JP2023545722A - 遺伝子治療剤の眼送達のためのアデノ随伴ウイルス - Google Patents
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Abstract
本発明は、眼組織に対して向性を有するカプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に関する。ｒＡＡＶは、参照ｒＡＡＶと比較して、眼組織への形質導入を増強または増加させたカプシドを有する。このようなｒＡＡＶは、眼疾患の治療のための治療用タンパク質をコードする導入遺伝子の送達に有用であり得る。【選択図】図１
Description
１．発明の分野
眼組織を標的にする、または眼組織への向性を有するカプシドタンパク質を有する、かつ、例えば参照カプシドと比較して眼組織への送達が増強された、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）が本明細書に開示される。特に、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ．ｈｕ．５１、ＡＡＶ９Ｓ４５４．Ｔｆｒ３であるカプシド、または１つ以上の眼組織を標的とすることが実証された他のカプシドを有するｒＡＡＶベクターが提供される。また、ｒＡＡＶを標的組織に方向付ける、及び／または網膜組織及びＲＰＥ脈絡膜組織を含む眼組織への形質導入を改善し、網膜疾患、特に非感染性ブドウ膜炎を治療するための治療剤を送達するカプシドタンパク質もまた提供される。
眼組織を標的にする、または眼組織への向性を有するカプシドタンパク質を有する、かつ、例えば参照カプシドと比較して眼組織への送達が増強された、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）が本明細書に開示される。特に、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｈｕ．２６、ＡＡＶ．ｈｕ．５１、ＡＡＶ９Ｓ４５４．Ｔｆｒ３であるカプシド、または１つ以上の眼組織を標的とすることが実証された他のカプシドを有するｒＡＡＶベクターが提供される。また、ｒＡＡＶを標的組織に方向付ける、及び／または網膜組織及びＲＰＥ脈絡膜組織を含む眼組織への形質導入を改善し、網膜疾患、特に非感染性ブドウ膜炎を治療するための治療剤を送達するカプシドタンパク質もまた提供される。
２．背景
遺伝子送達ベクターとしてのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用は、患者の満たされていない多くのニーズに対する処置のための有望な手段である。天然に存在する数十種のＡＡＶカプシドが報告されており、霊長類の組織における種々の天然ＡＡＶ配列をマイニングすることで、クレードに分布した１００種を超えるバリアントを特定した。ＡＡＶは、パルボウイルス科に属し、比較的小さなゲノム及び単純な遺伝子構成要素を有する一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、ヘルパーウイルスを伴わずに、潜伏感染を確立する。ＡＡＶゲノムは、通常、ベクター生成のための複製及びパッケージングシグナルとして機能する、末端逆位反復（ＩＴＲ）に挟まれたＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子を有する。カプシドタンパク質は、ゲノムＤＮＡを有し、かつＤＮＡを標的細胞に送達するための組織向性を決定し得るカプシドを形成する。
遺伝子送達ベクターとしてのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用は、患者の満たされていない多くのニーズに対する処置のための有望な手段である。天然に存在する数十種のＡＡＶカプシドが報告されており、霊長類の組織における種々の天然ＡＡＶ配列をマイニングすることで、クレードに分布した１００種を超えるバリアントを特定した。ＡＡＶは、パルボウイルス科に属し、比較的小さなゲノム及び単純な遺伝子構成要素を有する一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、ヘルパーウイルスを伴わずに、潜伏感染を確立する。ＡＡＶゲノムは、通常、ベクター生成のための複製及びパッケージングシグナルとして機能する、末端逆位反復（ＩＴＲ）に挟まれたＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子を有する。カプシドタンパク質は、ゲノムＤＮＡを有し、かつＤＮＡを標的細胞に送達するための組織向性を決定し得るカプシドを形成する。
低い病原性及び長期の標的化遺伝子発現の有望性のため、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、治療配列が様々なカプシドにパッケージングされた遺伝子移行ベクターとして使用されてきた。そのようなベクターは、前臨床遺伝子療法研究において使用されており、２０種を超える遺伝子療法製品が現在、臨床開発下にある。ＡＡＶ２などの組換えＡＡＶは、望ましい網膜細胞形質導入特性を実証しており、眼疾患の治療のための組換えＡＡＶ２を使用した臨床試験が進行中である。他の眼組織への向性は、治療する適応症に応じていることが望ましい。ヒト対象におけるｒＡＡＶの眼組織向性を増強する試みは、限定的な成功を収めている。
特定の眼組織を含む、眼組織への向性が向上したｒＡＡＶベクターが、例えば眼に関連する障害、例えば非感染性ブドウ膜炎の治療における送達療法に必要とされている。治療剤を送達するための組織特異的標的化が向上した及び／または組織特異的形質導入が向上したｒＡＡＶベクターも必要とされている。
３．発明の概要
ｒＡＡＶを標的組織に方向付けるカプシドタンパク質を有する、組換えＡＡＶ粒子が提供される。カプシドタンパク質は、眼組織標的化及び／または細胞取り込み及び／またはｒＡＡＶゲノムの組み込みを促進し、これには、ｒＡＡＶ粒子を前部組織（角膜、虹彩、毛様体、シュレム管及び／または線維柱帯）、または後部組織（網膜もしくはＲＰＥ脈絡膜組織など）、または視神経（眼窩部もしくは頭蓋部）に標的化し、眼疾患を治療するための治療剤を送達することが含まれる。ｒＡＡＶは、眼疾患を治療するための治療タンパク質をコードする導入遺伝子を有してもよく、眼疾患または障害の治療のために眼組織に送達するためのｒＡＡＶを投与する方法が提供される。実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１、配列番号５９）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２、配列番号６０）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３、配列番号６１）、ＡＡＶ血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ、配列番号７４）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４、配列番号６２）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５、配列番号６３）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６、配列番号６４）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７、配列番号６５）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８、配列番号６６）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９、配列番号６７）、ＡＡＶ血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ、配列番号６８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０、配列番号６９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．２０（ＡＡＶ．ｒｈ．２０、配列番号７０）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７、配列番号７１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ．３９、配列番号７３）、ＡＡＶ血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ．７３、配列番号７５）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．７４（ＡＡＶｒｈ．７４、配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ５１（ＡＡＶｈｕ．５１、配列番号７６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．２１（ＡＡＶｈｕ．２１、配列番号７７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．１２（ＡＡＶｈｕ．１２、配列番号７８）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．２６（ＡＡＶｈｕ．２６、配列番号７９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．２４（ＡＡＶｒｈ．２４、配列番号８７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．３８（ＡＡＶｈｕ．３８、配列番号８８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．７２（ＡＡＶｒｈ．７２、配列番号８９）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．５６（ＡＡＶｈｕ．５６、配列番号８６）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．５（ＡＡＶｃｙ．５、配列番号９０）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．６（ＡＡＶｃｙ．６、配列番号９１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．４６（ＡＡＶｒｈ．４６、配列番号９２）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１３（ＡＡＶ．ｒｈ．１３、配列番号８５）、もしくはＡＡＶ血清型ｒｈ．６４．Ｒ１（ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１、配列番号１０７）のカプシドを有し、またはカプシドは、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（Ａ２６９Ｓ置換（配列番号２６））、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（Ａ２９６Ｓ、４９８＿ＮＮＮ／ＡＡＡ＿５００、配列番号２７））、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、もしくはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）（図７または表１０を参照されたい）を含む、本明細書に記載のカプシドの１つに対する挿入及び／または１つ以上のアミノ酸置換を有する、操作されたカプシドである。
ｒＡＡＶを標的組織に方向付けるカプシドタンパク質を有する、組換えＡＡＶ粒子が提供される。カプシドタンパク質は、眼組織標的化及び／または細胞取り込み及び／またはｒＡＡＶゲノムの組み込みを促進し、これには、ｒＡＡＶ粒子を前部組織（角膜、虹彩、毛様体、シュレム管及び／または線維柱帯）、または後部組織（網膜もしくはＲＰＥ脈絡膜組織など）、または視神経（眼窩部もしくは頭蓋部）に標的化し、眼疾患を治療するための治療剤を送達することが含まれる。ｒＡＡＶは、眼疾患を治療するための治療タンパク質をコードする導入遺伝子を有してもよく、眼疾患または障害の治療のために眼組織に送達するためのｒＡＡＶを投与する方法が提供される。実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１、配列番号５９）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２、配列番号６０）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３、配列番号６１）、ＡＡＶ血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ、配列番号７４）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４、配列番号６２）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５、配列番号６３）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６、配列番号６４）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７、配列番号６５）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８、配列番号６６）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９、配列番号６７）、ＡＡＶ血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ、配列番号６８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０、配列番号６９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．２０（ＡＡＶ．ｒｈ．２０、配列番号７０）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７、配列番号７１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ．３９、配列番号７３）、ＡＡＶ血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ．７３、配列番号７５）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．７４（ＡＡＶｒｈ．７４、配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ５１（ＡＡＶｈｕ．５１、配列番号７６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．２１（ＡＡＶｈｕ．２１、配列番号７７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．１２（ＡＡＶｈｕ．１２、配列番号７８）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．２６（ＡＡＶｈｕ．２６、配列番号７９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．２４（ＡＡＶｒｈ．２４、配列番号８７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．３８（ＡＡＶｈｕ．３８、配列番号８８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．７２（ＡＡＶｒｈ．７２、配列番号８９）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．５６（ＡＡＶｈｕ．５６、配列番号８６）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．５（ＡＡＶｃｙ．５、配列番号９０）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．６（ＡＡＶｃｙ．６、配列番号９１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．４６（ＡＡＶｒｈ．４６、配列番号９２）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１３（ＡＡＶ．ｒｈ．１３、配列番号８５）、もしくはＡＡＶ血清型ｒｈ．６４．Ｒ１（ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１、配列番号１０７）のカプシドを有し、またはカプシドは、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（Ａ２６９Ｓ置換（配列番号２６））、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（Ａ２９６Ｓ、４９８＿ＮＮＮ／ＡＡＡ＿５００、配列番号２７））、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、もしくはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）（図７または表１０を参照されたい）を含む、本明細書に記載のカプシドの１つに対する挿入及び／または１つ以上のアミノ酸置換を有する、操作されたカプシドである。
所定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型のカプシドを有するか、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３である。特定のｒＡＡＶカプシドは、特定の眼組織に対する向性を有し、特定の眼組織を標的とするために使用され得る。実施形態において、ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドを有するｒＡＡＶは、虹彩、網膜、ＲＰＥ脈絡膜または強膜を標的とするように投与されてもよく、所定の実施形態において、毛様体、シュレム管、線維柱帯または視神経（眼窩及び／または頭蓋部）を標的としてもよい。実施形態において、ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドを有するｒＡＡＶは、網膜及び／またはＲＰＥ脈絡膜組織を標的にするために使用され得る。他の実施形態において、ＡＡＶｒｈ．７３カプシドを有するｒＡＡＶは、虹彩組織を標的にするために使用されてもよく、他の実施形態において、ＡＡＶｈｕ．２６カプシドは、毛様体または線維柱帯を標的にするために使用されてもよい。実施形態において、毛様体及び／または線維柱帯は、緑内障の治療のために標的化される。ＡＡＶ１カプシドは、線維柱帯、または強膜を標的にするために使用されてもよく、ＡＡＶ７は、線維柱帯を標的にするために使用されてもよい。所定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ヒアルロン酸の不存在下で投与される。ｒＡＡＶは、硝子体内、脈絡膜上、または前房内投与によって送達されてもよく、所定の実施形態において、投与は、網膜、網膜色素上皮、脈絡膜、強膜または毛様体などの特定の眼組織へのものであってもよい。
全身、静脈内、前房内、脈絡膜上または硝子体内投与時に、１つ以上の細胞型を含む１つ以上の組織におけるｒＡＡＶの形質導入を促進する操作されたカプシドタンパク質もまた提供され、カプシドタンパク質は、カプシドの表面露出可変領域（ＶＲ）（例えば、ＶＲ－Ｉ、ＶＲ－ＩＶまたはＶＲ－ＶＩＩＩ）、またはＶＰ２の第１のアミノ酸の後、例えば、ＡＡＶ９カプシドの残基１３８（配列番号６７のアミノ酸配列）の直後、または別のＡＡＶカプシドの対応する残基の直後に挿入される、または代替的に、本明細書に記載されるアミノ酸置換のうちの１つ以上によって操作されるペプチドを含み、例えば、前部もしくは後部または両方などの少なくとも１つの組織内に操作されたカプシドを有するＡＡＶの形質導入が、対応する操作されていないカプシドを有するＡＡＶの形質導入と比較して上記投与時に増大される。所定の実施形態において、形質導入は、ＧＦＰ蛍光などの導入遺伝子の検出によって測定される。特定の実施形態において、操作されたカプシド形質導入眼組織を有するｒＡＡＶは、参照ＡＡＶ（挿入を伴わない親ＡＡＶ血清型）による形質導入よりも、前部または後部を含む質導入した眼組織を１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きく、前部もしくは後部組織を含む眼組織に形質導入した。
所定の実施形態において、治療対象となる導入遺伝子を含むゲノムを有するｒＡＡＶを含む、本明細書に記載の操作されたカプシドを組み込んだｒＡＡＶが提供される。本明細書に記載のｒＡＡＶを生成するためのパッケージング細胞が提供される。本明細書に記載の操作されたｒＡＡＶの送達による処置方法、及び本明細書に記載の操作されたｒＡＡＶを含む薬学的組成物も提供される。本明細書に記載の操作されたカプシドを有するｒＡＡＶの製造方法も提供される。
本発明は、マウス及びＮＨＰにおけるバーコード化ｒＡＡＶを使用したＩＶまたはＩＶＴ投与後の、操作されたカプシドの構築、及び眼組織への向性についてのカプシドのスクリーニングを説明する例として以下に例示される。
３．１．実施形態
１．導入遺伝子を眼組織細胞に送達する方法であって、前記方法が、前記細胞を、眼組織細胞における眼疾患治療剤の発現を促進する１つ以上の調節エレメントに機能可能に連結した眼疾患治療剤をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターと接触させることを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１（配列番号５９）、ＡＡＶ２（配列番号６０）、ＡＡＶ３（配列番号６１）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号７４）、ＡＡＶ４（配列番号６２）、ＡＡＶ５（配列番号６３）、ＡＡＶ６（配列番号６４）、ＡＡＶ７（配列番号６５）、ＡＡＶ８（配列番号６６）、ＡＡＶ９（配列番号６７）、ＡＡＶ９ｅ（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ．１０（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ．２０（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ３９（配列番号７３）、ＡＡＶ ｒｈ７３（配列番号７５）、ＡＡＶｒｈ．７４（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｈｕ．５１（配列番号７６）、ＡＡＶｈｕ．２１（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ．１２（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ．２６（配列番号７９）、ＡＡＶｒｈ．２４（配列番号８７）、ＡＡＶｈｕ．３８（配列番号８８）、ＡＡＶｒｈ．７２（配列番号８９）、ＡＡＶｈｕ．５６（配列番号８６）、ＡＡＶｃｙ．５（配列番号９０）、ＡＡＶｃｙ．６（配列番号９１）、ＡＡＶｒｈ．４６（配列番号９２）、ＡＡＶｒｈ．１３（配列番号８５）、ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１（配列番号１０７）、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（配列番号２６）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、またはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）のカプシドを有する、前記方法。
１．導入遺伝子を眼組織細胞に送達する方法であって、前記方法が、前記細胞を、眼組織細胞における眼疾患治療剤の発現を促進する１つ以上の調節エレメントに機能可能に連結した眼疾患治療剤をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターと接触させることを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１（配列番号５９）、ＡＡＶ２（配列番号６０）、ＡＡＶ３（配列番号６１）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号７４）、ＡＡＶ４（配列番号６２）、ＡＡＶ５（配列番号６３）、ＡＡＶ６（配列番号６４）、ＡＡＶ７（配列番号６５）、ＡＡＶ８（配列番号６６）、ＡＡＶ９（配列番号６７）、ＡＡＶ９ｅ（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ．１０（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ．２０（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ３９（配列番号７３）、ＡＡＶ ｒｈ７３（配列番号７５）、ＡＡＶｒｈ．７４（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｈｕ．５１（配列番号７６）、ＡＡＶｈｕ．２１（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ．１２（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ．２６（配列番号７９）、ＡＡＶｒｈ．２４（配列番号８７）、ＡＡＶｈｕ．３８（配列番号８８）、ＡＡＶｒｈ．７２（配列番号８９）、ＡＡＶｈｕ．５６（配列番号８６）、ＡＡＶｃｙ．５（配列番号９０）、ＡＡＶｃｙ．６（配列番号９１）、ＡＡＶｒｈ．４６（配列番号９２）、ＡＡＶｒｈ．１３（配列番号８５）、ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１（配列番号１０７）、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（配列番号２６）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、またはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）のカプシドを有する、前記方法。
２．導入遺伝子の、対象の眼組織、または眼組織標的細胞、またはそれらの細胞マトリックスへの送達をそれを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、前記眼組織における眼疾患治療剤の発現を促進する１つ以上の調節エレメントに機能可能に連結された前記眼疾患治療剤をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含み、ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１（配列番号５９）、ＡＡＶ２（配列番号６０）、ＡＡＶ３（配列番号６１）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号７４）、ＡＡＶ４（配列番号６２）、ＡＡＶ５（配列番号６３）、ＡＡＶ６（配列番号６４）、ＡＡＶ７（配列番号６５）、ＡＡＶ８（配列番号６６）、ＡＡＶ９（配列番号６７）、ＡＡＶ９ｅ（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ．１０（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ．２０（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ３９（配列番号７３）、ＡＡＶ ｒｈ７３（配列番号７５）、ＡＡＶｒｈ．７４（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｈｕ．５１（配列番号７６）、ＡＡＶｈｕ．２１（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ．１２（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ．２６（配列番号７９）、ＡＡＶｒｈ．２４（配列番号８７）、ＡＡＶｈｕ．３８（配列番号８８）、ＡＡＶｒｈ．７２（配列番号８９）、ＡＡＶｈｕ．５６（配列番号８６）、ＡＡＶｃｙ．５（配列番号９０）、ＡＡＶｃｙ．６（配列番号９１）、ＡＡＶｒｈ．４６（配列番号９２）、ＡＡＶｒｈ．１３（配列番号８５）、ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１（配列番号１０７）、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（配列番号２６）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、またはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）のカプシドを有する、前記方法。
３．前記カプシドが、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドである、実施形態１または２に記載の方法。
４．前記眼組織または眼組織標的細胞が、角膜組織もしくは細胞、虹彩組織もしくは細胞、毛様体組織もしくは細胞、シュレム管組織もしくは細胞、線維柱帯組織もしくは細胞、網膜組織もしくは細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織もしくは細胞、または視神経細胞である、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。
５．前記眼組織または眼組織標的細胞が、網膜組織もしくは細胞またはＲＰＥ脈絡膜組織もしくは細胞である、実施形態４に記載の方法。
６．前記カプシドがＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドである、実施形態５に記載の方法。
７．前記眼疾患が非感染性ブドウ膜炎である、実施形態１～６に記載の方法。
８．前記眼疾患が緑内障である、実施形態１～４に記載の方法。
９．前記ｒＡＡＶが、前記線維柱帯及び／または前記シュレム管を標的とする、実施形態８に記載の方法。
１０．前記カプシドが、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ．ｈｕ．２６カプシド、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３カプシドである、実施形態８または９に記載の方法。
１１．前記ｒＡＡＶベクターが、硝子体内、脈絡膜上、または前房内投与される、実施形態１～１０のいずれかに記載の方法。
１２．前記ｒＡＡＶベクターが全身投与される、実施形態１～１０のいずれかに記載の方法。
１３．提供される前記ｒＡＡＶベクターが、ヒアルロン酸の不存在下で投与される、実施形態１～１２のいずれかに記載の方法。
１４．導入遺伝子の眼組織細胞への送達における使用のための薬学的組成物であって、前記組成物が、前記眼組織細胞における眼疾患治療剤の発現を促進する１つ以上の調節エレメントに機能可能に連結された前記眼疾患治療剤をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１（配列番号５９）、ＡＡＶ２（配列番号６０）、ＡＡＶ３（配列番号６１）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号７４）、ＡＡＶ４（配列番号６２）、ＡＡＶ５（配列番号６３）、ＡＡＶ６（配列番号６４）、ＡＡＶ７（配列番号６５）、ＡＡＶ８（配列番号６６）、ＡＡＶ９（配列番号６７）、ＡＡＶ９ｅ（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ．１０（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ．２０（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ３９（配列番号７３）、ＡＡＶ ｒｈ７３（配列番号７５）、ＡＡＶｒｈ．７４（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｈｕ．５１（配列番号７６）、ＡＡＶｈｕ．２１（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ．１２（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ．２６（配列番号７９）、ＡＡＶｒｈ．２４（配列番号８７）、ＡＡＶｈｕ．３８（配列番号８８）、ＡＡＶｒｈ．７２（配列番号８９）、ＡＡＶｈｕ．５６（配列番号８６）、ＡＡＶｃｙ．５（配列番号９０）、ＡＡＶｃｙ．６（配列番号９１）、ＡＡＶｒｈ．４６（配列番号９２）、ＡＡＶｒｈ．１３（配列番号８５）、ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１（配列番号１０７）、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（配列番号２６）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、またはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）のカプシドを有する、前記薬学的組成物。
１５．前記カプシドが、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドである、実施形態１４に記載の薬学的組成物。
１６．前記眼組織または眼組織標的細胞が、角膜組織もしくは細胞、虹彩組織もしくは細胞、毛様体組織もしくは細胞、シュレム管組織もしくは細胞、線維柱帯組織もしくは細胞、網膜組織もしくは細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織もしくは細胞、または視神経細胞である、実施形態１４または１５に記載の薬学的組成物。
１７．前記眼組織または眼組織標的細胞が、網膜組織もしくは細胞またはＲＰＥ脈絡膜組織もしくは細胞である、実施形態１６に記載の薬学的組成物。
１８．前記カプシドがＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドである、実施形態１７に記載の薬学的組成物。
１９．前記眼疾患が非感染性ブドウ膜炎である、実施形態１４～１８に記載の薬学的組成物。
２０．前記眼疾患が緑内障である、実施形態１４～１８に記載の薬学的組成物。
２１．前記ｒＡＡＶが、前記線維柱帯及び／または前記シュレム管を標的とする、実施形態２０に記載の薬学的組成物。
２２．前記カプシドが、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドである、実施形態２０または２１に記載の薬学的組成物。
２３．前記ｒＡＡＶベクターが、硝子体内、脈絡膜上、または前房内投与される、実施形態１４～２２のいずれかに記載の薬学的組成物。
２４．前記ｒＡＡＶベクターが全身投与される、実施形態１４～２２のいずれかに記載の方法。
２５．提供される前記ｒＡＡＶベクターが、ヒアルロン酸の不存在下で投与される、実施形態１４～２４に記載の方法。
２６．前記ｒＡＡＶが、参照ＡＡＶカプシドと比較して、標的組織内で少なくとも１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい形質導入を示す、実施形態１～２５のいずれかに記載の方法または医薬組成物。
２７．導入遺伝子ＲＮＡの存在量が、前記参照ＡＡＶカプシドからの導入遺伝子ＲＮＡの存在量と比較して、標的組織内で１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい、実施形態１～２６のいずれかに記載の方法または医薬組成物。
２８．前記参照ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９である、実施形態２６または２７に記載の方法または医薬組成物。
２９．眼障害の治療をそれを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、治療有効量の実施形態１４～２２または２５のいずれかに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
３０．前記眼疾患治療剤が、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ融合タンパク質、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、もしくはブロルシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合断片、ラナデルマブなどの抗カリクレイン抗体またはその抗原結合断片、サトラリズマブ、サリルマブ、シルツキシマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、オロキズマブ、ゲリリムズマブ、もしくはトシリズマブなどの抗ＩＬ６抗体または抗ＩＬ６Ｒ抗体またはその抗原結合断片、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、もしくはセルトリズマブ－ペゴルなどの抗ＴＮＦ抗体またはその抗原結合断片、エタネルセプトなどのＴＮＦ受容体融合タンパク質、エクリズマブ、ラブリズマブ、もしくはテシドルマブなどの抗Ｃ３抗体またはその抗原結合断片、ＮＧＭ６２１などの抗Ｃ５抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１～２９のいずれかに記載の方法または薬学的組成物。
３１．前記実施形態のいずれかに記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を共有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
３２．実施形態３１に記載の核酸を発現させて、前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターを生成することが可能なパッケージング細胞。
４．図面の簡単な説明
他のＡＡＶの領域に対応する、残基Ｌ４４７～Ｒ４７６（残基４５１～４５９は括弧で示されている）からのアデノ随伴ウイルス９型のＶＲ－ＩＶループ（ＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶ）を含むカプシドアミノ酸配列の配列比較を示している。図は、それぞれ、配列番号４９、５１～５４、５０、及び５５～５８を、出現する順番に開示する。
カプシド可変領域ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ及びＶＲ－ＶＩＩＩを示すＡＡＶカプシド構造のタンパク質モデルを示す。ボックスは、モデルにおいて表されるように、表面に露出したアミノ酸を提供するＶＲ－ＩＶのループ領域を強調している。
野生型ＡＡＶ９及び８種の候補改変ｒＡＡＶ９ベクター（１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、及び１０９７）のｍＬ当たりのゲノムコピー（ＧＣ／ｍＬ）の観点からの高パッケージング効率（力価）を示しており、候補ベクターは、それぞれ、残基Ｉ４５１～Ｑ４５８からのＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶの中の異なる部位の直後にＦＬＡＧ挿入物を各々含有する。全てのベクターを、１０ｍＬの培養物中でルシフェラーゼ導入遺伝子とともにパッケージングした。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
抗ＦＬＡＧ樹脂への結合によるパッケージングされたベクターの免疫沈降によって確認された、８種の候補改変ｒＡＡＶ９ベクター（１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、及び１０９７）の各々におけるｌ ＶＲ－ＩＶループＦＬＡＧ挿入物の表面露出を実証している。
野生型ＡＡＶ９（９－ｌｕｃ）、または８種の候補改変（ＦＬＡＧペプチドが挿入されている）ｒＡＡＶ９ベクター（１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、及び１０９７）の各々のいずれかにパッケージングされた、（導入遺伝子として）ルシフェラーゼ遺伝子を保有するカプシドベクターで形質導入されたＬｅｃ２細胞における形質導入効率を示しており、形質導入活性は、９－ｌｕｃの活性を１００％としたルシフェラーゼ活性パーセント（Ａ）として、またはマイクログラム当たりのタンパク質の相対発光量（ＲＬＵ）（Ｂ）として表されている。
様々なペプチドの長さ及び組成のＡＡＶ９のＳ４５４の直後の挿入が、パッケージング細胞におけるＡＡＶ粒子の生成効率に影響を及ぼし得ることを例示している棒グラフを示している。様々な組成及び長さの１０種のペプチドを、ＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶの中のＳ４５４の後に挿入した。トランスフェクトから５日後のトランスフェクトされた浮遊ＨＥＫ２９３細胞の収穫された上清についてｑＰＣＲを実施した。棒グラフにおいて示された結果は、挿入物の性質が、ＨＥＫ２９３細胞によってＡＡＶ粒子が生成され、分泌される能力に影響を及ぼすことを実証しており、全体収率（力価）によって示される。（エラーバーは、Ｙ軸に括弧で記されているペプチドの平均長さの標準誤差を表す）。
以下の細胞株の形質導入された細胞培養物の蛍光画像を示している：（６Ｂ）Ｌｅｃ２細胞株。ＡＡＶ９野生型及びＧＦＰ導入遺伝子を含有するＳ４５４挿入ホーミングペプチドカプシドを使用して前述の細胞株に形質導入した。Ｐ１ベクターは、形質導入効率が極めて低いため画像に含まれず、Ｐ８ベクターは、力価が低いため含まれなかった。ＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＦＬＡＧは、試験された全ての細胞タイプにおいて低い形質導入レベルを示した。
以下の細胞株の形質導入された細胞培養物の蛍光画像を示している：（６Ｃ）ＨＴ－２２細胞株。ＡＡＶ９野生型及びＧＦＰ導入遺伝子を含有するＳ４５４挿入ホーミングペプチドカプシドを使用して前述の細胞株に形質導入した。Ｐ１ベクターは、形質導入効率が極めて低いため画像に含まれず、Ｐ８ベクターは、力価が低いため含まれなかった。ＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＦＬＡＧは、試験された全ての細胞タイプにおいて低い形質導入レベルを示した。
以下の細胞株の形質導入された細胞培養物の蛍光画像を示している：（６Ｄ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞株。ＡＡＶ９野生型及びＧＦＰ導入遺伝子を含有するＳ４５４挿入ホーミングペプチドカプシドを使用して前述の細胞株に形質導入した。Ｐ１ベクターは、形質導入効率が極めて低いため画像に含まれず、Ｐ８ベクターは、力価が低いため含まれなかった。ＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＦＬＡＧは、試験された全ての細胞タイプにおいて低い形質導入レベルを示した。
以下の細胞株の形質導入された細胞培養物の蛍光画像を示している：（６Ｅ）Ｃ２Ｃ１２細胞株。ＡＡＶ９野生型及びＧＦＰ導入遺伝子を含有するＳ４５４挿入ホーミングペプチドカプシドを使用して前述の細胞株に形質導入した。Ｐ１ベクターは、形質導入効率が極めて低いため画像に含まれず、Ｐ８ベクターは、力価が低いため含まれなかった。ＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＦＬＡＧは、試験された全ての細胞タイプにおいて低い形質導入レベルを示した。
開始コドンＶＰ２の後、及び可変領域１（ＶＲ－Ｉ）、可変領域４（ＶＲ－ＩＶ）、及び可変領域８（ＶＲ－ＶＩＩＩ）の内またはその付近の、異種ペプチドの挿入部位とともにＡＡＶ１～９ｅ、ＡＡＶ３Ｂ、ｒｈ１０、ｒｈ２０、ｒｈ３９、ｒｈ７３、ならびにｒｈ７４バージョン１及びバージョン２、ｈｕ１２、ｈｕ２１、ｈｕ２６、ｈｕ３７、ｈｕ５１、及びｈｕ５３カプシド配列のアライメントを示し（全て灰色で強調表示）、各カプシドタンパク質の可変領域８（ＶＲ－ＶＩＩＩ）内の特定の挿入部位は、記号「＃」（ＡＡＶ９のアミノ酸番号付けに従うアミノ酸残基５８８の後）によって示される。図７は、上から下へそれぞれ、配列番号５９、６０、６１、９４、７４、６２、９５、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７３、７５、７２、９６、７８、７７、７９、７１、７６、８０の配列を示す。
図７－１の続きである。
図７－１の続きである。
図７－１の続きである。
図７－１の続きである。
図７－１の続きである。
図７－１の続きである。
ＡＡＶベクターの投与後の、マウス脳細胞におけるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）導入遺伝子のコピーを示す：ＡＡＶ９；ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ（本明細書では、ＡＡＶ９ｅ（５８８位と５８９位の間にペプチドＴＬＡＶＰＦＫ（配列番号２０）が挿入され、及び改変Ａ５８７Ｄ／Ａ５８８Ｇを有する）とも称される）、ＡＡＶ．ｈＤｙｎ（５８８と５８９の間にＴＬＡＡＰＦＫ（配列番号１）を有するＡＡＶ９）、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｓ（５８８位と５８９位の間にペプチドＱＡＶＲＴＳＬ（配列番号１６）が挿入されたＡＡＶ９）、及びＡＡＶ．ＰＨＰ．ＳＨ（５８８位と５８９位の間にペプチドＱＡＶＲＴＳＨ（配列番号１７）が挿入されたＡＡＶ９）。
Ｎ５８８とＴ５８９との間（Ａ、配列番号９７）、ＶＲ－ＩＩＩのＡ２６７とＳ２６８との間（Ｂ、配列番号９８）、及びＶＲ－ＩＶのＧ４５４とＴ４５５との間（Ｃ、配列番号９９）へのＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）ペプチドの挿入を含む、組換えＡＡＶ３Ｂベクターのアミノ酸配列を示し、各々ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）挿入物が太字で示されている。
Ｎ５９０とＴ５９１との間（Ａ、配列番号１００）、ＶＲ－ＩＩＩのＴ２７０とＮ２７１との間（Ｂ、配列番号１０１）、及びＶＲ－ＩＶのＧ４５６とＧ４５７との間（Ｃ、配列番号１０２）へのＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）ペプチドの挿入を含む、組換えＡＡＶｒｈ７３ベクターのアミノ酸配列を示し、各々挿入されるＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）が太字で示されている。
Ｎ５９０とＴ５９１との間（Ａ）、ＶＲ－ＩＩＩの配列番号Ａ２６９とＴ２７０との間（Ｂ）、及びＶＲ－ＩＶのＴ４５３とＴ４５４との間（Ｃ）へのＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）ペプチドの挿入を含む、組換えＡＡＶ８ベクターのアミノ酸配列を示し、各々挿入されるＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）が太字で示されている。
血液脳関門（ＢＢＢ）細胞層を横断するＡＡＶベクターのインビトロトランスウェルアッセイ（Ａ）を示し、結果は、ＡＡＶ．ｈＤｙｎ（逆三角形によって示される）がＡＡＶ９（正方形）よりも速く、ＡＡＶ２（円）よりも速く、かつより大きな範囲でアッセイのＢＢＢ細胞層を横断することを示す（Ｂ）。
操作されたカプシド及び天然カプシドのプールが静脈内に投与されたマウスからの脳ｇＤＮＡの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析の結果を示しており、プールにおける異なるカプシドのマウスの組織における相対的存在量を明らかにしている。３つの異なるプールをマウスに注射した。点線は、どのベクターが一緒にプールされていたかを示している。親ＡＡＶ９は、対照として各プールに含まれていた（プール１：ＢＣ０１、プール２：ＢＣ３１、プール３：ＢＣ０１）。プールの各カプシドのバーコードを表４Ａ～４Ｃに列挙する。
雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＡＡＶ．ｈＤｙｎのインビボ形質導入プロファイルを示し、ナイーブマウス、または脳（Ａ）、肝臓（Ｂ）、心臓（Ｃ）、肺（Ｄ）、腎臓（Ｅ）、骨格筋（Ｆ）、坐骨神経（Ｇ）、及び卵巣（Ｈ）にＡＡＶ９またはＡＡＶ．ｈＤｙｎのいずれかを注射されたマウスにおけるコピー数／マイクログラムｇＤＮＡを示し、ＡＡＶ．ｈＤｙｎがＡＡＶ９と比較して増加した脳の生体内分布を示す。
脳全体にわたるＡＡＶ．ｈＤｙｎからのＧＦＰの分布を示し、ここで、線条体（Ａ）、海馬（Ｂ）、及び皮質（Ｃ）からの脳切片の免疫組織化学的染色の画像は、改変ベクターによる脳の包括的な形質導入を明らかにした。
眼の解剖学的構造を示す。Ａは眼の前眼部の断面を示し、Ｂは眼全体の解剖学的構造を示す。
改変されたカプシド及びネイティブカプシドのプールがＩＶＴによって投与されたＮＨＰの眼から単離されたｇＤＮＡ（Ａ）のインビボ形質導入分析を示しており、プールにおける異なるカプシドのＮＨＰの眼の細胞型における相対的存在量を明らかにしている。親ＡＡＶ２．７ｍ８は、対照として各プールに含め、相対的な存在量を計算するために使用した。
改変されたカプシド及びネイティブカプシドのプールがＩＶＴによって投与されたＮＨＰの眼から単離されたＲＮＡ（Ｂ）のインビボ形質導入分析を示しており、プールにおける異なるカプシドのＮＨＰの眼の細胞型における相対的存在量を明らかにしている。親ＡＡＶ２．７ｍ８は、対照として各プールに含め、相対的な存在量を計算するために使用した。
眼組織、角膜（Ａ）、虹彩（Ｂ）、または水晶体（Ｃ）におけるＮＨＰ中へのＩＶＴ投与後の、最も豊富な９つのカプシド及び対照ＡＡＶ８及びＡＡＶ９について、カプシドによってバーコード化された導入遺伝子から発現されるｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの相対的存在量（ＡＡＶ９に対する）を表すグラフである。ＡＡＶ９（＃）に対する事後Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた通常の一方向ＡＮＯＶＡ。Ｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）。角膜または水晶体組織で検出できない導入遺伝子から転写されたＲＮＡ
毛様体（Ａ）、シュレム管（Ｂ）または線維柱帯（Ｃ）におけるＮＨＰ中へのＩＶＴ投与後の、９つの最も豊富なカプシドならびに対照ＡＡＶ８及びＡＡＶ９について、カプシドによってバーコード化された導入遺伝子から発現されるｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの相対的存在量（ＡＡＶ９に対する）を表すグラフ。ＡＡＶ９（＃）に対する事後Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた通常の一方向ＡＮＯＶＡ。Ｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）。
網膜（Ａ）、ＲＰＥ脈絡膜（Ｂ）または強膜（Ｃ）におけるＮＨＰ中へのＩＶＴ投与後の、９つの最も豊富なカプシド及び対照ＡＡＶ８及びＡＡＶ９について、カプシドによってバーコード化された導入遺伝子から発現されるｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの相対的存在量（ＡＡＶ９に対する）を表すグラフである。ＡＡＶ９（＃）に対する事後Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた通常の一方向ＡＮＯＶＡ。Ｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）。
視神経（ｏｐｔｉｃ ｎｅｒｖｅ）（眼窩部）（Ａ）または視神経（ｏｐｔｉｃａｌ ｎｅｒｖｅ）（頭蓋部）（Ｂ）におけるＮＨＰへのＩＶＴ投与後の、９つの最も豊富なカプシド及び対照ＡＡＶ８及びＡＡＶ９について、カプシドによってバーコード化された導入遺伝子から発現されるｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの相対的存在量（ＡＡＶ９に対する）を表すグラフである。ＡＡＶ９（＃）に対する事後Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた通常の一方向ＡＮＯＶＡ。Ｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）。視神経サンプルで検出できない導入遺伝子から転写されたＲＮＡは、眼窩または頭蓋部のいずれかである。
マウス（Ａ）またはＮＨＰ（Ｂ）の網膜組織におけるＩＶＴ投与後の、最も豊富な９つのカプシド及び対照ＡＡＶ８及びＡＡＶ９について、カプシドによってバーコード化された導入遺伝子から発現されたｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの相対的存在量（ＡＡＶ９に対する）を表すグラフである。ＡＡＶ９（＃）に対する事後Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた通常の一方向ＡＮＯＶＡ。Ｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）。
マウス（Ａ）またはＮＨＰ（Ｂ）のＡＡＶ８またはＡＡＶ９対するＲＰＥ脈絡膜におけるＩＶＴ投与後の、最も豊富な９つのカプシド及び対照ＡＡＶ８及びＡＡＶ９について、カプシドによってバーコード化された導入遺伝子から発現されたｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの相対的存在量（ＡＡＶ９に対する）を表すグラフである。ＡＡＶ９（＃）に対する事後Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いた通常の一方向ＡＮＯＶＡ。Ｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）。
ＩＶＴ注射後のカニクイザル及びマウスにおけるｒＡＡＶベクタープールにおけるベクターの生体内分布の比較を示す。
５．詳細な説明
本発明者らは、形質導入、細胞取り込み、ｒＡＡＶゲノムの組み込み、及びｒＡＡＶ粒子内で送達される導入遺伝子の発現を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の眼組織への標的化を促進するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のカプシドを、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドなどの参照カプシドを有するｒＡＡＶよりも大きい範囲で同定した。したがって、ｒＡＡＶを標的組織に方向付けるカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶ粒子が提供される。カプシドタンパク質は、眼組織標的化及び／または細胞取り込み及び／またはｒＡＡＶゲノムの組み込みを促進し、これには、ｒＡＡＶ粒子を前部組織（角膜、虹彩、毛様体、シュレム管及び／または線維柱帯）、または後部組織（網膜もしくはＲＰＥ脈絡膜組織など）、または視神経（眼窩部もしくは頭蓋部）に標的化し、眼疾患を治療するための治療剤を送達することが含まれる。親、非操作カプシドまたは参照カプシドに対するｒＡＡＶゲノムの眼組織標的化、形質導入及び組み込み等の所望の特性を付与及び／または増強するアミノ酸配列を含むように操作されたカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが含まれる。ｒＡＡＶは、眼疾患を治療するための治療タンパク質をコードする導入遺伝子を有してもよく、眼疾患または障害の治療のために眼組織に送達するためのｒＡＡＶを投与する方法が提供される。
本発明者らは、形質導入、細胞取り込み、ｒＡＡＶゲノムの組み込み、及びｒＡＡＶ粒子内で送達される導入遺伝子の発現を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の眼組織への標的化を促進するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のカプシドを、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドなどの参照カプシドを有するｒＡＡＶよりも大きい範囲で同定した。したがって、ｒＡＡＶを標的組織に方向付けるカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶ粒子が提供される。カプシドタンパク質は、眼組織標的化及び／または細胞取り込み及び／またはｒＡＡＶゲノムの組み込みを促進し、これには、ｒＡＡＶ粒子を前部組織（角膜、虹彩、毛様体、シュレム管及び／または線維柱帯）、または後部組織（網膜もしくはＲＰＥ脈絡膜組織など）、または視神経（眼窩部もしくは頭蓋部）に標的化し、眼疾患を治療するための治療剤を送達することが含まれる。親、非操作カプシドまたは参照カプシドに対するｒＡＡＶゲノムの眼組織標的化、形質導入及び組み込み等の所望の特性を付与及び／または増強するアミノ酸配列を含むように操作されたカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが含まれる。ｒＡＡＶは、眼疾患を治療するための治療タンパク質をコードする導入遺伝子を有してもよく、眼疾患または障害の治療のために眼組織に送達するためのｒＡＡＶを投与する方法が提供される。
実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１（配列番号５９）、ＡＡＶ血清型２（配列番号６０）、ＡＡＶ血清型３（配列番号６１）、ＡＡＶ血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）（配列番号７４）、ＡＡＶ血清型４（配列番号６２）、ＡＡＶ血清型５（配列番号６３）、ＡＡＶ血清型６（配列番号６４）、ＡＡＶ７カプシド（配列番号６５）、ＡＡＶ８カプシド（配列番号６６）、ＡＡＶ血清型９（配列番号６７）、ＡＡＶ血清型９ｅ（配列番号６８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ１０（配列番号６９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ２０（配列番号７０）、及びＡＡＶ血清型ｈｕ．３７（配列番号７１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ３９（配列番号７３）、ＡＡＶ血清型ｒｈ７３（配列番号７５）、ＡＡＶ血清型ｒｈ７４（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）（配列番号７６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）（配列番号７７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）（配列番号７８）、ＡＡＶ血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）（配列番号７９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．２４（配列番号８７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．３８（配列番号８８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．７２（配列番号８９）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．５６（配列番号８６）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．５（配列番号９０）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．６（配列番号９１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．４６（配列番号９２）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１３（配列番号８５）、もしくはＡＡＶ血清型ｒｈ．６４．Ｒ１（配列番号１０７）のカプシドを有し、またはカプシドは、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（Ａ２６９Ｓ置換（配列番号２６））、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（Ａ２９６Ｓ、４９８＿ＮＮＮ／ＡＡＡ＿５００、配列番号２７））、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）を含む、本明細書で開示されるカプシドの１つに対して挿入及び／または１つ以上のアミノ酸置換を有する操作されたカプシドである。（図７または表１０を参照されたい）。
カプシドタンパク質を含む組換えベクターが、その薬学的組成物、カプシドタンパク質をコードする核酸、ならびに標的眼組織に関連する眼障害への標的送達、改善された形質導入、及び／または治療のために眼標的化カプシドを有するカプシドタンパク質及びｒＡＡＶベクター作製方法及び使用方法とともに提供される。特に、ｒＡＡＶを含む組成物、及び虹彩、角膜、毛様体、シュレム管、線維柱帯、ＲＰＥ脈絡膜、網膜及び視神経を含む眼組織へのｒＡＡＶを標的化するためにカプシドタンパク質を使用し、眼の障害を治療するための治療剤の送達を容易にする方法が提供される。
他の実施形態において、眼科疾患治療薬である導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクター及びカプシドがＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドまたは本明細書に示される他のカプシドが、角膜、虹彩、水晶体毛様体、シュレム管、線維柱帯、網膜、ＲＰＥ脈絡膜、強膜、または視神経を含む、眼組織に対する向性を有する、眼疾患または障害を治療する方法が提供される。一実施形態において、眼疾患は、非感染性ブドウ膜炎である。一実施形態において、眼障害は、緑内障である。網膜などの標的組織を標的にするか、または標的組織上に向かうペプチド挿入物を含むｒＡＡＶを含む組成物、ならびにそれを使用する方法も提供される。
全体を通して使用されるように、ＡＡＶ「血清型」は、免疫学的に異なるカプシド、天然に存在するカプシド、または操作されたカプシドを有するＡＡＶを指す。
５．１．定義
用語「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」は、ウイルスのパルボウイルス属のウイルスであるＤｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓを指す。ＡＡＶは、天然に存在する「野生型」ウイルスに由来するＡＡＶ、天然に存在するｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来する及び／または天然に存在しないカプシドｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶであり得る。後者の例には、天然に存在するカプシドのアミノ酸配列内にペプチド挿入物を含むカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが含まれる。
用語「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」は、ウイルスのパルボウイルス属のウイルスであるＤｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓを指す。ＡＡＶは、天然に存在する「野生型」ウイルスに由来するＡＡＶ、天然に存在するｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来する及び／または天然に存在しないカプシドｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶであり得る。後者の例には、天然に存在するカプシドのアミノ酸配列内にペプチド挿入物を含むカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが含まれる。
用語「ｒＡＡＶ」は、「組換えＡＡＶ」を指す。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の一部または全てが異種配列で置換されているＡＡＶゲノムを有する。
用語「ｒｅｐ－ｃａｐヘルパープラスミド」は、ウイルスのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子機能を提供し、機能的ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子配列を欠くｒＡＡＶゲノムからのＡＡＶの産生を補助するプラスミドを指す。
用語「キャップ遺伝子」は、ウイルスのカプシドコートを形成するか、または形成するのを助けるカプシドタンパク質をコードする核酸配列を指す。ＡＡＶの場合、カプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３であり得る。
用語「ｒｅｐ遺伝子」は、ウイルスの複製及び生成に必要な非構造タンパク質をコードする核酸配列を指す。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」及び「ヌクレオチド配列」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の組み合わせまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡ分子のアナログが含まれる。そのようなアナログは、例えば、イノシンまたはトリチル化塩基を含むがこれらに限定されないヌクレオチドアナログを使用して生成され得る。そのようなアナログはまた、例えば、ヌクレアーゼ耐性または細胞膜を通過する能力の増加などの分子に有益な属性を与える改変された骨格を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含むことができる。核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であり得、一本鎖部分及び二本鎖部分の両方を含有し得、三本鎖部分を含有し得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
本明細書で使用される場合、用語「対象」、「宿主」、及び「患者」は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、対象は、哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サル及びヒト）、または所定の実施形態において、ヒトである。
本明細書で使用される場合、用語「治療剤」は、疾患または障害に関連する症状の治療、管理、または改善において使用され得る任意の薬剤であって、疾患または障害は、導入遺伝子によって提供される機能に関連するものを指す。本明細書で使用される場合、「予防的有効量」は、標的疾患または障害の予防または遅延において、それらに患う対象に投与したときに、標的疾患または障害の治療または管理に少なくとも１つの治療的利益を提供する薬剤の量（例えば、導入遺伝子によって発現される生成物の量）を指す。さらに、本発明の薬剤に関する治療的有効量は、単独での、または他の治療剤と組み合わせた場合の薬剤の量が、疾患または障害の処置または管理において少なくとも１つの治療的利益を提供することを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「予防剤」は、疾患または障害の進行の予防、遅延、また緩慢化において使用され得る任意の薬剤であって、疾患または障害は、導入遺伝子によって提供される機能に関連するものを指す。本明細書で使用される場合、「予防有効量」は、標的疾患または障害の予防または遅延において、それらに素因がある対象に投与したときに、少なくとも１つの予防的利益を提供する予防剤の量（例えば、導入遺伝子によって発現される生成物の量）を指す。予防的有効量はまた、標的疾患または障害の発生を予防もしくは遅延させる、または標的疾患もしくは障害の進行を減速させるのに十分な薬剤の量、標的疾患もしくは障害の発症を遅延または最小化するのに十分な量、またはそれらの再発もしくは広がりを予防もしくは遅延させるのに十分な量を指し得る。予防的有効量はまた、標的疾患または障害の症状の増悪を予防または遅延させるのに十分な薬剤の量を指し得る。さらに、本発明の予防剤に関する予防有効量は、単独での、または他の治療剤と組み合わせた場合の予防剤の量が、疾患または障害の予防または遅延において少なくとも１つの予防的利益を提供することを意味する。
本発明の予防剤は、標的疾患または障害の「素因がある」対象に投与され得る。疾患または障害の「素因がある」対象は、疾患または障害の発症に関連する症状を示すか、またはそのような疾患または障害の遺伝的構成、環境曝露、または他の危険因子を有するが、症状が疾患または障害として診断されるレベルにまだ達していない対象である。例えば、（導入遺伝子によって提供される）欠損遺伝子に関連する疾患の家族歴を有する患者は、それの素因があるものとして適する場合がある。さらに、原発性腫瘍の除去後に持続する休眠腫瘍を有する患者は、腫瘍の再発の素因があるものとして適格である場合がある。
本明細書で使用される場合、「中枢神経系」（「ＣＮＳ」）は、循環薬剤が血液脳関門を通過した後に到達する神経組織を指し、例えば、脳、視神経、脳神経、及び脊髄を含む。ＣＮＳにはまた、脊髄の中心管及び脳室を満たす脳脊髄液が含まれる。
全体を通して使用されるように、ＡＡＶ「血清型」は、免疫学的に異なるカプシド、天然に存在するカプシド、または操作されたカプシドを有するＡＡＶを指す。
５．２．眼標的化カプシド及びｒＡＡＶ
５．２．１ 眼組織への向性を有するＡＡＶカプシド
本明細書では、眼組織（角膜、虹彩、水晶体、毛様体、シュレム管、線維柱帯、網膜、ＲＰＥ脈絡膜、硬膜、または視神経を含む眼の前部または後部の特定の眼組織を含む）における形質導入及び導入遺伝子の発現のための向性を有するカプシドが同定される。網膜細胞は、アマクリン細胞、双極細胞、水平細胞、ミュラーグリア細胞、光受容細胞（例えば、桿体及び錐体）、網膜神経節細胞、網膜色素上皮など、特に、ヒト光受容細胞（例えば、ヒト桿体細胞及び／またはヒト錐体細胞）、ヒト水平細胞、ヒト双極細胞、ヒトアマクリン細胞、ならびにヒト網膜神経節細胞（例えば、ミジェット細胞、パラソル細胞、ｂｉｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ細胞、巨大網膜神経節細胞、感光性神経節細胞及び／またはミュラーグリア）、内境界膜内の内皮細胞及び／または外境界膜内のヒト網膜色素外皮細胞などを含む、網膜の中または近くに見られる細胞タイプの１つ以上を含む「網膜細胞」型であり得る。
５．２．１ 眼組織への向性を有するＡＡＶカプシド
本明細書では、眼組織（角膜、虹彩、水晶体、毛様体、シュレム管、線維柱帯、網膜、ＲＰＥ脈絡膜、硬膜、または視神経を含む眼の前部または後部の特定の眼組織を含む）における形質導入及び導入遺伝子の発現のための向性を有するカプシドが同定される。網膜細胞は、アマクリン細胞、双極細胞、水平細胞、ミュラーグリア細胞、光受容細胞（例えば、桿体及び錐体）、網膜神経節細胞、網膜色素上皮など、特に、ヒト光受容細胞（例えば、ヒト桿体細胞及び／またはヒト錐体細胞）、ヒト水平細胞、ヒト双極細胞、ヒトアマクリン細胞、ならびにヒト網膜神経節細胞（例えば、ミジェット細胞、パラソル細胞、ｂｉｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ細胞、巨大網膜神経節細胞、感光性神経節細胞及び／またはミュラーグリア）、内境界膜内の内皮細胞及び／または外境界膜内のヒト網膜色素外皮細胞などを含む、網膜の中または近くに見られる細胞タイプの１つ以上を含む「網膜細胞」型であり得る。
特定の実施形態において、導入遺伝子を眼組織に送達する方法、眼疾患の治療方法、及び眼治療剤をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶを含む医薬組成物が提供され、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１（配列番号５９）、ＡＡＶ血清型２（配列番号６０）、ＡＡＶ血清型３（配列番号６１）、ＡＡＶ血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）（配列番号７４）、ＡＡＶ血清型４（配列番号６２）、ＡＡＶ血清型５（配列番号６３）、ＡＡＶ血清型６（配列番号６４）、ＡＡＶ７カプシド（配列番号６５）、ＡＡＶ８カプシド（配列番号６６）、ＡＡＶ血清型９（配列番号６７）、ＡＡＶ血清型９ｅ（配列番号６８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ１０（配列番号６９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ２０（配列番号７０）、及びＡＡＶ血清型ｈｕ．３７（配列番号７１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ３９（配列番号７３）、ＡＡＶ血清型ｒｈ７３（配列番号７５）、ＡＡＶ血清型ｒｈ７４（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）（配列番号７６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）（配列番号７７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）（配列番号７８）、ＡＡＶ血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）（配列番号７９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．２４（配列番号８７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．３８（配列番号８８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．７２（配列番号８９）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．５６（配列番号８６）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．５（配列番号９０）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．６（配列番号９１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．４６（配列番号９２）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１３（配列番号８５）、もしくはＡＡＶ血清型ｒｈ６４（配列番号１０７）またはそれらの変異体（図７または表１０を参照されたい）のカプシドを有する。
特定の実施形態において、カプシドは、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドである。
特定のｒＡＡＶカプシドは、特定の眼組織に対する向性を有し、特定の眼組織を標的とするために使用され得る。実施形態において、ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドを有するｒＡＡＶは、虹彩、網膜、ＲＰＥ脈絡膜または強膜を標的とするように投与されてもよく、所定の実施形態において、毛様体、シュレム管、線維柱帯または視神経（眼窩及び／または頭蓋部）を標的とするように投与されてもよい。実施形態において、ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドを有するｒＡＡＶは、網膜及び／またはＲＰＥ脈絡膜組織を標的にするために使用され得る。他の実施形態において、ＡＡＶｒｈ．７３カプシドを有するｒＡＡＶは、虹彩組織を標的にするために使用されてもよく、他の実施形態において、ＡＡＶｈｕ．２６カプシドは、毛様体または線維柱帯を標的にするために使用されてもよい。ＡＡＶ１カプシドは、線維柱帯、または強膜を標的にするために使用されてもよく、ＡＡＶ７は、線維柱帯を標的にするために使用されてもよい。
本明細書に記載の眼組織標的化カプシドを有するｒＡＡＶ粒子は、参照カプシド、例えばＡＡＶ２、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９カプシドを有する参照ｒＡＡＶ粒子と比較して、眼組織における標的化、形質導入、ゲノム組み込み、導入遺伝子ｍＲＮＡ転写、及び／または導入遺伝子発現が増強している。増強は、眼組織全体内であってもよく、または具体的には、前部組織、後部組織、または視神経であってもよい。実施形態において、増強は、虹彩、網膜、ＲＰＥ脈絡膜、硬膜、毛様体、シュレム管、線維柱帯、または視神経にある。強化は、当該技術分野で知られているように、例えば本明細書の実施例１５～１８によって評価され得る。実施形態において、眼組織標的化カプシドを有するｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９であり得る参照ＡＡＶカプシドと比較して、標的組織において少なくとも１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きな形質導入または遺伝子コピーを示し、標的組織は、眼組織、前眼組織、後眼組織、虹彩、網膜、ＲＰＥ脈絡膜、強膜、毛様体、シュレム管、線維柱帯、または視神経である。実施形態において、眼組織標的化カプシドを有するｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９であり得る、参照ＡＡＶカプシド由来の導入遺伝子ＲＮＡまたはタンパク質の存在量と比較して、標的組織において少なくとも１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい導入遺伝子ｍＲＮＡまたは導入遺伝子タンパク質発現を示し、標的組織は、眼組織、前眼組織、後眼組織、虹彩、網膜、ＲＰＥ脈絡膜、強膜、毛様体、シュレム管、線維柱帯、または視神経である
５．２．２ ペプチド挿入を有する操作されたｒＡＡＶベクター
別の態様は、強化された形質導入、ＡＡＶゲノムコピーの存在量もしくは組み込み、導入遺伝子ｍＲＮＡレベル、または導入遺伝子タンパク質発現を含む、眼細胞ホーミング特性を付与または増強するためにペプチド及び／または１つ以上のアミノ酸置換の挿入によって改変されるカプシドタンパク質を含むカプシドタンパク質、及びｒＡＡＶ粒子に関する。改変されたカプシドは、アマクリン細胞、双極細胞、水平細胞、ミュラーグリア細胞、光受容細胞（例えば、桿体及び錐体）、網膜神経節細胞、網膜色素上皮などを含む網膜の細胞、特に、ヒト光受容細胞（例えば、ヒト桿体細胞及び／またはヒト錐体細胞）、ヒト水平細胞、ヒト双極細胞、ヒトアマクリン細胞、ならびにヒト網膜神経節細胞（例えば、ミジェット細胞、パラソル細胞、ｂｉｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ細胞、巨大網膜神経節細胞、感光性神経節細胞及び／またはミュラーグリア）、内境界膜内の内皮細胞及び／または外境界膜内のヒト網膜色素外皮細胞を標的化する。改変されたカプシドは、虹彩、角膜、毛様体、シュレム管、線維柱帯などの前部組織、ならびに網膜またはＲＰＥ脈絡膜及び視神経などの後部組織を含む、他の眼組織を標的にし得る。
別の態様は、強化された形質導入、ＡＡＶゲノムコピーの存在量もしくは組み込み、導入遺伝子ｍＲＮＡレベル、または導入遺伝子タンパク質発現を含む、眼細胞ホーミング特性を付与または増強するためにペプチド及び／または１つ以上のアミノ酸置換の挿入によって改変されるカプシドタンパク質を含むカプシドタンパク質、及びｒＡＡＶ粒子に関する。改変されたカプシドは、アマクリン細胞、双極細胞、水平細胞、ミュラーグリア細胞、光受容細胞（例えば、桿体及び錐体）、網膜神経節細胞、網膜色素上皮などを含む網膜の細胞、特に、ヒト光受容細胞（例えば、ヒト桿体細胞及び／またはヒト錐体細胞）、ヒト水平細胞、ヒト双極細胞、ヒトアマクリン細胞、ならびにヒト網膜神経節細胞（例えば、ミジェット細胞、パラソル細胞、ｂｉｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ細胞、巨大網膜神経節細胞、感光性神経節細胞及び／またはミュラーグリア）、内境界膜内の内皮細胞及び／または外境界膜内のヒト網膜色素外皮細胞を標的化する。改変されたカプシドは、虹彩、角膜、毛様体、シュレム管、線維柱帯などの前部組織、ならびに網膜またはＲＰＥ脈絡膜及び視神経などの後部組織を含む、他の眼組織を標的にし得る。
実施形態において、表１０に列挙されるか、または本明細書に記載されるように、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（Ａ２６９Ｓ置換（配列番号２６））、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（Ａ２９６Ｓ、４９８ ＮＮＮ／ＡＡＡ ５００、配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列におけるＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列におけるＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照）、ＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列におけるＹ６Ｆ、番号付けについては図７を参照）を含む、改変カプシド、及びカプシドを含むｒＡＡＶ粒子が提供される。
特定の実施形態において、眼組織を標的化するためのペプチド挿入物は、ＲＴＩＧＰＳＶ（配列番号１２）の少なくとも４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続するアミノ酸であるか、または４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続するアミノ酸からなる。特に関心のある一実施形態において、ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＲＴＩＧＰＳＶ（配列番号１２）を含むか、またはそれらからなる。
１つの態様は、眼組織細胞を標的にするように操作されたカプシドタンパク質である、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のカプシドタンパク質に関する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ペプチド挿入物を含むことができ、ペプチド挿入物は、ＡＡＶ粒子としてパッケージングされたときに表面に曝露される。例えば、ペプチド挿入物は、ＲＴＩＧＰＳＶ（配列番号１２）またはＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）、または任意の他のペプチド、例えば、配列番号１～２０を含む表５のペプチドなど、ＲＴＩＧＰＳＶ（配列番号１２）またはＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）の少なくとも４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の連続アミノ酸、または配列番号１～２０の任意の他のペプチドからなる任意の他のペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチド挿入は、ＡＡＶ９（配列番号１１８）カプシドの可変領域ＩＶ（ＶＲ ＩＶ）、または別のタイプのＡＡＶカプシド、特にＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶｒｈ７３、ＡＡＶ．ｈｕ．２６、ＡＡＶｈｕ．５１、またはＡＡＶｒｈ６４Ｒ１の対応する領域内（すなわち、任意のカプシドアミノ酸を欠失させることのない２つのアミノ酸間）に生じる（表１０及び図７のアライメントを参照）。いくつかの実施形態において、ペプチド挿入は、ＡＡＶ９カプシドの可変領域ＶＩＩＩ（ＶＲ－ＶＩＩＩ）、または別のＡＡＶタイプのカプシドの対応する領域内で（すなわち、任意のカプシドアミノ酸を欠失させることのない２つのアミノ酸間）生じる（図７の例示的なアライメントを参照されたい）。
様々な実施形態において、ｒＡＡＶカプシド及び／または挿入ペプチドは、ｒＡＡＶ粒子を標的組織、より具体的には、前部組織または後部組織を含む眼に向け、及び／またはｒＡＡＶ取り込み、形質導入及び／またはゲノム組み込みを促進する。操作されたカプシドタンパク質及びそのバリアントをコードする核酸、ｒＡＡＶベクターを生成するための核酸を発現するためのパッケージング細胞、導入遺伝子をさらに含むｒＡＡＶベクター、及びｒＡＡＶベクターの薬学的組成物、ならびに導入遺伝子を、それを必要とする対象の標的細胞タイプまたは標的組織に送達するためにｒＡＡＶベクターを使用する方法も提供される。
様々な実施形態において、ｒＡＡＶカプシドは、眼組織、または例えば、標的組織内などの１つ以上の特定の細胞型、またはその細胞マトリックスの形質導入を特異的に認識及び／または促進する。特に、カプシドは、虹彩、角膜、毛様体、シュレム管、線維柱帯、ＲＰＥ脈絡膜、及び視神経、特に網膜を含む眼組織にｒＡＡＶを標的化する。
ＡＡＶ９カプシドＶＲ－ＩＶループ（図２を参照）内及びその付近でペプチド挿入に適した位置に挿入されたペプチドを有するカプシド、及び他のＡＡＶ型のカプシドのＶＲ－ＩＶループ上の対応する領域が提供される。以前の研究では、様々なＡＡＶにおける潜在的な位置を分析したが、ＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶがこの目的のために適合可能であることを特定した研究はなかった（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，２０００，“Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２（ＡＡＶ２）Ｃａｐｓｉｄ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ２ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｔｒｏｐｉｓｍ，”Ｊ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（１８）：８６３５－８６４７、Ｌｏｃｈｒｉｅ ｅｔ ａｌ，２００６，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｄｅｆｉｎｅ ｔｗｏ ｎｅｗ ＡＡＶ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｓｔａｎｔｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＡＡＶ－５，”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５３：６８－８２、Ｓｈｉ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ，２００３、“ＲＧＤ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ ＶＰ３ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２（ＡＡＶ２）－Ｂａｓｅｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ａ Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７（４）：５１５５２５－、Ｎｉｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＡＡＶ２－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ４（２）：１７４－１８１、Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，“Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３（６）：９６４－９７５、Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．１９９９，“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃａｐｓｉｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｌｌｏｗ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２，”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３（９）：１０５２－１０５６、Ｄｏｕａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，“Ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄ，“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０９：２０３－２０８、及びＰｏｎｎａｚｈａｇａｎ，ｅｔ ａｌ．２００１，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９）：９４９３－９５０１を考慮されたい）。
したがって、ＲＴＩＧＰＳＶ（配列番号１２）、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号８）またはＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）または他のペプチド、例えば、挿入点での配列番号１～２０ペプチド挿入物、特に、カプシドコートの表面曝露可変領域内、特にカプシドタンパク質の可変領域ＩＶ内またはその付近でのペプチド挿入物を担持するｒＡＡＶベクターが提供される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸４５１～４６１（アミノ酸配列配列番号６７、及び他のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質アミノ酸配列とＡＡＶ９カプシドのアミノ酸配列とのアライメントについては図７を参照されたい）のうちの１つに対応するアミノ酸残基の直後の（すなわち、そのＣ末端に対するペプチド結合によって接続された）ペプチド挿入物を含み、上記ペプチド挿入物は、カプシドタンパク質がＡＡＶ粒子としてパッケージングされたときに表面に露出される。例えば、特定の実施形態において、ＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質は、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号７４）のアミノ酸４４９～４５９またはＡＡＶｒｈ７３カプシドタンパク質（配列番号７５）のアミノ酸４５２～４６１のうちの１つに対応するアミノ酸残基の直後（すなわち、ペプチド結合Ｃ末端によって結合された）のＲＴＩＧＰＳＶ（配列番号１２）ペプチド挿入物を含み、カプシドタンパク質がＡＡＶ粒子としてパッケージ化されると、前記ペプチド挿入物が表面に露出される。ペプチド挿入は、ＡＡＶカプシドタンパク質のいかなる残基も欠失させてはならない。通常、ペプチド挿入は、他の血清型と比較して、そのカプシドタンパク質の可変（保存性が低い）領域において、及び表面露出ループにおいて起こる。
所与の部位「で」挿入されるものとして記載されるペプチド挿入は、野生型ウイルスにおいてその部位で通常見られる残基のカルボキシキ基のペプチド結合を有する直後での（すなわち、そのカルボキシ基に対するペプチド結合を有する）挿入を指す。例えば、ＡＡＶ９中のＱ５８８での挿入は、ペプチド挿入が、ＡＡＶ９野生型カプシドタンパク質配列（配列番号６７）中のＱ５８８と連続するアミノ酸（Ａ５８９）との間に現れることを意味する。実施形態において、挿入点においてまたはその近くで（５、１０、１５残基内または挿入の部位である構造ループ内で）アミノ酸残基の欠失は存在しない。特定の実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ７３カプシドタンパク質であり、挿入は、それぞれ、アミノ酸残基４４９～４５９または４５１～４６１のうちの少なくとも１つの直後に生じる。特定の実施形態において、ペプチド挿入は、ＡＡＶ３Ｂカプシドのアミノ酸残基Ｑ４４９、Ｇ４５０、Ｔ４５１、Ｔ４５２、Ｓ４５３、Ｇ４５４、Ｔ４５５、Ｔ４５６、Ｎ４５７、Ｑ４５８、またはＳ４５９、またはＡＡＶｒｈ７３カプシドのＱ４５２、Ｓ４５３、Ｔ４５４、Ｇ４５５、Ｇ４５６、Ｔ４５７、Ａ４５８、Ｇ４５９、Ｔ４６０、またはＱ４６１の直後で起こる。所定の実施形態において、ペプチドは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の残基Ｓ４５４とＧ４５５の間、ＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質の残基Ｇ４５４とＴ４５５の間、ＡＡＶｒｈ７３の残基Ｇ４５７とＴ４５８の間、またはＡＡＶ９カプシドタンパク質（アミノ酸配列番号６７）以外のＡＡＶカプシドタンパク質のＳ４５４とＧ４５５に対応する残基の間に挿入される。他の実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４、バージョン１及び２）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）（図７参照）から選択される少なくとも１つのＡＡＶ血清型からのものであり、挿入は、ＡＡＶ９のアミノ酸残基４５１～４６１の少なくとも１つに対応するアミノ酸残基の直後に起こる。これらの異なるＡＡＶ血清型のアライメントは、図７に示されているように、異なるカプシドアミノ酸配列における「対応する」アミノ酸残基を示し、したがって、「対応する」アミノ酸残基は、アライメントで参照配列における残基と同じ位置に並べられている。いくつかの特定の実施形態において、ペプチド挿入は、図７に示した配列中、ＡＡＶ１カプシド（配列番号５９）の４５０～４５９、ＡＡＶ２カプシド（配列番号６０）の４４９～４５８、ＡＡＶ３カプシド（配列番号６１）の４４９～４５９、ＡＡＶ３Ｂカプシド（配列番号７４）の４４９～４５９、ＡＡＶ４カプシド（配列番号６２）の４４３～４５３、ＡＡＶ５カプシド（配列番号６３）の４４２～４４５、ＡＡＶ６カプシド（配列番号６４）の４５０～４５９、ＡＡＶ７カプシド（配列番号６５）の４５１～４６１、ＡＡＶ８カプシド（配列番号６６）の４５１～４６１、ＡＡＶ９カプシドの４５１～４６１（配列番号６７）、ＡＡＶ９ｅカプシドの４５２～４６１（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ１０カプシドの４５２～４６１（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ２０カプシドの４５２～４６１（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７の４５２～４６１（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ７３の４５２～４６１、ＡＡＶｒｈ７４の４５２～４６１（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｒｈ３９の４５２～４６１（配列番号７３）、ＡＡＶｈｕ１２の４４９～４５８（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ２１の４４９～４５８（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ２６の４４９～４５８（配列番号７９））、またはＡＡＶｈｕ５１の４４９～４５８（配列番号７６）内のアミノ酸残基の１つの直後に起こる。所定の実施形態において、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８（すなわち、Ｃ末端から）の直後にペプチド挿入（配列番号６７のアミノ酸配列を有し、図７を参照）を含み、カプシドタンパク質がＡＡＶ粒子としてパッケージ化されると、上記ペプチド挿入物が表面に露出する。特定の実施形態において、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、特に、ＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質のアミノ酸５８８の直後またはＡＡＶｒｈ７３カプシドタンパク質のアミノ酸５９０の直後にペプチド挿入物、特にＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）を有する。他の実施形態において、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８の直後ではない、またはＡＡＶ９のアミノ酸５８８に対応するものではないペプチド挿入物を有する。
他の実施形態において、ペプチドが、ＲＴＩＧＰＳＶ（配列番号１２）の少なくとも４つの連続アミノ酸または少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む標的ペプチドであるか、または正確に１０個の連続アミノ酸またはその機能的断片である場合、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４、バージョン１及び２）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）（図７を参照されたい）、から選択される少なくとも１つのＡＡＶ型に由来し、ペプチドがＡＡＶベクターに取り込まれたときに表面露出される任意の点においてカプシドタンパク質に挿入される。特定の実施形態において、ペプチドは、ＡＡＶ１カプシド（配列番号５９）の１３８、２６２～２７２、４５０～４５９、または５８５～５９３、ＡＡＶ２カプシド（配列番号６０）の１３８、２６２～２７２、４４９～４５８、または５８４～５９２、ＡＡＶ３カプシド（配列番号６１）の１３８、２６２～２７２、４４９～４５９、または５８５～５９３、ＡＡＶ３Ｂカプシド（配列番号７４）の１３８、２６２～２７２、４４９～４５９、または５８５～５９３、ＡＡＶ４カプシド（配列番号６２）の１３７、２５６～２６２、４４３～４５３、または５８３～５９１、ＡＡＶ５カプシド（配列番号６３）の１３７、２５２～２６２、４４２～４４５、または５７４～５８２、ＡＡＶ６カプシド（配列番号６４）の１３８、２６２～２７２、４５０～４５９、５８５～５９３、ＡＡＶ７カプシド（配列番号６５）の１３８、２６３～２７３、４５１～４６１、５８６～５９４、ＡＡＶ８カプシド（配列番号６６）の１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、ＡＡＶ９カプシド（配列番号６７）の１３８、２６２～２７３、４５２～４６１、５８５～５９３、ＡＡＶ９ｅカプシド（配列番号６８）の１３８、２６２～２７３、４５２～４６１、５８５～５９３、ＡＡＶｒｈ１０カプシド（配列番号６９）の１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、ＡＡＶｒｈ２０カプシド（配列番号７０）の１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、ＡＡＶｒｈ７３カプシド（配列番号７５）の１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、ＡＡＶｒｈ７４カプシド（配列番号７２または配列番号９６）の１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、ＡＡＶｈｕ３７カプシド（配列番号７１）の１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、ＡＡＶｒｈ３９カプシド（配列番号７３４）の１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、ＡＡＶｈｕ１２カプシド（配列番号７８）の１３８、２６４～２７１、４４９～４５８、５８４～５９２、ＡＡＶｈｕ２１カプシド（配列番号７７）の４４９～４５８、５８４～５９２、ＡＡＶｈｕ２６カプシド（配列番号７９）の４４９～４５８、５８４～５９２、及びＡＡＶｈｕ５１カプシド（配列番号７６）の４４９～４５８、５８４～５９２、の後に挿入される（図７で番号付けされるように）。
いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、血清型ＡＡＶ２以外のＡＡＶからのものである。いくつかの実施形態において、ペプチド挿入は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸５７０または６１１に対応するアミノ酸残基の直後に存在しない。いくつかの実施形態において、ペプチド挿入は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸５８７～５８８に対応するアミノ酸残基の間に存在しない（ＳｃｈａｆｆｅｒらのＵＳ２０１４／０２９４７７１を参照）。
操作されたカプシドを含むＡＡＶベクターも提供される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、非複製性であり、ｒｅｐまたはｃａｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない（これらは、ｒＡＡＶベクターの製造においてパッケージング細胞によって供給される）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶの１つ以上の血清型からの成分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７３、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ．２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６もしくは他のｒＡＡＶ粒子、またはそれらの２つ以上の組み合わせのうちの１つ以上からのカプシド成分を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７３、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ．２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６または他のｒＡＡＶ粒子、またはそれらの２つ以上の血清型を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７３、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ．２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはそれらの誘導体、改変物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型の例えばＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同じ、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、つまり最大１００％同じカプシドタンパク質を含む。これらの操作されたＡＡＶベクターは、治療タンパク質をコードする導入遺伝子を含むゲノムを含み得る。
特定の実施形態において、本明細書における組成物及び方法において使用するための組換えＡＡＶは、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８を参照されたい）。特定の実施形態において、本明細書における組成物及び方法において使用するための組換えＡＡＶは、ＡＡＶ．７ｍ８である（そのバリアントを含む）（例えば、それらの各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ９，１９３，９５６、ＵＳ９，４５８，５１７、ＵＳ９，５８７，２８２、ＵＳ２０１６／０３７６３２３、及びＷＯ２０１８／０７５７９８を参照されたい）。特定の実施形態において、本明細書における組成物及び方法において使用するためのＡＡＶは、ＵＳ９，５８５，９７１に開示されている任意のＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂである。特定の実施形態において、本明細書における組成物及び方法において使用するためのＡＡＶは、ＡＡＶ８及び血清型ｃｙ５、ｒｈ２０またはｒｈ３９に由来するハイブリッドカプシド配列を有するＡＡＶ２／Ｒｅｃ２またはＡＡＶ２／Ｒｅｃ３ベクターである（これらのベクターについて、参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（４）：ｅ６０３６１を参照されたい）。特定の実施形態において、本明細書の組成物及び方法で使用するためのＡＡＶは、以下のいずれかに開示されているＡＡＶであり、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：ＵＳ７，２８２，１９９、ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ８，５２４，４４６、ＵＳ８，９９９，６７８、ＵＳ８，６２８，９６６、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ８，７３４，８０９、ＵＳ９，２８４，３５７、ＵＳ９，４０９，９５３、ＵＳ９，１６９，２９９、ＵＳ９，１９３，９５６、ＵＳ９，４５８，５１７、ＵＳ９，５８７，２８２、ＵＳ２０１５／０３７４８０３、ＵＳ２０１５／０１２６５８８、ＵＳ２０１７／００６７９０８、ＵＳ２０１３／０２２４８３６、ＵＳ２０１６／０２１５０２４、ＵＳ２０１７／００５１２５７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９、及びＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願のいずれかに開示されるＡＡＶカプシドの、ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同じ、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、つまり最大１００％同じカプシドタンパク質を有し、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：米国特許第７，２８２，１９９号、同第７，９０６，１１１号、同第８，５２４，４４６号、同第８，９９９，６７８号、同第８，６２８，９６６号、同第８，９２７，５１４号、同第８，７３４，８０９号、ＵＳ９，２８４，３５７、９，４０９，９５３、９，１６９，２９９、９，１９３，９５６、９，４５８，５１７、及び９，５８７，２８２、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、同第２０１５／０１２６５８８号、同第２０１７／００６７９０８号、同第２０１３／０２２４８３６号、同第２０１６／０２１５０２４号、同第２０１７／００５１２５７号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３に開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１を含む（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ ｒｈ．７４などのＷＯ２０１４／１７２６６９に開示されている任意のＡＡＶカプシド（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０に記載されている、ＡＡＶ２／５のカプシド（それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２ｔＹＦなどのＷＯ２０１７／０７０４９１に開示されている任意のＡＡＶカプシド（それらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２９（９）：４１８に記載されているＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシド（それらはその全体が参照により組み込まれる）を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ９，９２３，１２０及びＷＯ２０１６／０４９２３０に開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６（それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１公開の配列番号２を参照されたい）、ＷＯ２００５／０３３３２１（例えば、’３２１公開の配列番号１２３及び８８を参照されたい）、ＷＯ０３／０４２３９７（例えば、’３９７公開の配列番号２、８１、８５、及び９７を参照されたい）、ＷＯ２００６／０６８８８８（例えば、’８８８公開の配列番号１及び３～６を参照されたい）、ＷＯ２００６／１１０６８９，（例えば、’６８９公開の配列番号５～３８を参照されたい）、ＷＯ２００９／１０４９６４（例えば、’９６４公開の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１を参照されたい）、ＷＯ２０１０／１２７０９７（例えば、’０９７公開の配列番号５～３８を参照されたい）、及びＷＯ２０１５／１９１５０８（例えば、’５０８公開の配列番号８０～２９４を参照されたい）、ならびに米国出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、’９２４公開の配列番号１、５～１０を参照されたい）（それらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）に開示されたカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１公開の配列番号２を参照されたい）、ＷＯ２００５／０３３３２１（例えば、’３２１公開の配列番号１２３及び８８を参照されたい）、ＷＯ０３／０４２３９７（例えば、’３９７公開の配列番号２、８１、８５、及び９７を参照されたい）、ＷＯ２００６／０６８８８８（例えば、’８８８公開の配列番号１及び３～６を参照されたい）、ＷＯ２００６／１１０６８９，（例えば、’６８９公開の配列番号５～３８を参照されたい）、ＷＯ２００９／１０４９６４（例えば、’９６４公開の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１を参照されたい）、ＷＯ２０１０／１２７０９７（例えば、’０９７公開の配列番号５～３８を参照されたい）、及びＷＯ２０１５／１９１５０８（例えば、’５０８公開の配列番号８０～２９４を参照されたい）、ならびに米国出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、’９２４公開の配列番号１、５～１０を参照されたい）に開示されるＡＡＶカプシドの、例えばＶＰ１，ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して少なくとも８０％以上同じ、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、つまり最大１００％同じカプシドタンパク質を有する。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプ化ＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプ化ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ化ＡＡＶカプシドである。シュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子の製造及び使用方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照されたい。
所定の実施形態において、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）が使用され得る。所定の実施形態において、自己相補的ベクター、例えば、ｓｃＡＡＶを使用してもよい（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８（１６）：１２４８－１２５４、ＵＳ６，５９６，５３５、ＵＳ７，１２５，７１７、及びＵＳ７，４５６，６８３を参照されたい。その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
通常、ペプチド挿入物は、異種タンパク質またはそのドメインからの連続アミノ酸の配列である。挿入されるペプチドは、典型的には、それが由来するタンパク質またはドメインの特定の生物学的機能、特性、または特徴を保持するのに十分なほど長い。挿入されるペプチドは、典型的には、挿入物を有さないネイティブカプシドタンパク質と類似してまたは実質的に類似して、カプシドタンパク質がコートを形成することが可能となるように十分に短い。好ましい実施形態において、ペプチド挿入物は、約４～約３０アミノ酸残基長、長さが約４～約２０、約４～約１５、約５～約１０、または約７アミノ酸長である。挿入のためのペプチド配列は、少なくとも４アミノ酸長であり、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態において、ペプチド配列は、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。実施形態において、ペプチドは、７アミノ酸長以下、１０アミノ酸長または１２アミノ酸長以下である。
ＡＡＶカプシドタンパク質における「異種タンパク質からのペプチド挿入物」は、カプシドタンパク質に導入されており、かつ任意のＡＡＶ血清型カプシドに対してネイティブではないアミノ酸配列を指す。非限定的な例には、ＡＡＶカプシドタンパク質におけるヒトタンパク質のペプチドが含まれる。
本発明者らはまた、驚くべきことに、特定の組織、器官、または細胞にＡＡＶベクターを再標的化するために使用され得る特定のペプチド、特に、ｒＡＡＶベクターを眼組織に標的化させるペプチドを提供するために使用され得る特定のペプチドを発見した。いずれか１つの理論に束縛されることなく、ＡＡＶカプシド可変領域ループに挿入されるペプチド、例えば、ＲＴＩＧＰＳＶ（配列番号１２）ペプチドが、眼組織における形質導入効率を向上させることが実証された。そのようなペプチドは、内皮細胞マトリックスを横断して導入遺伝子をカプセル化するＡＡＶ粒子の強化された輸送を提供することができる。
以下は、以下に記載されるＡＡＶカプシドのアミノ酸残基の直後に、本明細書に記載されるペプチドの挿入部位を要約する（再度、図７を参照されたい）：
ＡＡＶ１：１３８、２６２～２７２、４５０～４５９、５９５～５９３、及び特定の実施形態において、４５３～４５４の間（配列番号５９）．
ＡＡＶ２：１３８、２６２～２７２、４４９～４５８、５８４～５９２、及び特定の実施形態において、４５２～４５３の間（配列番号６０）．
ＡＡＶ３：１３８、２６２～２７２、４４９～４５９、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５２～４５３の間（配列番号６１）．
ＡＡＶ３Ｂ：１３８、２６２～２７２、４４９～４５９、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５２～４５３の間（配列番号７４）．
ＡＡＶ４：１３７、２５６～２６２、４４３～４５３、５８３～５９１、及び特定の実施形態において、４４６～４４７の間（配列番号６２）．
ＡＡＶ５：１３７、２５２～２６２、４４２～４４５、５７４～５８２、及び特定の実施形態において、４４５～４４６の間（配列番号６３）．
ＡＡＶ６：１３８、２６２～２７２、４５０～４５９、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５２～４５３の間（配列番号６４）．
ＡＡＶ７：１３８、２６３～２７３、４５１～４６１、５８６～５９４、及び特定の実施形態において、４５３～４５４の間（配列番号６５）．
ＡＡＶ８：１３８、２６３～２７４、４５１～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５３～４５４の間（配列番号６６）．
ＡＡＶ９：１３８、２６２～２７３、４５２～４６１、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号６７）．
ＡＡＶ９ｅ：１３８、２６２～２７３、４５２～４６１、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号６８）．
ＡＡＶｒｈ１０：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号６９）．
ＡＡＶｒｈ２０：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号７０）．
ＡＡＶｒｈ３９：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号７３）．
ＡＡＶ．ｈｕ１２：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８４～５９５
ＡＡＶ．ｈｕ２１：１３８、２６４～２７１、４４９～４５８、５８４～５９２
ＡＡＶ．ｈｕ２６：１３８、２６４～２７１、４４９～４５８、５８４～５９２
ＡＡＶ．ｈｕ５１：１３８、２６４～２７１、４４９～４５８、５８４～５９２
ＡＡＶｒｈ７３：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５６～４５７の間（配列番号７５
ＡＡＶｒｈ７４：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号１２３または配列番号１４４）．
ＡＡＶｈｕ．３７：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号１２２）
ＡＡＶ１：１３８、２６２～２７２、４５０～４５９、５９５～５９３、及び特定の実施形態において、４５３～４５４の間（配列番号５９）．
ＡＡＶ２：１３８、２６２～２７２、４４９～４５８、５８４～５９２、及び特定の実施形態において、４５２～４５３の間（配列番号６０）．
ＡＡＶ３：１３８、２６２～２７２、４４９～４５９、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５２～４５３の間（配列番号６１）．
ＡＡＶ３Ｂ：１３８、２６２～２７２、４４９～４５９、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５２～４５３の間（配列番号７４）．
ＡＡＶ４：１３７、２５６～２６２、４４３～４５３、５８３～５９１、及び特定の実施形態において、４４６～４４７の間（配列番号６２）．
ＡＡＶ５：１３７、２５２～２６２、４４２～４４５、５７４～５８２、及び特定の実施形態において、４４５～４４６の間（配列番号６３）．
ＡＡＶ６：１３８、２６２～２７２、４５０～４５９、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５２～４５３の間（配列番号６４）．
ＡＡＶ７：１３８、２６３～２７３、４５１～４６１、５８６～５９４、及び特定の実施形態において、４５３～４５４の間（配列番号６５）．
ＡＡＶ８：１３８、２６３～２７４、４５１～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５３～４５４の間（配列番号６６）．
ＡＡＶ９：１３８、２６２～２７３、４５２～４６１、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号６７）．
ＡＡＶ９ｅ：１３８、２６２～２７３、４５２～４６１、５８５～５９３、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号６８）．
ＡＡＶｒｈ１０：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号６９）．
ＡＡＶｒｈ２０：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号７０）．
ＡＡＶｒｈ３９：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号７３）．
ＡＡＶ．ｈｕ１２：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８４～５９５
ＡＡＶ．ｈｕ２１：１３８、２６４～２７１、４４９～４５８、５８４～５９２
ＡＡＶ．ｈｕ２６：１３８、２６４～２７１、４４９～４５８、５８４～５９２
ＡＡＶ．ｈｕ５１：１３８、２６４～２７１、４４９～４５８、５８４～５９２
ＡＡＶｒｈ７３：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５６～４５７の間（配列番号７５
ＡＡＶｒｈ７４：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号１２３または配列番号１４４）．
ＡＡＶｈｕ．３７：１３８、２６３～２７４、４５２～４６１、５８７～５９５、及び特定の実施形態において、４５４～４５５の間（配列番号１２２）
特定の実施形態において、ペプチド挿入は、ＡＡＶ９カプシドのアミノ酸残基５８８～５８９の間、またはアミノ酸配列アライメントによって決定される別のＡＡＶ型カプシドの対応する残基の間に起こる（例えば、図７のように）。特定の実施形態において、ペプチド挿入は、ＡＡＶ９カプシド配列のアミノ酸残基Ｉ４５１～Ｌ４６１、Ｓ２６８、及びＱ５８８の直後、または別のＡＡＶカプシド配列の対応する残基の直後に起こる（図７）。
いくつかの実施形態において、１つ以上のホーミングドメインからの１つ以上のペプチド挿入物は、単一システムにおいて使用され得る。いくつかの実施形態において、カプシドは、対象の免疫系、例えば、対象における既存の抗体の回避によってＡＡＶ粒子の認識を減少させるように選択及び／またはさらに改変され得る。いくつかの実施形態において。いくつかの実施形態において、カプシドは、所望の向性／標的化を向上させるように選択及び／またはさらに改変され得る。
５．３．ｒＡＡＶ分子を作製する方法
本発明の別の態様は、本明細書に開示される分子を作製することを含む。いくつかの実施形態において、本発明による分子は、本明細書のカプシドタンパク質分子のいずれかをコードする核酸配列を含むヌクレオチドを準備すること、カプシドタンパク質から構成されるカプシドコートを有する対応するｒＡＡＶ粒子を調製するためのパッケージング細胞システムを使用することと、によって作製される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載のカプシドタンパク質分子の配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する配列をコードし、カプシドタンパク質の生物学的機能を保持（または実質的に保持）する（いくつかの実施形態において、異種タンパク質またはそのドメインから挿入されたペプチドを有するものを含む）。いくつかの実施形態において、核酸は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の生物学的機能を保持（または実質的に保持）しながら、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の配列（配列番号６７及び図７を参照されたい）に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、核酸は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の生物学的機能を維持しつつ（または実質的に維持しつつ）、ＡＡＶ１カプシドタンパク質（配列番号５９）、ＡＡＶ２カプシドタンパク質（配列番号６０）、ＡＡＶ３カプシドタンパク質（配列番号６１）、ＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質（配列番号７４）、ＡＡＶ４カプシドタンパク質（配列番号６２）、ＡＡＶ５カプシドタンパク質（配列番号６３）、ＡＡＶ６カプシドタンパク質（配列番号６４）、ＡＡＶ７カプシドタンパク質（配列番号６５）、ＡＡＶ８カプシドタンパク質（配列番号６６）、ＡＡＶ９ｅカプシドタンパク質（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ．２０カプシドタンパク質（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７カプシドタンパク質（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ３９カプシドタンパク質（配列番号７３）、ＡＡＶｒｈ７３カプシドタンパク質（配列番号７５）、ＡＡＶｒｈ．７４カプシドタンパク質（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｈｕ．５１カプシドタンパク質（配列番号７６）、ＡＡＶｈｕ．２１カプシドタンパク質（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ．１２カプシドタンパク質（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ．２６カプシドタンパク質（配列番号７９）、ＡＡＶｒｈ．２４カプシドタンパク質（配列番号８７）、ＡＡＶｈｕ．３８カプシドタンパク質（配列番号８８）、ＡＡＶｒｈ．７２カプシドタンパク質（配列番号８９）、ＡＡＶｈｕ．５６カプシドタンパク質（配列番号８６）、ＡＡＶｃｙ．５カプシドタンパク質（配列番号９０）、ＡＡＶｃｙ．６カプシドタンパク質（配列番号９１）、ＡＡＶｒｈ．４６カプシドタンパク質（配列番号９２）、ＡＡＶｒｈ．１３カプシドタンパク質（配列番号８５）、ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１カプシドタンパク質（配列番号１０７）、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３カプシドタンパク質（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢカプシドタンパク質（配列番号２６）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤカプシドタンパク質（配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆカプシドタンパク質（配列番号６６アミノ酸配列におけるＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆカプシドタンパク質（配列番号６７のアミノ酸配列におけるＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、またはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆカプシドタンパク質（配列番号６６のアミノ酸配列におけるＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）の配列に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する配列をコードする。
本発明の別の態様は、本明細書に開示される分子を作製することを含む。いくつかの実施形態において、本発明による分子は、本明細書のカプシドタンパク質分子のいずれかをコードする核酸配列を含むヌクレオチドを準備すること、カプシドタンパク質から構成されるカプシドコートを有する対応するｒＡＡＶ粒子を調製するためのパッケージング細胞システムを使用することと、によって作製される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載のカプシドタンパク質分子の配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する配列をコードし、カプシドタンパク質の生物学的機能を保持（または実質的に保持）する（いくつかの実施形態において、異種タンパク質またはそのドメインから挿入されたペプチドを有するものを含む）。いくつかの実施形態において、核酸は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の生物学的機能を保持（または実質的に保持）しながら、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の配列（配列番号６７及び図７を参照されたい）に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する配列をコードする。いくつかの実施形態において、核酸は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の生物学的機能を維持しつつ（または実質的に維持しつつ）、ＡＡＶ１カプシドタンパク質（配列番号５９）、ＡＡＶ２カプシドタンパク質（配列番号６０）、ＡＡＶ３カプシドタンパク質（配列番号６１）、ＡＡＶ３Ｂカプシドタンパク質（配列番号７４）、ＡＡＶ４カプシドタンパク質（配列番号６２）、ＡＡＶ５カプシドタンパク質（配列番号６３）、ＡＡＶ６カプシドタンパク質（配列番号６４）、ＡＡＶ７カプシドタンパク質（配列番号６５）、ＡＡＶ８カプシドタンパク質（配列番号６６）、ＡＡＶ９ｅカプシドタンパク質（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ．２０カプシドタンパク質（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７カプシドタンパク質（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ３９カプシドタンパク質（配列番号７３）、ＡＡＶｒｈ７３カプシドタンパク質（配列番号７５）、ＡＡＶｒｈ．７４カプシドタンパク質（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｈｕ．５１カプシドタンパク質（配列番号７６）、ＡＡＶｈｕ．２１カプシドタンパク質（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ．１２カプシドタンパク質（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ．２６カプシドタンパク質（配列番号７９）、ＡＡＶｒｈ．２４カプシドタンパク質（配列番号８７）、ＡＡＶｈｕ．３８カプシドタンパク質（配列番号８８）、ＡＡＶｒｈ．７２カプシドタンパク質（配列番号８９）、ＡＡＶｈｕ．５６カプシドタンパク質（配列番号８６）、ＡＡＶｃｙ．５カプシドタンパク質（配列番号９０）、ＡＡＶｃｙ．６カプシドタンパク質（配列番号９１）、ＡＡＶｒｈ．４６カプシドタンパク質（配列番号９２）、ＡＡＶｒｈ．１３カプシドタンパク質（配列番号８５）、ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１カプシドタンパク質（配列番号１０７）、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３カプシドタンパク質（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢカプシドタンパク質（配列番号２６）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤカプシドタンパク質（配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆカプシドタンパク質（配列番号６６アミノ酸配列におけるＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆカプシドタンパク質（配列番号６７のアミノ酸配列におけるＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、またはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆカプシドタンパク質（配列番号６６のアミノ酸配列におけるＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）の配列に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の同一性を有する配列をコードする。
カプシドタンパク質、コート、及びｒＡＡＶ粒子は、当該技術分野で知られている技術によって生成され得る。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、ベクターへのパッケージングを許容するための少なくとも１つの末端逆位配列含む。いくつかの実施形態において、ウイルスゲノムは、ｃａｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子の発現及びスプライシングのためのｒｅｐ遺伝子をさらに含む。他の実施形態において、ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、パッケージング細胞によって提供され、ウイルスゲノムには存在しない。
いくつかの実施形態において、操作されたカプシドタンパク質をコードする核酸は、既存のカプシド遺伝子の代わりにＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐヘルパープラスミドにクローニングされる。宿主細胞に一緒に導入される場合、このプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを、カプシドコートとしての操作されたカプシドタンパク質にパッケージングすることを補助する。パッケージング細胞は、ＡＡＶゲノム複製、カプシド組み立て、及びパッケージングを促進するのに必要な遺伝子を保有する任意の細胞タイプであり得る。非限定的な例としては、２９３細胞またはその誘導体、ＨＥＬＡ細胞、または昆虫細胞が挙げられる。
標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実行され得る。前述の技術及び手順は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、及び本明細書全体で引用及び論じられている様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載されているように、実行することができる。例えば、あらゆる目的のため参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。具体的な定義が提供されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、及び医薬的及び薬学的化学に関連して利用される命名法、ならびに実験室の手順及び技術は、当該技術分野でよく知られ、一般的に使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、及び患者の送達、及び治療に使用できる。ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列、及び組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、ＵＳ７，２８２，１９９、ＵＳ７，７９０，４４９、ＵＳ８，３１８，４８０、ＵＳ８，９６２，３３２及びＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で教示されている。
実施形態において、本明細書に提供されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ９ ＩＴＲ配列などのＩＴＲ配列に隣接する発現カセットを含む組換えＡＡＶゲノムを含み、発現カセットは、眼の適応症の治療のための治療タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。実施形態において、治療用タンパク質は、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ融合タンパク質、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、またはブロルシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合断片、ラナデルマブなどの抗カリクレイン抗体またはその抗原結合断片、サトラリズマブ、サリルマブ、シルツキシマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、オロキズマブ、ゲリリムズマブ、またはトシリズマブなどの抗ＩＬ６または抗ＩＬ６Ｒ抗体もしくはその抗原結合断片、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、またはセルトリズマブ－ぺゴルなどの抗ＴＮＦ抗体またはその抗原結合断片、エタネルセプトなどのＴＮＦ受容体融合タンパク質、エクリズマブ、ラブリズマブまたはテシドルマブなどの抗Ｃ３抗体またはその抗原結合断片、ＮＧＭ６２１などの抗Ｃ５抗体またはその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、以下により詳細に論述されるように、治療及び予防用途において使用され得る導入遺伝子送達ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはまた、対象の標的細胞内で核酸（導入遺伝子）によってコードされるＲＮＡ及び／またはタンパク質生成物の発現に影響を及ぼすことが当業者に知られている制御性調節要素を含む。制御性調節要素は、組織特異的、すなわち、標的細胞／組織においてのみ活性（または実質的により活性または有意により活性）であり得る。特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、制御性配列、例えば、標的組織における発現を可能にする、導入遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ＣＢ７プロモーターであり得る。追加のプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、またはオプシンプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態において、特に、導入遺伝子発現をオフにすることが望ましい場合には、誘導性プロモーター、例えば、低酸素誘導性またはラパマイシン誘導性プロモーターが使用される。
特定の実施形態において、調節エレメントの制御下で、導入遺伝子の発現のための発現カセットを含むウイルスゲノムを含むＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドベクターが提供され、調節エレメントの制御下で、ＩＴＲ及び本明細書に記載されるような操作されたウイルスカプシド隣接し、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドの生物学的機能を維持しつつＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶ．ｈｕ．２６、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドタンパク質（それぞれ配列番号７４、７５、７９、７６、１０７、及び４２、図７を参照されたい）のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％同一である。所定の実施形態において、コードされたＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドは、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３の配列をともに有し、加えてＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する。
組換えアデノウイルスは、Ｅ１欠失を有し、Ｅ３欠失を有しまたは有さず、いずれかの欠失領域に挿入された発現カセットを有する第一世代ベクターであり得る。組換えアデノウイルスは、Ｅ２及びＥ４領域の完全または部分欠失を含有する第二世代ベクターであり得る。ヘルパー依存性アデノウイルスは、アデノウイルス末端逆位反復及びパッケージングシグナル（ｐｈｉ）のみを保持する。導入遺伝子は、通常、パッケージングシグナルと３’ＩＴＲとの間に挿入され、およそ３６ｋｂの野生型サイズに近いゲノムを維持するためにｓｔｕｆｆｅｒ配列を伴うか、または伴わない。アデノウイルスベクターの生成のための例示的なプロトコルは、Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，２００５，“Ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ｌａｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１８－Ｓ２７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされる。
導入遺伝子を標的組織、細胞、または器官に送達するためのｒＡＡＶベクターは、その特定の標的組織、細胞、または器官、特に眼及び眼内の組織に対する向性を有する。組織特異的プロモーターも使用され得る。構築物は、ベクターによって作動される導入遺伝子の発現を向上させる発現調節要素（例えば、イントロン、例えば、ニワトリβ－アクチンイントロン、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、ヒト第ＩＸ因子イントロン（例えば、ＦＩＸ切断イントロン１）、β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スパイス受容体イントロン、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライス受容体イントロン、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）イントロン、及びハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライス受容体イントロン及びポリＡシグナル、例えば、ウサギβ－グロビンポリＡシグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、合成ポリＡ（ＳＰＡ）シグナル、及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルをさらに含み得る。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｒｉｖｅｒａ－Ｓｏｔｏ，２０１５，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．，１９（１０２）：４９－５７を参照されたい。
所定の実施形態において、本明細書に開示される核酸配列は、例えば、当業者に知られている任意のコドン最適化技術を介してコドン最適化され得る（例えば、Ｑｕａｘ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５９：１４９－１６１による概説を参照されたい）。
特定の実施形態において、本明細書に記載の構築物は、以下の構成要素を含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆位末端反復、（２）構成的プロモーターまたは眼組織特異的プロモーター、任意選択で、イントロン配列、例えば、ニワトリ β－アクチンイントロン及びポリＡシグナルを含む、制御要素、及び（３）目的の核酸またはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。実施形態において、目的のタンパク質は、例えば、ＶＥＧＦ融合タンパク質、例えば、アフリベルセプト、抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合断片、例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、またはボロルシズマブ、抗カリクレイン抗体またはその抗原結合断片、例えば、ラナデルマブ、抗ＩＬ６または抗ＩＬ６Ｒ抗体、またはその抗原結合断片、例えば、サトラリズマブ、サリルマブ、シルツキシマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、オロキズマブ、ゲリリムズマブ、またはトシリズマブ、抗ＴＮＦ抗体、またはその抗原結合断片、例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、またはセルトリズマブ－ぺゴル、ＴＮＦ受容体融合タンパク質、例えばエタネルセプト、抗Ｃ３抗体またはその抗原結合断片、例えば、エクリズマブ、またはラブリズマブ、またはテシドルマブ、または抗Ｃ５抗体、またはその抗原結合断片、例えばＮＧＭ６２１を含む、眼治療タンパク質である。
本明細書で提供されるウイルスベクターは、宿主細胞、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスターからの宿主細胞を含む哺乳動物宿主細胞を使用して製造され得る。非限定的な例は、以下を含む：Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、２９３、Ｓａоｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、一次線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞。典型的には、宿主細胞は、導入遺伝子及び関連エレメント（すなわち、ベクターゲノム）をコードする配列、及び宿主細胞内でウイルスを産生するための遺伝子成分、例えば、複製及びカプシド遺伝子（例えば、ＡＡＶのＲＥＰ及びＣＡＰ遺伝子）によって安定して形質転換される。ＡＡＶ８カプシドを有する組換えＡＡＶベクターの製造方法については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号の詳細な説明のセクションＩＶを参照されたい。前記ベクターのゲノムコピー力価は、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析によって決定され得る。ビリオンは、例えば、ＣｓＣｌ２沈降によって回収され得る。あるいは、昆虫細胞内のバキュロウイルス発現系を使用して、ＡＡＶベクターを生成し得る。概説については、製造技術のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２：１０４５－１０５４を参照されたい。
インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイは、本明細書に記載されるベクターからの導入遺伝子発現を測定するために使用され得、したがって、例えば、ベクターの効力を示す。例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株（Ｌｏｎｚａ）、ヒト胚網膜細胞に由来する細胞株、または網膜色素上皮細胞、例えば、網膜色素上皮細胞株ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）から利用可能である）が、導入遺伝子発現を評価するために使用され得る。代替的には、肝臓または他の細胞タイプに由来する細胞株、例えば、限定されないが、ＨｕＨ－７、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、ＨＫＢ－１１、及びＣＡＰ細胞が使用され得る。発現すると、当該技術分野で知られているアッセイを使用して、グリコシル化及びチロシン硫酸化パターンの決定を含む、発現した生成物（すなわち、導入遺伝子産物）の特性が決定され得る。
５．４．治療的及び予防的使用
別の態様は、眼疾患または障害を遅延、予防、治療、及び／または管理するための、本発明によるｒＡＡＶベクターを介した導入遺伝子を、それを必要とする対象に投与すること、及び／またはそれに関連する１つ以上の症状を改善することを伴う治療に関する。それを必要とする対象は、疾患もしくは障害に罹患している対象、またはその素因がある対象、例えば、疾患もしくは障害の発症または再発のリスクがある対象を含む。一般に、特定の導入遺伝子を保有するｒＡＡＶは、導入遺伝子に対応する対象の天然遺伝子が、正しい遺伝子産物、または正しい量の遺伝子産物を提供することに欠陥がある対象において、所与の疾患または障害に関して使用されることになる。次いで、導入遺伝子は、対象において欠陥のある遺伝子のコピーを提供することができる。
別の態様は、眼疾患または障害を遅延、予防、治療、及び／または管理するための、本発明によるｒＡＡＶベクターを介した導入遺伝子を、それを必要とする対象に投与すること、及び／またはそれに関連する１つ以上の症状を改善することを伴う治療に関する。それを必要とする対象は、疾患もしくは障害に罹患している対象、またはその素因がある対象、例えば、疾患もしくは障害の発症または再発のリスクがある対象を含む。一般に、特定の導入遺伝子を保有するｒＡＡＶは、導入遺伝子に対応する対象の天然遺伝子が、正しい遺伝子産物、または正しい量の遺伝子産物を提供することに欠陥がある対象において、所与の疾患または障害に関して使用されることになる。次いで、導入遺伝子は、対象において欠陥のある遺伝子のコピーを提供することができる。
導入遺伝子は、対応する天然遺伝子内の遺伝子変異（複数可）を有する対象にタンパク質機能を復元するｃＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、相同組換えを介したゲノム編集などのゲノム工学を実行するための関連ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、治療用ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、人工ｍｉＲＮＡ、またはスプライシングに影響を及ぼす要素をコードする。
実施形態において、導入遺伝子は、ヌクレオチドを含む。
本明細書に記載されるように、ＡＡＶベクターは、本明細書に記載されるように、導入遺伝子を送達して治療または予防的使用を達成するための、眼組織を含む適切な組織または細胞タイプを標的とするように選択または操作され得る。
特定の態様において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、治療／予防される障害または疾患に関連する、標的眼組織に関連する細胞マトリックスを含む、標的細胞、または標的眼組織細胞タイプへの送達に使用することができる。特定の組織または細胞タイプに関連する疾患または障害は、身体の他の細胞タイプの組織と比較して、特定の組織または細胞タイプに大きな影響を及ぼすもの、または障害の作用または症状が特定の組織または細胞タイプで現れるものである。導入遺伝子を、それを必要とする対象の標的組織に送達する方法は、対象に、カプシドが強化された形質導入、ゲノム組み込み、導入遺伝子ｍＲＮＡ、及び眼組織におけるタンパク質発現を含む、組織細胞タイプへの向性を有するｒＡＡＶを、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９などの参照カプシドを有するｒＡＡＶと比べて含んで、投与することを含む。
網膜または眼に関連する疾患または障害の場合、ｒＡＡＶベクターは、眼への向性を有するカプシドを有し、ｒＡＡＶを対象の眼または眼組織を標的にするように方向付け、実施形態において、血液眼関門を通過することを含む。用語「網膜細胞」は、アマクリン細胞、双極細胞、水平細胞、ミュラーグリア細胞、光受容細胞（例えば、桿体及び錐体）、網膜神経節細胞（例えば、ミジェット細胞、パラソル細胞、ｂｉｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ細胞、巨大網膜神経節細胞、及び感光性神経節細胞）、網膜色素上皮、内境界膜の内皮細胞などを含む網膜の中または近くに見られる細胞タイプの１つ以上を指す。眼組織は、虹彩、角膜、水晶体、毛様体、シュレム管、線維柱帯、などの前部組織、ならびに網膜またはＲＰＥ脈絡膜、及び視神経などの後部組織を含む（図１６Ａ及び１６Ｂを参照されたい。）
追加の実施形態において、眼治療薬をコードする導入遺伝子を含む組換えゲノムを含むｒＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１、配列番号５９）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２、配列番号６０）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３、配列番号６１）、ＡＡＶ血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ、配列番号７４）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４、配列番号６２）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５、配列番号６３）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６、配列番号６４）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７、配列番号６５）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８、配列番号６６）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９、配列番号６７）、ＡＡＶ血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ、配列番号６８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０、配列番号６９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．２０（ＡＡＶ．ｒｈ．２０、配列番号７０）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７、配列番号７１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ．３９、配列番号７３）、ＡＡＶ血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ．７３、配列番号７５）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．７４（ＡＡＶｒｈ．７４、配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ５１（ＡＡＶｈｕ．５１、配列番号７６）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．２１（ＡＡＶｈｕ．２１、配列番号７７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．１２（ＡＡＶｈｕ．１２、配列番号７８）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．２６（ＡＡＶｈｕ．２６、配列番号７９）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．２４（ＡＡＶｒｈ．２４、配列番号８７）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．３８（ＡＡＶｈｕ．３８、配列番号８８）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．７２（ＡＡＶｒｈ．７２、配列番号８９）、ＡＡＶ血清型ｈｕ．５６（ＡＡＶｈｕ．５６、配列番号８６）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．５（ＡＡＶｃｙ．５、配列番号９０）、ＡＡＶ血清型ｃｙ．６（ＡＡＶｃｙ．６、配列番号９１）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．４６（ＡＡＶｒｈ．４６、配列番号９２）、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１３（ＡＡＶ．ｒｈ．１３、配列番号８５）、またはＡＡＶ血清型ｒｈ．６４．Ｒ１（ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１、配列番号１０７）のカプシドを有する、または、カプシドは、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（Ａ２６９Ｓ置換（配列番号２６））、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（Ａ２９６Ｓ、４９８＿ＮＮＮ／ＡＡＡ＿５００、配列番号２７））、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列におけるＹ７０３Ｆ置換、番号付けに関しては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列におけるＹ４４３Ｆ置換、番号付けに関しては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列におけるＹ６Ｆ置換、番号付けに関しては図７を参照されたい）（図７または表１０を参照されたい）を含む本明細書に記載のカプシドの１つに対して挿入及び／または１つ以上のアミノ酸置換を有する操作されたカプシドである、前部及び／または後部を含む眼組織内の形質導入及び／または導入遺伝子発現の向性を有するカプシドを有する、方法及び組成物が提供される。所定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型のカプシドを有するか、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３である。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶが以前にヒアルロン酸（０．１重量体積％、０．２重量体積％、０．２５重量体積％、０．３重量体積％、０．３５重量体積％、０．４重量体積％、０．４５重量体積％、０．５重量体積％、０．６重量体積％、０．７５重量体積％、または１．０重量体積％のヒアルロン酸を含む）とインキュベートされていないまたは混合されていない場合を含む、ヒアルロン酸の不存在下で投与される。
一般に、ｒＡＡＶベクターが眼組織の向性を有する場合、ベクターは、眼への直接注射などのインビボ注射によって投与される。例えば、眼、網膜、またはＲＰＥ脈絡膜組織の向性を増加させるためのペプチド挿入物を含むｒＡＡＶは、硝子体内、前房内、または脈絡膜上に注射されてもよい。いくつかの実施形態において、眼組織への向性を有するｒＡＡＶは、眼内注射、例えば、毛様体扁平部を介して眼の硝子体または房水に投与される。いくつかの実施形態において、眼組織への向性を増加させるためのｒＡＡＶは、眼球周囲注射または結膜下注射を投与される。いくつかの実施形態において、眼組織への向性を有するｒＡＡＶは、硬膜と脈絡膜との間の空間内にある、脈絡膜上注射によって投与される。眼組織への向性を有するｒＡＡＶベクターの１つの利点は、対象が手術を回避してもよく、例えば、注射による送達の代わりに治療薬を移植する手術を回避してもよいことである。所定の実施形態において、治療薬は、前房内、硝子体内、または脈絡膜上注射により本明細書に記載のｒＡＡＶベクターによって送達され、眼に関連する疾患または障害、特に、対象の眼に関連する疾患または障害を処置するための治療的有効量を提供する。より多くの実施形態において、処置は、単回の前房内、硝子体内、または脈絡膜上注射、２回以下の前房内、硝子体内、または脈絡膜上注射、３回以下の前房内、硝子体内、または脈絡膜上注射、４回以下の前房内、硝子体内、または脈絡膜上注射、５回以下の前房内、硝子体内、または脈絡膜上注射、または６回以下の前房内、硝子体内、または脈絡膜上注射の後に達成される。
眼または網膜に関連する疾患／障害は、「眼疾患」と称される。眼疾患の非限定的な例には、前部虚血性視神経症、急性黄斑視神経網膜障害、バルデー・ビードル症候群、ベーチェット病、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、全脈絡膜萎縮、脈絡膜血管新生、脈絡網膜変性、錐体杆体ジストロフィー、色覚障害（例えば、色覚異常、第１色盲、第２色盲、及び第３色盲）、先天性停止性夜盲症、糖尿病性ブドウ膜炎、網膜上膜障害、遺伝性黄斑変性症、ヒストプラスマ症、黄斑変性症（例えば、急性黄斑変性症、非滲出性加齢黄斑変性症、滲出性加齢黄斑変性症）、糖尿病性網膜症、浮腫（例えば、黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫）、緑内障、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症、黄斑部毛細血管拡張症、多巣性脈絡膜炎、非網膜症糖尿病性網膜機能不全、眼外傷、眼腫瘍、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、未熟児網膜症、網膜分離症、網膜色素変性症、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、スターガルト病（黄色斑眼底）、交感性眼炎、ブドウ膜拡散、ブドウ膜網膜疾患、アッシャー症候群、Ｖｏｇｔ・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群、または眼レーザーもしくは光力学療法に関連する後部眼状態が含まれる。
特定の実施形態において、疾患または障害は、非感染性ブドウ膜炎、視神経脊髄炎、乾燥年齢関連黄斑変性を含む黄斑変性、黄斑浮腫、糖尿病性網膜症または緑内障である。
特定の実施形態において、ｒＡＡＶ（形質導入及び導入遺伝子発現を含む）は、前部組織または後部組織を含む１つ以上の特定の眼組織を標的とし、より具体的な実施形態において、ｒＡＡＶは、角膜、虹彩もしくは水晶体、または毛様体、シュレム管もしくは線維柱帯、または網膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）脈絡膜もしくは硬膜、または視神経を標的とする。特定の実施形態において、ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドを有するｒＡＡＶは、虹彩、網膜、ＲＰＥ脈絡膜または強膜を標的とするように投与されてもよく、所定の実施形態において、毛様体、シュレム管、線維柱帯または視神経（眼窩及び／または頭蓋部）を標的としてもよい。実施形態において、ＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドを有するｒＡＡＶは、網膜及び／またはＲＰＥ脈絡膜組織を標的にするために使用され得る。他の実施形態において、ＡＡＶｒｈ．７３カプシドを有するｒＡＡＶは、虹彩組織を標的にするために使用されてもよく、他の実施形態において、ＡＡＶｈｕ．２６カプシドは、毛様体または線維柱帯を標的にするために使用されてもよい。ＡＡＶ１カプシドは、線維柱帯または強膜を標的にするために使用されてもよく、ＡＡＶ７は、線維柱帯を標的にするために使用されてもよい。
所定の実施形態において、導入遺伝子は眼疾患治療剤コードするヌクレオチド配列を含み、それは、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦ融合タンパク質、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、またはブロルシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合断片、ラナデルマブなどの抗カリクレイン抗体またはその抗原結合断片、サトラリズマブ、サリルマブ、シルツキシマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、オロキズマブ、ゲリリムズマブ、またはトシリズマブなどの抗ＩＬ６または抗ＩＬ６Ｒ抗体もしくはその抗原結合断片、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ－ぺゴルなどの抗ＴＮＦ抗体またはその抗原結合断片、エタネルセプトなどのＴＮＦ受容体融合タンパク質、エクリズマブ、ラブリズマブまたはテシドルマブなどの抗Ｃ３抗体またはその抗原結合断片、ＮＧＭ６２１などの抗Ｃ５抗体またはその抗原結合断片、またはＬＫＡ－６５１、ソラネズマブ、ＧＳＫ９３３７７６、レカネマブ、アスクリンバクマブ、カロツキマブ、ＡＮＤ－００７またはイネビリズマブである。抗体またはその抗原結合断片をコードする遺伝子治療構築物は、重鎖及び軽鎖の両方が発現されるように設計される。重鎖及び軽鎖のコード配列は、分離した重鎖及び軽鎖ポリペプチドが発現されるように、重鎖及び軽鎖が切断可能なリンカーまたはＩＲＥＳ、例えばフリン－Ｔ２Ａリンカー等によって分離される単一の構築物中で操作することができる。所定の実施形態において、コード配列は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖをコードする。所定の実施形態において、抗体の全長の重鎖及び軽鎖が発現される。他の実施形態において、構築物は、重鎖及び軽鎖可変ドメインが可撓性の切断不可能なリンカーを介して接続されているｓｃＦｖを発現する。治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、標的眼組織における治療用タンパク質の発現を促進するために、調節エレメントに作用可能に連結される。
本発明のｒＡＡＶベクターはまた、オリゴヌクレオチド、薬物、造影剤、無機ナノ粒子、リポソーム、抗体の標的細胞または組織への送達、特に標的化送達を容易化し得る。ｒＡＡＶベクターはまた、非コードＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドの標的組織への送達、特に標的化送達を容易化し得る。
薬剤は、当該技術分野で知られている及び／または本明細書に記載されている薬学的に許容可能な組成物として提供され得る。また、本発明のｒＡＡＶ分子は、単独でまたは他の予防及び／または治療剤と組み合わせて投与され得る。
本明細書で提供される投与の投薬量及び頻度は、治療的に有効及び予防的に有効という用語に包含される。投薬量及び頻度は、典型的には、投与される特定の治療薬または予防薬、疾患の重症度及びタイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、及び過去の病歴に応じて、各患者に特有の要因に従って変化し、開業医の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。好適なレジメンは、そのような要因を考慮し、例えば、文献に報告され、ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５６ｔｈ ｅｄ．，２００２）に推奨される投与量に従うことによって、当業者によって選択され得る。予防及び／または治療剤は、繰り返し投与され得る。手順のいくつかの態様は、予防剤または治療剤を投与する時間的レジメン、ならびにそのような薬剤が別々にまたは混合物として投与されるかどうかなど、変化し得る。
有効であろう本発明の薬剤の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量応答曲線から外挿され得る。本発明の方法で使用される任意の薬剤について、治療有効用量は、最初は、細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半数阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルで定式化されてもよい。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
予防及び／または治療剤、ならびにそれらの組み合わせは、ヒトにおいて使用する前に、好適な動物モデルシステムにおいて試験され得る。そのような動物モデルシステムには、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で周知の任意の動物系が使用され得る。そのようなモデル系は、広く使用されており、当業者によく知られている。いくつかの実施形態において、ラット、マウス、または霊長類以外の他の小型哺乳動物に基づく眼の状態のための動物モデル系が使用される。
本発明の予防及び／または治療剤が動物モデルにおいて試験されると、それらは、それらの有効性を確立するために臨床試験において試験され得る。臨床試験の確立は、当業者に知られている一般的な方法論に従って行われ、本発明の薬剤の最適な用量及び投与経路ならびに毒性プロファイルを確立することができる。例えば、臨床試験は、ヒト患者における有効性及び毒性について本発明のｒＡＡＶ分子を試験するように設計され得る。
本発明の予防及び／または治療剤の毒性及び有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きな治療指標を示す予防及び／または治療剤が好ましい。毒性副作用を示す予防及び／または治療剤が使用され得るが、未感染細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減するために、そのような薬剤を罹患組織の部位に標的とする送達システムを設計するように注意されるべきである。
ｒＡＡＶは一般に、所望の治療的及び／または予防的利益を得るのに有効な時間及び量で投与される。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための予防及び／または治療剤の投薬量のための範囲及び／またはスケジュールを定式化する際に使用され得る。そのような薬剤の投薬量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に入る。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わり得る。
患者に対するｒＡＡＶベクターの治療上有効な投与量は、一般に、約１×１０９～約１×１０１６ゲノム、または約１×１０１０～約１×１０１５ゲノム、約１×１０１２～約１×１０１６ゲノム、約１×１０１４～約１×１０１６ゲノム、約１×１０１１～約１×１０１３ゲノム、または約１×１０１２～約１×１０１４ゲノムの濃度を含有する、約０．１ｍｌ～約１００ｍｌの溶液である。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、投与量、頻度、スケジューリングなどを決定／調整することができる。
治療的または予防的有効量の本発明の薬剤による対象の治療は、単一の治療を含み得るか、または一連の治療を含み得る。例えば、本発明の薬剤を含む薬学的組成物は、１回投与され得るか、または２回、３回もしくは４回、例えば、１週間、１ヶ月、２ヶ月または３ヶ月離れて投与され得る。
また、本発明のｒＡＡＶ分子は、単独でまたは他の予防及び／または治療剤と組み合わせて投与され得る。各予防または治療剤は、同じ時間または異なる時点で任意の順序で順次に投与され得る。しかしながら、同じ時間に投与されない場合、それらは、所望の治療的または予防的効果を提供するように、十分に近い時間で投与されるべきである。各治療剤は、任意の適切な形態で及び任意の好適な経路によって別々に投与され得る。
様々な実施形態において、異なる予防及び／または治療剤は、１時間未満の間隔で、約１時間の間隔で、約１時間～約２時間の間隔で、約２時間～約３時間の間隔で、約３時間～約４時間の間隔で、約４時間～約５時間の間隔で、約５時間～約６時間の間隔で、約６時間～約７時間の間隔で、約７時間～約８時間の間隔で、約８時間～約９時間の間隔で、約９時間～約１０時間の間隔で、約１０時間～約１１時間の間隔で、約１１時間～約１２時間の間隔で、２４時間以内の間隔で、または４８時間以内の間隔で投与される。所定の実施形態において、２つ以上の薬剤は、同一の患者来訪において投与される。
本明細書に記載される薬剤の投与方法は、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下、注入またはボーラス注射を含む）、硬膜外、ならびに上皮または粘膜皮膚または粘膜内層（例えば、鼻腔内、口腔粘膜、直腸及び腸内粘膜等）を介した吸収によるものを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、例えば、導入遺伝子が眼内で発現されることが意図されている場合、ベクターは、硝子体内、眼内、脈絡膜上、または前房内注射を介して投与される。特定の実施形態において、ベクターは、標的組織に直接投与され、例えば、網膜または毛様体に直接投与される。
所定の実施形態において、本発明の薬剤は、静脈内に投与され、他の生物学的活性剤と一緒に投与され得る。
別の特定の実施形態において、本発明の薬剤は、持続放出製剤で送達され得、例えば、その場合、製剤は、延長放出及びそれによる投与される薬剤の延長した半減期を提供する。使用に好適な制御放出システムとしては、拡散制御、溶媒制御、及び化学制御システムが挙げられるが、これらに限定されない。拡散制御システムは、例えば、本発明の分子が、拡散バリアを通る浸透によって分子の放出が制御されるように、デバイス内に囲まれているリザーバデバイスを含む。一般的なリザーバデバイスとしては、例えば、膜、カプセル、マイクロカプセル、リポソーム、及び中空繊維が挙げられる。モノリシック（マトリックス）デバイスは、第２のタイプの拡散制御システムであり、二重抗原結合分子は、速度制御マトリックス（例えば、ポリマーマトリックス）中に分散または溶解される。本発明の薬剤は、速度制御マトリックス全体を通して均質的に分散され得、放出の速度は、マトリックスを通じた拡散によって制御される。モノリシックマトリックスデバイスにおける使用に好適なポリマーとしては、天然ポリマー、合成ポリマー及び合成修飾天然ポリマー、ならびにポリマー誘導体が挙げられる。
当業者に知られている任意の技術を使用して、本明細書に記載の１つ以上の薬剤を含む徐放性製剤を製造することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０５５４８号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｇｅｌ，”Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３９：１７９ １８９，１９９６、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｏｎｇ－Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，”ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５０：３７２ ３９７，１９９５、Ｃｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ａ ｂＦＧＦ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏ．Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：８５３ ８５４，１９９７、及びＬａｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：７５９ ７６０，１９９７を参照されたい。それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ポンプは、制御放出システムにおいて使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１４：２０，１９８７、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８：５０７，１９８０、及びＳａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１：５７４，１９８９を参照されたい）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用して、二重抗原結合分子またはその抗原結合断片を含む薬剤の制御放出を達成することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３：６１，１９８３を参照されたい。Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１９０，１９８５、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２５：３５１，１９８９、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，７ １：１０５，１９８９）、米国特許第５，６７９，３７７号、米国特許第５，９１６，５９７号、米国特許第５，９１２，０１５号、米国特許第５，９８９，４６３号、米国特許第５，１２８，３２６号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／１５１５４号及びＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２０２５３号を参照されたい）。さらに別の実施形態において、制御放出系は、治療標的（例えば、罹患関節）の近くに配置することができ、したがって、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５ １３８（１９８４）を参照されたい）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７ １５３３，１９９０による概説において議論されている。
また、ｒＡＡＶは、科学的研究、例えば、光遺伝学のためのインビボ送達導入遺伝子、ｍｉＲＮＡでの遺伝子ノックダウン、条件的遺伝子欠損のためのリコンビナーゼ送達、ＣＲＩＳＰＲでの遺伝子編集などのために使用され得る。
５．５．薬学的組成物及びキット
本発明は、薬学的に許容可能な担体及び本発明の薬剤を含む薬学的組成物をさらに提供し、上記薬剤は、本発明のｒＡＡＶ分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、対象への投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わされたｒＡＡＶを含む。一実施形態において、用語「薬学的に許容可能な」は、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されているまたは米国薬局方もしくは動物、より具体的にはヒトにおいて使用するための他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、薬剤とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイント完全及び不完全アジュバント）、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、滅菌液体、例えば、水及び、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む油であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に一般的な担体である。生理食塩溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、液体担体、特に注射用溶液として用いられ得る。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。薬学的に許容される担体、賦形剤、及び安定剤の追加の例としては、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン及びゼラチンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、及び／または当該技術分野で知られているＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。本発明の医薬組成物はまた、上記の成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、及び防腐剤も含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性製剤などの形態をとることができる。
本発明は、薬学的に許容可能な担体及び本発明の薬剤を含む薬学的組成物をさらに提供し、上記薬剤は、本発明のｒＡＡＶ分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、対象への投与のための薬学的に許容可能な担体と組み合わされたｒＡＡＶを含む。一実施形態において、用語「薬学的に許容可能な」は、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されているまたは米国薬局方もしくは動物、より具体的にはヒトにおいて使用するための他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、薬剤とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイント完全及び不完全アジュバント）、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、滅菌液体、例えば、水及び、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む油であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に一般的な担体である。生理食塩溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、液体担体、特に注射用溶液として用いられ得る。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。薬学的に許容される担体、賦形剤、及び安定剤の追加の例としては、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン及びゼラチンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、及び／または当該技術分野で知られているＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。本発明の医薬組成物はまた、上記の成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、及び防腐剤も含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性製剤などの形態をとることができる。
本発明の所定の実施形態において、薬学的組成物は、本発明の方法に従って使用するために提供され、上記薬学的組成物は、治療的及び／または予防的有効量の本発明の薬剤を薬学的に許容可能な担体と一緒に含む。
所定の実施形態において、本発明の薬剤は、実質的に純粋である（すなわち、その効果を制限するまたは望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。特定の実施形態において、宿主または対象は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）及び霊長類（例えば、サル、例えば、カニクイザル及びヒト）である。所定の実施形態において、宿主は、ヒトである。
本発明は、上記の方法において使用され得るキットをさらに提供する。一実施形態において、キットは、例えば、１つ以上の容器内に、本発明の１つ以上の薬剤を含む。別の実施形態において、キットは、１つ以上の容器内に状態の処置に有用な１つ以上の他の予防または治療剤をさらに含む。
本発明はまた、薬剤及び活性剤の量を示すアンプルやサシェットなどの密封容器内にパッケージングされた本発明の薬剤も提供する。一実施形態において、薬剤は、密封容器内で乾燥滅菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給され、例えば、水または生理食塩水で、対象への投与のための適切な濃度に再構成することができる。典型的には、薬剤は、少なくとも５ｍｇ、より頻繁には少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、または少なくとも７５ｍｇの単位投与量で、密封容器において乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥剤は、元の容器に２～８℃の間で保管され、薬剤は、再構成後１２時間以内、通常は６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与されるべきである。代替的な実施形態において、本発明の薬剤は、薬剤または活性剤の量及び濃度を示す密封容器において液体形態で供給される。典型的には、薬剤の液体形態は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの密封容器で供給される。
本発明の組成物は、薬学的組成物の製造に有用なバルク薬物組成物（例えば、不純または非滅菌組成物）、ならびに薬学的組成物（すなわち、対象または患者への投与に好適な組成物）を含む。バルク薬物組成物は、単位剤形の調製に使用することができ、例えば、本明細書に開示される予防的または治療的有効量の薬剤、またはそれらの薬剤と薬学的に許容可能な担体との組み合わせを含む。
本発明は、本発明の薬剤のうちの１つ以上で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットをさらに提供する。加えて、標的疾患または障害の処置に有用な１つ以上の他の予防的または治療的薬剤もまた、薬学的パックまたはキットに含まれ得る。本発明は、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットもまた提供する。そのような容器（複数可）に任意に関連付けられるのは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であり得、その通知は、ヒト投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。
一般的に、本発明の組成物の成分は、例えば、薬剤または活性剤の量を示すアンプルまたはサシェット等の密封容器において乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々にまたは単位剤形に一緒に混合されて供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌された医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルで調剤することができる。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように、注射用または生理食塩水の滅菌水のアンプルを提供することができる。
６．実施例
以下の実施例は、挿入変異誘発を介するカプシド操作のための候補を特定するためのＡＡＶ９カプシド上の表面露出ループの分析を報告する。さらなる実施例は、本明細書に記載の様々なＡＡＶカプシドに対する形質導入の増加及び組織の向性を実証する。
以下の実施例は、挿入変異誘発を介するカプシド操作のための候補を特定するためのＡＡＶ９カプシド上の表面露出ループの分析を報告する。さらなる実施例は、本明細書に記載の様々なＡＡＶカプシドに対する形質導入の増加及び組織の向性を実証する。
６．１．実施例１－ＡＡＶ９カプシドの分析
図１及び２は、他のＡＡＶのＶＲ－ＩＶ（図１）に対するアミノ酸配列比較によるアデノ随伴ウイルス９型の可変領域４（ＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶ）の分析及びタンパク質モデル（図２）を示している。見てとれるように、ＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶは、３フォールドスパイクの先端または外側表面で表面上に露出している。さらなる分析は、ＶＲ－ＩＶとＶＲ－Ｖとの間にいくつかの側鎖相互作用が存在すること及びＶＲ－ＩＶの配列及び構造が、ＡＡＶ血清型間で可変であること、及びさらに、一般的に標的とされる中和抗体エピトープを妨害し、それにより、改変カプシドの免疫原性を減少させる潜在性が存在することを示していた。
図１及び２は、他のＡＡＶのＶＲ－ＩＶ（図１）に対するアミノ酸配列比較によるアデノ随伴ウイルス９型の可変領域４（ＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶ）の分析及びタンパク質モデル（図２）を示している。見てとれるように、ＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶは、３フォールドスパイクの先端または外側表面で表面上に露出している。さらなる分析は、ＶＲ－ＩＶとＶＲ－Ｖとの間にいくつかの側鎖相互作用が存在すること及びＶＲ－ＩＶの配列及び構造が、ＡＡＶ血清型間で可変であること、及びさらに、一般的に標的とされる中和抗体エピトープを妨害し、それにより、改変カプシドの免疫原性を減少させる潜在性が存在することを示していた。
６．２．実施例２－ＡＡＶ９変異体の構築
８種のＡＡＶ９変異体を、各々がＶＲ－ＩＶループにおける異なる挿入点で異種ペプチドを含むように構築した。異種ペプチドは、表１に示されるように、ｐＲＧＮＸ１０９０－１０９７として同定されたベクターにおける以下の残基の直後に挿入されたＦＬＡＧタグであった。
８種のＡＡＶ９変異体を、各々がＶＲ－ＩＶループにおける異なる挿入点で異種ペプチドを含むように構築した。異種ペプチドは、表１に示されるように、ｐＲＧＮＸ１０９０－１０９７として同定されたベクターにおける以下の残基の直後に挿入されたＦＬＡＧタグであった。
６．３．実施例３－パッケージング効率の分析
図３は、野生型ＡＡＶ９及び８種の候補ｒＡＡＶ９ベクター（１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、及び１０９７）のｍＬ当たりのゲノムコピー（ＧＣ／ｍＬ）に関する高いパッケージング効率を示しており、候補ベクターは、それぞれ、ＡＡＶ９のＶＲ－ＩＶ中の異なる部位にＦＬＡＧ挿入物を含有する。全てのベクターは、１０ｍＬの培養物中にルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングし、どの挿入点がカプシドのパッケージングを中断しなかったかの決定を容易にし、エラーバーは平均の標準誤差を示す。
図３は、野生型ＡＡＶ９及び８種の候補ｒＡＡＶ９ベクター（１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、及び１０９７）のｍＬ当たりのゲノムコピー（ＧＣ／ｍＬ）に関する高いパッケージング効率を示しており、候補ベクターは、それぞれ、ＡＡＶ９のＶＲ－ＩＶ中の異なる部位にＦＬＡＧ挿入物を含有する。全てのベクターは、１０ｍＬの培養物中にルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングし、どの挿入点がカプシドのパッケージングを中断しなかったかの決定を容易にし、エラーバーは平均の標準誤差を示す。
見てとれるように、全ての候補が高効率でパッケージングする。
６．４．実施例４－表面ＦＬＡＧ露出の分析
図４は、抗ＦＬＡＧ樹脂への結合による形質変換されたベクターの免疫沈降によって確認された、８種の候補改変ｒＡＡＶ９ベクター（１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、及び１０９７）の各々におけるＦＬＡＧ挿入物の表面露出を示している。抗ＦＬＡＧへの結合は、表面上にペプチド挿入物を提示するカプシドの形成を可能にする挿入点を示している。
図４は、抗ＦＬＡＧ樹脂への結合による形質変換されたベクターの免疫沈降によって確認された、８種の候補改変ｒＡＡＶ９ベクター（１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、及び１０９７）の各々におけるＦＬＡＧ挿入物の表面露出を示している。抗ＦＬＡＧへの結合は、表面上にペプチド挿入物を提示するカプシドの形成を可能にする挿入点を示している。
形質導入された細胞を溶解し、遠心分離した。５００μＬの細胞培養上清を２０μＬのアガロース－ＦＬＡＧビーズにロードし、ゲルにも直接的にロードされるＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファーで溶出させた。陰性対照のため、ＦＬＡＧ挿入物を含有しない２９３－ｓｓｃ上清を使用した。
見てとれるように、１０９０は、候補ベクターのうち最も低い力価を有し、最も少ないタンパク質プルダウンを示していた。陽性対照でも極めて低い力価が確認された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの可視化のために十分ではない量の陽性対照がロードされたようである。
６．５．実施例５－形質導入効率の分析
図５Ａ～５Ｂは、野生型ＡＡＶ９（９－ｌｕｃ）、または８種の候補改変ｒＡＡＶ９ベクター（１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、及び１０９７）の各々のいずれかにパッケージングされた、導入遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を保有するカプシドベクターで形質導入されたＬｅｃ２細胞における形質導入効率を示しており、活性は、９－ｌｕｃの活性を１００％としたルシフェラーゼ活性パーセントとして（図５Ａ）、またはマイクログラム当たりのタンパク質の相対発光量（ＲＬＵ）として表される（図５Ｂ）。
図５Ａ～５Ｂは、野生型ＡＡＶ９（９－ｌｕｃ）、または８種の候補改変ｒＡＡＶ９ベクター（１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、及び１０９７）の各々のいずれかにパッケージングされた、導入遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を保有するカプシドベクターで形質導入されたＬｅｃ２細胞における形質導入効率を示しており、活性は、９－ｌｕｃの活性を１００％としたルシフェラーゼ活性パーセントとして（図５Ａ）、またはマイクログラム当たりのタンパク質の相対発光量（ＲＬＵ）として表される（図５Ｂ）。
ＣＨＯ由来Ｌｅｃ２細胞をαＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中で成長させた。Ｌｅｃ２細胞を約２×１０８ＧＣベクターのＭＯＩ（約１０，０００のＭＯＩ）で形質導入し、ＶｉｒａＤｕｃｔｉｎ試薬で処置した（Ｌｅｃ２細胞を約１０，０００ＧＣ／細胞のＭＯＩで形質導入したが４０μｇ／ｍＬの塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）で処置したものについて同様の結果が観察された。結果は示されていない）。Ｌｅｃ２細胞は、ＣＨＯからのプロリン栄養要求株である。
見てとれるように、インビボでの形質導入効率は、野生型ＡＡＶ９（９－ｌｕｃ）を使用して得られたものよりも低い。それにもかかわらず、先行研究は、ホーミングペプチドの導入が、非標的細胞（２９３、Ｌｅｃ２、またはＨｅＬａなど）においてインビトロ遺伝子移行を減少させ得るのに対し、標的細胞におけるインビトロ遺伝子移行を有意に増加させることを示している（例えば、Ｎｉｃｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．２００１、及びＧｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００１参照）。
６．６．実施例６－挿入ペプチドの組成及び長さの要因としてのパッケージング効率の分析
図６Ａは、様々なペプチドの長さ及び組成のＡＡＶ９カプシドのＳ４５４の直後（配列番号６７）の挿入が、パッケージング細胞株におけるＡＡＶ粒子の生成効率に影響を及ぼし得ることを例示している棒グラフを示している。様々な組成及び長さの１０種のペプチドを、ＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶの中のＳ４５４の後（残基４５４と４５５の間）に挿入した。トランスフェクトから５日後のトランスフェクトされた浮遊ＨＥＫ２９３細胞の収穫された上清についてｑＰＣＲを実施した。棒グラフにおいて示された結果は、挿入物の性質及び長さが高力価でＡＡＶ粒子が生成され、２９３細胞にパッケージングされる能力に影響を及ぼすことを実証している。（エラーバーは、Ｙ軸に括弧で記されているペプチドの平均長さの標準誤差を表す）。
図６Ａは、様々なペプチドの長さ及び組成のＡＡＶ９カプシドのＳ４５４の直後（配列番号６７）の挿入が、パッケージング細胞株におけるＡＡＶ粒子の生成効率に影響を及ぼし得ることを例示している棒グラフを示している。様々な組成及び長さの１０種のペプチドを、ＡＡＶ９ ＶＲ－ＩＶの中のＳ４５４の後（残基４５４と４５５の間）に挿入した。トランスフェクトから５日後のトランスフェクトされた浮遊ＨＥＫ２９３細胞の収穫された上清についてｑＰＣＲを実施した。棒グラフにおいて示された結果は、挿入物の性質及び長さが高力価でＡＡＶ粒子が生成され、２９３細胞にパッケージングされる能力に影響を及ぼすことを実証している。（エラーバーは、Ｙ軸に括弧で記されているペプチドの平均長さの標準誤差を表す）。
Ｓ４５４挿入部位に以下のペプチド配列（表２）のホーミングペプチドを含有するカプシドタンパク質を有するＡＡＶ９ベクターを研究した。浮遊適合ＨＥＫ２９３細胞を、１０ｍＬの培地中で形質導入の１日前に１×１０６細胞／ｍＬで播種した。三重プラスミドＤＮＡトランスフェクションをＰＥＩｐｒｏ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いて１：１．７５のＤＮＡ：ＰＥＩ比で行った。トランスフェクションの５日後に細胞を遠心沈降し、上清を収穫し、－８０℃で保存した。
トランスフェクションから５日後に収穫されたトランスフェクションされた浮遊ＨＥＫ２９３細胞の上清についてｑＰＣＲを実施した。試料をＤＮａｓｅ Ｉ処置に供して残留プラスミドまたは細胞ＤＮＡを除去し、次いで熱処理してＤＮａｓｅ Ｉを不活性化し、カプシドを変性させた。サンプルをＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び導入遺伝子コンストラクトにパッケージングされたポリＡ配列に対するプライマー／プローブを使用してｑＰＣＲを介して力価測定した。標準曲線を、ＲＧＸ－５０１ベクターＢＤＳを使用して確立した。
５～１０アミノ酸長の範囲のＳ４５４の直後のペプチド挿入物は、適正な力価を有するＡＡＶ粒子を生成した一方で、１２アミノ酸長を有するペプチド挿入物については有意なパッケージング欠損が観察されたことに伴い、サイズ上限がある可能性がある。
６．７．実施例７－ホーミングペプチドは、Ｓ４５４の後に挿入された場合、インビトロでＡＡＶ９の形質導入特性を変化させる。
図６Ｂ～Ｅは、（図６Ｂ）Ｌｅｃ２細胞株（シアル酸欠損上皮細胞株）（図６Ｃ）ＨＴ－２２細胞株（ニューロン細胞株）、（図６Ｄ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞株（脳内皮細胞株）、及び（図６Ｅ）Ｃ２Ｃ１２細胞株（筋肉細胞株）の細胞培養物の蛍光画像を示している。ＡＡＶ９野生型及びＧＦＰ導入遺伝子を含有する表２のＳ４５４挿入ホーミングペプチドカプシドを使用して前述の細胞株に形質導入した。
図６Ｂ～Ｅは、（図６Ｂ）Ｌｅｃ２細胞株（シアル酸欠損上皮細胞株）（図６Ｃ）ＨＴ－２２細胞株（ニューロン細胞株）、（図６Ｄ）ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞株（脳内皮細胞株）、及び（図６Ｅ）Ｃ２Ｃ１２細胞株（筋肉細胞株）の細胞培養物の蛍光画像を示している。ＡＡＶ９野生型及びＧＦＰ導入遺伝子を含有する表２のＳ４５４挿入ホーミングペプチドカプシドを使用して前述の細胞株に形質導入した。
細胞株を形質導入の２４時間前に５～２０×１０３細胞／ウェル（細胞株による）で９６ウェルに播種した。細胞をＡＡＶ９－ＧＦＰベクター（挿入物を有するまたは有さない）で１×１０１０粒子／ウェルで形質導入し、各細胞株における発現速度の相違に応じて、形質導入から４８～９６時間後にＣｙｔａｔｉｏｎ５（ＢｉｏＴｅｋ）を介して分析した。Ｌｅｃ２細胞を実施例５のように培養し、血液脳関門ｈＣＭＥＣ／Ｄ３（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）細胞を製造業者のプロトコルに従って培養し、ＨＴ－２２及びＨＵＨ７細胞をＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中で培養し、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞をＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳに播種し、２％ウマ血清及び０．１％インスリンが補充されたＤＭＥＭ中でトランスフェクション前の３日間分化させた。ＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＦＬＡＧは、試験された全ての細胞タイプにおいて低い形質導入レベルを示した。
画像は、未改変ＡＡＶ９カプシドと比較して、ＡＡＶ９カプシドタンパク質においてＳ４５４の後に挿入された場合、ホーミングペプチドがインビトロでＡＡＶ９の形質導入特性を変化させ得ることを示している。全ての細胞株についてＰ７（ＴｆＲ１ペプチド、ＨＡＩＹＰＲＨ（配列番号１０））が最も高い形質導入速度を示し、Ｐ９（ＴｆＲ３ペプチド、ＲＴＩＧＰＳＶ（配列番号１２））が続く。Ｐ４（腎臓１ペプチド、ＬＰＶＡＳ（配列番号６））は、全ての細胞型について、ＡＡＶ９野生型よりもわずかに高い形質導入速度を示した。Ｌｅｃ２及びＨＴ－２２細胞株培養物と比較して、脳内皮ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞株及びＣ２Ｃ１２筋肉細胞株培養物中のＰ６（筋肉１ペプチド、ＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号７））についてより高い形質導入率が観察された。Ｐ１ベクターは、形質導入効率が極めて低いため画像に含まれず、Ｐ８ベクターは、力価が低いため含まれなかった。
６．８．実施例８－ペプチド挿入点のためのＡＡＶカプシドの分析
図７は、開始コドンＶＰ２、可変領域１（ＶＲ－Ｉ）、可変領域４（ＶＲ－ＩＶ）、及び可変領域８（ＶＲ－ＶＩＩＩ）の中またはその付近での眼組織への向性を増強するペプチドの挿入部位内のＡＡＶ１～９ｅ、３Ｂ、ｒｈ１０、ｒｈ２０、ｒｈ３９、ｒｈ７３、ｒｈ７４バージョン１及びバージョン２、ｈｕ１２、ｈｕ２１、ｈｕ２６、ｈｕ３７、ｈｕ５１及びｈｕ５３配列のアライメントを灰色で強調表示したものであり、各カプシドタンパク質の可変領域８（ＶＲ－ＶＩＩＩ）内の特定の挿入部位は、記号「＃」（ＡＡＶ９のアミノ酸番号付けによるアミノ酸残基５８８の後）によって示されている。
図７は、開始コドンＶＰ２、可変領域１（ＶＲ－Ｉ）、可変領域４（ＶＲ－ＩＶ）、及び可変領域８（ＶＲ－ＶＩＩＩ）の中またはその付近での眼組織への向性を増強するペプチドの挿入部位内のＡＡＶ１～９ｅ、３Ｂ、ｒｈ１０、ｒｈ２０、ｒｈ３９、ｒｈ７３、ｒｈ７４バージョン１及びバージョン２、ｈｕ１２、ｈｕ２１、ｈｕ２６、ｈｕ３７、ｈｕ５１及びｈｕ５３配列のアライメントを灰色で強調表示したものであり、各カプシドタンパク質の可変領域８（ＶＲ－ＶＩＩＩ）内の特定の挿入部位は、記号「＃」（ＡＡＶ９のアミノ酸番号付けによるアミノ酸残基５８８の後）によって示されている。
６．９．実施例９－様々なベクターのＡＡＶゲノムコピー／μｇゲノムＤＮＡの比較
図８は、ＡＡＶベクターの投与後に、マウス脳細胞において発現されるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）導入遺伝子のコピーを示す：ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ．ｈＤｙｎ（５８８～５８９の間のＴＬＡＡＰＦＫ（配列番号１）を有するが、カプシド配列への他のアミノ酸修飾を伴わないＡＡＶ９）、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｓ、及びＡＡＶ．ＰＨＰ．ＳＨ（表１０を参照されたい）。
図８は、ＡＡＶベクターの投与後に、マウス脳細胞において発現されるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）導入遺伝子のコピーを示す：ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ．ｈＤｙｎ（５８８～５８９の間のＴＬＡＡＰＦＫ（配列番号１）を有するが、カプシド配列への他のアミノ酸修飾を伴わないＡＡＶ９）、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｓ、及びＡＡＶ．ＰＨＰ．ＳＨ（表１０を参照されたい）。
ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂは、ＡＡＶ９カプシドにＴＬＡＶＰＦＫ（配列番号２０）挿入を有するカプシドであり、カプシド配列に他のアミノ酸修飾はない。ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢは、ＡＡＶ９カプシドにＴＬＡＶＰＦＫ（配列番号２０）挿入を有するカプシドであり、ＰＨＰ．Ｂ挿入の上流にあるカプシド配列の２つのアミノ酸修飾を有する（表１０も参照されたい）。表３Ａは、本研究において利用されたカプシドを要約する。
材料及び方法
ＧＦＰ導入遺伝子をコードするＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＰＨＰｅＢ、ＡＡＶ．ｈＤｙｎ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｓ及びＡＡＶ．ＰＨＰ．ＳＨのコンストラクトを調製し、１×ＰＢＳ＋０．００１％プルロニック中で製剤化した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、１日目の体重に基づいて処置群に無作為化した。５群の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスそれぞれに、以下の表３Ｂに従って、ＡＡＶ９．ＧＦＰ、ＡＡＶ．ＰＨＰｅＢ．ＧＦＰ、ＡＡＶ．ｈＤｙｎ．ＧＦＰ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｓ．ＧＦＰまたはＡＡＶ．ＰＨＰ．ＳＨ．ＧＦＰを静脈投与した。投薬体積は、１０ｍＬ／ｋｇ（０．２００ｍＬ／２０ｇマウス）であった。マウスは、開始日に８～１２週齢であった。投与後１５日目に、動物を安楽死させ、脳組織、肝臓、前肢二頭筋、心臓、腎臓、肺、卵巣、及び坐骨神経を含む末梢組織を収集した。
ＧＦＰ導入遺伝子をコードするＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＰＨＰｅＢ、ＡＡＶ．ｈＤｙｎ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｓ及びＡＡＶ．ＰＨＰ．ＳＨのコンストラクトを調製し、１×ＰＢＳ＋０．００１％プルロニック中で製剤化した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、１日目の体重に基づいて処置群に無作為化した。５群の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスそれぞれに、以下の表３Ｂに従って、ＡＡＶ９．ＧＦＰ、ＡＡＶ．ＰＨＰｅＢ．ＧＦＰ、ＡＡＶ．ｈＤｙｎ．ＧＦＰ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｓ．ＧＦＰまたはＡＡＶ．ＰＨＰ．ＳＨ．ＧＦＰを静脈投与した。投薬体積は、１０ｍＬ／ｋｇ（０．２００ｍＬ／２０ｇマウス）であった。マウスは、開始日に８～１２週齢であった。投与後１５日目に、動物を安楽死させ、脳組織、肝臓、前肢二頭筋、心臓、腎臓、肺、卵巣、及び坐骨神経を含む末梢組織を収集した。
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して脳ゲノムＤＮＡのμｇ当たりのベクターゲノムの数を決定した。注射されたマウスからの脳試料を処理し、Ｑｉａｇｅｎ製のＢｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡキットを使用してゲノムＤＮＡを単離した。標準曲線法に従ってｅＧＦＰに特異的なプライマー－プローブの組み合わせを使用してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）でｑＰＣＲアッセイを実行した。
脳ゲノムＤＮＡのμｇ当たりのＡＡＶベクターゲノムコピーは、他の全ての血清型：ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ＰＨＰｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ及びＰＨＰ．ＳＨと比較して、ＡＡＶ．ｈＤｙｎが投与されたマウスでは少なくとも１ｌｏｇ高かった（図８を参照されたい）。この研究で見られるように、ＡＡＶ９カプシドの残基５８８～５８９間の「ＴＬＡＡＰＦＫ」（配列番号１）ペプチド挿入物（ヒト軸糸ダイニン由来のペプチド）を含有するＡＡＶ９カプシドであるＡＡＶ．ｈＤｙｎについては、ＧＣ／μｇゲノムＤＮＡが最も高い。研究は、ｅＧＦＰを保有するＡＡＶ．ｈＤｙｎが全身的に投与された５匹のマウスにおいて、平均で１Ｅ０４ ＧＣ／μｇ導入遺伝子を超えてマウス脳における形質導入を実証した。しかしながら、「ＴＬＡＶＰＦＫ」（配列番号２０）配列（マウスダイニン由来のペプチド）を含むベクターであるＡＡＶ．ＰＨＰｅＢを含む他の改変されたＡＡＶ９カプシドは、全身治療時に１Ｅ０３ ＧＣ／μｇ未満の導入遺伝子マウス脳中の形質導入を実証した。
６．１０．実施例９－ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）を含有するｒＡＡＶカプシドの構築
図９Ａは、ＶＲ－ＩＩＩＶのＮ５８８とＴ５８９との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶ３Ｂベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
図９Ａは、ＶＲ－ＩＩＩＶのＮ５８８とＴ５８９との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶ３Ｂベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
図９Ｂは、ＶＲ－ＩＩＩのＳ２６７とＳ２６８との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶ３Ｂベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
図９Ｃは、ＶＲ－ＩＶのＧ４５４とＴ４５５との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶ３Ｂベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
６．１１．実施例１０－ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）を含有するｒＡＡＶカプシドの構築
図１０Ａは、ＶＲ－ＩＩＩＶのＮ５９０とＴ５９１との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶｒｈ７３ベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
図１０Ａは、ＶＲ－ＩＩＩＶのＮ５９０とＴ５９１との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶｒｈ７３ベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
図１０Ｂは、ＶＲ－ＩＩＩのＴ２７０とＮ２７１との間のアミノ酸配列のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶｒｈ７３ベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
図１０Ｃは、ＶＲ－ＩＶのＧ４５６とＧ４５７との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶｒｈ７３ベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
６．１２．実施例１１－ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）を含有するｒＡＡＶカプシドの構築
図１１Ａは、ＶＲ－ＶＩＩＩのＮ５９０とＴ５９１との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶ８ベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
図１１Ａは、ＶＲ－ＶＩＩＩのＮ５９０とＴ５９１との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶ８ベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
図１１Ｂは、ＶＲ－ＩＩＩのＡ２６９とＴ２７０との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶ８ベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
図１１Ｃは、ＶＲ－ＩＶのＴ４５３とＴ４５４との間のアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号９）のペプチド挿入を含む組換えＡＡＶ８ベクターカプシドのアミノ酸配列を示す。挿入されたペプチドは太字。
６．１３．実施例１２－血液脳関門通過の形質導入のインビトロ試験
改変されたカプシドが血液脳関門を通過する能力を、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３ ＢＢＢ細胞（ＳＣＣ０６６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）を使用したインビトロトランスウェルアッセイにおいて試験した（図１２Ａ～１２Ｂを参照されたい）。より具体的には、このアッセイは、Ｓａｄｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１４ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（４）：ｅ９６３４０）Ａ ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ａｓｓａｙ ｒｅｖｅａｌｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ，Ａｐｒｉｌ ２０１４，Ｖｏｌ．９，Ｉｓｓｕｅ ４、及びＺｈａｎｇ，Ｘ．，Ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ＡＡＶ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，２０１８ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １７６：７１－８３を本質的に適合させた。簡潔には、５×１０４個のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞／ｃｍ２を１２ウェルプレートにおいてコラーゲン被覆トランスウェルインサートに播種した。各インサートは、５００μＬの培地を含有し、下部チャンバーは、１ｍＬの培地を含有していた。培地を１日おきに交換した。播種後１０日の時点で上清を除去した（ゼロ（０）時点）。この０時点で、１×１０９ＧＣのベクターを上側インサートチャンバーの培地に加えることによって細胞を形質導入した。１０μＬの下側チャンバーの上清サンプルを形質導入から０．５、３、６、及び２３時間後に間隔を空けて試験のために取り除いた。各条件（ベクター）を二重に試験し、力価についてポリＡに対するｑＰＣＲを介して三重に測定した。
改変されたカプシドが血液脳関門を通過する能力を、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３ ＢＢＢ細胞（ＳＣＣ０６６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）を使用したインビトロトランスウェルアッセイにおいて試験した（図１２Ａ～１２Ｂを参照されたい）。より具体的には、このアッセイは、Ｓａｄｅ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１４ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（４）：ｅ９６３４０）Ａ ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ａｓｓａｙ ｒｅｖｅａｌｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｐＨ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ，Ａｐｒｉｌ ２０１４，Ｖｏｌ．９，Ｉｓｓｕｅ ４、及びＺｈａｎｇ，Ｘ．，Ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｓｈｕｔｔｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ＡＡＶ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，２０１８ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １７６：７１－８３を本質的に適合させた。簡潔には、５×１０４個のｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞／ｃｍ２を１２ウェルプレートにおいてコラーゲン被覆トランスウェルインサートに播種した。各インサートは、５００μＬの培地を含有し、下部チャンバーは、１ｍＬの培地を含有していた。培地を１日おきに交換した。播種後１０日の時点で上清を除去した（ゼロ（０）時点）。この０時点で、１×１０９ＧＣのベクターを上側インサートチャンバーの培地に加えることによって細胞を形質導入した。１０μＬの下側チャンバーの上清サンプルを形質導入から０．５、３、６、及び２３時間後に間隔を空けて試験のために取り除いた。各条件（ベクター）を二重に試験し、力価についてポリＡに対するｑＰＣＲを介して三重に測定した。
図１２Ａ～１２Ｂは、血液脳関門（ＢＢＢ）細胞層を通過すするＡＡＶ．ｈＤｙｎ（アミノ酸残基５８８～５８９の間にＴＬＡＡＰＦＫ（配列番号１）を有するＡＡＶ９）のインビトロトランスウェルアッセイを示し（図１２Ａ）、結果は、ＡＡＶ．ｈＤｙｎ（逆三角形によって示される）が、ＡＡＶ９（正方形）よりも速く、ＡＡＶ２（円）よりも速く、かつより大きな範囲でアッセイのＢＢＢ細胞層を通過することを示す（図１２Ｂ）。開発されたインビトロアッセイは、向上したＢＢＢ通過トラフィックを予測し、同様のアッセイは、他の器官への標的化を予測するためにも使用され得る。
６．１４．実施例１３－改変されたカプシドの形質導入及び生体内分布
６．１４．１材料及び方法
カプシド改変は、ＶＲ－ＩＶの位置Ｓ４５４の後（表４）、またはＡＡＶカプシドのＶＲ－ＶＩＩＩ表面曝露ループの位置Ｑ５８８の後、ならびにアミノ酸１３７（ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、及びＡＡＶ５）またはアミノ酸１３８（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９ｅ、ｒｈ．１０、ｒｈ．２０、ｒｈ．３９、ｒｈ．７４、及びｈｕ．３７）（図７）（特定のカプシド配列についても表１０を参照されたい）で開始するＶＰ２の開始コドンの後の挿入に、様々なペプチド配列を挿入することによって、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ．１０を含む広く使用されているＡＡＶカプシドに実施した。選択された単数～複数のアミノ酸変異もまた、カプシドを改変するために使用した。Ｙｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｌｏｏｐｓ ｏｎ ＡＡＶ Ｃａｐｓｉｄｓ．２０１９．ＡＳＧＣＴ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、及びＷｕ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（上記）もまた参照されたい。パッケージング効率は、小規模ではこれらのカプシド改変のいずれの後にも悪影響を受けないことが確認された。
６．１４．１材料及び方法
カプシド改変は、ＶＲ－ＩＶの位置Ｓ４５４の後（表４）、またはＡＡＶカプシドのＶＲ－ＶＩＩＩ表面曝露ループの位置Ｑ５８８の後、ならびにアミノ酸１３７（ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、及びＡＡＶ５）またはアミノ酸１３８（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９ｅ、ｒｈ．１０、ｒｈ．２０、ｒｈ．３９、ｒｈ．７４、及びｈｕ．３７）（図７）（特定のカプシド配列についても表１０を参照されたい）で開始するＶＰ２の開始コドンの後の挿入に、様々なペプチド配列を挿入することによって、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ．１０を含む広く使用されているＡＡＶカプシドに実施した。選択された単数～複数のアミノ酸変異もまた、カプシドを改変するために使用した。Ｙｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｌｏｏｐｓ ｏｎ ＡＡＶ Ｃａｐｓｉｄｓ．２０１９．ＡＳＧＣＴ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ、及びＷｕ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（上記）もまた参照されたい。パッケージング効率は、小規模ではこれらのカプシド改変のいずれの後にも悪影響を受けないことが確認された。
特定の改変カプシドを有するｒＡＡＶを、実施例５において上述したように、Ｌｅｃ２細胞においてインビトロで形質導入について試験した。Ｌｅｃ２細胞における形質導入について試験された改変ＡＡＶは以下の通りである：ＡＡＶ９と比較して、ｅＢ ５８８ Ａｄ、ｅＢ ５８８ Ｈｅｐ、ｅＢ ５８８ ｐ７９、ｅＢ ５８８ Ｒａｂ、ＡＡＶ９ ５８８ Ａｄ、ＡＡＶ９ ５８８ Ｈｅｐ、ＡＡＶ９ ５８８ ｐ７９、ＡＡＶ９ ５８８ Ｒａｂ、ｅＢ ＶＰ２ Ａｄ、ｅＢ ＶＰ２ Ｈｅｐ、ｅＢ ＶＰ２ ｐ７９、ｅＢ ＶＰ２ Ｒａｂ、ＡＡＶ９ ＶＰ２ Ａｄ、ＡＡＶ９ ＶＰ２ Ｈｅｐ、ＡＡＶ９ ＶＰ２ ｐ７９、ＡＡＶ９ ＶＰ２ Ｒａｂ。ＡＡＶカプシドの同一性については以下の表４Ｂを参照されたい。
生体内分布を試験するために、改変されたＡＡＶを、各々の個々のカプシドに対応する特定のバーコードを含有するｅＧＦＰ導入遺伝子カセットとともにパッケージングした。スクリーニングの効率を増加させるために新規バーコード化ベクターをプールし、マウスに注射した。
遺伝子改変されたＡＡＶベクターの生体内分布を分析するために、ＧＦＰをコードする様々なベクターを調製し、１×ＰＢＳ＋０．０００１％プルロニック酸中で配合した。全てのベクターは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリー（プール）の調製を可能にするために１０ｂｐのバーコードを含有するシスプラスミドを用いて作製した。３つのベクタープール（研究１、研究２、及び研究３ベクター）を、表４Ａ～Ｃに従って５匹の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのコホートに静脈内注射した。投薬体積はそれぞれ１０ｍＬ／ｋｇ（０．２ｍＬ／２０ｇマウス）であった。
マウスを１日目の体重に基づいて処置群に無作為化し、開始日におけるマウスの年齢は８～１２週であった。投与後１５日目に、動物を安楽死させ、脳、腎臓、肝臓、坐骨神経、肺、心臓、及び筋肉組織を含む末梢組織を収集した。プールからの選択されたカプシドを個々に注射した研究において、同じプロトコルに従った。
Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（６９５０６）を使用してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を組織サンプルから単離した。各ベクターのバーコード領域を、製造業者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって推奨されているように、ＮＧＳ及びユニークデュアルインデックス（ＵＤＩ）及びマルチプレックスシーケンシング戦略のためのオーバーラップを含有するプライマーで増幅させた。試薬ナノ及びマイクロキットｖ２（ＭＳ－１０３－１００１／１００２）を使用するＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用して、マウスから収集されたサンプルにつき各々のバーコード化ＡＡＶベクターの相対的存在量を決定した。したがって、以下の表４Ａ～Ｃにおける各ベクターサンプルを上記のようにバーコード化して、各リードの特定を可能にし、選別してから最終データ分析をした。当初注射されたプールにおけるＡＡＶの組成に基づいてデータを正規化し、バーコード化サンプルに特異的なプライマー－プローブの組み合わせを用いたｑＰＣＲ分析から得られた総ゲノムコピー数を使用して定量した。
プールから選択されたカプシドが個別に注射される研究において、ｑＰＣＲは、μｇの組織ゲノムＤＮＡの当たりのベクターゲノムの数を決定するために使用された。標準曲線法に従ってｅＧＦＰに特異的なプライマー－プローブの組み合わせを使用してＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）でｑＰＣＲを実行した（図１３）。
個々のベクターを特徴付けのためにマウスに注射した研究から、ホルマリン固定したマウス脳を振動ブレードミクロトーム（ＶＴ１０００Ｓ，Ｌｅｉｃａ）で４０μｍの厚さで切片化し、浮遊切片をＧＦＰに対する抗体でプローブし、送達されたベクターの細胞分布を調べた。
より具体的には、ＡＡＶ．ｈＤｙｎが注射されたマウスからの固定した脳をＶｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ，ＶＴ－１０００）を使用して切片化し、抗ＧＦＰ抗体（ＡＢ３０８０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ｋｉｔ（ＰＫ－６１００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）及びＤＡＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｋｉｔ（ＳＫ－４１００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用してＧＦＰ発現を評価した。ＡＡＶ．ｈＤｙｎが注射されたマウスにおける脳全体を通してＧＦＰ発現細胞の広い分布が存在し、これには、脳の皮質、線条体、及び海馬における分布が含まれていた。図１５Ａ～１５Ｃは、これらの領域からの画像を示し、スケールバーは４００ｕｍである（以下で説明する）。
６．１４．２ 結果
結果を図１３、図１４Ａ～１４Ｈ、及び図１５Ａ～１５Ｃに示す。
結果を図１３、図１４Ａ～１４Ｈ、及び図１５Ａ～１５Ｃに示す。
Ｌｅｃ２細胞形質導入アッセイのデータは示されていない。ＡＡＶ９ ５８８ Ｈｅｐ（５８８位の後に挿入されたペプチドＴＩＬＳＲＳＴＱＴＧ（配列番号１５）を有するＡＡＶ９）は、野生型ＡＡＶ９よりも有意に大きい形質導入（４倍）を示し、ＡＡＶ９ ＶＰ２ Ａｄ（１３８位の後に挿入されたペプチドＳＩＴＬＶＫＳＴＱＴＶ（配列番号１４）を有するＡＡＶ９）、ＡＡＶ９ ＶＰ２ Ｈｅｐ（１３８位の後に挿入されたペプチドＴＩＬＳＲＳＴＱＴＧ（配列番号１５）を有するＡＡＶ９）、及びＡＡＶ９ ＶＰ２ Ｒａｂ（１３８位の後に挿入されたペプチドＲＳＳＥＥＤＫＳＴＱＴＴ（配列番号１９）を有するＡＡＶ９）は、ＡＶＶ９と比較してＬｅｃ２細胞のわずかに大きな形質導入を示した。アッセイされた他のＡＡＶは、ＡＡＶ９よりも低いレベルの形質導入を示した。
図１３は、脳ｇＤＮＡの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析の結果を示しており、静脈内注射の後にマウス脳に送達されたカプシドプールの相対的存在量（組成パーセント）を明らかにしている。当初注射されたプールにおけるＡＡＶの組成に基づいてデータを正規化し、ｅＧＦＰ配列に特異的なプライマー－プローブの組み合わせを用いたｑＰＣＲ分析から得られた総ゲノムコピー数を使用して定量した。示されているデータは、３つの異なる実験からのものである。点線は、どのベクターが一緒にプールされていたかを示している。親ＡＡＶ９を標準として使用し、各プールに含めた。「ＢＣ」識別子は、上記の表４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃに示されるものである。
図１４Ａ～１４Ｈは、雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＡＡＶ．ｈＤｙｎのインビボ形質導入プロファイルを示し、ナイーブマウス、または脳（図１４Ａ）、肝臓（図１４Ｂ）、心臓（図１４Ｃ）、肺（図１４Ｄ）、腎臓（図１４Ｅ）、骨格筋（図１４Ｆ）、坐骨神経（図１４Ｇ）、及び卵巣（図１４Ｈ）にＡＡＶ９またはＡＡＶ．ｈＤｙｎのいずれかを注射されたマウスにおけるコピー数／マイクログラムｇＤＮＡを示し、ＡＡＶ．ｈＤｙｎはＡＡＶ９と比較して増加した脳の生体内分布を示す。脳ゲノムＤＮＡのμｇ当たりのＡＡＶベクターゲノムコピーは、親ＡＡＶ９ベクターと比較して、ＡＡＶ．ｈＤｙｎが投与されたマウスでは少なくとも１ｌｏｇ高かった
図１５Ａ～１５Ｃは、上述の免疫組織化学分析において分析された領域からの画像を示し、スケールバーは４００μｍである。図１５Ａ～１５Ｃは、脳全体にわたるＡＡＶ．ｈＤｙｎからのＧＦＰの分布を示し、ここで、線条体（図１５Ａ）、海馬（図１５Ｂ）、及び皮質（図１５Ｃ）からの脳切片の免疫組織化学的染色の画像は、改変されたベクターによる脳の全体的な形質導入を明らかにした。
６．１４．３ 結果
ＶＲ－ＩＶ及びＶＲ－ＶＩＩＩの表面露出ループにおける挿入によってまたは特定のアミノ酸変異によってのいずれかで実施されたＡＡＶカプシド改変は、それらのパッケージング効率に影響を及ぼさず、本明細書に記載の生成システムにおいて同様の力価をもたらすことができた。
ＶＲ－ＩＶ及びＶＲ－ＶＩＩＩの表面露出ループにおける挿入によってまたは特定のアミノ酸変異によってのいずれかで実施されたＡＡＶカプシド改変は、それらのパッケージング効率に影響を及ぼさず、本明細書に記載の生成システムにおいて同様の力価をもたらすことができた。
ＡＡＶ．ｈＤｙｎのマウスへの静脈内投与は、試験された他の改変ＡＡＶベクター及びＡＡＶ９より高いウイルスゲノムの相対的存在量及びより多い脳細胞形質導入をもたらした。
６．１５．実施例１４－ＩＶＴ注射後のカニクイザルにおけるｒＡＡＶベクタープールの生体内分布
カニクイザルにおける単回の硝子体内注射（ＩＶＴ）後に、投与、インビボ及び死後の観察、ならびに操作されたカプシド及びＧＦＰ導入遺伝子を有する組換えＡＡＶのプールの生体内分布を評価した（表５）。プールは、カニクイザルへの投与後に次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析を使用した識別を可能にする独自のバーコード識別を各々が含有する複数のカプシドを含有した。本研究に参加した全ての動物は、以前の治療に関してナイーブであった。プールは、表５に列挙された改変されたカプシドを有する少なくとも以下の組換えＡＡＶを含み得る。
カニクイザルにおける単回の硝子体内注射（ＩＶＴ）後に、投与、インビボ及び死後の観察、ならびに操作されたカプシド及びＧＦＰ導入遺伝子を有する組換えＡＡＶのプールの生体内分布を評価した（表５）。プールは、カニクイザルへの投与後に次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析を使用した識別を可能にする独自のバーコード識別を各々が含有する複数のカプシドを含有した。本研究に参加した全ての動物は、以前の治療に関してナイーブであった。プールは、表５に列挙された改変されたカプシドを有する少なくとも以下の組換えＡＡＶを含み得る。
６．１５．１ 研究デザイン
雌のカニクイザル３匹が使用された。関連する組織を収集して、ＩＶＴ注射に関連する生体内分布（ＮＧＳ及びＰＣＲによって測定）を評価した。３匹の動物が単回の硝子体内注射を受けた。
雌のカニクイザル３匹が使用された。関連する組織を収集して、ＩＶＴ注射に関連する生体内分布（ＮＧＳ及びＰＣＲによって測定）を評価した。３匹の動物が単回の硝子体内注射を受けた。
硝子体内（ＩＶＴ）注射を、５０μＬの用量体積でボーラス注射として両側に投与した。
６．１５．２ 観察及び検査
臨床的兆候を少なくとも１日１回記録し、これは投薬の開始のおよそ２週間前から開始して研究期間全体にわたって継続する。動物を臨床的効果、疾病、及び／または死亡の兆候について観察する。
臨床的兆候を少なくとも１日１回記録し、これは投薬の開始のおよそ２週間前から開始して研究期間全体にわたって継続する。動物を臨床的効果、疾病、及び／または死亡の兆候について観察する。
用量投与前、及び２日目、８日目、１５日目及び２２日目に、動物に対して眼科検査を実施した。全ての動物に、１日目以降に実施された眼科検査のために塩酸ケタミンＩＭで鎮静させた。１日目の検査では、動物を注射麻酔で鎮静させた（セクション１５．３．３を参照されたい）。検査の前に１％トロピカミドで眼を拡げる。検査には、スリットランプ生体顕微鏡検査及び間接眼鏡検査が含まれた。加えて、用量前、用量投与直後（約１０～１５分）、及び２日目及び２２日目に動物に対して圧平眼圧測定を行った。
用量投与のおよそ２～３週前に中和抗体分析のために末梢静脈から血液試料（約３ｍＬ）を収集する。
６．１５．３生物学的分析試料収集
用量投与前（１日目）、８日目及び１５日目、ならびに剖検前（２２日目）のＰＢＭＣ分析のために、絶食した動物から、末梢静脈から血液試料（約５ｍＬ）を採取した。リチウムヘパリン管に試料を収集し、時間を記録する。
用量投与前（１日目）、８日目及び１５日目、ならびに剖検前（２２日目）のＰＢＭＣ分析のために、絶食した動物から、末梢静脈から血液試料（約５ｍＬ）を採取した。リチウムヘパリン管に試料を収集し、時間を記録する。
用量投与（１日目、２ｍＬ）及び剖検（２２日目、５ｍＬ）の前に、生化学的分析のために末梢静脈から血液試料を採取した。凝固管に試料を収集し、時間を記録する。完全に凝固するまで管を室温で維持し、次いでおよそ２４００ｒｐｍにて室温で１５分間遠心分離する。血清を収穫し、ラベル付きバイアル（剖検サンプルを１ｍＬのアリコートに分割する）に入れ、液体窒素中で凍結させ、－６０℃以下で保存する。
６．１５．４ 剖検
死亡して発見された、または瀕死屠殺した動物、及び処置の少なくとも２１日後（２２日目）に計画されていた剖検時に全般的剖検を実施する。死亡して発見されたものを除く全ての動物を８ｍｇ／ｋｇのケタミンＨＣｌ ＩＭで鎮静化し、イソフルラン／酸素混合物で維持し、ヘパリンナトリウムの静脈内ボーラス（２００ＩＵ／ｋｇ）を提供する。動物に、生理食塩水中０．００１％の亜硝酸ナトリウムを、左心室を介して灌流する。
死亡して発見された、または瀕死屠殺した動物、及び処置の少なくとも２１日後（２２日目）に計画されていた剖検時に全般的剖検を実施する。死亡して発見されたものを除く全ての動物を８ｍｇ／ｋｇのケタミンＨＣｌ ＩＭで鎮静化し、イソフルラン／酸素混合物で維持し、ヘパリンナトリウムの静脈内ボーラス（２００ＩＵ／ｋｇ）を提供する。動物に、生理食塩水中０．００１％の亜硝酸ナトリウムを、左心室を介して灌流する。
以下の組織を全ての動物から保存した：骨髄、脳、盲腸、結腸、背側神経根及び神経節、十二指腸、食道、視神経を有する眼、総病変、心臓、回腸、空腸、腎臓、膝関節、肝臓、気管支を伴う肺、リンパ節、卵巣、膵臓、坐骨神経、骨格筋、脊髄、脾臓、甲状腺、気管、及び迷走神経。
６．１５．５ 生化学的分析
組織中のベクターコピー数及び転写物の数を、定量的ＰＣＲ及びＮＧＳ法によって調べた。
組織中のベクターコピー数及び転写物の数を、定量的ＰＣＲ及びＮＧＳ法によって調べた。
６．１５．６ 結果
図１７Ａは、異なる構造の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析の結果及び眼の細胞構成要素（眼の解剖学について、図１６Ａ及び１６Ｂを参照されたい）を示しており、ＩＶＴ以後のカプシドプールの相対的存在量（組成パーセント）を明らかにしている。当初注射されたプールにおけるＡＡＶの組成に基づいてデータを正規化し、ｅＧＦＰ配列に特異的なプライマー－プローブの組み合わせを用いたｑＰＣＲ分析から得られた総ゲノムコピー数を使用して定量した。ＡＡＶ２．７ｍ８を標準として使用し、データは、ＡＡＶ２．７ｍ８カプシドと比較して最高性能のカプシドを示している。
図１７Ａは、異なる構造の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析の結果及び眼の細胞構成要素（眼の解剖学について、図１６Ａ及び１６Ｂを参照されたい）を示しており、ＩＶＴ以後のカプシドプールの相対的存在量（組成パーセント）を明らかにしている。当初注射されたプールにおけるＡＡＶの組成に基づいてデータを正規化し、ｅＧＦＰ配列に特異的なプライマー－プローブの組み合わせを用いたｑＰＣＲ分析から得られた総ゲノムコピー数を使用して定量した。ＡＡＶ２．７ｍ８を標準として使用し、データは、ＡＡＶ２．７ｍ８カプシドと比較して最高性能のカプシドを示している。
図１７Ｂは、眼の異なる組織における転写物（ＲＮＡ）の数を示しており、ＩＶＴ後のカプシドプールの相対的存在量（組成パーセント）を明らかにしている。当初注射されたプールにおけるＡＡＶの組成に基づいてデータを正規化し、ｅＧＦＰ配列に特異的なプライマー－プローブの組み合わせを用いたｑＰＣＲ分析から得られた総ゲノムコピー数を使用して定量した。ＡＡＶ２．７ｍ８を標準として使用し、データは、ＡＡＶ２．７ｍ８カプシドと比較して最高性能のカプシドを示している。
６．１６．実施例１５－ＩＶＴ注射後のカニクイザルにおける改変カプシドの生体内分布
カニクイザルにおける単回の硝子体内注射（ＩＶＴ）後に、投与、インビボ及び死後の観察、ならびＮＨＰのバーコードライブラリースクリーンの最高性能の組換えＡＡＶの生体内分布が評価されるであろう（表６）。本研究に参加した全ての動物は、以前の治療に関してナイーブであった。
カニクイザルにおける単回の硝子体内注射（ＩＶＴ）後に、投与、インビボ及び死後の観察、ならびＮＨＰのバーコードライブラリースクリーンの最高性能の組換えＡＡＶの生体内分布が評価されるであろう（表６）。本研究に参加した全ての動物は、以前の治療に関してナイーブであった。
６．１６．１ 研究デザイン
１カプシド当たりカニクイザルの雌動物２匹を使用する。ＩＶＴ注射を使用して、異なるＡＡＶに関連する生体内分布を評価するために、関連する組織を収集する（図１６Ａ及びＢを参照されたい）。ＩＶＴ注射を、５０μＬの用量体積でボーラス注射として両側に投与した。
１カプシド当たりカニクイザルの雌動物２匹を使用する。ＩＶＴ注射を使用して、異なるＡＡＶに関連する生体内分布を評価するために、関連する組織を収集する（図１６Ａ及びＢを参照されたい）。ＩＶＴ注射を、５０μＬの用量体積でボーラス注射として両側に投与した。
６．１６．２ 観察及び検査
臨床的兆候を少なくとも１日１回記録し、これは投薬の開始のおよそ２週間前から開始して研究期間全体にわたって継続する。動物を臨床的効果、疾病、及び／または死亡の兆候について観察する。
臨床的兆候を少なくとも１日１回記録し、これは投薬の開始のおよそ２週間前から開始して研究期間全体にわたって継続する。動物を臨床的効果、疾病、及び／または死亡の兆候について観察する。
用量投与前、及び２日目、８日目、１５日目及び２２日目に、動物に対して眼科検査を実施した。全ての動物に、１日目以降に実施された眼科検査のために塩酸ケタミンＩＭで鎮静させた。１日目の検査では、動物を注射麻酔で鎮静させた。
検査の前に１％トロピカミドで眼を拡げる。検査には、選択した時点でのスリットランプ生体顕微鏡検査、間接眼鏡検査、眼底画像、及びＯＣＴが含まれる。
用量投与のおよそ２～３週前に中和抗体分析のために末梢静脈から血液試料（約３ｍＬ）を収集する。
６．１６．３ 生化学的分析試料収集
用量投与（１日目、２ｍＬ）及び剖検（２８日目、５ｍＬ）の前に、生化学的分析のために末梢静脈から血液試料を採取する。凝固管に試料を収集し、時間を記録する。完全に凝固するまで管を室温で維持し、次いでおよそ２４００ｒｐｍにて室温で１５分間遠心分離する。血清を収穫し、ラベル付きバイアル（剖検サンプルを１ｍＬのアリコートに分割する）に入れ、液体窒素中で凍結させ、－６０℃以下で保存する。
用量投与（１日目、２ｍＬ）及び剖検（２８日目、５ｍＬ）の前に、生化学的分析のために末梢静脈から血液試料を採取する。凝固管に試料を収集し、時間を記録する。完全に凝固するまで管を室温で維持し、次いでおよそ２４００ｒｐｍにて室温で１５分間遠心分離する。血清を収穫し、ラベル付きバイアル（剖検サンプルを１ｍＬのアリコートに分割する）に入れ、液体窒素中で凍結させ、－６０℃以下で保存する。
６．１６．４ 剖検
死亡して発見された、または瀕死屠殺した動物、及び処置の少なくとも２１日後（２２日目）に計画されていた剖検時に全般的剖検を実施する。死亡して発見されたものを除く全ての動物を８ｍｇ／ｋｇのケタミンＨＣｌ ＩＭで鎮静化し、イソフルラン／酸素混合物で維持し、ヘパリンナトリウムの静脈内ボーラス（２００ＩＵ／ｋｇ）を提供する。動物に、生理食塩水中０．００１％の亜硝酸ナトリウムを、左心室を介して灌流する。
死亡して発見された、または瀕死屠殺した動物、及び処置の少なくとも２１日後（２２日目）に計画されていた剖検時に全般的剖検を実施する。死亡して発見されたものを除く全ての動物を８ｍｇ／ｋｇのケタミンＨＣｌ ＩＭで鎮静化し、イソフルラン／酸素混合物で維持し、ヘパリンナトリウムの静脈内ボーラス（２００ＩＵ／ｋｇ）を提供する。動物に、生理食塩水中０．００１％の亜硝酸ナトリウムを、左心室を介して灌流する。
試験終了時に眼を採取する。片方の眼は免疫組織化学（ＩＨＣ）に使用され、もう片方の眼は生体分布研究に使用される。末梢組織を採取することができる。
６．１６．５ 生化学的分析
組織中のベクターコピー数及び転写物の数を、定量的ＰＣＲによって検査した。ＧＦＰ発現レベル及び局在化は、ＩＨＣを用いて調べる。
組織中のベクターコピー数及び転写物の数を、定量的ＰＣＲによって検査した。ＧＦＰ発現レベル及び局在化は、ＩＨＣを用いて調べる。
６．１７．実施例１６－ＩＶＴ注射後のカニクイザルにおけるｒＡＡＶベクタープールの生体内分布
プールされたバーコード化ベクターを、硝子体内注射及びベクターＤＮＡの生体内分布によってＮＨＰに投与し、ＲＮＡを、以下の実施例１４及び１５に記載されるプロトコルを用いて投与の３週間後に屠殺時に評価した。特に、ベクタープールを、以下の表７に従って、ＩＶＴにより、２群の２匹の成体カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の両眼（両側）に投与した。
プールされたバーコード化ベクターを、硝子体内注射及びベクターＤＮＡの生体内分布によってＮＨＰに投与し、ＲＮＡを、以下の実施例１４及び１５に記載されるプロトコルを用いて投与の３週間後に屠殺時に評価した。特に、ベクタープールを、以下の表７に従って、ＩＶＴにより、２群の２匹の成体カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の両眼（両側）に投与した。
用量投与の前、及び２日目、８日目、１５日目及び２２日目に、スリットランプ生体顕微鏡検査、間接眼鏡検査、及びＩＯＰ測定を含む眼科検査を実施した。３週間の屠殺時に、組織を解剖し（眼の解剖学的構造については図１６Ａ及びＢを参照）、試料をＲＮＡｌａｔｅｒを含有するチューブに収集し、冷蔵保存した。ベクターＤＮＡ及び転写された導入遺伝子ＲＮＡの存在量を、ＰＲＩＳＭを用いて生成された事後Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較を用いて、通常の一方向ＡＮＯＶＡを用いて、参照カプシドＡＡＶ８及びＡＡＶ９と比較して組織試料中で評価した。
ＡＡＶ９の存在量と比較して、ベクターＤＮＡ及び転写された導入遺伝子ＲＮＡの相対的存在量に関して上位９つのカプシドについて、結果を提示する。図１８Ａ～１８Ｃは、解剖された角膜（図１８Ａ）、虹彩（図１８Ｂ）及び水晶体（図１８Ｃ）組織における９つの最も豊富なカプシドのｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの（ＡＡＶ９に対する）相対的な存在量を表し、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９を制御する。ＲＮＡは、角膜及び水晶体組織試料において検出できなかった。図１９Ａ～１９Ｃは、毛様体（図１９Ａ）、シュレム管（図１９Ｂ）、及び線維柱帯（図１９Ｃ）組織における、９つの最も豊富なカプシド及び対照ＡＡＶ８及びＡＡＶ９について、カプシドによってバーコード化された導入遺伝子から発現されるｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの相対的存在量（ＡＡＶ９に対する）を示す。棒グラフには含まれていないが、ＡＡＶ３Ｂ ＲＮＡは毛様体組織（１１８の存在量のうち４７位）及び線維柱帯（１１８の存在量のうち２６位）で検出された。図２０Ａ～２０Ｃは、網膜（図２０Ａ）、ＲＰＥ脈絡膜（図２０Ｂ）及び強膜（図２０Ｃ）における９つの最も存在するカプシド及び対照ＡＡＶ８及びＡＡＶ９のｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの（ＡＡＶ９に対する）相対存在量を示す。棒グラフ上にはないが、ＡＡＶ３Ｂ ＤＮＡは強膜で検出された（１１８の存在量の内の３７位）。最後に、図２１Ａ及び２１Ｂは、視神経（眼窩部）（図２１Ａ）または視神経（頭蓋部）（図２０Ｂ）における９つの最も存在するカプシド及び制御ＡＡＶ８及びＡＡＶ９についてのｒＡＡＶ ＤＮＡ及びＲＮＡの（ＡＡＶ９に対する）相対的存在量を示す。視神経試料から検出できない導入遺伝子から転写されたＲＮＡは、眼窩または頭蓋部のいずれかである。
組織中のＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドと比較した相対ＲＮＡ存在量を、以下の表８に要約する。
６．１８．実施例１７－ＩＶＴ注射後のカニクイザルおよびマウスにおけるｒＡＡＶベクタープールの生体内分布
この実施例は、実施例１６、下記、及び実施例１３に記載されるマウスに記載されるように、カニクイザルに硝子体内に注入されたｒＡＡＶベクタープールの生体内分布を比較する。この実施例では、５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの２つの群に、以下の表９に詳述されるように、両眼に両側にプールされたベクターを投与し、次いで、投与の３週間後に屠殺した。一方の眼からの組織を採取し、ＲＮＡアッセイのためにＲＮＡｌａｔｅｒに保存し、一方の眼からの組織をＤＮＡ分析のために凍結した。
この実施例は、実施例１６、下記、及び実施例１３に記載されるマウスに記載されるように、カニクイザルに硝子体内に注入されたｒＡＡＶベクタープールの生体内分布を比較する。この実施例では、５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの２つの群に、以下の表９に詳述されるように、両眼に両側にプールされたベクターを投与し、次いで、投与の３週間後に屠殺した。一方の眼からの組織を採取し、ＲＮＡアッセイのためにＲＮＡｌａｔｅｒに保存し、一方の眼からの組織をＤＮＡ分析のために凍結した。
生体内分布結果は、マウス（図２２Ａ）及びＮＨＰ（図２２Ｂ）由来の網膜組織における、ならびにマウス（図２３Ａ）及びＮＨＰ（図２３Ｂ）由来のＲＰＥ脈絡膜における、異なるカプシドのＡＡＶ９に対するｒＡＡＶのＤＮＡ及びＲＮＡの相対的存在量を示す。棒グラフには反映されなかったが、ＡＡＶ３Ｂ ＤＮＡは、マウスＲＰＥ－脈絡膜（ＡＡＶ９と比較して存在量が１１８個のカプシドのうち７３個にランク付けされた）で検出され、ＡＡＶ３Ｂ ＲＮＡは、マウス網膜（ＡＡＶ９と比較して存在量が１１８個のカプシドのうち８１個にランク付けされた）及びマウスＲＰＥ－脈絡膜（ＡＡＶ９と比較して存在量が１１８個のカプシドのうち１４個にランク付けされた）で検出された。
本研究は、ｒＡＡＶがＩＶＴ投与を介して投与された場合、マウス及びＮＨＰ組織の両方において、ＡＡＶ２及びＡＡＶ４及びまたｒｈ．７３の網膜及びＲＰＥ脈絡膜組織における濃縮を示した。図２４に示されるように、ＩＶＴ注入雌マウスのプールにおけるｒｈ．７３の相対的存在量（ＤＮＡ濃縮）も観察された。
６．１９ 実施例１８：硝子体内（ＩＶＴ）注射後のカニクイザルにおける単一ｒＡＡＶベクターのＡＡＶ３Ｂ調製のカプシド生体内分布
ユニバーサルＣＡＧプロモーターからのＧＦＰレポーター遺伝子を発現する単一のＡＡＶベクターであるＡＡＶ３Ｂ（ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する）を含むｒＡＡＶベクター調製物を、１．６１Ｅ１１ ＧＣ／眼の用量（眼注射体積当たり５０μＬ）のＩＶＴ注射によって２つのＮＨＰの群に投与した。ＧＦＰを発現する対照ＡＡＶ２変異型（ＡＡＶ２ｖ）ベクターも、１．６１Ｅ１１ ＧＣ／眼の用量（眼注射体積当たり５０μＬ）のＩＶＴ注射によって２つのＮＨＰの群に投与した。本研究は、前述の実施例、例えば、実施例１４、１５及び１６に記載されるものに類似するプロトコルに従ったが、様々な眼組織、ならびにいくつかの末梢組織におけるＡＡＶ３Ｂまたは対照ベクターＤＮＡ及びＲＮＡの生体内分布は、ベクター投与の３週間後に屠殺後に評価される。
ユニバーサルＣＡＧプロモーターからのＧＦＰレポーター遺伝子を発現する単一のＡＡＶベクターであるＡＡＶ３Ｂ（ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する）を含むｒＡＡＶベクター調製物を、１．６１Ｅ１１ ＧＣ／眼の用量（眼注射体積当たり５０μＬ）のＩＶＴ注射によって２つのＮＨＰの群に投与した。ＧＦＰを発現する対照ＡＡＶ２変異型（ＡＡＶ２ｖ）ベクターも、１．６１Ｅ１１ ＧＣ／眼の用量（眼注射体積当たり５０μＬ）のＩＶＴ注射によって２つのＮＨＰの群に投与した。本研究は、前述の実施例、例えば、実施例１４、１５及び１６に記載されるものに類似するプロトコルに従ったが、様々な眼組織、ならびにいくつかの末梢組織におけるＡＡＶ３Ｂまたは対照ベクターＤＮＡ及びＲＮＡの生体内分布は、ベクター投与の３週間後に屠殺後に評価される。
用量投与の前、用量投与に続く間欠的な日に、例えばスリットランプ生体顕微鏡検査、間接眼鏡検査、及びＩＯＰ測定を含む眼科検査を実施した。３週間の屠殺において、眼組織、ならびに視神経を解剖し、抽出した（眼の解剖学的構造については、図１６Ａ及びＢを参照されたい）。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、肝臓、脳、及び涙腺も抽出した。右眼からの組織を採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（製造業者の指示に従って）を有するチューブ中で試料を採取し、ｑＰＣＲを実施することができるまで－８０℃でフラッシュ凍結した。ＡＡＶ３Ｂカプシドの生体内分布及び導入遺伝子発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲ法によって各対象の左眼の組織で分析する。各対象の右眼の組織を眼球除去し、４％パラホルムアルデヒド中に収集し、パラフィンブロックに処理し、ＧＦＰ発現については免疫組織化学（ＩＨＣ）、組織病理学分析についてはヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって評価する。
６．２０ 実施例１９：カニクイザルにおけるｒＡＡＶベクタープールの上脈絡腔（ＳＣＳ）注入後のカプシド生体内分布
プールされたバーコード化ベクターを、脈絡膜上注射によってＮＨＰに投与した。プールされた混合物は、本明細書に記載されるように、普遍的なＣＡＧプロモーターからのＧＦＰレポーター遺伝子を発現する天然分離株及び操作されたＡＡＶを含む１１８の異なるＡＡＶカプシドからなる。上脈絡膜研究は、以下の実施例１４、１５及び１６に記載されているものと同様のプロトコルに従ったが、ベクタープールを、ＳＣＳによって２匹の成体カニクイザルの両眼（両側）に７．２Ｅ１１ ＧＣ／眼の用量で投与した。脈絡膜上注射の前に、動物をケタミン及びデクスメデトミジンで麻酔した。ＡＡＶライブラリー（プール）は、１００μＬの単回ＳＣＳ注入を介して各眼の脈絡膜上腔（ＳＣＳ）に送達した。
プールされたバーコード化ベクターを、脈絡膜上注射によってＮＨＰに投与した。プールされた混合物は、本明細書に記載されるように、普遍的なＣＡＧプロモーターからのＧＦＰレポーター遺伝子を発現する天然分離株及び操作されたＡＡＶを含む１１８の異なるＡＡＶカプシドからなる。上脈絡膜研究は、以下の実施例１４、１５及び１６に記載されているものと同様のプロトコルに従ったが、ベクタープールを、ＳＣＳによって２匹の成体カニクイザルの両眼（両側）に７．２Ｅ１１ ＧＣ／眼の用量で投与した。脈絡膜上注射の前に、動物をケタミン及びデクスメデトミジンで麻酔した。ＡＡＶライブラリー（プール）は、１００μＬの単回ＳＣＳ注入を介して各眼の脈絡膜上腔（ＳＣＳ）に送達した。
用量投与の投与前及び間欠的な日に、例えばスリットランプ生体顕微鏡検査、間接眼鏡検査、及びＩＯＰ測定による検査を含む眼科検査を実施した。３週間の屠殺時に、組織を採取し、試料を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（製造業者の指示に従って）を用いたチューブに採取し、ＤＮＡ及びＲＮＡ分析（プール内の各ベクターの生体内分布）が水性体液、硝子体液、脈絡膜－網膜色素上皮（ＲＰＥ）、角膜、虹彩－糸状体、水晶体、視神経、網膜及び強膜を含む眼組織においてＮＧＳによって実行され得るまで、－８０℃でフラッシュ凍結した。
６．２１．カプシドアミノ酸配列
表１０は、本明細書に記載の研究において記載及び／または使用される、特定の操作されたカプシドタンパク質及び操作されていないカプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。異種ペプチド及びアミノ酸置換は、灰色のシェーディングで示されている。
表１０は、本明細書に記載の研究において記載及び／または使用される、特定の操作されたカプシドタンパク質及び操作されていないカプシドタンパク質のアミノ酸配列を提供する。異種ペプチド及びアミノ酸置換は、灰色のシェーディングで示されている。
７.均等物
本発明は、その具体的な実施形態を参照して詳細に説明されているが、機能的に均等である類型が本発明の範囲内であることが理解される。実際、本明細書に示され、説明されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかであろう。そのような修正は、添付される特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験を超えるものを使用せずに確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって網羅されることが意図される。
本発明は、その具体的な実施形態を参照して詳細に説明されているが、機能的に均等である類型が本発明の範囲内であることが理解される。実際、本明細書に示され、説明されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかであろう。そのような修正は、添付される特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験を超えるものを使用せずに確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって網羅されることが意図される。
本明細書で言及されている全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、その全体が参照により具体的かつ個別に同じ程度で、本明細書に参照により組み込まれる。
本明細書における議論は、当該技術分野が直面している問題の本質をよりよく理解することを提供し、いかなる方法においても、先行技術に関して認めるものとして解釈されるべきではなく、また、本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願の「先行技術」を構成するということを認めるものとして解釈されるべきではない。
本明細書で引用される特許出願及び刊行物を含む全ての参考文献は、各個々の刊行物または特許または特許出願が、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が、全ての目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の多くの修正及び変形は、当業者に明らかであるように、その趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に記載の具体的な実施形態は、例としてのみ提供され、本発明は、添付の特許請求の範囲の条件、ならびにかかる特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲によってのみ制限されるべきである。
Claims (31)
- 導入遺伝子を眼組織細胞に送達する方法であって、前記方法が、前記細胞を、前記眼組織細胞における眼疾患治療剤の発現を促進する１つ以上の調節エレメントに機能可能に連結した前記眼疾患治療剤をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターと接触させることを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１（配列番号５９）、ＡＡＶ２（配列番号６０）、ＡＡＶ３（配列番号６１）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号７４）、ＡＡＶ４（配列番号６２）、ＡＡＶ５（配列番号６３）、ＡＡＶ６（配列番号６４）、ＡＡＶ７（配列番号６５）、ＡＡＶ８（配列番号６６）、ＡＡＶ９（配列番号６７）、ＡＡＶ９ｅ（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ．１０（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ．２０（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ３９（配列番号７３）、ＡＡＶ ｒｈ７３（配列番号７５）、ＡＡＶｒｈ．７４（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｈｕ．５１（配列番号７６）、ＡＡＶｈｕ．２１（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ．１２（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ．２６（配列番号７９）、ＡＡＶｒｈ．２４（配列番号８７）、ＡＡＶｈｕ．３８（配列番号８８）、ＡＡＶｒｈ．７２（配列番号８９）、ＡＡＶｈｕ．５６（配列番号８６）、ＡＡＶｃｙ．５（配列番号９０）、ＡＡＶｃｙ．６（配列番号９１）、ＡＡＶｒｈ．４６（配列番号９２）、ＡＡＶｒｈ．１３（配列番号８５）、ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１（配列番号１０７）、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（配列番号２６）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、またはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）のカプシドを有する、前記方法。
- 導入遺伝子の、対象の眼組織、または眼組織標的細胞、またはそれらの細胞マトリックスへの送達を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、前記対象に、前記眼組織における眼疾患治療剤の発現を促進する１つ以上の調節エレメントに機能可能に連結された前記眼疾患治療剤をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターを投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１（配列番号５９）、ＡＡＶ２（配列番号６０）、ＡＡＶ３（配列番号６１）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号７４）、ＡＡＶ４（配列番号６２）、ＡＡＶ５（配列番号６３）、ＡＡＶ６（配列番号６４）、ＡＡＶ７（配列番号６５）、ＡＡＶ８（配列番号６６）、ＡＡＶ９（配列番号６７）、ＡＡＶ９ｅ（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ．１０（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ．２０（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ３９（配列番号７３）、ＡＡＶ ｒｈ７３（配列番号７５）、ＡＡＶｒｈ．７４（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｈｕ．５１（配列番号７６）、ＡＡＶｈｕ．２１（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ．１２（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ．２６（配列番号７９）、ＡＡＶｒｈ．２４（配列番号８７）、ＡＡＶｈｕ．３８（配列番号８８）、ＡＡＶｒｈ．７２（配列番号８９）、ＡＡＶｈｕ．５６（配列番号８６）、ＡＡＶｃｙ．５（配列番号９０）、ＡＡＶｃｙ．６（配列番号９１）、ＡＡＶｒｈ．４６（配列番号９２）、ＡＡＶｒｈ．１３（配列番号８５）、ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１（配列番号１０７）、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（配列番号２６）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、またはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）のカプシドを有する、前記方法。
- 前記カプシドが、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドである、請求項１または２に記載の方法。
- 前記眼組織または前記眼組織標的細胞が、角膜組織もしくは細胞、虹彩組織もしくは細胞、毛様体組織もしくは細胞、シュレム管組織もしくは細胞、線維柱帯組織もしくは細胞、網膜組織もしくは細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織もしくは細胞、または視神経細胞である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
- 前記眼組織または前記眼組織標的細胞が、網膜組織もしくは細胞またはＲＰＥ脈絡膜組織もしくは細胞である、請求項４に記載の方法。
- 前記カプシドがＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドである、請求項５に記載の方法。
- 前記眼疾患が非感染性ブドウ膜炎である、請求項１～６に記載の方法。
- 前記眼疾患が緑内障である、請求項１～４に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、前記線維柱帯及び／または前記シュレム管を標的とする、請求項８に記載の方法。
- 前記カプシドが、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ３Ｂカプシド、ＡＡＶ．ｈｕ．２６カプシド、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３カプシドである、請求項８または９に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶベクターが、硝子体内、脈絡膜上、または前房内投与される、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶベクターが全身投与される、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
- 提供される前記ｒＡＡＶベクターが、ヒアルロン酸の不存在下で投与される、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
- 導入遺伝子の眼組織細胞への送達における使用のための薬学的組成物であって、前記組成物が、前記眼組織細胞における眼疾患治療剤の発現を促進する１つ以上の調節エレメントに機能可能に連結された前記眼疾患治療剤をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１（配列番号５９）、ＡＡＶ２（配列番号６０）、ＡＡＶ３（配列番号６１）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号７４）、ＡＡＶ４（配列番号６２）、ＡＡＶ５（配列番号６３）、ＡＡＶ６（配列番号６４）、ＡＡＶ７（配列番号６５）、ＡＡＶ８（配列番号６６）、ＡＡＶ９（配列番号６７）、ＡＡＶ９ｅ（配列番号６８）、ＡＡＶｒｈ．１０（配列番号６９）、ＡＡＶｒｈ．２０（配列番号７０）、ＡＡＶｈｕ．３７（配列番号７１）、ＡＡＶｒｈ３９（配列番号７３）、ＡＡＶ ｒｈ７３（配列番号７５）、ＡＡＶｒｈ．７４（配列番号７２または配列番号９６）、ＡＡＶｈｕ．５１（配列番号７６）、ＡＡＶｈｕ．２１（配列番号７７）、ＡＡＶｈｕ．１２（配列番号７８）、ＡＡＶｈｕ．２６（配列番号７９）、ＡＡＶｒｈ．２４（配列番号８７）、ＡＡＶｈｕ．３８（配列番号８８）、ＡＡＶｒｈ．７２（配列番号８９）、ＡＡＶｈｕ．５６（配列番号８６）、ＡＡＶｃｙ．５（配列番号９０）、ＡＡＶｃｙ．６（配列番号９１）、ＡＡＶｒｈ．４６（配列番号９２）、ＡＡＶｒｈ．１３（配列番号８５）、ＡＡＶｒｈ．６４．Ｒ１（配列番号１０７）、ＡＡＶ９．Ｓ４５４－ＴＦＲ３（配列番号４２）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ（配列番号２６）、ＡＡＶ８．ＢＢＢ．ＬＤ（配列番号２７）、ＡＡＶ８．Ｙ７０３Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ７０３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、ＡＡＶ９．Ｙ４４３Ｆ（配列番号６７のアミノ酸配列中のＹ４４３Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）、またはＡＡＶ９．Ｙ６Ｆ（配列番号６６のアミノ酸配列中のＹ６Ｆ置換、番号付けについては図７を参照されたい）のカプシドを有する、前記薬学的組成物。
- 前記カプシドが、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドである、請求項１４に記載の薬学的組成物。
- 前記眼組織または前記眼組織標的細胞が、角膜組織もしくは細胞、虹彩組織もしくは細胞、毛様体組織もしくは細胞、シュレム管組織もしくは細胞、線維柱帯組織もしくは細胞、網膜組織もしくは細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織もしくは細胞、または視神経細胞である、請求項１４または１５に記載の薬学的組成物。
- 前記眼組織または前記眼組織標的細胞が、網膜組織もしくは細胞またはＲＰＥ脈絡膜組織もしくは細胞である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
- 前記カプシドがＡＡＶ３ＢまたはＡＡＶｒｈ．７３カプシドである、請求項１７に記載の薬学的組成物。
- 前記眼疾患が非感染性ブドウ膜炎である、請求項１４～１８に記載の薬学的組成物。
- 前記眼疾患が緑内障である、請求項１４～１８に記載の薬学的組成物。
- 前記ｒＡＡＶが、前記線維柱帯及び／または前記シュレム管を標的とする、請求項２０に記載の薬学的組成物。
- 前記カプシドが、ＡＡＶ３Ｂ血清型、ＡＡＶｒｈ．７３血清型、ＡＡＶ．ｈｕ．２６血清型、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１血清型、またはＡＡＶ９．Ｓ４５４．ＴＦＲ３カプシドである、請求項２０または２１に記載の薬学的組成物。
- 前記ｒＡＡＶベクターが、硝子体内、脈絡膜上、または前房内投与される、請求項１４～２２のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ｒＡＡＶベクターが全身投与される、請求項１４～２２のいずれかに記載の方法。
- 提供される前記ｒＡＡＶベクターが、ヒアルロン酸の不存在下で投与される、請求項１４～２４に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、参照ＡＡＶカプシドと比較して、標的組織内で少なくとも１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい形質導入を示す、請求項１～２５のいずれかに記載の方法または薬学的組成物。
- 導入遺伝子ＲＮＡの存在量が、前記参照ＡＡＶカプシドからの導入遺伝子ＲＮＡの存在量と比較して、前記標的組織内で１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい、請求項１～２６のいずれかに記載の方法または薬学的組成物。
- 前記参照ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９である、請求項２６または２７に記載の方法または薬学的組成物。
- 眼障害の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１４～２２または２５のいずれかに記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
- 上記請求項のいずれかに記載の前記ｒＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を共有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
- 請求項３０に記載の核酸を発現させて、前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターを生成することが可能なパッケージング細胞。
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