CN112779255A

CN112779255A - 用于治疗色盲和其它疾病的启动子、表达盒、载体、药盒和方法

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Publication number: CN112779255A
Application number: CN202110108750.0A
Authority: CN
Inventors: 叶国杰
Original assignee: Applied Genetic Technologies Corp
Current assignee: Applied Genetic Technologies Corp
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2014-05-05
Publication date: 2021-05-11
Also published as: US20180154022A1; AU2022203073A1; US20140364486A1; CN105764531A; WO2014186160A8; EP2996725A4; US9724429B2; JP2023153788A; NZ753155A; US20210154325A1; CA2912525A1; EP2996725A1; AU2014265799B2; WO2014186160A1; JP7452953B2; EP3517135A1; JP2021168670A; JP6588008B2; JP2019187421A; AU2020200701A1

Abstract

本发明提供用于治疗影响视网膜的视锥细胞的遗传疾病的分离启动子、转基因表达盒、载体、药盒和方法。本发明在第一方面中的特征为包含视锥细胞特异性启动子PR 2.1的一部分的核酸。在一个实施方案中，该核酸包含序列SEQ ID NO:4。在另一实施方案中，PR2.1在5’或3’端截短。在上述方面的一个实施方案中，该启动子能够促进S‑视锥细胞、M‑视锥细胞和L‑视锥细胞中的CNGB3表达。在上述方面的另一实施方案中，该启动子能够促进S‑视锥细胞、M‑视锥细胞和L‑视锥细胞中的CNGA3表达。在上述方面的再一实施方案中，该启动子能够促进S‑视锥细胞、M‑视锥细胞和L‑视锥细胞中的GNAT2表达。

Description

用于治疗色盲和其它疾病的启动子、表达盒、载体、药盒和方法

本申请是与母案发明名称相同的分案申请，母案的中国申请号是201480040296.8，国际申请号是PCT/US2014/036792，申请日是2014年5月5日。

相关申请

本申请要求2013年5月16日提交的美国临时申请61/824,071的优先权，其整个内容全文经此引用并入本文。

背景技术

色盲是以明显降低的视敏度、眼球震颤、在日光条件下的严重畏光和减弱或完全丧失的辨色力为特征的常染色体隐性视网膜疾病（Kohl, S.等人，Achromatopsia. In:Pagon RA, Bird TC, Dolan CR, Stephens K, 编辑Gene Reviews [Internet].Seattle: University of Washington; 2010）。其可以是部分或完全的。参见Pang, J.-J.等人(2010). Achromatopsia as a Potential Candidate for Gene Therapy. 在Advances in Experimental Medicine and Biology中, 第664卷, 第6部分, 639-646(2010)（下文称作Pang等人）。色盲（achromatopsia）的症状包括降低的视敏度、全色盲（achromatopia）（缺乏色觉）、昼盲（在亮光中的视觉能力降低，伴随着厌光，意味着不喜欢或逃避亮光）、眼球震颤（眼睛的不受控颤动）、虹膜工作异常和立体视觉受损（不能察觉场景的三维外观）。视网膜电图揭示，在色盲中，视杆光感受器的功能保持完好，而视锥光感受器失去功能。视锥特异性环核苷酸门控通道β亚基（CNGB3）基因中的突变导致大约50%的色盲病例（Kohl S等人Eur J Hum Genet 2005;13:302-8）。视杆和视锥光感受器在视力中发挥不同功能。Pang等人(2010)。视锥光感受器主要负责中心、高分辨率和颜色视觉，同时在微光至极亮光中工作。它们集中在视网膜的中央黄斑中并占几乎100%的中央凹。视杆光感受器负责周边、微光和夜视觉；它们主要存在于黄斑外的周边视网膜中。

大约30,000个个体中有一个患有全色盲。在全色盲中，完全丧失色视觉、丧失中心视觉、视敏度为20/200或更差。因此，大多数色盲个体是法定盲人。现行护理标准包括用有色隐形眼镜限制视网膜曝光并提供放大以增强中心视觉。但是，没有校正色盲中的视锥功能的疗法。Pang等人。

先天性色盲有各种遗传原因。环核苷酸-门控离子通道β3（CNGB3，也称作ACHM3）基因中的突变是色盲的一个遗传原因。近期在犬类中的研究表明使用基于重组腺相关病毒（rAAV）的基因疗法治疗由CNGB3基因中的突变造成的色盲的前景。Komaromy等人, 基因疗法拯救了先天性色盲中视锥功能(Gene therapy rescues cone function in congenitalachromatopsia). Human Molecular Genetics, 19(13): 2581-2593 (2010)（下文称作Komaromy等人）。在犬类研究中，所用rAAV载体包装人CNGB3（hCNGB3）表达盒，其含有包括2.1 kb锥红色视蛋白启动子（PR2.1）和人CNGB3（hCNGB3）cDNA在内的元件。该研究的一个限制在于，由PR2.1启动子驱动的hCNGB3仅在感红和感绿视锥中表达，而内源性hCNGB3在所有三种类型的视锥（感红、感绿和感蓝视锥）中表达。另一限制在于所用表达盒的整体大小（5,230 bp）远超过AAV粒子的正常包装容量（<4.9 kb）；过载的（over-stuffed）rAAV粒子显著损害rAAV包装效率，以造成低收率、更高的空/满粒子比和可能更低的载体感染性。含有锥红色视蛋白启动子的更短形式或锥抑制蛋白启动子的表达盒在恢复视觉功能中的效率低得多。本发明致力于解决这些限制。

本发明的优点在于提供能促进所有三种类型的视锥中的hCNGB3表达的启动子。此外，本发明的启动子的优点在于它们足够短以使该hCNGB3表达盒合适地装配在rAAV的正常包装容量内。装配在正常rAAV包装容量内的启动子提供益处，如改进的收率、更低的空/满粒子比和更高的载体感染性。本发明还提供利用这些改进的启动子的表达盒、载体和药盒，以及通过给予该载体来治疗色盲的方法。

本发明致力于解决对有效色盲疗法的需求。

发明内容

在第一方面中，本发明的特征为包含视锥细胞特异性启动子PR 2.1的一部分的核酸。

在一个实施方案中，该核酸包含序列SEQ ID NO: 4。在另一实施方案中，PR2.1在5’或3’端截短。在一个相关实施方案中，该截短为大约100个碱基对至1,500个碱基对。在另一相关实施方案中，该截短为在5’端的大约300个碱基对。在再一实施方案中，该截短为在5’端的大约500个碱基对。在另一实施方案中，该截短为在5’端的大约1,1000个碱基对。在再一实施方案中，该截短为在3’端的大约300个碱基对。在另一实施方案中，该截短为在3’端的大约500个碱基对。在再一实施方案中，该截短为在3’端的大约1,1000个碱基对。

在一个实施方案中，上述方面和实施方案的核酸包含SEQ ID NO:3。在一个实施方案中，上述方面和实施方案的核酸包含SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，核酸

在另一方面，本发明的特征为包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸。在另一方面，本发明的特征为包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸。在另一方面，本发明的特征为包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的核酸。

在再一实施方案中，本发明的特征为包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列至少85%一致的核苷酸序列的核酸。

在上述方面的一个实施方案中，该启动子能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGB3表达。在上述方面的另一实施方案中，该启动子能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGA3表达。在上述方面的又一实施方案中，该启动子能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的GNAT2表达。

在另一实施方案中，本发明的特征为包含可操作地与任一上述方面和实施方案的核酸连接的靶核酸序列的重组腺相关（rAAV）表达载体。在一个相关实施方案中，该rAAV是血清型1。在一个相关实施方案中，该rAAV是血清型2。在另一相关实施方案中，该rAAV是血清型5。在又一相关实施方案中，该rAAV包含在AAV病毒粒子内。

在一个实施方案中，该靶核酸序列编码环核苷酸门控通道亚基B（CNGB3）多肽。在一个相关实施方案中，该CNGB3是小鼠CNGB3。在另一相关实施方案中，该CNGB3是大鼠CNGB3。在又一相关实施方案中，该CNGB3是人CNGB3。

在一个实施方案中，该靶核酸序列编码环核苷酸门控通道亚基A（CNGA3）多肽。在一个相关实施方案中，该CNGA3是小鼠CNGA3。在另一相关实施方案中，该CNGA3是大鼠CNGA3。在又一相关实施方案中，该CNGA3是人CNGA3。

在一个实施方案中，该靶核酸序列编码鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白G(t)亚基α-2（GNAT-2）多肽。在一个相关实施方案中，该GNAT-2是小鼠GNAT-2。在另一相关实施方案中，该GNAT-2是大鼠GNAT-2。在又一相关实施方案中，该GNAT-2是人GNAT-2。

在另一实施方案中，本发明的特征为包含任一上述方面和实施方案的表达载体的哺乳动物细胞。

在再一实施方案中，本发明的特征为包含任一上述方面或实施方案的核酸、选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸和最小调节元件（minimal regulatoryelements）的转基因表达盒。在一个实施方案中，本发明的特征为包含任一上述方面或实施方案的表达盒的核酸载体。在一个相关实施方案中，该载体是腺相关病毒（AAV）载体。

在另一实施方案中，本发明的特征为包含任一上述方面或实施方案的表达载体和使用说明书的药盒。

本发明在另一实施方案中的特征还为一种治疗眼病的方法，其包括给予需要其的对象任一上述方面或实施方案的表达载体，由此治疗所述对象。

本发明在另一实施方案中的特征还为一种促进对象的视锥细胞中的CNGA3或CNGB3表达的方法，其包括给予所述对象任一上述方面或实施方案的表达载体，由此促进CNGA3或CNGB3表达。

在一个实施方案中，该眼病与影响视锥细胞的基因突变、替换或缺失相关联。在另一实施方案中，该眼病影响视网膜色素上皮细胞。在另一相关实施方案中，该眼病是色盲。

在另一实施方案中，该表达载体能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGB3表达。在再一实施方案中，该表达载体能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGA3表达。在又一实施方案中，该表达载体能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的GNAT-2表达。

在另一些实施方案中，该载体在视网膜下给药。

附图说明

图1: 截短的人感红/感绿视蛋白启动子的示意图

图2: rAAV5-PR2.1-hCNGB3载体的示意图

图3: 含有PR2.1启动子的变体的四种前病毒质粒的示意图。PR2.1启动子（截短的人感红/感绿视蛋白启动子）在其5’-端截短300 bp、500 bp和1,100 bp以产生更短的启动子，分别被标作PR1.7、PR1.5和PR1.1。将CMV增强子添加到PR1.1的5’端以产生杂合启动子。PR2.1的500 bp核心启动子（以灰色显示）和基因座控制区（以红色显示）在各构建物中保持完好。末端重复由箭头标示并显示SV40剪接信号序列的位置。

图4示出SEQ ID NOs: 1-4。

图5显示使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的rAAV载体评估PR1.1和 PR1.5靶向小鼠视锥的效率和特异性的实验结果。PNA是视锥光感受器的标记。使用DAPI识别核。

图6显示使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的rAAV载体评估PR1.7和PR2.1靶向小鼠视锥的效率和特异性的实验结果。PNA是视锥光感受器的标记。使用DAPI识别核。

图7显示用于检测在视网膜下接收rAAV2tYF-PR2.1-GFP、rAAV2tYF-PR1.7-GFP或AAV2tYF-CSP-GFP的非人灵长类（NHP）眼睛中的绿色荧光蛋白（GFP）存在的眼底自发荧光成像（FAF）的结果。

图8 (A-E)显示在注射AAV2tYF-GFP载体后3个月的NHP视网膜中的GFP表达。这组图显示来自没有AAV治疗的正常对照眼睛（图A）或来自视网膜下注射AAV2tYF-CSP-GFP（图B）、AAV2tYF-PR2.1-GFP（图C）或AAV2tYF-PR1.7-GFP（图D & E）（它们被核的DAPI（蓝色）和GFP的抗体（绿色）、L/M锥视蛋白（红色，图A、B、C & D）或S锥视蛋白（红色，图E）染色）的眼睛的代表性视网膜区。

图9是显示在注射AAV2tYF-GFP载体后3个月的NHP视网膜中的GFP的信使RNA（mRNA）水平的图。通过qRT-PCR测定GFP的信使RNA（mRNA），在3个不同时间一式三份进行，并通过样品中的18S RNA表达标准化。

具体实施方式:

I. 综述和定义

除非另行定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下列参考文献为技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第二版.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker 编辑, 1988)；The Glossary of Genetics, 第五版, R. Rieger等人(编辑), Springer Verlag(1991)；和Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另行规定，本文所用的下列术语具有下文给予它们的含义。

冠词“一”在本文中用于表示一个或多于一个（即至少一个）该冠词的语法对象。例如，“一元件”是指一个元件或多于一个元件。

术语“包括”在本文中用于表示短语“包括但不限于”并可与短语“包括但不限于”互换使用。

除非上下文明确地另行说明，术语“或”在本文中用于表示术语“和/或”并可与术语“和/或”互换使用。

术语“如”在本文中用于表示短语“例如但不限于”并可与短语“例如但不限于”互换使用。

要通过本发明的方法治疗的“对象”或“患者”可以是指人类或非人动物。“非人动物”包括任何脊椎生物或无脊椎生物。

“色盲”是一种色视觉障碍。色盲的症状包括全色盲（achromatopia）（缺乏色觉）、弱视（降低的视敏度）、昼盲（在亮光中的视觉能力降低，伴随着厌光，意味着不喜欢或逃避亮光）、眼球震颤（眼睛的不受控颤动）、虹膜工作异常和立体视觉受损（不能察觉场景的三维外观）。本文所用的术语“色盲”是指由基因突变、替换或缺失造成的色盲形式。

“治疗”疾病（例如，诸如色盲）是指减轻、预防或延迟该疾病的至少一种征兆或症状的发生。

DNA和RNA链的不对称末端被称作5′（五撇）和3′（三撇）端，5'端具有末端磷酸基，3'端具有末端羟基。五撇（5’）端具有脫氧核糖或核糖在其末端的糖环中的第五个碳。核酸以5'-到3'的方向体内合成，因为用于装配新链的聚合酶将各个新核苷酸经磷酸二酯键连接到3'-羟基（-OH）上。

“启动子”是促进特定基因的转录的DNA区。作为转录过程的一部分，合成RNA的酶（被称作RNA聚合酶）连接到基因附近的DNA上。启动子含有特定的DNA序列和响应元件，它们为RNA聚合酶和为募集RNA聚合酶的转录因子提供初始结合位点。

视网膜含有三种光感受器：视杆细胞、视锥细胞和感光神经节细胞。视锥细胞有三种类型：S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞。S-视锥细胞最强烈响应短波长光（峰在420-440纳米附近）并且也被称作感蓝视锥。M-视锥细胞最强烈响应中波长光（峰在534-545纳米附近）并且也被称作感绿视锥。L-视锥细胞最强烈响应长波长光（峰在564–580纳米附近）并且也被称作感红视锥。从这三种视锥类型接收的信号的差异能使大脑感知所有可能的颜色。

“转基因表达盒”或“表达盒”包含核酸载体向靶细胞递送的基因序列。这些序列包括感兴趣的基因（例如CNGB3或CNGA3核酸）、一种或多种启动子和最小调节元件。

“最小调节元件”是靶细胞中的有效基因表达所必需的并因此应包括在转基因表达盒中的调节元件。这样的序列可以包括，例如，启动子或增强子序列、促进DNA片段插入质粒载体内的多接头序列，和对内含子剪接和mRNA转录子的多腺苷酸化负责的序列。在色盲的基因疗法的一个最近的实例中，表达盒包括多腺苷酸化位点的最小调节元件、剪接信号序列和AAV反向末端重复。参见例如Komaromy等人。

“核酸”或“核酸分子”是由单体核苷酸的链构成的分子，例如，诸如DNA分子（例如cDNA或基因组DNA）。核酸可以编码例如启动子、CNGB3或CNGA3基因或其部分，或调节元件。核酸分子可以是单链或双链的。“CNGB3核酸”是指包含CNGB3基因或其一部分，或CNGB3基因或其一部分的功能变体的核酸。类似地，“CNGA3核酸”是指包含CNGA3基因或其一部分，或CNGA3基因或其一部分的功能变体的核酸，且“GNAT2核酸”是指包含GNAT2基因或其一部分，或GNAT2基因或其一部分的功能变体的核酸。基因的功能变体包括具有次要变异，例如沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变和不显著改变基因功能的其它突变或缺失的基因变体。

“分离的”核酸分子（例如，诸如分离的启动子）是与核酸的天然来源中存在的其它核酸分子分离的核酸分子。例如，关于基因组DNA，术语“分离的”包括从与该基因组DNA天然关联的染色体中分离的核酸分子。“分离的”核酸分子优选不含天然位于该核酸分子源自的生物体的基因组DNA中的核酸分子侧面的序列。

II. 本发明的方法

本发明提供可用于治疗影响视网膜的视锥细胞的遗传疾病的启动子、表达盒、载体、药盒和方法。影响视网膜的视锥细胞的遗传疾病包括色盲；Leber先天性黑蒙；视锥-视杆营养不良；视网膜色素变性，包括X-连锁视网膜色素变性；黄斑病变；和年龄相关黄斑变性。在优选实施方案中，该疾病是色盲。

色盲是一种色视觉障碍。三种基因中的常染色体隐性突变或其它类型的序列变异是先天性色盲的主要成因。参见Pang, J.-J.等人 (2010). Achromatopsia as aPotential Candidate for Gene Therapy. 在Advances in Experimental Medicine andBiology中, 第664卷, 第6部分, 639-646 (2010)。色盲与环核苷酸门控通道（CNGs）的α或β亚基（分别被称作CNGA3和CNGB3）中的突变相关联。与色盲相关的CNGA3基因中的突变报道在Patel KA等人Transmembrane S1 mutations in CNGA3 from achromatopsia 2patients cause loss of function and impaired cellular trafficking of the coneCNG channel. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7): 2282–90. (2005).、Johnson S等人Achromatopsia caused by novel mutations in both CNGA3 and CNGB3. J. Med. Genet. 41 (2): e20. (2004)、Wissinger B等人CNGA3 mutations in hereditary conephotoreceptor disorders. Am. J. Hum. Genet. 69 (4): 722–37.(2001)和Kohl S等人Total colourblindness is caused by mutations in the gene encoding the α-subunit of the cone photoreceptor cGMP-gated cation channel. Nat. Genet. 19(3): 257–9. (1998)中。与色盲相关的CNGB3基因中突变报道在Johnson S等人Achromatopsia caused by novel mutations in both CNGA3 and CNGB3. J. Med. Genet. 41 (2): e20. (2004)、Peng C等人Achromatopsia-associated mutation in thehuman cone photoreceptor cyclic nucleotide-gated channel CNGB3 subunit altersthe ligand sensitivity and pore properties of heteromeric channels. J. Biol. Chem. 278 (36): 34533–40 (2003)、Bright SR等人Disease-associated mutations inCNGB3 produce gain of function alterations in cone cyclic nucleotide-gatedchannels. Mol. Vis. 11: 1141–50 (2005)、Kohl S等人CNGB3 mutations account for50% of all cases with autosomal recessive achromatopsia. Eur. J. Hum. Genet.13 (3): 302–8 (2005)、Rojas CV等人A frameshift insertion in the cone cyclicnucleotide gated cation channel causes complete achromatopsia in aconsanguineous family from a rural isolate. Eur. J. Hum. Genet. 10 (10): 638–42 (2002)、Kohl S等人Mutations in the CNGB3 gene encoding the β-subunit of thecone photoreceptor cGMP-gated channel are responsible for achromatopsia(ACHM3) linked to chromosome 8q21. Hum. Mol. Genet. 9 (14): 2107–16 (2000)、Sundin OH等人Genetic basis of total colourblindness among the Pingelapeseislanders. Nat. Genet. 25 (3): 289–93 (2000)中。被称作GNAT2的视锥细胞转导素的基因中的序列变异也可造成色盲。参见Kohl S等人, Mutations in the conephotoreceptor G-protein alpha-subunit gene GNAT2 in patients withachromatopsia。Kokl S等人Mutations in the cone photoreceptor G-protein α-subunit gene GNAT2 in patients with achromatopsia. Am J Hum Genet 71 (2):422-425 (2002)（下文称作Kohl等人）。这些蛋白质中的突变严重程度与色盲表型的严重程度相关联。http://en.wikipedia.org/wiki/achromatopsia。CNGB3中的突变导致大约50%的色盲病例。Kohl等人。CNGA3中的突变导致大约23%的比例，GNAT2中的突变导致大约2%的病例。

“CNGB3基因”是编码环核苷酸门控通道β3（CNGB3）的基因。“CNGA3基因”是编码环核苷酸门控通道α3（CNGA3）的基因。CNGB3和CNGA3基因在视网膜的视锥细胞中表达。天然视网膜环核苷酸门控通道（CNGs）关键性地参与光转导。CNGs是由两个α和两个β亚基构成的阳离子通道。在暗处，视锥具有相对较高浓度的3'-5'环一磷酸鸟苷（cGMP），其使CNGs打开，以造成去极化和连续谷氨酸释放。曝光激活分解cGMP的信号转导通路。cGMP浓度的降低使CNGs关闭，以防止正离子流入、使细胞超极化并停止谷氨酸的释放。CNGB3或CNGA3基因中的突变可造成视锥光感受器功能缺陷，导致色盲。CNGB3基因中的突变与除色盲外的其它疾病相关联，包括进行性视锥细胞营养不良和幼年黄斑变性。

GNAT2基因编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白的α-2亚基，其也被称作视锥特异性α转导素。鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白（G蛋白）由α、β和γ亚基构成。在光感受器中，G蛋白在视觉信号的放大和转导中至关重要。GNAT2中的各种类型的序列变异可造成人类色盲：无义突变、小缺失和/或插入突变、移码突变和大基因内缺失。Pang等人。

目前，没有有效的色盲治疗。动物研究表明有可能使用基因疗法治疗色盲和其它视网膜疾病。对于隐性基因缺陷，目标是将缺陷基因的野生型拷贝递送给受影响的视网膜细胞类型。例如在Mauck, M. C.等人, Longitudinal evaluation of expression ofvirally delivered transgenes in gerbil cone photoreceptors. Visual Neuroscience 25(3): 273-282 (2008)中证实了将基因递送到视锥细胞的一些亚群的能力。作者显示重组AAV载体可用于实现编码绿色荧光蛋白的报告基因在沙鼠视锥细胞的特定类型中的长期表达。作者进一步证实，可以将人类长波长视蛋白基因递送给特定沙鼠视锥，以获得视锥对长波长光的响应。

其它研究证实，使用重组AAV载体的基因疗法可用于通过将人类L-视蛋白基因引入松鼠猴视网膜中来将二色性色盲的猴子转化成三色视者。Mancuso, K.,等人Genetherapy for red-green colour blindness in adult primates. Nature 461: 784-787(2009)。视网膜电图证实，引入的感光色素是功能性的，且猴子在行为学试验中表现出改善的色视觉。

有色盲的几种动物模型用于基因疗法实验，其已表现出恢复视锥功能的能力。参见Pang等人。首先，Gnat2^cpfl3小鼠在视锥特异性α转导素基因中具有隐性突变，以造成不良视敏度和几乎或完全没有视锥特异性ERT响应。通过单次视网膜下注射带有野生型小鼠GNAT2 cDNA和人感红锥视蛋白启动子的AAV血清型5载体治疗纯合Gnat2^cpfl3小鼠恢复视锥特异性ERG响应和视敏度。Alexander等人Restoration of cone vision in a mousemodel of achromatopsia. Nat Med 13:685-687 (2007)（下文称作Alexander等人）。其次，cpfl5（视锥光感受器功能丧失5）小鼠在没有视锥特异性ERG响应的CNGA3基因中具有常染色体隐性错义突变。通过视网膜下注射带有野生型小鼠CNGA3基因和人感蓝视锥启动子（HB570）的AAV载体治疗cpfl5小鼠使得视锥特异性ERG响应恢复。Pang等人。第三，一种Alaskan Malmute犬具有天然存在的CNGB3突变造成白天视觉丧失和视锥功能缺失。在这类犬中，视网膜下注射含有人CNGB3 cDNA和人感红锥视蛋白启动子的AAV5载体恢复视锥特异性ERG响应。参见例如Komaromy等人。

使用基因疗法治疗色盲的在先方法受限于所用启动子仅在某些类型的视锥细胞光感受器中造成转基因的表达的事实。本发明的启动子可以驱动在人类中存在的所有三种类型的视锥细胞（S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞）中的基因表达。

Komaromy等人进行的研究的另一限制在于所用表达盒的整体大小（5,230 bp）远超过AAV粒子的正常包装容量（<4.9 kb）；过载的（over-stuffed）rAAV粒子显著损害rAAV包装效率，造成低收率、更高的空/满粒子比和可能更低的载体感染性。含有锥红色视蛋白启动子的更短形式或锥抑制蛋白启动子的表达盒在恢复视觉功能中的效率低得多。本发明的启动子的优点在于，由于它们的长度缩短，它们使该hCNGB3表达盒有效包装在AAV粒子中。装配在正常rAAV包装容量内的启动子提供益处，如改进的收率、较低的空/满粒子比和较高的载体感染性，和最终，用于治疗所需病况的更高效力。

III. 本发明的启动子、表达盒、核酸和载体

本发明的启动子、CNGB3核酸、调节元件和表达盒和载体可以使用本领域中已知的方法制备。作为此类方法的非限制性实例提供下述方法。

启动子

本发明提供分离和/或截短的启动子。在一些方面中，这些启动子包括PR 2.1启动子的片段。在一个实施方案中，该启动子是截短的PR2.1启动子。

在本发明的启动子的一些实施方案中，该启动子能够促进在S-视锥、M-视锥和L-视锥细胞中的转基因的表达。“转基因”是指含有已从一种生物体中分离并引入不同生物体中的基因序列的DNA片段。例如，为了治疗具有由人CNGB3基因的突变造成的色盲的个体，可以使用适当的载体施加野生型（即非突变或功能性变体）人CNGB3基因。该野生型基因被称作“转基因”。在优选实施方案中，该转基因是编码视网膜的视锥细胞中正常表达的蛋白质的基因的野生型形式。在一个这样的实施方案中，该转基因源自人类基因。在第一个具体实施方案中，该启动子能够促进在S-视锥、M-视锥和L-视锥细胞中的CNGB3核酸表达。在第二个具体实施方案中，该启动子能够促进在S-视锥、M-视锥和L-视锥细胞中的CNGA3核酸表达。在第三个具体实施方案中，该启动子能够促进在S-视锥、M-视锥和L-视锥细胞中的GNAT2核酸表达。在这三个具体实施方案中，CNGB3、CNGA3或GNAT2优选是人类CNGB3、CNGA3或GNAT2。

另一方面，本发明提供作为PR2.1启动子的缩短形式的启动子。这样的启动子的优点在于它们更好地装配在AAV粒子的包装容量内并因此提供例如改进的收率、更低的空/满粒子比和更高的载体感染性之类的优点。在一些实施方案中，通过截短PR2.1的5’-端或PR2.1的3’-端，创造这些启动子。在一些这样的实施方案中，截短长度选自大约300bp、500bp和1,100 bp（分别参见例如PR1.7、PR1.5和PR1.1）。

表达盒

另一方面，本发明提供一种转基因表达盒，其包括(a) 本发明的启动子；(b) 选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸；和(c) 最小调节元件。本发明的启动子包括上文论述的启动子。

“CNGB3核酸”是指包含CNGB3基因或其一部分，或CNGB3基因或其一部分的功能变体的核酸。类似地，“CNGA3核酸”是指包含CNGA3基因或其一部分，或CNGA3基因或其一部分的功能变体的核酸，以及“GNAT2核酸”是指包含GNAT2基因或其一部分，或GNAT2基因或其一部分的功能变体的核酸。基因的功能变体包括具有次要变异，例如，诸如沉默突变、单核苷酸多态性、错义突变和不显著改变基因功能的其它突变或缺失的基因变体。

在某些实施方案中，该核酸是人类核酸（即源自人类CNGB3、CNGA3或GNAT2基因的核酸）。在其它实施方案中，该核酸是非人类核酸（即源自非人类CNGB3、CNGA3或GNAT2基因的核酸）。

“最小调节元件”是靶细胞中有效基因表达所必需的调节元件。这样的调节元件可以包括，例如，启动子或增强子序列、促进DNA片段插入质粒载体内的多接头序列，和对内含子剪接和mRNA转录子的多腺苷酸化负责的序列。在色盲的基因疗法的一个最近的实例中，表达盒包括多腺苷酸化位点的最小调节元件、剪接信号序列和AAV反向末端重复。参见例如Komaromy等人。本发明的表达盒还可任选包括不是基因有效并入靶细胞中所必需的另外的调节元件。

载体

本发明还提供包括上一节中论述的任一表达盒的载体。在一些实施方案中，该载体是包含该表达盒的序列的寡核苷酸。在具体实施方案中，可以通过体内电穿孔法实现寡核苷酸的递送（参见例如Chalberg, TW等人phiC31 integrase confers genomicintegration and long-term transgene expression in rat retina. Investigative Ophthalmology &Visual Science, 46, 2140–2146 (2005)（下文称作Chalberg等人,2005））或电子雪崩转染（参见例如Chalberg, TW等人Gene transfer to rabbit retinawith electron avalanche transfection. Investigative Ophthalmology &Visual Science, 47, 4083–4090 (2006)（下文称作Chalberg等人, 2006））。在另一些实施方案中，该载体是DNA-压缩肽（DNA-compacting peptide）（参见例如Farjo, R等人Efficientnon-viral ocular gene transfer with compacted DNA nanoparticles. PLoS ONE, 1,e38 (2006)（下文称作Farjo等人, 2006），其中CK30——含有偶联到聚乙二醇上的半胱氨酸残基、接着30个赖氨酸的肽——用于将基因转移到光感受器）、具有细胞穿透性质的肽（参见Johnson, LN等人, Cell-penetrating peptide for enhanced delivery ofnucleic acids and drugs to ocular tissues including retina and cornea.Molecular Therapy, 16(1), 107–114 (2007)（下文称作Johnson等人, 2007）、Barnett,EM等人Selective cell uptake of modified Tat peptide-fluorophore conjugates inrat retina in ex vivo and in vivo models. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 47, 2589–2595 (2006)（下文称作Barnett等人, 2006）、Cashman, SM等人Evidence of protein transduction but not intercellular transport byproteins fused to HIV tat in retinal cell culture and in vivo. Molecular Therapy, 8, 130–142 (2003)（下文称作Cashman等人, 2003）、Schorderet, DF等人D-TATtransporter as an ocular peptide delivery system. Clinical and Experimental Ophthalmology, 33, 628–635 (2005)（下文称作Schorderet等人, 2005）、Kretz, A等人.HSV-1 VP22 augments adenoviral gene transfer to CNS neurons in the retinaand striatum in vivo. Molecular Therapy, 7, 659–669 (2003)（下文称作Kretz等人2003），例如肽递送到视细胞），或包封DNA的lipoplex、polyplex、脂质体或免疫脂质体（参见例如Zhang, Y等人Organ-specific gene expression in the rhesus monkey eyefollowing intravenous nonviral gene transfer. Molecular Vision, 9, 465–472(2003)（下文称作Zhang等人 2003）、Zhu, C,等人Widespread expression of anexogenous gene in the eye after intravenous administration. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 43, 3075–3080 (2002)（下文称作Zhu等人 2002）、Zhu, C.,等人Organ-specific expression of the lacZ gene controlled by theopsin promoter after intravenous gene administration in adult mice. Journal of Gene Medicine, 6, 906–912. (2004)（下文称作Zhu等人 2004））。

在优选实施方案中，该载体是病毒载体，如源自腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒（HSV））的载体。参见例如Howarth。在最优选的实施方案中，该载体是腺相关病毒（AAV）载体。

现在已经识别出腺相关病毒（AAV）的多种血清型，包括12种人类血清型（AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12）和来自非人灵长类的多于100种血清型。Howarth JL等人, Using viral vectors as gene transfer tools.Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010)（下文称作Howarth等人）。在该载体是AAV载体的本发明的实施方案中，AAV载体的反向末端重复（ITR）的血清型可选自任何已知的人类或非人AAV血清型。在优选实施方案中，AAV载体的AAV ITR的血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。此外，在该载体是AAV载体的本发明的实施方案中，该AAV载体的衣壳序列的血清型可选自任何已知的人类或动物AAV血清型。在一些实施方案中，该AAV载体的衣壳序列的血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在优选实施方案中，该衣壳序列的血清型是AAV5。在该载体是AAV载体的一些实施方案中，使用假型化（pseudotyping）法，其中将一种ITR血清型的基因组包装到不同的血清型衣壳中。参见例如Zolutuhkin S.等人Production andpurification of serotype 1,2, and 5 recombinant adeno-associated viralvectors. Methods 28(2): 158-67 (2002)。在优选实施方案中，AAV载体的AAV ITR的血清型和AAV载体的衣壳序列的血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

在该载体是rAAV载体的本发明的一些实施方案中，使用突变体衣壳序列。突变体衣壳序列以及其它技术，如合理诱变（rational mutagenesis）、靶向肽的工程学、嵌合粒子的生成、库和定向进化法，和免疫逃避修饰可在本发明中用于优化AAV载体，以例如实现免疫逃避和增强的治疗输出。参见例如Mitchell A.M.等人AAV’s anatomy: Roadmap foroptimizing vectors for translational success. Curr Gene Ther. 10(5): 319-340。

制备本发明的核酸

本发明的核酸分子（包括例如启动子、CNGB3核酸、CNGA3核酸、GNAT2核酸或调节元件）可以使用标准分子生物学技术分离。使用全部或一部分的感兴趣的核酸序列作为杂交探针，可以使用标准杂交和克隆技术分离核酸分子（例如如Sambrook, J., Fritsh, E. F.和Maniatis, T. 分子克隆，实验手册（Molecular Cloning. A Laboratory Manual）. 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y., 1989中所述）。

用于本发明的方法的核酸分子也可以通过聚合酶链式反应（PCR）分离，所述聚合酶链式反应使用基于感兴趣的核酸分子的序列设计的合成寡核苷酸引物。用于本发明的方法的核酸分子可以使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术扩增。

此外，也可以使用标准技术化学合成与感兴趣的核苷酸序列对应的寡核苷酸。化学合成多聚脱氧核苷酸的许多方法是已知的，包括已在市售DNA合成仪中自动化的固相合成（参见例如Itakura等人美国专利No. 4,598,049；Caruthers等人美国专利No. 4,458,066；和Itakura美国专利No. 4,401,796和4,373,071，经此引用并入本文）。设计合成寡核苷酸的自动化方法是可得的。参见例如Hoover, D.M. & Lubowski, J. Nucleic Acids Research, 30(10): e43 (2002)。

本发明的许多实施方案涉及CNGB3核酸、CNGA3核酸或GNAT2核酸。本发明的一些方面和实施方案涉及其它核酸，如分离的启动子或调节元件。核酸可以是例如cDNA或化学合成核酸。可以例如通过使用聚合酶链式反应（PCR）扩增或通过筛选适当的cDNA库来获得cDNA。或者，可以化学合成核酸。

IV. 本发明的方法和药盒

治疗方法

本发明提供治疗与影响视锥细胞的基因突变、替换或缺失相关的疾病的方法，其中该方法包括给予需要这种治疗的对象包括本发明的启动子之一的载体，由此治疗该对象。在一个优选实施方案中，该疾病是色盲。与影响视锥细胞的基因突变、替换或缺失相关的其它疾病包括色盲、Leber先天性黑蒙、视锥-视杆营养不良、黄斑病变、年龄相关黄斑变性和视网膜色素变性，包括X-连锁视网膜色素变性。

本发明还提供治疗色盲的方法，其包括给予需要这种治疗的对象任何本发明的载体，由此治疗该对象。

要通过本发明的方法治疗的“对象”可以是指人类或非人动物。“非人动物”包括任何脊椎生物或无脊椎生物。在一些实施方案中，非人动物是视网膜疾病的，特别是色盲的动物模型。参见例如Pang等人、Alexander等人、Komaromy等人。各种大型动物模型可用于研究视网膜中的AAV介导的基于基因的疗法。Stieger K.等人AAV-mediated gene therapy forretinal disorders inlarge animal models. ILAR J. 50(2): 206-224 (2009)。上文描述了本发明的启动子。“治疗”疾病（例如，诸如色盲）是指减轻、预防或延迟该疾病的至少一种征兆或症状的发生。疾病的“征兆”是可被其他人观察到或通过客观方法，例如，如视网膜电图学或行为学测试测量出的该疾病的表现。疾病的“症状”是该对象主观察觉到的该疾病的特征。

在这两种治疗方法的任一种中，该载体可以是本领域中已知的任何类型的载体。在一些实施方案中，该载体是非病毒载体，如裸DNA质粒、寡核苷酸（例如，如反义寡核苷酸、小分子RNA（siRNA）、双链寡脱氧核苷酸或单链DNA寡核苷酸）。在涉及寡核苷酸载体的具体实施方案中，可以通过体内电穿孔（参见例如Chalberg等人, 2005）或电子雪崩转染（参见例如Chalberg等人 2006）实现递送。在另一些实施方案中，该载体是可任选包封在水溶性聚合物中的树枝状聚合物/DNA复合物、DNA-压缩（compacting）肽（参见例如Farjo等人2006，其中CK30——含有偶联到聚乙二醇上的半胱氨酸残基、接着30个赖氨酸的肽——用于将基因转移到光感受器）、具有细胞穿透性质的肽（参见Johnson等人2007；Barnett等人,2006；Cashman等人, 2003；Schorder等人, 2005；Kretz等人2003，例如肽递送到视细胞）或包封DNA的lipoplex、polyplex、脂质体或免疫脂质体（参见例如Zhang等人2003；Zhu等人2002；Zhu等人2004）。在许多另外的实施方案中，该载体是病毒载体，如源自腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒（HSV））的载体。参见例如Howarth。在优选实施方案中，该载体是腺相关病毒（AAV）载体。

在本发明的治疗方法中，可以通过本领域中已知的任何手段实现载体的给药。在优选实施方案中，该给药是通过视网膜下注射。在某些实施方案中，该视网膜下注射先递送到一个或多个区域，在此视锥密度特别高（例如绒毡区优于视神经盘）。在其它实施方案中，该给药是通过眼球内注射、玻璃体内注射或静脉注射。向视网膜给药载体可以是单侧或双侧的，并可以借助或不借助全身麻醉实现。

在本发明的治疗方法中，可以基于接受治疗的对象的特征，如对象的年龄和该载体递送至的区域的体积确定递送的载体体积。已知的是，眼睛尺寸和视网膜下腔的体积在个体中不同，并可随对象的年龄而变。在该载体在视网膜下给药的实施方案中，可以选择载体体积以便覆盖视网膜下腔的全部或一定百分比，或以便递送特定数量的载体基因组。

在本发明的治疗方法中，给予的载体浓度可取决于制备方法而有所不同，并可基于被确定为在治疗上对特定给药途径有效的浓度选择或优化。在一些实施方案中，每毫升的载体基因组浓度（vg/ml）选自大约10⁸ vg/ml、大约10⁹ vg/ml、大约10¹⁰vg/ml、大约10¹¹vg/ml、大约10¹² vg/ml、大约10¹³vg/ml和大约10¹⁴ vg/ml。在优选实施方案中，该浓度在10¹⁰ vg/ml - 10¹³vg/ml的范围内，以大约0.1毫升、大约0.2毫升、大约0.4毫升、大约0.6毫升、大约0.8毫升和大约1.0毫升的体积通过视网膜下注射或玻璃体内注射递送。`

药盒

本发明还提供药盒。一方面，本发明的药盒包含载体，所述载体包含(a) 本发明的任一启动子和(b) 其使用说明书。另一方面，本发明的药盒包含(a) 本发明的任一载体，和(b) 其使用说明书。上文描述了本发明的启动子和载体。在一些实施方案中，本发明的载体可以是本领域中已知的任何类型的载体，包括如上所述的非病毒或病毒载体。在优选实施方案中，该载体是病毒载体，如源自腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒（HSV））的载体。在最优选的实施方案中，该载体是腺相关病毒（AAV）载体。

随该药盒提供的说明书可以描述如何将启动子并入载体中或如何为治疗用途（例如为了治疗与影响视锥细胞的基因突变、替换或缺失相关的疾病）给予该载体。在该药盒用于治疗用途的一些实施方案中，该说明书包括关于推荐剂量和给药途径的细节。

制备重组腺相关病毒载体（AAV载体）的方法

本发明还提供制备重组腺相关病毒（rAAV）载体的方法，其包括在腺相关病毒载体中插入本发明的任一启动子（在上文中描述）和选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸（也在上文中描述）。在一些实施方案中，该核酸是人类核酸，即源自人类CNGB3、CNGA或GNAT基因的核酸，或其功能变体。在替代的实施方案中，该核酸是源自非人类基因的核酸。

在本发明的提供的制备rAAV载体的方法中，所述AAV载体的衣壳序列的血清型和ITR的血清型独立地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。因此，本发明包括使用假型化（pseudotyping）法的载体，其中将一种ITR血清型的基因组包装到不同的血清型衣壳中。参见例如Daya S.和Berns, K.I., Gene therapyusing adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews, 21(4):583-593 (2008)（下文称作Daya等人）。此外，在一些实施方案中，该衣壳序列是突变体衣壳序列。

AAV载体

AAV载体源自腺相关病毒，该病毒因最初被描述为腺病毒制备物的污染物而得名。AAV载体与其它类型的载体相比提供许多公知的优点：野生型病毒株感染人类和非人灵长类而没有表现出疾病或不利影响；AAV衣壳表现出极低的免疫原性以及化学和物理高度稳定性，这允许使用严格的病毒纯化和浓缩方法；AAV载体转导造成有丝分裂后的非分裂细胞中的持续转基因表达并提供长期的功能增益；AAV亚型和变体的多样化提供靶向所选组织和细胞类型的可能性。Heilbronn R & Weger S, Viral Vectors for Gene Transfer:Current Status of Gene Therapeutics, in M. Schäfer-Korting (编辑), DrugDelivery, Handbook of Experimental Pharmacology, 197: 143-170 (2010)（下文称作Heilbronn）。AAV载体的主要限制在于对于含有单链DNA的传统载体，AAV仅提供有限的转基因容量（<4.9 kb）。

AAV是无包膜的含单链DNA的小病毒，其被20纳米直径的二十面体衣壳包裹。在AAV的大多数早期研究中使用人血清型AAV2。Heilbronn。其含有4.7 kb的线性单链DNA基因组，具有两个开放阅读框rep和cap（“rep”代表复制且“cap”代表衣壳）。Rep编码四个重叠的非结构蛋白质：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV生命周期的大多数步骤需要Rep78和Rep69，包括引发在发夹结构化反向末端重复（ITR）处的AAV DNA复制——这是AAV载体生产的重要步骤。cap基因编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。Rep和cap的侧面是145 bp ITR。ITR含有DNA复制的起点和包装信号，且它们用于介导染色体整合。ITR通常是保持在AAV载体构造中的仅有AAV元件。

为了实现复制，AAV必须与辅助病毒同时感染到靶细胞中。Grieger JC &Samulski RJ, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vectordevelopment, production, and clinical applications. Adv Biochem Engin/ Biotechnol 99:119-145 (2005)。通常，辅助病毒是腺病毒（Ad）或单纯疱疹病毒（HSV）。在不存在辅助病毒的情况下，AAV可以通过整合到人类染色体19上的位点中来建立潜伏感染。被AAV潜伏感染的细胞的Ad或HSV感染会使整合基因组复苏并开始生产性感染。辅助功能所需的四种Ad蛋白质是E1A、E1B、E4和E2A。此外，需要Ad病毒相关（VA）RNA的合成。疱疹病毒也可充当用于生产性AAV复制的辅助病毒。编码解旋酶-引物酶复合物（UL5、UL8和UL52）和DNA-结合蛋白（UL29）的基因已被发现足以介导HSV辅助作用。在使用rAAV载体的本发明的一些实施方案中，该辅助病毒是腺病毒。在使用rAAV载体的其它实施方案中，该辅助病毒是HSV。

制备重组AAV（rAAV）载体

可以使用本领域中已知的任何方法进行本发明的rAAV载体的生产、纯化和表征。关于实验室规模生产方法的综述，参见例如Clark RK, Recent advances in recombinantadeno-associated virus vector production. Kidney Int. 61s:9-15 (2002)；Choi VW等人, Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitroand in vivo use. Current Protocols in Molecular Biology 16.25.1-16.25.24(2007)（下文称作Choi等人）；Grieger JC & Samulski RJ, Adeno-associated virus asa gene therapy vector: Vector development, production, and clinicalapplications. Adv Biochem Engin/Biotechnol 99:119-145 (2005)（下文称作Grieger& Samulski）；Heilbronn R & Weger S, Viral Vectors for Gene Transfer: CurrentStatus of Gene Therapeutics, in M. Schäfer-Korting (ed.), Drug Delivery,Handbook of Experimental Pharmacology, 197: 143-170 (2010)（下文称作Heilbronn）；Howarth JL等人, Using viral vectors as gene transfer tools. Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010)（下文称作Howarth）。下述生产方法意在作为非限制性实例。

可以通过包装质粒的共转染实现AAV载体生产。Heilbronn。细胞系供应缺失AAV基因rep和cap和所需的辅助病毒功能。腺病毒辅助基因VA-RNA、E2A和E4与AAV rep和cap基因一起转染，分别在两个分开的质粒上或在单个辅助构建物上。也转染重组AAV载体质粒，其中用被ITR包括的转基因表达盒（包含感兴趣的基因，例如CNGB3核酸；启动子；和最小调节元件）替代AAV衣壳基因。这些包装质粒通常转染到293个细胞中——在组成上表达其余所需Ad辅助基因E1A和E1B的人类细胞系。这导致携带有感兴趣的基因的AAV载体的扩增和包装。

现在已经识别出AAV的多种血清型，包括12种人类血清型和来自非人灵长类的多于100种血清型。Howarth等人。本发明的AAV载体可包含源自任何已知血清型的AAV的衣壳序列。本文所用的“已知血清型”包含可使用本领域中已知的方法制成的衣壳突变体。这样的方法包括例如，病毒衣壳序列的遗传操作、不同血清型的衣壳区的暴露表面的结构域交换，和使用如标记获救之类的技术生成AAV嵌合体。参见Bowles等人Marker rescue ofadeno-associated virus (AAV) capsid mutants: A novel approach for chimericAAV production. Journal of Virology, 77(1): 423-432 (2003)以及其中引用的参考资料。此外，本发明的AAV载体可包含源自任何已知血清型的AAV的ITR。优先地，该ITR源自人类血清型AAV1-AAV12之一。在本发明的一些实施方案中，使用假型化（pseudotyping）法，其中将一种ITR血清型的基因组包装到不同的血清型衣壳中。

优先地，本发明中所用的衣壳序列源自人类血清型AAV1-AAV12之一。含有AAV5血清型衣壳序列的重组AAV载体已被证实在体内靶向视网膜细胞。参见例如Komaromy等人。因此，在本发明的优选实施方案中，该AAV载体的衣壳序列的血清型是AAV5。在其它实施方案中，该AAV载体的衣壳序列的血清型是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12。即使该衣壳序列的血清型没有天然靶向视网膜细胞，也可以使用其它特异性组织靶向法。参见Howarth等人。例如，可以通过病毒衣壳序列的遗传操作（特别是在AAV三维结构的环出（looped out）区中），或通过不同血清型的衣壳区的暴露表面的结构域交换，或通过使用如标记获救之类的技术生成AAV嵌合体来直接靶向重组AAV载体。参见Bowles等人Marker rescue of adeno-associated virus (AAV) capsid mutants: Anovel approach for chimeric AAV production. Journal of Virology, 77(1): 423-432 (2003)以及其中引用的参考资料。

在Choi等人中提供了用于生产、纯化和表征重组AAV（rAAV）载体的一种可能的方法。通常，涉及下列步骤：设计转基因表达盒、设计靶向特异性受体的衣壳序列、生成无腺病毒的rAAV载体、纯化和滴定。这些步骤概述在下文中并详细描述在Choi等人中。

该转基因表达盒可以是单链AAV（ssAAV）载体或作为假双链转基因包装的“二聚”或自补AAV（scAAV）载体。Choi等人；Heilbronn；Howarth。使用传统ssAAV载体由于需要将单链AAV DNA转化成双链DNA而通常导致基因表达缓慢开始（需要数天至数周达到转基因表达的平稳期）。相反，scAAV载体显示在数小时内开始基因表达，这在静止期细胞转导后数天内达到平稳期。Heilbronn。但是，scAAV载体的包装容量为传统ssAAV载体的大约一半。Choi等人。或者，该转基因表达盒可以分成两种AAV载体，这能够递送更长的构建物。参见例如Daya等人。可以通过用限制性核酸内切酶消化适当的质粒（例如，诸如含有hCNGB3基因的质粒）以除去rep和cap片段并凝胶纯化含有AAVwt-ITR的质粒骨架来构建ssAAV载体。Choi等人。随后，可以在适当的限制位点之间插入所需转基因表达盒以构建单链rAAV载体质粒。可以如Choi等人所述构建scAAV载体。

然后，可以通过双CsCl梯度分级纯化rAAV载体和合适的AAV辅助质粒和pXX6 Ad辅助质粒的大规模质粒制备物（至少1毫克）。Choi等人。合适的AAV辅助质粒可选自pXR系列的pXR1-pXR5，它们分别能将AAV2 ITR基因组交叉包装（cross-packaging）到AAV血清型1至5的衣壳中。可以基于衣壳靶向感兴趣细胞的效率选择适当的衣壳。例如，在本发明的一个优选实施方案中，rAAV载体的衣壳序列的血清型是AAV5，因为这种类型的衣壳已知有效靶向视网膜细胞。可以使用改变基因组（即转基因表达盒）长度和AAV衣壳的已知方法改进表达和/或基因转移至特定细胞类型（例如视锥细胞）。参见例如Yang GS, Virus-mediatedtransduction of murine retina with adeno-associated virus: Effects of viralcapsid and genome size. Journal of Virology, 76(15): 7651-7660。

接着，用pXX6辅助质粒、rAAV载体质粒和AAV辅助质粒转染293个细胞。Choi等人。随后，对分级的细胞裂解液施以rAAV纯化、接着CsCl梯度纯化或肝素琼脂糖柱纯化的多步法。可以使用斑点印记测定法测定rAAV病毒粒子的生产和量化。rAAV在细胞培养物中的体外转导可用于检验病毒的感染性和表达盒的功能。

除Choi等人描述的方法外，在本发明上下文中可以使用各种其它转染方法生产AAV。例如，可利用瞬时转染法，包括依赖于磷酸钙沉淀步骤的方法。

除用于生产rAAV载体的实验室规模方法外，本发明可以使用本领域中已知的技术以生物反应器规模制备AAV载体，包括例如Heilbronn；Clement, N.等人Large-scaleadeno-associated viral vector production using a herpesvirus-based systemenables manufacturing for clinical studies. Human Gene Therapy, 20: 796-606。

通过下列实施例进一步例示本发明，它们不应被解释为进一步限制。本申请通篇以及附图中引用的所有图和所有参考资料、专利和公开专利申请的内容全文经此引用并入本文。

实施例

实施例1: PR2.1启动子的更短形式的制备和测试

材料和方法

图2显示含有AAV 末端重复（TR）、PR2.1启动子和hCMGB3转基因的前病毒质粒的示意图。通过从PR2.1的5’端开始进行截短，缩短PR2.1启动子。PR2.1的500 bp核心启动子和600 bp基因座控制区（LCR）保持完好。制备PR2.1启动子的三种缩短形式：PR1.7、PR1.5和PR1.1。通过在PR2.1的5’-端分别截短大约300 bp、500 bp和1,100 bp，制备PR1.7、PR1.5和PR1.1。

SEQ ID NO: 1相当于PR1.1启动子

SEQ ID NO: 2相当于PR1.5启动子

SEQ ID NO: 3相当于PR1.7启动子

SEQ ID NO: 4相当于PR2.1启动子

将CMV增强子添加到PR1.1的5’端以产生杂合启动子。如图3中所示，制备含有各启动子的前病毒质粒。这些前病毒质粒(p)含有AAV末端重复(TR)、合成启动子(PR2.1-syn)或其截短形式、具有或没有CMV增强子(CMVenh)，和绿色荧光蛋白(GFP)转基因。构建下列四种前病毒质粒并测序：

(1) pTR-PR2.1syn-GFP

(2) pTR-PR1.8-GFP

(3) pTR-PR1.6-GFP

(4) pTR-CMVenh-PR1.1-GFP

为了构建pTR-PR2.1syn-GFP，首先由pTR-CBA-hRS1通过用hGFP序列替代CBA和hRS1序列构建亲本质粒pTR-CMVenh-hGFP。由该来源用两端（Not I和BspHI）都具有核酸内切酶限制位点的寡核苷酸引物进行PCR扩增人类GFP（hGFP）DNA序列，用Not I /BspHI消化，并连接到pTR-CBA-hRS1质粒中，所述质粒已用NotI/NcoI消化以除去所有不必要的DNA序列，包括鸡β肌动蛋白启动子和hRS1（但不是CMV增强子）。所得质粒pTR-CMVenh-hGFP含有CMV增强子、hGFP开放阅读框（ORF）和SV40 poly (A)序列，其在侧面具有AAV2 ITR。根据人类感红锥视蛋白的DNA序列5’合成PR2.1 DNA序列（Wang Y.等人, A locus controlregion adjacent to the human red and green visual pigment genes, Neuron, 第9卷, 第429-440页, 1992）。该合成PR2.1由连接到碱基-496至0上的跨越-4564至-3009的碱基构成，并含有人类L和M视蛋白基因的表达都必需的LCR（Komaromy AM等人, Targetinggene expression to cones with human cone opsin promoters in recombinant AAV,Gene Therapy, 第15卷, 第1049-1055页, 2008）。此外，将97碱基对SV40剪接供体/剪接受体（SD/SA）连接到PR2.1启动子的末端。将包括SD/SA序列的合成PR2.1插入pJ206克隆载体中以生成pJ206-PR2.1syn。通过HindIII/Acc65I消化从pJ206-PR2.1syn中释放PR2.1synDNA序列，包括SV40 SD/SA序列，并插入已用HindIII/Acc65I消化以除去不必要的CMV增强子序列的pTR-CMVenh-hGFP中以生成质粒pTR-PR2.1syn-hGFP。

为了构建具有PR2.1启动子的更短形式的质粒，由pJ206-PR2.1syn 进行PCR扩增从PR2.1的5’端截短300 bp、500 bp或1,100 bp的PR2.1序列。设计四种寡核苷酸引物：

1) PR right-Hind: 5’-GATTTAAGCTTGCGGCCGCGGGTACAATTCCGCAGCTTTTAGAG-3’；

2) PR1.1 Left-Hind: 5’-CTGCAAGCTTGTGGGACCACAAATCAG-3’；

3) PR1.5 Left-Acc65I: 5’- TAGCGGTACCAGCCATCGGCTGTTAG-3’；和

4) PR1.7 left-Acc65I: 5’-GTGGGTACCGGAGGCTGAGGGGTG-3’。引物PR right-Hind与其它三种引物配对以分别PCR扩增PR1.1、PR1.5和PR1.7。Pfu Ultra HS聚合酶混合物用于95℃热循环，持续5分钟，然后进行94℃ 1分钟、58℃ 45秒和72℃ 2分钟的35个循环。

由pJ206-PR2.1syn使用PR right-Hind和PR1.1-left-Hind的引物组扩增PR1.1。扩增的DNA用HindIII消化并插入已用HindIII消化的pTR-CMVenh-hGFP中以生成质粒pTR-CMVenh-PR1.1-hGF。

由pJ206-PR2.1syn使用PR right-Hind和PR1.5-left-Acc65I的引物组扩增PR1.5。扩增的DNA用HindIII/Acc65I消化并插入已用HindIII/Acc65I消化的pTR-CMVenh-hGFP中以生成质粒pTR-PR1.5-hGFP。

由pJ206-PR2.1syn使用PR right-Hind和PR1.7-left-Acc65I的引物组扩增PR1.7。扩增的DNA用HindIII/Acc65I消化并插入已用HindIII/Acc65I消化的pTR-CMVenh-hGFP中以生成质粒pTR-PR1.7-hGFP。

通过DNA测序证实包括启动子和hGFP的表达盒的DNA序列，并通过SmaI限制性内切图谱法证实TRs的位置。

为了检查PR2.1启动子对RNA转录和随后的蛋白质表达是否是功能性的，将人视网膜色素上皮（RPE）细胞系APRE-19和人胚肾HEK293细胞接种在6孔板中（每孔5 x10⁵个细胞），然后用来自六种质粒的每种的1微克DNA转染：pTR-CMVenh-PR1.1-GFP、pTR-PR1.5-GFP、pTR-PR1.7-GFP、pTR-PR2.1syn-GFP、pTR-PR2.1-GFP（对照物）或pTR-smCBA-GFP（阳性对照）。转染的细胞在37℃、5%CO2培养器中培养4天。在培养期间，通过荧光显微术检查转染细胞的GFP表达。

结果

所有四种质粒的DNA测序和限制性内切图谱法证实这些前病毒质粒的序列和TRs是正确的。

使用ARPE-19和HEK293细胞的体外分析发现，这些细胞系无一支持PR2.1启动子的功能。在转染后24小时，在用来自pTR-smCBA-GFP（阳性对照）的DNA转染的细胞中观察到强GFP表达。在转染后48小时，在用来自pTR-CMVenh-PR1.1-GFP的DNA转染的细胞中观察到弱GFP表达。在所有其它孔，即用来自pTR-PR1.5-GFP、pTR-PR1.7-GFP、pTR-PR2.1syn-GFP或pTR-PR2.1-GFP的DNA转染的那些中没有观察到表达GFP的细胞。质粒pTR-PR2.1-GFP含有已知对体内RNA转录和随后的GFP表达具有功能性的全长PR2.1启动子（Komaromy AM等人,Targeting gene expression to cones with human cone opsin promoters inrecombinant AAV, Gene Therapy, 第15卷, 第1049-1055页, 2008）。因此这些结果表明ARPE-19细胞系不支持PR2.1启动子，也不支持PR2.1启动子的任何其它更短的形式。来自pTR-CMVenh-PR1.1-GFP转染细胞的GFP的弱表达最可能归因于CMV增强子，其极大提高PR1.1启动子的强度。

进行进一步研究以使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的rAAV载体评估PR1.1、PR1.5、PR1.7和PR2.1靶向小鼠视锥的效率和特异性。

将这些构建物包装在rAAV衣壳中并在小鼠模型中体内测试。如图5和6中所示，通过标准质粒转染法制备四种rAAV载体，即rAAV5-CMVenh-PR1.1-GFP、rAAV5-PR1.5-GFP、rAAV5-PR1.7-GFP和rAAV5-PR2.1-GFP。通过细胞溶解收获已包装在转染细胞中的rAAV载体，然后通过碘克沙醇（IDX）梯度、接着Q Sepharose HP柱色谱法纯化，并配制在Alcon BSS溶液中。然后通过视网膜下注射（1微升）到正常小鼠的双眼中（每种载体5只小鼠）。在注射后六周，处死小鼠，摘出眼睛并制备视网膜切片。载玻片用DAPI染色以识别核并对GFP和PNA（视锥光感受器的标记）免疫染色。结果显示在图5和6中。在接收含有四种启动子（即PR1.1、PR1.5、PR1.7或PR2.1）之一的rAAV5-GFP载体的眼睛的光感受器（视锥和视杆）中检测GFP蛋白表达。其中，PR1.5是相对较弱的启动子，PR1.1是强启动子，但在RPE细胞中具有脱靶GFP表达。总体而言，PR1.7在强度（视锥中的GFP表达水平的分数都是+++）和细胞类型特异性（靶向视锥以及视杆，但不靶向RPE细胞）方面与PR2.1启动子相当。

实施例2: 在非人灵长类中的评估

使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的rAAV载体进行进一步研究，以通过比较它们靶向非人灵长类（NHP）中的L、M和S视锥的效率和特异性来评估三种视锥特异性启动子和三种AAV衣壳血清型。在第一个研究中，六只食蟹猴（cynomolgus macaque）接收含有PR1.7、CSP或PR2.1启动子的AAV2tYF-GFP的双侧视网膜下注射。各眼睛接受浓度为5 x10¹¹ vg/mL的0.1毫升AAV载体的两次注射（两次0.05 mL气泡（blebs）/眼睛，1 x 10¹¹ vg/眼睛）。在治疗后12周，获得视网膜组织以进行定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）和免疫组织化学。发现含有PR1.7启动子的载体在所有NHP眼睛中的视网膜下气泡区中的所有三种类型的视锥中都获得稳健和特异性靶向GFP-报告基因表达（等级3）。图7显示存活眼底自发荧光成像（FAF）以检测眼睛中的荧光团（GFP）存在的结果。在PR2.1启动子组中在视网膜下气泡区中看出GFP的可变染色（等级0、1或2）并在接收CSP启动子组的任何眼睛中不存在GFP标记（等级0）（图8，下表1）。表1是在启动子选择研究中本文所述的免疫组织化学评级的概要。在表1中，将GFP表达分级为0（无染色）、1（轻微染色）、2（中等染色）和3（强染色）。

表1

总体而言，这些实验的结果表明，缩短的PR1.7在小鼠中的强度和特异性与PR2.1相当。发现PR1.7启动子在感红/感绿和感蓝视锥中引导最高表达水平。CNGB3天然启动子已被确定为小鼠中的强RPE特异性启动子。

等同方案

本领域技术人员会认识到或仅用常规实验就能确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。下列权利要求书意在包含这样的等同方案。

序列表

<110> 应用遗传科技公司

<120> 用于治疗色盲和其它疾病的启动子、表达盒、载体、药盒和方法

<130> 119561-00620

<140> PCT/US2014/036792

<141> 2014-05-05

<150> 61/824,071

<151> 2013-05-16

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

多核苷酸

<400> 1

gtgggaccac aaatgagttt tcacctggcc tggggacaca cgtgccccca caggtgctga 60

gtgactttct aggacagtaa tctgctttag gctaaaatgg gacttgatct tctgttagcc 120

ctaatcatca attagcagag ccggtgaagg tgcagaacct accgcctttc caggcctcct 180

cccacctctg ccacctccac tctccttcct gggatgtggg ggctggcaca cgtgtggccc 240

agggcattgg tgggattgca ctgagctggg tcattagcgt aatcctggac aagggcagac 300

agggcgagcg gagggccagc tccggggctc aggcaaggct gggggcttcc cccagacacc 360

ccactcctcc tctgctggac ccccacttca tagggcactt cgtgttctca aagggcttcc 420

aaatagcatg gtggccttgg atgcccaggg aagcctcaga gttgcttatc tccctctaga 480

cagaagggga atctcggtca agagggagag gtcgccctgt tcaaggccac ccagccagct 540

catggcggta atgggacaag gctggccagc catcccaccc tcagaaggga cccggtgggg 600

caggtgatct cagaggaggc tcacttctgg gtctcacatt cttggatccg gttccaggcc 660

tcggccctaa atagtctccc tgggctttca agagaaccac atgagaaagg aggattcggg 720

ctctgagcag tttcaccacc caccccccag tctgcaaatc ctgacccgtg ggtccacctg 780

ccccaaaggc ggacgcagga cagtagaagg gaacagagaa cacataaaca cagagagggc 840

cacagcggct cccacagtca ccgccacctt cctggcgggg atgggtgggg cgtctgagtt 900

tggttcccag caaatccctc tgagccgccc ttgcgggctc gcctcaggag caggggagca 960

agaggtggga ggaggaggtc taagtcccag gcccaattaa gagatcaggt agtgtagggt 1020

ttgggagctt ttaaggtgaa gaggcccggg ctgatcccac aggccagtat aaagcgccgt 1080

gaccctcagg tgatgcgcca gggccggctg ccgtcgggga cagggctttc catagccatg 1140

<210> 2

<211> 1513

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

多核苷酸

<400> 2

agccatcggc tgttagtgac aaagcccctg agtcaagatg acagcagccc ccataactcc 60

taatcggctc tcccgcgtgg agtcatttag gagtagtcgc attagagaca agtccaacat 120

ctaatcttcc accctggcca gggccccagc tggcagcgag ggtgggagac tccgggcaga 180

gcagagggcg ctgacattgg ggcccggcct ggcttgggtc cctctggcct ttccccaggg 240

gccctctttc cttggggctt tcttgggccg ccactgctcc cgctcctctc cccccatccc 300

accccctcac cccctcgttc ttcatatcct tctctagtgc tccctccact ttcatccacc 360

cttctgcaag agtgtgggac cacaaatgag ttttcacctg gcctggggac acacgtgccc 420

ccacaggtgc tgagtgactt tctaggacag taatctgctt taggctaaaa tgggacttga 480

tcttctgtta gccctaatca tcaattagca gagccggtga aggtgcagaa cctaccgcct 540

ttccaggcct cctcccacct ctgccacctc cactctcctt cctgggatgt gggggctggc 600

acacgtgtgg cccagggcat tggtgggatt gcactgagct gggtcattag cgtaatcctg 660

gacaagggca gacagggcga gcggagggcc agctccgggg ctcaggcaag gctgggggct 720

tcccccagac accccactcc tcctctgctg gacccccact tcatagggca cttcgtgttc 780

tcaaagggct tccaaatagc atggtggcct tggatgccca gggaagcctc agagttgctt 840

atctccctct agacagaagg ggaatctcgg tcaagaggga gaggtcgccc tgttcaaggc 900

cacccagcca gctcatggcg gtaatgggac aaggctggcc agccatccca ccctcagaag 960

ggacccggtg gggcaggtga tctcagagga ggctcacttc tgggtctcac attcttggat 1020

ccggttccag gcctcggccc taaatagtct ccctgggctt tcaagagaac cacatgagaa 1080

aggaggattc gggctctgag cagtttcacc acccaccccc cagtctgcaa atcctgaccc 1140

gtgggtccac ctgccccaaa ggcggacgca ggacagtaga agggaacaga gaacacataa 1200

acacagagag ggccacagcg gctcccacag tcaccgccac cttcctggcg gggatgggtg 1260

gggcgtctga gtttggttcc cagcaaatcc ctctgagccg cccttgcggg ctcgcctcag 1320

gagcagggga gcaagaggtg ggaggaggag gtctaagtcc caggcccaat taagagatca 1380

ggtagtgtag ggtttgggag cttttaaggt gaagaggccc gggctgatcc cacaggccag 1440

tataaagcgc cgtgaccctc aggtgatgcg ccagggccgg ctgccgtcgg ggacagggct 1500

ttccatagcc atg 1513

<210> 3

<211> 1727

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

多核苷酸

<400> 3

ggaggctgag gggtggggaa agggcatggg tgtttcatga ggacagagct tccgtttcat 60

gcaatgaaaa gagtttggag acggatggtg gtgactggac tatacactta cacacggtag 120

cgatggtaca ctttgtatta tgtatatttt accacgatct ttttaaagtg tcaaaggcaa 180

atggccaaat ggttccttgt cctatagctg tagcagccat cggctgttag tgacaaagcc 240

cctgagtcaa gatgacagca gcccccataa ctcctaatcg gctctcccgc gtggagtcat 300

ttaggagtag tcgcattaga gacaagtcca acatctaatc ttccaccctg gccagggccc 360

cagctggcag cgagggtggg agactccggg cagagcagag ggcgctgaca ttggggcccg 420

gcctggcttg ggtccctctg gcctttcccc aggggccctc tttccttggg gctttcttgg 480

gccgccactg ctcccgctcc tctcccccca tcccaccccc tcaccccctc gttcttcata 540

tccttctcta gtgctccctc cactttcatc cacccttctg caagagtgtg ggaccacaaa 600

tgagttttca cctggcctgg ggacacacgt gcccccacag gtgctgagtg actttctagg 660

acagtaatct gctttaggct aaaatgggac ttgatcttct gttagcccta atcatcaatt 720

agcagagccg gtgaaggtgc agaacctacc gcctttccag gcctcctccc acctctgcca 780

cctccactct ccttcctggg atgtgggggc tggcacacgt gtggcccagg gcattggtgg 840

gattgcactg agctgggtca ttagcgtaat cctggacaag ggcagacagg gcgagcggag 900

ggccagctcc ggggctcagg caaggctggg ggcttccccc agacacccca ctcctcctct 960

gctggacccc cacttcatag ggcacttcgt gttctcaaag ggcttccaaa tagcatggtg 1020

gccttggatg cccagggaag cctcagagtt gcttatctcc ctctagacag aaggggaatc 1080

tcggtcaaga gggagaggtc gccctgttca aggccaccca gccagctcat ggcggtaatg 1140

ggacaaggct ggccagccat cccaccctca gaagggaccc ggtggggcag gtgatctcag 1200

aggaggctca cttctgggtc tcacattctt ggatccggtt ccaggcctcg gccctaaata 1260

gtctccctgg gctttcaaga gaaccacatg agaaaggagg attcgggctc tgagcagttt 1320

caccacccac cccccagtct gcaaatcctg acccgtgggt ccacctgccc caaaggcgga 1380

cgcaggacag tagaagggaa cagagaacac ataaacacag agagggccac agcggctccc 1440

acagtcaccg ccaccttcct ggcggggatg ggtggggcgt ctgagtttgg ttcccagcaa 1500

atccctctga gccgcccttg cgggctcgcc tcaggagcag gggagcaaga ggtgggagga 1560

ggaggtctaa gtcccaggcc caattaagag atcaggtagt gtagggtttg ggagctttta 1620

aggtgaagag gcccgggctg atcccacagg ccagtataaa gcgccgtgac cctcaggtga 1680

tgcgccaggg ccggctgccg tcggggacag ggctttccat agccatg 1727

<210> 4

<211> 2064

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

多核苷酸

<400> 4

cccctacagc agccagggtg agattatgag gctgagctga gaatatcaag actgtaccga 60

gtagggggcc ttggcaagtg tggagagccc ggcagctggg gcagagggcg gagtacggtg 120

tgcgtttacg gacctcttca aacgaggtag gaaggtcaga agtcaaaaag ggaacaaatg 180

atgtttaacc acacaaaaat gaaaatccaa tggttggata tccattccaa atacacaaag 240

gcaacggata agtgatccgg gccaggcaca gaaggccatg cacccgtagg attgcactca 300

gagctcccaa atgcatagga atagaagggt gggtgcagga ggctgagggg tggggaaagg 360

gcatgggtgt ttcatgagga cagagcttcc gtttcatgca atgaaaagag tttggagacg 420

gatggtggtg actggactat acacttacac acggtagcga tggtacactt tgtattatgt 480

atattttacc acgatctttt taaagtgtca aaggcaaatg gccaaatggt tccttgtcct 540

atagctgtag cagccatcgg ctgttagtga caaagcccct gagtcaagat gacagcagcc 600

cccataactc ctaatcggct ctcccgcgtg gagtcattta ggagtagtcg cattagagac 660

aagtccaaca tctaatcttc caccctggcc agggccccag ctggcagcga gggtgggaga 720

ctccgggcag agcagagggc gctgacattg gggcccggcc tggcttgggt ccctctggcc 780

tttccccagg ggccctcttt ccttggggct ttcttgggcc gccactgctc ccgctcctct 840

ccccccatcc caccccctca ccccctcgtt cttcatatcc ttctctagtg ctccctccac 900

tttcatccac ccttctgcaa gagtgtggga ccacaaatga gttttcacct ggcctgggga 960

cacacgtgcc cccacaggtg ctgagtgact ttctaggaca gtaatctgct ttaggctaaa 1020

atgggacttg atcttctgtt agccctaatc atcaattagc agagccggtg aaggtgcaga 1080

acctaccgcc tttccaggcc tcctcccacc tctgccacct ccactctcct tcctgggatg 1140

tgggggctgg cacacgtgtg gcccagggca ttggtgggat tgcactgagc tgggtcatta 1200

gcgtaatcct ggacaagggc agacagggcg agcggagggc cagctccggg gctcaggcaa 1260

ggctgggggc ttcccccaga caccccactc ctcctctgct ggacccccac ttcatagggc 1320

acttcgtgtt ctcaaagggc ttccaaatag catggtggcc ttggatgccc agggaagcct 1380

cagagttgct tatctccctc tagacagaag gggaatctcg gtcaagaggg agaggtcgcc 1440

ctgttcaagg ccacccagcc agctcatggc ggtaatggga caaggctggc cagccatccc 1500

accctcagaa gggacccggt ggggcaggtg atctcagagg aggctcactt ctgggtctca 1560

cattcttgga tccggttcca ggcctcggcc ctaaatagtc tccctgggct ttcaagagaa 1620

ccacatgaga aaggaggatt cgggctctga gcagtttcac cacccacccc ccagtctgca 1680

aatcctgacc cgtgggtcca cctgccccaa aggcggacgc aggacagtag aagggaacag 1740

agaacacata aacacagaga gggccacagc ggctcccaca gtcaccgcca ccttcctggc 1800

ggggatgggt ggggcgtctg agtttggttc ccagcaaatc cctctgagcc gcccttgcgg 1860

gctcgcctca ggagcagggg agcaagaggt gggaggagga ggtctaagtc ccaggcccaa 1920

ttaagagatc aggtagtgta gggtttggga gcttttaagg tgaagaggcc cgggctgatc 1980

ccacaggcca gtataaagcg ccgtgaccct caggtgatgc gccagggccg gctgccgtcg 2040

gggacagggc tttccatagc catg 2064

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

引物

<400> 5

gatttaagct tgcggccgcg ggtacaattc cgcagctttt agag 44

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

引物

<400> 6

ctgcaagctt gtgggaccac aaatcag 27

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

引物

<400> 7

tagcggtacc agccatcggc tgttag 26

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

引物

<400> 8

gtgggtaccg gaggctgagg ggtg 24

Claims

1.一种核酸，其包含视锥细胞特异性启动子PR 2.1的部分。

2.权利要求1的核酸，其包含序列SEQ ID NO: 4。

3.权利要求1的核酸，其中PR2.1在5’或3’端截短。

4.权利要求3的核酸，其中所述截短为大约100个碱基对至1,500个碱基对。

5.权利要求3的核酸，其中所述截短为在5’端的大约300个碱基对。

6.权利要求3的核酸，其中所述截短为在5’端的大约500个碱基对。

7.权利要求3的核酸，其中所述截短为在5’端的大约1,1000个碱基对。

8.权利要求3的核酸，其中所述截短为在3’端的大约300个碱基对。

9.权利要求3的核酸，其中所述截短为在3’端的大约500个碱基对。

10.权利要求3的核酸，其中所述截短为在3’端的大约1,1000个碱基对。

11.权利要求5的核酸，其包含SEQ ID NO:3。

12.权利要求6的核酸，其包含SEQ ID NO:2。

13.权利要求7的核酸，其包含SEQ ID NO:1。

14.一种核酸，其包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

15.一种核酸，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

16.一种核酸，其包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

17.一种核酸，其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列至少85%一致的核苷酸序列。

18.权利要求1-17任一项的核酸，其中所述启动子能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGB3表达。

19.权利要求1-17任一项的核酸，其中所述启动子能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGA3表达。

20.权利要求1-17任一项的核酸，其中所述启动子能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的GNAT2表达。

21.一种重组腺相关（rAAV）表达载体，其包含可操作地连接到权利要求1-17任一项的核酸上的靶核酸序列。

22.权利要求21的表达载体，其中rAAV是血清型1。

23.权利要求21的表达载体，其中rAAV是血清型2。

24.权利要求21的表达载体，其中rAAV是血清型5。

25.权利要求21的表达载体，其中rAAV包含在AAV病毒粒子内。

26.权利要求21的表达载体，其中所述靶核酸序列编码环核苷酸门控通道亚基B（CNGB3）多肽。

27.权利要求26的表达载体，其中所述CNGB3是小鼠CNGB3。

28.权利要求26的表达载体，其中所述CNGB3是大鼠CNGB3。

29.权利要求26的表达载体，其中所述CNGB3是人CNGB3。

30.权利要求21的表达载体，其中所述靶核酸序列编码环核苷酸门控通道亚基A（CNGA3）多肽。

31.权利要求30的表达载体，其中所述CNGA3是小鼠CNGA3。

32.权利要求30的表达载体，其中所述CNGA3是大鼠CNGA3。

33.权利要求30的表达载体，其中所述CNGA3是人CNGA3。

34.权利要求21的表达载体，其中所述靶核酸序列编码鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白G(t)亚基α-2（GNAT-2）多肽。

35.权利要求34的表达载体，其中所述GNAT-2是小鼠GNAT-2。

36.权利要求34的表达载体，其中所述GNAT-2是大鼠GNAT-2。

37.权利要求34的表达载体，其中所述GNAT-2是人GNAT-2。

38.一种哺乳动物细胞，其包含权利要求21-37任一项的表达载体。

39.一种转基因表达盒，其包含：

(a) 权利要求1-17任一项的核酸；

(b) 选自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸；和

(c) 最小调节元件。

40.一种核酸载体，其包含权利要求39的表达盒。

41.权利要求40的载体，其中所述载体是腺相关病毒（AAV）载体。

42.一种药盒，其包含权利要求21-37任一项的表达载体和使用说明书。

43.一种治疗眼病的方法，其包括给予需要其的对象权利要求21-37任一项的表达载体，由此治疗所述对象。

44.一种促进对象的视锥细胞中的CNGA3或CNGB3表达的方法，其包括给予所述对象权利要求21-37任一项的表达载体，由此促进CNGA3或CNGB3表达。

45.权利要求43的方法，其中所述眼病与影响视锥细胞的基因突变、替换或缺失相关联。

46.权利要求43的方法，其中所述眼病影响视网膜色素上皮细胞。

47.权利要求43的方法，其中所述眼病是色盲。

48.权利要求43或44的方法，其中所述表达载体能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGB3表达。

49.权利要求43或44的方法，其中所述表达载体能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的CNGA3表达。

50.权利要求43或44的方法，其中所述表达载体能够促进S-视锥细胞、M-视锥细胞和L-视锥细胞中的GNAT-2表达。

51.权利要求43或44的方法，其中所述载体在视网膜下给药。