JP2023540464A - 眼疾患の処置のための組成物および方法 - Google Patents

眼疾患の処置のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、眼疾患を処置するためのシステム、およびシステムを用いて眼疾患を処置する方法に関する。【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０２０年７月２１日出願の中国特許出願第２０２０１０７０６６５８．Ｘ号（代理人明細書５７８３７－７０９．７１１番）、および２０２０年７月２１日出願の中国特許出願第２０２０１０７０６５０５．５号（代理人明細書５７８３７－７１２．７１１番）、の利益を主張し、その全体の内容は参照によって本明細書に援用される。
血管形成は、組織への血管の新生または成長を表す、または既存の毛細管または血管の一層の形成または成長、疾患および健康の重要な役割を果たします。病理学の目の血管形成または新血管新生が網膜、脈絡膜と角膜の生じる場合があり、重症の視力障害を引き起こす場合があります。眼血管形成は、ぬれた加齢黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、黄斑の浮腫などを含む広範囲の疾患に関連しています。
血管形成関連の障害を処置するための多くの薬物が、抗ＶＥＧＦ抗体（Ｌｕｃｅｎｔｉｓのような）または融合タンパク質（Ｅｙｌｅａのような）のような開発されています。しかしながら、頻繁に繰り返された注射剤はこれらの薬物の短い半減期により有効性を維持するように要求されます。従って、血管形成を標的とする新しい治療は、血管形成に関連する眼疾患の処置のために必要とされます。
配列表
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を引用することで本明細書に組み込まれる。２０２１年７月１９日に作成されたＡＳＣＩＩのコピーは、５７８３７－７１２＿６０１＿ＳＬという名称であり、２４，３７６バイトのサイズである。
現在、血管形成に関連した眼疾患を有効に処置することができる組成物と方法を開発する芸術の必要性があります。
いくつかの態様では、本の開示は、第１のプロモーターに操作しやすくリンクされた第１のシーケンス、と別のプロモーターに操作しやすくリンクされた別のシーケンスを含む第１のポリヌクレオチドを含む組成物を提供します。そこでは最初のシーケンスはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド・タンパク質（そこで第２のシーケンスはＡＡＶレプ・タンパク質をエンコードする）、と３番めのプロモーター（そこでは３番目のシーケンスは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列を含む）に操作しやすくリンクされた３番めのシーケンスを含む別のポリヌクレオチドをエンコードします。
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、融合タンパク質、またはそれのＶＥＧＦ抗体または、抗原結合フラグメントです。いくつかの実施形態では、コドンにｏｐｔｍｉｚｅｄされた核酸配列は、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードします：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４．いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードします：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ、Ｎｏ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：１．いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は、配列番号よりＣｐＧジヌクレオチドの変更された数を含みます：１３．いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５つのＣｐＧジヌクレオチド未満を含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列はＣｐＧジヌクレオチドを含みません。いくつかの実施形態では、３番目のシーケンスは、配列番号のシーケンスを含みます：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６．いくつかの実施形態では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは昆虫細胞または哺乳動物細胞の発現のために適しています。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はそれについてＨＥＫ２９３細胞または派生的な細胞です。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターまたは第２のプロモーターはｐ１０プロモーターまたはｐｏｌｈプロモーターです。いくつかの実施形態では、３番目のプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１ａプロモーターまたは眼の特有のプロモーターです。いくつかのｅｍｂｏｄｉｍｅｅｎｔｓでは、眼に特有のプロモーターは、ＲＰＥ ６５遺伝子プロモーター、ヒト網膜の結合蛋白質遺伝子プロモーター、ネズミ科の１１－ｃｉｓレチノイド・アルコール脱水素酵素遺伝子プロモーター、ロドプシン・プロモーター、ｒｈｏｄｏｐｏｓｉｎキナーゼ・プロモーター、コラーゲン分解酵素阻害３プロモーター、光受容体レチノール結合蛋白質プロモーター、卵黄様黄斑ジストロフィ２プロモーターと光受容体間類網膜の結合蛋白質プロモーターから構成される群から選択されます。いくつかの実施形態では、最初のシーケンス、第２のシーケンスまたは３番目のシーケンスの３’終了は、さらにポリＡシーケンスを含みます。いくつかの実施形態では、ポリＡシーケンスは、ｈＧＨポリ（Ａ）、シミアンウイルス４０ポリ（Ａ）またはβ－グロビン・ポリ（Ａ）です。いくつかの実施形態では、最初のシーケンスと第２のシーケンスはリンカーによる接続されます。幾つかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。幾つかの実施形態において、リンカーは環状構造を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）を含みます。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）からです。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドはイントロンまたは調整する要素を含みます。幾つかの実施形態では、組成物はリポソームを含む。いくつかの実施形態では、調整する要素はＴＰＬ（アデノウイルスから三者間のリーダー配列）とｅＭＬＰ（アデノウイルス・マヨール後期プロモーターからエンハンサーエレメント）シーケンスを含みます。いくつかの実施形態において、第２のドメインはＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドはヒト足場を付属の領域（ＳＡＲ）シーケンスを含みます。幾つかの実施形態において、第２癌処置はエポキシケトンを含む。幾つかの実施形態において、耳は中耳である。幾つかの実施形態において、第１化合物は更に別の第１化合物を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドはさらに逆方向末端反復（ＩＴＲ）シーケンスを含みます。いくつかの実施形態では、ＩＴＲシーケンスはＡＡＶ２ ＩＴＲです。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、付加的な治療のタンパク質をエンコードする４番めのシーケンスをさらに含みます。いくつかの実施形態では、付加的な治療のタンパク質は、ＶＥＧＦ阻害剤、ＰＤＧＦ阻害剤、胎盤の成長因子阻害剤、インテグリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ阻害剤とＴＧＦβ阻害作用薬から構成される群から選択されます。いくつかの実施形態では、３番目のシーケンスと４番目のシーケンスはリンカーによる接続されます。幾つかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。幾つかの実施形態において、リンカーは環状構造を含む。
別の態様では、本の開示は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドのうちのいかなるものまたは細胞へ本明細書に開示された組成物のいずれかでも導入することにより調製された組み換えのアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を提供します。いくつかの実施形態では、細胞は昆虫細胞または哺乳動物細胞です。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はそれについてＨＥＫ２９３細胞または派生的な細胞です。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。
別の態様では、本の開示は、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化されたｎｕｃｌｅｏｉｃな辛辣なシーケンスを含むポリヌクレオチドを提供します：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：１．いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は、配列番号よりＣｐＧジヌクレオチドの変更された数を含みます：１３．いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５つのＣｐＧジヌクレオチド未満を含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列はＣｐＧジヌクレオチドを含みません。いくつかの実施形態では、３番目のシーケンスは、配列番号のシーケンスを含みます：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６．いくつかの実施形態では、装置はさらに制御装置を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１ａプロモーターまたは眼の特有のプロモーターです。いくつかの実施形態では、眼に特有のプロモーターは、ＲＰＥ ６５遺伝子プロモーター、ヒト網膜の結合蛋白質遺伝子プロモーター、ネズミ科の１１－ｃｉｓレチノイド・アルコール脱水素酵素遺伝子プロモーター、ロドプシン・プロモーター、ｒｈｏｄｏｐｏｓｉｎキナーゼ・プロモーター、コラーゲン分解酵素阻害３プロモーター、光受容体レチノール結合蛋白質プロモーター、卵黄様黄斑ジストロフィ２プロモーターと光受容体間類網膜の結合蛋白質プロモーターから構成される群から選択されます。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはさらにポリＡシーケンスを含みます。いくつかの実施形態では、ポリＡシーケンスは、ｈＧＨポリ（Ａ）、シミアンウイルス４０ポリ（Ａ）またはβ－グロビン・ポリ（Ａ）です。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはさらにイントロンまたは調整する要素を含みます。幾つかの実施形態では、組成物はリポソームを含む。いくつかの実施形態では、調整する要素はＴＰＬ（アデノウイルスから三者間のリーダー配列）とｅＭＬＰ（アデノウイルス・マヨール後期プロモーターからエンハンサーエレメント）シーケンスを含みます。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルはさらに造影剤を含む。
別の態様では、本の開示は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドのうちのいかなるものでも含む組み換えのアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を提供します。
別の態様では、本の開示は、細胞、細胞へ投与することを含む対象の組織、ｒＡＡＶ粒子のうちのいかなるものでも本明細書に開示した対象の組織または本明細書に開示されたポリヌクレオチドのいずれかのＶＥＧＦ阻害剤を示す方法を提供します。
別の態様では、本の開示は、ｒＡＡＶ粒子のうちの治療上有効な量のいかなるものでも本明細書に開示した対象または本明細書に開示されたポリヌクレオチドのいずれかに投与することを含むその必要性のある対象の眼疾患を処置する方法を提供します。いくつかの実施形態では、目の疾患は、ぬれた加齢黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病の黄斑の浮腫、増殖性糖尿病性網膜症と黄斑の浮腫から構成される群から選択されます。
別の態様では、本の開示は、本明細書に開示された組成物のうちのいかなるものを有するも細胞を導入するまたは本明細書に開示されたポリヌクレオチドのうちのいかなるものを有するも導入するを含む組み換えのアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を調製する方法を提供します。いくつかの実施形態における、細胞における本明細書に開示されたポリヌクレオチドのうちのいかなるものでも示すことを含む方法。幾つかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は分裂細胞である。幾つかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は分裂細胞である。いくつかの実施形態では、方法はｂａｃｍｉｄ ＤＮＡおよび／またはバキュロウィルスを生成することを含みます。いくつかの実施形態では、方法はＶＥＧＦ阻害剤発現シーケンス（本明細書に開示されたポリヌクレオチドのような）を含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを生成することを含みます。いくつかの実施形態では、方法はｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ ｒＡＡＶキャップ・レプ発現シーケンスを生成することを含みます。いくつかの実施形態では、方法は、バキュロウィルスを生成するためにｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを有する細胞をトランスフェクトすることを含みます。いくつかの実施形態では、方法はバキュロウィルスを生成するためにＶＥＧＦ阻害剤発現シーケンスを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを有する細胞をトランスフェクトすることを含みます。いくつかの実施形態では、方法は、ｒＡＡＶキャップ・レプ発現シーケンスを含むバキュロウィルスを生成するためにｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを有する細胞をトランスフェクトすることを含みます。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示された、パッケージにされたｒＡＡＶ／ＶＥＧＦ阻害剤ウイルス粒子を得るために細胞（Ｓｆ９細胞のような）を感染させるためにバキュロウィルスを混合することをさらに含みます。
参照による援用
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により本明細書に具体的かつ個別に引用されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に引用される。引用により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示に矛盾する程度にまで、本明細書は、そのような矛盾のある題材に取って代わる、および／または、それに先行するように意図される。
本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲とともに説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面（本明細書では「図面」および「図」ともいう）を参照することによって得られるだろう。
１Ａは、２９３Ｔ細胞における第２のポリヌクレオチド・コード化ＧＦＰのトランスフェクションの４８時間後に緑の蛍光性のタンパク質（ＧＦＰ）の発現を示す蛍光画像を説明します。 １Ｂは、トランスフェクションの４８時間後に細胞を示すＧＦＰのパーセンテージを示すフローサイトメトリー結果を説明します。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され記載されてきたが、こうした実施形態はほんの一例として提供されることは当業者にとって明白である。当業者は発明から外れずに、多くの変異、変化と置換について考えることができます。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、利用されることもあることを理解されたい。
もし他の方法で述べられなかったならば、本明細書に開示されたいくつかの実施形態の実行は免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスと組換えＤＮＡの従来の技術を使用します。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄＧｒｅｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ＰＣ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ． （１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（２０１０））。
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が他に明確に示していない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「ｉｍｍｕｎｏａｃｔｉｖａｔｏｒ」は １つ以上の免疫の賦活物質を含みます。
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、例えば測定システムの限界に部分的に左右される。芸術の実行に応じて、例えば、「に関して」ある以上の標準偏差内に示されるかもしれません。代替的に、「約」とは所定の値の最大で２０％、最大で１０％、最大で５％、または最大で１％の範囲内を意味し得る。または、特に、生物系または手順のために、用語は、２倍以内に好ましくは５倍以内に、値の桁をより好ましくは意味するかもしれません。特有の値が適用およびクレームの記載された場合、もし他の方法で述べられなかったならば、それは仮定されるべきです、特有の値の許容可能な誤差範囲内の方法「に関する」用語。
本明細書に用いられるような用語「処置」は、個体における疾患の処置の自然経過を変更する試みを表し、臨床病理学の間に予防またはインプリメンテーションの臨床の介在かもしれません。希望の治療効果は含むが、その疾患の発生または再発を防ぐ、症状を和らげる、その疾患のいかなる直接か間接の病理学の結果も低減する、転移を防ぐ、疾患進行の速度を遅くする、改善する、あるいは疾患状態および／またはより良くする予後の低減に限定的ではありません。
本明細書に用いられるように、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」と「タンパク質」は、あらゆる長さのアミノ酸ポリマーを参照するために交換可能に本明細書に用いられます。ポリマーは線状かもしれないか、あるいは環状か、分岐しました。それは修正済のアミノ酸を含んでいるかもしれません。そして、それは非アミノ酸による中断されるかもしれません。用語は、またラベルが付けられた構成要素を有する接合などの硫酸化、グリコシレーション、ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ、アセチル化、リン酸化、ヨウ素化、メチル化、酸化、タンパク質分解の治療、リン酸化、ｉｓｏｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ、ラセミ化、セレン化、タンパク質（例えばアルギニン）へのアミノ酸の転移ＲＮＡを媒介とした付加、ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎまたは他の操作によるのような、修飾されたアミノ酸ポリマーを含みます。本明細書に用いられるように、用語「アミノ酸」は参照します、に、自然でおよび／または不自然か、合成の、アミノ酸類似体およびｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓと同様にグリシンとＤまたはＬの光学異性体を含むアミノ酸。指定されたタンパク質から「誘導した」ポリペプチドまたはアミノ酸配列順序は、ポリペプチドの起源を表します。むしろ、ポリペプチドはアミノ酸配列順序を実質的にシーケンスの中でエンコードされたポリペプチド、またはその部分のアミノ酸配列順序と同様にしています、部分は、どこで少なくとも１０－２０のアミノ酸または少なくとも２０－３０のアミノ酸から構成されるか、または少なくとも３０－５０のアミノ酸、または、それは、シーケンスの中でエンコードされたポリペプチドに免疫学的に同一視することができます。用語は、また指定された核酸配列から発現されたポリペプチドを含みます。本明細書に用いられるように、用語「領域」はタンパク質またはペプチドの他の部分と物理的にまたは機能的に識別されるタンパク質の一部を表します。物理的に定義された領域は、それらの膜結合型のシーケンスまたは細胞質の境界のシーケンスなどのまさに疎水性のシーケンスまたは親水性アミノ酸シーケンスを含みます。領域も例えば遺伝子複製による引き起こされた内部相同による定義することができます。機能的に定義された領域には異なる生物学的機能があります。例えば、抗原束縛領域は、抗原に結合する抗原を拘束力のある単位または抗体の部分を表します。連続するアミノ酸配列順序による機能的に定義された領域をエンコードする必要はありません。そして、機能的に定義された領域は １つ以上の物理的に定義された領域を含んでいるかもしれません。
本明細書に用いられるように、用語「アミノ酸」は、アミノ酸類似体およびｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓを含み、これらに限定されずにもＤまたはＬの光学異性体を含み、これらに限定されずにも、生まれつきの名人および／または不自然か合成アミノ酸を表します。標準の １つのレターまたは３－レター・コードはアミノ酸を参照するために用いられます。このコンテキストでは、アミノ酸は、当技術で既知のあるレターと３レターの略語による一般に表わされます。例えば、アラニンはＡまたはアラバマによる表わすことができます。
ポリペプチドの場合には、本明細書に用いられるように、「シーケンス」はアミノ末端からカルボキシ末端へ方角のポリペプチドへのアミノ酸のシーケンスです。そこでは互いに隣接している残基はシーケンスの中でポリペプチドのあります。一次構造は連続的です。シーケンスは、また １つまたは２つの方角の追加の残基を含むと知られていたポリペプチドの一部の線状のシーケンスかもしれません。
本明細書に用いられるように、「同一性」、「相同」または「シーケンス同一性」は２つ以上のポリヌクレオチド・シーケンス、または２つ以上のポリペプチド配列間の類似点を順番に並べるために参照します。２つの異なるアミノ酸配列順序間のシーケンス同一性、類似性または相同を測定するためにＥＭＢＯＳＳ針またはＢｅｓｔＦｉｔなどのプログラムを用いる時、デフォルト設定は用いることができます。または、ｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０などの適切な得点するマトリックスは、最適化同一性、類似性または相同性のスコアのために選択することができます。むしろ、同族のポリヌクレオチドは、より好ましくは少なくとも９０％より好ましくはむしろ、厳格な条件の下で交雑し、少なくとも７０％が少なくとも８０％あるものです（９５％、より好ましくは）９７％、より好ましくは９８％およびより好ましくはこれらのシーケンスに比較された９９％のシーケンス同一性さえ。最適に比較可能な長さのシーケンスを整列させる時、同族のポリペプチドはむしろ少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を持っているか、少なくとも９７％、または少なくとも９８％が同一性を順番に並べるか、または少なくとも９９％のシーケンス同一性があります。
本明細書に開示された抗原結合単位に関する限り、用語「パーセント・シーケンス同一性（％）」は、いかなる保存的置換もシーケンス同一性の一部と見なさずに、シーケンスを整列させて、シーケンス同一性の最大のパーセンテージを得るのに必要なときにギャップを導入した後に質問シーケンスおよび第２の間の同じａｎｉｍｏ酸と参照ポリペプチド配列のパーセンテージとして定義されます。アミノ酸配列順序のパーセント同一性を測定するための配列は、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの公に有効なコンピューター・ソフトウェアを用いることにより、芸術の熟練したものによる感謝された様々な面の中で例えば達成することができます。当業者は、比較されている配列の全体にわたる最大の整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む整列を測定するための、適切なパラメーターを測定することができる。パーセント同一性は、定義されたポリペプチド配列全体の長さの間測定することができる、またはより短い長さの間測定することができる、例えば、破片の長さ以上、より大きな定義されたポリペプチド配列から得られた、少なくとも５つ、１０（少なくとも）の、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００または少なくとも２００連続する残基の破片のような。これらの長さは単に典型的です。そして、パーセント同一性が測定することができる長さを記載するために表、図または本明細書にリストするシーケンスにおける示されるシーケンスによる支持されたいかなる破片長さも用いることができることが、理解されるに違いありません。
本明細書に記載されたタンパク質は、参照シーケンスに関する １つ以上の変異をしているかもしれません。その変異は、欠失、挿入または、付加、またはアミノ酸残基の置換かもしれません。「欠失」は、 １つ以上のアミノ酸残基の除去によりアミノ酸配列順序の変化を表します。「挿入」または「付加」は、基準シーケンスに比較して、 １つ以上のアミノ酸残基の付加の帰着するアミノ酸配列順序変化を表します。「置換」「または置換された」 １つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸に取り替えられることを意味します。ここで、参照シーケンスに対する抗原結合フラグメントの変異は、抗原結合フラグメントを参照シーケンスに比較することにより測定することができます。比較のシーケンスの最適な配列は、芸術のあらゆる既知の方法に応じて果たすことができます。
本明細書に用いられたように、用語「分離された」自然界、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体または破片において場合には、細胞・他の構成要素から分離に言及する、それについて。当業者は、それらとそれらの自然発生の相当物を区別するためには、非自然発生のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその破片が「分離される必要がない」ことに気づいています。加えて、「濃縮」ポリヌクレオチド、「分離された」ポリヌクレオチドまたは「希釈された」ポリヌクレオチド、またはペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその破片は、より大きな単位体積について分子の濃縮または数のためにそれらの自然発生の相当物から識別可能です、より（「集中する」）またはその自然発生の相当物（「分離する」）より小さな豊富化は １つの単位体積当たりの解決の重量などの絶対量に基づいて、測定することができるか、またはそれを第２に関連があって測定することができます、潜在的に、出所混合物においてある干渉物質。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に用いられます。彼らは、あらゆる長さ（デオキシリボヌクレオチドもリボヌクレオチドも）またはアナログのヌクレオチドの重合体の形を表します。ポリヌクレオチドはいかなる三次元構造も持つことができ、いかなる既知か未知の作用も果たすことができます。以下はポリヌクレオチドの制限しない例です：遺伝子または遺伝子破片のコーディング、連鎖解析、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えのポリヌクレオチド、枝分かれさせられたポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、分離されたＤＮＡ、分離されたＲＮＡ、核酸プローブ、入門書、オリゴヌクレオチドまたは合成ＤＮＡから測定された座または非コードの領域。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなど修飾されたヌクレオチドを含むかもしれない。ヌクレオチド構造への変異は、ポリヌクレオチドの形成の前に、またはその形成の後に与えることができます。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって阻止され得る。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素との抱合によってなど、重合の後にさらに修飾され得る。
ポリヌクレオチドに適用された時、「組み換えである」ことはポリヌクレオチドがクローニングであることを意味します。または、生成物は制限消化、連結反応と他の手順から起因しました。そして、生成物は自然界の中で発見されたポリヌクレオチドとは異なります。
「遺伝子」、「遺伝子破片」という用語は交換可能に本明細書に用いられます。彼らは、転写および翻訳の後に特有のタンパク質をエンコードすることができる少なくとも １つの読取枠を含んでいるポリヌクレオチドを表します。遺伝子または遺伝子破片はゲノムかもしれません、ｃＤＮＡ、またはポリヌクレオチドが少なくとも １つの読取枠を含んでいる限り、合成の、それはそれのコード領域またはセグメント全体を覆うかもしれません。
「操作しやすく接続しているか」、「有効に接続している」用語は、それらの意図した方法の中で作用への構成要素を許可する、構成要素の並置を表します。例えば、プロモーター・シーケンスが暗号配列の転写を促進する場合、プロモーター・シーケンスは暗号配列に操作しやすくリンクされます。
本明細書に用いられるように、「発現」はポリヌクレオチドがｍＲＮＡへ転写される手順および／または転写されたｍＲＮＡ（また「転写」と呼ばれた）がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へ次に変換される手順を表します。転写とエンコードされたポリペプチドは総体として遺伝子産物と呼ばれます。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導した場合、発現は真核細胞のｍＲＮＡのスプライシングを含むかもしれません。
本明細書に用いられるように、用語「ベクター」はポリヌクレオチドが挿入することができる核酸ビヒクルを表します。ベクターが挿入されたポリヌクレオチドによるエンコードされたタンパク質の発現を可能にする時、ベクターは発現ベクトルと呼ばれます。ベクターは変態、形質導入またはトランスフェクションによる宿主細胞へ導入することができます。それは、それによる運ばれた遺伝物質が宿主細胞で示されうるほどのものです。当業者によく知られているベクターは含みます、しかし制限されない、プラスミド、ファージミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などの人工染色体、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）とＰ１は、人工染色体（ＰＡＣ）、λファージおよびＭ１３ファージなどのファージと動物ウイルスを引き出しました。ベクターとして用いることができる動物ウイルス、含む、しかし制限されない、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウィルス（単純疱疹ウイルスのような）、ポックスウイルス、バキュロウィルス、乳頭腫ウィルス、および乳頭突起ポリオーマウイルス空胞のあるウィルス（ｅｇシミアンウイルス４０）。ベクターは、プロモーター、転写開始剤、エンハンサー、選択要素とレポーター遺伝子を含み、これらに限定されずに、抑制発現に対して多数の要素を持つことができます。加えて、ベクターはまた複製開始点を含んでいるかもしれません。
用語「トランスフェクション」は細胞で外来性ＤＮＡの摂取を参照するために用いられます。そして、外来性ＤＮＡが細胞膜の内部で導入された時、細胞は「トランスフェクトされました」。多くのトランスフェクション技術が、当技術分野において一般的に知られている。例えば国際公開第２００９／１０１６１１号を参照されたい。（１９７３） ウイルス学、５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） 分子クローニング、実験手引き書、コールド・スプリング湾研究所、ニューヨーク、デイビスら（１９８６） 分子生物学、Ｅｌｓｅｖｉｅｒとチューの基本的方法ら（１９８１） 遺伝子１３：１９７。そのような技術は適切なホスト細胞へ、ヌクレオチド統合ベクターと他の核酸分子などの １つ以上の外因性の核酸を導入するために用いることができます。
本明細書に用いられるように、用語「抗体」は２組のポリペプチド鎖（ １つの「光」（Ｌ）鎖と １つの「重い」（Ｈ）鎖がある各ペア）から一般に構成される免疫グロブリン分子を表します。抗体軽鎖はカッパおよびλ軽鎖へ分類することができます。重鎖はμ、δ、γ、αまたはεとして分類することができます。そして、抗体アイソタイプはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡとＩｇＥとしてそれぞれ定義されます。光および重鎖の内では、変数および不変部領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域による接続されます。そして、重鎖は、また約３つ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含んでいます。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖不変部領域は領域ＣＬから構成されます。抗体の定常領域は、免疫系（例えば、エフェクター細胞）と古典的な補体系の第１構成要素（Ｃｌｑ）の様々な細胞を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介してもよい。ＶＨおよびＶＬの領域も、その間に点在したフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より多くの保存された領域を備えた高い変性（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれた）を有する領域へ細分することができます。ＶＨとＶＬは各々、次の順の整えられた３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成されます：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、アミノ末端からカルボキシ末端へ整えられたＦＲ４。個々の重い／軽鎖ペアの可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、抗体結合部位をそれぞれ形成します。各領域または領域へのアミノ酸の割付けは、免疫学に興味のあるタンパク質（国立衛生研究所（ベテスダ（メリーランド）（１９８７年および１９９１年）））、またはＣｈｏｔｈｉａのカバット・シーケンス＆ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．ｍｏｌに続きます。生物学者１９６：９０１ －９１７；Ｃｈｏｔｈｉａらの定義（１９８９） 自然３４２：８７８－８８３。用語「抗体」は抗体を生成するいかなる特定の方法によるも限定的ではありません。例えば、それは組み換えの抗体、単クローン抗体と多クローン性抗体を含みます。抗体は、異なるアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ抗体）（ｅｇ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４亜型）の抗体かもしれません。
本明細書に用いられるように、用語「抗原結合フラグメント」は抗体に特に短縮していない抗体が結合するのと同じ抗原を拘束する能力を保持する、短縮していない抗体の破片を含むポリペプチド、および／または特に抗原に結合する長い抗体に競争する能力を表します。抗原結合フラグメントも「抗原結合部分」として知られています。一般に見る、基本の免疫学、７章（ポール（Ｗ）。）ｅｄ。第二版、参照によるすべての目的のその全体の本明細書に組み入れられる、漆黒の出版（ＮＹ（１９８９））。完全な抗体のＤＮＡ再結合技術、酵素の切断または化学の切断を用いることは、抗体の抗原結合フラグメントを生成するかもしれません。ある場合には、抗原結合フラグメントが含みます、驚くべき、驚くべき。」Ｆ（ａｂ」）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂと相補性決定領域（ＣＤＲ）破片、単一の鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重特異性抗体（二重特異性抗体）と、少なくとも特異性抗原結合能力を与えるのに十分な抗体の一部を含んでいるポリペプチド．ある場合には、抗原結合フラグメントが単一の鎖の抗体（例えばｓｃＦｖ）です。そこでは、ＶＬおよびＶＨの領域はそれらが単一のポリペプチド鎖（参照、例えばバードら、サイエンス２４２：４２３ ４２６（１９８８）、ヒューストンら、米国科学アカデミー紀要８５：５８７９ ５８８３（１９８８））であるリンカーを生成することを可能にすることにより、１価の分子を形成するためにペアになります。そのようなｓｃＦｖ分子には一般的な構造があるかもしれません：ＮＨ２－ＶＬリンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨリンカーＶＬ－ＣＯＯＨ。適切なリンカーは含みます、しかしそれについて繰り返されたＧＧＧＧＳアミノ酸配列順序または変異体に限定的でありませんでした。例えば、アミノ酸配列順序（ＧＧＧＧＳ）４とその変異体を有するリンカーは用いることができます。（ホリガーらを参照（１９９３）（Ｐｒｏｃ国家アカデミーＳｃｉ）。アメリカの９０：６４４４－６４４８）用いることができる他のリンカーはＡｌｆｔｈａｎらによる記載されます。（１９９５）（タンパク質エング）。８：７２５－７３１、チョウイら（２００１）（ヨーロッパＪ Ｉｍｍｕｎｏｌ）。３１の解釈：９４－１０６、フーら（１９９６）（癌事実）。５６：３０５５－３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９）（Ｊ．ｍｏｌ）。生物学的な２９３：４１－５６、Ｒｏｏｖｅｒｓら（２００１）（癌Ｉｍｍｕｎｏｌ）。参照はすべて、参照によるすべての目的のそれらの全体の本明細書に組み入れられます。
抗体（例えば上に言及されるような抗体フラグメント）の抗原結合フラグメントは、ルーチン技術（例えばＤＮＡ再結合技術、酵素の切断または化学の切断）による得ることができ、完全な抗体に関しては特に同じ方法の中でスクリーニングすることができます。もし、コンテキストが明白に示さなければ、用語「抗体」を参照する時、そうでなければ、それは、全体の抗体だけでなく抗体の抗原結合フラグメントも含みます。
本明細書に用いられるように、用語「宿主細胞」はベクターが導入することができる細胞を表します、含む、しかし限定的でない、に、大腸菌または枯草菌などの原核細胞、酵母菌またはアスペルギルス属などの菌による細胞、Ｓ２ミバエ細胞またはＳｆ９昆虫細胞などの昆虫細胞、または繊維芽細胞などの動物細胞、ＣＨＯ細胞、コス細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはヒト細胞。
「アンタゴニスト」、「阻害剤」という用語は交換可能に本明細書に用いられ、標的タンパク質の活動または発現の抑制により、標的タンパク質の生物学的な作用を阻害することができる分子を表します。従って、用語「アンタゴニスト」及び「阻害剤」は、標的タンパク質の生物学的な役割との関連において定義されている。本明細書における好ましいアンタゴニストは標的と特異的に相互作用（例えば、結合）するが、標的タンパク質が一員となる、信号伝達経路の他の員と相互作用することにより、標的タンパク質の生物活性を阻害する化合物も、この定義内に特異的に含まれている。
本明細書に用いられるように、「有効な量」は少なくとも特定の疾患または症状の測定可能な改善または予防を達成するのに必要な最低額を表します。有効な量は、患者の疾患状態、時代、ジェンダーと重量によって異なることができます。有効な量はまた治療の有益な効果が超過する量です、治療のあらゆる有毒または悪影響。癌または腫瘍の処置では、有効な薬物量は次の効果があるかもしれません：癌細胞の数を減らすこと、腫瘍の寸法の低減、周辺の器官へ癌細胞の浸潤の阻害、抑止的な腫瘍転移、抑止的な腫瘍の増殖、ある程度まで、および／または、 １つ以上の症状の緩和、その疾患に関連した、ある程度まで。有効な量は １つ以上の適用の中で投与することができます。
本明細書で使用するとき、用語「受容者」、「個体」、「対象」、「宿主」と「患者」は交換可能に用いられる、および診断されるか処置されることが従属するあらゆる哺乳類を参照する、好ましくはヒト。
本明細書に用いられるように、用語「治療」、「処置し」こと、および当量は、希望の薬学でおよび／または生理的な効果を得ることを一般に指すために本明細書に用いられます。効力は、完全にまたは部分的に疾患またはその症状を予防する点では予防かもしれないし、および／または疾患および／またはその疾患に起因する副作用を部分的にまたは完全に安定させるか直す点では治療かもしれません。本明細書に用いられるような「処置」は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、霊長類、人間を含むこと他の類人猿（好ましくは人間）などの哺乳動物への疾患のいかなる処置も包含します。該方法は、（ａ） 疾患または症状に弱いかもしれない対象の生じることから疾患または症状だが診断書の予防は、まだ生じていません；（ｂ）病徴を阻害すること；（ｃ） その疾患の発現を防ぐこと；（ｄ） その疾患の症状を和らげること；（ｅ）疾患または症状をおさまらせてください；（１）－（３）の任意の組み合わせによって達成される。
本明細書に用いられるような用語「キット」は、共通の使用のための、または営利上パッケージにされた組み合わせを表します、有効。例えば、本の開示のキットは、本明細書に開示された組成物、と組成物またはキットを用いるための指示を含んでいるかもしれません。用語「指示」は、治療薬のコマーシャル・パッケージの通常含まれている説明の挿入物を表します。それは、適応症、使用、量、投与、併用に関する情報、禁忌および／またはそのような治療薬の使用に関する警告を含んでいます。
「コドン最適化」「またはコドン最適化された」という用語は、コドンが特有のシステム（例えば特有の種類または一群の種類）において発現には打ってつけのことができるように、核酸配列を構築するコドンを変更することを指します。例えば、核酸配列は哺乳動物細胞へのより効率的な発現のための最適化されます。同意語のコドンの存在により、コドン最適化は、エンコードされたタンパク質のアミノ酸配列順序を変更しません。様々なコドン最適化方法は、米国の特許の番号５，７８６，４６４と６，１１４，１４８の開示されたものなどの技術で知られています。それは参照によるすべての目的のそれらの全体の本明細書に組み入れられます。「同意語のコドン」は、同じアミノ酸をエンコードするコドンを表します。
タンパク質を構成する２０のアミノ酸と、アミノ酸をエンコードする６４のコドンがあります。アミノ酸は各々少なくとも １つのコドンに相当します。そして、 １つのアミノ酸は６つまでのコドン（縮重暗号）に相当する場合があります。異なる生体（同じ生体の異なるタンパク質をコード化する遺伝子さえ）も、縮重暗号の異なる使用頻度を持っており、特定の優先度があります。それらの中で、高周波を有するコドンは好ましいコドンと呼ばれます。そして、めったに用いられないものはまれか低周波のコドンと呼ばれます。遺伝子コドンの最適化は、好ましいコドンを利用し、低い利用を有するまれか低周波のコドンを回避し、遺伝子転写の後にｍＲＮＡの二次構造を単純化し、高性能発現の助けになり、発現に不利で、ＧＣ含有量を調節しているモチーフを低減しているモチーフをｉｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇすること等により、タンパク質発現レベルを増加する場合があります。多くの一般的なコドン最適化原理がありますが、これらの一般的な最適化原理は、一様に単一の遺伝子治療ベクターに適用することができません。異なる一般的な最適化原理は互いに否定するかもしれません。例えば、ＣｐＧ島の組成物またはコード領域のＧＣ含有量の変更は、コドン利用優先度の選択に影響するかもしれません。加えて、異なるコドン最適化は異なる翻訳後修飾と異なる生物活性に至るかもしれません。
「活発な」または、本の発明の目的の「活動」は、対応する在来か自然発生のポリペプチドの生物活性を保持する、治療のタンパク質の形を表します。活動はより大きいかもしれません、より、等しい、に、または対応する在来か自然発生のポリペプチドを有する観測されたそれ未満。
ウェット型黄斑変性
斑は網膜の中央部です。網膜の変性として知られる黄斑変性は黄斑変性に関する眼疾患です。
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、５０歳のときにわたる人々における不可逆の視力障害の最も重要な原因のうちの１つです。ＡＭＤは、「乾燥して」、「ぬれた」２つの型へ臨床的に分類されます。ＡＭＤのぬれた形では、新しい血管は、網膜の組織（特に斑より下のもの）への血液供給を形成し変更します。しかしながら、新しい血管は容易に破損されます。そして、それらの破裂は、周囲の組織、形成に傷跡を残す網膜の組織とビジョンの急速な損失に出血および損傷をもたらすでしょう。その疾患は迅速に進行し、盲目にしばしば至ります。ぬれた黄斑変性は、黄斑変性に関連した盲目の約９０％を占めて、通常視野の中心の歪曲から始まります。
いくつかのサイトカインは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦレセプタ（ＶＥＧＦＲ）、胎盤の成長因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、低酸素症誘導可能な要素（ＨＩＦ）、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ（Ａｎｇ）と他のサイトカインを含み、これらに限定されずに、血管形成の調節の重要な役割を果たすと分かりました、およびＭＡＰキナーゼ（ＭＰＫ）。
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、４６ ｋＤａ（それは色素上皮細胞を含む目の細胞における示される）の寸法を有する糖タンパク質です、周皮細胞、血管内皮細胞、神経膠、および神経節細胞。ＶＥＧＦは様々な眼疾患に関連すると知られている、虚血の網膜症を含み、これらに限定されずに、眼内の新血管新生、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、網膜新生血管、糖尿病の黄斑の浮腫、糖尿病の網膜虚血、糖尿病の網膜浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞症（網膜静脈分枝閉塞症）。
Ｅｙｌｅａ（ｒ）（ＶＥＧＦを拘束力のある融合タンパク質（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ））は滲出型ＡＭＤの治療のための承認された薬物です。それは目の新血管新生を防ぎ、このように、滲出型ＡＭＤを処置することができます。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ｒ）（抗ＶＥＧＦ抗体（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ））は滲出型ＡＭＤの治療のための承認された別の薬物です。また、それは目の新血管新生を防ぎ、このように、滲出型ＡＭＤを処置することができます。臨床研究は、患者の約９５％がＬｕｃｅｎｔｉｓ（ｒ）を投与したことを示しました、改善した、または安定したビジョン。しかしながら、両方の薬物は非常に高価です。そして、頻繁に繰り返された注射剤はこれらの薬物の短い半減期により有効性を維持するように要求されます。従って、新しい治療は、関連する眼疾患を処置するためにＶＥＧＦを標的とすることのに必要です。
組換えＡＡＶベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科ファミリーのもので、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウィルスです。ＡＡＶゲノムは長さ約４．７キロベースで、ＤＮＡ鎖の両端と、レプおよびキャップと呼ばれる２つの読取枠（ＯＲＦ）で逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含んでいます。
「ＡＡＶ逆方向末端反復」（ＩＴＲ）シーケンスは、在来の単鎖のＡＡＶゲノムの両端で存在する約１４５のヌクレオチドのシーケンスです。ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス・ゲノムへの効率的な複製の対称的な核酸配列です。それは複製起点としてウィルスＤＮＡ合成のために用いることができ、組み換えのＡＡＶベクターのために必要な構造の構成要素です。
「レプ」はポリヌクレオチドを含んでいます、順番に並べる、４のレプ・タンパク質ｒｅｐ７８のエンコード、それをｒｅｐ６８し、ｒｅｐ５２し、ｒｅｐ４０する、ＡＡＶ生活環のために必要です。「脱帽してください」ポリヌクレオチドを含んでいる、順番に並べる、ＡＡＶカプシド・タンパク質のエンコード、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、ＡＡＶカプシド・タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２とＶＰ３が２４の対称なＡＡＶカプシドを形成するために互いと相互に作用することができる場合には。
ＡＡＶは分割され分割されなかったヒト細胞を有効に感染させる場合があります。そして、そのゲノムは、宿主細胞ゲノムへの１回の染色体のサイトへ統合することができます。最も重要なことには、ＡＡＶは人体の存在しますが、現在の調査はＡＡＶがいかなる疾患にも関連していないことを示唆します。その高い安全性、低い免疫原性、広い宿主領域と動物への外来遺伝子の長期的な安定した発現を調停する能力に基づいて、ＡＡＶは遺伝子治療の最も有望なベクターシステムになりました。
ＡＡＶ血清型または感染した組織または、細胞に基づいて、１３の異なるＡＡＶがこれまで確認されました（すなわちＡＡＶ１－ＡＡＶ１３）。さらに、表あるの下に示されるように、ＡＡＶを用いる多くの有利なベクターシステムが特有の細胞型へのトランスフェクションのための開発されています。ＡＡＶ血清型中で、血清型２（ＡＡＶ２）は最も広く調査される（用いられる）ものです。それは網膜の上皮、光受容細胞、骨格筋、中枢神経と肝細胞を感染させる場合があります。それは担体として多くの臨床研究のために用いられました。
本明細書に用いられるように、用語「組み換えのＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は１つ含んでいるポリヌクレオチド・ベクターを表します。または、より異種のシーケンス（すなわち非－ＡＡＶ－派生した核酸配列）は２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）による側面に位置しました。ＡＡＶレプとキャップ・タンパク質を示すホスト細胞における示す時、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶへウイルス粒子を複製しパッケージにすることができます。
「組み換えのＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウィルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、ｒＡＡＶベクターをカプセルに入れる少なくとも １つのＡＡＶカプシド・タンパク質からなるＡＡＶウイルス粒子を表します。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のために現在用いられたホスト細胞は、すべて２９３個の細胞、コス細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞と他の哺乳動物細胞株などの哺乳動物から細胞型です。ｒＡＡＶウイルス粒子はｒＡＡＶプラスミドを備えた提供される哺乳動物細胞培養系の中で生むことができます。しかしながら、ほとんどの哺乳動物細胞培養系の出力は治験と工業規模産生のための必要性を満たすのが困難です。この理由で、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞を用いるｒＡＡＶウイルス粒子プロダクション・システムは、最近開発されています。しかしながら、昆虫細胞のＡＡＶを生成するために、ＡＡＶカプシド・タンパク質の正しい理論混合比を得るためにいくつかの変異をなさなければなりません。
バキュロウィルスはバキュロウィルス・ファミリーが所有しており、二重らせん構造のサーキュラーＤＮＡウィルスです。そのゲノム・サイズは９０ｋｂ－２３０ｋｂの間であります。バキュロウィルスは、節足動物においてもっぱら寄生し、６００匹を超える昆虫を感染させることができると知られています。１９８３年には、スミスらが、成功裡にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統Ｓｆ９（ｍｏｌ細胞Ｂｉｏｌ、１９８３年、３： ２１５６－２１６５）における人間β－インターフェロンを示すためにＡｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多重カプシド核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を用いることにより、第一のバキュロウィルス発現システムを作出しました。その時以来、バキュロウィルス発現システムは継続的に改善され開発されており、広く用いられている真核生物の発現システムになりました。２００２年には、Ｕｒａｂｅらが、バキュロウィルスに感染したＳｆ９昆虫細胞がＡＡＶの複製を支持することができることを確認しました。彼らは、Ｓｆ９細胞と成功裡に準備したｒＡＡＶウイルス粒子を共同感染させるためにＡＡＶのレプ遺伝子、キャップ遺伝子とＩＴＲコア発現要素をそれぞれ運んで、３つの組み換えのバキュロウィルスを用いました。その時以来、研究者は、ｒＡＡＶウイルス粒子の大規模調製のために、より適しているシステムをｃｏｎｔｉｎｕｏｕｌｙに開発しました。
現在、ｒＡＡＶウイルス粒子の大規模調製の２つの主なバキュロウィルス発現システムがあります：２つのバキュロウィルス・システム（２つのＢａｃシステム）とパッケージにする細胞系統依存の １つのバキュロウィルス・システム（ １つのＢａｃシステム）。２つのバキュロウィルス・システムを用いて、ｒＡＡＶウイルス粒子を調製する主な過程は、レプ遺伝子と、 １つのバキュロウィルス・ゲノムへのＡＡＶのキャップ遺伝子を統合し、ＩＴＲコア発現要素と、別のバキュロウィルス・ゲノムへ興味のある標的遺伝子を統合することです。その後、２つの組み換えのバキュロウィルスは興味のある遺伝子を運ぶｒＡＡＶウイルス粒子を生むホスト細胞を共同感染させるために用いられます。 １つのバキュロウィルス・システムを用いて、ｒＡＡＶウイルス粒子を調製する主な過程は、レプおよびキャップの遺伝子の発現を引き起こすパッケージング細胞系統の確立を有する始まります。パッケージング細胞系統はレプを統合します。そして、レプ遺伝子とキャップ遺伝子がそうだったように、キャップ遺伝子発現要素は強いプロモーターｐｏｌｈプロモーターをバキュロウィルス後期遺伝子発現の管理下に配置しました。ｈｒ２エンハンサー配列とＡＡＶレプ・タンパク結合シーケンスは、さらにｐｏｌｈプロモーターの上流に付加になりえます。ＡＡＶ ＩＴＲと標的遺伝子を含んでいる組み換えのバキュロウィルスによる感染症の後、パッケージング細胞系統へのレプ遺伝子とキャップ遺伝子はタンパク質を示すために引き起こされ、それによって、標的遺伝子を統合するｒＡＡＶウイルス粒子を生成します。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターはかつてはｒＡＡＶウィルス粒子の興味のある遺伝子を運びました、促進してもよい、１つ以上を含む「発現調整する要素。」用語「発現調整する要素」本明細書に用いられたように、異種のポリヌクレオチドの転写と翻訳を促進するポリヌクレオチド・シーケンスを含む操作しやすくリンクしたポリヌクレオチドの発現に影響する核酸配列に言及します。発現調節要素の制限しない例は含みます、しかし制限されない、プロモーター、エンハンサー、イントロン継手信号、ポリアデニル化（ポリ（１つの））、逆方向末端反復シーケンス（ＩＴＲ）。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シーケンスは、ｈＧＨポリ（Ａ）、シミアンウイルス４０ポリ（Ａ）またはβ－グロビン・ポリ（Ａ）です。
「プロモーター」は、標的生成物をエンコードする異種のポリヌクレオチド・シーケンスに隣接した位置にあったＤＮＡ塩基配列です。それは、通常異種のポリヌクレオチドなどの隣接したシーケンスに操作しやすくリンクされます。プロモーターの不在への異種のポリヌクレオチドの発現レベルと比較して、プロモーターは、一般に異種のポリヌクレオチドの発現レベルを増加します。
「エンハンサー」はプロモーターの活動を増強するシーケンスです。プロモーターと異なり、エンハンサーはプロモーター作用をしておらず、プロモーター（すなわち上流にまたは下流にプロモーターの）に関連のあるそれらの位置と無関係に一般に機能することができます。エンハンサーエレメント（またはその部分）の制限しない例はバキュロウィルス・エンハンサーと、昆虫細胞の中で見つけられたエンハンサーエレメントを含みます。
「充填材シーケンス」は、ベクターなどのより大きな核酸分子の含まれていたヌクレオチド配列を表し、プロモーターおよび暗号配列の間でのような２つの核酸配列間の必要な間隔を作出するかまたは希望の長さに核酸配列を延長するために一般に用いられます。充填材シーケンスはタンパク質暗号情報を含んでいません。充填材シーケンスは未知か合成起源を持っているかもしれないし、および／または他の核酸配列ｉｎｔｈｅに無関係かもしれません、より大きな核酸分子。
組成物
１つの態様では、本の開示は、第１のポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドを含む組成物を提供します。そこでは最初のポリヌクレオチドは、第１のプロモーターに操作しやすくリンクされた第１のシーケンス、と別のプロモーターに操作しやすくリンクされた別のシーケンスを含みます。
いくつかの実施形態では、最初のシーケンスはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャップ・タンパク質をエンコードします。キャップ・タンパク質は、機能的なＡＡＶカプシド（すなわち、ＤＮＡをパッケージにすることができ、標的細胞を感染させることができること）を形成することができる技術で既知のあらゆる構造タンパク質かもしれません。いくつかの実施形態では、キャップ・タンパク質はＶＰ１、ＶＰ２とＶＰ３を含みます。いくつかの実施形態では、それが機能的なＡＡＶカプシドを生成することができる限り、キャップ・タンパク質はＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３のすべてを含む必要がありません。いくつかの実施形態では、キャップ・タンパク質はＶＰ１およびＶＰ２を含みます。いくつかの実施形態では、キャップ・タンパク質はＶＰ１およびＶＰ３を含みます。いくつかの実施形態では、キャップ・タンパク質はＶＰ２およびＶＰ３を含みます。幾つかの実施形態では、ＲＮＡは、された核酸塩基を含まない。幾つかの実施形態では、ＲＮＡは、された核酸塩基を含まない。幾つかの実施形態では、ＲＮＡは、された核酸塩基を含まない。
ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３はあらゆるＡＡＶ血清型から誘導しているかもしれません。いくつかの実施形態では、ＶＰ１はＡＡＶ血清型ある（ＡＡＶ１）とＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）から誘導しているかもしれません、ＡＡＶ血清型３（血清型３Ａと３Ｂを含むＡＡＶ３）とＡＡＶは、４（ＡＡＶ４）とＡＡＶをセロタイプで分けます、５（ＡＡＶ５）とＡＡＶをセロタイプで分ける、６（ＡＡＶ６）とＡＡＶをセロタイプで分ける、７（ＡＡＶ７）とＡＡＶをセロタイプで分ける、８（ＡＡＶ８）とＡＡＶをセロタイプで分ける、９（ＡＡＶ９）とＡＡＶをセロタイプで分ける、１０（ＡＡＶ１０）セロタイプで分ける、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、ＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）、ＡＡＶ血清型１３（ＡＡＶ１３）、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶ。いくつかの実施形態では、ＶＰ１は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８から野性型ＶＰ１から誘導しています。それはこれらの野性型ＶＰ１タンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または高い同一性持っていますいくつかの実施形態では、ＶＰ１は血清型ＡＡＶ１から野性型ＶＰ１から誘導しています、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２変異体（ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ２（コッドＹ－Ｆ）とＡＡＶ２ｔＹＦのような）、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８、 １つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加を持っている。
いくつかの実施形態では、ＶＰ２はＡＡＶ１から誘導しているかもしれません、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２変異体（ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ２（コッドＹ－Ｆ）とＡＡＶ２ｔＹＦのような）、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ（Ｒｈ１０（－）、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶ）。いくつかの実施形態では、ＶＰ２は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８から野性型ＶＰ２から誘導しています。それはこれらの野性型ＶＰ１タンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または高い同一性持っていますいくつかの実施形態では、ＶＰ２は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８から野性型ＶＰ２から誘導しています。それには １つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加があります。
ＶＰ３はＡＡＶ１から誘導しているかもしれません、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２変異体（ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ２（コッドＹ－Ｆ）とＡＡＶ２ｔＹＦのような）、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶ。いくつかの実施形態では、ＶＰ３は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８から野性型ＶＰ３から誘導しています。それはこれらの野性型ＶＰ３タンパク質に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または高い同一性持っていますいくつかの実施形態では、ＶＰ３は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８から野性型ＶＰ３から誘導しています。それには １つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加があります。
例えばいくつかの実施形態では、キャップはＶＰ１、ＶＰ２および／または同じ血清型のＡＡＶから誘導したＶＰ３を含みます、キャップはＶＰ１、ＶＰ２および／またはＡＡＶ２からすべて誘導したＶＰ３を含むかもしれません。いくつかの実施形態では、キャップはＶＰ１、ＶＰ２および／または異なる血清型のＡＡＶから誘導したＶＰ３を含みます。例えば、キャップは、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＡＡＶ１のうちのいかなるものからも誘導したＶＰ３の１つ以上を含むかもしれません、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２変異体（ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ２（コッドＹ－Ｆ）とＡＡＶ２ｔＹＦのような）、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、およびＡＡＶ－２ｉ８。
いくつかの実施形態では、キャップをエンコードする最初のシーケンスは、第１のプロモーターに操作しやすくリンクされます。第１のプロモーターは、細胞におけるキャップの発現を駆り立てることができる技術における既知のあらゆる適切なプロモーターかもしれません。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、組織特異的プロモーター、構成するプロモーターまたは規制されたプロモーターかもしれません。例えばいくつかの実施形態では、第１のプロモーターは異なる出所から選択されるかもしれません、第１のプロモーターは、ウイルスのプロモーター、プラント・プロモーターまたは哺乳類のプロモーターかもしれません。
第１のプロモーターの例は含みます、しかし制限されない、ヒト－サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター（例えば、早い（ＣＭＶ ＩＥ）即時のＣＭＶ、エンハンサー／プロモーター）、シミアンウイルス４０エンハンサー／プロモーター（例えばシミアンウイルス４０の初期のエンハンサー／プロモーター）、ＪＣポリオーマウイルス・プロモーター、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ－ある）の潜伏期に関連するプロモーター（ＬＡＰ）または神経膠線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ルー肉腫ウイルス（ＲＳＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロンに特有のプロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス・メタロプロテイン・プロモーター（ＭＰＰ）、鶏β－アクチン・プロモーター、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫとＥＦ１ａプロモーター。
いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは哺乳動物細胞への発現のために適しているプロモーターです。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はそれについてＨＥＫ２９３細胞または派生的な細胞です。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは昆虫細胞の発現のために適しているプロモーターです。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、昆虫細胞の発現のために適しているプロモーターは含めます、しかし制限されない、ｐｏｌｈプロモーター、ｐ１０プロモーター、基礎的なプロモーター、誘導可能なプロモーター、Ｅ１プロモーター、またはΔＥ１プロモーター。幾つかの実施形態において、プロモータは構成型プロモータである。幾つかの実施形態において、プロモータは構成型プロモータである。
いくつかの実施形態では、最初のシーケンスの３’終了はさらにポリアデニル化シーケンス（すなわちポリ（Ａ）シーケンス）を含みます。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シーケンスの長さは及ぶかもしれません、から、５００ ｂｐへの１ｂｐに関して。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シーケンスの長さはそうかもしれません、しかし制限されなかった、ある、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０の、３０、５０、１０、２００または５００ヌクレオチド．いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シーケンスは、ｈＧＨポリ（Ａ）、シミアンウイルス４０ポリ（Ａ）またはβ－グロビン・ポリ（Ａ）です。
いくつかの実施形態では、第２のシーケンスはＡＡＶレプ・タンパク質をエンコードします。そこではレプ・タンパク質は、折れ重なり、パッケージングｒＡＡＶウイルス粒子ために必要なあらゆる複製タンパク質かもしれません。いくつかの実施形態では、レプ・タンパク質はｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２とｒｅｐ４０を含みます。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子が複製されパッケージにされることをそれが可能にする限り、レプ・タンパク質はｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２とｒｅｐ４０のすべてを含む必要がありません。いくつかの実施形態では、レプ・タンパク質は、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２とｒｅｐ４０のうちのいかなる３も含みます。いくつかの実施形態では、レプ・タンパク質は、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２とｒｅｐ４０のうちのいかなる２も含みます。いくつかの実施形態では、レプ・タンパク質は、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２とｒｅｐ４０のうちのいずれか１つを含みます。いくつかの実施形態では、レプ・タンパク質はｒｅｐ７８およびｒｅｐ５２を含みます。いくつかの実施形態では、レプ・タンパク質はｒｅｐ７８およびｒｅｐ４０を含みます。いくつかの実施形態では、レプ・タンパク質はｒｅｐ６８およびｒｅｐ５２を含みます。いくつかの実施形態では、レプ・タンパク質はｒｅｐ６８およびｒｅｐ４０を含みます。
ｒｅｐ７８（ｒｅｐ６８）はｒｅｐ５２します。そして、ｒｅｐ４０はあらゆるＡＡＶ血清型から誘導しているかもしれません。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ７８は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶから誘導しているかもしれません。いくつかの実施形態における、ｒｅｐ７８は血清型ＡＡＶ１から野性型ｒｅｐ７８から誘導している、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８、野性型に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはより高い同一性を持っている、タンパク質をｒｅｐ７８する。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ７８は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８から野性型ｒｅｐ７８から誘導しています。それには １つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加があります。
いくつかの実施形態では、ｒｅｐ６８は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶから誘導しているかもしれません。いくつかの実施形態における、ｒｅｐ６８は血清型ＡＡＶ１から野性型ｒｅｐ６８から誘導している、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８、野性型に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはより高い同一性を持っている、タンパク質をｒｅｐ６８する。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ６８は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８から野性型ｒｅｐ６８から誘導しています。それには置換、欠失および／または １つ以上のアミノ酸の付加があります。
いくつかの実施形態では、ｒｅｐ５２は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶから誘導しているかもしれません。いくつかの実施形態における、ｒｅｐ５２は血清型ＡＡＶ１から野性型ｒｅｐ５２から誘導している、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８、野性型に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはより高い同一性を持っている、タンパク質をｒｅｐ５２する。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ５２は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８から野性型ｒｅｐ５２から誘導しています、 １つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加を持っています。
いくつかの実施形態では、ｒｅｐ４０は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶから誘導しているかもしれません。いくつかの実施形態における、ｒｅｐ４０は血清型ＡＡＶ１から野性型ｒｅｐ５２から誘導している、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８、野性型に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはより高い同一性を持っている、タンパク質をｒｅｐ５２する。いくつかの実施形態では、ｒｅｐ４０は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４またはＡＡＶ－２ｉ８から野性型ｒｅｐ５２から誘導しています、 １つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または付加を持っています。
いくつかの実施形態では、レプはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２および／または同じ血清型ＡＡＶから誘導したｒｅｐ４０を含みます。例えば、レプはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２および／またはＡＡＶ２のみから誘導したｒｅｐ４０を含むかもしれません。いくつかの実施形態では、レプはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２および／または異なる血清型ＡＡＶから誘導したｒｅｐ４０を含みます。例えば、レプは、他の既知のＡＡＶ ｒｅｐ７８のＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８とある以上を含むかもしれません、ｒｅｐ６８する、ｒｅｐ５２する、および／またはｒｅｐ４０。
いくつかの実施形態では、レプ・タンパク質をエンコードする第２のシーケンスは、別のプロモーターに操作しやすくリンクされます。第２のプロモーターは、細胞におけるキャップの発現を駆り立てることができる技術における既知のあらゆる適切なプロモーターかもしれません。いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは、組織特異的プロモーター、構成するプロモーターまたは規制されたプロモーターかもしれません。いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは異なる出所から選択されるかもしれません。例えば、第２のプロモーターは、ウイルスのプロモーター、プラント・プロモーターまたは哺乳類のプロモーターかもしれません。
第２のプロモーターの例は含みます、しかし制限されない、ヒト－サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター（例えば、早い（ＣＭＶ ＩＥ）即時のＣＭＶ、エンハンサー／プロモーター）、シミアンウイルス４０エンハンサー／プロモーター（例えばシミアンウイルス４０の初期のエンハンサー／プロモーター）、ＪＣポリオーマウイルス・プロモーター、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ－ある）の潜伏期に関連するプロモーター（ＬＡＰ）または神経膠線維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ルー肉腫ウイルス（ＲＳＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロンに特有のプロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス・メタロプロテイン・プロモーター（ＭＰＰ）、鶏β－アクチン・プロモーター、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫとＥＦ１ａプロモーター。
いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは哺乳動物細胞への発現のために適しているプロモーターです。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はそれについてＨＥＫ２９３細胞または派生的な細胞です。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、第２のプロモーターは昆虫細胞の発現のために適しているプロモーターです。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、昆虫細胞の発現のために適しているプロモーターは含めます、しかし制限されない、ｐｏｌｈプロモーター、ｐ１０プロモーター、基礎的なプロモーター、誘導可能なプロモーター、Ｅ１プロモーター、またはΔＥ１プロモーター。幾つかの実施形態において、プロモータは構成型プロモータである。幾つかの実施形態において、プロモータは構成型プロモータである。
いくつかの実施形態では、第２のシーケンスの３’終了はさらにポリアデニル化シーケンス（すなわちポリ（Ａ）シーケンス）を含みます。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シーケンスの長さは約あるｂｐから５００ ｂｐに及ぶかもしれません。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シーケンスの長さはそうかもしれません、しかし制限されなかった、ある、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０の、３０、５０、１０、２００または５００ヌクレオチド．いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シーケンスは、ｈＧＨポリ（Ａ）、シミアンウイルス４０ポリ（Ａ）またはβ－グロビン・ポリ（Ａ）です。
いくつかの実施形態では、キャップおよびレプは同じＡＡＶ血清型から誘導しているかもしれません。例えば、キャップとレプは両方とも、同じＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ －Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８または他の既知のＡＡＶから誘導しているかもしれません。
いくつかの実施形態では、キャップおよびレプは異なるＡＡＶ血清型から誘導しているかもしれません。例えば、レプがＡＡＶのうちのいかなるものからも誘導しているかもしれない一方、キャップは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８または他の既知のＡＡＶから誘導しているかもしれません、言及した、しかしキャップが誘導したもの。例えば、レプがＡＡＶ５から誘導している一方、キャップはＡＡＶ２から誘導しているかもしれません。
いくつかの実施形態では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同じプロモーターかもしれません。例えば、第１のプロモーターと第２のプロモーターは、ｐｏｌｈプロモーター、ｐ１０プロモーター、基礎的なプロモーター、誘導可能なプロモーター、Ｅ１プロモーターとΔＥ１プロモーターから構成される群から選択された同じプロモーターです。例えば、いくつかの実施形態では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは両方ともｐｏｌｈプロモーターです。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターと第２のプロモーターの両方はｐ１０プロモーターです。
いくつかの実施形態では、第１のプロモーターと第２のプロモーターは異なるプロモーターかもしれません。例えば、第１のプロモーターと第２のプロモーターは、ｐｏｌｈプロモーター、ｐ１０プロモーター、基礎的なプロモーター、誘導可能なプロモーター、Ｅ１プロモーターとΔＥ１プロモーターから選択された２人の異なるプロモーターかもしれません。例えば、いくつかの実施形態では、第１のプロモーターはｐｏｌｈプロモーターです。そして、第２のプロモーターはｐ１０プロモーターです。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターはｐ１０プロモーターです。そして、第２のプロモーターはｐｏｌｈプロモーターです。
いくつかの実施形態では、最初のシーケンスと第２のシーケンスはリンカーをエンコードするシーケンスによるリンクされます。幾つかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは２Ａペプチドを含むシーケンスです。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、ブタのＪｉｅｓｈｅｎウィルス（ＰＴＶ－ある）の口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、馬鼻炎Ａウィルス（ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウィルス（ＴａＶ）または２Ａペプチドから例えば誘導して、類Ａｐｈｔｈｏｒａまたはカルジオウイルスから誘導した２Ａペプチドから選択されるかもしれません。いくつかの実施形態では、リンカーをエンコードするシーケンスはさらにプロモーター・シーケンスを含みます。幾つかの実施形態において、プロモータは誘導プロモータである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示された組成物の第２のポリヌクレオチドは３番めのシーケンスを含みます、ＶＥＧＦ阻害剤をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列を含みます。いくつかの実施形態では、組成物はｓｃＡＡＶベクターを含みます。そこではｓｃＡＡＶベクターは第２のポリヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、組成物はｓｓＡＡＶベクターを含みます。そこではｓｓＡＡＶベクターは第２のポリヌクレオチドを含みます。
ＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦタンパク質の活動または発現の抑制によりＶＥＧＦタンパク質の生物学的な作用を阻害することができるあらゆるポリペプチドまたはタンパク質かもしれません。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤はそれについて抗ＶＥＧＦ抗体または抗原結合フラグメントです。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは含みます、しかし制限されない、Ｆａｂ、驚くべき。」Ｆ（ａｂ」）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）破片、単一の鎖の抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体と二重特異性抗体。いくつかの実施形態では、抗ＶＥＧＦ阻害剤はｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、ベバシズマブまたはａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔから選択されます。
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：あるまたは配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同を持っているシーケンス：１．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：１．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：２または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、配列番号への９９％の相同があるシーケンス：２．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：２．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：３または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、配列番号への９９％の相同があるシーケンス：３．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：３．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：４または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、配列番号への９９％の相同があるシーケンス：４．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：４．
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：５または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同を持っているシーケンス：５．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：５．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：６または配列番号に相同性で、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％があるシーケンス：６．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：６．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：７または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同を持っているシーケンス：７．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：７．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：０、１、および２いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または配列番号に相同性の９９％があるシーケンスを含みます：０、１、および２いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：２５９２、２５９４、または２５９５である。
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：８または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同を持っているシーケンス：８．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：８．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：９または配列番号に相同性で、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％があるシーケンス：９．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：９．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：１０または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同を持っているシーケンス：１０．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：１０．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：２００７年、９と３６３１。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または配列番号に相同性の９９％があるシーケンスを含みます：２００７年、９と３６３１。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：２００７年、９と３６３１。
いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列はｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂをエンコードします。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列はベバシズマブをエンコードします。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列はａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔをエンコードします。いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：あるまたは配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：１．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：２または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：２．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：３または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：３．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：４または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：４．
いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：５または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：５．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：６または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：６．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：７または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：７．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：配列番号に相同性の５、６と７、または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるアミノ酸配列順序：０、１、および２
いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：８または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：８．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：９または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：９．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：１０または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：１０．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：配列番号に相同性の８、９と１０、または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるアミノ酸配列順序：２００７、９と３６３１。
いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：１１または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：１１．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：１２または配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％の相同を持っているシーケンス：１２．
いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は、配列番号１３よりＣｐＧジヌクレオチドの変更された数を含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は配列番号１３より少ないＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は配列番号１３より多くのＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５つのＣｐＧジヌクレオチド未満を含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０のＣｐＧジヌクレオチド以上を含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は０－８０のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は５－７５のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は１０－７０のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は１５－６５のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は２０－６０のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は２５－５５のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は３０－５０のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は３５－４５のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４の、３３、３２、３１、３０ ＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列はＣｐＧジヌクレオチドを含んでいません。いくつかの実施形態では、３番目のシーケンスは、配列番号のシーケンスを含みます。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８．
いくつかの実施形態では、３番目のシーケンスは、３番めのプロモーターに操作しやすくリンクされます。いくつかの実施形態では、３番目のプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１ａプロモーターまたは眼に特有のプロモーターです。いくつかの実施形態では、眼に特有のプロモーターは網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞特異的なプロモーターです。ＲＰＥの細胞特異的なプロモーターは含めるが、ＲＰＥ６５遺伝子プロモーター、ヒト網膜の結合蛋白質（ＣＲＡＬＢＰ）遺伝子プロモーター、ネズミ科の１１－ｃｉｓ－レチノール脱水素酵素（ＲＤＨ）遺伝子プロモーター、ロドプシン・プロモーター、ｒｈｏｄｏｐｏｓｉｎキナーゼ・プロモーター、コラーゲン分解酵素阻害３（Ｔｉｍｐ３）プロモーター、光受容体レチノール結合蛋白質プロモーターとガラス状の黄斑ジストロフィ２（卵黄様黄斑ジストロフィ２）プロモーター（光受容体間類網膜の結合蛋白質（ＩＲＢＰ）プロモーター）に限定的ではありません。
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、合図（ポリアデニル化合図（ポリ（１つの）））を結合して、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、エンハンサーを含み、これらに限定されずに、さらに他の調節配列を含みます、詰めるシーケンス、終端装置、タンパク質低下合図、内部リボソーム・エントリー要素（ＩＲＥＳ）、２Ａシーケンス。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）シーケンスは、ｈＧＨポリ（Ａ）、シミアンウイルス４０ポリ（Ａ）またはβ－グロビン・ポリ（Ａ）です。
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドはさらにエンハンサー領域を含みます。いくつかの実施形態では、エンハンサー領域はシミアンウイルス４０エンハンサー、サイトメガロウィルス・エンハンサー、ＩＲＢＰエンハンサー、免疫グロブリン遺伝子から誘導したエンハンサーを含みます。いくつかの実施形態では、エンハンサー領域は、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーターの上流に位置します。いくつかの実施形態では、エンハンサーは眼に特有のプロモーターの上流に位置します。いくつかの実施形態では、エンハンサー領域は、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫ、ＥＦ１ａプロモーターに下流に位置します。いくつかの実施形態では、エンハンサーは、眼に特有のプロモーターに下流に位置します。
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドはさらに逆方向末端反復シーケンス（ＩＴＲ）を含みます。幾つかの実施形態では、印字ヘッドは、少なくとも１つのノズルを含む。いくつかの実施形態では、デバイスは２つのモードを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の経路は同じである。一実施形態において、２つのペン先構成要素は互いから絶縁される。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶから誘導したＩＴＲです。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶから誘導しているかもしれません。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶから野性型ＩＴＲと比較して、ＩＴＲには １つ以上の塩基変異、挿入または欠失があります、しかし標的遺伝子複製、ウィルス・パッケージングおよび／または統合などの希望のターミナル反復配列作用を保持する。
幾つかの実施形態において、組成物は更に、１以上のフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーター・シーケンスの上流に位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーター・シーケンスに下流に位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは眼に特有のプロモーターの上流に位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、眼に特有のプロモーターに下流に位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、５’ＩＴＲシーケンスの５’終わりに位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、５’ＩＴＲシーケンスの３’終わりに位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、３’ＩＴＲシーケンスの５’終わりに位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、３’ＩＴＲシーケンスの３’終わりに位置します。
いくつかの実施形態では、充填材シーケンスの長さは約０．１ｋｂ－５ｋｂかもしれません、のような、しかし、０．１ｋｂに限定的でなかった、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、あるｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、ｋｂ（４．８）、または。（４．９）（５．０ｋｂ）
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドはさらにイントロンを含みます。ある場合には、イントロンが、転写されるかもしれないが翻訳されないあらゆるシーケンスを表すかもしれません。ある場合には、イントロンが、転写されるあらゆるシーケンスを表すかもしれないし、細胞の成熟したＲＮＡ転写物から取り除かれます。ある場合には、イントロンが約少なくともあるｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００年ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐまたは５０００ｂｐを含むかもしれません。ある場合には、イントロンが約３００ｂｐかもしれません。ある場合には、イントロンが約２００－４００ｂｐかもしれません。ある場合には、イントロンが約１００－５００ｂｐかもしれません。ある場合には、イントロンが約５０－２００
ｂｐかもしれません。ある場合には、イントロンが完全な自然発生のイントロンまたはキメラ的なイントロンのいずれかかもしれません。いくつかの実施形態では、イントロンは３番目のシーケンスの上流に位置します。いくつかの実施形態では、イントロンは、プロモーターに下流に位置します。幾つかの実施形態において、第１化合物は更に別の第１化合物を含む。いくつかの実施形態では、調整する要素はＴＰＬ（アデノウイルスから三者間のリーダー配列）とｅＭＬＰ（アデノウイルス・マヨール後期プロモーターからエンハンサーエレメント）シーケンスを含みます。いくつかの実施形態では、調整する要素は３番目のシーケンスの上流に位置します。幾つかの実施形態において、外部要素は機器の一部ではない。いくつかの実施形態において、第２のドメインはＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、コザック配列は３番目のシーケンスの上流に位置します。いくつかの実施形態では、コザック配列は、イントロンに下流に位置します。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドはヒト足場を付属の領域（ＳＡＲ）シーケンスを含みます。いくつかの実施形態では、ＳＡＲシーケンスは、３番目のシーケンスに下流に位置します。いくつかの実施形態では、ＳＡＲシーケンスはポリＡ信号の上流に位置します。
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、３００、２９０、２８０未満のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。２７０．１７２．２、１７１．５、１６９．６、１３８．５、１３７．６、１３０．１、１２９．７、１２８．３、１２７．１、１１７．５、１１４．６、９０．５、７１．７、７１．３、５８．４、５４．２、４７．０、４０．１、３３．２、３１．８、３１．４、３０．１、２９．３、２４．２、２１．４、１６．３．いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、５を超えるＣｐＧジヌクレオチド、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００を含みます。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは１００－３００、１００－２００、１００－１５０を含みます。１５０－２００、１５０－２５０の、１５０－３００、２００－２５０、２００－３００、または２５０－３００ ＣｐＧジヌクレオチド。
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、異なる治療のタンパク質をエンコードする４番めのシーケンスをさらに含みます。いくつかの実施形態では、異なる治療のタンパク質は、ＶＥＧＦ阻害剤、ＰＤＧＦ阻害剤、インテグリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ阻害剤またはＴＧＦβ阻害剤です。
いくつかの実施形態では、４番目のシーケンスと３番目のシーケンスはリンカーをエンコードするシーケンスによるリンクされます。幾つかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、２Ａペプチドのシーケンスを含みます。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、類Ａｐｈｔｈｏｒａ（例えば口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、馬鼻炎Ａウィルス（ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウィルス（ＴａＶ）またはブタのｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ－ある）の２Ａペプチド）またはカルジオウイルスから誘導した２Ａペプチドから選択されるかもしれません。
組換えＡＡＶウイルス粒子
別の態様では、本の開示は、細胞へ組成物または本の開示のポリヌクレオチドを導入することにより調製された組み換えのアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を提供します。いくつかの実施形態では、細胞は昆虫細胞または哺乳動物細胞です。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞です、それについてＨＥＫ２９３細胞または派生的な細胞です。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞である。
いくつかの実施形態では、本の開示の組成物は当技術における既知のあらゆる方法による細胞へ送達することができます。いくつかの実施形態では、方法は含むが、エレクトロポレーションに限定的ではありません、リン酸カルシウム沈澱反応、およびリポソーム調停しました。幾つかの実施形態において、組成物は、目への注入のために製剤される。幾つかの実施形態において、組成物は、目への注入のために製剤される。いくつかの実施形態では、細胞はｒＡＡＶウイルス粒子を生むために用いられます。
ｒＡＡＶウイルス粒子は、当業者に知られていた方法による細胞から分離し精製することができます。例えば、ｒＡＡＶは、遠心分離、ＨＰＬＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーおよび／または他の浄化技術をウイルス粒子のために用いて精製することができます。
別の態様では、本の開示は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドのうちのいかなるものでも含むｒＡＡＶ粒子を提供します。
ポリヌクレオチド
別の態様では、本の開示は、ＶＥＧＦ阻害剤をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供します。ＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦタンパク質の活動または発現の抑制によりＶＥＧＦタンパク質の生物学的な作用を阻害することができるあらゆるポリペプチドまたはタンパク質かもしれません。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤はそれについて抗ＶＥＧＦ抗体または抗原結合フラグメントです。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは含みます、しかし制限されない、Ｆａｂ、驚くべき。」Ｆ（ａｂ」）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）破片、単一の鎖の抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体と二重特異性抗体。いくつかの実施形態では、抗ＶＥＧＦ阻害剤はｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、ベバシズマブまたはａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔから選択されます。
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：あるまたは配列番号に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同を持っているシーケンス：１．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：１．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：２または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、配列番号への９９％の相同があるシーケンス：２．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：２．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：３または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、配列番号への９９％の相同があるシーケンス：３．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：３．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号のシーケンスを含みます：４または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、配列番号への９９％の相同があるシーケンス：４．いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、配列番号に相同性の少なくとも９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％があるシーケンスを含みます：４．いくつかの実施形態における、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は、配列番号よりＣｐＧジヌクレオチドの変更された数を含みます：１３．いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は配列番号より少ないＣｐＧジヌクレオチドを含みます：１３．いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は配列番号より多くのＣｐＧジヌクレオチドを含みます：１３．いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５つのＣｐＧジヌクレオチド未満を含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０のＣｐＧジヌクレオチド以上を含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は０－８０のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は５－７５のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は１０－７０のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は１５－６５のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は２０－６０のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は２５－５５のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は３０－５０のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は３５－４５のＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列は６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４の、３３、３２、３１、３０ ＣｐＧジヌクレオチドを含みます。いくつかの実施形態では、コドンに最適化された核酸配列はＣｐＧジヌクレオチドを含んでいません。いくつかの実施形態では、３番目のシーケンスは、配列番号のシーケンスを含みます。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８．
幾つかの実施形態において、コーティングは更にポリマーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１ａプロモーターまたは眼の特有のプロモーターです。いくつかの実施形態では、眼に特有のプロモーターは、ＲＰＥ ６５遺伝子プロモーター、ヒト網膜の結合蛋白質遺伝子プロモーター、ネズミ科の１１－ｃｉｓレチノイド・アルコール脱水素酵素遺伝子プロモーター、ロドプシン・プロモーター、ｒｈｏｄｏｐｏｓｉｎキナーゼ・プロモーター、コラーゲン分解酵素阻害３プロモーター、光受容体レチノール結合蛋白質プロモーター、卵黄様黄斑ジストロフィ２プロモーターと光受容体間類網膜の結合蛋白質プロモーターから構成される群から選択されます。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、シーケンス、終端装置、タンパク質低下信号、内部リボソーム・エントリー要素（ＩＲＥＳ）、２Ａシーケンスを詰めて、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、エンハンサー、スプライシング信号、ポリアデニル化信号（ポリＡ）を含み、これらに限定されずに、さらに他の調節配列を含みます。いくつかの実施形態では、ポリＡシーケンスは、ｈＧＨポリ（Ａ）、シミアンウイルス４０ポリ（Ａ）またはβ－グロビン・ポリ（Ａ）です。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはさらにエンハンサー領域を含みます。いくつかの実施形態では、エンハンサー領域はシミアンウイルス４０エンハンサー、サイトメガロウィルス・エンハンサー、ＩＲＢＰエンハンサー、免疫グロブリン遺伝子から誘導したエンハンサーを含みます。いくつかの実施形態では、エンハンサー領域は、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーターの上流に位置します。いくつかの実施形態では、エンハンサーは眼に特有のプロモーターの上流に位置します。いくつかの実施形態では、エンハンサー領域は、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫ、ＥＦ１ａプロモーターに下流に位置します。いくつかの実施形態では、エンハンサーは、眼に特有のプロモーターに下流に位置します。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはさらに逆方向末端反復シーケンス（ＩＴＲ）を含みます。幾つかの実施形態では、印字ヘッドは、少なくとも１つのノズルを含む。いくつかの実施形態では、デバイスは２つのモードを含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の経路は同じである。一実施形態において、２つのペン先構成要素は互いから絶縁される。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはＡＡＶから誘導したＩＴＲです。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶから誘導しているかもしれません。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２（ＡＡＶ３）（ＡＡＶ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－Ｒｈ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、ＡＡＶ－２ｉ８と他の既知のＡＡＶから野性型ＩＴＲと比較して、ＩＴＲには １つ以上の塩基変異、挿入または欠失があります、しかし標的遺伝子複製、ウィルス・パッケージングおよび／または統合などの希望のターミナル反復配列作用を保持する。
幾つかの実施形態において、組成物は更に、１以上のＥＡＣ保護剤を含む。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーター・シーケンスの上流に位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＭＮＤＵ３、ＰＧＫまたはＥＦ１ａプロモーター・シーケンスに下流に位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは眼に特有のプロモーターの上流に位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、眼に特有のプロモーターに下流に位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、５’ＩＴＲシーケンスの５’終わりに位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、５’ＩＴＲシーケンスの３’終わりに位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、３’ＩＴＲシーケンスの５’終わりに位置します。いくつかの実施形態では、充填材シーケンスは、３’ＩＴＲシーケンスの３’終わりに位置します。
いくつかの実施形態では、充填材シーケンスの長さは約０．１ｋｂ－５ｋｂかもしれません、のような、しかし、０．１ｋｂに限定的でなかった、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、あるｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ ｋｂ、１．６ ｋｂ、１．７ ｋｂ、１．８ ｋｂ、１．９ ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ ｋｂ、３．３ ｋｂ、３．４ ｋｂ、３．５ ｋｂ、３．６ ｋｂ、３．７ ｋｂ、３．８ ｋｂ、３．９ ｋｂ、４．０ ｋｂ、４．１ ｋｂ、４．２ ｋｂ、４．３ ｋｂ、４．４ ｋｂ、４．５ ｋｂ、４．６ ｋｂ、４．７ ｋｂ、ｋｂ（４．８）、または、または。（４．９）（５．０ ｋｂ）
幾つかの実施形態において、コーティングは更にポリマーを含む。ある場合には、イントロンが、転写されるかもしれないが翻訳されないあらゆるシーケンスを表すかもしれません。ある場合には、イントロンが、転写されるあらゆるシーケンスを表すかもしれないし、細胞の成熟したＲＮＡ転写物から取り除かれます。ある場合には、イントロンが約少なくともあるｂｐ、５０ ｂｐ、１００ ｂｐ、１５０ ｂｐ、２００ ｂｐ、３００ ｂｐ、４００ ｂｐ、５００ ｂｐ、６００ ｂｐ、７００ ｂｐ、８００ ｂｐ、９００ ｂｐ、１０００ ｂｐ、２０００年ｂｐ、３０００ ｂｐ、４０００ ｂｐまたは５０００ ｂｐを含むかもしれません。ある場合には、イントロンが約３００ ｂｐかもしれません。ある場合には、イントロンが約２００－４００ ｂｐかもしれません。ある場合には、イントロンが約１００－５００ ｂｐかもしれません。ある場合には、イントロンが約５０－２００ ｂｐかもしれません。ある場合には、イントロンが完全な自然発生のイントロンまたはキメラ的なイントロンのいずれかかもしれません。いくつかの実施形態では、イントロンはコドンに最適化された核酸配列の上流に位置します。いくつかの実施形態では、イントロンは、プロモーターに下流に位置します。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルはさらに造影剤を含む。いくつかの実施形態では、調整する要素はＴＰＬ（アデノウイルスから三者間のリーダー配列）とｅＭＬＰ（アデノウイルス・マヨール後期プロモーターからエンハンサーエレメント）シーケンスを含みます。いくつかの実施形態では、調整する要素はコドンに最適化された核酸配列の上流に位置します。幾つかの実施形態において、外部要素は機器の一部ではない。幾つかの実施形態では、組成物はリポソームを含む。いくつかの実施形態では、コザック配列はコドンに最適化された核酸配列の上流に位置します。いくつかの実施形態では、コザック配列は、イントロンに下流に位置します。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはヒト足場を付属の領域（ＳＡＲ）シーケンスを含みます。いくつかの実施形態では、ＳＡＲシーケンスは、コドンに最適化された核酸配列に下流に位置します。いくつかの実施形態では、ＳＡＲシーケンスはポリＡ信号の上流に位置します。
システム
別の態様では、本の開示は、本明細書に開示されたｒＡＡＶ粒子を含むその必要性のある対象、薬学的に許容可能な担体または賦形剤の眼疾患を処置するためにシステムを提供します。
本明細書で使用されるように、「薬学的にまたは治療的に許容可能な担体」とは、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、宿主または患者に毒性ではない担体媒体を指す。医薬製剤における用いられる担体の型は、治療の化合物の投与のどの方法が用いられるかに左右されるでしょう。様々な投与経路のために医薬組成物を調製する多くの方法が当該技術分野で周知である。「薬学的に許容可能な眼の担体」は、眼に、の上でまたはの近くで本明細書に直接にまたは間接的に発表されるようなｒＡＡＶウィルス粒子を送達するために用いることができる、薬学的に許容可能な担体または賦形剤を表します。
いくつかの実施形態では、システムは、適切な溶媒における本明細書に開示されたｒＡＡＶウィルス粒子を溶かすことにより調製されています。適切な溶媒は含むが、給水するために限定的ではありません、食塩水（例えばＮａＣｌ）、緩衝液または他の溶媒。特定の実施形態において、溶媒はＴＨＦである。
システムの調製における用いられる懸濁の水溶液と希釈剤は、蒸留水または生理的塩類を含むかもしれません。様々な添加物は含むことができます。これらの添加物は接触または過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギーを伴わない眼のまわりの使用のために適している追加の成分、添加物または担体を含むかもしれません。典型的な添加物は溶媒、塩基、共同溶媒、懸濁化剤、シックナー、乳化剤、スタビライザー、緩衝剤、等張性アジャスター、ｐＨアジャスター、キレート剤、無痛化剤、保存剤、香料、香料、着色剤、賦形剤、結合剤、潤滑剤、界面活性剤、吸収促進剤、分散剤、保存剤と可溶化剤を含みます。
例えば、緩衝剤は、ｐＨを一定に保つために加えられ、ホウ酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酒石酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸緩衝液、またはトリス－ＨＣｌ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとＨＣｌを含む）などの薬学的に許容可能な緩衝剤を含むことができる。
緩衝剤に加えて、裂け目に等張の調製を調製するために、等張の作用薬はシステムに付加かもしれません。等張化剤としては、限定されないが、デキストロース、グルコース、スクロース、およびフルクトースなどの糖；マンニトールとソルビトールなどの糖アルコール；グリセリン、ポリエチレングリコールとプロピレングリコールなどのポリオール；ならびに、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化エフェドリン（ｐｈｅｄｒｉｎｅ）、塩化カリウム、塩化プロカイン、クロラムフェニコール、およびコハク酸ナトリウムなどの塩が挙げられる。等張の作用薬は、目薬の浸透圧が裂け目の浸透圧に等しい量における付加です。
上記のものに加えて、いくつかの実施形態では、限定されないが以下を含む追加薬剤を使用することが望ましい：亜硫酸ナトリウム、安定化剤、炭酸ナトリウム、およびプロピレングリコールなどの安定化剤；アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、トコフェロール、チオ硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；および／または、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ビス－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－四酢酸、およびクエン酸ナトリウムなどのキレート剤。
本明細書に開示されたシステムは、無菌の手順による調製することができるか、または調製の適切な病期で代わりに殺菌することができます。例えば、システムは無菌的に無菌の成分を混合することにより調製することができます。代替的に、滅菌医薬組成物は、最初に材料を混合し、次いで最終的な調製物を滅菌することにより調製され得る。滅菌方法は、限定されないが、加熱滅菌、照射、及び濾過を含む。
本明細書に開示されたｒＡＡＶウイルス粒子も、他の治療剤と結合して提供することができます。様々な実施形態では、本明細書に開示された化合物も、目の治療剤と結合して提供されるかもしれません、Ａｃｕｌａｒ（ケトプロフェン・トロメタミン点眼剤）から０．５％構成される群とＡｃｕｖａｉｌ（ｋｅｔｏｒｏｌａｃトロメタミン）、ＡＫコンカナバリンＡ（ナファゾリン目薬）、Ａｋｔｅｎ（塩酸リドカイン）、Ａｌａｍａｓｔ、Ａｌｐｈａｇａｎ（ｂｒｏｍｉｄｉｎｅ）、Ａｌｒｅｘ、Ａｓｔｅｐｒｏ（塩酸）アゼラスチン鼻内噴霧、ＡｚａＳｉｔｅ（アジスロマイシン）、Ｂｅｐｒｅｖｅ（ベシル酸ベポタスチン点眼剤）から選択した、Ｂｅｓｉｖａｎｃｅ（ｂｅｓｉｆｌｏｘａｃｉｎ眼科用懸濁液剤）、Ｂｅｔａｘｏｎ、ＢＳＳの無菌の洗浄解決、Ｃｏｓｏｐｔ、Ｄｕｒｅｚｏｌ（ジフルプレドナート）、Ｅｙｌｅａ（Ａｂｅｒｃｅｐｔ）、Ｌｏｔｅｍａｘ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、Ｌｕｍｉｇａｎ（ｂｉｍａｔｏｐｒｏｓｔ点眼剤）、Ｍａｃｕｇｅｎ（ｐｉｇａｔｉｎｉｂ）、Ｏｃｕｆｌｏｘ（ｏｘｙｆｌｕｒａｎｅ）Ｓａｘｉｎｅ点眼剤０．３％、ＯｃｕＨｉｓｔ、Ｏｚｕｒｄｅｘ（デキサメサゾン）、Ｑｕｉｘｉｎ（レボフロキサシン）、レスキュラ（ｕｎｏｐｒｏｓｔｏｎｅイソプロピル点眼剤）０．１５％、Ｒｅｓｔａｓｉｓ（シクロスポリンの眼のエマルジョン）、Ｓａｌａｇｅｎタブレット、Ｔｒａｖａｔａｎ（ｔｒａｖｏｐｒｏｓｔ点眼剤）、Ｖａｌｃｙｔｅ（ｖａｌｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ塩酸塩）、トリフルオロサイミジン（Ｖｉｒｏｐｔｉｃ）、Ｖｉｓｔｉｄｅ（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）、ビスダイン（注入のｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、Ｖｉｔｒａｓｅｒｔ植込剤、ｆｏｒｍａｍｉｖｉｒ注入、ＺＡＤＩＴＯＲ、Ｚｉｏｐｔａｎ（ｔａｆｌｕｐｒｏｓｔ点眼剤）、Ｚｉｒｇａｎ（ガンシクロビルの眼のゲル）、Ｚｙｍａｘｉｄ（ｇａｔｉｆｌｏｘａｃｉｎ点眼剤）、アトロピン、フルルビプロフェン、Ｐｈｙｓｏｓｔｉｍｉｎｅ、Ａｚｏｐｔ、ゲンタミシン、プロパラカイン、バシトラシン、Ｈｙｐｒｏｍｅｌｌｏｓｅ点眼薬（Ｇｏｎｉｏｓｏｌ）、ポリミキシンＢ．ポビドンヨード（ベータダイン）、グラミシジン、プレドニゾロン、ｂｅｔａｘｏｌｏｌ、Ｈｕｍｏｒｓｏｌ、ｐｒｏｍｅｔｈａｉｎｅ、ｂｅｔａｘｏｌｏｌ目薬（ベトプティック）、Ｈｙｌａｒｔｉｎ、贈り物、ｂｒｉｎｚｏｌａｍｉｄｅ、高張性のＮａＣｌ、Ｐｕｒａｌｕｂｅ、ＢＳＳ、Ｉｎｄｏｃｙｃａｎｉｎｅグリーン、ローズベンガル、カルバコール、イトラコナゾール、ヒアルロン酸ナトリウム、セファゾリン、ラタノプロスト、Ｓｕｌｏｆｅｎ、Ｘｉａｏ Ｃｅｌｌｕｖｉｓｃ、マンニトール、オキシテトラサイクリン、クロラムフェニコール、メタゾルアミド、眼球内血圧液圧減退剤、Ｃｉｌｏｘａｎ、ミコナゾール、トブラマイシン、シプロフロキサシン、Ｍｉｏｓｔａｔ、トリアムシノロン、Ｃｏｓｏｐｔ、Ｍｕｒｏ １２８、ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ、デメカリウム、ネオマイシン、ｔｏｐｉｒａｍａｔｅ、デキストラン・デキサメサゾン、ネプタザン、トルソプト、Ｄｉｐｉｃｏｌｉｎ、Ｏｃｕｆｌｏｘ、（アデノシン）アラビノシッド。オフロキサシン、ビラ－Ａ、エピネフリン、オキシテトラサイクリン、トリフルオロサイミジン、蛍光フェニレフリンとキサラタン）
典型的な薬物は、血液造成阻害剤、ａｎｅｃｏｔａｓｔａｔ、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦレセプタ・チロシンキナーゼ阻害剤などの抗血管原性の作用薬を含むかもしれません；ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、ベバシズマブ、ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ、ｓｕｎｉｔｉｎｉｂとｓｏｒａｆｅｎｉｂなどの抗血管内皮細胞増殖因子（抗ＶＥＧＦ）薬物と血管形成の他の既知の小さな分子と転写阻害剤；アドレナリン作動性拮抗薬（例えばａｃｅｔｂｕｔｏｌｏｌ、アテノロール、ｂｉｓｏｐｒｏｌｏｌ、カルベジロール、ａｓｍｏｌｏｌ、ラベタロール、ナドロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ｍｅｔｉｐｒａｎｏｌｏｌ、ｂｅｔａｘｏｌｏｌ、カルテオロール、ｌｅｖｏｂｅｔａｘｏｌｏｌ、ｌｅｖｏｂｕｎｏｌｏｌと眼球内血圧液圧減退剤などのβ－遮断薬；）などの緑内障作用薬を含む点眼薬エピネフリン、ｄｉｐｉｖｅｆｒｉｎ、クロニジン、ａｐａｒｃｌｏｎｉｄｉｎｅとｂｒｉｍｏｎｉｄｉｎｅなどのアドレナリン作用のアゴニストまたは交感神経興奮剤；ピロカルピン、カルバコール、ホスホリン・ヨウ素、フィゾスチグミン、サリチル酸、塩化アセチルコリン、エゼリン、ジイソプロピルフルオロホスファート、臭化デメカリウムなどの副交感神経興奮薬またはコリン作用性リセプタのアゴニスト；ムスカリン；ａｃｅｔｏｚｏｌａｍｉｄｅ、ｂｒｉｎｚｏｌａｍｉｄｅ、ｄｏｒｚｏｌａｍｉｄｅ、メタゾルアミド、ｅｔｈｏｘｚｏｌａｍｉｄｅ、ダイアモックスとジクロルフェナミドなどの地方の作用薬および／または全身の作用薬を含む炭酸脱水酵素阻害薬作用薬（）アトロピン、シクロペントレート、サクシニルコリン、ホマトロピン、フェニレフリン、スコポラミンとトロピカミドなどの瞳孔拡大の毛様体筋麻痺の作用薬；プロスタグランジンＦ２α、抗プロスタグランジン、プロスタグランジン前駆体などのプロスタグランジン；またはｂｉｍａｔｏｐｒｏｓｔ、ラタノプロスト、ｔｒａｖｏｐｒｏｓｔとｕｎｏｐｒｏｓｔｏｎｅなどのプロスタグランジン・アナログ作用薬。
追加の典型的な薬物は、また例えば、グルココルチコイドと、ベタメタゾン、コルチゾン、デキサメサゾン、デキサメサゾン２１のリン酸塩、メチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイドを含む抗炎症薬を含むかもしれません。（プレドニゾロン２１のリン酸塩、酢酸プレドニゾロン、プレドニゾロン、ｆｌｕｍｉｒｏｎ、ｌｏｔｅｐｒｅｄｎｏｌ、メチルプレドニゾロン）（フルオシノロン、トリアムシノロン、トリアムシノロン、トリアムシノロン酢酸塩、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルメタゾン、ｆｌｕｔｉｃａｓｏｎｅ、フルドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ｌｏｔｅｐｒｅｄｎｏｌ、ｒｉｍｅｔｈｏｌｏｎｅ）非ステロイド系抗炎症薬、含んでいること、アスピリン、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ｂｒｏｍｆｅｎａｃ、ｎｅｐａｆｅｎａｃ、ケトプロフェン、サリチラート、インドメタシン、ｎａｘｏｐｒｅｎ、ピロキシカム、ナブメトン・ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、塩素酸塩、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、オキサプロジン、ピロキシカム、ｄｉｓａｌｉｃｙｌａｔｅ、スリンダクおよびトルメチン；ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ、ロフェコキシブとｖａｌｄｅｃｏｘｉｂなどのＣＯＸ－２インヒビター；抗生物質（例えばテトラサイクリン、クロールテトラサイクリン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシン、ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｉｎ、セファレキシン、オキシテトラサイクリン、クロラムフェニコール）、リファンピシン、シプロフロキサシン、トブラマイシン、ゲンタミシン、エリスロマイシン、ペニシリン、スルホンアミド、スルファダイアジン、スルファセタミド、スルファメトキサゾール、スルフイソキサゾール、ニトロフラゾン、プロピオン酸ナトリウム、ゲンタミシンなどのアミノグリコシド、トブラマイシン、アミカシンとストレプトマイシンなどの抗感染症または抗微生物薬；シプロフロキサシン、ｇａｔｉｆｌｏｘａｃｉｎ、レボフロキサシン、ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ、ノルフロキサシン、オフロキサシンなどのフルオロキノロン；バシトラシン、エリスロマイシン、フシジン酸、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、グラミシジン、アルファｏｘｙｂｅｎｚｉｄｉｎｅとｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｍｉｄｅ；アムホテリシンＢ、ｃａｓｐｏｆｕｎｇｉｎ、クロトリマゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ｖｏｒｉｃｏｎａｚｏｌｅ、テルビナフィン、ナイスタチンとミコナゾールなどの抗真菌物質；クロロキン、ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ、メフロキン、プリマキン、キニジンとキニーネなどの抗マラリア剤；エタンブトール、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピンとＲｉｆａｂｕｔｉｎなどの抗ミコバクテリウムの作用薬；アルベンダゾール、メベンダゾール、ｔｈｉｏｂｅｎｄａｚｏｌｅ、ｂｉｓａｚｏｌａｔｅ坐薬、ｔｈｉｕｒａｃｉｌ、ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ、ｉｏｄｏｑｕｉｎａｏｌ、イベルメクチン、パロモマイシン、プラジカンテルとｔｒｉｍａｔｒｅｘａｔｅなどの駆虫剤。
方法
別の態様では、本の開示は、細胞または細胞または対象の組織へ組成物、ｒＡＡＶ粒子、ポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されたシステムのうちのいかなるものでも投与することを含む対象の組織のＶＥＧＦ阻害剤を示す方法を提供します。いくつかの実施形態では、組成物、ｒＡＡＶ粒子、ポリヌクレオチドまたはシステムは当技術における既知のあらゆる適切な方法による対象に投与されるかもしれません。いくつかの実施形態では、細胞または組織は関連する眼です。いくつかの実施形態では、組成物、ｒＡＡＶ粒子、ポリヌクレオチドまたはシステムは結膜下か、眼球後か、ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒ、網膜下か、ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌか、眼内の経路による眼に適用することができます。
別のａｐｓｅｃｔにおける、本の開示は、処置する目の疾患の方法を提供する、治療上有効な量の組成物、ｒＡＡＶ粒子、ポリヌクレオチドまたは必要性への対象に本明細書に発表されたシステムを投与することを含みます。
いくつかの実施形態では、システムは当技術における既知のあらゆる適切な方法による対象に投与されるかもしれません。いくつかの実施形態では、システムは結膜下か、眼球後か、ｐｅｒｉｏｃｕｌａｒ、網膜下か、ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌか、眼内の経路による眼に適用することができます。
いくつかの実施形態では、目の疾患は含みます、しかし制限されない、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、網膜新生血管、脈絡膜の新血管新生、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞症、枝分かれさせられた網膜静脈閉塞、糖尿病の黄斑の浮腫、糖尿病の網膜虚血、虚血の網膜症、および糖尿病の網膜浮腫。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウィルス粒子を含むシステムは、医学的に毒性の合格水準で希望の生物学的作用を達成する、治療上有効な量における提供されます。組成物の量は、投与経路とその病気の重症度に依存して変動することもある。投与量は処置される各患者の体重、年齢、性別、および／または症状の程度に依存して調節されてもよい。患者の年齢と重量と、処置される条件の厳しさに応じて量のルーチン変化が作られる必要があるかもしれないことが理解されます。
いくつかの実施形態では、治療上有効な量が、１×１０５ － １×１０１３ ｒＡＡＶウイルス粒子に一般に関係しています。いくつかの実施形態では、治療上有効な量が、１×１０６ － １×１０１２ ｒＡＡＶウイルス粒子に一般に関係しています。いくつかの実施形態では、治療上有効な量が、１×１０７ － １×１０１２ ｒＡＡＶウイルス粒子に一般に関係しています。いくつかの実施形態では、治療上有効な量が、１×１０８ － １×１０１２ ｒＡＡＶウイルス粒子に一般に関係しています。いくつかの実施形態では、治療上有効な量が、１×１０９ － １×１０１２ ｒＡＡＶウイルス粒子に一般に関係しています。いくつかの実施形態では、治療上有効な量が、１×１０１０－１×１０１２ ｒＡＡＶウイルス粒子に一般に関係しています。
いくつかの実施形態では、送達された体積は １つの眼当たり約０．００５のｍＬ－０．５ ｍＬです。いくつかの実施形態では、送達された体積は １つの眼当たり約０．０５のｍＬ－０．５ｍＬです。いくつかの実施形態では、送達された体積は １つの眼当たり約０．１のｍＬ－０．５ｍＬです。いくつかの実施形態では、送達された体積は １つの眼当たり約０．２のｍＬ－０．５ｍＬです。
いくつかの実施形態では、投与の度数は、少なくとも一度１日当たり２、３、４、または５倍を含む１日かもしれません。代替的に、処置レジメンは、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、１００日、１５０日、２００日、２５０日、３００日、４００日、５００日、７５０日、１０００日、または１０００日以上にわたって続くことがある。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子またはポリヌクレオチドの投与はまた生体外の投与を含むことができます。いくつかの実施形態では、生体外の投与は、対象へ（１）対象から興味のある細胞または組織の隔離、十分なレベルの遺伝子移入と不適当な悪影響を伴わない発現を提供する細胞または組織をトランスフェクトするために（２）細胞または組織を十分な量におけるｒＡＡＶｓに接触させること（３）移る細胞、または組織を後ろに含みます。いくつかの実施形態では、細胞または組織は培養されているかもしれません、数日の間生体外、の前に、および／またはトランスフェクションの後に。いくつかの実施形態では、細胞または組織は関連する眼です。
別のａｐｓｅｃｔでは、本の開示は、組成物、ｒＡＡＶ粒子、ポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されたシステムのうちのどれもを有する細胞をトランスフェクトすることを含む組み換えのアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を調製する方法を提供します。幾つかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は分裂細胞である。幾つかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は分裂細胞である。いくつかの実施形態では、方法はｂａｃｍｉｄ ＤＮＡおよび／またはバキュロウィルスを生成することを含みます。いくつかの実施形態では、方法はＶＥＧＦ阻害剤発現シーケンス（本明細書に開示されたポリヌクレオチドのような）を含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを生成することを含みます。いくつかの実施形態では、方法はｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ ｒＡＡＶキャップ・レプ発現シーケンスを生成することを含みます。いくつかの実施形態では、方法は、バキュロウィルスを生成するためにｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを有する細胞をトランスフェクトすることを含みます。いくつかの実施形態では、方法はバキュロウィルスを生成するためにＶＥＧＦ阻害剤発現シーケンスを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを有する細胞をトランスフェクトすることを含みます。いくつかの実施形態では、方法は、ｒＡＡＶキャップ・レプ発現シーケンスを含むバキュロウィルスを生成するためにｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを有する細胞をトランスフェクトすることを含みます。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示された、パッケージにされたｒＡＡＶ／ＶＥＧＦ阻害剤ウイルス粒子を得るために細胞（Ｓｆ９細胞のような）を感染させるためにバキュロウィルスを混合することをさらに含みます。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示された組成物または本明細書に開示されたポリヌクレオチドは、当技術における既知のあらゆる方法による細胞へ送達することができます。いくつかの実施形態では、方法は含むが、エレクトロポレーションに限定的ではありません、リン酸カルシウム沈澱反応、およびリポソーム調停しました。いくつかの実施形態では、組成物またはポリヌクレオチドは、細胞へ安定してトランスフェクトされます。いくつかの実施形態では、組成物またはポリヌクレオチドは、細胞へ一時的にトランスフェクトされます。リポソーム、ナノカプセル剤、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞等などの伝達手段は、ベクター、組成物または細胞へポリヌクレオチドの導入のために用いられてもよい。特に、ベクター、組成物またはポリヌクレオチドは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ球体またはナノ粒子におけるカプセルに入れられた送達のための処方されるかもしれません。キット
他方では、本の開示は眼疾患を処置するためにキットを提供します。それはｒＡＡＶ粒子または本明細書に開示されたシステムと指示を含みます。いくつかの実施形態では、指示は目の疾患を処置するためにｒＡＡＶ粒子またはシステムを投与する方法を示すために用いられます。
幾つかの実施形態において、コーティングは更にポリマーを含む。いくつかの実施形態では、包装容器は本明細書に記載されたシステムを送達するように構成されます。いくつかの実施形態では、包装容器はバイアル、滴瓶、ボトル、チューブと注射器を含みます。特定の実施形態において、容器は、点眼剤を投与するための滴瓶である。特定の実施形態において、容器は、点眼剤を投与するための滴瓶である。
本発明の幾つかの実施形態は、制限されるものとして解釈されるべきでない、以下の実施例により更に例示される。当業者は、実施形態のインプリメンテーションの中でうまくいくために、発明者が見つけた技術が本明細書に記述し従って、これらの実施形態をインプリメントするために用いられるものを構成すると考えることができる、と次の実施例において開示された技術が相当すると理解するでしょう。しかしながら、本の開示に基づいて、当業者は、本の発明の趣旨と範囲から外れずに、本明細書に開示された、特有の実施形態と同様なにおける多くの変化を行なうことができるか同様の結果を今までどおり得ることができる、と理解するでしょう。
次の実施例はさらに発明を説明します。これらの実施例は、単に本の発明を説明するように意図され、本の発明の制限として解釈されるべきではありません。
実施例１ 組み換えのＡＡＶベクターの設計
それらの対応するプロモーターと共にＡＡＶ２から誘導したキャップおよびレプの暗号配列は、ｐＵＣ５７（ｐＦａｓｔＢａｃ１）へ合成されクローンを作られたか、またはｐＵＣ５７を修飾したか、キャップおよびレプのタンパク質の暗号配列を含む最初のポリヌクレオチドを得るためにｐＦａｓｔＢａｃ１を修飾しました。
緑の蛍光性のタンパク質（ＧＦＰ）をエンコードするヌクレオチド配列またはＶＥＧＦ阻害剤ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔをエンコードする核酸配列は、ｐＵＣ５７（ｐＦａｓｔＢａｃ１）へ合成されクローンを作られたか、またはそれぞれ、ｐＵＣ５７を修飾したか、ＧＦＰまたはＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの暗号配列を含んでいる別のポリヌクレオチドを得るためにそれらの対応するプロモーターを有するｐＦａｓｔＢａｃ１を修飾しました。第２のポリヌクレオチドのｃｏｎｔｒｕｃｔの設計は表２の中で見つけることができます。
「ｃｏ」は、「最適化されたコドン」を表します。例えば、「ｃｏ１」はコドンに最適化されたシーケンス＃１を表します。「ＣＭＶｅｐ」はＣＭＶエンハンサーとプロモーターを表します。「ｓｖ４０ｉ」はシミアンウイルス４０イントロンを表します。
実施例２ プラスミド・トランスフェクション
発現激しさを測定するために、設計された、構築する、２個の×１０５ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が接種されました、１つの、２４－よく、プレート、および培養した、夜通し。各発現の０．５μｇがプラスミドを構築します、１．５のμＬ Ｍｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮ（ｒ）トランスフェクション試薬に混合された、につき、５０のμＬ Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍ媒体（ＤＮＡ： Ｍｉｒｕｓ試薬（ｕｌ）＝ １：３（ｕｇ））におけるよく。４８時間の後、ＧＦＰの発現は、細胞が発現カセットを有する成功裡にトランスフェクトされたことを示唆して、螢光顕微鏡とフロー血球計（図１Ａと１Ｂ）による検出されました。表面に浮かぶ培地は４８時間後にａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ検知のための収穫されました。
実施例３ 組み換えＡＡＶウイルス粒子の調製
実施例あるにおいて得られた最初のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドは組成物と助手プラスミドと組成物を形成するために混合されました、パッケージにされたｒＡＡＶ２．７ｍ８／Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔウイルス粒子とｒＡＡＶ２．７ｍ８／ＧＦＰウイルス粒子を得るＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトするために用いられました。ＡＡＶ技術へのｂａｃによるＡＡＶ粒子を生成することができるかもしれません、つまり、最初に２つのｂａｃｍｉｄｓの含んでいるレプ・キャップとトランスジーン発現カセットをそれぞれ生成し、次に、これらの２ ｂａｃｍｉｄｓのバキュロウィルスを生成する、Ｓｆ９細胞のレプ・キャップとトランスジーン発現バキュロウィルスの両方を感染させることにより、ｒＡＡＶを生成することができるかもしれません。組み換えのＡＡＶ２．７ｍ８／Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔウイルス粒子とＡＡＶ２．７ｍ８／ＧＦＰウイルス粒子は、勾配超遠心分離を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から分離され精製されました。
実施例４ トランスフェクトされた細胞からＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの発現レベル
細胞培養上澄液へのＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの発現レベルは定量的ＥＬＩＳＡによる測定されました。ＥＬＩＳＡプレートは１００を有するコートされました、ｕＬ／緩衝剤のコートにおいてあるｕｇ／ｍＬの濃縮で組み換えのヒトＶＥＧＦＡ（ｒｈＶＥＧＦＡ）によく、および４°Ｃで夜通し培養しました。洗濯緩衝剤を有する洗った後に、プレートは３００を有するブロックされました、ｕＬ／タンパク質なしのブロッキング緩衝剤によく。後で、プレートは洗浄されました。そして、試料は１：１０００希釈で付加で（１００ ｕＬ／ウェル）、室温で２時間で培養されました。その後、プレートは再び洗浄されました、および１００、ｕＬ／よく、ＩｇＧ（Ｆｃγ）の抗ヒトＦｃ領域に、ＰＢＳの中でＢＳＡにおける５００ｎｇ／ｍＬでホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にある％変化する－特異抗体は、ウェルに付加でした。洗浄の後に、１００、ｕＬ／よく、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡピコに、化学発光の基質はウェルに付加でした。そして、ルミネセンス信号はマイクロプレート・リーダを用いて測定されました。 結果を表８に示す。
生化学的アッセイＩＣ５０データは以下の範囲内に指定される：Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ濃縮（ｎｇ／ｍｌ）：〉１５，０００〉 Ｂ〉１０，０００〉 Ｃ〉１０００〉 Ｄ
実施例５ ｒＡＡＶからＡｌｉｂｅｒｃｅｐｔの活性レベル
ＨＵＶＥＣ増殖反応測定法は２９３Ｔ細胞のｒＡＡＶ形質導入の後に示されたａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの活動レベルを測定するために利用されました。特に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）懸濁が投薬された１００μｌ、基本培地（約５０００、細胞／よく）における、１つの、９６－よく、プレート。９６ウェルのプレートを、４８時間インキュベートした。表面に浮かぶ試料の１００ｘ希釈、ある時間基本培地におけるＶＥＧＦ（８０ｎｇ／ｍＬ）を有する調製され、かえされた。希釈の１００μｌがＨＵＶＥＣへ付加でした。プレートは４日間培養されました。細胞計測キット－８（ＣＣＫ－８）解決の２０μｌが、プレートに各々によく付加でした。プレートを暗所で４時間インキュベートした。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
ＨＵＶＥＣの上のａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの抑制する活動は次の方程式に基づいてｃａｃｕｌａｔｅｄされました：阻害％ ＝／＊（ＯＤ（ＧＦＰ抑制）－ ＯＤ（ブランク））（ＯＤ（ＧＦＰ抑制）－ ＯＤ（試料））１００％
当業者による感謝されるように、非放射性のＣＣＫ－８は細胞増殖への生細胞の数の決定の高感度な比色測定法を許可します。そして、細胞傷害性は分析します。オレンジの有色の生成物（ホルマザン）を与えるために、ＷＳＴ－ ８は細胞の脱水素酵素による低減されます。それは組織培養培地において可溶です。生成されたホルマザンの量は生細胞の数に正比例し、４６０ｎｍで吸収率による測定されます。細胞計測キット８（ＷＳＴ－８／ＣＣＫ８）（ａｂ２２８５５４）は、細胞の生存率アッセイを果たす便利で丈夫な面を提供します。キットは、電子伝達体が存在する状態の中でバイオ低減上のオレンジのホルマザン染料を生成することにより、ライブ細胞の数の量を計るために水溶性のテトラゾリウム塩を用います。
結果は、分泌されたａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔがＶＥＧＦに引き起こされたＨＵＶＥＣ増殖を抑制したことを示しました。言いかえれば、分泌されたａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔは保持しました、生物学的に、活動。結果を表４に示す。
生化学的アッセイＩＣ５０データは以下の範囲内に指定される：ＨＵＶＥＣ細胞増殖の阻害：〉４０〉 Ｂ〉２５〉 Ｃ〉１０〉 Ｄ
実施例６．生体外のＡＡＶ感染症
６個の×１０５細胞／ｍＬ ２９３Ｔ細胞（６×１０４／よく）の１００ ｕＬ、種は、ＤＭＥＭ完全培地における各々よくまかれた、における、１つの、９６－よく、プレート。細胞はある時間培養されていました。次に、媒体が切り捨て。ＭＯＩ ５．５６×１０３および１．６７×１０４での７ｍ８ ＡＡＶベクターを有する３０のｕＬ ＤＭＥＭ完全培地が、各々によく付加で、夜通し培養しました。ＭＯＩは飛沫ディジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）滴定濃度に基づいて計算されました。明日、７０のｕＬ ＤＭＥＭ完全培地が付加でした。細胞は全体において４８時間培養されていました。
次に、細胞培養上澄液へのＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの発現レベルは定量的ＥＬＩＳＡによる測定されました。ＥＬＩＳＡプレートは１００を有するコートされました、ｕＬ／緩衝剤のコートにおいてあるｕｇ／ｍＬの濃縮で組み換えのヒトＶＥＧＦＡ（ｒｈＶＥＧＦＡ）によく、および４°Ｃで夜通し培養しました。洗濯緩衝剤を有する洗った後に、プレートは３００を有するブロックされました、ｕＬ／タンパク質なしのブロッキング緩衝剤によく。後で、プレートは洗浄されました。そして、試料は１：１０００希釈で付加で（１００ ｕＬ／ウェル）、室温で２時間で培養されました。その後、プレートは再び洗浄されました、および１００、ｕＬ／よく、ＩｇＧ（Ｆｃγ）の抗ヒトＦｃ領域に、ＰＢＳの中でＢＳＡにおける５００ｎｇ／ｍＬでホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にある％変化する－特異抗体は、ウェルに付加でした。洗浄の後に、１００、ｕＬ／よく、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡピコに、化学発光の基質はウェルに付加でした。そして、ルミネセンス信号はマイクロプレート・リーダを用いて測定されました。結果を表５に示す。
生化学的アッセイＩＣ５０データは以下の範囲内に指定される：左のカラム（ＭＯＩ＝１．６７Ｅの＋４）、Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ濃縮（ｎｇ／ｍｌ）のための：〉３，０００〉 Ｂ〉２，０００〉 Ｃ〉１，０００〉 Ｄ；正しいカラム（ＭＯＩ＝５．５６Ｅの＋３）、Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ濃縮（ｎｇ／ｍｌ）のための：〉１，５００〉 Ｂ〉１，０００〉 Ｃ〉５００〉 Ｄ。
実施例７ ｒＡＡＶからＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの活動の測定
２０のｕＬ ＤＭＥＭ完全培地（２つのｕｇ／ｍＬ ＶＥＧＦを含んで）を有する表面に浮かぶ試料が調合されたａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの２０ ｕＬ、およびある時間かえされました。試料希釈の２５ ｕＬが、製造のＶＥＧＦ生物検定（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧＡ２００１）の指示によるあらかじめめっきした細胞の２５ ｕＬに分配されました。Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの活動は次の方程式に基づいてｃａｃｕｌａｔｅｄされます：阻害＝ ＲＬＵ／ＲＬＵ（細胞だけ － 背景）（細胞だけ － アッセイ試料）を折り重ねます。（ＲＬＵ：相対的な軽い単位）
ｒＡＡＶから発現されたａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔによるＶＥＧＦの阻害の結果は、培養液上清への分泌されたａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔが生物学的に活発であることを示唆しました。データを表２に示す。
生化学的アッセイＩＣ５０データは以下の範囲内に指定される：左のカラム（ＭＯＩ＝１．６７Ｅの＋４）、ＶＥＧＦ（ルシフェラーゼ・リポーター）の阻害のための：〉６０〉 Ｂ〉４０〉 Ｃ〉２０〉 Ｄ；正しいカラム（ＭＯＩ＝５．５６Ｅの＋３）、ＶＥＧＦ（ルシフェラーゼ・リポーター）の阻害のための：〉３５〉 Ｂ〉２５〉 Ｃ〉１５〉 Ｄ。マウスへのＶＥＧＦ阻害剤の
実施例８ 送達と発現
マウスは２つの群へ分割されます：対照群および目標実験群。両方の群におけるマウスは、実施例３において精製されたＡＡＶ２．７ｍ８／ＶＥＧＦ阻害剤のウイルス粒子をｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｌｙにそれぞれ注入されます。眼組織はＥＬＩＳＡによるａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの測定濃縮に集められます。
実施例９ 生体内の本の適用の組成物の有効性
レーザーに引き起こされた脈絡膜の新血管新生（ＬＣＮＶ）は、ぬれた加齢黄斑変性症の前臨床のモデルとして用いられる脈絡膜の血管形成のモデルです。２つの腕臨床実験は、抑制（この適用の記載されたシステムの有効性を証明するためにこの適用のｒＡＡＶ２．７ｍ８／ＶＥＧＦ阻害剤ウイルス粒子を含んでいるシステム）を用いて行なわれます。
配列表
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔの－アミノ酸配列順序
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ、ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ＶＥＧＦレセプタある（ＶＥＧＦＲ１）領域２－ＶＥＧＦレセプタの－アミノ酸配列順序、２つの（ＶＥＧＦＲ２）領域３融合タンパク質
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＤＰＩＥＧＲ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＶＥＧＦレセプタある（ＶＥＧＦＲ１）領域２の－アミノ酸配列順序
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴＩＩＤ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＶＥＧＦレセプタ２（ＶＥＧＦＲ２）領域３の－アミノ酸配列順序
ＶＶＬＳＰＳＨＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧＳＥＭＫＫＦＬＳＴ ＬＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶＲＶＨＥＤＰＩＥＧＲ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ 重鎖のＣＤＲ１の－アミノ酸配列順序
ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ 重鎖のＣＤＲ２の－アミノ酸配列順序
ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ 重鎖のＣＤＲ３の－アミノ酸配列順序
ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ 軽鎖のＣＤＲ１の－アミノ酸配列順序
ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ 軽鎖のＣＤＲ１の－アミノ酸配列順序
ＦＴＳＳＬＨＳ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ 軽鎖のＣＤＲ２の－アミノ酸配列順序
ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ 重鎖（ＶＨ）の可変的な領域の－アミノ酸配列順序
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ 軽鎖（ＶＬ）の可変的な領域の－アミノ酸配列順序
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ － ＶＥＧＦトラップ（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）核酸配列（ＷＯ２００５０００８９５）
ＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＧＴＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＧＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴ、ＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＴＡＴＣＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＡＡＡＴＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＧＡＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＣＴＴＣＧ、ＡＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＴＡＡＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＡＡＡＡＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴＡＡＣＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴＧＴＡＡＣＣＣＧＧＡＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＴＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＴＧＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧ、ＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣ、ＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔのコドンに最適化された＃１（ＣｐＧ計算＝ ５７）
ＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＡＴＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＧＧＣＡＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧ、ＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣ、ＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧ、ＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣ、ＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔのコドンに最適化された＃２（ＣｐＧ計算＝ ５４）
ＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＡＴＴＧＧＧＡＴＡＣＧＧＧＣＧＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＡＧＴＴＧＴＣＴＣＴＴＧＴＴＧＡＣＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＣＧＡＣＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＣＣＣＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＡＴＡＣＣＡＴＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＡＴＴＡＣＣＧＴＴ、ＡＣＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＣＡＴＴＧＧＡＣＡＣＴＴＴＧＡＴＡＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＧＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＡＡＴＧＣＴＡＣＡＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＴＴＡＣＧＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＴＡＡＣＴＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＧＧＡＡＴＴＧＡＧＣＴＴＡＧＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＴＴＧＴＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＧＡＡＴＧＴＴＧＧＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＡＧＴ、ＡＡＧＣＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＡＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＣＡＡＴＡＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＣＧＣＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＴＴＴＡＣＡＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＣＧＧＧＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＡＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＡＧＡＣＡＣＧＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＣＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＧ、ＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＴＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＧＴＴＣＡＣＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＡＧＴＴＧＴＡＡＧＴＧＴＡＣＴＴＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧＧＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡＴＡＡＧＧＣＡＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＴＣＴＡＡＡＧＣＧＡＡＧＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＣＧＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＣＴ、ＴＧＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＣＣＡＴＣＴＧＡＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＧＧＴＴＣＴＣＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＴＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＡＴＴＧＣＡＴＡＡＴＣＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＡＧＴＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＧＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔのコドンに最適化された＃３（ＣｐＧ計算＝ ０）
ＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＣＴＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＧ、ＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣ、ＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＧＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧ、ＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＴＴＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣ、ＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔのコドンに最適化された＃４（ＣｐＧ計算＝ ５６）
ＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴＧＧＧＡＴＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＧＧＣＡＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣ、ＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＧＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧ、ＴＡＣＡＣＡＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡ、ＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣ、ＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔのコドンに最適化された＃５（ＣｐＧ計算＝ ５６）
ＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＧＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＧＧＣＡＧＡＣＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣ、ＴＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＣＧＴＧＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＣＡＣＧＧＣＡＴＴＧＡＡＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧ、ＴＡＣＡＣＡＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＣＴＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡ、ＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣ、ＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＡ

Claims (58)

  1. 医薬組成物であって、前記医薬組成物は、（ｉ）第１のポリヌクレオチド、第１のシーケンスを操作しやすく含むこと、第１のプロモーターと別のシーケンスにリンクされた、操作しやすく、別のプロモーターにリンクされた、そこでは最初のシーケンスはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド・タンパク質（そこで第２のシーケンスはＡＡＶレプ・タンパク質をエンコードする）をエンコードします、および（ｉｉ）３番めのプロモーター（そこでは３番目のシーケンスは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列を含む）に操作しやすくリンクされた３番めのシーケンスを含む別のポリヌクレオチド。
  2. 請求項１の組成物（そこではＶＥＧＦ阻害剤は融合タンパク質である）またはそれのＶＥＧＦ抗体または、抗原結合フラグメント。
  3. 請求項１または請求項２の組成物（そこではコドンにｏｐｔｍｉｚｅｄされた核酸配列は配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４．
  4. 請求項１または請求項２の組成物（そこではコドンに最適化された核酸配列は配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ、Ｎｏ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２．
  5. 請求項３の組成物、そこで、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：１．
  6. 請求項５の組成物（そこではコドンに最適化された核酸配列は配列番号よりＣｐＧジヌクレオチドの変更された数を含む）：１３．
  7. 請求項６の組成物（そこではコドンに最適化された核酸配列は６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５つのＣｐＧジヌクレオチド未満を含む）。
  8. 請求項７の組成物（そこではコドンに最適化された核酸配列はＣｐＧジヌクレオチドを含まない）。
  9. 請求項１－８のうちのいずれかの組成物（そこでは３番目のシーケンスは配列番号のシーケンスを含む）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８．
  10. 請求項１－９のうちのいずれかの組成物（そこでは第１のプロモーターと第２のプロモーターは昆虫細胞または哺乳動物細胞の発現のために適している）。
  11. 請求項１０の組成物（そこでは昆虫細胞はＳｆ９細胞である）。
  12. 請求項１０の組成物（そこでは哺乳動物細胞はそれのＨＥＫ２９３細胞または派生的な細胞である）。
  13. 接着細胞は、分化細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
  14. 請求項１－１３のうちのいずれかの組成物（そこでは第１のプロモーターまたは第２のプロモーターはｐ１０プロモーターまたはｐｏｌｈプロモーターである）。
  15. 請求項１－１４のうちのいずれかの組成物（そこでは３番目のプロモーターはＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１ａプロモーターまたは眼の特有のプロモーターである）。
  16. 請求項１５の組成物（そこではＲＰＥ ６５遺伝子プロモーター、ヒト網膜の結合蛋白質遺伝子プロモーター、ネズミ科の１１－ｃｉｓレチノイド・アルコール脱水素酵素遺伝子プロモーター、ロドプシン・プロモーター、ｒｈｏｄｏｐｏｓｉｎキナーゼ・プロモーター、コラーゲン分解酵素阻害３プロモーター、光受容体レチノール結合蛋白質プロモーター、卵黄様黄斑ジストロフィ２プロモーターと光受容体間類網膜の結合蛋白質プロモーターから構成される群から眼に特有のプロモーターは選択される）。
  17. 請求項１－１６のうちのいずれかの組成物（そこでは最初のシーケンス、第２のシーケンスまたは３番目のシーケンスの３’終了は、さらにポリ（Ａ）シーケンスを含む）。
  18. 請求項１７の組成物。（そこではポリ（１つの）シーケンスはｈＧＨポリ（１つの）、シミアンウイルス４０ポリ（１つの）またはβ－グロビン・ポリ（１つの）である）
  19. 請求項１－１８（そこでは第２のポリヌクレオチドはイントロンまたは調整する要素を含む）のうちのいずれかの組成物。
  20. 組成物の粘性は低い、ことを特徴とする請求項１０８に記載の組成物。
  21. 請求項１９の組成物（そこでは調整する要素はＴＰＬ（アデノウイルスから三者間のリーダー配列）とｅＭＬＰ（アデノウイルス・マヨール後期プロモーターからエンハンサーエレメント）シーケンスを含む）。
  22. 請求項１－２１（そこでは第２のポリヌクレオチドはコザック配列を含む）のうちのいずれかの組成物。
  23. 請求項１－２２（そこでは第２のポリヌクレオチドはヒト足場を付属の領域（ＳＡＲ）シーケンスを含む）のうちのいずれかの組成物。
  24. 請求項１－２３（そこでは第２のポリヌクレオチドはさらにエンハンサーを含む）のうちのいずれかの組成物。
  25. 担体は薬学的に許容可能な担体である、ことを特徴とする請求項１１３に記載の組成物。
  26. 請求項１－２５のうちのいずれかの組成物（そこでは第２のポリヌクレオチドはさらに充填材シーケンスを含む）。
  27. 請求項１－２６（そこでは第２のポリヌクレオチドは逆方向末端反復（ＩＴＲ）シーケンスをさらに含む）のうちのいずれかの組成物。
  28. 個体はタモキシフェンに耐性がある、ことを特徴とする請求項１０８に記載の組成物。
  29. 請求項１－２８のうちのいずれかの組成物（そこでは第２のポリヌクレオチドは付加的な治療のタンパク質をエンコードする４番めのシーケンスをさらに含む）。
  30. 請求項２９の組成物（そこではＶＥＧＦ阻害剤、ＰＤＧＦ阻害剤、胎盤の成長因子阻害剤、インテグリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ阻害剤とＴＧＦβ阻害作用薬から構成される群から付加的な治療のタンパク質は選択される）。
  31. 請求項３０の組成物（そこでは３番目のシーケンスと４番目のシーケンスはリンカーによる接続される）。
  32. 担体は薬学的に許容可能な担体である、ことを特徴とする請求項１１３に記載の組成物。
  33. 前記ＴＡはペプチドである、ことを特徴とする請求項２４に記載のｍＴＡ。
  34. 細胞へ請求項１－３３のうちのいずれか１つの組成物をトランスフェクトすることにより調製された組み換えのアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
  35. 請求項３４のｒＡＡＶ粒子（そこでは細胞は昆虫細胞または哺乳動物細胞である）。
  36. 接着細胞は、分化細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
  37. 請求項３５のｒＡＡＶ粒子（そこでは哺乳動物細胞はそれのＨＥＫ２９３細胞または派生的な細胞である）。
  38. 接着細胞は、分化細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の組織構成物。
  39. 配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化されたｎｕｃｌｅｏｉｃな辛辣なシーケンスを含むポリヌクレオチド：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４．
  40. 請求項３９のポリヌクレオチド、そこで、配列番号のアミノ酸配列順序を含むタンパク質をエンコードする、コドンに最適化された核酸配列：１．
  41. 請求項４０のポリヌクレオチド（そこではコドンに最適化された核酸配列は配列番号よりＣｐＧジヌクレオチドの変更された数を含む）：１３．
  42. 請求項４１のポリヌクレオチド（そこではコドンに最適化された核酸配列は６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５つのＣｐＧジヌクレオチド未満を含む）。
  43. 請求項４２のポリヌクレオチド（そこではコドンに最適化された核酸配列はＣｐＧジヌクレオチドを含まない）。
  44. 請求項３９－４３のうちのいずれかのポリヌクレオチド（そこでは３番目のシーケンスは配列番号のシーケンスを含む）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８．
  45. さらにプロモーターを含む請求項３９－４４のうちのいずれかのポリヌクレオチド。
  46. 請求項４５のポリヌクレオチド（そこではプロモーターはＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１ａプロモーターまたは眼の特有のプロモーターである）。
  47. 請求項４６のポリヌクレオチド（そこではＲＰＥ ６５遺伝子プロモーター、ヒト網膜の結合蛋白質遺伝子プロモーター、ネズミ科の１１－ｃｉｓレチノイド・アルコール脱水素酵素遺伝子プロモーター、ロドプシン・プロモーター、ｒｈｏｄｏｐｏｓｉｎキナーゼ・プロモーター、コラーゲン分解酵素阻害３プロモーター、光受容体レチノール結合蛋白質プロモーター、卵黄様黄斑ジストロフィ２プロモーターと光受容体間類網膜の結合蛋白質プロモーターから構成される群から眼に特有のプロモーターは選択される）。
  48. さらにポリ（Ａ）シーケンスを含む請求項３９－４７のうちのいずれかのポリヌクレオチド。
  49. 請求項４８のポリヌクレオチド。（そこではポリ（１つの）シーケンスはｈＧＨポリ（１つの）、シミアンウイルス４０ポリ（１つの）またはβ－グロビン・ポリ（１つの）である）
  50. イントロンまたは調整する要素をさらに含む請求項３９－４９のうちのいずれかのポリヌクレオチド。
  51. カバーは液体絆創膏を含む、ことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
  52. 請求項５０のポリヌクレオチド（そこでは調整する要素はＴＰＬ（アデノウイルスから三者間のリーダー配列）とｅＭＬＰ（アデノウイルス・マヨール後期プロモーターからエンハンサーエレメント）シーケンスを含む）。
  53. さらにコザック配列を含む請求項３９－５２のうちのいずれかのポリヌクレオチド。
  54. 請求項３９－５３のうちのいずれかのポリヌクレオチドを含む組み換えのアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
  55. 細胞または細胞または対象の組織へ請求項１－３３のうちのいずれかの組成物、請求項３４－３８および請求項５４のうちのいずれかのｒＡＡＶ粒子または請求項３９－５３のうちのいずれかのポリヌクレオチドを投与することを含む対象の組織のＶＥＧＦ阻害剤を示す方法。
  56. 対象に請求項１－３３のうちのいずれかの治療上有効な量の組成物、請求項３４－３８および請求項５４のうちのいずれかのｒＡＡＶ粒子または請求項３９－５３のうちのいずれかのポリヌクレオチドを投与することを含むその必要性のある対象の眼疾患を処置する方法。
  57. 請求項５６の方法（そこではぬれた加齢黄斑変性症（滲出型ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病の黄斑の浮腫、増殖性糖尿病性網膜症と黄斑の浮腫から構成される群から目の疾患は選択される）。
  58. 請求項１－３３のうちのいずれかの組成物または請求項３９－５３のうちのいずれかのポリヌクレオチドを有する細胞を導入することを含む組み換えのアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を調製する方法。
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