CN116323949A

CN116323949A - 用于治疗眼部疾病的组合物和方法

Info

Publication number: CN116323949A
Application number: CN202180064547.6A
Authority: CN
Inventors: 施中东; 赵巍
Original assignee: Fangtuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Fangtuo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2023-06-23
Also published as: EP4185333A1; JP2023540464A; US20230295243A1; WO2022018516A1; CA3186830A1; AU2021313839A1

Abstract

一种用于治疗眼部疾病的系统和一种用于使用所述系统来治疗眼部疾病的方法。

Description

用于治疗眼部疾病的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年7月21日提交的中国专利申请号202010706658.X(代理人卷号57837-709.711)和于2020年7月21日提交的中国专利申请号202010706505.5(代理人案卷号57837-712.711)的权益，所述专利的全部内容以引用的方式并入本文。

背景技术

血管生成是指组织中血管的新形成或生长或者现有毛细血管或血管的进一步形成或生长，血管生成在疾病和健康中起着重要作用。病理性眼部血管生成或新生血管形成可能发生在视网膜、脉络膜和角膜中，并且可能造成严重的视力障碍。眼部血管生成与多种疾病相关联，包括湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、糖尿病性视网膜病变、黄斑水肿等。

已经开发出许多用于治疗血管生成相关病症的药物，诸如抗VEGF抗体(诸如Lucentis)或融合蛋白(诸如艾力雅(Eylea))。然而，由于这些药物的半衰期短，所以需要频繁重复的注射以维持功效。因此，需要针对血管生成的新疗法来治疗与血管生成有关的眼部疾病。

序列表

本申请包含序列表，其按ASCII格式以电子方式提交并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建2021年7月19日，名称为57837-712_601_SL且大小为24,376字节。

发明内容

目前，本领域中需要开发可以有效地治疗与血管生成相关联的眼部疾病的组合物和方法。

在一些方面中，本公开内容提供了一种组合物，其包含：第一多核苷酸，其包含可操作地连接至第一启动子的第一序列和可操作地连接至第二启动子的第二序列，其中第一序列编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其中第二序列编码AAV rep蛋白；和第二多核苷酸，其包含可操作地连接至第三启动子的第三序列，其中第三序列包含编码血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂的密码子优化的核酸序列。

在一些实施方案中，VEGF抑制剂是融合蛋白或者VEGF抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含与SEQ ID NO:13相比数目不同的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含少于60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列不包含CpG二核苷酸。在一些实施方案中，第三序列包含序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子适合于在昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是HEK293细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，衍生细胞是HEK293T细胞。在一些实施方案中，第一启动子或第二启动子是p10启动子或polh启动子。在一些实施方案中，第三启动子是CMV启动子、CAG启动子、MNDU3启动子、PGK启动子、EF1a启动子或眼部特异性启动子。在一些实施方案中，眼部特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白基因启动子、鼠11-顺式类视黄醇(retinoid alcohol)脱氢酶基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子、卵黄状黄斑营养不良2启动子和光感受器间类视黄醇(retinoid)结合蛋白启动子。在一些实施方案中，第一序列、第二序列或第三序列的3'端还包含多聚A序列。在一些实施方案中，多聚A序列是hGH多聚(A)、SV40多聚(A)或β-珠蛋白多聚(A)。在一些实施方案中，第一序列和第二序列通过接头连接。在一些实施方案中，接头是可切割接头。在一些实施方案中，接头包含2A肽。在一些实施方案中，接头包含内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，IRES来自口蹄疫病毒(FMDV)。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含内含子或调控元件。在一些实施方案中，内含子包含嵌合内含子。在一些实施方案中，调控元件包含TPL(来自腺病毒的三联前导序列)和eMLP(来自腺病毒主要晚期启动子的增强子元件)序列。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含Kozak序列。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含人支架附着区(SAR)序列。在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含增强子。在一些实施方案中，增强子是CMV增强子。在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含填充序列。在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，ITR序列是AAV2 ITR。在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含编码额外治疗性蛋白质的第四序列。在一些实施方案中，额外治疗性蛋白质选自VEGF抑制剂、PDGF抑制剂、胎盘生长因子抑制剂、整联蛋白抑制剂、mTOR抑制剂、血管生成素抑制剂和TGFβ抑制剂。在一些实施方案中，第三序列和第四序列通过接头连接。在一些实施方案中，接头是可切割接头。在一些实施方案中，接头包含2A肽。

在另一方面中，本公开内容提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其通过将本文公开的任何多核苷酸或本文公开的任何组合物引入到细胞中来制备。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是HEK293细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，衍生细胞是HEK293T细胞。

在另一方面中，本公开内容提供了一种多核苷酸，其包含密码子优化的核酸序列，所述密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含与SEQ ID NO:13相比数目不同的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含少于60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列不包含CpG二核苷酸。在一些实施方案中，第三序列包含序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，多核苷酸还包含启动子。在一些实施方案中，启动子是CMV启动子、CAG启动子、MNDU3启动子、PGK启动子、EF1a启动子或眼部特异性启动子。在一些实施方案中，眼部特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白基因启动子、鼠11-顺式类视黄醇脱氢酶基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子、卵黄状黄斑营养不良2启动子和光感受器间类视黄醇结合蛋白启动子。在一些实施方案中，多核苷酸还包含多聚A序列。在一些实施方案中，多聚A序列是hGH多聚(A)、SV40多聚(A)或β-珠蛋白多聚(A)。在一些实施方案中，多核苷酸还包含内含子或调控元件。在一些实施方案中，内含子包含嵌合内含子。在一些实施方案中，调控元件包含TPL(来自腺病毒的三联前导序列)和eMLP(来自腺病毒主要晚期启动子的增强子元件)序列。在一些实施方案中，多核苷酸还包含Kozak序列。

在另一方面中，本公开内容提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含本文公开的任何多核苷酸。

在另一方面中，本公开内容提供了一种用于在对象的细胞或组织中表达VEGF抑制剂的方法，其包括向对象的细胞或组织施用本文公开的任何rAAV颗粒或本文公开的任何多核苷酸。

在另一方面中，本公开内容提供了一种用于治疗有需要的对象的眼部疾病的方法，其包括向对象施用治疗有效量的本文公开的任何rAAV颗粒或本文公开的任何多核苷酸。在一些实施方案中，眼部疾病选自湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变和黄斑水肿。

在另一方面中，本公开内容提供了一种用于制备重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其包括向细胞中引入本文公开的任何组合物或本文公开的任何多核苷酸。在一些实施方案中，所述方法包括在细胞中表达本文公开的任何多核苷酸。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是HEK293细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，衍生细胞是HEK293T细胞。在一些实施方案中，所述方法包括生成杆状病毒质粒(bacmid)DNA和/或杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括生成包含VEGF抑制剂表达序列(诸如本文公开的多核苷酸)的杆状病毒质粒DNA。在一些实施方案中，所述方法包括生成杆状病毒质粒DNA rAAV cap-rep表达序列。在一些实施方案中，所述方法包括用杆状病毒质粒DNA转染细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括用包含VEGF抑制剂表达序列的杆状病毒质粒DNA转染细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括用杆状病毒质粒DNA转染细胞以产生包含rAAV cap-rep表达序列的杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法还包括混合杆状病毒以感染细胞(诸如Sf9细胞)以获得本文公开的包装的rAAV/VEGF抑制剂病毒颗粒。

援引并入

本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过以引用的方式并入本文，其并入程度如同指示每个单独出版物、专利或专利申请明确且单独地以引用的方式并入一般。就通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何这种矛盾的材料。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图(在本文中也称为“图(Figure)”和“图(FIG)”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些附图中：

图1A示出了荧光图像，其显示在293T细胞中转染编码GFP的第二多核苷酸之后48小时，绿色荧光蛋白(GFP)的表达。

图1B示出了流式细胞术结果，其显示在转染之后48小时GFP表达细胞的百分比。

具体实施方式

尽管已经在本文中示出和描述了本发明的各个实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅通过举例方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员可以想到许多变型、变化和替代。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种另选方案。

除非另有说明，否则本文所公开的一些实施方案的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术。例如Sambrook和Green,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等人,编辑)系列；Methods In Enzymology(AcademicPress,Inc.)系列,PC 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)),Harlow和Lane,编辑(1988)Antibodies,A Laboratory Manual，以及Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and SpecializedApplications,第6版(R.I.Freshney,编辑(2010))。

定义

除非上下文另有明确指示，否则如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(said)”包括复数个指示物。例如，术语“免疫激活剂”包括一种或多种免疫激活剂。

术语“约”或“大约”意指由本领域普通技术人员测定的具体值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于所述值的测量或测定方式，即，测量系统的限制性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表达在标准偏差1或更大内。替代地，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，此术语可以意指值的数量级，优选在5倍内，更优选地在2倍内。在申请和权利要求中描述具体值的情况下，除非另有说明，否则应当假设术语“约”意指在具体值的可接受的误差范围内。

如本文所用的术语“治疗”是指试图改变个体疾病的自然治疗过程，并且可以是用于预防的临床干预或在临床病理学过程期间的实施。所需的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接的病理后果、预防转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态和/或改善预后。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换地用于指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是线型的、环状的或支化的，它可以含有修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。此术语还包括诸如通过硫酸化、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸(例如，精氨酸)、泛素化或任何其它操作诸如与标记组分缀合来修饰的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。多肽或氨基酸序列“来源”于指定蛋白质是指多肽的起源。优选地，多肽具有与序列中编码的多肽的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列或其一部分，其中所述部分由至少10-20个氨基酸、或至少20-30个氨基酸、或至少30-50个氨基酸组成，或者它可以用序列中编码的多肽来免疫学鉴定。此术语还包括从指定核酸序列表达的多肽。如本文所用，术语“结构域”是指蛋白质的一部分，其在物理上或功能上与蛋白质或肽的其它部分不同。物理上定义的结构域包括非常疏水或亲水的氨基酸序列，诸如那些膜结合或细胞质结合序列。结构域还可以通过例如由基因复制引起的内部同源性来定义。功能上定义的结构域具有不同的生物学功能。例如，抗原结合结构域是指抗原结合单元或抗体中结合抗原的一部分。功能上定义的结构域不必由接连的氨基酸序列编码，而功能上定义的结构域可以含有一个或多个物理上定义的结构域。

如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括但不限于D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。使用标准的单字母或三字母代码来指代氨基酸。在此上下文中，氨基酸通常由本领域已知的单字母和三字母缩写表示。例如，丙氨酸可以由A或Ala表示。

如本文所用，在多肽的情况下，“序列”是多肽中在氨基末端到羧基末端方向上的氨基酸序列，其中序列中彼此相邻的残基在多肽中。一级结构是连续的。序列还可以是已知在一个或两个方向上含有额外残基的多肽的一部分的线性序列。

如本文所用，“同一性”、“同源性”或“序列同一性”是指两个或多个多核苷酸序列之间或两个或多个多肽序列之间的序列相似性。当使用诸如EMBOSS Needle或BestFit的程序确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认设定，或者可以选择适当的评分矩阵，诸如blosum45或blosum80，以获得优化同一性、相似性或同源性评分。优选地，同源多核苷酸是在严格条件下杂交并且与这些序列相比具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、更优选地95％、更优选地97％、更优选地98％并且甚至更优选地99％序列同一性的那些。当最佳比对长度相当的序列时，同源多肽优选地具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％序列同一性，或者具有至少99％序列同一性。

就本文公开的抗原结合单元而言，术语“百分比序列同一性(％)”被定义为在比对序列并且必要时引入空位以获得最大序列同一性百分比之后，查询序列与第二和参考多肽之间相同氨基酸的百分比，而不将任何保守取代考虑为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列的百分比同一性的比对可以以本领域技术人员熟知的各种方式实现，例如通过使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在待比较序列的全长上获得最大比对所需的任何算法。百分比同一性可以在整个定义的多肽序列的长度上测量，或者可以在较短的长度上测量，例如，在取自较大定义的多肽序列的片段的长度上，诸如至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少50个、至少100个或至少200个接连残基的片段。这些长度仅是示例性的，并且应当理解，本文的表、图或序列表中所示的序列所支持的任何片段长度都可以用于描述可以测量百分比同一性的长度。

本文所述的蛋白质可以具有相对于参考序列的一个或多个修饰。修饰可以是氨基酸残基的缺失、插入或添加或取代。“缺失”是指由于去除一个或多个氨基酸残基所致的氨基酸序列变化。“插入”或“添加”是指导致与参考序列相比，添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列变化。“取代”或“取代的”意指一个或多个氨基酸被不同的氨基酸替换。此处，抗原结合片段与参考序列相比的突变可以通过将抗原结合片段与参考序列相比较来确定。可以根据本领域任何已知的方法进行序列比较的最佳比对。

如本文所用，术语“分离的”是指将多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段与细胞和自然界中的其它组分分离。本领域技术人员知道，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以将它们与其天然存在的对应物区分开。此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在的对应物区分开，因为每单位体积的浓度或分子数大于(“浓缩的”)或小于其天然存在的对应物(“分离的”)。富集可以基于绝对量进行测量，诸如每单位体积的溶液重量，或者它可以相对于来源混合物中存在的第二种潜在干扰物质进行测量。

术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合物形式(无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸)或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析确定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、分离DNA、分离RNA、核酸探针、引物、寡核苷酸或合成DNA。多核苷酸可以包含修饰核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。可以在多核苷酸形成之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。

当应用于多核苷酸时，“重组”意指多核苷酸是克隆或由限制性消化和/或连接和其它程序得到的产物，并且产物不同于自然界中存在的多核苷酸。

术语“基因”或“基因片段”在本文中可互换使用。它们是指含有至少一个可以在转录和翻译之后编码特定蛋白质的开放阅读框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因组的、cDNA的或合成的，只要多核苷酸含有至少一个开放阅读框即可，开放阅读框可以覆盖整个编码区或其片段。

术语“可操作地连接”或“有效地连接”是指允许组分以其预期方式起作用的组分并置。例如，如果启动子序列促进编码序列的转录，则启动子序列可操作地连接至编码序列。

如本文所用，“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA(也称为“转录物”)随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸来源于基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。

如本文所用，术语“载体”是指其中可以插入多核苷酸的核酸媒介物(vehicle)。当载体能够表达由插入的多核苷酸编码的蛋白质时，载体被称为表达载体。载体可以通过转化、转导或转染来引入宿主细胞，使得它所携带的遗传物质可以在宿主细胞中表达。本领域技术人员熟知的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、人工染色体(诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和P1来源的人工染色体(PAC))、噬菌体(诸如λ噬菌体和M13噬菌体)和动物病毒。可以用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(诸如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳头状多瘤空泡病毒(例如SV40)。载体可以具有多个控制表达的元件，包括但不限于启动子、转录起始子、增强子、选择元件和报告基因。此外，载体可以还含有复制起点。

术语“转染”用于指细胞摄取外来DNA，并且当外源DNA被引入细胞膜内部时，细胞被“转染”。多种转染技术通常是本领域已知的。参见，例如，Graham等人(1973)Virology,52:456，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold SpringHarbor Laboratories,New York，Davis等人(1986)Basic Methods in MolecularBiology,Elsevier，以及Chu等人(1981)Gene13:197。这类技术可以用于将一个或多个外源性核酸(诸如核苷酸整合载体和其它核酸分子)引入适合的宿主细胞中。

如本文所用，术语“抗体”是指通常由两对多肽链组成的免疫球蛋白分子(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)。抗体轻链可以被分类为κ和λ轻链。重链可以被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且抗体同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，并且重链还含有约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)构成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。轻链恒定区由结构域CL组成。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)或经典补体系统的第一组分(C1q)。VH和VL区还可以细分为高度变性的区(称为互补决定区(CDR))，更保守的区称为骨架区(FR)散布于其间。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，它们按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合位点。每个区或结构域的氨基酸分配遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901 -917；Chothia等人(1989)Nature342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何具体的产生抗体的方法的限制。例如，它包括重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。

如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留特异性结合与全长抗体结合的相同抗原的能力和/或与长抗体竞争以特异性结合抗原的能力。抗原结合片段也称为“抗原结合部分”。大体上参见，Fundamental Immunology,第7章(Paul,W.编辑,第2版,Raven Press,NY(1989)，其出于所有目的以引用的方式全文并入本文。使用重组DNA技术，完整抗体的酶促片段化或化学片段化可以产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和含有足以赋予特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分的多肽。在一些情况下，抗原结合片段是单链抗体(例如，scFv)，在所述抗体中VL和VH结构域通过允许它们产生呈单条多肽链的接头来配对以形成单价分子(参见例如，Bird等人,Science242:423 426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:58795883(1988))。此类scFv分子可以具有通式结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的接头包括但不限于重复的GGGGS氨基酸序列或其变体。例如，可以使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头及其变体(参见Holliger等人(1993),Proc Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。其它可以使用的接头由以下进行了描述：Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001),Eur.J Immunol.31:94-106，Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol。所有参考文献都出于所有目的以引用的方式全文并入本文。

抗体的抗原结合片段(例如，如上所述的抗体片段)可以通过常规技术(例如，重组DNA技术、酶促片段化或化学片段化)获得，并且可以以与针对完整抗体相同的方式进行特异性筛选。除非上下文另外明确指出，否则当提到术语“抗体”时，它不仅包括全抗体，还包括抗体的抗原结合片段。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以引入载体的细胞，其包括但不限于原核细胞(诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)、真菌细胞(诸如酵母细胞或曲霉属)、昆虫细胞(诸如S2果蝇细胞或Sf9昆虫细胞)或动物细胞(诸如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK293细胞或人细胞)。

术语“拮抗剂”和“抑制剂”在本文中可以互换使用并且是指能够通过抑制靶蛋白的活性或表达来抑制靶蛋白的生物学功能的分子。因此，术语“拮抗剂”和“抑制剂”是在靶蛋白的生物学效果的情境下定义的。尽管本文优选的拮抗剂特异性地与靶标相互作用(例如，结合)，但是通过与其中靶蛋白是成员的信号传导通路的其它成员相互作用来抑制靶蛋白的生物活性的分子也包括在此定义中。

如本文所用，“有效量”至少是指实现特定疾病或病症的可测量改善或预防所需的最小量。有效量可以基于患者的疾病状态、年龄、性别和体重而变化。有效量还是治疗有益效果超过治疗的任何毒性或不良效果的量。在癌症或肿瘤的治疗中，有效量的药物可能具有以下效果：减少癌细胞的数目，减小肿瘤的大小，抑制癌细胞向外周器官中的浸润，抑制肿瘤转移，在一定程度上抑制肿瘤生长和/或在一定程度上减轻与疾病相关的一种或多种症状。有效量可以一次或多次应用来施用。

如本文所用，术语“接受者”、“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”可以互换使用并且指待诊断或治疗的任何哺乳动物对象，优选为人。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和等同形式在本文中通常用于指获得所需药理学和/或生理效果。此效果可以是预防性的，具体为完全或部分预防疾病或其症状，并且/或者可以是治疗性的，具体为部分或完全稳定或治愈疾病和/或归因于疾病的不良反应。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、兔、猪、灵长类动物，包括人和其它类人猿，优选为人)的疾病的任何治疗。此术语包括以下：(a)预防疾病或症状在可能易感疾病或症状但尚未被诊断的对象中发生；(b)抑制疾病症状；(c)预防疾病的发展；(d)缓解疾病的症状；(e)使疾病或症状平息；或(a)-(e)的任何组合。

如本文所用，术语“试剂盒”是指为平常使用而包装或可商购获得的组合。例如，本公开内容的试剂盒可以含有本文公开的组合物和使用组合物或试剂盒的说明书。术语“说明书”是指治疗性产品的商业包装中通常所含的说明性插页，其含有关于使用此类治疗性产品的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

术语“密码子优化(codon optimization)”或“密码子优化的(codon-optimized)”是指改变构成核酸序列的密码子，使得密码子最适合在特定系统(例如，特定物种或一组物种)中表达。例如，将核酸序列优化以便在哺乳动物细胞中更有效地表达。由于同义密码子的存在，密码子优化不改变所编码蛋白质的氨基酸序列。多种密码子优化方法在本领域中是已知的，诸如美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的那些，所述专利出于所有目的以引用的方式全文并入本文。“同义密码子”是指编码相同氨基酸的密码子。

有20种构成蛋白质的氨基酸和64种编码氨基酸的密码子。每种氨基酸对应于至少一种密码子，并且一种氨基酸可以对应于至多6种密码子(简并密码子)。不同的生物体，甚至同一生物体的不同蛋白质编码基因，对简并密码子的使用频率是不同的，并且具有一定的偏好。其中，频率高的密码子被称为偏好密码子(preferred codon)，而很少使用的密码子被称为稀有密码子或低频密码子。基因密码子的优化可以通过利用偏好密码子，避免较少使用的稀有密码子或低频密码子，简化基因转录之后mRNA的二级结构，并入有利于高效表达的基序并减少不利于表达的基序以及调整GC含量等来增加蛋白质表达水平。虽然有许多通用的密码子优化原则，但这些通用的优化原则不可能统一应用于单个基因疗法载体。不同的通用的优化原则可能彼此矛盾。例如，改变CpG岛的组成或编码区的GC含量可能影响密码子使用偏好的选择。此外，不同的密码子优化可能导致不同的翻译后修饰和不同的生物活性。

出于本发明的目的，“活性(active)”或“活性(activity)”是指保留对应的天然或天然存在的多肽的生物活性的治疗性蛋白质的形式。活性可以大于、等于或小于以对应的天然或天然存在的多肽观察到的活性。

湿性黄斑变性

黄斑是视网膜的中央部分。黄斑变性，还称为视网膜变性，是一种涉及黄斑变性的眼部疾病。

年龄相关性黄斑变性(AMD)是超过50岁的人群的不可逆视力损伤的最重要原因之一。AMD在临床上被分为“干性”和“湿性”两种类型。在AMD的湿性形式中，新血管形成并且改变向视网膜组织(尤其是黄斑下方的组织)的血液供应。然而，新血管容易受到损伤，并且它们的破裂将导致出血和对周围组织的损伤、视网膜组织瘢痕形成以及视力快速丧失。此疾病进展快速并且常常导致失明。湿性黄斑变性通常开始于视野中心的畸变，占与黄斑变性相关联的失明的约90％。

已发现几种细胞因子在血管生成的调控中发挥重要作用，包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)、胎盘生长因子、血小板源性生长因子(PDGF)、缺氧诱导因子(HIF)、血管生成素(Ang)和其它细胞因子以及丝裂原激活蛋白激酶(MPK)。

血管内皮生长因子(VEGF)是一种大小为46kDa的糖蛋白，其在眼部细胞(包括色素上皮细胞、周细胞、血管内皮细胞、胶质细胞和神经节细胞)中表达。已知VEGF与多种眼部疾病相关联，包括但不限于缺血性视网膜病变(ischemic retinopathy)、眼内新生血管形成(intraocular neovascularization)、年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration，AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新生血管形成(retinalneovascularization)、糖尿病性黄斑水肿(diabetes macular edema)、糖尿病性视网膜缺血(diabetic retinal ischemia)、糖尿病视网膜水肿(diabetic retinal edema)、增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy)、视网膜静脉阻塞(retinalvein occlusion)、视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion)、视网膜分支静脉阻塞(branch retinal vein occlusion)。

VEGF结合融合蛋白(阿柏西普(aflibercept))

是一种被批准用于治疗湿性AMD的药物。它可以预防眼部新生血管形成，并且因此治疗湿性AMD。抗VEGF抗体(雷珠单抗(ranibizumab))/>

是另一种被批准用于治疗湿性AMD的药物。它还可以预防眼新生血管形成，并且因此治疗湿性AMD。临床研究显示，约95％的施用/>

的患者的视力得到改善或稳定。然而，这两种药物都非常昂贵，并且由于这些药物的半衰期短，需要经常重复注射以维持功效。因此，需要新的疗法来靶向VEGF以治疗相关眼部疾病。

重组AAV载体

腺相关病毒(AAV)属于细小病毒(Parvoviridae)科并且是单链DNA(ssDNA)病毒。AAV基因组的长度为约4.7千碱基，并且其含有在DNA链的两端的反向末端重复序列(ITR)以及两个称为rep和cap的开放阅读框(ORF)。

“AAV反向末端重复序列(ITR)”序列是存在于天然单链AAV基因组的两端的约145个核苷酸的序列。ITR是用于在腺相关病毒基因组中高效复制的对称核酸序列，其可以用作病毒DNA合成的复制起点并且是重组AAV载体必要的结构组分。

“rep”含有编码AAV生命周期所需的四种rep蛋白rep78、rep68、rep52和rep40的多核苷酸序列。“cap”含有编码AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的多核苷酸序列，其中AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3可以彼此相互作用以形成一个二十四种对称的AAV衣壳。

AAV可以有效地感染分裂和未分裂的人细胞，并且其基因组可以整合至宿主细胞基因组中的单个染色体位点中。最重要的是，虽然AAV存在于人体内，但目前的研究表明AAV与任何疾病不相关。基于其安全性高、免疫原性低、宿主范围广并且能够介导动物体内外来基因的长期稳定表达，AAV已成为最有前景的基因疗法载体系统。

基于AAV血清型或感染的组织或细胞，目前已鉴定出13种不同的AAV，即AAV1-AAV13。此外，如以下表1中所示，已开发出许多使用AAV的有利载体系统以实现在特定细胞类型中的转染。在AAV血清型中，血清型2(AAV2)是研究和使用最广泛的。它可以感染视网膜上皮、感光细胞、骨骼肌、中枢神经和肝脏细胞。它已被用作许多临床研究的载剂(carrier)。

表1.在基因疗法中用作载剂的AAV血清型及其组织

AAV血清型	递送组织
		AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9	中枢神经系统
AAV1、AAV8、AAV9	心脏
		AAV2	肾脏
AAV7、AAV8、AAV9	肝脏
		AAV4、AAV5、AAV6、AAV9	肺
AAV8	胰腺
		AAV2、AAV5、AAV8	感光细胞
AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8	视网膜上皮
		AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9	骨骼肌

如本文所用，术语“重组AAV载体(rAAV载体)”是指含有一个或多个异源序列(即，非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体，其两侧为两个AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于表达AAV rep和cap蛋白的宿主细胞中时，rAAV载体可以复制并且包装成AAV病毒颗粒。

“重组AAV(rAAV)病毒”或“rAAV病毒颗粒”是指由至少一种包裹rAAV载体的AAV衣壳蛋白构成的AAV病毒颗粒。目前用于生产rAAV病毒颗粒的宿主细胞全部为来自哺乳动物的细胞类型，诸如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和其它哺乳动物细胞系。rAAV病毒颗粒可以在提供有rAAV质粒的哺乳动物细胞培养系统中产生。然而，大多数哺乳动物细胞培养系统的输出难以满足临床试验和商业规模生产的需要。为此，最近开发了一种使用昆虫细胞(诸如Sf9细胞)的rAAV病毒颗粒生产系统。然而，为了在昆虫细胞中产生AAV，必须进行一些修改以获得AAV衣壳蛋白的正确化学计量比。

杆状病毒属于杆状病毒科并且是双链环状DNA病毒。它基因组的大小在90kb-230kb之间。杆状病毒专门寄生在节肢动物中，并且已知能够感染多于600种昆虫。1983年，Smith等人通过使用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa Californica MulticapsidNuclear Polyhedrosis Virus，AcMNPV)在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞系Sf9中成功地表达人β-干扰素而创建了第一个杆状病毒表达系统(Mol Cell Biol,1983,3:2156-2165)。此后，杆状病毒表达系统被不断改善和发展，并且成为广泛使用的真核表达系统。2002年，Urabe等人确认了，杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞可以支持AAV的复制。他们使用三种分别携带AAV的rep基因、cap基因和ITR核心表达元件的重组杆状病毒共感染Sf9细胞，并且成功地制备了rAAV病毒颗粒。此后，研究人员不断开发出更适合于大规模制备rAAV病毒颗粒的系统。

目前，大规模制备rAAV病毒颗粒的杆状病毒表达系统主要有两种：双杆状病毒系统(Two Bac系统)和包装细胞系依赖性单杆状病毒系统(One Bac系统)。利用双杆状病毒系统制备rAAV病毒颗粒的主要过程是将AAV的rep基因和cap基因整合于一个杆状病毒基因组中，并且将ITR核心表达元件和感兴趣的靶基因整合到另一个杆状病毒基因组中。然后使用两种重组杆状病毒共感染宿主细胞，以产生携带感兴趣的基因的rAAV病毒颗粒。使用单杆状病毒系统制备rAAV病毒颗粒的主要过程开始于建立诱导rep和cap基因的表达的包装细胞系。此包装细胞系整合rep和cap基因表达元件，使得rep基因和cap基因均处于杆状病毒晚期基因表达强启动子polh启动子的控制之下。可以在polh启动子的上游进一步添加hr2增强子序列和AAV rep蛋白质结合序列。在用含有AAV ITR和靶基因的重组杆状病毒进行感染之后，诱导包装细胞系中的rep基因和cap基因表达蛋白质，从而生成整合靶基因的rAAV病毒颗粒。

在一些实施方案中，用于在rAAV病毒颗粒中携带感兴趣的基因的rAAV载体还可以包括一个或多个“表达调控元件”。如本文所用，术语“表达调控元件”是指影响可操作地连接的多核苷酸的表达的核酸序列，包括促进异源多核苷酸的转录和翻译的多核苷酸序列。表达控制元件的非限制性实例包括但不限于启动子、增强子、内含子剪接信号、多聚腺苷酸化(多聚(A))、反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，多聚(A)序列是hGH多聚(A)、SV40多聚(A)或β-珠蛋白多聚(A)。

“启动子”是位于编码靶产物的异源多核苷酸序列附近的DNA序列，其通常可操作地连接至相邻序列，诸如异源多核苷酸。与不存在启动子时的异源多核苷酸的表达水平相比，启动子通常增加异源多核苷酸的表达水平。

“增强子”是增强启动子活性的序列。与启动子不同，增强子不具有启动子活性，并且通常可以独立于它们相对于启动子的位置(即，启动子的上游或下游)而发挥作用。增强子元件(或其部分)的非限制性实例包括杆状病毒增强子和在昆虫细胞中发现的增强子元件。

“填充序列”是指较大核酸分子(诸如载体)中所含的核苷酸序列，并且通常用于产生在两个核酸序列之间(诸如在启动子和编码序列之间)的所需间隔或者将核酸序列延伸至所需长度。填充序列不含有蛋白质编码信息。填充序列可能具有未知或合成来源且/或与较大核酸分子中的其它核酸序列无关。

组合物

在一个方面中，本公开内容提供了一种组合物，其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第一多核苷酸包含可操作地连接至第一启动子的第一序列和可操作地连接至第二启动子的第二序列。

在一些实施方案中，第一序列编码腺相关病毒(AAV)cap蛋白。cap蛋白可以是本领域已知的能够形成功能性AAV衣壳(即，能够包装DNA和感染靶细胞)的任何结构蛋白。在一些实施方案中，cap蛋白包括VP1、VP2和VP3。在一些实施方案中，cap蛋白不必包括VP1、VP2、VP3中的所有，只要它可以产生功能性AAV衣壳即可。在一些实施方案中，cap蛋白包括VP1和VP2。在一些实施方案中，cap蛋白包括VP1和VP3。在一些实施方案中，cap蛋白包括VP2和VP3。在一些实施方案中，cap蛋白包括VP1。在一些实施方案中，cap蛋白包括VP2。在一些实施方案中，cap蛋白包括VP3。

VP1、VP2、VP3可以来源于任何AAV血清型。在一些实施方案中，VP1可以来源于AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3(AAV3，包括血清型3A和3B)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)、AAV血清型12(AAV12)、AAV血清型13(AAV13)、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，VP1来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型VP1，其与这些野生型VP1蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。在一些实施方案中，VP1来源于血清型AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型VP1，其具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。

在一些实施方案中，VP2可以来源于AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，VP2来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型VP2，其与这些野生型VP1蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。在一些实施方案中，VP2来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型VP2，其具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。

VP3可以来源于AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，VP3来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型VP3，其与这些野生型VP3蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。在一些实施方案中，VP3来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型VP3，其具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。

在一些实施方案中，cap包含来源于相同血清型的AAV的VP1、VP2和/或VP3，例如，cap可以包含全部来源于AAV2的VP1、VP2和/或VP3。在一些实施方案中，cap包括来源于不同血清型的AAV的VP1、VP2和/或VP3。例如，cap可以包含来源于AAV1、AAV2、AAV2变体(诸如AAV2.7m8、AAV2(quad Y-F)和AAV2tYF)、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74和AAV-2i8中的任一种的VP1、VP2和/或VP3中的一种或多种。

在一些实施方案中，编码cap的第一序列可操作地连接至第一启动子。第一启动子可以是本领域已知的能够驱动cap在细胞中表达的任何合适的启动子。在一些实施方案中，第一启动子可以是组织特异性启动子、组成型启动子或调控型启动子。在一些实施方案中，第一启动子可以选自不同来源，例如，第一启动子可以是病毒启动子、植物启动子或哺乳动物启动子。

第一启动子的实例包括但不限于人巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子(例如，CMV立即早期(CMV immediate early，CMV IE)增强子/启动子)、SV40增强子/启动子(例如，SV40早期增强子/启动子)、JC多瘤病毒启动子、髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)或胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)启动子、单纯疱疹病毒(HSV-1)潜伏相关启动子(LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子、神经元特异性启动子(NSE)、血小板源性生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑色素聚集激素(MCH)启动子、CBA、基质金属蛋白启动子(MPP)、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子。

在一些实施方案中，第一启动子是适合于在哺乳动物细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是HEK293细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，衍生细胞是HEK293T细胞。在一些实施方案中，第一启动子是适合于在昆虫细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。在一些实施方案中，适合于在昆虫细胞中表达的启动子包括但不限于polh启动子、p10启动子、基本启动子、诱导型启动子、E1启动子或ΔE1启动子。在一些实施方案中，第一启动子是polh启动子。在一些实施方案中，第一启动子是p10启动子。

在一些实施方案中，第一序列的3'端还包含多聚腺苷酸化序列(即，多聚(A)序列)。在一些实施方案中，多聚腺苷酸化序列的长度可以在约1bp至500bp的范围内。在一些实施方案中，多聚腺苷酸化序列的长度可以是但不限于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、50个、10个、200个或500个核苷酸。在一些实施方案中，多聚(A)序列是hGH多聚(A)、SV40多聚(A)或β-珠蛋白多聚(A)。

在一些实施方案中，第二序列编码AAV rep蛋白，其中rep蛋白可以是复制和包装rAAV病毒颗粒必要的任何复制蛋白。在一些实施方案中，rep蛋白包括rep78、rep68、rep52和rep40。在一些实施方案中，rep蛋白不必包括rep78、rep68、rep52和rep40中的所有，只要它允许rAAV病毒颗粒被复制和包装即可。在一些实施方案中，rep蛋白包括rep78、rep68、rep52和rep40中的任何三种。在一些实施方案中，rep蛋白包括rep78、rep68、rep52和rep40中的任何两种。在一些实施方案中，rep蛋白包括rep78、rep68、rep52和rep40中的任何一种。在一些实施方案中，rep蛋白包括rep78和rep52。在一些实施方案中，rep蛋白包括rep78和rep40。在一些实施方案中，rep蛋白包括rep68和rep52。在一些实施方案中，rep蛋白包括rep68和rep40。

rep78、rep68、rep52和rep40可以来源于任何AAV血清型。在一些实施方案中，rep78可以来源于AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，rep78来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型rep78，其与这些野生型rep78蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。在一些实施方案中，rep78来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型rep78，其具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。

在一些实施方案中，rep68可以来源于AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，rep68来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型rep68，其与这些野生型rep68蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。在一些实施方案中，rep68来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型rep68，其具有一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。

在一些实施方案中，rep52可以来源于AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，rep52来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型rep52，其与这些野生型rep52蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。在一些实施方案中，rep52来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型rep52，其具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。

在一些实施方案中，rep40可以来源于AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，rep40来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型rep52，其与这些野生型rep52蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。在一些实施方案中，rep40来源于血清型AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74或AAV-2i8的野生型rep52，其具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。

在一些实施方案中，rep包含来源于相同血清型AAV的rep78、rep68、rep52和/或rep40。例如，rep可以包含仅来源于AAV2的rep78、rep68、rep52和/或rep40。在一些实施方案中，rep包括来源于不同血清型AAV的rep78、rep68、rep52和/或rep40。例如，rep可以包括AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV rep78、rep68、rep52和/或rep40中的一种或多种。

在一些实施方案中，编码rep蛋白的第二序列可操作地连接至第二启动子。第二启动子可以是本领域已知的能够驱动cap在细胞中表达的任何合适的启动子。在一些实施方案中，第二启动子可以是组织特异性启动子、组成型启动子或调控型启动子。在一些实施方案中，第二启动子可以选自不同来源。例如，第二启动子可以是病毒启动子、植物启动子或哺乳动物启动子。

第二启动子的实例包括但不限于人巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子(例如，CMV立即早期(CMV IE)增强子/启动子)、SV40增强子/启动子(例如，SV40早期增强子/启动子)、JC多瘤病毒启动子、髓磷脂碱性蛋白(MBP)或胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疱疹病毒(HSV-1)潜伏相关启动子(LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子、神经元特异性启动子(NSE)、血小板源性生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑色素聚集激素(MCH)启动子、CBA、基质金属蛋白启动子(MPP)、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG、MNDU3、PGK和EF1a启动子。

在一些实施方案中，第二启动子是适合于在哺乳动物细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是HEK293细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，衍生细胞是HEK293T细胞。在一些实施方案中，第二启动子是适合于在昆虫细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。在一些实施方案中，适合于在昆虫细胞中表达的启动子包括但不限于polh启动子、p10启动子、基本启动子、诱导型启动子、E1启动子或ΔE1启动子。在一些实施方案中，第二启动子是polh启动子。在一些实施方案中，第二启动子是p10启动子。

在一些实施方案中，第二序列的3'端还包含多聚腺苷酸化序列(即，多聚(A)序列)。在一些实施方案中，多聚腺苷酸化序列的长度可以在约1bp至500bp的范围内。在一些实施方案中，多聚腺苷酸化序列的长度可以是但不限于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、50个、10个、200个或500个核苷酸。在一些实施方案中，多聚(A)序列是hGH多聚(A)、SV40多聚(A)或β-珠蛋白多聚(A)。

在一些实施方案中，cap和rep可以来源于相同AAV血清型。例如，cap和rep都可以来源于相同的AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8或任何其它已知的AAV。

在一些实施方案中，cap和rep可以来源于不同AAV血清型。例如，cap可以来源于AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8或任何其它已知的AAV，而rep可以来源于除cap来源之外的提到的任何AAV。例如，cap可以来源于AAV2，而rep来源于AAV5。

在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子可以是相同启动子。例如，第一启动子和第二启动子是选自polh启动子、p10启动子、基本启动子、诱导型启动子、E1启动子和ΔE1启动子的相同启动子。例如，在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子都是polh启动子。在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子都是p10启动子。

在一些实施方案中，第一启动子和第二启动子可以是不同启动子。例如，第一启动子和第二启动子可以是选自polh启动子、p10启动子、基本启动子、诱导型启动子、E1启动子和ΔE1启动子的两种不同的启动子。例如，在一些实施方案中，第一启动子是polh启动子，并且第二启动子是p10启动子。在一些实施方案中，第一启动子是p10启动子，并且第二启动子是polh启动子。

在一些实施方案中，第一序列和第二序列通过编码接头的序列连接。在一些实施方案中，接头是可切割接头。在一些实施方案中，可切割接头是包含2A肽的序列。在一些实施方案中，2A肽可以选自来源于口蹄疫病毒(Aphthora)或心脏病毒(Cardiovirus)属的2A肽，例如来源于口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾病毒(TaV)或猪捷申病毒(PTV-1)的2A肽。在一些实施方案中，接头编码序列还包含启动子序列。在一些实施方案中，启动子是FMDV启动子。

在一些实施方案中，本文公开的组合物的第二多核苷酸包含第三序列，其包含编码VEGF抑制剂的密码子优化的核酸序列。在一些实施方案中，组合物包含scAAV载体，其中scAAV载体包含第二多核苷酸。在一些实施方案中，组合物包含ssAAV载体，其中ssAAV载体包含第二多核苷酸。

VEGF抑制剂可以是能够通过抑制VEGF蛋白的活性或表达来抑制VEGF蛋白的生物学功能的任何多肽或蛋白质。在一些实施方案中，VEGF抑制剂是抗VEGF抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体和双抗体。在一些实施方案中，抗VEGF抑制剂选自雷珠单抗、贝伐珠单抗(bevacizumab)或阿柏西普。

在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:1具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ IDNO:2或与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:2具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:3具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:4具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。

在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:5具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ IDNO:6或与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:6具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:7具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。

在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:8具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ IDNO:9或与SEQ ID NO:9具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:9具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:10具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。

在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码雷珠单抗。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码贝伐珠单抗。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码阿柏西普。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。

在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:5、SEQID NO:6和SEQ ID NO:7具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的氨基酸序列的蛋白质。

在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:10具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10或与SEQ ID NO:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的氨基酸序列的蛋白质。

在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:12或与SEQ ID NO:12具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列的蛋白质。

在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含与SEQ ID NO 13相比数目不同的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含比SEQ ID NO 13少的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含比SEQ ID NO 13多的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含少于60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含多于5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个或80个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含0-80个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含5-75个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含10-70个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含15-65个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含20-60个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含25-55个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含30-50个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含35-45个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含60个、59个、58个、57个、56个、55个、54个、53个、52个、51个、50个、49个、48个、47个、46个、45个、44个、43个、42个、41个、40个、39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列不含有CpG二核苷酸。在一些实施方案中，第三序列包含序列SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18。

在一些实施方案中，第三序列可操作地连接至第三启动子。在一些实施方案中，第三启动子是CMV启动子、CAG启动子、MNDU3启动子、PGK启动子、EF1a启动子或眼部特异性启动子。在一些实施方案中，眼部特异性启动子是视网膜色素上皮(RPE)细胞特异性启动子。RPE细胞特异性启动子包括但不限于RPE65基因启动子、人视网膜结合蛋白(CRALBP)基因启动子、鼠11-顺式-视黄醇脱氢酶(RDH)基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3(Timp3)启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子和玻璃体黄斑营养不良2(卵黄状黄斑营养不良2)启动子、光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子。

在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含其它调控序列，包括但不限于反向末端重复序列(ITR)、增强子、剪接信号、多聚腺苷酸化信号(多聚(A))、填充序列、终止子、蛋白质降解信号、内部核糖体进入元件(IRES)、2A序列。在一些实施方案中，多聚(A)序列是hGH多聚(A)、SV40多聚(A)或β-珠蛋白多聚(A)。

在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含增强子区。在一些实施方案中，增强子区包括SV40增强子、巨细胞病毒增强子、IRBP增强子、来源于免疫球蛋白基因的增强子。在一些实施方案中，增强子区位于CMV、CAG、MNDU3、PGK或EF1a启动子的上游。在一些实施方案中，增强子位于眼部特异性启动子的上游。在一些实施方案中，增强子区位于CMV、CAG、MNDU3、PGK、EF1a启动子的下游。在一些实施方案中，增强子位于眼部特异性启动子的下游。

在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含至少一个ITR。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含两个ITR。在一些实施方案中，两个ITR是相同的。在一些实施方案中，两个ITR彼此不同。在一些实施方案中，ITR是来源于AAV的ITR。在一些实施方案中，ITR可以来源于AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，与来自AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和其它已知的AAV的野生型ITR相比，ITR具有一个或多个碱基突变、插入或缺失，但保留了所需的末端重复序列功能，诸如靶基因复制、病毒包装和/或整合。

在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含一个或多个填充序列。在一些实施方案中，填充序列位于CMV、CAG、MNDU3、PGK或EF1a启动子序列的上游。在一些实施方案中，填充序列位于CMV、CAG、MNDU3、PGK或EF1a启动子序列的下游。在一些实施方案中，填充序列位于眼部特异性启动子的上游。在一些实施方案中，填充序列位于眼部特异性启动子的下游。在一些实施方案中，填充序列位于5'ITR序列的5'末端。在一些实施方案中，填充序列位于5'ITR序列的3'末端。在一些实施方案中，填充序列位于3'ITR序列的5'末端。在一些实施方案中，填充序列位于3'ITR序列的3'末端。

在一些实施方案中，填充序列的长度可以是约0.1kb-5kb，诸如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4.0kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb或5.0kb。

在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含内含子。在一些情况下，内含子可以指可以被转录但不被翻译的任何序列。在一些情况下，内含子可以指被转录并从细胞中的成熟RNA转录物中去除的任何序列。在一些情况下，内含子可以包含约至少1bp、50bp、100bp、150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp或5000bp。在一些情况下，内含子可以为约300bp。在一些情况下，内含子可以为约200-400bp。在一些情况下，内含子可以为约100-500bp。在一些情况下，内含子可以为约50-200bp。在一些情况下，内含子可以是完整的天然存在的内含子或嵌合内含子。在一些实施方案中，内含子位于第三序列的上游。在一些实施方案中，内含子位于启动子的下游。在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含调控元件。在一些实施方案中，调控元件包含TPL(来自腺病毒的三联前导序列)和eMLP(来自腺病毒主要晚期启动子的增强子元件)序列。在一些实施方案中，调控元件位于第三序列的上游。在一些实施方案中，调控元件位于启动子的下游。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列位于第三序列的上游。在一些实施方案中，Kozak序列位于内含子的下游。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含人支架附着区(SAR)序列。在一些实施方案中，SAR序列位于第三序列的下游。在一些实施方案中，SAR序列位于多聚A信号的上游。

在一些实施方案中，第二多核苷酸包含少于300个、290个、280个、270个、260个、250个、240个、230个、220个、210个、200个、190个、180个、170个、160个、150个、140个、130个、120个、110个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个或10个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含多于5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含100-300个、100-200个、100-150个、150-200个、150-250个、150-300个、200-250个、200-300个或250-300个CpG二核苷酸。

在一些实施方案中，第二多核苷酸还包含编码不同治疗性蛋白质的第四序列。在一些实施方案中，不同的治疗性蛋白质是VEGF抑制剂、PDGF抑制剂、整联蛋白抑制剂、mTOR抑制剂、血管生成素抑制剂或TGFβ抑制剂。

在一些实施方案中，第四序列和第三序列通过编码接头的序列连接。在一些实施方案中，接头是可切割接头。在一些实施方案中，可切割接头包含2A肽的序列。在一些实施方案中，2A肽可以选自来源于口蹄疫病毒或心脏病毒属的2A肽，例如，口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV)、明脉扁刺蛾病毒(TaV)或猪捷申病毒(teschovirus)(PTV-1)的2A肽。

重组AAV病毒颗粒

在另一方面中，本公开内容提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其通过将本公开内容的组合物或多核苷酸引入到细胞中来制备。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞是HEK293细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，衍生细胞是HEK293T细胞。

在一些实施方案中，本公开内容的组合物可以通过本领域已知的任何方法递送到细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀和脂质体介导。在一些实施方案中，组合物被稳定地转染到细胞中。在一些实施方案中，组合物被瞬时地转染到细胞中。在一些实施方案中，细胞用于产生rAAV病毒颗粒。

rAAV病毒颗粒可以根据本领域技术人员已知的方法从细胞中分离和纯化。例如，可以使用离心、HPLC、疏水相互作用色谱法(HIC)、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、超滤、凝胶电泳、亲和色谱法和/或用于病毒颗粒的其它纯化技术来纯化rAAV。

在另一方面中，本公开内容提供了一种rAAV颗粒，其包含本文公开的任何多核苷酸。

多核苷酸

在另一方面中，本公开内容提供了一种多核苷酸，其包含编码VEGF抑制剂的密码子优化的核酸序列。VEGF抑制剂可以是能够通过抑制VEGF蛋白的活性或表达来抑制VEGF蛋白的生物学功能的任何多肽或蛋白质。在一些实施方案中，VEGF抑制剂是抗VEGF抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体和双抗体。在一些实施方案中，抗VEGF抑制剂选自雷珠单抗、贝伐珠单抗或阿柏西普。

在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:1具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ IDNO:2或与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:2具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:3具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含序列SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列。在一些实施方案中，VEGF抑制剂包含与SEQ ID NO:4具有至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同源性的序列。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白质。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含与SEQ IDNO:13相比数目不同的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含比SEQID NO:13少的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含比SEQ ID NO:13多的CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含少于60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含多于5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个或80个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含0-80个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含5-75个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含10-70个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含15-65个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含20-60个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含25-55个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含30-50个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含35-45个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列包含60个、59个、58个、57个、56个、55个、54个、53个、52个、51个、50个、49个、48个、47个、46个、45个、44个、43个、42个、41个、40个、39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，密码子优化的核酸序列不含有CpG二核苷酸。在一些实施方案中，第三序列包含序列SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含启动子。在一些实施方案中，启动子是CMV启动子、CAG启动子、MNDU3启动子、PGK启动子、EF1a启动子或眼部特异性启动子。在一些实施方案中，眼部特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白基因启动子、鼠11-顺式类视黄醇脱氢酶基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子、卵黄状黄斑营养不良2启动子和光感受器间类视黄醇结合蛋白启动子。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含其它调控序列，包括但不限于反向末端重复序列(ITR)、增强子、剪接信号、多聚腺苷酸化信号(多聚A)、填充序列、终止子、蛋白质降解信号、内部核糖体进入元件(IRES)、2A序列。在一些实施方案中，多聚A序列是hGH多聚(A)、SV40多聚(A)或β-珠蛋白多聚(A)。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含增强子区。在一些实施方案中，增强子区包括SV40增强子、巨细胞病毒增强子、IRBP增强子、来源于免疫球蛋白基因的增强子。在一些实施方案中，增强子区位于CMV、CAG、MNDU3、PGK或EF1a启动子的上游。在一些实施方案中，增强子位于眼部特异性启动子的上游。在一些实施方案中，增强子区位于CMV、CAG、MNDU3、PGK、EF1a启动子的下游。在一些实施方案中，增强子位于眼部特异性启动子的下游。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，多核苷酸包含至少一个ITR。在一些实施方案中，多核苷酸包含两个ITR。在一些实施方案中，两个ITR是相同的。在一些实施方案中，两个ITR彼此不同。在一些实施方案中，ITR是来源于AAV的ITR。在一些实施方案中，ITR可以来源于AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和任何其它已知的AAV。在一些实施方案中，与来自AAV1、AAV2、AAV3(包括AAV3A和3B)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-Rh10、AAV-Rh74、AAV-2i8和其它已知的AAV的野生型ITR相比，ITR具有一个或多个碱基突变、插入或缺失，但保留了所需的末端重复序列功能，诸如靶基因复制、病毒包装和/或整合。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含一个或多个填充序列。在一些实施方案中，填充序列位于CMV、CAG、MNDU3、PGK或EF1a启动子序列的上游。在一些实施方案中，填充序列位于CMV、CAG、MNDU3、PGK或EF1a启动子序列的下游。在一些实施方案中，填充序列位于眼部特异性启动子的上游。在一些实施方案中，填充序列位于眼部特异性启动子的下游。在一些实施方案中，填充序列位于5'ITR序列的5'端。在一些实施方案中，填充序列位于5'ITR序列的3'端。在一些实施方案中，填充序列位于3'ITR序列的5'端。在一些实施方案中，填充序列位于3'ITR序列的3'端。

在一些实施方案中，多核苷酸还包含内含子。在一些情况下，内含子可以指可以被转录但不被翻译的任何序列。在一些情况下，内含子可以指被转录并从细胞中的成熟RNA转录物中去除的任何序列。在一些情况下，内含子可以包含约至少1bp、50bp、100bp、150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp或5000bp。在一些情况下，内含子可以为约300bp。在一些情况下，内含子可以为约200-400bp。在一些情况下，内含子可以为约100-500bp。在一些情况下，内含子可以为约50-200bp。在一些情况下，内含子可以是完整的天然存在的内含子或嵌合内含子。在一些实施方案中，内含子位于密码子优化的核酸序列的上游。在一些实施方案中，内含子位于启动子的下游。在一些实施方案中，多核苷酸还包含调控元件。在一些实施方案中，调控元件包含TPL(来自腺病毒的三联前导序列)和eMLP(来自腺病毒主要晚期启动子的增强子元件)序列。在一些实施方案中，调控元件位于密码子优化的核酸序列的上游。在一些实施方案中，调控元件位于启动子的下游。在一些实施方案中，多核苷酸包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列位于密码子优化的核酸序列的上游。在一些实施方案中，Kozak序列位于内含子的下游。在一些实施方案中，多核苷酸包含人支架附着区(SAR)序列。在一些实施方案中，SAR序列位于密码子优化的核酸序列的下游。在一些实施方案中，SAR序列位于多聚A信号的上游。

系统

在另一方面中，本公开内容提供了一种用于治疗有需要的对象的眼部疾病的系统，其包含本文公开的rAAV颗粒和药学上可接受的载剂或赋形剂。

如本文所用，“药学上或治疗学上可接受的载剂或赋形剂”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对宿主或患者无毒的载剂介质。药物制剂中使用的载剂类型将取决于所使用的治疗化合物的施用方法。制备用于多种施用途径的药物组合物的方法是本领域众所周知的。“药学上可接受的眼用载剂”是指可用于将如本文公开的rAAV病毒颗粒直接或间接地递送到眼部、眼部上或眼部附近的药学上可接受的载剂或赋形剂。

在一些实施方案中，所述系统通过将本文公开的rAAV病毒颗粒溶解在合适的溶剂中来制备。合适的溶剂包括但不限于水、盐溶液(例如，NaCl)、缓冲溶液或其它溶剂。在某些实施方案中，溶剂是无菌的。

在制备所述系统中使用的悬浮液的水溶液和稀释剂可以包括蒸馏水或生理盐水。可以包括各种添加剂。这些添加剂可以包括额外的适合与眼部接触或在眼部周围使用而没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、刺激、过敏的成分、添加剂或载剂。示例性添加剂包括溶剂、碱剂、共溶剂、悬浮剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂、缓冲液、等渗调节剂、pH调节剂、螯合剂、舒缓剂、防腐剂、调味剂、调味剂、着色剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、吸收促进剂、分散剂、防腐剂和增溶剂。

例如，加入缓冲液以保持pH恒定，并且缓冲液可以包括药学上可接受的缓冲液，诸如硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液(其含有三(羟甲基)氨基甲烷和HCl)。

除了缓冲液之外，还可以将等渗剂添加到系统中以制备与眼泪等渗的制剂。等渗剂包括但不限于：糖，诸如右旋糖、葡萄糖、蔗糖和果糖；糖醇，诸如甘露醇和山梨醇；多元醇，诸如甘油、聚乙二醇和丙二醇；和盐，诸如氯化钠、柠檬酸钠、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、氯化麻黄碱(phedrine chloride)、氯化钾、氯化普鲁卡因(procainechloride)、氯霉素(chloram phenicol)和琥珀酸钠。等渗剂以使滴眼液的渗透压与泪液的渗透压相等的量添加。

在一些实施方案中，还希望使用额外的剂，包括但不限于：稳定剂，诸如亚硫酸钠、碳酸钠和丙二醇；抗氧化剂，诸如抗坏血酸、抗坏血酸钠、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、生育酚、硫代硫酸钠；和/或螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双-(2-氨基乙基)-N,N,N,N-四乙酸(EGTA)和柠檬酸钠。

本文公开的系统可以通过无菌程序制备，或者替代地可以在合适的制备阶段进行灭菌。例如，所述系统可以通过无菌地混合无菌成分来制备。替代地，可以通过首先混合各成分，然后对最终制剂进行灭菌来制备系统。灭菌方法可包括但不限于热灭菌、辐射和过滤。

本文公开的rAAV病毒颗粒还可以与其它治疗剂组合提供。在各种实施方案中，本文公开的化合物还可以与选自以下的眼部治疗剂组合提供：安贺拉(Acular)(酮洛芬氨丁三醇(ketoprofen tromethamine)眼用溶液)0.5％、Acuvail(酮洛酸氨丁三醇(ketorolactromethamine))、AK-Con-A(萘甲唑林(naphazoline)滴眼液)、Akten(盐酸利多卡因(lidocaine hydrochloride))、Alamast、阿法根(Alphagan)(溴莫尼定(bromidine))、Alrex、Astepro(盐酸)氮卓斯汀(Azelastine)喷鼻剂)、AzaSite(阿奇霉素(azithromycin))、Bepreve(苯磺酸贝他斯汀(bepotastine besylate)眼用溶液)、Besivance(贝西沙星(besifloxacin)眼用悬浮液、左倍他洛尔(Betaxon)、BSS无菌灌洗溶液、康舒目(Cosopt)、Durezol(二氟泼尼酯(difluprednate))、艾力雅(Abercept)、露达舒(Lotemax)、Lucentis(雷珠单抗)、卢美根(Lumigan)(比马前列素(bimatoprost)眼用溶液)、Macugen(哌加他尼(pigatinib))、Ocuflox(氧氟烷(oxyflurane)Saxine眼用溶液)0.3％、OcuHist、Ozurdex(地塞米松(dexamethasone))、Quixin(左氧氟沙星(levofloxacin))、Rescula(异丙基乌诺前列酮(unoprostone isopropyl)眼用溶液)0.15％、丽眼达(Restasis)(环孢霉素(cyclosporin)眼用乳液)、舒乐津(Salagen)片剂、苏为坦(Travatan)(曲伏前列素(travoprost)眼用溶液)、万赛维(Valcyte)(缬更昔洛韦盐酸盐(valganciclovir hydrochloride))、三氟胸苷(trifluorothymidine)(Viroptic)、Vistide(西多福韦(cidofovir))、Visudyne(注射用维替泊芬(verteporfin))、Vitrasert植入物、formamivir注射液、ZADITOR、Zioptan(他氟前列素(tafluprost)眼用溶液)、Zirgan(更昔洛韦(ganciclovir)眼用凝胶)、Zymaxid(加替沙星(gatifloxacin)眼用溶液)、阿托品(atropine)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、毒扁豆碱(Physostimine)、派立明(Azopt)、庆大霉素(Gentamicin)、丙美卡因(Proparacaine)、杆菌肽(Bacitracin)、羟丙甲纤维素(Hypromellose)滴眼液(Goniosol)、多粘菌素B(Polymyxin B.)聚维酮碘(Povidoneiodine)(Betadine)、短杆菌肽(gramicidin)、泼尼松龙(prednisolone)、倍他洛尔(betaxolol)、优目缩(Humorsol)、promethaine、倍他洛尔滴眼液(贝特舒(Betoptic))、Hylartin、普罗品(Propine)、布林佐胺(brinzolamide)、高渗NaCl、Puralube、BSS、吲哚菁绿(Indocycanine Green)、孟加拉玫红(Rose Bengal)、卡巴可(Carbachol)、伊曲康唑(Itraconazole)、透明质酸钠(Sodium Hyaluronate)、头孢唑啉(Cefazolin)、拉坦前列腺素(Latanoprost)、Sulofen、潇莱威(Xiao Celluvisc)、甘露醇、氧四环素(oxytetracycline)、氯胺苯醇(chloramphenicol)、醋甲唑胺(methazolamide)、噻吗洛尔(timolol)、Ciloxan、咪康唑(miconazole)、妥布霉素(tobramycin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、Miostat、曲安西龙(triamcinolone)、康舒目、Muro 128、三氟尿苷(trifluorouridine)、地美溴铵(Demecarium)、新霉素(neomycin)、托吡酯(topiramate)、葡聚糖地塞米松(dextran Dexamethasone)、甲醋唑胺(Neptazane)、舒露瞳(Trusopt)、Dipicolin、Ocuflox、阿糖腺苷(adenosine arabinoside)、多佐胺(dorzolamide)、氧氟沙星(ofloxacin)、Vira-A、肾上腺素(epinephrine)、氧四环素、三氟胸苷、荧光(fluorescence)、苯肾上腺素(phenylephrine)和适利达(Xalatan)。

示例性药物可以包括：抗血管生成剂，诸如血管抑素(angiostatin)、anecotastat、凝血栓蛋白(thrombospondin)、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂；抗血管内皮生长因子(抗VEGF)药物，诸如雷珠单抗(ranibizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、培加他尼(pegaptanib)、舒尼替尼(sunitinib)和索拉非尼(sorafenib)和针对血管生成的任何其它已知的小分子和转录抑制剂；眼用药物，包括青光眼剂，诸如肾上腺素能拮抗剂(例如β受体阻断药(beta-blocker)，诸如醋丁洛尔(acetbutolol)、阿替洛尔(atenolol)、比索洛尔(bisoprolol)、卡维地洛(carvedilol)、asmolol、拉贝洛尔(labetalol)、纳多洛尔(nadolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普奈洛尔(propranolol)、美替洛尔(metipranolol)、倍他洛尔(betaxolol)、卡替洛尔(carteolol)、左倍他洛尔(levobetaxolol)、左布诺洛尔(levobunolol)和噻吗洛尔(timolol)；肾上腺素能激动剂或拟交感神经药，诸如肾上腺素(epinephrine)、地匹福林(dipivefrin)、可乐亭(clonidine)、阿可乐定(aparclonidine)和溴莫尼定(brimonidine)；拟副交感神经药(parasympathomimetics)或胆碱能受体激动剂，诸如匹鲁卡品(pilocarpine)、卡巴胆碱(carbachol)、碘化二乙氧磷酰硫胆碱(phospholine iodine)、毒扁豆碱(physostigmine)、水杨酸、氯化乙酰胆碱、依色林(eserine)、氟磷酸二异丙酯(diisopropylfluorophosphate)、地美溴铵(demecariumbromide)；蕈毒碱(muscarinic)；碳酸酐酶抑制剂剂，包括局部和/或全身性剂，诸如乙酰唑胺(acetozolamide)、布林佐胺(brinzolamide)、多佐胺(dorzolamide)、醋甲唑胺(methazolamide)、依索唑胺(ethoxzolamide)、乙酰唑胺(diamox)和双氯非那胺(dichlorphenamide)；睫状肌麻痹散瞳剂(mydriatic-cycloplegic agent)，诸如阿托品(atropine)、环喷托酯(cyclopentolate)、琥珀胆碱(succinylcholine)、后马托品(homatropine)、苯肾上腺素(phenylephrine)、东莨菪碱(scopolamine)和托吡卡胺(tropicamide)；前列腺素，诸如前列腺素F2α、抗前列腺素、前列腺素前体；或前列腺素类似物剂，诸如比马前列素(bimatoprost)、拉坦前列素(latanoprost)、曲伏前列素(travoprost)和乌诺前列酮(unoprostone)。

额外的示例性药物还可以包括抗炎药物，包括例如糖皮质激素和皮质类固醇，诸如倍他米松(betamethasone)、可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松21磷酸盐(dexamethasone 21-phosphate)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松龙21-磷酸盐(prednisolone 21-phosphate)、乙酸泼尼松龙(prednisolone acetate)、泼尼松龙(prednisolone)、氟米龙(flumiron)、氯替泼诺(loteprednol)、甲泼尼龙、氟轻松(fluocinolone)、曲安奈德(triamcinolone)、曲安奈德、乙酸曲安奈德(triamcinoloneacetate)、倍氯米松(beclomethasone)、布地奈德(budesonide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟米松(flumethasone)、氟替卡松(fluticasone)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氢化可的松(hydrocortisone)、乙酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、氯替泼诺(loteprednol)、rimetholone；非甾体抗炎药物，包括阿司匹林(aspirin)、双氯芬酸(diclofenac)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、溴芬酸(bromfenac)、奈帕芬胺(nepafenac)、酮洛芬(ketoprofen)、水杨酸盐(salicylate)、吲哚美辛(indomethacin)、naxopren、吡罗昔康(piroxicam)、萘丁美酮二氟尼柳(nabumetonediflunisal)、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、氯酸盐(chlorate)、甲芬那酸(mefenamicacid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、奥沙普秦(oxaprozin)、吡罗昔康(piroxicam)、二水杨酸盐、舒林酸(sulindac)和托麦汀(tolmetin)；COX-2抑制剂，诸如塞来昔布(celecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)和伐地昔布(valdecoxib)；抗感染或抗微生物剂，诸如抗生素，例如，四环素(tetracycline)、氯四环素(chlortetracycline)、杆菌肽(bacitracin)、新霉素(neomycin)、多粘菌素(polymyxin)、短杆菌素(brevibacillin)、头孢氨苄(cephalexin)、氧四环素(oxytetracycline)、氯霉素(chloramphenicol)、利福平(rifampicin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、妥布霉素(tobramycin)、庆大霉素(gentamicin)、红霉素(erythromycin)、青霉素(penicillin)、磺胺药(sulfonamides)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、磺胺异噁唑(sulfisoxazole)、呋喃西林(nitrofurazone)、丙酸钠(sodium propionate)、氨基糖苷类(aminoglycosides)诸如庆大霉素(gentamicin)、妥布霉素(tobramycin)、阿米卡星(amikacin)和链霉素(streptomycin)；氟喹诺酮类(fluoroquinolones)，诸如环丙沙星(ciprofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)；杆菌肽、红霉素、夫西地酸(fusidic acid)、新霉素(neomycin)、多粘菌素B、短杆菌肽、α氧联苯胺(alphaoxybenzidine)和胺磺甲草酰胺(sulfamethoxamide)；抗真菌剂，诸如两性霉素(amphotericin)B、卡泊芬净(caspofungin)、克霉唑(clotrimazole)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、伏立康唑(voriconazole)、特比萘芬(terbinafine)、制霉菌素(nystatin)和咪康唑(miconazole)；抗疟疾剂，诸如氯喹(chloroquine)、阿托伐醌(atovaquone)、甲氟喹(mefloquine)、伯氨喹(primaquine)、奎尼丁(quinidine)和奎宁(quinine)；抗分枝杆菌剂，诸如乙胺丁醇(ethambutol)、异烟肼(isoniazid)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、利福平(rifampin)和利福布汀(Rifabutin)；抗寄生物剂，诸如阿苯哒唑(albendazole)、甲苯达唑(mebendazole)、硫本达唑(thiobendazole)、双唑盐(bisazolate)栓剂、硫脲嘧啶(thiuracil)、阿托伐醌(atovaquone)、碘喹诺酮(iodoquinaol)、依维菌素(ivermectin)、巴龙霉素(paromomycin)、吡喹酮(praziquantel)和曲美沙特(trimatrexate)。

方法

在另一方面中，本公开内容提供了一种用于在对象的细胞或组织中表达VEGF抑制剂的方法，其包括向对象的细胞或组织施用本文公开的组合物、rAAV颗粒、多核苷酸或系统中的任一种。在一些实施方案中，可以通过本领域已知的任何合适的方法将组合物、rAAV颗粒、多核苷酸或系统施用至对象。在一些实施方案中，细胞或组织与眼部有关。在一些实施方案中，可以通过结膜下、眼球后、眼周、视网膜下、脉络膜上或眼内途径将组合物、rAAV颗粒、多核苷酸或系统应用至眼部。

在另一方面中，本公开内容提供了一种用于治疗眼部疾病的方法，其包括向有需要的对象施用治疗有效量的本文公开的组合物、rAAV颗粒、多核苷酸或系统。

在一些实施方案中，可以通过本领域已知的任何合适的方法将系统施用至对象。在一些实施方案中，可以通过结膜下、眼球后、眼周、视网膜下、脉络膜上或眼内途径将系统应用至眼部。

在一些实施方案中，眼部疾病包括但不限于年龄相关性黄斑变性(AMD)、湿性AMD、干性AMD、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization)、糖尿病视网膜病变、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病变和糖尿病性视网膜水肿。

在一些实施方案中，包括rAAV病毒颗粒的系统以在医学上可接受的毒性水平下实现所需生物效果的治疗有效量提供。剂量可以基于施用途径和疾病的严重程度而变化。还可以根据每个待治疗患者的体重、年龄、性别和/或症状程度来调整剂量。应当理解，可能需要根据患者的年龄和体重以及待治疗病况的严重程度对剂量进行常规改变。

在一些实施方案中，治疗有效量通常为约1×10⁵-1×10¹³个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，治疗有效量通常为约1×10⁶-1×10¹²个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，治疗有效量通常为约1×10⁷-1×10¹²个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，治疗有效量通常为约1×10⁸-1×10¹²个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，治疗有效量通常为约1×10⁹-1×10¹²个rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，治疗有效量通常为约1×10¹⁰-1×10¹²个rAAV病毒颗粒。

在一些实施方案中，递送的体积为每个眼部约0.005mL-0.5mL。在一些实施方案中，递送的体积为每个眼部约0.05mL-0.5mL。在一些实施方案中，递送的体积为每个眼部约0.1mL-0.5mL。在一些实施方案中，递送的体积为每个眼部约0.2mL-0.5mL。

在一些实施方案中，施用频率可以是每天至少一次，包括每天2次、3次、4次或5次。在一些实施方案中，治疗可持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天天、48天、49天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、150天、200天、250天、300天、400天、500天、750天、1000天或多于1000天。

在一些实施方案中，rAAV颗粒或多核苷酸的施用还可以包括离体施用。在一些实施方案中，离体施用包括(1)从对象分离出感兴趣的细胞或组织，(2)使细胞或组织与足以转染细胞或组织的量与rAAV接触以提供足够水平的基因转移和表达而没有不当的副作用，以及(3)将细胞或组织转移回对象体内。在一些实施方案中，细胞或组织可以在转染之前和/或之后离体培养数天。在一些实施方案中，细胞或组织与眼部有关。

在另一方面中，本公开内容提供了一种用于制备重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其包括用本文公开的组合物、rAAV颗粒、多核苷酸或系统中的任一种转染细胞。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是HEK293细胞或其衍生细胞。在一些实施方案中，衍生细胞是HEK293T细胞。在一些实施方案中，所述方法包括生成杆状病毒质粒DNA和/或杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括生成包含VEGF抑制剂表达序列(诸如本文公开的多核苷酸)的杆状病毒质粒DNA。在一些实施方案中，所述方法包括生成杆状病毒质粒DNA rAAVcap-rep表达序列。在一些实施方案中，所述方法包括用杆状病毒质粒DNA转染细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括用包含VEGF抑制剂表达序列的杆状病毒质粒DNA转染细胞以产生杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法包括用杆状病毒质粒DNA转染细胞以产生包含rAAV cap-rep表达序列的杆状病毒。在一些实施方案中，所述方法还包括混合杆状病毒以感染细胞(诸如Sf9细胞)以获得本文公开的包装的rAAV/VEGF抑制剂病毒颗粒。

在一些实施方案中，本文公开的组合物或本文公开的多核苷酸可以通过本领域已知的任何方法递送到细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀和脂质体介导。在一些实施方案中，组合物或多核苷酸被稳定地转染到细胞中。在一些实施方案中，组合物或多核苷酸被瞬时地转染到细胞中。递送媒介物诸如脂质体、纳米囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可用于将载体、组合物或多核苷酸引入到细胞中。特别地，载体、组合物或多核苷酸可以被配制用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒中的递送。

试剂盒

另一方面，本公开内容提供了一种用于治疗眼部疾病的试剂盒，其包括本文公开的rAAV颗粒或系统以及说明书。在一些实施方案中，说明书用于指示施用rAAV颗粒或系统以治疗眼部疾病的方法。

在一些实施方案中，试剂盒还包括容器。在一些实施方案中，容器被配置为递送本文所述的系统。在一些实施方案中，容器包括小瓶、滴管、瓶子、管和注射器。在一些实施方案中，容器是用于应用系统的滴管。在一些实施方案中，容器是用于施用系统的注射器。

本公开内容的一些实施方案通过以下实施例进一步说明，所述实施例不应被解释为限制性的。本领域的技术人员将理解，以下实施例中公开的技术代表了发明人已经发现在实施本文所述的实施方案中行之有效的技术，并且因此可被视为构成了用于实施这些实施方案的技术。然而，基于本公开内容，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在本文公开的具体实施方案中进行许多变化，并且仍然可以获得相同或相似的结果。

实施例

以下实施例进一步说明本发明。这些实施例仅旨在说明本发明，并且不应解释为限制本发明。

实施例1重组AAV载体的设计

合成了来源于AAV2的cap和rep编码序列以及它们对应的启动子，并且将其克隆到pUC57、pFastBac1、修饰的pUC57或修饰的pFastBac1中以获得包含cap和rep蛋白的编码序列的第一多核苷酸。

合成了编码绿荧光蛋白(GFP)的核苷酸序列或编码VEGF抑制剂阿柏西普的核酸序列，并且将它们与它们对应的启动子一起克隆到pUC57、pFastBac1、修饰的pUC57或修饰的pFastBac1中以获得分别含有GFP或阿柏西普的编码序列的第二多核苷酸。用于第二多核苷酸的构建体的设计可见于表2。

表2.构建体设计

“co”是指“密码子优化的”。例如，“co1”指密码子优化的序列#1。“CMVep”是指CMV增强子和启动子。“sv40i”是指SV40内含子。

实施例2质粒转染

为了确定所设计构建体的表达强度，将2×10⁵个HEK293T细胞接种在24孔板中并且培养过夜。将0.5μg每种表达构建体质粒与每孔1.5μL Mirus TransT-

转染试剂一起在50μL Opti-Mem培养基(DNA(ug):Mirus试剂(ul)＝1:3)中混合。48小时之后，通过荧光显微镜和流式细胞仪检测了GFP的表达(图1A和图1B)，表明表达盒成功转染了细胞。48小时之后收获上清液培养物培养基以用于阿柏西普检测。

实施例3重组AAV病毒颗粒的制备

将实施例1中获得的第一多核苷酸和第二多核苷酸混合以形成组合物，并且使用组合物加辅助质粒转染HEK293T细胞，以获得包装的rAAV2.7m8/阿柏西普病毒颗粒和rAAV2.7m8/GFP病毒颗粒。AAV颗粒还可以通过bac至AAV(bac to AAV)技术产生，即首先生成两个分别含有Rep-Cap和转基因表达盒的杆状病毒质粒，然后针对这两个杆状病毒质粒产生杆状病毒，通过在Sf9细胞中感染Rep-Cap和转基因表达杆状病毒两者可以产生rAAV。使用梯度超速离心从HEK293T细胞中分离和纯化重组AAV2.7m8/阿柏西普病毒颗粒和AAV2.7m8/GFP病毒颗粒。

实施例4来自转染细胞的阿柏西普表达水平

通过定量ELISA测量细胞培养物上清液中阿柏西普的表达水平。ELISA板用100uL/孔的在包被缓冲液中浓度为1ug/mL的重组人VEGFA(rhVEGFA)包被，并且在4℃下孵育过夜。用洗涤缓冲液洗涤之后，用300uL/孔的无蛋白封闭缓冲液封闭板。之后，洗涤板，并且以1:1000稀释添加样品(100uL/孔)并在室温下孵育2h。然后再次洗涤板，并且将100uL/孔的在含BSA 1％的PBS中为500ng/mL的与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG(Fcγ)特异性抗体的Fc结构域添加至孔。洗涤之后，向孔中添加100uL/孔的SuperSignal ELISA Pico化学发光底物，并且使用酶标仪测量发光信号。结果如表3中所示。

表3.ELISA数据

数据被设计成在以下范围内：

阿柏西普浓度(ng/ml)：A>15,000>B>10,000>C>1000>D实施例5.来自rAAV的阿柏西普的活性水平

利用HUVEC增殖测定测量293T细胞中rAAV转导之后表达的阿柏西普的活性水平。具体地讲，将100μl人脐静脉内皮细胞(HUVEC)悬浮液分配到96孔板中的基础培养基(约5000个细胞/孔)中。将板孵育4小时。在基础培养基中与VEGF(80ng/mL)一起制备上清液样品的100_x稀释液，并将其孵育1小时。将100μl稀释液添加至HUVEC中。将板孵育4天。将20μl细胞计数试剂盒-8(CCK-8)溶液添加至板的每个孔中。将板在培养箱中孵育4小时。在450nm处读板。

基于以下公式计算阿柏西普对HUVEC的抑制活性：抑制％＝(OD_(GFP对照)-OD_(样品))/(OD_(GFP对照)-OD_(空白))*100％

如本领域技术人员所理解的，CCK-8是非放射性的，其实现灵敏的比色测定法，以便在细胞增殖和细胞毒性测定中确定活细胞的数目。通过在细胞中的脱氢酶将WST-8还原以得到橙色产物(甲臜(formazan))，其可溶于组织培养物培养基。产生的甲臜的量与活细胞的数目成正比，并且通过在460nm处的吸光度进行测量。细胞计数试剂盒8(WST-8/CCK8)(ab228554)提供了一种方便且可靠的进行细胞活力测定的方式。所述试剂盒使用水溶性四唑盐以通过在存在电子载体的情况下的生物还原之后产生橙色甲臜染料来量化活细胞的数目。

结果显示分泌的阿柏西普抑制了VEGF诱导的HUVEC增殖。换言之，分泌的阿柏西普保留了生物活性。结果如表4中所示。

表4.HUVEC增殖测定数据

数据被设计成在以下范围内：

HUVEC细胞增殖的抑制：A>40>B>25>C>10>D

实施例6.体外AAV感染

将100uL 6×10⁵个细胞/mL的293T细胞(6×10⁴/孔)接种在96孔板中的DMEM完全培养基中的每个孔中。将细胞培养1小时，然后弃去培养基。将MOI 5.56×10³和1.67×10⁴的具有7m8 AAV载体的30uL DMEM完全培养基添加到每个孔中并且孵育过夜。MOI是基于微滴式数字PCR(ddPCR)滴度计算的。第二天，添加70uL DMEM完全培养基。将细胞培养总计48小时。

接下来，通过定量ELISA测量细胞培养物上清液中阿柏西普的表达水平。ELISA板用100uL/孔的在包被缓冲液中浓度为1ug/mL的重组人VEGFA(rhVEGFA)包被，并且在4℃下孵育过夜。用洗涤缓冲液洗涤之后，用300uL/孔的无蛋白封闭缓冲液封闭板。之后，洗涤板，并且以1:1000稀释添加样品(100uL/孔)并在室温下孵育2h。然后再次洗涤板，并且将100uL/孔的在含BSA 1％的PBS中为500ng/mL的与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG(Fcγ)特异性抗体的Fc结构域添加至孔。洗涤之后，向孔中添加100uL/孔的SuperSignal ELISAPico化学发光底物，并且使用酶标仪测量发光信号。结果如表5中所示。

表5.阿柏西普ELISA数据

数据被设计成在以下范围内：

对于左列(MOI＝1.67E+4)，阿柏西普浓度(ng/ml)：A>3,000>B>2,000>C>1,000>D；对于右列(MOI＝5.56E+3)，阿柏西普浓度(ng/ml)：A>1,500>B>1,000>C>500>D。

实施例7.测量来自rAAV的阿柏西普活性

将20uL阿柏西普上清液样品与20uL DMEM完全培养基(含有2ug/mL VEGF)混合并孵育1小时。根据VEGF生物测定(Promega GA2001)的制造商的说明，将25uL样品稀释液分配到25uL预铺板的细胞中。基于以下公式计算阿柏西普的活性：

倍数抑制＝RLU(仅细胞–测定样品)/RLU(仅细胞-背景)

(RLU：相对光单位)

表达自rAAV的阿柏西普对VEGF的抑制的结果表明，培养物上清液中的分泌的阿柏西普具有生物活性。数据如表6中所示。

表6.阿柏西普活性数据

数据被设计成在以下范围内：

对于左列(MOI＝1.67E+4)，VEGF的抑制(荧光素酶-报告基因)：A>60>B>40>C>20>D；对于右列(MOI＝5.56E+3)，VEGF的抑制(荧光素酶-报告基因)：A>35>B>25>C>15>D。

实施例8小鼠中VEGF抑制剂的递送和表达

将小鼠分为两组：对照组和实验组。将两组中的小鼠分别玻璃体内注射实施例3中纯化的AAV2.7m8/VEGF抑制剂的病毒颗粒。收集眼部组织以通过ELISA测量阿柏西普的浓度。

实施例9本申请的组合物的体内功效

激光诱导的脉络膜新生血管形成(LCNV)是一种脉络膜血管生成模型，其用作湿性年龄相关性黄斑变性的临床前模型。使用对照、本申请中的含有rAAV2.7m8/VEGF抑制剂病毒颗粒的系统进行了双臂临床实验，以验证本申请中描述的系统的有效性。

序列表

SEQ ID NO:1-阿柏西普的氨基酸序列

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO:2-VEGF受体1(VEGFR1)结构域2-VEGF受体2(VEGFR2)结构域3融合蛋白的氨基酸序列

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEDPIEGR

SEQ ID NO:3-VEGF受体1(VEGFR1)结构域2的氨基酸序列

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIID

SEQ ID NO:4-VEGF受体2(VEGFR2)结构域3的氨基酸序列

VVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEDPIEGR

SEQ ID NO:5-重链CDR1的氨基酸序列

GYDFTHYGMN

SEQ ID NO:6-重链CDR2的氨基酸序列

WINTYTGEPTYAADFKR

SEQ ID NO:7-重链CDR3的氨基酸序列

YPYYYGTSHWYFDV

SEQ ID NO:8-轻链CDR1的氨基酸序列

SASQDISNYLN

SEQ ID NO:9-轻链CDR1的氨基酸序列

FTSSLHS

SEQ ID NO:10-轻链CDR2的氨基酸序列

QQYSTVPWT

SEQ ID NO:11-重链(VH)可变结构域的氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHL

SEQ ID NO:12-轻链(VL)可变结构域的氨基酸序列

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:13-VEGF-trap(阿柏西普)核酸序列(WO2005000895)

ATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTAGTTCCGGAAGTGATACCGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGAAAAGGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO:14阿柏西普密码子优化的#1(CpG计数＝57)

ATGGTTTCTTACTGGGATACCGGCGTGCTGCTGTGTGCCCTGCTGTCTTGTCTGCTGCTGACCGGCTCTAGCAGCGGCTCTGATACCGGCAGACCCTTCGTGGAAATGTACAGCGAGATCCCCGAGATCATCCACATGACCGAGGGCAGAGAGCTGGTCATCCCCTGCAGAGTGACAAGCCCCAACATCACCGTGACTCTGAAGAAGTTCCCTCTGGACACACTGATCCCCGACGGCAAGAGAATCATCTGGGACAGCCGGAAGGGCTTCATCATCAGCAACGCCACCTACAAAGAGATCGGCCTGCTGACCTGTGAAGCCACCGTGAATGGCCACCTGTACAAGACCAACTACCTGACACACAGACAGACCAACACCATCATCGACGTGGTGCTGAGCCCTAGCCACGGCATTGAACTGTCTGTGGGCGAGAAGCTGGTGCTGAACTGTACCGCCAGAACCGAGCTGAACGTGGGCATCGACTTCAACTGGGAGTACCCCAGCAGCAAGCACCAGCACAAGAAACTGGTCAACCGGGACCTGAAAACCCAGAGCGGCAGCGAGATGAAGAAATTCCTGAGCACCCTGACCATCGACGGCGTGACCAGGTCTGACCAGGGCCTGTACACATGTGCCGCCAGCTCTGGCCTGATGACCAAGAAAAACAGCACCTTCGTGCGGGTGCACGAGAAGGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAATAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAGTGA

SEQ ID NO:15阿柏西普密码子优化的#2(CpG计数＝54)

ATGGTCAGCTATTGGGATACGGGCGTCCTCCTTTGTGCCCTTCTGAGTTGTCTCTTGTTGACGGGAAGTAGTTCCGGAAGTGACACTGGCCGACCATTTGTAGAAATGTACAGTGAGATCCCGGAAATCATCCACATGACCGAAGGCCGGGAGTTGGTTATACCATGCCGGGTGACATCCCCGAACATTACCGTTACACTGAAGAAATTCCCATTGGACACTTTGATACCTGATGGAAAGAGAATCATCTGGGATTCCAGAAAAGGCTTTATTATCTCAAATGCTACATACAAAGAAATCGGTCTTCTTACGTGTGAAGCAACCGTGAATGGTCATTTGTACAAGACTAACTACCTCACCCACAGGCAGACCAATACAATAATCGACGTCGTTCTCAGCCCCTCCCACGGAATTGAGCTTAGTGTGGGGGAGAAATTGGTCTTGAATTGTACCGCCCGGACAGAGTTGAATGTTGGCATTGACTTCAATTGGGAGTATCCATCTAGTAAGCACCAACACAAAAAGCTTGTTAATCGGGACCTGAAGACTCAAAGCGGATCAGAAATGAAAAAGTTTCTCTCAACGTTGACAATAGACGGCGTGACGCGCTCTGATCAGGGTCTTTACACCTGCGCTGCCAGCTCTGGGTTGATGACGAAAAAAAATTCTACATTTGTGCGGGTTCATGAAAAAGATAAGACACATACCTGTCCCCCGTGTCCAGCGCCGGAATTGCTTGGGGGCCCCAGCGTATTCCTTTTCCCCCCCAAGCCTAAAGACACGCTCATGATCTCTAGAACGCCGGAGGTCACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCATGAAGATCCCGAGGTTAAATTCAATTGGTACGTAGATGGAGTCGAAGTTCACAATGCAAAGACAAAGCCGAGAGAAGAGCAGTACAATAGCACCTACCGAGTTGTAAGTGTACTTACTGTCCTGCACCAAGATTGGTTGAATGGAAAAGAGTATAAGTGTAAGGTCTCAAATAAGGCACTCCCAGCTCCCATAGAAAAAACGATATCTAAAGCGAAGGGTCAGCCCAGAGAGCCTCAAGTGTACACGCTCCCTCCCTCACGGGATGAGCTGACAAAAAACCAGGTTTCACTGACTTGTTTGGTAAAGGGTTTTTATCCATCTGACATCGCTGTCGAGTGGGAAAGCAATGGTCAACCGGAGAACAACTATAAGACAACCCCCCCGGTTCTCGATTCAGATGGCTCCTTCTTCCTCTATTCTAAGCTCACTGTTGATAAATCTCGGTGGCAACAAGGGAATGTTTTCTCTTGCTCTGTTATGCACGAAGCATTGCATAATCATTATACACAAAAATCTCTTTCCCTTAGTCCAGGTAAATGA

SEQ ID NO:16阿柏西普密码子优化的#3(CpG计数＝0)

ATGGTGTCCTACTGGGACACAGGGGTGCTGCTGTGTGCCCTGCTGTCTTGTCTGCTGCTGACTGGCTCTAGCTCTGGCTCTGACACAGGCAGACCCTTTGTGGAAATGTACTCTGAGATCCCTGAGATCATCCACATGACAGAGGGCAGAGAGCTGGTCATCCCCTGCAGAGTGACAAGCCCCAACATCACAGTGACCCTGAAGAAGTTCCCTCTGGACACACTGATCCCTGATGGCAAGAGAATCATCTGGGACAGCAGAAAGGGCTTCATCATCAGCAATGCCACCTACAAAGAGATTGGCCTGCTGACCTGTGAAGCCACAGTGAATGGCCACCTGTACAAGACCAACTACCTGACACACAGACAGACCAACACCATCATTGATGTGGTGCTGAGCCCCAGCCATGGCATTGAGCTGTCTGTGGGAGAGAAGCTGGTGCTGAACTGCACAGCCAGAACAGAGCTGAATGTGGGCATTGACTTCAACTGGGAGTACCCCAGCAGCAAGCACCAGCACAAGAAACTGGTCAACAGGGACCTGAAAACCCAGAGTGGCTCTGAGATGAAGAAATTCCTGAGCACCCTGACCATTGATGGGGTCACCAGATCTGACCAGGGCCTGTACACATGTGCTGCCAGCTCTGGACTGATGACCAAGAAAAACAGCACCTTTGTCAGAGTGCATGAGAAGGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCACCTGAGCTGCTTGGAGGCCCCTCTGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACACCTGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCATGAGGACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTATGTGGATGGGGTTGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCAGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATTGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCACCTAGCAGGGATGAGCTGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCTGACATTGCTGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCTGATGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACTGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGAAATGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAGTGA

SEQ ID NO:17阿柏西普密码子优化的#4(CpG计数＝56)

ATGGTTTCTTACTGGGATACCGGCGTGCTGCTGTGTGCCCTGCTGTCTTGTCTGCTGCTGACCGGCTCTAGCAGCGGCTCTGATACCGGCAGACCCTTCGTGGAAATGTACAGCGAGATCCCCGAGATCATCCACATGACCGAGGGCAGAGAGCTGGTCATCCCCTGCAGAGTGACAAGCCCCAACATCACCGTGACTCTGAAGAAGTTCCCTCTGGACACACTGATCCCCGACGGCAAGAGAATCATCTGGGACAGCCGGAAGGGCTTCATCATCAGCAACGCCACCTACAAAGAGATCGGCCTGCTGACCTGTGAAGCCACCGTGAATGGCCACCTGTACAAGACCAACTACCTGACACACAGACAGACCAACACCATCATCGACGTGGTGCTGAGCCCTAGCCACGGCATTGAACTGTCTGTGGGCGAGAAGCTGGTGCTGAACTGTACCGCCAGAACCGAGCTGAACGTGGGCATCGACTTCAACTGGGAGTACCCCAGCAGCAAGCACCAGCACAAGAAACTGGTCAACCGGGACCTGAAAACCCAGAGCGGCAGCGAGATGAAGAAATTCCTGAGCACCCTGACCATCGACGGCGTGACCAGGTCTGACCAGGGCCTGTACACATGTGCCGCCAGCTCTGGCCTGATGACCAAGAAAAACAGCACCTTCGTGCGGGTGCACGAGAAGGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAATAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTC

AGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAGTGA

SEQ ID NO:18阿柏西普密码子优化的#5(CpG计数＝56)

ATGGTGTCCTACTGGGATACAGGCGTGCTGCTGTGTGCCCTGCTGTCTTGTCTGCTGCTGACCGGCTCTAGCAGCGGCTCTGATACCGGCAGACCCTTCGTGGAAATGTACAGCGAGATCCCCGAGATCATCCACATGACCGAGGGCAGAGAGCTGGTCATCCCCTGCAGAGTGACAAGCCCCAACATCACCGTGACTCTGAAGAAGTTCCCTCTGGACACACTGATCCCCGACGGCAAGAGAATCATCTGGGACAGCCGGAAGGGCTTCATCATCAGCAACGCCACCTACAAAGAGATCGGCCTGCTGACCTGTGAAGCCACCGTGAATGGCCACCTGTACAAGACCAACTACCTGACACACAGACAGACCAACACCATCATCGACGTGGTGCTGAGCCCTAGCCACGGCATTGAACTGTCTGTGGGCGAGAAGCTGGTGCTGAACTGTACCGCCAGAACCGAGCTGAACGTGGGCATCGACTTCAACTGGGAGTACCCCAGCAGCAAGCACCAGCACAAGAAACTGGTCAACCGGGACCTGAAAACCCAGAGCGGCAGCGAGATGAAGAAATTCCTGAGCACCCTGACCATCGACGGCGTGACCAGATCTGACCAGGGCCTGTACACATGTGCCGCCAGCTCTGGCCTGATGACCAAGAAAAACAGCACCTTCGTGCGGGTGCACGAGAAGGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAATAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAGTGA

序列表

<110> 英斯培瑞有限公司

<120> 用于治疗眼部疾病的组合物和方法

<130> 57837-712.601

<140>

<141>

<150> CN 202010706658.X

<151> 2020-07-21

<150> CN 202010706505.5

<151> 2020-07-21

<160> 20

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

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Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

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Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

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Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

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Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

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Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr

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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

245 250 255

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

260 265 270

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

275 280 285

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

325 330 335

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

340 345 350

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

355 360 365

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

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<210> 2

<211> 210

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

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Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

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Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Asp Pro Ile Glu

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Gly Arg

210

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

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Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

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Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

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Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp

100

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<212> PRT

<213> 智人

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Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys

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Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp

20 25 30

Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val

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Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu

50 55 60

Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr

65 70 75 80

Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe

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<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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Arg

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

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<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

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1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr

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<211> 231

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

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Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

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Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

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Ser Cys Asp Lys Thr His Leu

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<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 1377

<212> DNA

<213> 智人

<400> 13

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatcta gttccggaag tgataccggt agacctttcg tagagatgta cagtgaaatc 120

cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca 180

cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa 240

cgcataatct gggacagtag aaagggcttc atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata 300

gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca 360

catcgacaaa ccaatacaat catagatgtg gttctgagtc cgtctcatgg aattgaacta 420

tctgttggag aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa tgtggggatt 480

gacttcaact gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt aaaccgagac 540

ctaaaaaccc agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac tatagatggt 600

gtaacccgga gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct gatgaccaag 660

aagaacagca catttgtcag ggtccatgaa aaggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720

ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900

aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 960

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080

accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1140

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1200

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1260

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1320

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1377

<210> 14

<211> 1377

<212> DNA

<213> 智人

<400> 14

atggtttctt actgggatac cggcgtgctg ctgtgtgccc tgctgtcttg tctgctgctg 60

accggctcta gcagcggctc tgataccggc agacccttcg tggaaatgta cagcgagatc 120

cccgagatca tccacatgac cgagggcaga gagctggtca tcccctgcag agtgacaagc 180

cccaacatca ccgtgactct gaagaagttc cctctggaca cactgatccc cgacggcaag 240

agaatcatct gggacagccg gaagggcttc atcatcagca acgccaccta caaagagatc 300

ggcctgctga cctgtgaagc caccgtgaat ggccacctgt acaagaccaa ctacctgaca 360

cacagacaga ccaacaccat catcgacgtg gtgctgagcc ctagccacgg cattgaactg 420

tctgtgggcg agaagctggt gctgaactgt accgccagaa ccgagctgaa cgtgggcatc 480

gacttcaact gggagtaccc cagcagcaag caccagcaca agaaactggt caaccgggac 540

ctgaaaaccc agagcggcag cgagatgaag aaattcctga gcaccctgac catcgacggc 600

gtgaccaggt ctgaccaggg cctgtacaca tgtgccgcca gctctggcct gatgaccaag 660

aaaaacagca ccttcgtgcg ggtgcacgag aaggacaaga cccacacctg tcctccatgt 720

cctgctccag aactgctcgg cggaccttcc gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac 780

accctgatga tcagcagaac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag 840

gatcccgaag tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc 900

aagcctagag aggaacagta caatagcacc tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 960

caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct 1020

gctcctatcg agaaaaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggaacc ccaggtttac 1080

acactgcctc caagcaggga cgagctgaca aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc 1140

aagggcttct acccttccga tatcgccgtg gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac 1200

aactacaaga caacccctcc tgtgctggac agcgacggct cattcttcct gtacagcaag 1260

ctgacagtgg acaagagcag atggcagcag ggaaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 1320

gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgagcc tgtctcctgg caagtga 1377

<210> 15

<211> 1377

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

atggtcagct attgggatac gggcgtcctc ctttgtgccc ttctgagttg tctcttgttg 60

acgggaagta gttccggaag tgacactggc cgaccatttg tagaaatgta cagtgagatc 120

ccggaaatca tccacatgac cgaaggccgg gagttggtta taccatgccg ggtgacatcc 180

ccgaacatta ccgttacact gaagaaattc ccattggaca ctttgatacc tgatggaaag 240

agaatcatct gggattccag aaaaggcttt attatctcaa atgctacata caaagaaatc 300

ggtcttctta cgtgtgaagc aaccgtgaat ggtcatttgt acaagactaa ctacctcacc 360

cacaggcaga ccaatacaat aatcgacgtc gttctcagcc cctcccacgg aattgagctt 420

agtgtggggg agaaattggt cttgaattgt accgcccgga cagagttgaa tgttggcatt 480

gacttcaatt gggagtatcc atctagtaag caccaacaca aaaagcttgt taatcgggac 540

ctgaagactc aaagcggatc agaaatgaaa aagtttctct caacgttgac aatagacggc 600

gtgacgcgct ctgatcaggg tctttacacc tgcgctgcca gctctgggtt gatgacgaaa 660

aaaaattcta catttgtgcg ggttcatgaa aaagataaga cacatacctg tcccccgtgt 720

ccagcgccgg aattgcttgg gggccccagc gtattccttt tcccccccaa gcctaaagac 780

acgctcatga tctctagaac gccggaggtc acctgtgtgg tggtggacgt gtctcatgaa 840

gatcccgagg ttaaattcaa ttggtacgta gatggagtcg aagttcacaa tgcaaagaca 900

aagccgagag aagagcagta caatagcacc taccgagttg taagtgtact tactgtcctg 960

caccaagatt ggttgaatgg aaaagagtat aagtgtaagg tctcaaataa ggcactccca 1020

gctcccatag aaaaaacgat atctaaagcg aagggtcagc ccagagagcc tcaagtgtac 1080

acgctccctc cctcacggga tgagctgaca aaaaaccagg tttcactgac ttgtttggta 1140

aagggttttt atccatctga catcgctgtc gagtgggaaa gcaatggtca accggagaac 1200

aactataaga caaccccccc ggttctcgat tcagatggct ccttcttcct ctattctaag 1260

ctcactgttg ataaatctcg gtggcaacaa gggaatgttt tctcttgctc tgttatgcac 1320

gaagcattgc ataatcatta tacacaaaaa tctctttccc ttagtccagg taaatga 1377

<210> 16

<211> 1377

<212> DNA

<213> 智人

<400> 16

atggtgtcct actgggacac aggggtgctg ctgtgtgccc tgctgtcttg tctgctgctg 60

actggctcta gctctggctc tgacacaggc agaccctttg tggaaatgta ctctgagatc 120

cctgagatca tccacatgac agagggcaga gagctggtca tcccctgcag agtgacaagc 180

cccaacatca cagtgaccct gaagaagttc cctctggaca cactgatccc tgatggcaag 240

agaatcatct gggacagcag aaagggcttc atcatcagca atgccaccta caaagagatt 300

ggcctgctga cctgtgaagc cacagtgaat ggccacctgt acaagaccaa ctacctgaca 360

cacagacaga ccaacaccat cattgatgtg gtgctgagcc ccagccatgg cattgagctg 420

tctgtgggag agaagctggt gctgaactgc acagccagaa cagagctgaa tgtgggcatt 480

gacttcaact gggagtaccc cagcagcaag caccagcaca agaaactggt caacagggac 540

ctgaaaaccc agagtggctc tgagatgaag aaattcctga gcaccctgac cattgatggg 600

gtcaccagat ctgaccaggg cctgtacaca tgtgctgcca gctctggact gatgaccaag 660

aaaaacagca cctttgtcag agtgcatgag aaggacaaga cccacacctg tcctccatgt 720

cctgcacctg agctgcttgg aggcccctct gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac 780

accctgatga tcagcagaac acctgaagtg acctgtgtgg tggtggatgt gtcccatgag 840

gacccagaag tgaagttcaa ttggtatgtg gatggggttg aagtgcacaa tgccaagacc 900

aagcctagag aggaacagta caactccacc tacagagtgg tgtcagtgct gacagtgctg 960

caccaggact ggctgaatgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct 1020

gctcctattg agaaaaccat ctccaaggcc aagggccagc ctagggaacc ccaggtttac 1080

acactgccac ctagcaggga tgagctgaca aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc 1140

aagggcttct acccctctga cattgctgtg gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac 1200

aactacaaga caacccctcc tgtgctggac tctgatggct cattcttcct gtacagcaag 1260

ctgactgtgg acaagagcag atggcagcag ggaaatgtgt tcagctgctc tgtgatgcat 1320

gaggccctgc acaaccacta cacccagaaa agcctgagcc tgtctcctgg caagtga 1377

<210> 17

<211> 1377

<212> DNA

<213> 智人

<400> 17

atggtttctt actgggatac cggcgtgctg ctgtgtgccc tgctgtcttg tctgctgctg 60

accggctcta gcagcggctc tgataccggc agacccttcg tggaaatgta cagcgagatc 120

cccgagatca tccacatgac cgagggcaga gagctggtca tcccctgcag agtgacaagc 180

cccaacatca ccgtgactct gaagaagttc cctctggaca cactgatccc cgacggcaag 240

agaatcatct gggacagccg gaagggcttc atcatcagca acgccaccta caaagagatc 300

ggcctgctga cctgtgaagc caccgtgaat ggccacctgt acaagaccaa ctacctgaca 360

cacagacaga ccaacaccat catcgacgtg gtgctgagcc ctagccacgg cattgaactg 420

tctgtgggcg agaagctggt gctgaactgt accgccagaa ccgagctgaa cgtgggcatc 480

gacttcaact gggagtaccc cagcagcaag caccagcaca agaaactggt caaccgggac 540

ctgaaaaccc agagcggcag cgagatgaag aaattcctga gcaccctgac catcgacggc 600

gtgaccaggt ctgaccaggg cctgtacaca tgtgccgcca gctctggcct gatgaccaag 660

aaaaacagca ccttcgtgcg ggtgcacgag aaggacaaga cccacacctg tcctccatgt 720

cctgctccag aactgctcgg cggaccttcc gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac 780

accctgatga tcagcagaac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag 840

gatcccgaag tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc 900

aagcctagag aggaacagta caatagcacc tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 960

caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct 1020

gctcctatcg agaaaaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggaacc ccaggtttac 1080

acactgcctc caagcaggga cgagctgaca aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc 1140

aagggcttct acccttccga tatcgccgtg gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac 1200

aactacaaga caacccctcc tgtgctggac agcgacggct cattcttcct gtacagcaag 1260

ctgacagtgg acaagagcag atggcagcag ggaaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 1320

gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgagcc tgtctcctgg caagtga 1377

<210> 18

<211> 1377

<212> DNA

<213> 智人

<400> 18

atggtgtcct actgggatac aggcgtgctg ctgtgtgccc tgctgtcttg tctgctgctg 60

accggctcta gcagcggctc tgataccggc agacccttcg tggaaatgta cagcgagatc 120

cccgagatca tccacatgac cgagggcaga gagctggtca tcccctgcag agtgacaagc 180

cccaacatca ccgtgactct gaagaagttc cctctggaca cactgatccc cgacggcaag 240

agaatcatct gggacagccg gaagggcttc atcatcagca acgccaccta caaagagatc 300

ggcctgctga cctgtgaagc caccgtgaat ggccacctgt acaagaccaa ctacctgaca 360

cacagacaga ccaacaccat catcgacgtg gtgctgagcc ctagccacgg cattgaactg 420

tctgtgggcg agaagctggt gctgaactgt accgccagaa ccgagctgaa cgtgggcatc 480

gacttcaact gggagtaccc cagcagcaag caccagcaca agaaactggt caaccgggac 540

ctgaaaaccc agagcggcag cgagatgaag aaattcctga gcaccctgac catcgacggc 600

gtgaccagat ctgaccaggg cctgtacaca tgtgccgcca gctctggcct gatgaccaag 660

aaaaacagca ccttcgtgcg ggtgcacgag aaggacaaga cccacacctg tcctccatgt 720

cctgctccag aactgctcgg cggaccttcc gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac 780

accctgatga tcagcagaac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag 840

gatcccgaag tgaagttcaa ttggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc 900

aagcctagag aggaacagta caatagcacc tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 960

caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct 1020

gctcctatcg agaaaaccat ctccaaggcc aagggccagc ctagggaacc ccaggtttac 1080

acactgcctc caagcaggga cgagctgaca aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc 1140

aagggcttct acccttccga tatcgccgtg gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac 1200

aactacaaga caacccctcc tgtgctggac agcgacggct cattcttcct gtacagcaag 1260

ctgacagtgg acaagagcag atggcagcag ggaaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 1320

gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgagcc tgtctcctgg caagtga 1377

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的

肽

<400> 19

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的

肽

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

Claims

1.一种组合物，其包含：

(i)第一多核苷酸，其包含可操作地连接至第一启动子的第一序列和可操作地连接至第二启动子的第二序列，

其中所述第一序列编码腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，

其中所述第二序列编码AAV rep蛋白，

和

(ii)第二多核苷酸，其包含可操作地连接至第三启动子的第三序列，其中所述第三序列包含编码血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂的密码子优化的核酸序列。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述VEGF抑制剂是融合蛋白或者VEGF抗体或其抗原结合片段。

3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的蛋白质。

4.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的蛋白质。

5.如权利要求3所述的组合物，其中所述密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白质。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述密码子优化的核酸序列包含与SEQ ID NO:13相比数目不同的CpG二核苷酸。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述密码子优化的核酸序列包含少于60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个CpG二核苷酸。

8.如权利要求7所述的组合物，其中所述密码子优化的核酸序列不包含CpG二核苷酸。

9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述第三序列包含序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:18。

10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述第一启动子和所述第二启动子适合于在昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。

12.如权利要求10所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是HEK293细胞或其衍生细胞。

13.如权利要求12所述的组合物，其中所述衍生细胞是HEK293T细胞。

14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述第一启动子或所述第二启动子是p10启动子或polh启动子。

15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述第三启动子是CMV启动子、CAG启动子、MNDU3启动子、PGK启动子、EF1a启动子或眼部特异性启动子。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述眼部特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白基因启动子、鼠11-顺式类视黄醇脱氢酶基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子、卵黄状黄斑营养不良2启动子和光感受器间类视黄醇结合蛋白启动子。

17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述第一序列、所述第二序列或所述第三序列的3'端还包含多聚(A)序列。

18.如权利要求17所述的组合物，其中所述多聚(A)序列是hGH多聚(A)、SV40多聚(A)或β-珠蛋白多聚(A)。

19.如权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述第二多核苷酸包含内含子或调控元件。

20.如权利要求19所述的组合物，其中所述内含子包含嵌合内含子。

21.如权利要求19所述的组合物，其中所述调控元件包含TPL(来自腺病毒的三联前导序列)和eMLP(来自腺病毒主要晚期启动子的增强子元件)序列。

22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中所述第二多核苷酸包含Kozak序列。

23.如权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中所述第二多核苷酸包含人支架附着区(SAR)序列。

24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中所述第二多核苷酸还包含增强子。

25.如权利要求23所述的组合物，其中所述增强子是CMV增强子。

26.如权利要求1-25中任一项所述的组合物，其中所述第二多核苷酸还包含填充序列。

27.如权利要求1-26中任一项所述的组合物，其中所述第二多核苷酸还包含反向末端重复(ITR)序列。

28.如权利要求27所述的组合物，其中所述ITR序列是AAV2ITR。

29.如权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中所述第二多核苷酸还包含编码额外治疗性蛋白质的第四序列。

30.如权利要求29所述的组合物，其中所述额外治疗性蛋白质选自VEGF抑制剂、PDGF抑制剂、胎盘生长因子抑制剂、整联蛋白抑制剂、mTOR抑制剂、血管生成素抑制剂和TGFβ抑制剂。

31.如权利要求30所述的组合物，其中所述第三序列和所述第四序列通过接头连接。

32.如权利要求31所述的组合物，其中所述接头是可切割接头。

33.如权利要求32所述的组合物，其中所述接头包含2A肽。

34.一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其通过将如权利要求1-33中任一项所述的组合物转染到细胞中来制备。

35.如权利要求34所述的rAAV颗粒，其中所述细胞是昆虫细胞或哺乳动物细胞。

36.如权利要求35所述的rAAV颗粒，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。

37.如权利要求35所述的rAAV颗粒，其中所述哺乳动物细胞是HEK293细胞或其衍生细胞。

38.如权利要求37所述的rAAV颗粒，其中所述衍生细胞是HEK293T细胞。

39.一种多核苷酸，其包含密码子优化的核酸序列，所述密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的蛋白质。

40.如权利要求39所述的多核苷酸，其中所述密码子优化的核酸序列编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的蛋白质。

41.如权利要求40所述的多核苷酸，其中所述密码子优化的核酸序列包含与SEQ IDNO:13相比数目不同的CpG二核苷酸。

42.如权利要求41所述的多核苷酸，其中所述密码子优化的核酸序列包含少于60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个、15个、10个或5个CpG二核苷酸。

43.如权利要求42所述的多核苷酸，其中所述密码子优化的核酸序列不包含CpG二核苷酸。

44.如权利要求39-43中任一项所述的多核苷酸，其中所述第三序列包含序列SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。

45.如权利要求39-44中任一项所述的多核苷酸，其还包含启动子。

46.如权利要求45所述的多核苷酸，其中所述启动子是CMV启动子、CAG启动子、MNDU3启动子、PGK启动子、EF1a启动子或眼部特异性启动子。

47.如权利要求46所述的多核苷酸，其中所述眼部特异性启动子选自RPE 65基因启动子、人视网膜结合蛋白基因启动子、鼠11-顺式类视黄醇脱氢酶基因启动子、视紫红质启动子、视紫红质激酶启动子、金属蛋白酶组织抑制因子3启动子、光感受器视黄醇结合蛋白启动子、卵黄状黄斑营养不良2启动子和光感受器间类视黄醇结合蛋白启动子。

48.如权利要求39-47中任一项所述的多核苷酸，其还包含多聚(A)序列。

49.如权利要求48所述的多核苷酸，其中所述多聚(A)序列是hGH多聚(A)、SV40多聚(A)或β-珠蛋白多聚(A)。

50.如权利要求39-49中任一项所述的多核苷酸，其还包含内含子或调控元件。

51.如权利要求50所述的多核苷酸，其中所述内含子包含嵌合内含子。

52.如权利要求50所述的多核苷酸，其中所述调控元件包含TPL(来自腺病毒的三联前导序列)和eMLP(来自腺病毒主要晚期启动子的增强子元件)序列。

53.如权利要求39-52中任一项所述的多核苷酸，其还包含Kozak序列。

54.一种重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含如权利要求39-53中任一项所述的多核苷酸。

55.一种用于在对象的细胞或组织中表达VEGF抑制剂的方法，其包括向所述对象的所述细胞或所述组织施用如权利要求1-33中任一项所述的组合物、如权利要求34-38和54中任一项所述的rAAV颗粒或如权利要求39-53中任一项所述的多核苷酸。

56.一种用于治疗有需要的对象的眼部疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的如权利要求1-33中任一项所述的组合物、如权利要求34-38和54中任一项所述的rAAV颗粒或如权利要求39-53中任一项所述的多核苷酸。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述眼部疾病选自湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、增生性糖尿病性视网膜病变和黄斑水肿。

58.一种用于制备重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其包括向细胞中引入如权利要求1-33中任一项所述的组合物或如权利要求39-53中任一项所述的多核苷酸。