CN107287240B - 一种用于治疗2型全色盲病人的重组腺相关病毒基因治疗载体及药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因治疗载体，该基因治疗载体用于2型全色盲基因治疗。本发明的基因治疗载体包含人环核苷酸门控通道α3基因和大鼠血管紧张素II型受体内含子1。本发明还涉及包含上述基因治疗载体的药物及组合物。

Description

一种用于治疗2型全色盲病人的重组腺相关病毒基因治疗载 体及药物

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，具体地指一种用于治疗2型全色盲病人的重组腺相关病毒基因治疗载体及药物。

背景技术

人类视网膜含有大约600万个视锥细胞和1亿个视杆细胞。锥细胞主要是在明室下司职色觉及中央和精细视力，主要分布在黄斑部，特别是中心凹(占100％)；杆细胞正相反，主要是在暗环境下司职周边视力，主要分布在视网膜周边部，越靠近黄斑部越少。全色盲是一种罕见的隐性遗传病，以锥细胞功能丧失为特征，病人仅剩下杆体视觉。全色盲临床表现为：钟摆型眼球震颤，畏光，视力严重障碍，无色觉及无中心视力，表现为昼盲。视网膜电图(electroretinogram,ERG)锥细胞反应消失，有些严重病例ERG杆细胞反应也有减弱。其中眼球震颤和畏光在生后数周即可出现；患者视力很差(通常≤0.1)，且终身变化不大。原来一直以为全色盲病人的锥体细胞虽然功能丧失，但结构能够长期保持稳定。近年来，随着光学相干断层(OCT)成像技术的改进，发现大多数全色盲病人的黄斑中心凹处变薄，特别是锥细胞内外节及结合部有明显缩短、缺失或高反射区。全色盲在西方人群中的患病率约1/3万。对于全色盲患者，除了佩戴用来遮挡外部光线的暗色眼镜来减轻畏光症状并尽量利用网膜周边的杆细胞功能外，目前尚无有效的治疗方法。

目前已发现有环核苷酸门控通道α3(CNGA3)基因的突变与全色盲2型相关。此基因的蛋白表达仅在锥细胞内进行。CNG通道位于视细胞外节的质膜上，通过对钙、钠等阳离子流入视细胞的控制使光信号最终转变为生物电讯号，在光转导过程中起着重要作用。CNG通道属于电压门控离子通道超蛋白家族的成员，根据亚单位的不同可以分为CNGA和CNGB。CNGA3基因编码锥细胞CNG阳离子通道的α亚单位，CNGB3基因编码β亚单位。α亚单位与离子传导有关，而β亚单位主要参与功能调节。CNGA3基因突变会导致进行性锥细胞变性和一些黄斑病变。转导素介导视觉传导的第一步，环单磷酸鸟苷(cyclic guanosinemonophosphate,cGMP)门控通道CNGA3和CNGB3是调节级联的最后步骤。在西方国家的全色盲病人中，大约25％是由CNGA3突变造成的2型病人。虽然还没有确切的统计数字，但在近年的研究中观察到，亚洲国家包括中国的全色盲病人中CNGA3基因突变造成的2型比例明显要比欧美人群高，在全色盲中占60-90％。

传统医疗手段对遗传性视网膜疾病没有作用，所以到目前为止这类疾病还处于无药可治的状态。近年来，随着基因检测技术的发展，我们知道了这类隐性视网膜遗传病是由基因突变造成的相应功能性蛋白缺失导致的。本发明的发明人利用多年研究经验，开发出应用特定腺相关病毒载体将正常基因转染到有基因突变的相关视锥细胞，进而通过恢复病变细胞缺失的相关功能蛋白来达到恢复视功能，从而让患有此种基因突变的患者重见光明的个性化基因治疗方法。这种方法从根本上解除了造成此疾病的病因，如果开展早期治疗，应该具有很好的前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种腺相关病毒载体及其用于治疗2型全色盲的相关药物。

在本发明的第一方面，提供一种腺相关病毒载体，所述载体含有人环核苷酸门控通道α3基因、血管紧张素II型受体内含子1和增强子，所述的人环核苷酸门控通道α3基因选自与SEQ ID NO:1有至少95％同源性的核苷酸序列；所述的血管紧张素II型受体内含子1选自与SEQ ID NO:2有至少90％同源性的核苷酸序列。

优选地，所述的人环核苷酸门控通道α3基因选自与SEQ ID NO:1有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列；所述的血管紧张素II型受体内含子1选自与SEQ ID NO:2有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。

更优选地，所述的人环核苷酸门控通道α3基因的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1；所述的血管紧张素II型受体内含子1的核苷酸序列含有SEQ ID NO:2。最优选地，所述的人环核苷酸门控通道α3基因的核苷酸序列选自SEQ ID NO:1；所述的血管紧张素II型受体内含子1的核苷酸序列选自SEQ ID NO:2。

在一个优选例中，所述的腺相关病毒载体具有非特异性启动子。

优选地，所述的非特异性启动子为Chicken beta-actin(CBA)的启动子，选自与SEQ ID NO:3有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的(CBA)的启动子选自与SEQID NO:3有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最优选地，所述的CBA启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:3。

在另一优选例中，所述的腺相关病毒载体具有锥细胞特异性启动子。优选地，所述的锥细胞特异性启动子为PR2.1启动子，选自与SEQ ID NO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的PR2.1启动子选自与SEQ ID NO:4有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列；最优选地，所述的PR2.1启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:4。

在另一优选例中，所述腺相关病毒载体的序列含有

(a)SEQ ID NO:1；和

(b)SEQ ID NO:2；和

(c)SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

在另一优选例中，增强子为CMV IE启动子，选自与SEQ ID NO:5有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的CMV IE启动子选自与SEQ ID NO:5有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最优选地，所述的CMV IE启动子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:5。

在另一优选例中，所述腺相关病毒载体可选自AAV2，AAV3，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAV-HSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45AAV2或AAV5。更优选地，腺相关病毒载体选自AAV2和AAV5。最优选地，腺相关病毒载体选自AAV2。

在另一优选例中，所述腺相关病毒载体为自身互补型腺相关病毒。

在另一优选例中，所述的腺相关病毒载体的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

在本发明的另一方面，提供一种用于2型全色盲基因治疗的药物组合物，含有所述的腺相关病毒载体和药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供所述的腺相关病毒载体在制备治疗2型全色盲的药物中的应用。

在本发明的另一方面，提供一种基因治疗2型全色盲的方法，将所述的腺相关病毒载体眼内注射，增加正常hCNGA3蛋白表达。优选地，所述的眼内注射是指视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.包装进腺病毒载体的pTR-CBA-AT2R Intron 1-hCNGA3质粒模式图，该质粒包括CMV IE增强子、CBA(chicken beta-actin)启动子、大鼠血管紧张素II型受体内含子1(rat AT2R intron 1)以及人环核苷酸门控通道α3基因(hCNGA3)的cDNA，hCNGA3cDNA之后是SV40聚腺苷酸化信号，表达盒两侧是反向末端重复序列(TR)。

图2.AAV2-CBA-AT2R intron 1-hCNGA3载体和不带有AT2R intron 1的AAV2-CBA-hCNGA3载体视网膜下腔注射6个月后M-opsin视蛋白mRNA对比。

图3.AAV2-CBA-AT2R intron 1-hCNGA3载体和不带有AT2R intron 1的AAV2-CBA-hCNGA3载体视网膜下腔注射6个月后S-opsin视蛋白mRNA对比。

图4.cpfl5小鼠在生后14天视网膜下腔注射AAV2-CBA-AT2R intron 1-hCNGA3后12个月时视网膜电图(ERG)。

图5.cpfl5小鼠在生后14天视网膜下腔注射AAV2-CBA-AT2R intron 1-hCNGA3后12个月时视网膜铺片M-opsin和S-opsin免疫荧光染色

具体实施方式

药物组合物及药盒

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80C冰箱中。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、BBS(Balanced SaltSolution)磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，等。

基因治疗载体

本发明中的基因治疗载体是病毒表达载体。优选的，根据本发明，病毒表达载体是腺相关病毒(AVV)载体，诸如选自由血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合AAV组成的组中的AAV载体如AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAV-HSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45AAV2或AAV5，这能更好地适于在感兴趣的组织中进行高效率的转导。在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。在本发明的优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型2或5载体。在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV2载体。现有技术中认为，AAV包装治疗性基因的能力限制为约4.9kbp，而较长序列会导致AAV颗粒的截断(Wu et al.,2010,Mol Ther18:80-86)。然而，本文中表明，8.5kbp的超大DNA序列(包括两个反向末端重复序列(ITR)，在CBA或锥细胞特异性的PR2.1启动子控制下的AT2R intron 1和hCNGA3cDNA，以及SV40多聚腺苷酸信号的包装，不影响AAV5或AAV2的产生以及hCNGA3的高效表达。

本发明所述的AAV载体包括单链AAV和自身互补AAV(self-complementary AAV，scAAV)。采用scAAV可以使hCNGA3的表达更强，由于载体容量的限制，采用scAAV时，可以使用sCBA。sCBA包含了CBA启动子(SEQ ID NO:3)的序列和其下游一段缩短的嵌合内含子(shortened chimeric Intron1)序列(SEQ ID NO:13)。

可根据标准技术产生重组病毒载体。例如，重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10⁷～10¹³个病毒颗粒/mL范围内的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。

用于人的AAV的合适剂量在约1×10¹⁰～1×10¹⁴个病毒颗粒的范围内。

基因治疗载体是眼内注射给药的，可以采用视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中的实施例如无特别说明，所用的实验动物、试剂、耗材、仪器如下：

实验动物 正常C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。cpfl5小鼠购自美国Jackson实验室。光照周期12h光照-12h黑暗，自由采食，自由饮水。所有的动物研究严格按照国家科学技术委员会颁发的《实验动物管理条例》进行。

主要试剂、耗材 生理盐水(浙江天瑞药业有限公司)；荧光素钠(美国Alcon公司)；30^1/2gauge一次性注射针头(美国Becton Dickinson and Company公司)；1％阿托品滴眼液(美国Alcon公司)；复方托吡卡胺滴眼液(沈阳兴齐眼药股份有限公司)；盐酸四环素氢化可的松眼膏(南京白敬宇制药有限责任公司)。抗红/绿锥视蛋白(Anti-M-Opsin)、蓝锥视蛋白(Anti-S-Opsin)(一抗)多克隆抗体(IgG)(AB5405，AB5407),山羊抗兔IgG-Cy3(二抗)多克隆抗体(AP187C，德国Millipore公司)。牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)(北京生兴生物有限公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(上海碧云天生物技术研究所)，4％多聚甲醛(北京海德生物有限公司)。

主要仪器眼科实验手术显微镜(日本Nikon公司)；眼科显微器械(苏州明仁医疗器械有限公司)；微量进样器(美国Hamilton公司)；MicronⅣ视网膜影像系统(美国PhoenixResearch Labs公司)；视觉电生理检测系统(德国Roland Consult公司)；蔡司明视野显微镜(德国Carl Zesis公司)。

实施例1.pTR-CBA-AT2R intron 1-hCNGA3质粒的构建

人类CNGA3(hCNGA)的cDNA(SEQ ID NO:1)被克隆到CBA(chicken beta actin)启动子(SEQ ID NO:3)的下游，两者间具有CMV IE增强子(SEQ ID NO:5)和特有的大鼠AT2R(angiotensin II type 2receptor)Intron 1(SEQ ID NO:2)，可以增强转入基因hCNGA的长期表达。hCNGA cDNA之后是SV40聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:8)。表达盒两侧是反向末端重复序列：ITR5’(SEQ ID NO:7)，ITR3’(SEQ ID NO:9)，病毒载体还包括ColE1ori(SEQ IDNO:10)，Amp(r)(SEQ ID NO:11)和f1(+)origin(SEQ ID NO:12)。

pTR-CBA-AT2R intron 1-hCNGA3质粒的特征图谱如图1所示，各元件的起止位点如下：

ITR 5’起始:19终止:161

CMV ie增强子起始:162终止:542

Chiken beta-actin启动子起始:543终止:825

Rat AT2R Intron 1起始:1900终止:2055

hCNGA3 cDNA起始:2091终止:4195

SV40Poly(A)起始:5333终止:5531

ITR 3’起始:5556终止:5698

ColE1 ori起始:6147终止:6372

AMP(R)起始:6622终止:7622

f1(+)origin起始:8026终止:8485

质粒的全长序列如SEQ ID NO:6所示。

实施例2.pTR-PR2.1-AT2R intron 1-hCNGA3质粒的构建

方法与实施例1一样，区别仅在于用锥细胞特异的启动子PR2.1(SEQ ID NO:4)代替CBA启动子。

实施例3.AAV2-CBA-AT2R intron 1-hCNGA3病毒载体的构建

载体是通过质粒共转染方法获得的。将含有AAV2外壳蛋白基因、能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和pTR-CBA-AT2R Intron 1-hCNGA3质粒共转染HEK 293T细胞，初步形成AAV2-CBA-AT2R intron 1-hCNGA3重组腺相关病毒载体。经碘克丁醇初步纯化后，经过用5ml Hitrap Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化(使用仪器为Pharmacia AKTA FPLC system(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。之后用pH8.0的215mM NaCl，淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组病毒载体进行收集。收集的液体通过浓缩器(100K concentrater,Millipore)后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组病毒载体进行浓缩。滴度的测定通过用DNase I消化掉病毒颗粒以外DNA的步骤，聚合酶连锁反应，用点杂交方法分出重组腺相关病毒载体相比标准载体(例如含有相同启动子的载体质)不同杂交信号强度，以此确定滴度。最后用硝酸银染色的受到SDS电泳法确保病毒载体颗粒没被污染不含内毒素。最后分装零下80度储存。

实施例4.cpfl5小鼠视网膜下腔注射病毒载体

实验方法

注射前一天下午小鼠经1％阿托品滴眼液点眼1次，注射当日8：00～12：00使用1％阿托品滴眼液点眼，每小时1次，共4次，于12：00～14：00用复方托吡卡胺滴眼液点眼以快速扩瞳，每30分钟1次，共4次(对照眼术前准备相同)。扩瞳至能看见晶状体赤道部后，小鼠腹腔内注射氯胺酮(72mg/kg)/甲苯噻嗪(4mg/kg)行全身麻醉，用质量分数0.5％盐酸丙美卡因滴眼液点眼以局部麻醉。剪去小鼠胡须，将小鼠倾斜放于一硬质纸板上，头部抬高，操作者用一手固定小鼠体位。在小鼠结膜囊点质量分数2.5％羟丙基甲基纤维素以观察眼底。微量进样器术前经体积分数75％乙醇消毒。解剖显微镜下在瞳孔缘内1mm处用301/2G的一次性针头穿刺角膜，针头斜面向上垂直进入角膜全层的80％深度时，使针尖平行于晶状体前表面进入前房，避免伤及虹膜和晶状体。然后用带33G平针头微量进样器沿穿刺口平行于晶状体进入前房，针头绕过晶状体后至玻璃体，接触视网膜表面，继续进针至视网膜下腔。此时将微量进样器固定，试探性缓慢推动进样器活塞，将带有少量荧光素钠的生理盐水注射液注入视网膜下腔。如有绿色液体漏出，提示深度不够，需继续进针少许；如长时间未见视网膜隆起并伴有巩膜绿染，提示可能进针太深。约45s注入1μl溶液，然后针头缓慢撤回，避免损伤虹膜及晶状体。注射后小鼠用2.5％羟丙基甲基纤维素点入结膜囊以观察眼底情况及荧光染料在视网膜的分布范围。手术显微镜下如清楚看到眼底局部视网膜呈圆形隆起且网膜隆起下方可见绿色，证明注射成功。术中如不能看到视网膜隆起及其下方的绿色或看到视网膜有大出血等并发症，则另选小鼠重新注射。术毕涂1％阿托品眼膏和四环素可的松眼膏，以后每隔1天重复一次，共三次，以减少炎症反应、防止感染。

自然产生的具有CNGA3蛋白缺失的cpfl5模式小鼠具有正常的杆细胞功能，但没有锥细胞功能。在cpfl5小鼠出生后14天，在每只小鼠一侧眼注射1μl滴度为1×10¹³/ml的AAV2-CBA-AT2R intron 1-hCNGA3(治疗眼)，另一侧眼则不注射作为对照(非治疗眼)。

实施例5.AT2R intron 1对AAV功能增强的检测

结果如图2和3所示。应用不带有Rat AT2R Intron 1的AAV2-CBA-hCNGA3和带有Rat AT2R Intron 1的AAV2-CBA-AT2R Intron 1-hCNGA35载体注射同一只生后14天的cpfl5小鼠的右眼和左眼，6个月后，不带有Rat AT2R Intron 1的AAV2-CBA-hCNGA3载体注射眼的M-opsin和S-opsin的水平分别只有带Rat AT2R Intron 1的AAV2-CBA-AT2R Intron1-hCNGA3载体注射眼水平的40％和30％。

实施例6.ERG检测

实验方法

cpfl5小鼠视网膜下腔注射后12个月进行视网膜电图(electroretinogram,ERG)检测。暗适应过夜，为消除不同时间检测对ERG幅值产生的影响，检测均设在下午，在暗室内暗红光照下操作(>650nm)。小鼠放置在37℃恒温台上，眼表滴一滴复方托吡卡胺滴眼液后行全身麻醉，剪去胡须。将参考电极和接地电极插入头部和尾根部皮下，一对金制的环形电极放置在角膜表面，滴少量0.5％羟甲基纤维素滴眼液于角膜表面湿润保护角膜及降低干扰，增强导电性。全视野暗适应ERG在-1.85和0log cd·s/m2光强度下记录，明适应ERG在0.65log cd·s/m2光强度下记录，在明适应ERG记录之前小鼠在背景光强度为30cd·s/m2下照射10min。

实验结果

如图4所示，左上方为暗适应(dark-adapted)下注射了病毒载体的治疗眼和未注射的对侧未治疗眼的ERG幅值，显示杆细胞功能；左下方为明适应下(Light-adapted)治疗眼和未治疗眼ERG幅值,显示锥细胞功能。右方为暗适应下10Hz闪烁ERG。

结果显示，自然产生的具有CNGA3蛋白缺失的cpfl5模式小鼠具有正常的杆细胞功能，但没有锥细胞功能。

和未注射眼相比，注射眼的暗适应下视网膜电流图(ERG)在不同刺激强度下略有下降(和视网膜下腔注射引起的网膜脱离造成的损害有关)；未注射眼视网膜杆细胞功能基本正常。

cpfl5小鼠的注射了AAV2-CBA-AT2R Intron 1-hCNGA3治疗的一侧眼其锥细胞功能获得恢复，注射后12个月仍然维持，b-wave幅度约为普通未注射C57BL/6J小鼠的50％。相比之下，对侧未治疗眼则检测不到锥细胞ERG.

暗适应闪烁ERG则清晰显示AAV2-CBA-AT2R Intron 1-hCNGA3载体基因转入恢复了cpfl5小鼠的锥细胞功能。应用暗适应下10Hz闪烁ERG，发明人发现在低强度光刺激下诱导出的杆细胞功能在治疗眼和未治疗眼基本相同；但随着刺激强度的提高，杆细胞功能逐渐被抑制，在最强光线刺激下杆细胞的功能完全被抑制，展现出的都是锥细胞功能，这时只有治疗眼有代表锥细胞和功能的波形，而未治疗眼的锥细胞功能为零，波形为直线。

实施例7.视网膜铺片

实验方法

视网膜铺片的准备与固定：在手术显微镜下用角膜剪沿角巩缘将角膜虹膜剪掉仅保留12点烙印处，然后将眼球剩余部分放入4％多聚甲醛中固定5min后去除晶状体，所得眼杯继续固定20min后沿烙印处垂直于角巩缘剪一切口，用有齿镊夹住视神经周边处巩膜并用剪刀剪掉此处巩膜及视神经节，暴露出视神经处视网膜。将角膜剪从此处伸入视网膜色素上皮和神经网膜层之间的潜在间隙，缓慢钝性剥离后极部视网膜，并逐渐将剥离开的巩膜脉络膜视网膜色素上皮层向两侧剪开并外翻剥离出完整视网膜。4％多聚甲醛中继续固定24h。

免疫荧光染色与视网膜铺片：将固定好的神经视网膜放入PBS中漂洗3次，每次10min，并将玻璃体纤维等残余物取净。接着用弯镊子将视网膜移入0.3％TritonX-100溶液中室温下浸泡3h，PBS中轻轻吹打漂洗3次后再置于5％的BSA中室温下孵育3h，取出视网膜，不洗，将双眼视网膜放入含抗S-Opsin或抗M-Opsin的多克隆抗体(1:400，用含1％BSA和0.1％TritonX-100的稀释液稀释)的96孔板中，4℃孵育过夜。同时设阴性对照(每组1只眼)，不加一抗，用稀释液代替。吸去一抗，水平摇床上0.1％TritonX-100溶液洗3次，每次20min。滴加山羊抗兔IgG-Cy3(1:800，PBS稀释)室温避光孵育1小时，暗室下水平摇床上0.1％TritonX-100溶液洗3次，每次10min。手术显微镜下将视网膜以视盘为中心，12点钟开口处为基准，放射状剪成4瓣，将其分为颞上、颞下、鼻上和鼻下4个象限。用弯镊子将视网膜轻轻移到载玻片上的PBS珠滴上，神经节细胞面朝上，将载玻片上的PBS液体吸除大部，并将视网膜平铺开来(有时因视网膜弯曲度较大无法完全平铺，可以在此时再多剪几瓣)，12点钟开口朝上，滴少许抗荧光淬灭剂封片。

实验结果

经过免疫荧光染色的视网膜铺片如图5所示，小鼠中视网膜中有看红绿色的M-视蛋白(opsin)和看红色的S-视蛋白。应用免疫染色可以看到，在12月龄的未治疗cpfl5小鼠视网膜中，M-视蛋白和S-视蛋白都已变性消失。而治疗眼中大部分的M-视蛋白和S-视蛋白都正常存在。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 沈阳复明生物技术有限公司

<120> 一种用于治疗2型全色盲病人的重组腺相关病毒基因治疗载体及药物

<130> 2017

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2085

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

atggccaaga tcaacaccca atactcccac ccctccagga cccacctcaa ggtaaagacc 60

tcagaccgag atctcaatcg cgctgaaaat ggcctcagca gagcccactc gtcaagtgag 120

gagacatcgt cagtgctgca gccggggatc gccatggaga ccagaggact ggctgactcc 180

gggcagggct ccttcaccgg ccaggggatc gccaggctgt cgcgcctcat cttcttgctg 240

cgcaggtggg ctgccaggca tgtgcaccac caggaccagg gaccggactc ttttcctgat 300

cgtttccgtg gagccgagct taaggaggtg tccagccaag aaagcaatgc ccaggcaaat 360

gtgggcagcc aggagccagc agacagaggg agaagcgcct ggcccctggc caaatgcaac 420

actaacacca gcaacaacac ggaggaggag aagaagacga aaaagaagga tgcgatcgtg 480

gtggacccgt ccagcaacct gtactaccgc tggctgaccg ccatcgccct gcctgtcttc 540

tataactggt atctgcttat ttgcagggcc tgtttcgatg agctgcagtc cgagtacctg 600

atgctgtggc tggtcctgga ctactcggca gatgtcctgt atgtcttgga tgtgcttgta 660

cgagctcgga caggttttct cgagcaaggc ttaatggtca gtgataccaa caggctgtgg 720

cagcattaca agacgaccac gcagttcaag ctggatgtgt tgtccctggt ccccaccgac 780

ctggcttact taaaggtggg cacaaactac ccagaagtga ggttcaaccg cctactgaag 840

ttttcccggc tctttgaatt ctttgaccgc acagagacaa ggaccaacta ccccaatatg 900

ttcaggattg ggaacttggt cttgtacatt ctcatcatca tccactggaa tgcctgcatc 960

tactttgcca tttccaagtt cattggtttt gggacagact cctgggtcta cccaaacatc 1020

tcaatcccag agcatgggcg cctctccagg aagtacattt acagtctcta ctggtccacc 1080

ttgaccctta ccaccattgg tgagacccca ccccccgtga aagatgagga gtatctcttt 1140

gtggtcgtag acttcttggt gggtgttctg atttttgcca ccattgtggg caatgtgggc 1200

tccatgatct cgaatatgaa tgcctcacgg gcagagttcc aggccaagat tgattccatc 1260

aagcagtaca tgcagttccg caaggtcacc aaggacttgg agacgcgggt tatccggtgg 1320

tttgactacc tgtgggccaa caagaagacg gtggatgaga aggaggtgct caagagcctc 1380

ccagacaagc tgaaggctga gatcgccatc aacgtgcacc tggacacgct gaagaaggtt 1440

cgcatcttcc aggactgtga ggcagggctg ctggtggagc tggtgctgaa gctgcgaccc 1500

actgtgttca gccctgggga ttatatctgc aagaagggag atattgggaa ggagatgtac 1560

atcatcaacg agggcaagct ggccgtggtg gctgatgatg gggtcaccca gttcgtggtc 1620

ctcagcgatg gcagctactt cggggagatc agcattctga acatcaaggg gagcaagtcg 1680

gggaaccgca ggacggccaa catccgcagc attggctact cagacctgtt ctgcctctca 1740

aaggacgatc tcatggaggc cctcaccgag taccccgaag ccaagaaggc cctggaggag 1800

aaaggacggc agatcctgat gaaagacaac ctgatcgatg aggagctggc cagggcgggc 1860

gcggacccca aggaccttga ggagaaagtg gagcagctgg ggtcctccct ggacaccctg 1920

cagaccaggt ttgcacgcct cctggctgag tacaacgcca cccagatgaa gatgaagcag 1980

cgtctcagcc aactggaaag ccaggtgaag ggtggtgggg acaagcccct ggctgatggg 2040

gaagttcccg gggatgctac aaaaacagag gacaaacaac agtga 2085

<210> 2

<211> 156

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 2

taagtcagaa caatttacac atgcttgact cgggaagggg aacattcagc aataaaaagg 60

tttgtatgtg tgcatgtatg aatgttttct ttttcctgtt tttaacactg ccttttgcag 120

aatgccttaa ttctttaacc gctgtttctc ttacag 156

<210> 3

<211> 283

<212> DNA

<213> 鸡

<400> 3

catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc cctccccacc 60

cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg cggggggggg 120

gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag 180

aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg 240

gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcg 283

<210> 4

<211> 2109

<212> DNA

<213> 人

<400> 4

ccccggggga tcctctagag tcgacaggcc tacagcagcc agggtgagat tatgaggctg 60

agctgagaat atcaagactg taccgagtag ggggccttgg caagtgtgga gagcccggca 120

gctggggcag agggcggagt acggtgtgcg tttacggacc tcttcaaacg aggtaggaag 180

gtcagaagtc aaaaagggaa caaatgatgt ttaaccacac aaaaatgaaa atccaatggt 240

tggatatcca ttccaaatac acaaaggcaa cggataagtg atccgggcca ggcacagaag 300

gccatgcacc cgtaggattg cactcagagc tcccaaatgc ataggaatag aagggtgggt 360

gcaggaggct gaggggtggg gaaagggcat gggtgtttca tgaggacaga gcttccgttt 420

catgcaatga aaagagtttg gagacggatg gtggtgactg gactatacac ttacacacgg 480

tagcgatggt acactttgta ttatgtatat tttaccacga tctttttaaa gtgtcaaagg 540

caaatggcca aatggttcct tgtcctatag ctgtagcagc catcggctgt tagtgacaaa 600

gcccctgagt caagatgaca gcagccccca taactcctaa tcggctctcc cgcgtggagt 660

catttaggag tagtcgcatt agagacaagt ccaacatcta atcttccacc ctgccagggc 720

cccagctggc agcgagggtg ggagactccg ggcagagcag agggcgctga cattggggcc 780

cggcctggct tgggtccctc tggcctttcc ccaggggccc tctttccttg gggctttctt 840

gggccgccac tgctcccgct cctctccccc catcccaccc cctcaccccc tcgttcttca 900

tatccttctc tagtgctccc tccactttca tccacccttc tgcaagagtg tgggaccaca 960

aatgagtttt cacctggcct ggggacacac gtgcccccac aggtgctgag tgactttcta 1020

ggacagtaat ctgctttagg ctaaaatggg acttgatctt ctgttagccc taatcatcaa 1080

ttagcagagc cggtgaaggt gcagaaccta ccgcctttcc aggcctcctc ccacctctgc 1140

cacctccact ctccttcctg ggatgtgggg gctggcacac gtgtggccca gggcattggt 1200

gggattgcac tgagctgggt cattagcgta atcctggaca agggcagaca gggcgagcgg 1260

agggccagct ccggggctca ggcaaggctg ggggcttccc ccagacaccc cactcctcct 1320

ctgctggacc cccacttcat agggcacttc gtgttctcaa agggcttcca aatagcatgg 1380

tggccttgga tgcccaggga agcctcagag ttgcttatct ccctctagac agaaggggaa 1440

tctcggtcaa gagggagagg tcgccctgtt caaggccacc cagccagctc atggcggtaa 1500

tgggacaagg ctggccagcc atcccaccct cagaagggac ccggtggggc aggtgatctc 1560

agaggaggct cacttctggg tctcacattc ttggatccgg ttccaggcct cggccctaaa 1620

tagtctccct gggctttcaa gagaaccaca tgagaaagga ggattcgggc tctgagcagt 1680

ttcaccaccc accccccagt ctgcaaatcc tgacccgagg gtccacctgc cccaaaggcg 1740

gacgcaggac agtagaaggg aacagagaac acataaacac agagagggcc acagcggctc 1800

ccacagtcac cgccaccttc ctggcgggga tgggtggggc gtctgagttt ggttcccagc 1860

aaatccctct gagccgccct tgcgggctcg cctcaggagc aggggagcaa gaggtgggag 1920

gaggaggtct aagtcccagg cccaattaag agatcaggta gtgtagggtt tgggagcttt 1980

taaggtgaag aggcccgggc tgatcccaca ggccagtata aagcgccgtg accctcaggt 2040

gatgcgccag ggccggctgc ctgcggggac agggctttcc atagccatga ggatccgaat 2100

tcggatccc 2109

<210> 5

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CMV

<400> 5

gaattcggta ccctagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 60

atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 120

acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 180

tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 240

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 300

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 360

tcatcgctat ta 372

<210> 6

<211> 8550

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

gggggggggg ggggggggtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 60

gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120

gcgcgcagag agggagtggc caactccatc actaggggtt cctagatctg aattcggtac 180

cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 240

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 300

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 360

caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 420

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 480

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 540

accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 600

cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 660

gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 720

agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 780

cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 840

ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 900

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 960

gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 1020

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1140

ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg gtgccccgcg 1200

gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg 1260

agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc cctccccgag 1320

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500

cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560

tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620

gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680

cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740

gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800

gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860

tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcct aagtcagaac aatttacaca 1920

tgcttgactc gggaagggga acattcagca ataaaaaggt ttgtatgtgt gcatgtatga 1980

atgttttctt tttcctgttt ttaacactgc cttttgcaga atgccttaat tctttaaccg 2040

ctgtttctct tacagtcgaa gatctaggca acgcgtctcg aggcggccgc atggccaaga 2100

tcaacaccca atactcccac ccctccagga cccacctcaa ggtaaagacc tcagaccgag 2160

atctcaatcg cgctgaaaat ggcctcagca gagcccactc gtcaagtgag gagacatcgt 2220

cagtgctgca gccggggatc gccatggaga ccagaggact ggctgactcc gggcagggct 2280

ccttcaccgg ccaggggatc gccaggctgt cgcgcctcat cttcttgctg cgcaggtggg 2340

ctgccaggca tgtgcaccac caggaccagg gaccggactc ttttcctgat cgtttccgtg 2400

gagccgagct taaggaggtg tccagccaag aaagcaatgc ccaggcaaat gtgggcagcc 2460

aggagccagc agacagaggg agaagcgcct ggcccctggc caaatgcaac actaacacca 2520

gcaacaacac ggaggaggag aagaagacga aaaagaagga tgcgatcgtg gtggacccgt 2580

ccagcaacct gtactaccgc tggctgaccg ccatcgccct gcctgtcttc tataactggt 2640

atctgcttat ttgcagggcc tgtttcgatg agctgcagtc cgagtacctg atgctgtggc 2700

tggtcctgga ctactcggca gatgtcctgt atgtcttgga tgtgcttgta cgagctcgga 2760

caggttttct cgagcaaggc ttaatggtca gtgataccaa caggctgtgg cagcattaca 2820

agacgaccac gcagttcaag ctggatgtgt tgtccctggt ccccaccgac ctggcttact 2880

taaaggtggg cacaaactac ccagaagtga ggttcaaccg cctactgaag ttttcccggc 2940

tctttgaatt ctttgaccgc acagagacaa ggaccaacta ccccaatatg ttcaggattg 3000

ggaacttggt cttgtacatt ctcatcatca tccactggaa tgcctgcatc tactttgcca 3060

tttccaagtt cattggtttt gggacagact cctgggtcta cccaaacatc tcaatcccag 3120

agcatgggcg cctctccagg aagtacattt acagtctcta ctggtccacc ttgaccctta 3180

ccaccattgg tgagacccca ccccccgtga aagatgagga gtatctcttt gtggtcgtag 3240

acttcttggt gggtgttctg atttttgcca ccattgtggg caatgtgggc tccatgatct 3300

cgaatatgaa tgcctcacgg gcagagttcc aggccaagat tgattccatc aagcagtaca 3360

tgcagttccg caaggtcacc aaggacttgg agacgcgggt tatccggtgg tttgactacc 3420

tgtgggccaa caagaagacg gtggatgaga aggaggtgct caagagcctc ccagacaagc 3480

tgaaggctga gatcgccatc aacgtgcacc tggacacgct gaagaaggtt cgcatcttcc 3540

aggactgtga ggcagggctg ctggtggagc tggtgctgaa gctgcgaccc actgtgttca 3600

gccctgggga ttatatctgc aagaagggag atattgggaa ggagatgtac atcatcaacg 3660

agggcaagct ggccgtggtg gctgatgatg gggtcaccca gttcgtggtc ctcagcgatg 3720

gcagctactt cggggagatc agcattctga acatcaaggg gagcaagtcg gggaaccgca 3780

ggacggccaa catccgcagc attggctact cagacctgtt ctgcctctca aaggacgatc 3840

tcatggaggc cctcaccgag taccccgaag ccaagaaggc cctggaggag aaaggacggc 3900

agatcctgat gaaagacaac ctgatcgatg aggagctggc cagggcgggc gcggacccca 3960

aggaccttga ggagaaagtg gagcagctgg ggtcctccct ggacaccctg cagaccaggt 4020

ttgcacgcct cctggctgag tacaacgcca cccagatgaa gatgaagcag cgtctcagcc 4080

aactggaaag ccaggtgaag ggtggtgggg acaagcccct ggctgatggg gaagttcccg 4140

gggatgctac aaaaacagag gacaaacaac agtgaagaag gtcgtctgag gaggccgggg 4200

aggctgccta ccctgtccct ttgcctgctg ctgggaccat gggggctggg gccagcgctg 4260

aggagaagca ctccagagag ctggagaaga agctgaaaga ggatgctgag aaggatgccc 4320

gcactgtgaa actgctgctt ctgggtgccg gtgaatccgg gaagagcact attgtcaaac 4380

agatgaagat tatccaccag gacgggtatt cgctggagga atgcctcgag ttcattgcca 4440

tcatctacgg caacactctg cagtccatcc tggccatcgt tcgggctatg accacgctca 4500

acattcagta tggagattca gcccggcagg atgatgcccg gaagctcatg cacatggcag 4560

atactattga ggaaggcaca atgcccaagg agatgtcaga catcattcag cgcttgtgga 4620

aggactcggg tatccaagct tgctttgacc gagcctcaga ataccagctc aatgactccg 4680

ccggctacta tctctcagac ctagagcgtc tggtgactcc aggatatgtg cccactgagc 4740

aggacgtgtt gcgttctcgt gtcaaaacca ctggtattat cgagactcaa ttctccttca 4800

aggacctcaa cttcagaatg ttcgatgtgg gcgggcagcg ttccgagcgc aaaaagtgga 4860

tccactgctt tgagggtgtg acgtgcatca ttttcatcgc tgcgctgagc gcttacgaca 4920

tggtgctggt ggaggacgac gaagtgaacc gaatgcacga gagcctgcac ctgttcaaca 4980

gcatctgcaa tcatcgctac ttcgccacaa cgtctatcgt gctcttcctc aacaagaagg 5040

acgttttctc cgagaagata aaaaaggcac acctcagcat ctgcttcccc gactacgatg 5100

gacctaacac ttacgaggat gccggcaact acatcaaagt gcagttcctg gagcttaaca 5160

tgcgacgtga tgtgaaggag atctattccc acatgacgtg cgctaccgac acacagaacg 5220

tcaagtttgt ctttgacgct gtcaccgaca ttatcatcaa ggagaacctc aaagactgcg 5280

ggctcttctg aggtacctga attcaggtgt gtctcttgcc ctgaggcggc cgcggggatc 5340

cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 5400

aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 5460

ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 5520

gggaggtttt ttagtcgact ggggagagat ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 5580

tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc 5640

gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaaccc 5700

cccccccccc ccccctgcag ccctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 5760

tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 5820

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 5880

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 5940

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 6000

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 6060

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 6120

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 6180

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 6240

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 6300

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 6360

gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 6420

tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 6480

caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 6540

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 6600

acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 6660

ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 6720

ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 6780

tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 6840

tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 6900

gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 6960

tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 7020

tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 7080

ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 7140

tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 7200

ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 7260

gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 7320

ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 7380

cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 7440

ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 7500

ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 7560

gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 7620

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 7680

gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 7740

aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 7800

tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 7860

cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct 7920

taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc 7980

gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggaaattg taaacgttaa tattttgtta 8040

aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc 8100

aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg 8160

aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat 8220

cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc 8280

cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag 8340

ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg 8400

gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta 8460

cagggcgcgt cgcgccattc gccattcagg ctacgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 8520

cgggcctctt cgctattacg ccaggctgca 8550

<210> 7

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITR5’

<400> 7

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60

cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttc 143

<210> 8

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40

<400> 8

cggggatcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 60

gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 120

aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 180

ggaggtgtgg gaggttttt 199

<210> 9

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITR3'

<400> 9

acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc 60

ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc 120

gcgcagagag ggagtggcca ac 142

<210> 10

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ColE1 ori

<400> 10

tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 60

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 120

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 180

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtg 226

<210> 11

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Amp (r)

<400> 11

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 60

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 120

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 180

gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 240

cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 300

cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 360

tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 420

cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 480

gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 540

cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 600

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 660

gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 720

taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 780

gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 840

acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 900

aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 960

cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat t 1001

<210> 12

<211> 460

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> f1(+) origin

<400> 12

gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa 60

taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt 120

gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg 180

cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt 240

ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga 300

gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg 360

ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg 420

cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcgcgc cattcgccat 460

<210> 13

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 缩短的嵌合内含子

<400> 13

ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg 60

gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg ctccgggagc tagagcctct 120

gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt 180

gtgctgtctc atcattttgg ca 202

Claims (12)

1.一种腺相关病毒载体，其特征在于含有人环核苷酸门控通道α3基因、血管紧张素II型受体内含子1和增强子；

所述人环核苷酸门控通道α3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述血管紧张素II型受体内含子1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，含有非特异性启动子或锥细胞特异性启动子。

3.如权利要求2所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的非特异性启动子为CBA(chicken beta-actin)启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求2所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的锥细胞特异性启动子为PR2.1启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的序列含有

(a)SEQ ID NO:1；和

(b)SEQ ID NO:2；和

(c)SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

6.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的增强子为CMV IE增强子。

7.如权利要求6所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述的增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

8.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，为AAV2型或AAV5型腺相关病毒载体。

9.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，为自身互补型腺相关病毒载体。

10.如权利要求1所述的腺相关病毒载体，其特征在于，具有SEQ ID NO:6的核苷酸序列。

11.一种用于2型全色盲基因治疗的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有如权利要求1-10所述的任一腺相关病毒载体。

12.如权利要求1-10所述的任一腺相关病毒载体在制备治2型全色盲药物中的应用。

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