CN117736274A

CN117736274A - 一种腺相关病毒衣壳蛋白及其用途

Info

Publication number: CN117736274A
Application number: CN202211152831.1A
Authority: CN
Inventors: 刘海燕; 谢兴旺; 田文洪
Original assignee: Beijing Anlong Biomedical Co ltd
Current assignee: Beijing Anlong Biomedical Co ltd
Priority date: 2022-09-21
Filing date: 2022-09-21
Publication date: 2024-03-22

Abstract

本申请公开了一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本申请通过向AAV衣壳蛋白中引入点突变，并采用突变后的衣壳蛋白组装的AAV载体，作为眼部疾病的治疗药物，其药效和安全性能相比于采用突变前的衣壳蛋白，均具有明显的提升。

Description

一种腺相关病毒衣壳蛋白及其用途

技术领域

本申请属于病毒载体领域，具体涉及一种经过修饰的腺相关病毒衣壳蛋白及其用途。

背景技术

当前，基因治疗成为生物医药领域的研究热点，基因治疗中最常用的载体包括腺病毒、慢病毒以及腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV，下同)。野生型腺相关病毒(wtAAV，下同)隶属于细小病毒科，是一个直径为20nm的单链DNA病毒，呈一个二十面体，衣壳蛋白里包被着一个两端含有倒置末端重复序列(ITR，下同)的病毒基因组，ITR之间是一个开放阅读框ORF，包含衣壳蛋白Cap、复制蛋白Rep、包装激活蛋白AAP。已知野生型腺相关病毒会整合到人染色体AAVS1位点。重组型腺相关病毒(rAAV，下同)基因组序列只保留了包装病毒所必需的两端的ITR，中间全部替换为目的基因序列，这就保证了病毒基因组不整合进宿主基因组。

与腺病毒、慢病毒相比，重组型腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus，rAAV，下同)在人体中诱发免疫应答的几率较低，这有助于提高载体递送目的基因的效率，同时使用rAAV可以降低来自免疫相关的毒性风险；此外，rAAV可在体内外长期有效介导外源基因的持续稳定表达，已成为最有前景的基因治疗载体之一。

研究表明，腺相关病毒的衣壳蛋白在很大程度上影响甚至决定了型腺相关病毒载体的转导效率以及免疫源性等，因此，对腺相关病毒的衣壳蛋白的改进和优化有利于提高腺相关病毒载体药物的药效和/或安全性。

发明内容

本申请的目的在于提供一种经过修饰的腺相关病毒衣壳蛋白及其用途。

本申请为解决上述技术问题，提出了如下技术方案：

本申请第一方面提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本申请第二方面提供了一种多核苷酸分子，其包含编码本申请第一方面所提供的腺相关病毒衣壳蛋白的核苷酸序列或其互补序列的至少一种；优选地，所述多核苷酸分子包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本申请第三方面提供了一种表达载体，其包含本申请第二方面所提供的多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子与启动子序列可操作地连接。

本申请第四方面提供了一种细胞，其包含本申请第二方面所提供的多核苷酸分子或本申请第三方面所提供的表达载体。

本申请第五方面提供了一种重组病毒或病毒载体，其包含本申请第一方面所提供的腺相关病毒衣壳蛋白；优选地，所述重组病毒或病毒载体是AAV；更优选地，所述AAV是AAV2。

本申请第六方面提供了一种药物组合物，其包含本申请第五方面所提供的重组病毒或病毒载体，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本申请第七方面提供了本申请第一方面的腺相关病毒衣壳蛋白、本申请第二方面的多核苷酸分子、本申请第三方面的表达载体、本申请第四方面的细胞、本申请第五方面的重组病毒或病毒载体或本申请第六方面的药物组合物在制备治疗眼部疾病药物中的用途。

本申请第八方面还提供了一种治疗或预防眼部疾病方法，其包括通过玻璃体内注射或脉络膜上腔注射，向受试者施用本申请第五方面的重组病毒或病毒载体或本申请第六方面的药物组合物。

本申请的有益效果：本申请通过向AAV衣壳蛋白中引入点突变，并采用突变后的衣壳蛋白组装的AAV载体，作为眼部疾病的治疗药物，其药效和安全性能相比于采用突变前的衣壳蛋白，均具有明显的提升。

附图说明

图1为注射不同AAV病毒载体药物后，建模第2周、第4周，食蟹猴眼球AAF成像结果。

图2为注射不同AAV病毒载体药物后，建模第2周、第4周，食蟹猴眼球中IV级光斑率结果。

具体实施方式

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。

定义

如本文所用，术语“一个”和“一种”以及“所述”和类似的指代物指示单数和复数，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。

如本文所用，术语“约”、“基本上”和“类似于”是指在本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述误差范围可部分取决于该值的测量或确定方式，或取决于测量系统的局限性。

如本文所用，“载体”是指包含多核苷酸分子或与多核苷酸分子缔合，并且可以用于介导多核苷酸分子递送到细胞的大分子或大分子缔合物。示例性载体包含例如质粒、病毒载体、脂质体和其它基因递送媒剂。

术语“AAV”是腺相关病毒的缩写并且可以用于指病毒本身或其衍生物。除非另有说明，否则所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的形式和重组形式。术语“AAV”包含AAV 1型(AAV-1)、AAV 2型(AAV-2)、AAV 3型(AAV-3)、AAV 4型(AAV-4)、AAV 5型(AAV-5)、AAV 6型(AAV-6)、AAV 7型(AAV-7)、AAV 8型(AAV-8)、禽类AAV、牛类AAV、犬类AAV、马类AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV、绵羊类AAV等。示例性的，“灵长类AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛类AAV”是指感染牛类哺乳动物的AAV，等等。

各种血清型AAV的基因组序列以及天然末端重复(TR)序列、Rep蛋白序列和衣壳亚基序列是本领域已知的。这种序列可以在文献或如GenBank等公共数据库中找到。参见例如GenBank登录号NC_002077(AAV-1)、AF063497(AAV-1)、NC_001401(AAV-2)、AF043303(AAV-2)、NC_001729(AAV-3)、NC_-001829(AAV-4)、U89790(AAV-4)、NC_006152(AAV-5)、AF028704和AAB95450(AAV-6)、AF513851(AAV-7)、AF513852(AAV-8)和NC_006261(AAV-8)，其公开内容通过引用的方式并入本文中以用于教导AAV核酸和氨基酸序列。参见例如，Srivistava等人(1983)《病毒学杂志(J.Virology)》45:555；Chiorini等人(1998)《病毒学杂志》71:6823；Chiorini等人(1999)《病毒学杂志》73:1309；Bantel-Schaal等人(1999)《病毒学杂志》73:939；Xiao等人(1999)《病毒学杂志》73:3994；Muramatsu等人(1996)《病毒学杂志》221:208；Shade等人(1986)《病毒学杂志》58:921；Gao等人(2002)《美国科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》99:11854；以及Moris等人(2004)《病毒学(Virology)》33:375-383；国际专利出版物WO 00/28061、WO 99/61601和WO 98/11244；以及美国专利第6,156,303号。另外，基于包含密码子优化序列在内的氨基酸序列和已知的遗传密码，可以容易地生成对任何衣壳蛋白进行编码的多核苷酸序列。

“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”或“AAV病毒载体”或“AAV载体颗粒”或“AAV颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸AAV载体构成的病毒颗粒。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为此类载体是包含在AAV载体颗粒内的。

缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，也被称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。如本文所使用的，“rAAV载体”是指包括不属于AAV来源的多核苷酸序列(即，与AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，所述多核苷酸序列通常是对细胞进行基因转化时所关注的序列。通常，异源多核苷酸两侧接有至少一个，通常有两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体涵盖rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒两者。

“包装”是指导致AAV颗粒进行组装和衣壳化的一系列细胞内事件。

AAV“rep”和“cap”基因是指对腺相关病毒的复制和衣壳蛋白进行编码的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中被称为AAV“包装基因”。

AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。AAV的各种辅助病毒是本领域已知的，例如包括腺病毒、疱疹病毒和牛痘等痘病毒。腺病毒涵盖许多不同的亚群，但是最常用的是C亚群中的腺病毒5型。人类、非人类哺乳动物和禽类来源的许多腺病毒是已知的并且可从如ATCC等贮藏机构获得。疱疹家族的病毒包含例如单纯疱疹病毒(HSV)和艾巴氏病毒(EBV)以及巨细胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(PRV)；所述病毒也可以从如ATCC等贮藏机构获得。

“感染性”病毒或病毒颗粒是指包括适合的组装的病毒衣壳并且能够将多核苷酸组分递送到细胞中的病毒或病毒颗粒。所述术语并不一定暗示病毒有任何复制能力。在本申请和本领域的其它地方描述了用于对感染性病毒颗粒进行计数的测定。病毒感染性可以表达为感染性病毒颗粒与总病毒颗粒之比。确定感染性病毒颗粒与总病毒颗粒之比的方法是本领域已知的。参见例如Grainger等人(2005)《分子疗法(Mol.Ther.)》11:S337(描述了TCID50感染滴度测定)；Zolotukhin等人(1999)《基因疗法(Gene Ther.)》6:973。

“有复制能力的(replication-competent)”病毒(例如，有复制能力的AAV)是指具有感染性并且能够在受感染细胞中复制(即在辅助病毒或辅助病毒功能存在的情况下)的表型野生型病毒。在AAV的情况下，复制能力通常要求存在功能性AAV包装基因。通常，由于缺少一个或多个AAV包装基因，即使在存在辅助功能的情况下，本文所描述的重组病毒或病毒载体在哺乳动物细胞(尤其是在人类细胞中)是没有复制能力的；通常，本申请的重组病毒或病毒载体缺乏AAV包装基因序列，从而将AAV包装基因与进入的rAAV载体之间进行重组生成有复制能力的AAV(rcAAV)的可能性降到最低。在大多数情况下，如本文所描述的重组病毒或病毒载体(也可称为rAAV载体、rAAV病毒颗粒等)制剂含有很少(如果有的话)有复制能力的AAV(例如，少于约1rcAAV/10²rAAV颗粒、少于约1rcAAV/10⁴rAAV颗粒、少于约1rcAAV/10⁸rAAV颗粒、少于约1rcAAV/10¹²rAAV颗粒或无rcAAV)。

术语“多核苷酸分子”是指任何长度的核苷酸的聚合形式或其类似物，包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。多核苷酸分子可以包括经过修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分间隔开。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。如本文所使用的，术语多核苷酸分子可互换地指双链分子和单链分子。除非另外指明或需要，否则本申请所述的多核苷酸分子既涵盖双链形式，也涵盖已知或预测构成双链形式的两种互补的单链形式的每种单链形式。

“基因”是指含有至少一个开放阅读框的能够在转录并且有时翻译后对特定基因产物进行编码的多核苷酸。术语“基因”或“编码序列”是指对基因产物进行编码的体外或体内核苷酸序列。在一些情况下，基因由编码序列组成或基本上由编码序列组成，所述编码序列即对基因产物进行编码的序列。在其它情况下，基因包括另外的非编码序列。例如，基因可以包含或可以不包含在编码区域之前和之后的区域，例如5'未翻译区(5'UTR)或“前导”序列或3'UTR或“尾”序列、以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

“基因产物”是由特定基因的表达产生的分子。基因产物包含例如多肽、适配体、干扰RNA、mRNA等。在特定实施例中，“基因产物”是多肽、肽、蛋白质或干扰RNA，包含短干扰RNA(siRNA)、miRNA或小发夹RNA(shRNA)。在特定实施例中，基因产物是治疗性基因产物，例如治疗性蛋白。

如本文所使用的，“治疗性基因”是指在表达时产生治疗性基因产物的基因，所述治疗性基因产物对治疗性基因产物所存在的细胞或组织、或者表达了所述治疗性基因的哺乳动物赋予了有益效果。有益效果的实例包含改善病状或疾病的体征或症状、预防或抑制病状或疾病或者赋予期望的特性。治疗性基因包含但不限于校正细胞或哺乳动物中的遗传缺陷的基因。

如本文所使用的，“转基因”是由载体递送到细胞的基因。

“控制元件”或“控制序列”是参与分子的相互作用的核苷酸序列，所述相互作用有助于对多核苷酸进行功能调节，所述功能包括例如多核苷酸的复制、转录、剪接、翻译或降解。调节会影响过程的频率、速度或特异性并且在本质上会具有增强或抑制性。本领域中已知的控制元件包含例如转录调节序列，如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并且启动通常位于启动子下游(沿3'方向)的编码区进行转录的DNA区域。

如本文中使用的，术语“可操作连接”指已被置于相互之间的功能关系中的两种组分。在有关调节序列和编码序列的情况下使用时，术语“可操作连接”意味着该调节序列影响该连接的编码序列的表达。“调节序列”、“调节元件”、或“控制元件”是指影响转录的周期和水平/量、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译的核酸序列。调节序列可包括启动子；翻译前导序列；5'和3'非翻译区，内含子；增强子；茎环结构；抑制子结合序列；终止序列；多腺苷酸化识别序列等。具体的调节序列可位于与其可操作连接的编码序列的上游和/或下游。并且，与编码序列可操作连接的具体调节序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。连接可通过合适的限制性位点处的连接作用(ligation)来完成。如果这样的位点不存在，则根据常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。然而，可操作连接的元件不需要是毗连的。

“异源”意指源自与其所比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。例如，通过基因工程技术引入到源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。从启动子的天然编码序列中移除并且与未发现与启动子有天然连接的编码序列操作性地连接的启动子是异源启动子。因此，例如，包含对异源基因产物进行编码的异源核酸的rAAV是包含天然存在的野生型AAV中通常不包含的核酸的rAAV，并且编码后的异源基因产物是通常不由天然存在的野生型AAV编码的基因产物。

如本文所使用的，术语“肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物。所述术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记组分缀合。

如本文所使用的，“表达载体”涵盖载体，例如如上文所讨论的或如本领域中已知的质粒、微环、病毒载体、脂质体等，并且用于在预期靶细胞中实现基因产物的表达，所述载体包括对关注的基因产物进行编码的多核苷酸。表达载体还包括与编码区域操作性地连接的以促进基因产物在靶标中表达的控制元件。控制元件例如启动子、增强子、UTR、miRNA靶向序列等和与其可操作地连接以供表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”。许多这种控制元件在本领域中是已知且可获得的或者可以由本领域中可获得的组分容易地构建。

如本文所使用的关于核苷酸分子或基因产物的术语“内源性”是指核酸序列例如基因或遗传元件或者基因产物例如RNA、蛋白质天然存在于宿主病毒或细胞中或者与宿主病毒或细胞缔合。

如本文所使用的，术语“天然”是指核苷酸序列例如基因或者基因产物例如RNA、蛋白质存在于野生型病毒或细胞中。

如本文所使用的，术语“施用”或“引入”是指将用于重组基因或蛋白表达的载体递送到细胞、受试者的细胞和/或器官或者受试者。这种施用或引入可以在体内、在体外或离体地发生。用于表达基因产物的载体可以通过以下方式引入到细胞中：转染，其通常意指通过物理手段(例如，磷酸钙转染、电穿孔、微注射或脂质转染)将异源DNA插入到细胞中；感染，其通常是指通过感染剂即病毒引入；或者转导，其通常意指用细胞稳定感染细胞或将来自一个微生物的基因材料通过病毒剂(例如细菌噬菌体)转移到另一个微生物。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指已经用载体转导、感染、转染或转化的细胞。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。宿主细胞的培养条件，如温度、pH等，对于本领域技术人员而言是显而易见的。应了解，术语“宿主细胞”是指最初转导、感染、转染或转化的细胞和其子代。

术语“治疗(treatment、treating等)”在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效果。效果在完全或部分地预防疾病或其症状方面可以是预防性的，例如降低受试者体内发生疾病或其症状的可能性，和/或在部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应方面可以是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”覆盖对哺乳动物的疾病的任何治疗，并且包含：(a)防止疾病在可能倾向于患有疾病但尚未被诊断为患有疾病的受试者身上发生；(b)抑制疾病，即，中止疾病发展；或者(c)缓解疾病，即，使疾病消退。可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。特别关注了对发展中的疾病的治疗，其中所述治疗稳定或减少了患者的不期望的临床症状。理想的是，在受影响组织的功能完全丧失之前执行这种治疗。理想的是，将在疾病的症状期期间并且在一些情况下在疾病的症状期之后施用主题治疗。

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用，并且是指哺乳动物，包含但不限于人类和非人类灵长类动物，包含：猿猴和人类；哺乳类运动动物(例如马)；哺乳类农场动物(例如绵羊、山羊等)；哺乳类宠物(狗、猫等)；以及啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)。

下面通过具体实施例来说明本申请的腺相关病毒衣壳蛋白及其用途。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。以下实施例中所涉及的质粒均为本领域技术人员公知质粒。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

除非另有指示，否则本申请的实践将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的范围内。这种技术在文献中进行了充分解释，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)第二版》(Sambrook等人,1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir&C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller&M.P.Calos编,1987)；《分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》(F.M.Ausubel等人编,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase ChainReaction)》(Mullis等人编,1994)；以及《免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)》(J.E.Coligan等人编,1991)，上述文献中的每个文献通过引用的方式并入本文中。

本申请第一方面提供了一种非天然存在的经过修饰的腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本申请第二方面提供了一种多核苷酸分子，其包含编码本申请第一方面所提供的AAV衣壳蛋白的核苷酸序列或其互补序列的至少一种；优选地，所述多核苷酸分子包含SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述多核苷酸分子中还包含内含子，所述内含子有利于提高所述衣壳蛋白的表达效率。

在一些实施方式中，所述启动子是组织特异性启动子，所述组织特异性启动子优先驱动在一个或多个组织或细胞类型中表达，例如视网膜。

在一些实施方式中，所述表达载体进一步包括对rep蛋白，例如AAV2 rep蛋白进行编码的序列。

本申请第四方面提供了一种细胞，其包括本申请第二方面所提供的多核苷酸分子或本申请第三方面所提供的表达载体。

在一些实施方式中，所述细胞是辅助细胞或宿主细胞，例如可以用于产生包括本申请的衣壳蛋白的病毒颗粒的HEK293细胞。在制备包含本申请的AAV衣壳蛋白的病毒颗粒时，可以采用用于生产rAAV病毒颗粒的任何宿主细胞，包含例如哺乳动物细胞(例如293细胞)、昆虫细胞(例如Sf9细胞)、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞或生产细胞，在所述包装细胞中，AAV rep和cap基因稳定地维持在宿主细胞中，在所述生产细胞中，AAV载体基因组稳定地维持和包装。示例性包装细胞和生产细胞源自Sf-9、293、A549或HeLa细胞。AAV载体使用本领域已知的标准技术进行纯化和配制。

在一些实施方式中，所述细胞进一步包括对治疗性蛋白进行编码的多核苷酸。

在一些实施方式中，所述的细胞进一步包括对rep蛋白进行编码的多核苷酸。

本申请第五方面提供了一种重组病毒或病毒载体，其包括本申请第一方面所提供的腺相关病毒衣壳蛋白。

在一些实施方式中，所述重组病毒或病毒载体可以选自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒、疱疹病毒、甲病毒或逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MMuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗兰德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯氏肉瘤病毒(RSV)或慢病毒。虽然下面更详细地描述了涵盖腺相关病毒的用途的实施例，但是期望本领域普通技术人员应了解，本领域中的类似知识和技术也可以用于非AAV基因治疗载体。例如，参见例如美国专利第7,585,676号和美国专利第8,900,858号中对逆转录病毒载体的讨论以及例如美国专利第7,858,367号中对腺病毒载体的讨论。在一些实施方式中，所述重组病毒或病毒载体具有感染性。在一些实施方式中，所述重组病毒或病毒载体具有复制能力。在一些实施方式中，所述重组病毒或病毒载体不具有复制能力。在一些实施方式中，所述重组病毒或病毒载体是AAV；更优选地，所述AAV是AAV2。

在一些实施方式中，当玻璃体内或脉络膜上腔注射到哺乳动物中时，所述重组病毒或病毒载体能够结合并穿过内界膜(ILM)。

在一些实施方式中，所述重组病毒或病毒载体包括对治疗性基因产物进行编码的多核苷酸序列；优选地，所述治疗性基因产物是抗血管内皮生长因子(抗VEGF)。

在一些实施方式中，所述重组病毒或病毒载体是进一步包括表达盒的AAV，所述表达盒包括对所述治疗性基因产物进行编码的多核苷酸序列。在某些实施例中，对基因产物进行编码的多核苷酸序列与启动子序列可操作地连接。在某些实施例中，表达盒在5'端和3'端侧接功能性AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方式中，所述的AAV ITR可以从几种AAV血清型中的任何一种中得到，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAV10。某些AAV载体的野生型REP和CAP基因全部或部分缺失，但保留了功能性ITR序列。

在一些实施方式中，所述治疗性基因产物是干扰RNA。在一些实施方式中，所述治疗性基因产物是适配体。在一些实施方式中，所述治疗性基因产物是多肽。在一些实施方式中，所述治疗性基因产物是用于对基因功能进行位点特异性敲低的位点特异性核酸酶。

在基因产物是干扰RNA(RNAi)的情况下，适合的RNAi包含减少细胞中凋亡因子或血管生成因子水平的RNAi。例如，RNAi可以是降低细胞中诱导或促进凋亡的基因产物水平的shRNA或siRNA。干扰RNA也可以是针对血管生成产物的，例如VEGF的干扰RNA。

在基因产物是适配体的情况下，所关注的示例性适配体包含针对血管内皮生长因子(VEGF)的适配体。参见例如Ng等人(2006)《自然评论：药物发现(Nat.Rev.DrugDiscovery)》5:123；以及Lee等人(2005)《美国科学院院报》102:18902。同样适于使用的是PDGF特异性适配体，例如E10030；参见例如Ni和Hui(2009)《眼科学报(Ophthalmologica)》223:401；以及Akiyama等人(2006)《细胞生理学杂志(J.CellPhysiol.)》207:407)。

在基因产物为多肽的情况下，在某些实施例中，多肽可以增强视网膜细胞的功能，例如，视杆或视锥感光细胞、视网膜神经节细胞、Muller细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞的功能。示例性多肽包含：神经保护多肽(例如，GDNF、CNTF、NT4、NGF和NTN)；抗血管生成多肽(例如可溶性血管内皮生长因子(VEGF)受体；VEGF结合抗体；VEGF结合抗体片段(例如，单链抗VEGF抗体)；内皮抑素；肿瘤抑素；血管抑素；可溶性Flt多肽；包括可溶性Flt多肽的Fc融合蛋白；色素上皮衍生因子(PEDF)；可溶性Tie-2受体；组织金属蛋白酶抑制剂-3(TIMP-3)；光响应性视蛋白，例如视紫红质；抗凋亡多肽(例如Bcl-2、Bcl-Xl)等等。适合的多肽包含但不限于：神经胶质源性神经营养因子(GDNF)；成纤维细胞生长因子2；神经秩蛋白(neurturin)(NTN)；睫状神经营养因子(CNTF)；神经生长因子(NGF)；神经营养蛋白-4(NT4)；脑源性神经营养因子(BDNF)；表皮生长因子；视紫红质；X连接的凋亡抑制剂；以及音猬因子，以及这些多肽中的任何多肽的功能性变体和片段，包含与这些多肽中的任何多肽有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列一致性的变体、以及包括这些多肽或其变体中的任何多肽或其变体的至少20％、至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的片段。

在一些实施方式中，所述治疗性基因产物是用于对基因功能进行位点特异性敲低的位点特异性核酸酶，例如，所述核酸酶敲除了与视网膜疾病相关的等位基因。

除了敲除缺陷等位基因之外，还可以使用所述位点特异性核酸酶来刺激与对由缺陷等位基因编码的蛋白质的功能性副本进行编码的供体DNA的同源重组。例如，所述重组病毒或病毒载体既可以用于递送敲除缺陷等位基因的位点特异性内切核酸酶，并且还可以用于递送缺陷等位基因的功能副本，从而使修复缺陷等位基因，由此提供了功能性视网膜蛋白(例如功能性视网膜劈裂蛋白、功能性RPE65、功能性外周蛋白等)的产生。在一些实施例中，所述重组病毒或病毒载体可以包括：对位点特异性内切核酸酶进行编码的异源核苷酸序列；以及对缺陷等位基因的功能性副本进行编码的异源核苷酸序列，其中所述功能性副本对功能性视网膜蛋白进行编码。功能性视网膜蛋白包含例如视网膜劈裂蛋白、RPE65、视网膜色素变性GTP酶调节剂(RGPR)相互作用蛋白-1、外周蛋白、外周蛋白-2等。

在一些实施方式中，对所述治疗性基因产物进行编码的核苷酸序列与组成型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，对所述治疗性基因产物进行编码的核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些实施方式中，对所述治疗性基因产物进行编码的核苷酸序列与组织特异性或细胞类型特异性调节元件可操作地连接。在一些实施方式中，所述启动子选自巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、MMT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。

在一些实施方式中，对所述治疗性基因产物进行编码的核苷酸序列与感光器特异性调节元件(例如，感光器特异性启动子)可操作地连接，例如赋予了在感光细胞中选择性地表达可操作地连接的基因的调节元件。适合的感光器特异性调节元件包含例如：视紫红质启动子；视紫红质激酶启动子、β磷酸二酯酶基因启动子(Nicoud等人(2007)《基因医学(Gene Med.)》9:1015)；视网膜色素变性基因启动子(NiCoad等人(2007)同上)；内感光器类视黄醇结合蛋白(IRBP)基因增强子(NiCoad等人(2007)同上)；IRBP基因启动子(Yokoyama等人(1992)《实验眼科研究(Exp Eye Res.)》55:225)等。

可以使用标准方法生产包括本申请的腺相关病毒衣壳蛋白的重组病毒或病毒载体。例如，包括表达盒的AAV表达载体可以被引入到生产细胞中，随后引入AAV辅助构建体，所述AAV辅助构建体包含编码本申请的腺相关病毒衣壳蛋白的核苷酸序列，并且其中所述辅助构建体包含AAV编码区，所述AAV编码区能够在生产者细胞中表达，并且补充AAV载体中缺少的AAV辅助功能。随后将辅助病毒和/或另外的载体引入到生产细胞中，其中辅助病毒和/或另外的载体提供了能够支持所述重组病毒或病毒载体高效生产的辅助功能。然后培养生产细胞以生产所述重组病毒或病毒载体。这些步骤是使用标准方法实施的。包括本申请的腺相关病毒衣壳蛋白的复制缺陷型AAV病毒颗粒使用AAV包装细胞和包装技术通过本领域已知的标准技术制成。这些方法的实例可以在例如通过全文引用的方式明确地并入本文中的美国专利第5,436,146号、第5,753,500号、第6,040,183号、第6,093,570号和第6,548,286号中找到。用于包装的另外的组合物和方法描述于也通过全文引用的方式并入的Wang等人(US 2002/0168342)中。

在一些实施方式中，包括本文所描述的突变的衣壳蛋白的重组病毒或病毒载体，与不包含含有所述突变的衣壳蛋白的对应重组病毒或病毒载体相比，免疫原性降低小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％。

在一些实施方式中，包括本文所描述的突变的衣壳蛋白的重组病毒或病毒载体能够以其转导一种或多种其它眼部细胞类型的更高水平选择性地转导视网膜细胞。

本申请第六方面提供了一种药物组合物，其包括本申请第五方面所提供的重组病毒或病毒载体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本申请的重组病毒或病毒载体可以与药学上可接受的载体、添加剂和赋形剂组合，以供灵长类动物，尤其是人使用。在一些实施方式中，赋形剂可以是固体、液体、半固体或气雾组合物。载体的实例包含但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。所述药物组合物中还可以包含添加剂，例如：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；洗涤剂，如用于防止聚合的吐温20(Tween 20)；以及用于调节张力的化合物，如氯化钠或右旋糖。可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调整pH。在一些实施方式中，所述药物组合物是无菌的。对于要在体内接触眼部细胞的情况，可以适当地处理本申请的基因递送载体，以便递送到眼睛。

在一些实施方式中，所述药物组合物还可以进一步包含无菌水溶液或分散液和/或用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载剂包含生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方式中，所述药物组合物是无菌的并且应当具有易于注射的程度的流动性。在一些实施方式中，所述药物组合物在制造和储存条件下是稳定的，并且在避免如细菌和真菌等微生物的污染的条件下进行保存。在一些实施方式中，载体还可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用如卵磷脂等包衣、通过在分散体的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以维持恰当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，可以实现防止微生物的作用。在一些实施方式中，所述药物组合物中还可以包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。在一些实施方式中，通过在所述药物组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现对所述药物组合物的延长吸收。

无菌溶液可以通过根据需要将所需量的所述重组病毒或病毒载体与上文所列举的成分中的一种或组合并入适当的溶剂中、随后过滤灭菌来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法通常是真空干燥和/或冷冻干燥。

在一些实施方式中，所述药物组合物与保护所述重组病毒或病毒载体免于从体内快速消除的载体一起制备，如控释调配物，包含植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种调配物的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。材料也可以商购获得。脂质体悬浮液(包含用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如美国专利第4,522,811号中所描述的。

以单位剂型配制口服、眼部或肠胃外组合物以易于施用和剂量统一可以是有利的。如本文所使用的，单位剂型是指适于作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理离散单位；每个单位含有经计算与所需药物载体关联产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物(如本申请的重组病毒或病毒载体或其表达的治疗性基因产物)。本申请中所说的单位剂型的规格由活性化合物的独特特性、待实现的特定治疗效果、以及本领域中在混配这种活性化合物以用于治疗个体时固有的局限性决定。

可以制备出适于有效地转导哺乳动物细胞的任何浓度的病毒颗粒。例如，病毒颗粒的浓度可以配置成每毫升10⁸个载体基因组或更多，例如每毫升5×10⁸个载体基因组；每毫升10⁹个载体基因组；每毫升5×10⁹个载体基因组、每毫升10¹⁰个载体基因组、每毫升5×10¹⁰个载体基因组；每毫升10¹¹个载体基因组；每毫升5×10¹¹个载体基因组；每毫升10¹²个载体基因组；每毫升5×10¹²个载体基因组；每毫升10¹³个载体基因组；每毫升1.5×10¹³个载体基因组；每毫升3×10¹³个载体基因组；每毫升5×10¹³个载体基因组；每毫升7.5×10¹³个载体基因组；每毫升9×10¹³个载体基因组；每毫升1×10¹⁴个载体基因组、每毫升5×10¹⁴个载体基因组或更多，但是通常不多于每毫升1×10¹⁵个载体基因组。

本申请的病毒载体可以配制成任何适合的单位剂量，包含但不限于1×10⁸个载体基因组或更多，例如1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个或1×10¹³个载体基因组或更多，在某些情况下1×10¹⁴个载体基因组，但通常不多于4×10¹⁵个载体基因组。在一些情况下，单位剂量至多为约5×10¹⁵个载体基因组，例如1×10¹⁴个载体基因组或更少，例如1×10¹³个、1×10¹²个、1×10¹¹个、1×10¹⁰个或1×10⁹个载体基因组或更少，在某些情况下为1×10⁸个载体基因组或更少，并且通常不少于1×10⁸个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1×10¹⁰个到1×10¹¹个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1×10¹⁰个到3×10¹²个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1×10⁹个到3×10¹³个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1×10⁸个到3×10¹⁴个载体基因组。

在一些实施方式中，可以使用感染复数(MOI)测量药物组合物的单位剂量。MOI意指载体或病毒基因组与核酸可以递送到的细胞的比率或倍数。在一些实施方式中，MOI可以为1×10⁶。在一些实施方式中，MOI可以为1×10⁵-1×10⁷。在一些实施方式中，MOI可以为1×10⁴-1×10⁸。在一些实施方式中，本申请的重组病毒的MOI至少为约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷和1×10¹⁸。在一些实施方式中，本申请的重组病毒的MOI为1×10⁸到3×10¹⁴。在一些实施方式中，本申请的重组病毒的MOI至多为约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷和1×10¹⁸。

在一些实施方式中，药物组合物的量包括约1×10⁸个到约1×10¹⁵个重组病毒、约1×10⁹个到约1×10¹⁴个重组病毒、约1×10¹⁰个到约1×10¹³个重组病毒或约1×10¹¹个到约3×10¹²个重组病毒。

药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中，分配器例如注射器，例如载药注射器。

本申请的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或这种酯的盐、或在施用于包括人的动物时能够直接或间接提供生物活性代谢物或其残留物的任何其它化合物。

药学上可接受的盐是本领域已知的并且描述于例如以下文件中：《雷明顿药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第17版,Alfonso R.Gennaro(编),美国宾夕法尼亚州伊斯顿Mark出版公司(Mark Publishing Company,Easton,PA,USA),1985(以及其最近的版本)；《制药技术百科全书(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)》,第3版,James Swarbrick(编),美国纽约州美国英富曼卫生保健(有限公司)(InformaHealthcare USA(Inc.),NY,USA),2007；以及《制药科学(J.Pharm.Sci.)》66:2(1977)。此外，关于适合的盐，参见Stahl和Camille的《药用盐手册：性质、选择与使用(Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use)》(Wiley-VCH公司,2002)。

可以用如碱金属和碱土金属或有机胺等金属或胺形成药学上可接受的碱加成盐。用作阳离子的金属包括钠、钾、镁、钙等。胺包括n-N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见例如Berge等人,药用盐(Pharmaceutical Salts),《药学杂志(J.Pharma Sci)》,1977,66,119)。酸性化合物的碱加成盐是通过使游离酸形式与足量的期望的碱相接触以常规方式产生盐来制备的。游离酸形式可以通过使盐形式与酸相接触并且以常规方式分离游离酸来再生。游离酸形式在某些物理性质方面如在极性溶剂中的溶解度与其各自的盐形式略有不同。

在一些实施方式中，本申请所述的表达载体或重组病毒或病毒载体可以在无毒的惰性的药学上可接受的水性载体中配制，优选地，pH的范围为3到8，更优选地，范围为6到8。

在一些实施方式中，本申请所提供的药物组合物包括缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水以及本领域普通技术人员已知的其它缓冲液，如Good(1966)《生物化学(Biochemistry)》5:467中描述的那些缓冲液。在一些实施方式中，所述缓冲液的pH的范围可以为6.5到7.75，优选地为7到7.5并且最优选地为7.2到7.4。药物组合物可以配制用于各种类型的递送，包含例如眼部递送、玻璃体内注射、眼内注射、视网膜注射、视网膜下注射、脉络膜上腔注射、肠胃外施用、静脉内注射或输液以及注射到肝脏中。

在一些实施方式中，所述眼部疾病选自选年龄相关性黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新生血管、脉络膜新生血管、糖尿病性视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病变和糖尿病性视网膜水肿的至少一种。

本申请所描述的包括本申请的衣壳蛋白的重组病毒或病毒载体可以用于将转基因递送到细胞，例如动物的细胞。本申请的重组病毒或病毒载体科学研究或用于医学用途。在本申请的一些实施方式中，提供了在细胞中表达基因的方法，所述方法包括使细胞与本申请的表达载体或重组病毒或病毒载体或药物组合物相接触。在一些实施方式中，在体外发生接触。在一些实施例中，在体内发生接触，即，向受试者施用本申请的表达载体或重组病毒或病毒载体或药物组合物。在一些实施方式中，是肠胃外施用的，例如，静脉内、口服或通过注射。在一些实施方式中，表达载体或重组病毒或病毒载体或药物组合物可以通过注射施用于眼睛，例如施用于视网膜、视网膜下、脉络膜上腔或玻璃体。在一些实施方式中，所述表达载体或重组病毒或病毒载体或药物组合物通过视网膜注射、视网膜下注射、脉络膜上腔注射或玻璃体内注射施用。

在一些实施方式中，为了促进转基因的表达，包括突变的衣壳蛋白的重组病毒或病毒载体或表达载体与细胞接触约30分钟到24小时或更长，例如1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、24小时等。包括突变的衣壳蛋白的重组病毒或病毒载体或表达载体可以提供到所述细胞一次或多次，例如一次、两次、三次或多于三次，并且细胞可以被允许在每此接触例如16-24小时之后，与一种或多种药剂一起培育某个时间量，在所述时间量之后，用新鲜培养基替换培养基并且进一步培养细胞。接触细胞可以在任何培养基中，和/或在促进细胞存活的任何培养条件下发生。例如，细胞可以悬浮在任何适合的营养培养基中，如Iscove改良DMEM或RPMI 1640，所述适合的营养培养基可以补充有胎牛血清或热灭活山羊血清(约5-10％)、L-谷氨酰胺、硫醇，特别是2-巯基乙醇、以及抗生素，例如青霉素和链霉素。培养基中可以含有细胞对其有响应的生长因子。生长因子示例性举例包含多肽和非多肽因子。

在一些实施方式中，提供有效量的包括本申请的衣壳蛋白的重组病毒或病毒载体或表达载体，以使转基因在细胞中的表达。在一些实施方式中，有效量可以根据经验容易地确定，例如，通过检测转基因产物的存在或水平、通过检测细胞的活力或功能的作用等。

在一些实施方式中，对于细胞在体内与包括本申请的衣壳蛋白的重组病毒或病毒载体或表达载体相接触的情况，受试者可以是任何哺乳动物，例如，啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠)、兔、猫科动物、犬科动物、山羊、绵羊科动物、猪、马科动物、牛科动物或灵长类动物。在一些实施方式中，本申请的方法和药物组合物可用于治疗可以至少部分地通过细胞基因治疗解决的任何病状。在一些实施方式中，本申请的药物组合物和方法可用于治疗需要细胞治疗的个体。细胞包含但不限于血液、眼睛、肝脏、肾脏、心脏、肌肉、胃、肠、胰腺和皮肤。

在一些实施方式中，所述方法包括通过眼部注射向受试者施用包括本文所描述的重组病毒或病毒载体的药物组合物，其中重组病毒包括本文所公开的衣壳蛋白和对基因产物进行编码的多核苷酸序列。在一些实施方式中，视网膜细胞可以是感光细胞、视网膜神经节细胞、Muller细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞。在一些情况下，视网膜细胞是感光细胞，例如视杆细胞或视锥细胞。在一些实施方式中，递送是通过玻璃体内注射、视网膜注射、脉络膜上腔注射或视网膜下注射进行的。

在一些实施方式中，本申请提供了治疗或预防眼部疾病或病症的方法，包括例如通过玻璃体内注射或脉络膜上腔注射，向受试者的一只或两只眼睛施用本申请的药物组合物

可以使用本申请的方法治疗的眼部疾病包含但不限于：急性黄斑神经视网膜病变；白塞氏病；脉络膜新生血管；糖尿病性葡萄膜炎；组织胞浆菌病；黄斑变性，如急性黄斑变性、非渗出性年龄相关性黄斑变性和渗出性年龄相关性黄斑变性；水肿，如黄斑水肿、黄斑囊样水肿和糖尿病性黄斑水肿；多灶性脉络膜炎；眼外伤，其影响眼睛后部位点或位置；眼部肿瘤；视网膜病症，如视网膜中央静脉阻塞、糖尿病性视网膜病变(包含增殖性糖尿病视网膜病变)、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视网膜动脉闭塞性疾病、视网膜脱离和葡萄膜炎性视网膜疾病；交感性眼炎；伏格特-小柳-原田三氏(Vogt Koyanagi-Harada)(VKH)综合征；葡萄膜扩散；由眼部激光治疗引起的或受其影响的眼后病状；由光动力学治疗引起或受其影响的眼后病状；光凝固法、放射性视网膜病变；视网膜前膜病症；视网膜分支静脉阻塞；前部缺血性视神经病变；非视网膜病变糖尿病视网膜功能障碍；视网膜劈裂症；视网膜色素变性；青光眼；乌谢尔综合征、锥体-杆体营养不良；斯图加特氏疾病(眼底黄色斑点症)；遗传性黄斑变性；脉络膜视网膜变性；莱伯先天性黑朦；先天性静止性夜盲；无脉络膜；巴比二氏综合征；黄斑毛细血管扩张症；莱伯遗传性视神经病变；早产儿视网膜病变；以及色觉病症，包含全色盲、红色盲、绿色盲和蓝色盲。

在一些实施方式中，受试者已经被诊断为患有或被怀疑有发生选自由以下组成的组的一种或多种疾病或病症的风险：年龄相关性黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新生血管、脉络膜新生血管、糖尿病性视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病变和糖尿病性视网膜水肿。在某些实施例中，基因产物抑制受试者的视网膜内的新生血管，例如脉络膜新生血管(CNV)。已经发现，许多细胞因子在调节CNV生成方面起到重要作用，其中可能包含但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)、血小板源性生长因子(PDGF)、缺氧诱导因子(HIF)、血管生成素(Ang)和其它细胞因子，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)。在特定实施例中，基因产物抑制这些细胞因子中的一种或多种细胞因子。

在一些实施方式中，本申请的药物组合物所包含的重组病毒或病毒载体产生的基因产物是抗VEGF蛋白或VEGF拮抗剂，诸如但不限于在美国专利第5,712,380号、第5,861,484号和第7,071,159号中公开的VEGF结合蛋白或其功能片段以及美国专利第7,635,474号中公开的VEGF结合融合蛋白。抗VEGF蛋白还可以包含如美国专利申请公开第2013/0323302号中描述的sFLT-1蛋白。

在一些实施方式中，本申请的重组病毒或病毒载体可以包括对抗VEGF蛋白或VEGF拮抗剂进行编码的序列，VEGF拮抗剂是指部分地或充分降低或抑制VEGF的活性或产生的药剂。VEGF拮抗剂可以直接或间接地降低或抑制如VEGF165等特异性VEGF的活性或产生。此外，符合“拮抗剂”的上述定义的VEGF拮抗剂包含作用于VEGF配体或其同源受体以减少或抑制VEGF相关受体信号的药剂。VEGF拮抗剂的实例包含：靶向VEGF核酸的反义分子、核酶或RNAi；抗VEGF适配体、针对VEGF本身或其受体的抗VEGF抗体、或防止VEGF与其同源受体结合的可溶性VEGF受体诱饵；靶向同源VEGF受体(VEGFR)核酸的反义分子、核酶或RNAi；与同源VEGFR受体结合的抗VEGFR适配体或抗VEGFR抗体；以及VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。

术语“VEGF”是指诱导血管生成或血管生成过程的血管内皮生长因子。如本文所使用的，术语“VEGF”包含通过例如替代性地剪接VEGF-A/VPF基因产生的各种亚型的VEGF(也称为血管通透因子(VPF)和VEGF-A)(参见美国专利申请公开第20120100136号的图2(A)和(B))，包含VEGF121、VEGF165和VEGF189。进一步地，如本文所使用的，术语“VEGF”包含VEGF相关血管生成因子，如PIGF(胎盘生长因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E，所述VEGF相关血管生成因子通过同源VEFG受体(即VEGFR)起作用以诱导血管生成或血管生成过程。术语“VEGF”包含与VEGF受体结合的一类生长因子的任何成员，如VEGFR-1(Flt-1)(参见美国专利申请公开第20120100136号的图4(A)和(B))、VEGFR-2(KDR/Flk-1)(参见美国专利申请公开第20120100136号的图4(C)和(D))或VEGFR-3(FLT-4)。术语“VEGF”可以用于指“VEGF”多肽或对基因或核酸进行编码的“VEGF”。

在一些实施方式中，VEGF拮抗剂是VEGF-A拮抗剂。

在一些实施方式中，VEGF拮抗剂是兰尼单抗(ranibizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、阿柏西普(aflibercept)、康柏西普(Conbercept)、KH902 VEGF受体-Fc融合蛋白、2C3抗体、ORA102、哌加他尼钠(pegaptanib)、贝伐西尼(bevasiranib)、SIRNA-027、紫花前胡素(decursin)、紫花前胡醇(decursinol)、苦鬼臼脂素(picropodophyllin)、没药甾酮(guggulsterone)、PLG101、类二十烷酸LXA4、PTK787、帕唑帕尼(pazopanib)、阿西替尼(axitinib)、CDDO-Me、CDDO-Imm、紫草素(shikonin)、β-羟异戊酰紫草素(beta-hydroxyisovalerylshikonin)、或神经节苷脂GM3、DC101抗体、Mab25抗体、Mab73抗体、4A5抗体、4E10抗体、5F12抗体、VA01可抗体、BL2的抗体、VEGF相关蛋白、sFLT01、sFLT02、肽B3、TG100801、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitnab)、G6-31抗体、或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，VEGF拮抗剂是抗体兰尼单抗或其药学上可接受的盐(关于重链和轻链可变区序列，参见通过全文引用的方式并入本文的美国专利第7,060,269号的图1)。兰尼单抗可以商标(罗氏集团(Roche Group)成员美国基因泰克有限公司(GenentechUSA,Inc.))商购获得。

在一些实施方式中，VEGF拮抗剂是抗体贝伐单抗或其药学上可接受的盐(关于重链和轻链可变区序列，参见通过全文引用的方式并入本文中的美国专利第6,054,297号的图1)。贝伐单抗可以商标(罗氏集团成员美国基因泰克有限公司)商购获得。

在一些实施方式中，VEGF拮抗剂是阿柏西普或其药学上可接受的盐(Do等人(2009)《英国眼科学杂志(Br J Ophthalmol.)》93:144-9，其通过全文引用的方式并入本文中)。阿柏西普可以商购获得(再生元制药有限公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.))。

在一些实施方式中，VEGF拮抗剂是天然存在的蛋白质sFlt-1，如美国专利第5,861,484号所描述的。VEGF拮抗剂还包含但不限于其功能片段，包含sFlt-1结构域2的序列或美国专利申请公开第2013/0323302号中列出的那些序列、以及相关构建体，如美国专利第7,635,474号中公开的VEGF结合融合蛋白。抗VEGF蛋白也可以包含美国专利申请公开第2013/0323302号中描述的任何sFLT-1蛋白、其变体或片段。更具体地说，VEGF结合结构域(结构域2)或可替代地sFLT-1的结构域2加上来自sFLT1、KDR或另一个家族成员的结构域3可以用于结合和灭活VEGF。这些功能片段描述于Wiesmann等人，1997；《细胞(Cell)》91:695-704中，其通过全文引用的方式并入本文中。术语“sFLT-1”和“sFLT-1的功能片段”是等效的并且在此可互换地使用。“sFlt-1蛋白”在本文中是指与天然存在的人sFLT-1序列至少90％或更高同源，使得sFlt-1蛋白或多肽与VEGF和/或VEGF受体结合的多肽序列或其功能片段。

这些序列可以从使用遗传密码对这种序列进行编码的DNA表达，这是本领域技术人员所理解的标准技术。如本领域技术人员可以了解到的，由于遗传密码的简并性，抗VEGF蛋白序列可以从多个不同的DNA序列容易地表达。

VEGF拮抗剂进一步包含与本文所描述的任何VEGF拮抗剂同源的核酸或多肽以及任何VEGF拮抗剂或同系物的功能片段。同源是指包含但不限于功能片段的两个序列之间的比对的残基的保守性％，序列包括插入、缺失、取代、假片段、假基因、剪接变体或人工优化序列。在一些情况下，VEGF拮抗剂可以与天然存在的或亲本VEGF拮抗剂至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％同源。在一些情况下，VEGF拮抗剂可以与天然存在的或亲本序列至多约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或100％同源。

在一些实施方式中，本申请提供用于在需要治疗的人类受试者中以每3个月、每6个月、每9个月、每12个月、每18个月、每24个月或每36个月至少一次的频率施用包括本申请的病毒载体或重组病毒的药物组合物。在一些实施方式中，本申请提供用于在需要治疗的人类受试者中以每3个月、每6个月、每9个月、每12个月、每18个月、每24个月或每36个月至多一次的频率施用包括本申请的病毒载体或重组病毒的药物组合物。在一些实施方式中，本申请提供了在人类受试者中以少于3次、每年少于两次、每年少于一次、每两年少于一次或每三年少于一次的频率施用包括本申请的病毒载体或重组病毒的药物组合物。

在一些实施方式中，例如通过测量基因产物的水平、通过测量治疗功效等方式，可在施用后两个月或更短时间，例如在施用后4周、3周或2周或更短，例如在施用本申请的组合物后1周观察到转基因的表达。在一些实施方式中，例如通过测量基因产物的水平、通过测量治疗功效等方式，可在施用后2个月或更长，例如4个月、6个月、8个月或10个月或更长，在一些情况下1年或更长，例如2年、3年、4年或5年，在某些情况下超过5年观察到转基因的表达。

在一些实施方式中，受试者的一只眼睛或两只眼睛各自被施用约1×10⁸个载体基因组或更多，在一些实施方式中，1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个或1×10¹³个载体基因组或更多，在一些实施方式中，1×10¹⁴个载体基因组或更多。在一些实施方式中，递送的载体基因组的量至多为约1×10¹⁵个载体基因组，例如1×10¹⁴个载体基因组或更少，例如1×10¹³个、1×10¹²个、1×10¹¹个、1×10¹⁰个或1×10⁹个载体基因组或更少，在某些情况下1×10⁸个载体基因组，并且有时不少于1×10⁸个载体基因组。在一些实施方式中，递送的载体基因组的量为1×10¹⁰个到1×10¹¹个载体基因组。在一些实施方式中，递送的载体基因组的量为1×10¹⁰个到3×10¹²个载体基因组。在一些实施方式中，递送的载体基因组的量为1×10⁹个到3×10¹³个载体基因组。在一些实施方式中，递送的载体基因组的量为1×10⁸个到3×10¹⁴个载体基因组。

在一些实施方式中，可以使用感染复数(MOI)测量要施用的药物组合物的量。在一些实施方式中，MOI可以是指载体或病毒基因组与核酸可以递送到的细胞的比率或倍数。在一些实施方式中，MOI可以为1×10⁶。在一些实施方式中，MOI可以为1×10⁵-1×10⁷。在一些实施方式中，MOI可以为1×10⁴到1×10⁸。在一些实施方式中，本申请的重组病毒的MOI至少为约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×10¹⁶、1×10¹⁷和1×10¹⁸。在一些情况下，本申请的重组病毒的MOI为1×10⁸到3×10¹⁴。在一些实施方式中，本申请的重组病毒的MOI至多为约1×10¹、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³、1×10¹⁴、1×10¹⁵、1×1016、1×10¹⁷和1×10¹⁸。

在一些实施方式中，药物组合物的量包括约1×10⁸个到约1×10¹⁵个重组病毒粒子或病毒、约1×10⁹个到约1×10¹⁴个重组病毒粒子或病毒、约1×10¹⁰个到约1×10¹³个重组病毒粒子或病毒、或者约1×1011个到约3×10¹²个重组病毒粒子或病毒。

在一些实施方式中，病毒载体的存在是通过如本领域内已知的qPCR或ELBA检测到的。

在一些实施方式中，在本申请所描述的治疗方法之后，受试者的最佳矫正视力(BCVA)提高了1行、2行、3行、4行、5行或更多行。

在一些实施方式中，如通过荧光素血管造影术(FA)评估的新生血管的减少。

在一些实施方式中，可以测量视网膜厚度以检查治疗的效果。在一些实施方式中，在用本申请的药物组合物治疗之后，人类受试者的视网膜中央厚度在12个月内并未增加多于50微米、100微米或250微米。在一些实施方式中，在用本申请的药物组合物治疗之后，人类受试者的视网膜中央厚度在3个月、6个月、9个月或12个月内至少减少50微米、100微米、200微米、250微米、300微米、400微米、500微米、600微米。将时间点处的中央视网膜厚度与在施用本申请的药物组合物的1天、3天、7天或10天时或内取得的基线测量相比较，可以测量人类受试者的视网膜中央厚度的减少。

以下通过具体实施例说明本申请的腺相关病毒衣壳蛋白及其用途。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

分子和细胞生物化学的通用方法可以在如以下等标准教科书中找到：《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第3版》(Sambrook等人,港口实验室出版社(HaRBor Laboratory Press)2001)；《精编分子生物学实验指南(ShortProtocols in Molecular Biology)第4版》(Ausubel等人编,约翰威利父子公司(John38Wiley&Sons)1999)；《蛋白质方法(Protein Methods)》(Bollar等人,约翰威利父子公司1996)；《基因治疗非病毒载体(Nonviral Vectors for Gene Therapy)》(Wagner等人编,学术出版社1999)；《病毒载体(Viral Vectors)》(Kaplift&Loewy编,学术出版社1995)；《免疫学方法手册(Immunology Methods Manual)》(I.Lefkovits编,学术出版社1997)；以及《细胞和组织培养：生物技术实验室步骤(Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology)》(Doyle&Griffiths,约翰威利父子公司1998)，所述标准教科书的公开内容通过引用的方式并入本文中。本申请中提及的用于基因操纵的试剂、克隆载体和试剂盒可从如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech等商业供应商获得。

实施例1AAV2病毒载体的构建

按SEQ NO ID.4、SEQ NO ID.5、SEQ NO ID.6所示的序列分别由金唯智合成编码野生型AAV2的衣壳蛋白VP1、修饰的AAV2的VP1(SEQ ID NO.2)和本申请的AAV2的VP1(SEQ IDNO.1)的pRepCap质粒。

按SEQ NO ID.7序列由通用基因公司全基因合成表达阿柏西普的AAV穿梭质粒载体。

AAV载体的生产采用三质粒系统，即用含上述获得的穿梭质粒、辅助质粒pHelper，与三种不同的pRepCap质粒，以PEI为转染试剂，共同转染HEK293细胞，各自重组包装出AAV病毒载体。转染后48-72小时进行收获，收获液经亲和层析纯化后，通过阴离子层析进一步纯化，超滤浓缩，置换缓冲液。纯化后的重组AAV病毒载体测定基因组滴度，除菌过滤分装后备用。

三种具有不同衣壳蛋白的病毒载体分别命名为AL-AAV2(野生型VP1)、AL-000(具有SEQ ID NO.2所示的衣壳蛋白)、AL-001(514)(具有SEQ ID NO.1所示的衣壳蛋白)。

实施例2病毒载体药效验证

食蟹猴CNV(脉络膜新生血管)模型为药效评价的行业标准模型，本实施例中分别采用玻璃体内注射或脉络膜上腔注射的方式，向食蟹猴眼中注入1×10¹²vg/眼的AL-AAV2、AL-000或AL-001(514)，每组4只。在注射4周后，采用5W激光构建CNV模型，分别在建模后第2周至第5周，采用荧光素眼底血管造影术(FFA)，检测受试食蟹猴眼球中IV级光斑的面积(IV级光斑率降低或IV级光斑面积的缩小为NHP(非人灵长类)CNV模型中行业通行药效评价指标)。其中，建模后第2周和第4周，食蟹猴眼球FFA成像结果如图1所示。可以看出，随着时间推移，IV级光斑的面积逐渐减小，且采用本申请的AL-001(514)，IV级光斑的面积减小更为明显。

建模后第2周和第4周，食蟹猴眼球中IV级光斑率结果如图2所示，从图中可以看出，采用本申请的AL-001(514)，在第2周和第4周的IV级光斑率较AL-AAV2和AL-000有明显降低，说明包含本申请的衣壳蛋白的病毒载体药物的药效得到提高；更出人意料的是，采用脉络膜上腔注射的方式，眼球中IV级光斑率得到进一步降低，由此可能说明包含本申请的衣壳蛋白的病毒载体药物结合脉络膜上腔注射的方式，能够获得更好的治疗效果。

实施例3安全性评价

采用与实施例2相同的方法建立CNV模型，分别在建模后第2周和第4周进行眼科检测，项目包括房水细胞、玻璃体细胞、角质沉淀(角膜后渗出物)、房水闪辉、晶状体囊沉淀物以及眼压检测，Hacket-McDonald打分结果如表1所示。结果显示，玻璃体内注射(IVT)AL-AAV2或AL-000从第2周起，受试者眼球出现不同程度的晶状体浑浊、前玻璃体大小一致的灰白色点状颗粒漂浮物+、虹膜后粘连+、前房细胞+等症状，说明注射AL-AAV2或AL-000后有炎症发生；而玻璃体内注射AL-001(514)仅出现轻微晶状体浑浊，无其他症状出现，采用脉络膜上腔注射(SCS)AL-001(514)后2周至4周，均未出现上述任何症状，说明本申请的突变的衣壳蛋白引起更低的炎症反应，因此具有更高的安全性，此外，采用脉络膜上腔注射具有更高的安全性。

表1Hacket-McDonald打分结果

此外，通过注射后2、4、6周检测房水蛋白表达量，发现AL-AAV2、AL-000和AL-001(514)的蛋白表达没有明显的变化。

通过以上结果可以看出，本申请通过对AAV2衣壳蛋白VP1进行修饰，并进一步引入了D514E点突变，使包含所述衣壳蛋白的AAV病毒载体药物具有更好的药效和更高的安全性。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请保护的范围之内。

Claims

1.一种腺相关病毒衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.一种多核苷酸分子，其包含编码权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白的核苷酸序列或其互补序列的至少一种；优选地，所述多核苷酸分子包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其包含权利要求2所述的多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子与启动子序列可操作地连接。

4.一种细胞，其包含权利要求2所述的多核苷酸分子或权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的细胞，其进一步包含对治疗性蛋白进行编码的多核苷酸。

6.根据权利要求4或5所述的细胞，其进一步包含对rep蛋白进行编码的多核苷酸。

7.一种重组病毒或病毒载体，其包含权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白；优选地，所述重组病毒或病毒载体是AAV；更优选地，所述AAV是AAV2。

8.根据权利要求7所述的重组病毒或病毒载体，其中，当玻璃体内或脉络膜上腔注射到哺乳动物中时，所述重组病毒或病毒载体能够结合并穿过内界膜。

9.根据权利要求7或8所述的重组病毒或病毒载体，其中，所述重组病毒或病毒载体包含对治疗性基因产物进行编码的多核苷酸序列；优选地，所述治疗性基因产物是抗血管内皮生长因子。

10.一种药物组合物，其包括权利要求7到9中任一项所述的重组病毒或病毒载体，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

11.权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白、权利要求2所述的多核苷酸分子、权利要求3所述的表达载体、权利要求4-6中任一项所述的细胞、权利要求7-9中任一项所述的重组病毒或病毒载体或权利要求10所述的药物组合物在制备治疗眼部疾病药物中的用途；优选地，所述眼部疾病选自选年龄相关性黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新生血管、脉络膜新生血管、糖尿病性视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病变和糖尿病性视网膜水肿的至少一种。