用以延緩或防止該疾病。
已鑑別出至少三種黃斑部病變的形式。(1)萎縮、非滲出性-乾式AMD，亦稱為中間地圖樣萎縮，發生在大約85至90%的黃斑部病變病患中。乾式的AMD典型地係由視網膜下方的視網膜色素上皮層萎縮所致(及推測上脈絡膜毛細管)，並經由眼睛中央部份之光受體(桿細胞和錐細胞)喪失造成視力喪失。另外可能有細胞碎片(稱為脈絡膜疣)堆積在視網膜和脈絡膜之間。(2)濕式的AMD，亦稱為新生血管或滲出性，代表更嚴重的AMD型。濕式的AMD典型地特徵為眼睛中異常的血管生長，其中該錯誤的血管滲漏出液體和血液。其可能因異常的血管生長從脈絡膜毛細管經由布魯氏膜(Bruch’s membrane)進入視網膜下間隙，最後導致黃斑部下方血液和蛋白滲漏，造成視力喪失。若不治療，來自這些血管之流血、滲漏和結痂最後造成對光受體不可逆的傷害、黃斑部的結痂形成及相當快速的視力喪失。(3)色素上皮剝離有關的(PED)ARMD係發生在低於5%的病患中，並造成視網膜剝離。
Flt-1分子及融合
本發明係利用可溶性形式的Flt-1受體來調節VEGF活性並藉此治療、預防、減輕及/或防止或延緩黃斑部病變之進程。在本發明中係使用Flt-1受體-免疫球蛋白融合。保留與VEGF結合及調節配體活性之能力的天然分子，以及其活性片段和類似物，如任何已知的各種分析和動物模型中所測，包括該等進一步於文中所描述的，係適合用於本發明中。例如VEGF結合分析為已知的並描述於Pechan等人，Gene Ther(2009)16：10-16)和美國專利第7,928,072號，其係以全文引用的方式併入本文中。
編碼代表性全長人類Flt-1受體之胺基酸序列和核苷酸序列係分別如圖9A-9B(SEQ ID NO：18)和10A-10E(SEQ ID NO：19)所示。Flt-1受體蛋白具有在圖10A-10E之位置27-758所見的胞外區，其係包括七個類-Ig功能域。圖10A-10E之胺基酸1-26代表一訊號序列。七個類-Ig功能域分別係位於圖10A-10E之殘基編號32-123、151-214、230-327、335-421、428-553、556-654和661-747。該Flt-1蛋白係由如Genbank登錄號NM_002019所示的DNA序列所編碼(圖9A-9B,SEQ ID NO：18)。
在實施例中，用於本發明之Flt-1分子係包括一Flt-1類-Ig第2功能域。Flt-1分子的任何部份皆可使用，只要該分子保留調節VEGF活性之能力；然而，在某些實施例中，該Flt-1分子可能缺乏所有或部份的第1和3功能域。Flt-1第2功能域可參見圖10A-10E之位置151-214。然而，本發明之Flt-1組份可包括，例如在Flt-1的第1和2功能域之間、第2和3功能域之間等等所發現的胺基酸序列，例如對應圖10A-10E的位置124-229之間所發現的胺基酸序列之任何胺基酸序列，以任一圖10A-10E之位置124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、136...140...145...150、151、152、153、154、155...160...165...170開始，至胺基酸210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229等的胺基酸序列。在實施例中，文中所述的融合蛋白之Flt-1組份包括圖10A-10E之胺基酸132-226。Flt-1組份亦可包括任何存在Flt-1蛋白之胞外區的其他區之部份，包括第1和3功能 域，或甚至刪除第2功能域，只要所欲的活性保留即可。在特定的實施例中，第1和3功能域並非整體存在。
再者，本發明之可溶性蛋白可包括另外的多肽/基團。例如本發明之可溶性蛋白可包括所有或部份的VEGFR2，例如VEGFR2的任何可變功能域，包括(不限於)VEGFR2的第1、2及/或3功能域，以及具有一或多個這些功能域刪除的部份。用於說明VEGFR2融合及VEGFR2之功能域與Flt-1功能域的雜交融合，請參見，例如Holash等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)99：11393-11398和美國專利第7,378,095號，其係以全文引用的方式併入本文中。
本發明之特別的融合包括Flt-1類-Ig第2功能域與如圖2A-2B、6、8和12之位置24-118所示的序列，其係相當於圖10A-10E之胺基酸位置132-226，或保留調節VEGF能力之序列的一部份或變體。在某些實施例中，該融合蛋白亦與胎盤生長因子結合。
訊號序列亦可存在並與可溶性蛋白的N-端相連接(例如Flt-1類-Ig第2功能域序列)。該訊號序列可包括一部份全部的天然序列，例如所有或一部份圖10A-10E之位置1-26所見的序列。在圖2A-2B(SEQ ID NO：11)、6(SEQ ID NO：15)、8(SEQ ID NO：17)和12(SEQ ID NO：21)中所示的融合蛋白，存有一23個胺基酸(圖2A-2B、6、8和12之胺基酸1-23)之訊號序列。該序列係與Flt-1蛋白的天然訊號序列同源。另一種選擇，可存有異源性訊號序列。許多此等序列已為本項技術所知並可用於文中。訊號序列的非限定實例包括該等存在隱藏蛋白中的，例如人類生長激素、牛生長激素、牛白蛋白原、人類胰島素原、人類甘擾素-γ、人類α-纖維蛋白原、人類IgG重鏈、大鼠澱粉酶、鼠科α-胎兒蛋白、雞溶菌酶及玉米(Zea mays)rein蛋白22.1、腦衍生的神經營養因子、胰島素生長因子1及β-葡萄醣醛酸酶。
如上所說明，融合蛋白的Flt-1部份係直接或經由一連接子與多聚化功能域相連接。多聚化功能域可為一免疫球蛋白序列，例如免疫球蛋白恆定功能域、白胺酸拉鏈、疏水區、親水區、包括一游離硫醇之多肽，而該硫醇係在二或多個多聚化功能域之間形成一分子間雙硫鍵或，例 如，「腔內突起」功能域，係描述於例如美國專利第5,731,168號中，其係以全文引用的方式併入本文中。該多聚化功能域係提供促進或得以從單體功能域形成二聚體、三聚體及其類似物之分子部份。
多聚化功能域將造成至少5%、10%、20%、30%%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%或95%的單體融合蛋白以適合多聚體之速率在非變性聚丙烯醯胺凝膠上遷移。糖基化亦可影響凝膠中蛋白的遷移。雖然在本處係顯示特別的序列，但變體，例如等位基因變體亦可使用。典型地此等變體與所揭示的序列將具有至少85%、90%、95%、97%、98%或99%相同度。
多聚化可，例如使用還原或非還原凝膠來分析。多聚化亦可藉由偵測蛋白對其配體/受體增加的結合親和力來分析。就此，可使用BiaCoreTM表面電漿共振分析。這些分析係藉由於一接近感測晶片表面之水性層中測量折射率變化，偵測質量的變化。任何本項技術中已知的方法皆可用於偵測多聚化作用。
在態樣上，多聚化功能域係衍生自免疫球蛋白分子，包括(但不限於)來自重鏈的區、免疫球蛋白恆定功能域、Fc區等等。可使用IgG1或IgG2 λ重鏈的Fc部份之序列，例如單獨的CH3，例如圖14A-14B之胺基酸371-477，或CH3的部份或延伸，或CH2和CH3功能域二者，例如圖14A-14B的胺基酸247-477，或其延伸。
獲得免疫球蛋白分子之部份的方法已為本項技術所熟知。例如免疫球蛋白分子的Fc部份可藉由以木瓜蛋白酶(papain)裂解整個抗體分子來獲得。亦可使用其他的方法來獲得這些部份。就IgG1 λ重鏈蛋白序列，參見，例如Genbank登錄號Y14737及圖13(SEQ ID NO：22)和14A-14B(SEQ ID NO：23)，係分別顯示DNA和胺基酸序列。可使用其他的Fc區，例如，來自其他IgG種類及來自IgA、IgM、IgD或IgE抗體。亦可使用VEGF的多聚化功能域。編碼VEGF之DNA序列係顯示在Genbank登錄號10 NM003376和圖3(SEQ ID NO：12)。VEGF之胺基酸序列係顯示在Genbank登錄號CAC19513和圖4(SEQ ID NO：13)。VEGF之多聚化功能域，由VEGF外顯子 3(VEGF Ex3)所編碼，係在VEGF蛋白約75-88的胺基酸殘基(圖4)並包括胺基酸序列Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(SEQ ID 15 NO：7)。
雖然有許多不同的連接子基團可使用且可能功能上相當，但在態樣上，在本發明中係使用9個甘胺酸殘基之連接子。其他的連接子可包括列如5-100個胺基酸殘基，5-75個胺基酸殘基，5-50個胺基酸殘基，5-25個胺基酸殘基，5-20個胺基酸殘基，5-15個胺基酸殘基，5-10個胺基酸殘基，或5-9個胺基酸殘基。可使用的連接子之實例包括：gly9(SEQ ID NO：1)；glu9(SEQ ID NO：2)；ser9(SEQ ID NO：3)；25 gly5cyspro2cys(SEQ ID NO：4)；(gly4ser)3(SEQ ID NO：5)；SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：6)；ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：7)；GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ ID NO：8)；及30 Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：9)。
可使用的其他多肽連接子包括不同長度的聚甘胺酸，包括5、7或30個殘基。另外，可使用Flt-1的其他部份作為連接子，例如Flt-1的3功能域或其部份或延伸，例如圖10A-10E之胺基酸235-336。
亦可從其他的聚合物製造連接子基團，例如聚乙二醇。此等連接子可具有從10至1000、10-500、10-250、10-100或10-50個乙二醇單體單元。適合的聚合物大小應與適當的胺基酸殘基範圍所佔據的大小相類似。一典型大小的聚合物應提供約10-25埃(Å)之間隔。
用於本發明之融合蛋白的示例形式係如圖2A-2B(SEQ ID NO：11)、6(SEQ ID NO：15)、8(SEQ ID NO：17)和12 10(SEQ ID NO：21)所示，其分別係由圖1(SEQ ID NO：10)、5(SEQ ID NO：14)、7(SEQ ID NO：16)和11(SEQ ID NO：20)所示的聚核苷酸序列所編碼。此等序列係描述於美國專利第7,928,072號中，其係以全文引用的方式併入本文中。
如圖2A-2B(SEQ ID NO：11)所示的融合，文中稱為「sFLT01蛋白」，包括N-端至C-端之順序，圖2A-2B之位置1-23所見的訊號序列；一Flt-1類-Ig第2功能域加上此功能域的延伸，參見圖2A-2B之位置24-118(相當於圖10A-10E之胺基酸132-226)；九個甘胺酸之序列，參見圖2A-2B之位置119-127；及IgG1-Fc CH2/CH3殘基，在圖2A-2B之位置128-358。
圖6(SEQ ID NO：15)所示的融合包括N-端至C-端之順序，圖6之位置1-23所見的訊號序列；Flt-1類-Ig第2功能域加上此功能域之延伸，參見圖6之位置24-118(相當於圖10A-10E之胺基酸132-226)；九個甘胺酸之序列，參見圖6之位置119-127 of圖6；及圖6之位置128-141的VEGF多聚化功能域。
圖8(SEQ ID NO：17)包括N-端至C-端之順序，圖8之位置1-23所見的訊號序列；Flt-1類-Ig第2功能域加上此功能域的延伸，參見圖8之位置24-118(相當於圖10A-10E之胺基酸132-226)；九個甘胺酸之序列，參見圖8之位置119-127；VEGF多聚化功能域在圖8之位置128-141；及來自IgG CH2/CH3在圖8之位置142-247的序列。
圖12(SEQ ID NO：21)係顯示文中稱為「sFLT02」的融合蛋白，其係包括以N-端至C-端之順序，圖12之位置1-23所見的訊號序列；一Flt-1類-Ig第2功能域加上此功能域的延伸，參見圖12之位置24-118(相當於圖10A-10E之胺基酸132-226)；九個甘胺酸之序列，參見圖12之位置119-127；在圖12之位置128-233所見的IgG CH2/CH3殘基。
雖然本處係論述特別的序列，但變體例如等位基因變體亦可使用。典型地此等變體與所揭示的序列將具有至少85%、90%、95%、97%、98%或99%相同度並保留文中所述的功能，包括聚合化及與VEFG結合之能力。
編碼本發明所用的Flt-1受體及其融合蛋白之聚核苷酸可使用標準的分子生物技術來製造。例如，編碼上述分子之聚核苷酸序列可使用，例如藉由從表現該基因的細胞篩選cDNA和基因體庫，或藉由從已知包括該基因的載體衍生該基因，來獲得。所指的基因亦可以已知的序列為基準，以合成製造，而非選殖。該分子可用特定序列之適當的密碼子來設計。然後從以標準方法所製備的重疊寡核苷酸裝配完整的序列並組裝成完整的編碼序列。參見，例如Edge,Nature(1981)292：756；Nambair等人.，Science(1984)223：1299；及Jay等人，J.Biol.Chem.(1984)259：6311。
因此，特定的核苷酸序列可由藏有所欲序列的載體來獲得，或完全或部分使用本項技術中已知的各種寡核苷酸合成技術來合成，例如，若適當，位點突變和聚合酶連鎖反應(PCR)技術。參見，例如Sambrook，上文。獲得編碼所欲序列之核苷酸序列的一方法係藉由黏接以習用的自動聚核苷酸合成器所產生的重疊合成寡核苷酸之互補組，接著以適當的DNA連接酶連接並將連接的核苷酸序列經由PCR增幅。參見，例如Jayaraman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88：4084-4088。另外，寡核苷酸-定向合成(Jones等人，Nature(1986)54：75-82)、預先存在核苷酸區之寡核苷酸定點突變(Riechmann等人，Nature(1988)332：323-327及Verhoeyen等人，Science(1988)239：1534-1536)及使用T4 DNA聚合酶之酵素性填補缺位寡核苷酸(Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86：10029-10033)可用於提供主體方法中所用的分子。
一但獲得，編碼該受體的寡核苷酸，如上述，可直接或經由一連接子基團與多聚化功能域相連接。該結構可使用重組的病毒載體，如另於下文中所述，遞送至患者。
基因遞送技術
sFlt-1結構，例如該等上述者，可使用任何數種基因遞送技術，遞送至所指的患者。用於基因遞送的數種方法已為本項技術所知。一般，重組載體係調配成如下述之醫藥組成物並使用活體內或活體外轉導技 術，導入患者中。若以活體外轉導，則將會從患者移出所欲的接受細胞，以重組載體轉導並再導入患者中。另一種選擇，可使同源性或外源性細胞，其中該等細胞將不會在患者中產生不適當的免疫反應。
用於將轉導細胞遞送和導入患者中之適合的方法已有描述。例如，細胞可在活體外藉由將重組載體與患者細胞組合，例如於適當的培養基中，並使用習用的技術，例如南方墨點及或CPR或藉由使用可選擇的標記，篩選藏有所指DNA之細胞，來轉導。
已開發出許多用於活體內或活體外將基因轉移到哺乳動物細胞之病毒基礎的系統。例如，反轉錄病毒提供一基因遞送系統方便的平台。選擇的基因可使用本項技術中已知的技術插入載體或包裹在反轉錄病毒粒子中。然後可分離重組的病毒並於活體內或活體外遞送至患者細胞。許多反轉錄病毒系統已有描述。參見，例如美國專利第5,219,740號；Miller和Rosman,BioTechniques(1989)7：980-990；Miller,A.D.,Human Gene Therapy(1990)1：5-14；Scarpa等人，Virology(1991)180：849-852；Burns等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：8033-8037；及Boris-Lawrie and Temin,Cur.Opin.Genet.Develop.(1993)3：102-109。複製缺陷的鼠科反轉錄病毒載體係廣泛利用的基因轉移載體。鼠科白血病反轉錄病毒包括一單股RNA複合核心蛋白及被蛋白核心(gag)包入及決定宿主範圍之糖蛋白外套膜(env)圍繞的聚合酶(pol)酵素。反轉錄病毒的基因體結構包括附在5’和3’長末端重複(LTR)之gag、pol和env基因。反轉錄病毒載體系統揭露了含有5’和3’LTR及包裹訊號之最小的載體係足以讓載體包裹和感染及整合至目標細胞的事實，其限制條件為病毒結構蛋白在包裹的細胞株中係以反式來供應。用於基因轉移之反轉錄病毒載體的基本優點包括在大部份細胞類型中有效感染及基因表現、精準的單一複製載體整合至目標細胞染色體DNA及反轉錄病毒基因體的容易操作。
許多腺病毒載體已有描述。與整合至宿主基因體之反轉錄病毒不同，腺病毒係留在染色體外，因而將插入突變之相關風險減至最低(Haj-Ahmad和Graham,J.Virol.(1986)57：267-274；Bett等人，J.Virol.(1993) 67：5911-5921；Mittereder等人，Human Gene Therapy(1994)5：717-729；Seth等人，J.Virol.(1994)68：933-940；Barr等人，Gene Therapy(1994)1：51-58；Berkner,K.L.BioTechniques 20(1988)6：616-629；及Rich等人，Human Gene Therapy(1993)4：461-476)。用於主題方法中之腺病毒載體更詳細描述於下。
另外，已開發用於基因遞送之腺-相關病毒(AAV)載體系統。AAV載體可使用本項技術中熟知的技術容易地建構。參見，例如美國專利第5,173,414和5,139,941號；國際公開案號WO 92/01070(1992年1月23日公開)和WO 93/03769(1993年3月4日公開)；Lebkowski等人，Molec.Cell.Biol.(1988)8：3988-3996；Vincent等人，Vaccines 90(1990)(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter,B.J.Current Opinion in Biotechnology(1992)3：533-539；Muzyczka,N.Current Topics in Microbiol.and Immunol.(1992)158：97-129；Kotin,R.M.Human Gene Therapy(1994)5：793-801；Shelling和Smith,Gene Therapy(1994)1：165-169；及Zhou等人，J.Exp.Med.(1994)179：1867-1875。AAV載體系統進一步詳述於下。
可用於遞送所指的核酸分子之另外的病毒載體包括該等衍生自痘科病毒，包括牛痘病毒和禽痘病毒。例如，表現此等基因之牛痘病毒重組物可如下來建構。首先將編碼特定多肽之DNA插入一適當的載體中，使其與牛痘啟動子及側面牛痘DNA序列相鄰，例如編碼胸苷激酶(TK)之序列。然後將該載體用於轉染同時經牛痘轉染之細胞。同源性重組用於將牛痘啟動子及編碼該蛋白的基因差入病毒的基因體。所產生的TK-重組物可藉由在5-溴去氧尿苷的存在下培養細胞作選擇並挑選病毒蝕斑抗性。
另一種選擇，禽痘病毒，例如雞痘和金絲雀痘病毒亦可用來遞送基因。使用禽痘載體對在人類和其他哺乳動物物種中為特別有利的，因為禽痘屬之成員僅可在易受影響的鳥類中繁殖複製且因此在哺乳類細胞中無感染性。用於製造重組禽痘病毒之方法已為本項技術所知，並使用基因重組，如上述有關牛痘病毒之製造。參見，例如WO 91/12882；WO 89/03429；及WO 92/03545。
分子接合載體，例如描述於Michael等人，J.Biol.Chem.(1993)268：6866-6869和Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6099-6103中之腺病毒嵌合載體，亦可用於基因遞送。阿爾法病毒(Alphavirus)屬的成員，例如(但不限於)衍生自辛德畢斯(Sindbis)和塞姆利基森林(Semliki Forest)病毒之載體，亦可用作遞送編碼融合蛋白之多肽的病毒載體。就可用於施行本發明方法之辛德畢斯病毒衍生的載體的說明係參見Dubensky等人，J.25 Virol.(1996)70：508-519；及國際申請案號WO 95/07995及WO 96/17072。
另一種選擇，Flt-1結構可在無使用病毒載體下遞送，例如藉由以質體為基礎的核酸遞送系統，如美國專利案號6,413,942；6,214,804；5,580,859；5,589,466；5,763,270；及30 5,693,622中所述，其全部係以全文引用的方式併入本文中。質體係包括所指的基因操作上連接引導蛋白產物在活體中表現之控制元素。此等控制元素已為本項技術所知。
腺病毒基因遞送系統
在一本發明之實施例中，編碼Flt-1受體，例如上述融合蛋白之核苷酸序列，係插入腺病毒為基礎的載體中。腺病毒基因體為一大約36,000個鹼基具有55-kDa末端蛋白與各股5’端共價結合之直鏈雙股DNA分子。腺病毒(“Ad”)DNA含有約100對鹼基之相同的反轉末端重複(“ITR”)，其中確切的長度係依血清型而定。病毒的複製源係位於ITR內確切地在基因體末端。DNA合成係以二個10階段發生。首先，以股置換進行複製，產生子代雙鏈分子和親代置換股。置換股為單股且可形成一「鍋柄狀」中間物，其使得複製開始並產生子代雙鏈分子。另一種選擇，複製可同時從基因體的二個末端進行，而不需要形成鍋柄結構。
在生產性感染週期期間，病毒基因係以二個時期表現：早期，其為達到病毒DNA複製之時期，及晚期，其係與病毒DNA複製之啟動一致。在早期期間僅表現較早的基因產物(由E1、E2、E3和E4區所編碼)，其進行許多的功能為細胞準備合成病毒結構蛋白。在晚期期間，除了較早 的基因產物之外，亦表現晚期病毒基因產物，且宿主細胞DNA和蛋白合成停止。因此，細胞變得專注於病毒DNA及病毒結構蛋白之製造。
腺病毒載體的E1區為感染目標細胞後第一個表現的區。該區係由二個轉錄單位E1A和E1B基因所組成。E1A基因產物主要的功能為引發靜態細胞進入細胞週期及再繼續細胞DNA合成，並轉錄性活化E1B基因和其他早期區(E2、E3、E4)。單獨以E1A基因轉染初級細胞可能引發無限增生(不朽化)，但不會造成完全轉變。然而，E1A之表現在大部分的情況下係導致程序性細胞死亡(細胞凋亡)，且僅有偶發的不朽化。E1B基因的共現性為防止引發細胞凋亡所需及用於完全的形態轉變發生。在建立的不朽細胞株中，E1A的高表現量可能造成在缺乏E1B下之完全轉變。
E1B-編碼的蛋白幫助E1A重新引導細胞功能，而得以進行細胞複製。E1B 55kD和E4 33kD蛋白，其形成一基本上侷限在核中之複合物，係進行抑制宿主蛋白合成及促進病毒基因表現之功能。其主要的影響為建立從胞核選擇性轉運病毒的mRNA至細胞質，隨附地開始感染後期。E1B 21kD蛋白對於正確暫時性控制生產性感染週期為重要的，藉此防止在病毒生命週期完成之前宿主細胞過早死亡。
腺病毒為基礎的載體係以高量表現基因產物胜肽。腺病毒載體具有高效的感染性，即使是低病毒效價。另外，當此病毒作為一無細胞之病毒體時為完全感染性的，所以並不需要注射生產者細胞株。腺病毒載體在活體內進行長期的異源基因表現。腺病毒與嚴重的人類病理無關，此病毒可感染廣泛的各種細胞並具有廣泛的宿主-範圍，該病毒可容易地大量製造，及該病毒可藉由刪除病毒基因體之早期1(“E1”)而提供複製缺陷。因此，衍生自人類腺病毒的載體，其中至少E1區已刪除並經指定基因置換，已廣泛地用於臨床前和臨床階段之基因治療試驗。
用於本發明之腺病毒載體係衍生自任何各種的腺病毒血清型，包括(不限於)任何超過40種血清型腺病毒株，例如血清型2、5、12、40和41。文中所用的腺病毒載體為複製缺陷並含有在適合啟動子控制下的指定基因，例如任何下文所論述有關腺-相關病毒之啟動子。例如，美國專 利第6,048,551號，其係以全文引用的方式併入本文中，描述了包括抗發炎細胞激素IL-10之人類基因的複製缺陷腺病毒載體，以及包括抗發炎細胞激素IL-1ra之基因的載體，係在勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子的控制下，分別稱為Ad.RSVIL-10和Ad.RSVIL-1ra。
衍生自任何腺病毒血清型，及帶有不同啟動子系統之其他的重組腺病毒，可為熟習本項技術者所使用。例如，美國專利第6,306,652號，其係以全文引用的方式併入本文中，描述了帶有E2A序列，含有hr突變及ts125突變，稱為ts400的腺病毒載體，用以防止E2A過度表現之細胞死亡，和帶有E2A序列，僅含有hr突變，於誘導型啟動子的控制下之載體，以及帶有E2A序列，含有hr突變和ts125突變(ts400)，於誘導型啟動子的控制下之載體。
再者，描述於美國專利第10 6,306,652號中「最小的」腺病毒載體可用於本發明。此等載體保留至少部份的病毒基因體，其為基因體殼體化進入病毒粒子中(殼體化訊號)，以及至少複製一至少一ITR的功能性部分或衍生物。包裹最小的腺病毒載體可藉由以一幫手病毒共感染，或另一種選擇，如美國專利第6,306,652號所述，以包裹缺乏複製的幫手系統來進行。
用於遞送所指基因之其他有用的腺病毒基礎載體包括其中大多數的病毒基因體已移除之「無病毒(gutless)」(幫手-依賴的)腺病毒(Wu等人，Anesthes.(2001)94：1119-1132)，此等「無病毒(gutless)」腺病毒載體基本上不會製造病毒蛋白，因此能在單一給藥後，於一整年內成功地確保該病毒驅動的基因治療(Parks,R.J.,Clin.Genet.(2000)58：1-11；Tsai等人，Curr.Opin.Mol.Ther.(2000)2：515-523)及消除免疫系統的干擾。此外，移除病毒基因體為插入控制序列創造出空間，其提供全身性給藥之表現調控(Burcin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96：355-360)，加入病毒驅動的蛋白表現之安全性和控制。這些和其他的重組腺病毒可用於本發明方法。
腺-相關病毒基因遞送系統
腺-相關病毒(AAV)已成功用於遞送基因治療之基因。該AAV基因體為一含有約4681個核苷酸之直鏈、單股DNA分子。AAV基因體一般係包括一內部、非重複基因體，在各末端側接反轉末端重複(ITR)序列。該ITR長度為大約145對鹼基(bp)。該ITR具有多重功能，包括提供DNA之複製源及包裹病毒基因體之訊號。基因體之內部非重複部份包括二個大的開放讀框，稱為AAV複製(rep)和殼體(cap)基因。病毒蛋白之rep和cap基因編碼讓病毒得以複製並包裹成病毒體。特言之，至少四種病毒蛋白之家族係由AAV rep區表現，Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40，係根據其表觀分子量來命名。AAV cap區編碼至少三種蛋白，VPI、VP2和VP3。
AAV係藉由刪除AAV基因體內部的非重複部份，經工程化用以遞送所指之基因(亦即rep和cap基因)並在ITR之間插入一異源性基因(在此情況下，為編碼Flt-1受體或融合蛋白之基因)。該異源性基因典型地係功能上與一能在病患的目標細胞中於適當的條件下驅動基因表現之異源性啟動子相連接(組成性，細胞-專一性或誘導型)。亦可包括終止訊號，例如聚腺苷化位置。
AAV為一幫手-依賴的病毒；亦即，其需要與一幫手病毒共感染(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘)，以形成AAV病毒體。在缺乏與幫手病毒共感染下，AAV建立一潛伏狀態，其中病毒基因體係插入宿主細胞染色體，但感染的病毒體並未產生。隨後以幫手病毒感染「拯救」整合的基因體，使其得以複製並將其基因體包裹成一感染的AAV病毒體。當AAV可感染來自不同物種之細胞的同時，該幫手病毒必須為宿主細胞之相同物種。因此，例如人類的AAV將在經犬腺病毒共感染的犬細胞中複製。
包括所指基因之重組的AAV病毒體可使用下文中更完整描述之各種技術-驗證的技術來產生。野生型AAV和幫手病毒可用於提供製造rAAV病毒體之必須的複製功能(參見，例如美國專利第5,139,941號，其係以全文引用的方式併入本文中)。另一種選擇，含有幫手功能基因之質體，與一熟知的幫手病毒之感染組合，可用作為複製功能之來源(參見，例如美國專利第5,622,856號和美國專利第5,139,941號，二者係以全文引用的方式 併入本文中)。類似地，含有附屬功能基因之質體，可與野生型AAV之感染組合使用，用以提供必須的複製功能。這三種方法，當與rAAV載體組合使用時，其各自係足以產生rAAV病毒體。其他的方法，已為本項技術所熟知，亦可為熟習技術者所用，用以產生rAAV病毒體。
在本發明一實施例中，係使用三重轉染方法(詳係描述於美國專利第6,001,650號中，其係以全文引用的方式併入)來製造rAAV病毒體，因為此方法不需要使用有感染性的幫手病毒，而能在無任何可偵測的幫手病毒存在下製造rAAV病毒體。此方法係使用三種供rAAV病毒體製造之載體來進行：一AAV幫手功能載體，一附屬功能載體及一rAAV表現載體。熟習本項技術者應了解，然而，這些載體所編碼的核酸序列，可以各種組合提供在二或多個載體上。
如上所說明，AAV幫手功能載體係編碼「AAV幫手功能」序列(亦即，rep和cap)，其係反向進行生產性AAV複製和殼體化。AAV幫手功能可在無產生任何可偵測的wt AAV病毒體之下，支持有效的AAV載體產生(亦即，含有功能性rep和cap基因之AAV病毒體)。一此等載體之實例pHLP19，係描述於美國專利第6,001,650中，其係以全文引用的方式併入本文中。AAV幫手功能載體之rep和cap基因，如上所說明，可衍生自任何已知的AAV血清型。例如，AAV幫手功能載體可具有一衍生自AAV-2的rep基因和一衍生自AAV-6的cap基因；熟習本項技術者應了解，其他的rep和cap基因組合亦為可能的，其定義性特徵為支持rAAV病毒體產生之能力。
附屬功能載體係編碼AAV依賴用於複製之非-AAV-衍生的病毒及/或細胞功能(亦即附屬功能)的核苷酸序列。附屬功能包括該等AAV複製所需的功能，包括(不限於)該等涉及活化AAV基因轉錄、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、合成cap表現產物及AAV殼體組件。病毒-基礎的附屬功能可衍生自任何熟知的幫手病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(單純皰疹病毒-1型以外)及牛痘病毒。在實施例中，係使用附屬功能質體pLadeno5(有關pLadeno5之詳請係描述於美國專利第6,004,797號中，其係 以全文引用的方式併入本文中)。該質體係提供整套用於AAV載體複製之腺病毒附屬功能，但缺乏形成有複製能力之腺病毒所需的組份。
為了進一步了解AAV，有關重組AAV表現載體和AAV幫手和附屬功能之更詳細的論述係提供於下。
重組的AAV表現載體
重組的AAV(rAAV)表現載體係使用已知的技術來建構，用以至少提供操作上連接引導轉錄的組份、包括一轉錄起始區、所指的多肽和一轉錄終止區的控制元素。該控制元素係經選擇在所指的細胞，例如哺乳動物細胞中為有功能的。所生成之含有此操作上連結組份的結構係與功能性AAV ITR序列鍵結(5’和3’)。
AAV ITR區的核苷酸序列為已知的。AAV-2序列請參見，例如Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5：793-801；Berns,K.I.“Parvoviridae and their Replication”in Fundamental Virology，第2版，(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.)。用於本發明載體中之AAV ITR不需要具有野生型核苷酸，且可改變，例如以插入、刪除或取代核苷酸。另外，AAV ITR可衍生自任何數種的AAV血清型，包括(不限於)AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12等等。再者，5’和3’ITR其在AAV表現載體中側接一選擇的核苷酸序列，不一定要相同或衍生或分離自相同的AAV血清型，只要其如所希望的運作即可，亦即當AAV Rep基因產物存在細胞中時，能從宿主細胞基因體或載體刪除和拯救所指序列，並能將DNA分子整合至接受細胞基因體即可。
適合用於AAV載體之核苷酸分子大小應小於約5千個鹼基(kb)。所選的核苷酸序列係操作上連結在病患活體中引導轉錄或其表現之控制元素。此等控制元素可包括一般與所選的基因結合之控制序列。另一種選擇，亦可使用異源性控制序列。有用的異源性控制序列一般係包括該等衍生自編碼哺乳動物或病毒基因之序列。實例包括(但不限於)，神經元特異性烯醇化酶啟動子、GFAP啟動子、SV40早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤 病毒LTR啟動子；腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)；單純疱疹病毒(HSV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子例如CMV立即早期啟動子區(CMVIE)、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子、合成的啟動子、雜交啟動子等等。此外，衍生自非病毒基因之序列，例如鼠科金屬硫蛋白基因，亦可用於本文。此等啟動子序列可從市面上，例如由Stratagene(San Diego,CA)購得。
藏有與AAV ITR結合之所指聚核苷酸分子的AAV表現載體，可藉由直接將所選的序列插入AAV基因體中來建構，而該AAV基因體已將主要開放的讀框(“ORF”)從其刪除。亦可刪除AAV基因體的其他部份，只要留下足夠的ITR部份能進行複製和包裹功能。此等結構可使用本項技術中熟知的技術來設計。參見，例如美國專利第5,173,414和5,139,941號；國際公開案號WO 92/01070(1992年1月23日公開)及WO 93/03769(1993年3月4日公開)；Lebkowski等人(1988)Molec.Cell.Biol.8：3988-3996；Vincent等人(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter(1992)Current Opinion in Biotechnology 3：533-539；Muzyczka(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158：97-129；Kotin(1994)Human Gene Therapy 5：793-801；Shelling and Smith(1994)Gene Therapy 1：165-169；及Zhou等人(1994)J.Exp.Med.179：1867-1875。
另一種選擇，可從病毒基因體中或從含有彼等之AAV載體中割除AAV ITR並使用標準的連接技術融合存在另外載體中之所選的胺基酸結構的5’和3’，例如描述於前文Sambrook等人中。例如，連接可在20mM Tris-Cl pH 7.5、10mM MgCl2、10mM DTT,33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl和40μM ATP,0.01-0.02(Weiss)單位T4 DNA連接酶於0℃(用於「黏性末端」連接)或1mM ATP,0.3-0.6(Weiss)單位T4 DNA連接酶於14℃(用於「平端」連接)進行。分子內「黏性末端」連接通常係在30-100μg/ml總DNA濃度(5-100nM總末端濃度)進行。含有ITR之AAV載體已描述於，例如美國專利第5,139,941號中。特言之，文中所的述數種AAV載體其可得自美國菌種中心(“ATCC”登錄號為53222、53223、53224、53225和53226。
就本發明之目的，適合用於從AAV表現載體製造rAAV病毒體的宿主細胞包括微生物、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞，其可，或已經用作為異源性DNA分子之接受者且其能在，例如懸浮培養基、生物反應器及其類似物中生長。此術語包括已轉染的原始細胞之子代。因此，「宿主」如文中所用一般係指以外源性DNA序列轉染之細胞。來自安定的人類細胞株293之細胞(可取自，例如美國菌種中心登錄號ATCC CRL1573)可用於施行本發明。特言之，人類細胞株293為一經腺病毒第5型DNA片段轉染(Graham等人(1977)J.Gen.Virol.36：59)，及表現腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等人(1979)Virology 94：460)的人類胚胎腎細胞株。293細胞株可容易轉染並提供一製造rAAV病毒體之特別方便的平台。
AAV幫手功能
含有上述AAV表現載體之宿主細胞必須能提供AAV幫手功能以便於複製及殼體化側接AAV ITR之核苷酸序列，產生rAAV病毒體。AAV幫手功能一般為AAV-衍生的編碼序列，其可經表現用以提供AAV基因產物，其轉而，以反向進行生產性AAV複製之功能。AAV幫手細胞係用於文中補充AAV表現載體缺失之必須的AAV功能。因此，AAV幫手功能包括主要一或二項主要的AAV ORF，亦即rep和cap編碼區，或其功能性類似物。
「AAV rep編碼區」係指編碼複製蛋白Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep 40之AAV基因體的技術-辨識區。這些Rep表現產物已顯示具有許多功能，包括AAV起源的DNA複製、DNA螺旋酶活性及調節來自AAV之轉錄(活其他異源性)啟動子的辨識、結合和形成缺口。Rep表現產物整體上為複製AAV基因體所需。就AAV rep編碼區之說明，請參見，例如Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158：97-129；及Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5：793-801。適合的AAV rep編碼區之同源物包括人類疱疹病毒6(HHV-6)rep基因，其亦已知係媒介AAV-2 DNA複製(Thomson等人(1994)Virology 204：304-311)。
「AAV cap編碼區」係指編碼殼體蛋白VP1、VP2和VP3或其功能性同源物之AAV基因體的技術-辨識區。這些Cap表現產物供應包裹功能，其整體上為包裹病毒基因體所需。就AAV cap編碼區之說明，請參見，例如Muzyczka,N.c04Kotin,R.M.(前文)。
AAV幫手功能係在以AAV表現載體之轉染之前或同時藉由以AAV幫手結構轉染宿主細胞，而導入宿主細胞。AAV幫手結構因此係用來提供至少過渡性AAV rep及/或cap基因之表現，用以補充生產性AAV轉染所必須之缺失的AAV功能。AAV幫手結構缺乏AAV ITR且可能無法複製及無法包裹其本身。
這些結構可為質體、噬菌體、轉位子、黏質體、病毒或病毒體形式，許多的AAV幫手功能已有描述，例如編碼Rep和Cap表現產物二者之常用的質體pAAV/Ad和pIM29+45。參見，例如Samulski等人(1989)J.Virol.63：3822-3828；及McCarty等人(1991)J.Virol.65：2936-2945。許多編碼Rep及/或Cap表現產物之其他的載體已有描述，參見，例如美國專利第5,139,941號。
AAV附屬功能
宿主細胞(或包裹細胞)亦必須能提供非AAV-衍生功能或「附屬功能」，以便於產生rAAV病毒體。附屬功能為AAV依賴用於其複製之非AAV-衍生的病毒及/或細胞功能。因此，附屬功能包括至少該等AAV複製中所需的非AAV蛋白及和RNA，其包括該等涉及AAV基因轉錄活化、階段特異性AAV mRNA剪接、AAV DNA複製、合成Cap表現產物和AAV殼體組件。病毒-基礎的附屬功能可衍生自任何已知的幫手病毒。
特言之，可使用熟習本項技術者已知的方法導入附屬功能及然後在宿主細胞中表現。典型地，附屬功能係藉由以不相關的幫手病毒感染宿主細胞來提供。有許多已知適合的幫手病毒，包括腺病毒；疱疹病毒例如單純疱疹病毒第1和2型；及牛痘病毒。非病毒附屬功能亦可用於本文，例如該等使用任何各種已知的試劑藉由細胞同步化所提供。參見，例 如Buller等人(1981)J.Virol.40：241-247；McPherson等人(1985)Virology 147：217-222；Schlehofer等人(1986)Virology 152：110-117。
另一種選擇，附屬功能可使用如上所定義之附屬功能載體來提供。參見，例如美國專利第6,004,797號及國際公開案號WO 01/83797，其係以全文引用的方式併入本文中。提供附屬功能之核酸序列可得自天然來源，例如得自腺病毒粒子之基因體，或使用本項技術中已知的重組或合成方法來建構。如上所說明，已驗證附屬幫手功能並不需要完全互補的腺病毒基因。特言之，不能複製DNA和晚基因合成之腺病毒突變體已顯示對於AAV複製為有利的。Ito等人，(1970)J.Gen.Virol.9：243；Ishibashi等人，(1971)Virology 45：317。類似地，E2B和E3區內的突變體已顯示支持AAV複製，其指出E2B和E3區可能不涉及提供附屬功能。Carter等人，(1983)Virology 126：505。然而，缺乏E1區，或具有刪除E4區之腺病毒無法支持AAV複製。因此，AAV複製可能，直接或間接，需要E1A和E4區。Laughlin等人，(1982)J.Virol.41：868；Janik等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1925；Carter等人，(1983)Virology 126：505。其他特性化Ad變種包括：E1B(前文，Laughlin等人(1982)；前文，Janik等人(1981)；Ostrove等人，(1980)Virology 104：502)；E2A(Handa等人，(1975)J.Gen.Virol.29：239；Strauss等人，(1976)J.Virol.17：140；Myers等人，(1980)J.Virol.35：665；Jay等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2927；Myers等人，(1981)J.Biol.Chem.256：567)；E2B(Carter,Adeno-Assocciated Virus Helper Functions,in I CRC Handbook of Parvoviruses(P.Tijssen ed.,1990))；E3(前文，Carter等人(1983))；及E4(前文，Carter等人(1983)；Carter(1995))。雖然以在E1B編碼區具有突變之腺病毒所提供的附屬功能研究產生牴觸性結果，但Samulski等人，(1988)J.Virol.62：206-210已提出AAV病毒體產生需要E1B55k，而E1B19k則否。另外，國際公開案WO 97/17458和Matshushita等人，(1998)Gene Therapy 5：938-945，描述了編碼各種Ad基因之附屬功能載體。附屬功能載體可包括一腺病毒VA RNA編碼區、腺病毒E4 ORF6編碼區、腺病毒 E2A 72kD編碼區、腺病毒E1A編碼區及缺乏完整E1B55k編碼區之腺病毒E1B區。此等載體係描述於國際公開案號WO 01/83797中。
因此以幫手病毒感染宿主細胞，或以附屬功能載體轉染宿主細胞，表現了附屬功能，其轉活化了AAV幫手結構，產生AAV Rep及/或Cap蛋白。Rep表現產物從AAV表現載體去除重組的DNA(包括所指的DNA)。Rep蛋白亦用於複製AAV基因體。將表現的Cap蛋白組裝至殼體中，並將重組的AAV基因體包裹至殼體中。因此，發生了生產性AAV複製，並將該DNA包裹至rAAV病毒體。「重組的AAV病毒體」或「rAAV病毒體」在文中係定義為具感染性之複製缺陷的病毒，其包括一AAV蛋白殼、殼體化兩側有AAV ITR之指定的異源核苷酸序列。
重組的AAV複製之後，可使用各種習用的純化方法，例如管柱層析、CsCl梯度等等，從宿主細胞純化rAAV病毒體。例如，可使用多數個管柱純化部驟，例如於一陰離子交換管柱、親和性管柱及/或陽離子交換管柱內純化。參見，例如國際公開案號WO 02/12455。另外，若是使用感染來表現附屬功能，則可使用已知的方法使殘餘的幫手病毒失活。例如，可藉由加熱至大約60℃的溫度歷時20分鐘或更久，使腺病毒失活。此處理僅有效地使幫手病毒失活，因為AAV為極度熱穩定，而幫手腺病毒卻不耐熱。
然後使用下述之技術將所產生含有指定核苷酸序列之rAAV病毒體用於基因遞送。
rAAV粒子
在某些實施例中，該病毒粒子為一重組的AAV粒子，其係包括一包含兩側有一或二個ITR之轉殖基因的核酸。該核酸係殼體化於AAV粒子中。該AAV粒子亦包括殼體蛋白。在某些實施例中，該核酸係包括指定的蛋白編碼序列(例如，一治療性轉殖基因)提供操作上連接引導轉錄的組份，包括轉錄起始區和終止區的控制序列，藉此形成一表現匣。該表現匣在5'和3'末端的側邊至少有一個功能性AAV ITR序列。「功能性AAV ITR序列」係指ITR序列係如所希望作為救回、複製和包裹AAV病毒 體。參見Davidson 15等人，PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等人，J.Virol.,2003,77(12)：7034-40；及Pechan等人，Gene Ther.,2009,16：10-16，其全部係以全文引用的方式併入本文中。就施行本發明之某些樣態，該重組載體包括至少所有殼體化必須的AAV序列和被rAAV感染之生理結構。用於本發明載體中之AAV ITR不需要具有野生型核酸序列(例如Kotin,Hum.Gene Ther.,1994,5：793-801中所述)，且可藉由插入、刪除或取代核苷酸來改變，或AAV ITR可衍生自任何數種的AAV血清型。目前已知有超過40種AAV的血清型，並持續地鑑別新的血清型和現存血清型的變體。參見Gao等人，PNAS,2002,99(18)：11854-6；Gao等人，PNAS,2003,100(10)：6081-6；及Bossis等人，J.Virol.,2003,77(12)：6799-810。使用任何的AAV血清型係視為在本發明的範圍內。在某些實施例中，一rAAV載體為衍生自一AAV血清型之載體，其包括(不限於)AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAV11、AAV12等等。在某些實施例中，該AAV中的核酸係包括一AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh10、AAV11、AAV12等之ITR。在另外的實施例中，該rAAV粒子係包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAV11、AAV12等之殼體蛋白。在另外的實施例中，該rAAV粒子係包括來自Clades A-F之AAV血清型的殼體蛋白(Gao，等人J.Virol.2004,78(12)：6381)。
使用不同的AAV血清型將轉導特定目標細胞最適化，或鎖定特定目標組織(例如，罹病的組織)內的特定細胞類型。rAAV粒子可包括相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。文中提供用於製造rAAV粒子之任何AAV血清型的組合，如同各組合已於文中明確說明一般。
自體互補的AAV病毒基因體
在某些方面，本發明係提供包括一重組自體互補的基因體之病毒粒子。帶有自體互補基因體的AAV病毒粒子及使用自體互補的AAV基因體之方法係描述於美國專利號6,596,535；7,125,717；7,765,583； 7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；及Wang Z.，等人，(2003)Gene Ther 10：2105-2111中，其各自係以全文引用的方式併入本文中。包括自體互補基因體的rAAV利用其部份互補的序列快速形成雙股DNA分子(例如，轉殖基因之互補的編碼和非編碼股)。在某些實施例中，本發明係提供包括一AAV基因體之AAV病毒粒子，其中該rAAV基因體係包括一第一異源性聚核苷酸序列(例如，治療性轉殖基因編碼股)和一第二異源性聚核苷酸序列(例如，治療性轉殖基因之非編碼股或反義股)，其中該第一異源性聚核苷酸序列可與第二聚核苷酸序列延著大部份或其全長，形成股內鹼基對。在某些實施例中，第一異源性聚核苷酸序列和第二異源性聚核苷酸序列係藉由一促進股內鹼基配對之序列相連接；例如，髮夾DNA結構。髮夾結構已為本項技術中所知，例如siRNA分子。在某些實施例中，第一異源性聚核苷酸序列和第二異源性聚核苷酸序列係藉由一突變的ITR(例如右側ITR)相連接。突變的ITR包括一刪除包含末端解析序列的D區。因此，在複製AAV病毒基因體上，該rep蛋白將不會在突變的ITR裂解該病毒基因體，且如此一來，包括下列以5’至3’順序之重組的病毒基因體將被包裹至病毒殼體中：AAV ITR，包括調控序列的第一異源性聚核苷酸序列，突變的AAV ITR，第二異源性聚核苷酸與第一異源性聚核苷酸方向相反，以及第三AAV ITR。
製造rAAV載體
已知在本項技術中有許多係用於製造rAAV載體，包括轉染、安定細胞株製造及包括腺病毒-AAV雜交、疱疹病毒-AAV雜交和桿狀病毒-AAV雜交之感染性雜交病毒製造。用於製造rAAV病毒粒子之rAAV生產培養全部需要；1)適合的宿主細胞，包括，例如，就桿狀病毒生產系統的情況為人類衍生的細胞株例如HeLa、A549或293細胞，或昆蟲衍生的細胞株例如SF-9；2)適合的幫手病毒功能，由野生型或突變腺病毒所提供(例如溫度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、桿狀病毒或質體結構提供幫手功能；3)AAV rep和cap基因及基因產物；4)側接至少一AAV ITR序列之基因轉殖(例如治療性轉殖基因)；及5)用以支持rAAV生產的適合培養基和培養基組份。 本項技術中已知的適合培養基可用於製造rAAV載體。這些培養基包括(但不限於)由Hyclone Laboratories和JRH所製造的培養基，包括改良的伊格爾培養基(MEM)、達爾伯克改良的伊格爾培養基(DMEM)、客製調配物例如該等描述於美國專利第6,566,118號之調配物及如描述於美國專利第6,723,551號中之Sf-900 II SFM培養基，其各自係以全文引用的方式併入本文中，特別是有關用於製造重組的AAV載體之客製培養基調配物。
適合的本發明之rAAV生產培養基可補添0.5%-20%(v/v或w/v)之量的血清或血清衍生的重組蛋白。另一種選擇，如本項技術中已知的，rAAV載體可在無血清的條件下製造，其亦指無動物性衍生產物之培養基。本項技術之一般技術者可了解，設計來支持製造rAAV載體的商業或客製培養基亦可補添一或多種本項技術中已知的細胞培養組份，包括(不限於)葡萄糖、維生素、銨基酸及/或生長因子，以便於增加生產培養基中rAAV的效價。
rAAV生產培養基可在適合所欲利用的特定宿主細胞之各種條件下生長(於一廣泛的溫度範圍，進行不同的時間長度等等)。如本項技術中已知的，rAAV生產培養包括依附依賴的培養，其可在適合的依附依賴容器中，例如轉瓶、中空纖維過濾器、微載體和填充床或流化床生物反應器中培養。rAAV載體生產培養亦可包括懸浮-適應的宿主細胞，例如HeLa、293和SF-9細胞，其可以各種方式來培養，包括，例如旋轉瓶、攪拌槽生物反應器和拋棄式系統例如波浪袋系統(Wave bag system)。
本發明之rAAV載體粒子可藉由解離生產培養基的宿主細胞從rAAV生產培養基中收取，或藉由從生產培養基收取已用過的培養，其限制條件為細胞係在本項技術中已知的條件下培養使其從完整的細胞釋放rAAV粒子至培養基中，如更完整描述於美國專利第6,566,118號中)。適合的解離細胞之方法亦已為本項技術所知並包括，例如冷凍/解凍循環、音波處理、微流化及以化學品處理，例如清潔劑及/或蛋白酶。
純化rAAV載體
在收取時，本發明之rAAV生產培養可能含有下列一或多項：(1)宿主細胞蛋白；(2)宿主細胞DNA；(3)質體DNA；(4)幫手病毒；(5)幫手病毒蛋白；(6)幫手病毒DNA；及(7)培養基組份，包括，例如血清蛋白、胺基酸、運鐵蛋白和其他低分子量蛋白。此外，rAAV生產培養進一步係包括具有由下列組成之群中選出的AAV殼體血清型之rAAV粒子：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12或其類似型。
因此，在某些實施例中，該rAAV生產培養收取物係經淨化以移除宿主細胞碎片。在某些實施例中，生產培養收取物係以過濾經由一系列深層過濾器，包括，例如等級DOHC Millipore Millistak+HC Pod過濾器、等級A1HC Millipore Millistak+HC Pod過濾器及0.2μm Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC親水性膜過濾器，加以淨化。淨化亦可藉由各種其他本項技術中已知的標準技術來進行，例如離心或經由任何本項技術中已知的0.2μm或更大孔洞的纖維素乙酸酯過濾器過濾。
在某些實施例中，該rAAV生產培養收取物進一步係經Benzonase®處理，用以消化任何存在生產培養中的高分子量DNA。在某些實施例中，該Benzonase®消化係於本項技術中已知的的標準條件下進行，包括，例如最終濃度1-2.5單位/ml之Benzonase®，在從環境溫度至37℃的溫度範圍歷經一段30分鐘至數小時的期間。
rAAV粒子可使用一或多個下列純化步驟來分離或純化：離心、順流陰離子交換樹脂、切向流過濾(TFF)供濃縮rAAV粒子、以磷灰石層析捕捉rAAV、幫手病毒之熱失活、以疏水作用層析捕捉rAAV、粒徑篩析層析(SEC)之緩衝劑交換、奈米過濾及陰離子交換層析捕捉rAAV。這些步驟可單獨使用、以各種組合或以不同的順序來使用。在某些實施例中，此方法係包括下文所述之順序的所有步驟。純化rAAV粒子之方法，可參見，例如美國專利第6,989,264和8,137,948號以及WO 2010/148143。
組成物及遞送
一但產生了，該sFlt-1受體或編碼彼等之載體(或病毒體)，例如上述之融合蛋白，將調配成適合直接遞送至眼睛的組成物，以便於治療黃斑部病變。若基因治療為所欲的，則組成物將包括足夠的基因物質以產生治療上有效量的所指Flt-1，例如足以結合或媒介對應訊號路徑之量，或降低或改善所提之疾病狀態的癥狀，或足以給予所欲利益之量。適當的劑量亦將依照所欲治療之患者的症狀、年齡、所欲治療之症狀的嚴重度、給藥模式、還有其他因素而定。熟習本項技術者可容易地決定適當的有效量。
因此，「治療上有效量」將落在相當廣泛的範圍，其可經由臨床試驗來決定。例如，就活體內注射rAAV病毒體，治療上有效劑量將從約106至1015個重組病毒之載體基因體(vg)，例如108至1014 vg，例如108至1012 vg，例如108至1010 vg、108至109 vg，或之間的任何整數，例如.5 x 108 vg...1 x 108 vg...1.5 x 108 vg...2 x 108 vg...5 x 108 vg...1 x 109 vg...2 x 109 vg...3 x 109 vg...5 x 109 vg...6 x 109 vg...1 x 1010 vg...2 x 1010 vg...5 x 1010 vg...1 x 1011 vg...5 x 1011 vg...1 x 1012 vg...5 x 1012 vg等。
在態樣上，該組成物亦將包含眼科上可接的賦形劑。組成物可調配成液體、凝膠、軟膏、懸浮液、使用前以媒劑重建之乾粉，或其他適合及完全耐受的眼睛遞送系統。該等賦形劑係包括適合直接遞送至眼睛的任何醫藥劑，其可給藥而無不當的毒性。醫藥上可接受的賦形劑包括(但不限於)山梨醇、任何各種TWEEN化合物、及液體例如水、食鹽水、甘油和乙醇。醫藥上可接受的鹽類可包括在其中，例如無機酸鹽類如鹽酸鹽、溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等；及有機酸的鹽類例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等等。另外，佐劑物質，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝物質等等，可存在此等媒劑中。醫藥上可接受賦形劑之完整論述可參閱REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)。
給藥在整個治療過程中可以一個劑量，連續或間歇性，來進行。測定最有效給藥方式之方法已為熟習本項技術者所熟知，且將隨載 體、治療組成物、目標細胞和所欲治療的患者而變。可以治療醫師所選擇的劑量和模式來進行單一和多重給藥。
若是給予多重劑量，則給予的第一調配物可與後續的調配物相同或不同。因此，例如第一給藥可為AAV病毒體之形式，而第二給藥為腺病毒載體、質體DNA、AAV病毒體、亞單位疫苗組成物或其類似物。載者，後續給藥亦可與第二次遞送的模式相同或不同。
應了解，可藉由遞送的重組載體來表現一個以上的轉殖基因。另一種選擇，分離的載體，各自表現一或多個不同的轉殖基因，亦可如上所述遞送至患者中。因此，多數轉殖基因亦可同時或先後遞送。再者，藉由本發明方法遞送的載體與其他適合的組成物和治療組合，亦為所希望的。例如，可存有用於治療黃斑部病變之其他化合物。
如上所說明，就遞送sFlt-1受體結構至眼睛(無論是經由基因治療或蛋白治療)，給藥典型地為局部的。此項具有限制需要投予之物質(蛋白或DNA)的量及限制全身性副作用之優點。可使用許多可能的遞送模式，包括(但不限於)：以基因槍局部投予在角膜上；結膜下注射、經由眼睛滴劑滴至角膜、經由顳側角膜緣注射至前房、基質內注射、角膜塗覆結合電脈衝、角膜內注射、視網膜下注射、玻璃體內注射(例如前、中或後玻璃體注射)及眼內注射。另一種選擇，細胞可在活體外經轉染或轉導並以眼內植入來遞送。參見Auricchio,Mol.Ther.(2002)6：490-494；Bennett,Nature Med.(1996)2：649-654,1996；Borras,Experimental Eye Research(2003)76：643-652；Chaum,Survey of Ophthalmology(2002)47：449-469；Campochiaro,Expert Opinions in Biological Therapy(2002)2：537-544；Lai,Gene Therapy(2002)9：804 813；Pleyer,Progress in Retinal and Eye Research(2003)22：277-293。
因此，眼用調配物係以任何適用於眼部藥物投予之形式來給藥，例如適合局部給藥的劑型、用於眼睛滴劑給藥之溶液或懸浮液、眼睛沖洗液或注射劑、軟膏、凝膠、微脂體分散劑、膠體微粒懸浮液等等，或眼用嵌入劑，例如視需要生物可降解控制釋放的聚合物基質。眼用嵌入 劑係植入結膜、鞏膜、平坦部、眼睛之前房或後房中。植入物係提供控制釋放的調配物至眼睛表面，典型地長時間持續釋放。另外，在實施例中，此調配物整體係由包含天然生成的及/或美國食品藥品監督管理局GRAS(「一般視為安全的」)組份。
可使用蛋白和核酸之組合治療。例如，可將本發明之融合蛋白投予一患者。若觀察到有利的反應，則可給予編碼該融合蛋白的核酸分子進行長期效應。另一種選擇，蛋白和核酸可同時或大約同時投予。
劑量治療可為單一給劑時程或多重給劑時程。再者，若適當可投予患者許多劑量。熟習本項技術者可容易地決定適當數目的劑量。
在態樣上，文中所述的組成物係用於任何文中所述的方法中。
本發明之套組
本發明亦提供套組。在特定的實施例中，本發明之套組係包括一或多個容器，該容器係包含一純化的sFlt-1受體，包括sFlt-1受體之融合蛋白，編碼sFlt-1受體之重組載體或編碼sFlt-1受體之AAV病毒體/rAAV載體。在實施例中，此等套組係包含一眼科上可接受的賦形劑。此等套組亦可包括適合眼部遞送的遞送裝置。此等套組可進一步包括適合的說明書組，一般而言書面說明，係有關用於任何文中所述方法中之套組的用法及其內容物。
此等套組可包括任何方便、適當的包裝之組份。例如，若核酸、蛋白、載體或病毒體係以乾燥調配物來提供(例如冷凍乾燥或乾燥粉末)，可使用帶有彈力塞子之小瓶，使得載體可經由彈力塞藉由注射液體再懸浮。液體調配物可使用帶有無彈力、可移除封蓋(例如密封玻璃)或彈力塞之安瓶。亦涵蓋與特定裝置(例如注射器)組合使用的包裝。
說明書一般係包括就希望使用之方法的劑量、給劑時程及給藥路徑之資訊。容器可為單位劑量、大量包裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。本發明套組中所提供的說明書典型地為在標簽上或單張(包括在套 組中的紙張)書面說明，但亦可涵蓋機器可讀取的說明書(例如載入磁片或光碟上的說明)。
2.實驗
下列為用於進行本發明之特定實施例的實例。此等實例僅提供作為說明之目的，且不希望在任何方面限制本發明之範圍。
儘管已努力確保有關所用的數字之正確性(例如量、溫度等)，但當然應可容許某些實驗誤差和偏差。
材料和方法 可溶性載體結構
圖1(SEQ ID NO：10)和2A-2B(SEQ ID NO：11)係顯示稱為「sFLT01蛋白」之融合蛋白D的NA和蛋白序列。該結構以N-端至C-端之順序包括，圖2A-2B之位置1-23所見的訊號序列；一Flt-1類-Ig第2功能域加上此功能域的延伸，參見圖2A-2B之位置24-118；9個甘胺酸之序列，參見圖2A-2B之位置119-127；及IgG1-Fc CH2/CH3殘基，在圖2A-2B之位置128-358。
將DNA選殖至質體pCBA(2)-int-BGH，其含有一雜交的雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子及一牛生長激素聚腺苷酸化訊號序列(BGH poly A)。Xu等人，Hum.Gene.Ther.(2001)12：563-573。
然後將整個sFLT01表現匣選殖至含有AAV2反轉末端重複(ITR)之前病毒質體載體pAAVSP70中。Ziegler等人，Mol.Ther.(2004)9：231-240。所生成的AAV基因體大小在包括側邊有ITR之區域的質體sp70.BR/sFLT01中為4.6kb。
以三重的293細胞轉染，使用幫手質體p5rep-△-CMVcap和pHelper(Stratagene,La Jolla,CA,USA)產生重組載體AAV2-sFLT01，並根據該方法使用碘克沙醇(iodixanol)分級梯度及HiTrap Heparin管柱(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ,USA)於ÅKTA FPLC系統(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)上純化。Vincent等人，J.Virol.(1997)71：1897-1905；Zolotukhin等人，Methods(2002)28：158-167。
使用即時TaqMan PCR分析(ABI Prism 7700；Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)以BGH poly A序列特異性之引子，測定病毒效價。
玻璃體內注射
就實例1，將雌性長尾獼猴(Macaca fascicularis)2.1-2.8kg以K他命(ketamine)和二氮泮(diazepam)使其鎮定。在給劑之前，以普維酮-碘(povidone-iodine)局部抗菌劑清潔眼睛並以無菌生理食鹽水沖洗。將散瞳劑(1%托平卡胺(tropicamide))和局部麻醉劑(丙氧苯卡因(proparacaine))慢慢灌輸到各注射的眼睛。插入一撐眼器以便在處理期間保持眼皮張開及眼球後縮。經由鞏膜和平坦部大約邊緣後方4mm，將27號劑量注射針插入。然後將針導向水晶體後方進入三個位置之一：與周邊視網膜相鄰的前部玻璃體，中部玻璃體或與黃斑部相鄰的後部玻璃體。AAV載體係以50μl或100μl之總量來注射。
引發脈絡膜新生血管(CNV).
在投予試驗物品以足夠的時間讓轉質基因達到高峰表現後，在靈長類中引發CNV。使用532nm波長的二極體雷射(Iridex Corp.,Mountain View,CA)和裂隙燈適配器破壞布氏膜引發CNV。使用相同的類型的雷射用75微米大小的點於500-700mW操作100-200毫秒，於黃斑部上以3 x 3網隔形式放置9個燒灼點。
CNV評估
在雷射誘發後，以螢光血管攝影評估來自猴子CNV病灶之滲漏2、3和4週。以螢光素染劑(10%螢光素鈉，約0.1mL/kg)注射經鎮定的動物並在染劑注射後於數個時間點拍攝眼底，監測動脈和靜脈相。收集眼底鏡影像並分析各燒灼位置是否存有CNV滲漏。
實例1 AAV2-sFLT01於非人類靈長類中的效用
於非人類靈長類中進行二個研究，用以測定玻璃體內投予AAV2-sFLT01之效用。在第一個研究(研究A)中，以玻璃體內2 x 108或2 x 109 vg的AAV2-sFLT01治療長尾獼猴。對側的對照眼睛係以相同劑量、非編碼轉殖基因的AAV2載體(AAV2-無效)治療。在載體投予後6週進行雷射CNV引發。發現CNV的程度在3週螢光血管攝影時為最大，因此，以此時間點用來評估治療效用。比較AAV2-sFLT01治療和對側對照眼睛之間滲漏病灶的數目(表1)。相較於AAV2-無效的對照眼睛，在滲漏的CNV病灶中，無任何sFLT01治療組顯示統計上顯著的減低。
在第二個研究(研究B)中，係以玻璃體內遞送2 x 1010 vg的AAV2-sFLT01或AAV2-無效，而對側眼睛則保持未治療。在載體投予後22週進行CNV引發。相較於未治療的對側對照眼睛，所有6個經AAV2-sFLT01治療的眼睛在CNV滲漏量上顯示顯著降低，其中僅7%經AAV2-sFLT01治療的燒灼點顯現抑制CNV滲漏，而在對照眼睛中有56%的燒灼點滲漏。此差異如費雪精確檢定(Fisher’s exact test)所測，為統計上顯著的(p<0.0001)。相較於未治療的對照眼睛，經AAV2-無效之對照載體治療的眼睛並未顯示CNV減低。
在以雷射引發CNV前6週，來自研究同側眼睛係接受AAV2-sFLT01載體，而對側對照眼睛係接受AAV2-無效載體。在研究B中，在以雷射引發二眼CNV的前6週，同側眼睛係接受AAV2-sFLT01載體，而對側對照眼睛係維持未治療。在雷射引發時的平均sFLT01表現量係如表中所示。
總言之，玻璃體內投予編碼VEGF之可溶性受體的AAV2基因治療載體，在非人類靈長類眼睛中造成轉殖基因產物之劑量依賴表現的視網膜細胞轉導。早在投予後3週先測量表現並發現至最後的測量時間點(23週)仍相當穩定。
在NHP模型中觀察效用，就8隻動物中有7隻在水狀液中其sFLT01表現量係高於100ng/mL，其顯示可能有一sFLT01閥值，必須達到以使得在此模型中血管新生產生改變。相較於對照眼睛，在載體投予後22週，雷射過的所有經2 x 1010 vg治療之6隻動物，具有降低的CNV。
實例2 AAV2-sFLT01在人體中之效用
在人類中進行劑量漸增研究，用以評估單一玻璃體內注射AAV2-sFLT01之安全性、耐受性和效用。如上述製造AAV2-sFLT01。用於本研究的病患為末期新生血管AMD病患。符合本研究資格之病患標準包括下列：
˙續發AMD之後的脈絡膜新生血管(CNV)，如病患醫療史和CNV診斷文件證明所確認。
˙研究的眼睛為20/100或更差之遠距離最佳矯正視力(BCVA)。
˙另一眼必須具有20/400或更佳的遠距離BCVA。
˙研究的眼睛，亦即接受AAV2-sFLT01的眼睛，具有最壞的CVA(相較於另一眼)。
˙就劑量漸增部分的研究，研究的眼睛之中央窩下盤狀結疤。就第二部分之研究中(最大耐受劑量(MTD)期)，病患在研究的眼睛中可具有，或可不具 有黃斑部結痂。此外，加入第二部分研究的病患必須在篩選前12週或病患最近的抗-VEGF治療後，已顯示對抗-VEGF有反應。
˙存有明顯的視網膜內液或視網膜下液。
˙適度放大瞳孔以便詳盡眼睛檢查和檢測。
排除標準係如下：
˙研究眼睛中由於任何AMD以外的因素之CNV。
˙篩選期間研究眼睛的症狀病史，其可能改變視力或干擾研究檢測。
˙活動性難治青光眼。
˙在加入3個月內研究的眼睛有任何眼內手術或已知或在治療的1年內研究的眼睛可能進行眼內手術之預定患者(包括白內障手術)。
˙研究眼睛之急性或慢性感染。
˙研究眼睛有發炎病史或任一隻眼睛有進行性發炎。
˙任何對玻璃體內注射的禁忌癥候。
˙研究的眼睛在60天內接受光動力治療，或在篩選前14內接受雷射光凝固術。
˙目前正使用或在篩選前1個月內已使用蘭尼單抗(ranibizumab)(Lucentis®)、貝伐單抗(bevacizumab)(AvastinTM)或呱加他尼鈉(pegaptanib sodium)(Macugen®)。
˙目前正使用或在篩選前4個月內已使用阿柏西普(Eylea®)。
˙目前正使用任何眼周(研究眼睛)、玻璃體內(研究眼睛)，或在篩選前3個月內全身性(口服或靜脈內)類固醇。
˙任何活動性疱疹感染，特別是眼睛中或臉上之活動性病灶。
˙任何明顯控制差的疾病，其可能預先排除研究併發症和追蹤。
˙目前或之前使用任何已知對視網膜或視神經有毒性的藥物。
˙在篩選前120天內接受任何試驗藥品。
在第一部分的研究中，四組個別的病患組係投予下列之100μL固定體積不同劑量的AAV2-sFLT01。(1)第1組在一隻眼睛接受2 x 108 vg之單一玻璃體內注射；(2)第2組在一隻眼睛接受2 x 109 vg之單一玻璃體內 注射；(3)第3組在一隻眼睛接受6 x 109 vg之單一玻璃體內注射；(4)第4組在一隻眼睛接受2 x 1010 vg之單一玻璃體內注射。
這些經測定為安全及完全耐受的。特言之，無觀察到劑量限制性毒性(DLT)且未達到MTD。
為了測定AAV2-sFLT01之效用，係以同調斷層掃描(OCT)測量與基線相比之視網膜下液和視網膜內液量的變化。另外測量BCVA，如水狀液中sFLT01蛋白的量，經由前房取出液體。
令人意外地，接受2 x 108 vg單一玻璃體內注射之病患，如OCT所測，展現顯著的視網膜下液和視網膜內液下降。參見，圖15A和15B。
在第二部份的研究中，將用於第一研究的高劑量單一玻璃體內注射(2 x 1010 vg)給予不同的病患。此劑量在注射後二個月，如OCT所測，亦造成視網膜下液和視網膜內液量顯著的下降。參見，圖16A和16B。
表2係顯示預期的有反應者和無反應者。一預期的有反應者其特徵為以其基礎特徵為基準，預期顯示對抗-VEGF治療有反應之病患。預期的有反應者則特徵如下：完全有反應者：顯示強健反應、乾燥視網膜及回到正常視網膜剖析，不需要額外治療之病患。部分有反應者：顯現些許液體減少。無反應者：未見到效用。
a.有一位病患為不可評估的。
b.在四位完全有反應者中：一位大於三年，一位大於二年，一位大於一年年，一位大於18個月。
如表2中所示，11位預期有反應者中有6位顯示對治療至少有部分反應。
由此，描述了用於治療黃斑部病變之方法，以及包括sFlt-1受體和其融合蛋白之組成物。雖然已略加詳細地描述本發明之實施例，但應了解，在不悖離文中所定義的本發明精神和範圍下，可作各種變化。

Claims (60)

  1. 一種治療人類患者中黃斑部病變之方法，其係包括將一包含重組的腺-相關病毒(rAAV)病毒體之組成物投予該患者患病的眼睛，而該腺-相關病毒(rAAV)病毒體係包括一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸，該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之VEGFR-1(Flt-1)的功能域，其中係將從約1 x107至約1 x 1013個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  2. 如請求項1之方法，其中該方法係包括降低眼內壓、視網膜厚度、視網膜下液或視網膜內液。
  3. 一種治療人類患者中黃斑部水腫之方法，其係包括將一包含重組的腺-相關病毒(rAAV)病毒體之組成物投予患者患病的眼睛，而該腺-相關病毒(rAAV)病毒體係包括一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸，該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之VEGFR-1(Flr-1)的功能域，其中係將從約1 x107至約1 x 1013個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  4. 如請求項3之方法，其中該方法係包括降低眼內壓、視網膜厚度、視網膜下液或視網膜內液。
  5. 如請求項1-4中任一項之方法，其中係將從約1 x 107至約1 x 1012；1 x 108至約1 x 1012；約1 x 108至約1 x 1011；約1 x 108至約1 x 1010；約1 x 108至約1 x 109；約2 x 107至約2 x 1012；約2 x 108至約2 x 1012；約2 x 108至約2 x 1011；約2 x 108至約2 x 1010；約2 x 108至約2 x 109；2 x 109至約2 x 1010；約1 x 1010至約1 x 1013；約1 x 1010至約1 x 1012；約1 x 1010至約1 x 1011；約2 x 1010至約1 x 1013；2 x 1010至約1 x 1012；約2 x 1010至約2 x 1012；約2 x 1010至約1 x 1011；或約2 x 1010至約2 x 1011個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  6. 如請求項1-5中任一項中之方法，其中係將約1 x 107，約2x107，約6 x 107，約1 x 108，約2x108，約6 x 108，約1 x 109，約2x109，約6 x 109，約1 x 1010，約2x1010，約6 x 1010，約1 x 1011，約2x1011，約6 x 1011，約1 x 1012，約2x1012，約6 x 1012或約1 x 1013個rAAV病毒體遞送至眼 睛。
  7. 一種治療人類患者中黃斑部病變之方法，其係包括將一包含重組腺-相關病毒(rAAV)病毒體之組成物投予患者患病的眼睛，而該腺-相關病毒(rAAV)病毒體係包括一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸，該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)功能域，其中係將低於約2 x1010個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  8. 如請求項7之方法，其中該方法係包括降低眼內壓、視網膜厚度、視網膜下液或視網膜內液。
  9. 一種治療人類患者中黃斑部水腫之方法，其係包括將一包含重組腺-相關病毒(rAAV)病毒體之組成物投予患者患病的眼睛，而該腺-相關病毒(rAAV)病毒體係包括一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸，該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性的VEGFR-1(Flt-1)功能域，其中係將低於約2 x1010個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  10. 如請求項9之方法，其中該方法係包括降低眼內壓、視網膜厚度、視網膜下液或視網膜內液。
  11. 如請求項7-10中任一項之方法，其中係將從約2 x 108至低於2 x 1010個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  12. 如請求項7-10中任一項之方法，其中係將至高約2 x 108個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  13. 如請求項7-10中任一項之方法，其中係將至高約2 x 109個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  14. 如請求項1-13中任一項之方法，其中該組成物進一步係包括一眼科可接受的媒劑。
  15. 如請求項1-14中任一項之方法，其中係將一單一玻璃體內注射的rAAV病毒體投予眼睛。
  16. 如請求項1-15任一項中之方法，其中該可溶性蛋白係包括：(a)至少一個Flt-1之功能域；(b)一衍生自免疫球蛋白重鏈之多聚化功能域；及 (c)連接(a)和(b)之長度5-25個胺基酸殘基的連接子，其中當可溶性蛋白表現時，則產生一可溶性蛋白之多聚體。
  17. 如請求項1-16中任一項之方法，其中該至少一個功能域係包括Flt-1之第2功能域。
  18. 如請求項16或17之方法，其中該多聚體為一同型二聚體。
  19. 如請求項16-18中任一項之方法，其中該多聚化功能域係包括IgG的Fc區或其活性片段。
  20. 如請求項16-19中任一項之方法，其中該多聚化功能域係包括IgG的CH3功能域或其活性片段。
  21. 如請求項16-20中任一項之方法，其中該多聚化功能域係來自gG1、IgG2、IgG或IgG4。
  22. 如請求項21之方法，其中該多聚化功能域係來自IgG1重鏈之恆定區。
  23. 如請求項16-22中任一項之方法，其中該連接子係由下列組成之群中選出：gly9(SEQ ID NO：1)；glu9(SEQ ID NO：2)；ser9(SEQ ID NO：3)；gly5cyspro2cys(SEQ ID NO：4)；(gly4ser)5 3(SEQ ID NO：5)；SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：6)；ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：7)；GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys(SEQ ID NO：8)；及Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：9)。
  24. 如請求項16-23中任一項中之方法，其中該可溶性蛋白具有式X-Y-Z，其中X係包括Flt-1之類-IgG第2功能域，其中Y為Gly9，及其中Z為一IgG Fc區或IgG CH3區。
  25. 如請求項16-24中任一項之方法，其中該多聚化功能域為人源化的。
  26. 如請求項16-25中任一項之方法，其中該可溶性蛋白係包括一由下列組 成之群中選出的胺基酸序列：(a)圖2A-2B中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：11)；(b)圖6中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：15)；(c)圖8中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：17)；(d)圖12中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：21)；及(e)具有至少其90%序列相同度之(a)、(b)、(c)或(d)的變體。
  27. 如請求項1、2、5-8和11-26中任一項中之方法，其中該黃斑部病變為老化有關的黃斑部病變(AMD)。
  28. 如請求項第27項之方法，其中該黃斑部病變為濕性AMD。
  29. 如前述請求項中任一項之方法，其中該rAAV病毒體係由選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12之AAV血清型所衍生。
  30. 如請求項29之方法，其中該rAAV病毒體係由AAV2所衍生。
  31. 一種包含一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸的重組腺-相關病毒(rAAV)病毒體用於製造組成物之用途，而該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之VEGFR-1(Flt-1)的功能域，該組成物藉由將約1 x107至約1 x 1013個rAAV病毒體遞送至眼睛，供人類患者治療黃斑部病變。
  32. 如請求項31之用途，其中係降低眼內壓、視網膜厚度、視網膜下液或視網膜內液。
  33. 一種包含一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸的重組腺-相關病毒(rAAV)病毒體用於製造組成物之用途，而該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之VEGFR-1(Flt-1)的功能域，該組成物藉由將約1 x107至約1 x 1013個rAAV病毒體遞送至眼睛，供人類患者治療黃斑部水腫。
  34. 如請求項33之用途，其中係降低眼內壓、視網膜厚度、視網膜下液或視網膜內液。
  35. 如請求項31-34中任一項中之用途，其中係將從約1 x 107至約1 x 1012；1 x 108至約1 x 1012；約1 x 108至約1 x 1011；約1 x 108至約1 x 1010；約1 x 108至約1 x 109；約2 x 107至約2 x 1012；約2 x 108至約2 x 1012；約2 x 108至約2 x 1011；約2 x 108至約2 x 1010；約2 x 108至約2 x 109；2 x 109至約2 x 1010；約1 x 1010至約1 x 1013；約1 x 1010至約1 x 1012；約1 x 1010至約1 x 1011；約2 x 1010至約1 x 1013；2 x 1010至約1 x 1012；約2 x 1010至約2 x 1012；約2 x 1010至約1 x 1011；或約2 x 1010至約2 x 1011個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  36. 如請求項31-35中任一項之方法，其中係將約1 x 107，約2x107，約6 x 107，約1 x 108，約2x108，約6 x 108，約1 x 109，約2x109，約6 x 109，約1 x 1010，約2x1010，約6 x 1010，約1 x 1011，約2x1011，約6 x 1011，約1 x 1012，約2x1012，約6 x 1012或約1 x 1013個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  37. 一種包含一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸的重組腺-相關病毒(rAAV)病毒體於製造組成物之用途，而該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之VEGFR-1(Flt-1)的功能域，該組成物藉由將低於約2 x 1010個rAAV病毒體遞送至眼睛，供人類患者治療黃斑部病變。
  38. 如請求項37之用途，其中係降低眼內壓、視網膜厚度、視網膜下液或視網膜內液。
  39. 一種包含一編碼可溶性蛋白之聚核苷酸的重組腺-相關病毒(rAAV)病毒體於製造組成物之用途，而該可溶性蛋白係包括至少一個能調節VEGF活性之VEGFR-1(Flt-1)的功能域，該組成物藉由將低於約2 x 1010個rAAV病毒體遞送至眼睛，供人類患者治療黃斑部水腫。
  40. 如請求項39之用途，其中係降低眼內壓、視網膜厚度、視網膜下液或視網膜內液。
  41. 如請求項37-40中任一項之用途，其中係將從約2 x 108至低於2 x 1010個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  42. 如請求項37-40中任一項之用途，其中係將至高約2 x 108個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  43. 如請求項37-40中任一項之用途，其中係將至高約2 x 109個rAAV病毒體遞送至眼睛。
  44. 如請求項31-43中任一項之用途，其中該組成物進一步係包括一眼科可接受的媒劑。
  45. 如請求項31-44中任一項之用途，其中係將一單一玻璃體內注射的rAAV病毒體遞送至眼睛。
  46. 如請求項31-45中任一項之用途，其中該可溶性蛋白係包括：(a)至少一個Flt-1之功能域；(b)一衍生自免疫球蛋白重鏈之多聚化功能域；及(c)連接(a)和(b)之長度5-25個胺基酸殘基的連接子，其中當可溶性蛋白表現時，則產生一可溶性蛋白之多聚體。
  47. 如請求項31-46中任一項之用途，其中該至少一個功能域係包括Flt-1之第2功能域。
  48. 如請求項46或47之用途，其中該多聚體為一同型二聚體。
  49. 如請求項46-48中任一項之用途，其中該多聚化功能域係包括IgG的Fc區或其活性片段。
  50. 如請求項46-49中任一項之用途，其中該多聚化功能域係包括IgG的CH3功能域或其活性片段。
  51. 如請求項46-50中任一項之用途，其中該多聚化功能域係來自gG1、IgG2、IgG或IgG4。
  52. 如請求項51之用途，其中該多聚化功能域係來自IgG1重鏈之恆定區。
  53. 如請求項46-52中任一項之用途，其中該連接子係由下列組成之群中選出：gly9(SEQ ID NO：1)；glu9(SEQ ID NO：2)；ser9(SEQ ID NO：3)；gly5cyspro2cys(SEQ ID NO：4)；(gly4ser)3(SEQ ID NO：5)；SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：6)；ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：7)； GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys 5(SEQ ID NO：8)；及Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO：9)。
  54. 如請求項46-53中任一項之用途，其中該可溶性蛋白係具有式X-Y-Z，其中X係包括Flt-1之類-IgG第2功能域，其中Y為Gly9，及其中Z為一IgG Fc區或IgG CH3區。
  55. 如請求項46-54中任一項之用途，其中該多聚化功能域為人源化的。
  56. 如請求項46-55中任一項之用途，其中該可溶性蛋白係包括一由下列組成之群中選出的胺基酸序列：(a)圖2A-2B中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：11)；(b)圖6中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：15)；(c)圖8中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：17)；(d)圖12中所描繪的胺基酸序列(SEQ ID NO：21)；及(e)具有至少其90%序列相同度之(a)、(b)、(c)或(d)的變體。
  57. 如請求項31、32、35-38及41-56中任一項之用途，其中該黃斑部病變為老化有關的黃斑部病變(AMD)。
  58. 如請求項57之用途，其中該黃斑部病變為濕性AMD。
  59. 如請求項31-58中任一項之用途，其中該rAAV病毒體係由選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh8R、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12之AAV血清型所衍生。
  60. 如請求項59之用途，其中該rAAV病毒體係由AAV2所衍生。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2016010215A (es) * 2014-02-06 2016-11-15 Genzyme Corp Composiciones y metodos de tratamiento y prevencion de degeneracion macular.
KR101685532B1 (ko) * 2016-04-26 2016-12-13 한국프라임제약주식회사 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질
EP3596213A4 (en) 2017-03-17 2021-02-17 Adverum Biotechnologies, Inc. COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR ENHANCED GENE EXPRESSION
KR102205830B1 (ko) * 2017-10-26 2021-01-21 주식회사 큐로진생명과학 솔루블 VEGFR-1 변이체 cDNA를 함유하는 rAAV를 포함하는 황반변성 치료용 조성물
SG11202006431WA (en) * 2018-02-14 2020-08-28 Generation Bio Co Non-viral dna vectors and uses thereof for antibody and fusion protein production
CN113952473A (zh) * 2020-07-21 2022-01-21 英斯培瑞有限公司 用于治疗眼部疾病的组合物和方法

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
DE10399032I1 (de) 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
FR2658432B1 (fr) 1990-02-22 1994-07-01 Medgenix Group Sa Microspheres pour la liberation controlee des substances hydrosolubles et procede de preparation.
WO1992001070A1 (en) 1990-07-09 1992-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
MY109299A (en) 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US5834441A (en) 1993-09-13 1998-11-10 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5763270A (en) 1995-06-07 1998-06-09 Genemedicine, Inc. Plasmid for delivery of nucleic acids to cells and methods of use
DK0833934T4 (da) 1995-06-15 2012-11-19 Crucell Holland Bv Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US7034009B2 (en) * 1995-10-26 2006-04-25 Sirna Therapeutics, Inc. Enzymatic nucleic acid-mediated treatment of ocular diseases or conditions related to levels of vascular endothelial growth factor receptor (VEGF-R)
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
US6048551A (en) 1997-03-27 2000-04-11 Hilfinger; John M. Microsphere encapsulation of gene transfer vectors
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
EP1194451A1 (en) 1999-07-02 2002-04-10 Genentech, Inc. Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
ES2308989T3 (es) 1999-08-09 2008-12-16 Targeted Genetics Corporation Aumento de la expresion de una secuencia nucleotidica heterologa a partir de vectores viricos recombinantes que contienen una secuencia que forman pares de bases intracatenarios.
US7125705B2 (en) 2000-04-28 2006-10-24 Genzyme Corporation Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
WO2001092551A2 (en) 2000-06-01 2001-12-06 University Of North Carolina At Chapel Hill Duplexed parvovirus vectors
US6593123B1 (en) 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
ATE490307T1 (de) 2003-05-21 2010-12-15 Genzyme Corp Verfahren zur herstellung von präparationen rekombinanter aav-virionen, die weitgehend frei von leeren capsiden sind
CN100577947C (zh) * 2003-08-04 2010-01-06 邱则有 一种现浇砼用空腔模壳构件
MX2007001241A (es) 2004-07-30 2007-07-11 Regeneron Pharma Metodos para tratar diabetes tipo i mediante el bloqueo de la actividad mediada de vegf.
JP4944032B2 (ja) * 2004-09-13 2012-05-30 ジェンザイム・コーポレーション 多量体構築物
DE602004031786D1 (de) * 2004-11-26 2011-04-21 Inst Nat Sante Rech Med Modulierung der retinalen pigmentierten epithel-permeation durch hemmung von vegfr-1
US7765583B2 (en) 2005-02-28 2010-07-27 France Telecom System and method for managing virtual user domains
US20090105245A1 (en) * 2006-12-21 2009-04-23 Bingaman David P Methods for treating macular edema and ocular angiogenesis using an anti-inflammatory agent and a receptor tyrosine kinase inhibitor
CN101951925A (zh) 2008-02-20 2011-01-19 建新公司 血管发生抑制
SG176283A1 (en) 2009-06-16 2012-01-30 Genzyme Corp Improved methods for purification of recombinant aav vectors
TWI702955B (zh) * 2012-05-15 2020-09-01 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒（ａａｖ）ｓｆｌｔ-１治療老年性黃斑部退化（ａｍｄ）
SG10201708547YA (en) * 2013-04-17 2017-11-29 Genzyme Corp Compositions and methods for treating and preventing macular degeneration
MX2016010215A (es) * 2014-02-06 2016-11-15 Genzyme Corp Composiciones y metodos de tratamiento y prevencion de degeneracion macular.

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