KR20210040275A - 망막 색소 상피 세포 조성물 - Google Patents

Abstract

망막 변성 질환 및 손상의 치료를 위한 즉시 투여가능한 (RTA) 망막 색소 상피 (RPE) 세포 치료 조성물이 본원에 제시된다. 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 RPE 세포를 제형화하는 방법, 및 동결보존시키고 동결보존된 조성물을 해동 후에 대상체에게 투여하기 위한 RPE 세포 치료 조성물을 제형화하는 방법이 또한 제시된다. 또 다른 측면에서, RTA 조성물은 해동 및 주사 (TAI) 조성물로서 제형화될 수 있으며, 조성물은 해동 후에 주사에 의해 투여된다.

Description

망막 색소 상피 세포 조성물

본 출원은 2017년 12월 29일에 출원한 미국 가특허 출원 번호 62/612,210을 우선권으로 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

망막 색소 상피 (RPE)는 광수용체 외측 분절 (POS)과 맥락막 혈관 사이의 브루크 막 상에 위치하는 신경상피-유래된 착색된 세포의 단층이다. RPE 단층은 광수용체의 기능 및 건강에 중요하다. 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 기능장애, 손상 및 손실은 특정한 안구 질환 및 장애, 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 유전성 황반 변성, 예컨대 베스트병 (난황상 황반 이영양증의 초기 발병 형태), 및 색소성 망막염 (RP)의 아형의 두드러진 특징이다. 이러한 질환이 발병한 이들 망막으로 RPE (및 광수용체)의 이식은 RPE가 변성된 망막 질환에서 세포 대체 요법으로서 이용될 수 있다.

인간 태아 및 성인 RPE는 동종이계 이식을 위한 공여자 공급원으로서 사용되어 왔다. 그러나, 충분한 조직 공급을 얻는데 있어서의 실질적인 문제 및 유산된 태아로부터의 조직 사용과 관련된 윤리적 우려는 이들 공여자 공급원의 광범위한 이용을 제한한다. 성인 및 태아 RPE 이식편의 공급에서의 제한으로 인해, 대안적인 공여자 공급원의 잠재성을 연구하였다.

인간 다능성 줄기 세포는 이식을 위한 RPE 세포의 공급원으로서 상당한 이점을 제공한다. 그들의 다능성 발달 잠재성은 진정한 기능적 RPE 세포로의 그들의 분화를 가능하게 하고, 무한 자가-재생에 대한 그들의 잠재성을 고려할 때, 그들은 RPE 세포의 비제한적인 공여자 공급원으로서 기능할 수 있다. 실제로, 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)가 시험관 내에서 RPE 세포로 분화할 수 있고, 망막 변성을 약화시킬 수 있고, 망막하 이식후 시각 기능을 보존할 수 있음이 입증된 바 있다. 따라서, hESC는 세포 치료제를 위해 RPE 세포의 생산을 위한 비제한적인 공급원일 수 있다.

그러나, 대부분의 세포 기반 치료는 보통 신체로 직접 투여하기에 적합하지 않은 동결-용액으로 냉동 보존되며, 이는 임상적 사용을 위한 실질적인 문제를 일으킨다. 세포는 그들이 해동된 후 몇 시간 내에 이식되어야 하며, 그렇지 않으면 그들은 생존력 및 품질이 손실되기 시작할 수 있다. 또한, 임상 지역, 병원 또는 다른 치료 시설과 가깝지 않을 수 있는 인증된 시설에서는 투여하기 전에 세포가 제조되어야 한다. 최종적으로, 최종 제형의 제조가 세포 치료제 생산 과정의 일부로 고려되기 때문에, 각각의 대상체의 치료 용량은 적격한 기술자에 의해 방출되어야 한다.

본 개시내용은 재생 의약 및 RPE 세포 치료제의 분야에서 이들 및 다른 단점을 다룬다.

한 측면에서, 망막 변성 질환 및 손상의 치료를 위한 즉시 투여가능한 (RTA) 망막 색소 상피 (RPE) 세포 치료 조성물이 제시된다. 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 RPE 세포를 제형화하는 방법, 및 동결보존시키고 동결보존된 조성물을 해동 후에 대상체에게 투여하기 위한 RPE 세포 치료 조성물을 제형화하는 방법이 또한 제시된다. 또 다른 측면에서, RTA 조성물은 해동 및 주사 (TAI) 조성물로서 제형화될 수 있으며, 조성물은 해동 후에 주사에 의해 투여된다.

다른 측면에서, 대상체에서 망막 변성 질환의 진행을 늦추거나, 연령 관련 황반 변성 (AMD) 및/또는 지도형 위축 (GA)의 진행을 늦추거나, 망막 변성 질환을 예방하거나, AMD를 예방하거나, GA를 예방하거나, 망막 색소 상피 (RPE)를 복원시키거나, RPE를 증가시키거나, RPE를 대체하거나 또는 RPE 결함을 치료하는 것 중 하나 이상을 위한 방법으로서, 대상체에게 RPE 세포 및 즉시 투여가능한 생체적합성 동결보존 배지를 포함하는 조성물을 투여하는 것에 의한 방법이 제시된다.

본원에 기재된 동결보존 배지는 약 2% DMSO, 5% DMSO, 약 1% 내지 약 15% DMSO, 또는 약 0.5% 내지 약 7% DMSO, 또는 약 1.5% 내지 약 6.5% DMSO, 또는 약 1.5% 내지 약 3% DMSO, 또는 약 4% 내지 약 6% DMSO를 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 동결보존 배지는 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함한다.

다른 측면에서, 망막 변성 질환은 RPE 기능장애, 광수용체 기능장애, 리포푸신의 축적, 드루젠의 형성, 또는 염증 중 하나 이상을 포함한다.

망막 변성 질환은 색소성 망막염, 레베르 선천성 흑암시, 유전성 또는 후천성 황반 변성, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 베스트병, 망막 박리, 뇌회형 위축, 맥락막결손, 패턴 이영양증, RPE 이영양증, 스타르가르트병, 광, 레이저, 감염, 방사선, 신생혈관 또는 외상성 손상 중 어느 하나에 의해 야기된 RPE 및 망막 손상 중 적어도 하나로부터 선택될 수 있다. 또한, AMD는 지도형 위축 (GA)을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, RPE 결함은 고령, 담배 흡연, 건강하지 못한 체중, 항산화제의 낮은 섭취, 또는 심혈관 장애 중 하나 이상으로부터 초래된다. 추가의 또 다른 측면에서, RPE 결함은 선천성 이상으로부터 초래된다.

일부 측면에서, 시력의 회복을 필요로 하는 대상체에서 시력을 회복시키는 방법으로서, 대상체에게 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 물, 및 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법이 기재된다.

다른 측면에서, 시력의 회복을 필요로 하는 대상체에서 시력을 회복시키는 방법으로서, 대상체에게 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지; 및 RPE 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법이 기재된다.

다른 측면에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서, (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 적어도 약 60% 내지 약 92%가 생존가능하는 것인 방법이 기재된다.

일부 측면에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서, (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 50% 내지 약 120%인 방법이 기재된다.

일부 측면에서, 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 65% 내지 약 70%였고; 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 64% 내지 약 97%였고; 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 59% 내지 약 82%였다.

다른 측면에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서, (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동한지 약 24 시간 후에 세포의 활력이 적어도 약 30% 내지 약 112%였던 것인 방법이 기재된다.

일부 측면에서, 해동한지 약 24 시간 후에 세포의 활력이 적어도 약 89% 내지 약 110%였고; 해동한지 약 24 시간 후에 세포의 활력이 적어도 약 76% 내지 약 112%였다.

다른 측면에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서, (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 및 배양한지 약 8-18 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 3 내지 약 7배였던 것인 방법이 기재된다.

다른 측면에서, 해동 및 배양한지 약 14 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 4.2 내지 약 5.4배였다. 추가의 다른 측면에서, 해동 및 배양한지 약 14 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 4.2 내지 약 4.9배였고; 해동 및 배양한지 약 14 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 4.5 내지 약 5.4배였다.

다른 측면에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서, (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; (c) 동결보존된 세포 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 세포가 해동 후에 약 100 Ω 내지 약 1300 Ω의 장벽 기능 TEER; 약 3.5 내지 약 9.4의 PEDF 상부 대 하부 비; 약 1.2 내지 약 5의 VEGF 하부 대 상부 비; 또는 약 95% 내지 약 100%의 순도 중 하나 이상을 입증한 것인 방법이 기재된다.

일부 측면에서, 세포는 약 107 내지 약 402 Ω; 또는 약 241 내지 약 715 Ω의 장벽 기능을 가졌다. 다른 측면에서, 세포는 약 5.1 내지 약 9.4; 또는 약 3.5 내지 약 9.4의 PEDF 상부 대 하부 비를 가졌다. 다른 측면에서, 세포는 약 1.2 내지 약 1.7; 또는 약 1.2 내지 약 1.9의 VEGF 하부 대 상부 비를 가졌다.

일부 측면에서, 퓨린 뉴클레오시드, 분지형 글루칸, 완충제, 및 극성 비양성자성 용매 중 1종 이상은 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정된다.

다른 측면에서, 세포 보존은 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 추가로 포함한다.

추가의 다른 측면에서, 당 산은 락토비온산, 글리세르산, 크실론산, 글루콘산, 아스코르브산, 뉴라민산, 케토데옥시옥툴로손산, 글루쿠론산, 갈락투론산, 갈락투론산, 이두론산, 타르타르산, 뮤신산, 또는 사카르산을 포함한다.

일부 측면에서, 1종 이상의 염기는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 포함한다. 일부 측면에서, 항산화제는 L-글루타티온, 아스코르브산, 리포산, 요산, 카로텐, 알파-토코페롤, 또는 유비퀴놀을 포함한다. 일부 측면에서, 1종 이상의 할라이드 염은 염화칼륨, 염화나트륨, 또는 염화마그네슘을 포함한다. 일부 측면에서, 염기성 염은 중탄산칼륨, 중탄산나트륨, 또는 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 측면에서, 포스페이트 염은 인산칼륨, 인산나트륨, 또는 인산칼륨을 포함한다. 일부 측면에서, 1종 이상의 당은 덱스트로스, 수크로스를 포함한다. 일부 측면에서, 당 알콜은 만니톨, 소르비톨, 에리트리톨 또는 크실리톨을 포함한다. 일부 측면에서, 당 산, 염기, 할라이드 염, 염기성 염, 항산화제, 포스페이트 염, 당, 당 알콜 중 1종 이상은 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정된다.

다른 측면에서, RPE 조성물은 망막하로 투여된다. 다른 측면에서, RPE 조성물은 전달 디바이스를 이용하여 투여된다. 다른 측면에서, 전달 디바이스는 니들, 모세관 및 팁을 포함한다. 다른 측면에서, 전달 디바이스는 약 0.63 mm의 외부 직경 및 약 0.53 mm의 내부 직경을 갖는 니들, 약 0.5 mm의 외부 직경 및 약 0.25 mm의 내부 직경을 갖는 모세관, 및 약 0.12 mm의 외부 직경 및 약 0.07 mm의 내부 직경을 갖는 팁을 포함한다.

특정 측면에서, 전달후 퍼센트 생존력은 약 85% 내지 약 99%이고, 전달후 퍼센트 회복률은 약 65% 내지 약 99%이고, 전달후 장벽 기능 TEER은 약 100 내지 약 600 Ω이고, PEDF 정단/기저 비는 약 2 내지 약 7이고, 전달후 VEGF 기저/정단 비는 약 1.5 내지 약 3이다.

일부 측면에서, 조성물은 망막하 공간으로 투여된다. 일부 측면에서, 조성물은 주사된다. 일부 측면에서, 조성물은 단일 용량 치료로서 투여된다.

다른 측면에서, 조성물은 투여된 후에 염증을 야기하지 않는다. 추가의 다른 측면에서, 염증은 염증과 연관된 세포의 존재를 특징으로 한다. 다른 측면에서, 세포 조성물은 유리체절제 없이 및 망막을 천공할 필요 없이 투여된다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 맥락막상 주사에 의해 투여된다.

일부 측면에서, 세포는 신경영양 인자: 섬유모세포 성장 인자 (bFGF 및 aFGF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 색소 상피-유래된 인자 (PEDF), 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 중 1종 이상을 분비한다. 일부 측면에서, 세포는 1종 이상의 항염증성 시토카인을 분비한다.

다른 측면에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서, (a) 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물을 포함하는 배지 조성물 중에서 RPE 세포를 현탁시키고; (b) 동결보존에 적절한 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 적어도 약 60% 내지 약 95%가 생존가능한 것인 방법이 기재된다.

다른 측면에서, 해동 후에 세포의 적어도 약 40% 내지 약 100%가 생존가능하고; 해동 후에 세포의 적어도 약 45% 내지 약 95%가 생존가능하고; 해동 후에 세포의 적어도 약 62% 내지 약 70%가 생존가능하다.

일부 측면에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서, (a) 줄기 세포를 RPE 세포를 포함하는 세포의 집단으로 분화시키고; (b) RPE 세포를 효소적으로 수확하고; (c) 효소를 중화제에 의해 중화시키며, 여기서 중화제는 인간 혈청을 포함하지 않는 것이고; (d) 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물을 포함하는 배지 조성물 중에서 RPE 세포를 현탁시키고; (e) 동결보존에 적절한 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; (f) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 적어도 약 70%가 생존가능한 것인 방법이 기재된다.

일부 측면에서, RPE 세포를 중화제 중에서 약 1 내지 약 8 시간 동안 저장하며, 생존력은 약 10% 초과로 감소되지 않는다. 일부 측면에서, RPE 세포를 동결보존 이전에 배지 조성물 중에서 약 3 시간 동안 현탁시키며, 배지 중에서 1 시간 미만 동안 현탁시킨 RPE 세포와 비교하여 해동후 퍼센트 생존력이 약 10% 초과로 감소되지 않고, 해동후 퍼센트 수율은 20% 초과로 감소되지 않고, 해동후 활력이 10% 초과로 감소되지 않는다.

일부 측면에서, RPE 세포를 동결보존 이전에 배지 조성물 중에서 약 3 시간 동안 현탁시키며, 배지 중에서 1 시간 미만 동안 현탁시킨 RPE 세포와 비교하여 해동후 장벽 기능이 감소되지 않고, 해동후 PEDF 상부 대 하부 비가 10% 초과로 감소되지 않고, 해동후 VEGF 하부 대 상부 비가 감소되지 않는다.

일부 측면에서, RPE 세포를 동결보존 이전에 배지 조성물 중에서 약 2 내지 3 시간 동안 현탁시키고, 해동후 퍼센트 생존력은 약 50 내지 약 75이고, 해동후 퍼센트 수율은 약 50 내지 약 95이고, 해동후 활력은 약 80 내지 약 120이고, 해동후 장벽 기능은 약 100 내지 약 750 Ω이고, 해동후 PEDF 상부 대 하부 비는 약 3 내지 약 7이고, 해동후 VEGF 하부 대 상부 비는 약 1 내지 3이다.

일부 측면에서, 상기 기재된 방법은 단계 (c) 이후에 RPE 세포를 순차적으로 여과하는 것을 추가로 포함하고, 퍼센트 생존력은 적어도 98%이다. 일부 측면에서, 상기 방법은 단계 (c) 이후에 RPE 세포를 순차적으로 여과하고, RPE 세포를 배지 조성물 중에서 약 2-4 시간 동안 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하고, 퍼센트 회복률은 약 80% 내지 약 95%이다.

일부 측면에서, 상기 기재된 방법은 단계 (c) 이후에 RPE 세포를 순차적으로 여과하고, RPE 세포를 중화 용액 중에서 약 2 내지 약 4 시간 동안 인큐베이션하고, RPE 세포를 배지 조성물 중에서 약 2-4 시간 동안 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하고, 퍼센트 생존력은 약 80% 내지 약 99%이고, 퍼센트 회복률은 약 70% 내지 약 95%이다.

다른 측면에서, 상기 기재된 방법은 단계 (c) 이후에 RPE 세포를 순차적으로 여과하고, RPE 세포를 중화 용액 중에서 약 2 내지 약 4 시간 동안 인큐베이션하고, RPE 세포를 배지 조성물 중에서 약 2-4 시간 동안 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하고, 해동후 퍼센트 생존력은 약 80% 내지 약 99%이고, 해동후 퍼센트 회복률은 약 70% 내지 약 95%이고, PEDF 분비는 약 2,000 ng/ml/일 내지 약 3,000 ng/ml/일이다.

다른 측면에서, 상기 기재된 방법은 RPE 세포를 배지 조성물 중에서 약 2-6 시간 동안 실온에서 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하고, 퍼센트 생존력은 약 80% 내지 약 99%이고, 퍼센트 회복률은 약 80% 내지 약 120%이다.

다른 측면에서, (a) 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물; 및 (b) RPE 세포를 포함하는 조성물로서, 극저온 온도에서 저장될 수 있고 해동 직후에 대상체에게 즉시 투여가능한 조성물이 기재된다.

다른 측면에서, (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지; 및 (b) RPE 세포를 포함하는 조성물이 기재된다.

특정 조성물에서, 퓨린 뉴클레오시드, 분지형 글루칸, 완충제, 및 극성 비양성자성 용매 중 1종 이상은 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정된다.

다른 측면에서, 본원에 기재된 치료용 세포 조성물은 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 추가로 포함한다.

상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 당 산은 락토비온산, 글리세르산, 크실론산, 글루콘산, 아스코르브산, 뉴라민산, 케토데옥시옥툴로손산, 글루쿠론산, 갈락투론산, 갈락투론산, 이두론산, 타르타르산, 뮤신산, 또는 사카르산을 포함한다. 상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 1종 이상의 염기는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 포함한다. 상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 항산화제는 L-글루타티온, 아스코르브산, 리포산, 요산, 카로텐, 알파-토코페롤, 또는 유비퀴놀을 포함한다. 상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 1종 이상의 할라이드 염은 염화칼륨, 염화나트륨, 또는 염화마그네슘을 포함한다. 상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 염기성 염은 중탄산칼륨, 중탄산나트륨, 또는 아세트산나트륨을 포함한다. 상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 포스페이트 염은 인산칼륨, 인산나트륨, 또는 인산칼륨을 포함한다. 상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 1종 이상의 당은 덱스트로스, 수크로스를 포함한다. 상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 당 알콜은 만니톨, 소르비톨, 에리트리톨 또는 크실리톨을 포함한다. 상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 당 산, 염기, 할라이드 염, 염기성 염, 항산화제, 포스페이트 염, 당, 당 알콜 중 1종 이상은 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정된다.

상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, RPE 세포 농도는 약 100,000 내지 약 10,000,000개 세포/mL이다. 상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 상기 조성물 중에서 세포의 개수는 약 100,000 내지 약 500,000개이다.

상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 세포 보존 배지는 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 추가로 포함한다.

상기 기재된 조성물의 다른 측면에서, 조성물은 ROCK 억제제 또는 NA 중 1종 이상을 추가로 포함한다.

추가의 측면에서, 동결보존 배지는 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 약 2% DMSO를 포함한다. 다른 실시양태에서, 동결보존 배지는 약 5% DMSO를 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 동결보존 배지는 약 1% 내지 약 15% DMSO를 포함한다.

추가의 실시양태에서, 동결보존 배지는 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함한다. 더욱 추가의 실시양태에서, 퓨린 뉴클레오시드, 분지형 글루칸, 완충제, 및 극성 비양성자성 용매 중 1종 이상은 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정된다.

일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 추가로 포함한다.

다른 실시양태에서, 당 산, 염기, 할라이드 염, 염기성 염, 항산화제, 포스페이트 염, 당, 당 알콜 중 1종 이상은 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정된다.

특정 실시양태에서, 망막 변성 질환은 RPE 기능장애, 광수용체 기능장애, 리포푸신의 축적, 드루젠의 형성, 또는 염증 중 하나 이상일 수 있다.

다른 실시양태에서, 망막 변성 질환은 색소성 망막염, 레베르 선천성 흑암시, 유전성 또는 후천성 황반 변성, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 베스트병, 망막 박리, 뇌회형 위축, 맥락막결손, 패턴 이영양증, RPE 이영양증, 스타르가르트병, 광, 레이저, 감염, 방사선, 신생혈관 또는 외상성 손상 중 어느 하나에 의해 야기된 RPE 및 망막 손상 중 적어도 하나로부터 선택된다. 추가의 다른 실시양태에서, AMD는 지도형 위축 (GA)이다.

특정 실시양태에서, RPE 결함은 고령, 담배 흡연, 건강하지 못한 체중, 항산화제의 낮은 섭취, 또는 심혈관 장애 중 하나 이상으로부터 초래될 수 있다. 다른 실시양태에서, RPE 결함은 선천성 이상으로부터 초래될 수 있다.

다른 실시양태에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법은 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물을 포함하는 조성물 중에서 RPE 세포를 현탁시키고, 동결보존에 적절한 온도에서 세포 현탁액을 저장하고, 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 적어도 약 70%가 생존가능하다.

다른 실시양태에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법은 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 세포의 적어도 약 60% 내지 약 75%가 해동 후에 생존가능하다.

다른 실시양태에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법은 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 제형에 첨가하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 해동 후에 세포의 적어도 약 40% 내지 약 100%가 생존가능하고; 해동 후에 세포의 적어도 약 45% 내지 약 95%가 생존가능하고; 해동 후에 세포의 적어도 약 62% 내지 약 70%가 생존가능하다.

일부 실시양태에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법은 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 59% 내지 약 92%였다.

일부 실시양태에서, 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 65% 내지 약 70%였고; 적어도 해동 후에 세포의 수율이 약 64% 내지 약 92%였고; 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 59% 내지 약 82%였다.

일부 실시양태에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법은 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동한지 약 24 시간 후에 세포의 활력이 적어도 약 76% 내지 약 112%였다.

일부 실시양태에서, 해동한지 약 24 시간 후에 세포의 활력이 적어도 약 89% 내지 약 110%였고; 해동한지 약 24 시간 후에 세포의 활력이 적어도 약 76% 내지 약 112%였다.

다른 실시양태에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법은 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; 동결보존된 현탁액을 해동시키며, 여기서 해동 및 배양한지 약 14 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 4.2 내지 약 5.4배였다.

일부 실시양태에서, 해동 및 배양한지 약 14 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 4.2 내지 약 4.9배였고; 해동 및 배양한지 약 14 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 4.5 내지 약 5.4배였다. 일부 실시양태에서, 해동 및 배양한지 약 8-18 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 3 내지 약 7배였다. 일부 실시양태에서, 해동 및 배양한지 약 8 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 3 내지 약 5배였다.

일부 실시양태에서, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법은 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고; 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고; 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 세포가 해동 후에 약 100 내지 약 720의 장벽 기능; 약 3.5 내지 약 9.4의 PEDF 상부 대 하부 비; 약 1.2 내지 약 2.7의 VEGF 하부 대 상부 비; 약 95 내지 약 100%의 순도; 약 150 내지 약 900의 효력 중 하나 이상을 입증하였다.

일부 실시양태에서, 세포는 약 107 내지 약 402 Ω; 또는 약 241 내지 약 715 Ω의 장벽 기능을 가졌다.

일부 실시양태에서, 세포는 약 5.1 내지 약 9.4; 또는 약 3.5 내지 약 9.4의 PEDF 상부 대 하부 비를 가졌다.

일부 실시양태에서, 세포는 약 1.2 내지 약 1.7; 또는 약 1.2 내지 약 1.9의 VEGF 하부 대 상부 비를 가졌다.

일부 실시양태에서, 시력의 회복을 필요로 하는 대상체에서 시력을 회복시키는 방법은 대상체에게 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 물, 및 망막 색소 상피 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 시력의 회복을 필요로 하는 대상체에서 시력을 회복시키는 방법은 대상체에게 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지; 및 RPE 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 보존 배지는 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 세포 조성물은 망막하 공간으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 세포 조성물은 주사된다. 일부 실시양태에서, 세포 조성물은 유리체를 경유하여 망막하 공간으로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포 조성물은 단일 용량 치료로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 단일 용량 치료는 몇몇 주사를 포함하는 단일 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 주사는 몇몇 망막하 수포의 투여를 포함한다.

일부 실시양태에서, 세포 조성물은 유리체절제 없이 및 망막을 천공할 필요 없이 망막하 공간으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포 조성물은 맥락막상 주사에 의해 투여된다.

일부 실시양태에서 RPE 세포는 맥락막 모세혈관층 내피 및 광수용체의 구조적 온정성을 유지하는데 도움이 되는 다양한 신경영양 인자, 예컨대 섬유모세포 성장 인자 (bFGF 및 aFGF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 색소 상피-유래된 인자 (PEDF), 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 등을 분비한다. RPE 세포는 또한 눈의 면역 특권 성질을 확립하는데 중요한 항염증성 시토카인, 예컨대 형질전환 성장 인자 (TGF)-β를 분비한다. 본원에 기재된 RTA 치료용 세포 조성물에서 사용되는 RPE 세포는 신경영양 인자를 분비할 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포 조성물은 투여된 후에 염증을 야기하지 않는다. 일부 실시양태에서, 가벼운 염증은 염증과 연관된 세포의 존재를 특징으로 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 (a) 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물; 및 (b) RPE 세포를 포함하며, 여기서 조성물은 극저온 온도에서 저장될 수 있고, 여기서 조성물은 해동 직후에 대상체에게 즉시 투여가능하다.

다른 실시양태에서, 치료용 세포 조성물은 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지; 및 RPE 세포를 포함한다.

일부 실시양태에서, 세포 보존 배지는 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 추가로 포함한다.

추가의 다른 실시양태에서, 세포 보존 배지는 ROCK 억제제 및 NA 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, RPE 세포 조성물은 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물; 및 약 2,000,000 내지 약 5,000,000개 세포/mL의 세포 농도의 RPE 세포를 포함한다. 조성물은 극저온 온도에서 저장될 수 있고, 조성물은 해동 직후에 대상체에게 즉시 투여가능하다. 이 RPE 세포 조성물에서, 세포의 개수는 약 200,000 내지 약 500,000개일 수 있다. 또한, 대상체에게 투여되는 부피는 약 50 μl 내지 약 100 μl일 수 있다.

본원에 기재된 기술의 추가의 측면은 명세서의 하기 부분에서 확인될 것이며, 여기서 상세한 설명은 그에 대해 제한을 두지 않고 기술의 바람직한 실시양태를 충분히 개시하기 위한 목적이다.

본원에 기재된 기술은 하기 도면을 참조하여 더욱 충분히 이해될 것이며, 이는 단지 설명의 목적을 위한 것이다:
도 1은 해동 후에 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 생존력 및 활력을 제시하는 그래프이다. 세포는 해동하기 전에 5% DMSO (CS5)와 함께 동결보존 배지 중에서 동결보존되었다.
도 2는 나이브 동물 (비처리된 동물)의 눈의 조직학적 영상이며, 병리학을 나타내지 않는다 (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 3은 대조군 그룹에서 동물의 오른쪽 눈 (비처리된/대조군 눈)의 조직학적 영상이며, 병리학적 변화를 나타내지 않는다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 4a는 BSS 플러스로 치료되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 공막의 가벼운 침윤과 함께 가벼운 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 4b는 BSS 플러스로 치료되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 가벼운 염증 및 약간의 손실된 대식세포 및 림프구를 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 5a는 CS5로 처리되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 공막의 중간 정도의 염증 및 침윤을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 5b는 CS5로 처리되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 일부 대식세포 및 약간의 호중구와 함께 중간 정도의 염증을 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 6a는 CS2로 처리되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 각막에서 대식세포 및 호중구와 함께 중간 정도의 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 6b는 CS2로 처리되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 대식세포 및 호중구와 함께 중간 정도의 염증을 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 7a는 BSS 플러스:CS2로 처리되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 공막의 중간 정도의 침윤과 함께 강한 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 7b는 BSS 플러스:CS2로 처리되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 공막에서 림프구 옆의 우측 하단 코너에 제시된 피브린과 함께 강한 염증을 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 8a는 BSS 플러스로 치료되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 공막의 중간 정도의 침윤과 함께 중간 정도의 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 8b는 BSS 플러스로 치료되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 몇몇 대식세포와 함께 중간 정도의 염증을 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 9a는 CS5로 처리되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 국소 과립화 반응과 함께 강한 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 9b는 CS5로 처리되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 몇몇 대식세포 및 섬유모세포와 함께 강한 염증을 나타내고, 이는 초기 단계의 일시적인 이물질 반응을 입증한다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 10a는 CS2로 처리되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 국소 과립화 반응과 함께 강한 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 10b는 CS2로 처리되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 몇몇 대식세포 및 섬유모세포와 함께 강한 염증을 나타내고, 이는 초기 단계의 일시적인 이물질 반응을 입증한다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 11a는 BSS 플러스:CS2로 처리되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 가벼운 부종과 함께 가벼운 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 11b는 BSS 플러스:CS2로 처리되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 가벼운 염증 및 약간의 대식세포를 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 12a는 BSS 플러스로 치료되고 연구 10 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 약간의 대식세포와 함께 가벼운 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 12b는 BSS 플러스로 치료되고 연구 10 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 약간의 대식세포와 함께 가벼운 염증을 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 13a는 CS5로 처리되고 연구 10 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 약간의 대식세포와 함께 가벼운 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 13b는 CS5로 처리되고 연구 10 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 약간의 대식세포와 함께 가벼운 염증을 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 14a는 CS2로 처리되고 연구 10 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 약간의 대식세포와 함께 가벼운 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 14b는 CS2로 처리되고 연구 10 일째에 희생된 동물로부터 취한 왼쪽 눈 (처리된 눈)의 조직학적 영상이며, 약간의 대식세포와 함께 가벼운 염증을 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 15는 RPE 및 인접한 세포를 제시한다.
도 16은 대조군 그룹, G1과 비교하여 여과후 시간에 걸쳐 4℃에서 그룹 2 (G2) (NUTS(-)+HSA) 및 그룹 3 (G3) (NUTS(-))의 생존력의 그래프이다. 여과된 세포 조성물을 샘플링하였고, 3가지 시점에서: 여과후 0 시간, 2 시간후 및 4 시간후에 계수하였다 (n=3).
도 17a는 동결보존 이전에, 세포 생존력에 대한 여과후 치료용 세포 조성물의 0 시간 인큐베이션, 이어서 동결보존 배지 중에서 치료용 세포 조성물의 0, 2, 3 및 4 시간 인큐베이션의 효과를 제시하는 그래프이다.
도 17b는 동결보존 이전에, 세포 회복률에 대한 여과후 치료용 세포 조성물의 0 시간 인큐베이션, 이어서 동결보존 배지 중에서 치료용 세포 조성물의 0, 2, 3 및 4 시간 인큐베이션의 효과를 제시하는 그래프이다.
도 18a는 동결보존 이전에, 세포 생존력에 대한 여과후 치료용 세포 조성물의 2 시간 인큐베이션, 이어서 동결보존 배지 중에서 치료용 세포 조성물의 0, 2, 3 및 4 시간 인큐베이션의 효과를 제시하는 그래프이다.
도 18b는 동결보존 이전에, 세포 회복률에 대한 여과후 치료용 세포 조성물의 2 시간 인큐베이션, 이어서 동결보존 배지 중에서 치료용 세포 조성물의 0, 2, 3 및 4 시간 인큐베이션의 효과를 제시하는 그래프이다.
도 19a는 동결보존 이전에, 세포 생존력에 대한 여과후 치료용 세포 조성물의 4 시간 인큐베이션, 이어서 동결보존 배지 중에서 치료용 세포 조성물의 0, 2, 3 및 4 시간 인큐베이션의 효과를 제시하는 그래프이다.
도 19b는 동결보존 이전에, 세포 회복률에 대한 여과후 치료용 세포 조성물의 4 시간 인큐베이션, 이어서 동결보존 배지 중에서 치료용 세포 조성물의 0, 2, 3 및 4 시간 인큐베이션의 효과를 제시하는 그래프이다.
도 20a는 해동후 세포 생존력에 대한 동결배지 중에서 0, 2, 3 및 4 시간 동안 세포 조성물의 장기간 동결보존 이전 인큐베이션의 효과를 제시하는 그래프이다.
도 20b는 해동후 세포 회복률에 대한 동결배지 중에서 0, 2, 3 및 4 시간 동안 세포 조성물의 장기간 동결보존 이전 인큐베이션의 효과를 제시하는 그래프이다.
도 21a는 동결보존 이전에 효소 중화 용액 중에서 인큐베이션한 다음, 동결보존 이전에 동결배지 중에서 인큐베이션한 치료용 세포 조성물의 효과를 제시하는 그래프이다. 이어서, 세포를 동결보존하고, 해동시키고, 해동후 생존력에 대해 분석하였다.
도 21b는 동결보존 이전에 효소 중화 용액 중에서 인큐베이션한 다음, 동결보존 이전에 동결배지 중에서 인큐베이션한 치료용 세포 조성물의 효과를 제시하는 그래프이다. 이어서, 세포를 동결보존하고, 해동시키고, 해동후 회복률에 대해 분석하였다.
도 22는 여과하고 약 2-8℃에서 및 RT에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후에 치료용 세포의 퍼센트 회복률을 제시하는 그래프이다.
도 23a는 상이한 인큐베이션 조건 하에 동결배지를 포함하는 치료용 세포 조성물의 생존력을 제시하는 그래프이다.
도 23b는 상이한 인큐베이션 조건 하에 동결배지를 포함하는 치료용 세포 조성물의 생존력을 제시하는 그래프이다.
도 24a는 4 시간 기간에 걸쳐 실온에서 유지한 해동된 RTA 세포 조성물의 생존력을 제시하는 그래프이다. 세포를 0, 2, 4 시간 시점에서 시험하였다.
도 24b는 4 시간 기간에 걸쳐 실온에서 유지한 해동된 RTA 세포 조성물의 회복률을 제시하는 그래프이다. 세포를 0, 2, 4 시간 시점에서 시험하였다.
도 25a는 RTA (세포 + CS5)로 처리되고 연구 14 일째에 희생된 동물로부터 취한 처리된 눈의 조직학적 영상이며, 가벼운 염증 및 약간 손실된 대식세포 및 림프구를 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).
도 25b는 RTA (세포 + CS5)로 처리되고 연구 14 일째에 희생된 동물로부터 취한 처리된 눈의 조직학적 영상이며, 가벼운 염증 및 약간 손실된 대식세포 및 림프구를 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).

본원에 기재된 조성물은 대상체의 눈에 주사 또는 이식하기 전에 세척 또는 재구성과 같은 준비 절차를 필요로 하지 않는 치료 용도에 적합한 즉시 투여가능한 (RTA) 망막 색소 상피 (RPE) 세포 조성물로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 치료 조성물은 무독성 동결-용액으로 보존되고, 임상 지역으로 운송되고, 해동되고, 의료진에 의해 대상체의 눈에 즉시 투여된다. 투여전 준비 절차, 특히 GLP/GMP 조건 하에 수행되어야 하는 준비 절차를 제거함으로써, 안전성 및 품질을 보존하면서 RPE 세포 치료제에 광범위하게 접근할 수 있게 된다.

"망막 색소 상피 세포", "RPE 세포", "RPE"는 문맥상 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 망막의 색소 상피 세포 층을 형성하는 본래의 RPE 세포와 기능적으로, 후성적으로 또는 발현 프로파일에서 유사한 세포 유형을 갖는 세포를 지칭한다 (예를 들어, 눈 안으로 이식, 투여 또는 전달 시에, 이들은 본래의 RPE 세포와 유사한 기능적 활성을 나타냄).

일부 실시양태에 따라, RPE 세포는 성숙한 RPE 세포의 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 마커를 발현한다. 일부 실시양태에 따라, RPE 세포는 성숙한 RPE 세포의 적어도 2 내지 적어도 10개 또는 적어도 2 내지 적어도 30개의 마커를 발현한다. 이러한 마커에는 CRALBP, RPE65, PEDF, PMEL17, 베스트로핀 1 및 티로시나제가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 임의적으로, RPE 세포는 RPE 전구체의 마커 (예를 들어, MITF)를 또한 발현할 수 있다. 다른 실시양태에서, RPE 세포는 PAX-6을 발현한다. 다른 실시양태에서, RPE 세포는 Rx, OTX2 또는 SIX3을 비롯하여 이로 제한되지 않는 망막 전구 세포의 적어도 1개의 마커를 발현한다. 임의적으로, RPE 세포는 SIX6 및/또는 LHX2를 발현할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "성숙한 RPE 세포의 마커"는 비 RPE 세포 또는 미성숙 RPE 세포에 비해 성숙한 RPE 세포에서 (예를 들어, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배) 상승되는 항원 (예를 들어, 단백질)을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이 어구 "RPE 전구 세포의 마커"는 비 RPE 세포에 비해 RPE 전구 세포에서 (예를 들어, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배) 상승되는 항원 (예를 들어, 단백질)을 지칭한다.

다른 실시양태에 따라, RPE 세포는 망막의 색소 상피 세포 층을 형성하는 본래의 RPE 세포와 유사한 모폴로지를 갖는다. 예를 들어, 세포는 침착될 수 있고, 특징적인 다변형 형상을 갖는다.

추가의 다른 실시양태에 따라, RPE 세포는 황반 변성과 같은 질환을 치료할 수 있다.

추가의 실시양태에 따라, RPE 세포는 본원에서 상기 열거된 요건 중 적어도 1, 2, 3, 4가지 또는 모두를 충족시킨다.

본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "줄기 세포"는 특별한 특수화된 기능을 갖는 다른 세포 유형 (예를 들어 완전히 분화된 세포)으로 분화되도록 유도될 때까지 장기간 배양 기간 동안 미분화된 상태로 유지될 수 있는 세포 (예를 들어, 다능성 또는 다분화능 줄기 세포)를 지칭한다. 바람직하게는, 어구 "줄기 세포"는 배아 줄기 세포 (ESC), 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC), 성인 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 조혈성 줄기 세포를 포괄한다.

일부 실시양태에 따라, RPE 세포는 다능성 줄기 세포 (예를 들어, ESC 또는 iPSC)로부터 생성된다.

유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)는, 체세포의 유전자 조작에 의해, 예를 들어 전사 인자, 예컨대 Oct-3/4, Sox2, c-Myc 및 KLF4에 의한 체세포, 예컨대 섬유모세포, 간세포, 위 상피 세포의 레트로바이러스 형질도입에 의해 체세포로부터 생성될 수 있다 [Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49; Aoi T, et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 2008 Feb 14. (Epub ahead of print); IH Park, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008;451:141-146; K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131:861-872]. 수용자 세포가 유사분열에서 정지된 경우, 다른 배아-유사 줄기 세포는 난모세포로의 핵 전달, 배아 줄기 세포와의 융합, 또는 접합자로의 핵 전달에 의해 생성될 수 있다. 또한, iPSC는 예를 들어 소분자 또는 RNA를 사용함으로써 비통합 방법을 이용하여 생성될 수 있다.

어구 "배아 줄기 세포"는 3가지 모든 배아 생식 층 (즉, 내배엽, 외배엽 및 중배엽)의 세포로 분화할 수 있거나 또는 미분화된 상태로 유지될 수 있는 배아 세포를 지칭한다. 어구 "배아 줄기 세포"는 배아의 이식 전에 (즉, 이식전 배반포) 임신 후에 형성된 배아 조직 (예를 들어, 배반포)으로부터 수득되는 세포, 이식후/임신전 단계 배반포로부터 수득되는 확장된 배반포 세포 (EBC) (WO 2006/040763 참조) 및 임신 동안에 임의의 시점의, 바람직하게는 임신 10 주 이전의 태아의 생식기 조직으로부터 수득되는 배아 생식 (EG) 세포를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태의 배아 줄기 세포는 널리 공지된 세포-배양 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포는 인간 배반포로부터 단리될 수 있다.

인간 배반포는 전형적으로 인간 생체내 이식전 배아로부터 또는 시험관내 수정된 (IVF) 배아로부터 수득된다. 대안적으로, 단일 세포 인간 배아는 배반포 단계로 확장될 수 있다. 인간 ES 세포의 단리를 위해, 투명대를 배반포로부터 제거하고, 영양외배엽 세포를 용해시키고, 부드러운 피펫팅에 의해 온전한 내부 세포 매스 (ICM)로부터 제거하는 절차에 의해 ICM을 단리한다. 이어서, ICM을 그의 성장을 가능하게 하는 적절한 배지를 함유하는 조직 배양 플라스크에 플레이팅한다. 9 내지 15 일 후에, ICM 유래된 성장을 기계적 해리에 의해 또는 효소적 분해에 의해 덩어리로 해리시킨 다음, 세포를 신선한 조직 배양 배지 상에 다시 플레이팅한다. 미분화된 모폴로지를 입증하는 콜로니를 마이크로피펫에 의해 개별적으로 선택하고, 덩어리로 기계적으로 해리시키고, 다시 플레이팅한다. 이어서, 생성된 ES 세포를 4-7 일마다 일상적으로 분열시킨다. 인간 ES 세포의 제조 방법에 대한 추가의 상세한 내용에 대해서는 문헌 (Reubinoff et al. Nat Biotechnol 2000, May: 18(5): 559; Thomson et al., [미국 특허 번호 5,843,780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso et al., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; 및 Gardner et al., [Fertil. Steril. 69: 84, 1998])를 참조한다.

상업적으로 입수가능한 줄기 세포 또한 본 개시내용의 일부 실시양태에 따라 사용될 수 있음을 이해할 것이며, 인간 ES 세포를 NIH 인간 배아 줄기 세포 등록소, www.grants.nih.govstem_cells/로부터 또는 다른 hESC 등록소로부터 구입할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배아 줄기 세포주의 비제한적인 예는 HAD-C 102, ESI, BGO 1, BG02, BG03, BG04, CY12, CY30, CY92, CYIO, TE03, TE32, CHB-4, CHB-5, CHB-6, CHB-8, CHB-9, CHB-10, CHB-11, CHB-12, HUES 1, HUES 2, HUES 3, HUES 4, HUES 5, HUES 6, HUES 7, HUES 8, HUES 9, HUES 10, HUES 11, HUES 12, HUES 13, HUES 14, HUES 15, HUES 16, HUES 17, HUES 18, HUES 19, HUES 20, HUES 21, HUES 22, HUES 23, HUES 24, HUES 25, HUES 26, HUES 27, HUES 28, CyT49, RUES3, WAO 1, UCSF4, NYUES I, NYUES2, NYUES3, NYUES4, NYUES5, NYUES6, NYUES7, UCLA 1, UCLA 2, UCLA 3, WA077 (H7), WA09 (H9), WA 13 (H13), WA14 (H14), HUES 62, HUES 63, HUES 64, CT 1, CT2, CT3, CT4, MA135, Eneavour-2, WIBR 1, WIBR2, WIBR3, WIBR4, WIBR5, WIBR6, HUES 45, Shef 3, Shef 6, BJNhem19, BJNhem20, SAGO 1, SAOO1이다.

일부 실시양태에 따라, 배아 줄기 세포주는 HAD-C102 또는 ESI이다.

또한, ES 세포는 마우스 (Mills and Bradley, 2001), 골든 햄스터 [Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 127: 224-7], 래트 [lannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92], 토끼 [Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8; Graves & Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 30 36: 424-33], 몇몇 사육 동물 종 [Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil Suppl. 43: 255-60; Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8; Mitalipova et al., 2001, Cloning. 3: 59-67] 및 비-인간 영장류 종 (레수스 원숭이 및 마모셋) [Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 7844-8; Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9]을 비롯한 다른 종으로부터 수득될 수 있다.

확장된 배반포 세포 (EBC)는 장배 형성 이전의 단계에서 수정후 적어도 9 일째의 배반포로부터 수득될 수 있다. 배반포를 배양하기 전에, 투명대를 소화시켜서 [예를 들어, 타이로드(Tyrode) 산성 용액 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스)에 의해] 내부 세포 매스를 노출시킨다. 이어서, 수정후 (즉, 장배 형성 사건 이전에) 시험관 내에서 표준 배아 줄기 세포 배양 방법을 이용하여 배반포를 전체 배아로서 적어도 9 일 동안 (그리고 바람직하게는 14 일을 넘지 않게) 배양한다.

ES 세포의 또 다른 제조 방법은 [Chung et al., Cell Stem Cell, Volume 2, Issue 2, 113-117, 7 February 2008]에 기재된다. 이 방법은 시험관내 수정 과정 동안에 배아로부터 단일 세포를 제거하는 것을 포함한다. 배아는 이 과정에서 파괴되지 않는다.

EG (배아 생식) 세포는 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 실험실 기술을 이용하여 (인간 태아의 경우) 임신 약 8-11 주째의 태아로부터 수득된 원시 생식 세포로부터 제조될 수 있다. 생식 융선을 해리시키고, 소형 부분으로 절단한 후, 기계적 해리에 의해 세포로 분해시킨다. 이어서, EG 세포를 적절한 배지를 갖는 조직 배양 플라스크에서 성장시킨다. EG 세포와 일치하는 세포 모폴로지가 관찰될 때까지, 전형적으로 7-30 일 또는 1-4 계대 후에, 배지를 매일 대체하면서 세포를 배양한다. 인간 EG 세포의 제조 방법에 대한 추가의 상세한 내용은 Shamblott et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998] 및 미국 특허 번호 6,090,622를 참조하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

ES 세포의 추가의 또 다른 제조 방법은 단위생식에 의한 것이다. 배아는 상기 공정에서 파괴되지 않는다.

ES 배양 방법은 줄기 세포 증식을 위해 필요한 인자를 분비하고, 그와 동시에 그들의 분화를 억제하는 피더 세포 층을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 배양은 전형적으로 고체 표면, 예를 들어 젤라틴 또는 비멘틴으로 코팅된 표면 상에서 수행된다. 예시적인 피더 층은 인간 배아 섬유모세포, 성인 난관 상피 세포, 일차 마우스 배아 섬유모세포 (PMEF), 마우스 배아 섬유모세포 (MEF), 뮤린 태아 섬유모세포 (MFF), 인간 배아 섬유모세포 (HEF), 인간 배아 줄기 세포의 분화로부터 수득되는 인간 섬유모세포, 인간 태아 근육 세포 (HFM), 인간 태아 피부 세포 (HFS), 인간 성인 피부 세포, 인간 포피 섬유모세포 (HFF), 인간 탯줄 섬유모세포, 탯줄 또는 태반으로부터 수득되는 인간 세포, 및 인간 골수 기질 세포 (hMSC)를 포함한다. 성장 인자를 배지에 첨가하여 ESC를 미분화된 상태로 유지시킬 수 있다. 이러한 성장 인자에는 bFGF 및/또는 TGF가 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 작용제를 배지에 첨가하여 hESC를 나이브의 미분화된 상태로 유지시킬 수 있으며; 예를 들어 [Kalkan et al., 2014, Phil. Trans. R. Soc. B, 369: 20130540]를 참조한다.

인간 탯줄 섬유모세포를 인간 혈청 (예를 들어 20%) 및 글루타민으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (예를 들어 DMEM, SH30081.01, 하이클론(Hyclone)) 중에서 확장시킬 수 있다. 바람직하게는 인간 제대 세포를 방사선 조사한다. 이는 관련 기술분야에 공지된 방법 (예를 들어, 감마 셀(Gamma cell), 220 엑셀(Exel), 엠디에스 노르디온(MDS Nordion) 3,500 - 750Ω rads)을 이용하여 수행될 수 있다. 충분한 세포가 수득되면, 이들을 냉동시킬 수 있다 (예를 들어 동결보존시킬 수 있다). ESC의 확장을 위해, 약 20% 인간 혈청 (및 글루타민)으로 보충된 DMEM (예를 들어, SH30081.01, 하이클론) 중에서 약 25,000-100,000개 세포/cm²의 농도로 부착성 기질, 예컨대 젤라틴 (예를 들어, 재조합 인간 젤라틴 (RhG 100-001, 피브로겐(Fibrogen)) 또는 인간 비트로넥틴(Vitronectin) 또는 라미닌(Laminin) 521 (바이오 라미나(Bio lamina))로 임의적으로 코팅된 고체 표면 (예를 들어 T75 또는 T 175 플라스크) 상에 인간 제대 섬유모세포를 시딩할 수 있다. 1-4 일 후에 hESC를 보충 배지 (예를 들어, 인간 혈청 알부민을 갖는 뉴트리스템(NUTRISTEM)^® 또는 NUT(+)) 중에서 피더 세포의 상단에 플레이팅할 수 있다. 추가의 인자를 배지에 첨가하여 ESC, 예컨대 bFGF 및 TGFβ의 분화를 방지할 수 있다. 충분한 양의 hESC가 수득되면, 세포를 기계적으로 파괴할 수 있다 (예를 들어, 멸균성 팁 또는 일회용 멸균성 줄기 세포 도구를 사용함으로써; 14602 스웨메드(Swemed)). 예를 들어, 매주 계대하는 동안 세포를 기계적으로 확장시킬 수 있다. 대안적으로, 세포를 효소 처리 (예를 들어, 콜라게나제 A, 또는 트리플 셀렉트(TrypLE Select))에 의해 제거할 수 있다. hESC의 필요한 농도에 도달하도록 이 과정을 몇회 반복할 수 있다. 일부 실시양태에 따라, 첫번째 차례의 확장 이후에, 트리플 셀렉트를 이용하여 hESC를 제거하고, 두번째 차례의 확장 이후에, 콜라게나제 A를 이용하여 hESC를 제거한다.

분화 단계 이전에 ESC를 피더 상에서 확장시킬 수 있다. 예시적인 피더 층 기반 배양이 본원에서 상기에 기재된다. 확장은 전형적으로 적어도 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 또는 10 일 동안 수행된다. 확장은 적어도 1 계대, 적어도 2 계대, 적어도 3 계대, 적어도 4 계대, 적어도 5 계대, 적어도 6 계대, 적어도 7 계대, 적어도 8 계대, 적어도 9 계대 또는 적어도 10 계대 동안 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 확장은 적어도 2 계대 내지 적어도 20 계대 동안 수행된다. 다른 실시양태에서, 확장은 적어도 2 내지 적어도 40 계대 동안 수행된다. 확장 이후에, 다능성 줄기 세포 (예를 들어, ESC)를 분화제를 사용하여 지시된 분화에 적용할 수 있다.

피더 세포 무함유 시스템 또한 ES 세포 배양에서 이용될 수 있다. 이러한 시스템은 피더 세포 층에 대한 대체물로서 혈청 대체물, 시토카인 및 성장 인자 (예컨대, IL6 및 가용성 IL6 수용체 키메라)가 보충된 매트릭스를 사용한다. 줄기 세포를 배양 배지 - 예를 들어 론자(Lonza) L7 시스템, mTeSR, 스템프로(StemPro), XFKSR, E8, 뉴트리스템^®)의 존재 하에 고체 표면, 예컨대 세포외 매트릭스 (예를 들어, 마트리겔(MATRIGELR)™, 라미닌 또는 비트로넥틴) 상에서 성장시킬 수 있다. 피더 세포 및 줄기 세포의 동시 성장을 필요로 하고, 혼합된 세포 집단을 생성할 수 있는 피더-기반 배양과는 달리, 피더-무함유 시스템 상에서 성장한 줄기 세포는 표면으로부터 용이하게 분리된다. 줄기 세포를 성장시키기 위해 사용한 배양 배지는 분화를 효과적으로 억제하고 그들의 성장을 촉진시키는 인자, 예컨대 MEF-조건화된 배지 및 bFGF를 함유한다.

일부 실시양태에서, 확장 이후에, 다능성 ESC를 (구상체 또는 배양체의 중간 생성 없이) 부착성 표면 상에서 지시된 분화에 적용한다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/072763을 참조하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.

따라서, 본 개시내용의 측면에 따라, 부착성 표면 상에서 지시된 분화에 적용된 세포의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 미분화된 ESC이고, 다능성 마커를 발현한다. 예를 들어, 세포의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 Oct4⁺TRA- I-60⁺이다. 미분화 ESC는 다른 다능성 마커, 예컨대 NANOG, Rex- 1, 알칼리 포스파타제, Sox2, TDGF- 베타, SSEA-3, SSEA-4, SSEA-5, OCT4, TRA-1-60 및/또는 TRA-1-81을 발현할 수 있다.

한 예시적인 분화 프로토콜에서, 미분화 배아 줄기 세포를 제1 분화제를 사용하여 부착성 표면 상에서 RPE 세포 계통으로 분화시킨 다음, 수많은 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 수퍼패밀리, (예를 들어 TGF 1, TGF2, 및 TGF 3 아형, 뿐만 아니라 상동성 리간드, 예컨대 액티빈 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 및 액티빈 AB), 결절, 항-뮐러 호르몬 (AMH), 일부 골 형태발생 단백질 (BMP), 예를 들어 BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 및 BMP7, 및 성장 및 분화 인자 (GDF))를 사용하여 RPE 세포로 분화시킨다. 구체적인 실시양태에 따라, 형질전환 성장 인자-β (TGFβ) 수퍼패밀리의 구성원은 액티빈 A - 예를 들어 20-200 ng/mL, 예를 들어 100-180 ng/mL이다.

일부 실시양태에 따라, 제1 분화제는 약 1-100 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 및 예를 들어 10 mM의 농도로 사용되는 니코틴아미드 (NA)이다. 다른 실시양태에 따라, 제1 분화제는 3-아미노벤즈민이다.

"니아신아미드"로도 공지된 NA는 베타 세포 기능을 보존하고 개선시키는 것으로 생각되는 비타민 B3 (니아신)의 아미드 유도체 형태이다. NA는 화학식 C6H6N20를 갖는다. NA는 성장 및 음식의 에너지 전환에 필수적이고, 관절염 치료 및 당뇨병 치료 및 예방에 사용되어 왔다.

일부 실시양태에 따라, 니코틴아미드는 니코틴아미드 유도체 또는 니코틴아미드 모방체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "니코틴아미드 (NA)의 유도체"는 천연 NA의 화학적으로 변형된 유도체인 화합물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 화학적 변형은 아미드 모이어티의 질소 또는 산소 원자를 통해 염기성 NA 구조체의 피리딘 고리의 치환 (고리의 탄소 또는 질소 구성원을 통해)일 수 있다. 치환될 때, 1개 이상의 수소 원자는 치환체로 대체될 수 있고/거나 N 원자에 부착되어 4가의 양으로 하전된 질소를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 니코틴아미드는 치환된 또는 비치환된 니코틴아미드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학적 변형은 예를 들어 NA의 티오벤즈아미드 유사체를 형성하기 위한 단일 기의 결실 또는 대체일 수 있으며, 이들 모두는 유기 화학에 정통한 사람들에 의해 이해되는 것과 같다. 본 발명의 문맥에서 유도체에는 NA의 뉴클레오시드 유도체 (예를 들어, 니코틴아미드 아데닌) 또한 포함된다. NA의 다양한 유도체가 PDE4 효소의 억제 활성과 관련하여 (WO 03/068233; WO 02/060875; GB2327675A), 또는 VEGF-수용체 티로신 키나제 억제제로서 (WO 01/55114) 일부 기재된다. 예를 들어, 4-아릴-니코틴아미드 유도체 (WO 05/014549)의 제조 방법. 다른 예시적인 니코틴아미드 유도체가 WO 01/55114 및 EP2128244에 개시된다.

니코틴아미드 모방체는 변형된 형태의 니코틴아미드, 및 다능성 세포로부터 RPE 세포의 분화 및 성숙에서 니코틴아미드의 효과를 재현하는 니코틴아미드의 화학적 유사체를 포함한다. 예시적인 니코틴아미드 모방체에는 벤조산, 3-아미노벤조산, 및 6-아미노니코틴아미드가 포함된다. 니코틴아미드 모방체로서 작용할 수 있는 또 다른 부류의 화합물은 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARR)의 억제제이다. 예시적인 PARP 억제제에는 3-아미노벤즈아미드, 이니파립 (BSI 201), 올라파립 (AZD-2281), 루카파립 (AG014699, PF- 01367338), 벨리파립 (ABT-888), CEP 9722, MK 4827, 및 BMN- 673이 포함된다.

추가로 고려되는 분화제에는 예를 들어 노긴, Wnt의 길항제 (Dkk1 또는 IWR1e), 결절 길항제 (Lefty-A), 레티노산, 타우린, GSK3b 억제제 (CHIR99021) 및 노치 억제제 (DAFT)가 포함된다.

특정 실시양태에 따라, 분화는 다음과 같이 수행된다: (a) 제1 분화제 (예를 들어 니코틴아미드)를 포함하는 배지 중에서 ESC의 배양; 및 (b) TGFβ 수퍼패밀리의 구성원 (예를 들어 액티빈 A) 및 제1 분화제 (예를 들어 니코틴아미드)를 포함하는 배지 중에서 단계 a)로부터 수득된 세포의 배양. 단계 (a)는 TGFβ 수퍼패밀리의 구성원 (예를 들어 액티빈 A)의 부재 하에 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 단계 (a)에서 배지에는 TGFβ 수퍼패밀리의 구성원이 전혀 없다. 다른 실시양태에서, 배지 중에서 TGFβ 수퍼패밀리 구성원의 수준은 20 ng/mL, 10 ng/mL, 1 ng/mL 미만 또는 심지어 0.1 ng/mL 미만이다.

상기 기재된 프로토콜은 제1 분화제 (예를 들어 니코틴아미드)는 포함하지만 TGFβ 수퍼패밀리의 구성원 (예를 들어 액티빈 A)은 전혀 없는 배지 중에서 단계 (b)에서 수득된 세포를 배양함으로써 계속될 수 있다. 이 단계는 본원에서 단계 (b^*)로 지칭된다.

상기 기재된 프로토콜은 이제 추가의 실시양태와 함께 더욱 상세하게 기재된다.

단계 (a): 충분한 양의 ESC가 수득되면 분화 과정이 시작된다. 이들을 전형적으로 세포 배양물로부터 (예를 들어, 콜라게나제 A, 디스파제, 트리플 셀렉트, EDTA를 사용함으로써) 제거하고, 니코틴아미드의 존재 하에 (그리고 액티빈 A의 부재 하에) 비-부착성 기질 (예를 들어, 세포 배양 플레이트, 예컨대 히드로셀(Hydrocell) 또는 아가로스-코팅된 배양물 디쉬, 또는 페트리 박테리아용 디쉬) 상에 플레이팅한다. 니코틴아미드의 예시적인 농도는 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 및 10 mM이다. 세포를 비-부착성 기질 (예를 들어 세포 배양 플레이트) 상에 플레이팅한 후에, 세포 배양물은 세포 현탁액, 바람직하게는 현탁액 배양물 중의 자유-부유 클러스터, 즉, 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로부터 유래된 세포의 응집물로 지칭될 수 있다. 세포 클러스터는 임의의 기질 (예를 들어, 배양 플레이트, 담체)에 부착하지 않는다. 자유 부유 줄기 세포의 공급원은 이전에 WO 06/070370에 기재되었고, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이 단계는 최소 1 일, 더욱 바람직하게는 2 일, 3 일, 1 주 또는 심지어 14 일 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포를 예를 들어 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 예를 들어 10 mM의 니코틴아미드와 함께 (및 액티빈 A의 부재 하에) 현탁액 중에서 3 주 초과 동안 배양하지 않는다. 한 실시양태에서, 세포를 예를 들어 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 예를 들어 10 mM의 니코틴아미드와 함께 (및 액티빈 A의 부재 하에) 현탁액 중에서 6-8 일 동안 배양한다.

일부 실시양태에 따라, 세포를 비-부착성 기질, 예를 들어 세포 배양 플레이트 상에서 배양할 때, 대기 산소 조건은 20%이다. 그러나, 대기 산소 조건의 조작은 또한 대기 산소 퍼센트가 약 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 미만 또는 심지어 약 5% 미만 (예를 들어, 1% - 20%, 1% - 10% 또는 0 - 5%)이도록 고려된다. 다른 실시양태에 따라, 세포를 초기에는 정상 대기 산소 조건 하에 비-부착성 기질 상에서 배양한 다음, 정상 미만의 대기 산소 조건으로 저하시킨다. 일부 실시양태에서, 세포를 초기 분화 동안에는 저산소 수준 하에 배양한 다음, 후기 분화 동안에는 고산소 수준 하에 배양한다.

비-부착성 세포 배양 플레이트의 예에는 눈크(Nunc)에 의해 제작된 것들 (예를 들어, 히드로셀 카탈로그 번호 174912) 등이 포함된다.

클러스터는 적어도 50-500,000, 50-100,000, 50-50,000, 50-10,000, 50-5000, 50-1000개 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에 따라, 클러스터 중의 세포는 층으로 조직화되지 않고, 불규칙한 형태를 형성한다. 한 실시양태에서, 클러스터에는 다능성 배아 줄기 세포가 전혀 없다. 또 다른 실시양태에서, 클러스터는 소량의 다능성 배아 줄기 세포 (예를 들어, 단백질 수준에서 OCT4 및 TRA-1-60을 공동-발현하는 5 % 이하, 또는 3 % 이하 (예를 들어 0.01-2.7%)의 세포)를 포함한다. 전형적으로, 클러스터는 니코틴아미드의 영향 하에 부분적으로 분화된 세포를 포함한다. 이러한 세포는 주로 신경 및 망막 전구체 마커, 예컨대 PAX6, Rax, Six3 및/또는 CHX10을 발현한다.

관련 기술분야에 공지된 효소적 또는 비효소적 방법 (예를 들어, 기계적)을 이용하여 클러스터를 해리시킬 수 있다. 일부 실시양태에 따라, 클러스터 - 예를 들어 2-100,000개 세포, 2-50,000개 세포, 2-10,000개 세포, 2-5000개 세포, 2-1000개 세포, 2-500개 세포, 2-100개 세포, 2-50개 세포의 응집물 또는 덩어리가 더이상 없도록 세포를 해리시킨다. 특별한 실시양태에 따라, 세포는 단일 세포 현탁액 중에 있다.

이어서, 세포 (예를 들어, 해리된 세포)를 부착성 기질 상에 플레이팅하고, 예를 들어 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1- 50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 예를 들어 10 mM의 니코틴아미드의 존재 하에 (액티빈 A의 부재 하에) 배양할 수 있다. 이 단계는 최소 1 일, 더욱 바람직하게는 2 일, 3 일, 1 주 또는 심지어 14 일 동안 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포를 니코틴아미드의 존재 하에 (및 액티빈의 부재 하에) 3 주 초과 동안 배양하지 않는다. 예시적인 실시양태에서, 이 단계를 6-7 일 동안 수행한다.

다른 실시양태에 따라, 세포를 부착성 기질, 예를 들어 라미닌 상에서 배양할 때, 대기 산소 조건은 20%이다. 이들은 백분율이 약 20%, 15%, 10% 미만, 더욱 바람직하게는 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6 % 미만 및 더욱 바람직하게는 약 5% 미만 (예를 들어, 1% - 20%, 1% - 10% 또는 0 - 5%)이도록 조작될 수 있다.

일부 실시양태에 따라, 세포를 초기에는 정상 대기 산소 조건 하에 부착성 기질 상에서 배양하고, 후속적으로 산소를 정상 미만의 대기 산소 조건으로 저하시킨다. 다른 실시양태에 따라, 세포를 초기에는 정상 미만의 대기 산소 조건 하에 부착성 기질 상에서 배양하고, 후속적으로 산소를 정상 대기 산소 조건으로 상승시킨다.

부착성 기질 또는 물질들의 혼합물의 예에는 피브로넥틴, 라미닌, 폴리D-리신, 콜라겐 및 젤라틴이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.

단계 (b): 지시된 분화의 첫번째 단계 이후에 (단계 a; 즉, 니코틴아미드 (예를 들어, 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 예를 들어 10 mM)의 존재 하에 배양), 부분-분화된 세포를 부착성 기질 상에서 추가의 분화 단계에 적용하며, 액티빈 A (예를 들어, 0.01-1000 ng/mL, 0.1-200 ng/mL, 1-200 ng/mL 예를 들어 140 ng/mL, 150 ng/mL, 160 ng/mL 또는 180 ng/mL)의 존재 하에 배양한다. 따라서, 액티빈 A를 0.1 pM-10 nM, 10 pM-10 nM, 0.1 nM-10 nM, 1 nM-10 nM, 예를 들어 5.4 nM의 최종 몰농도로 첨가할 수 있다.

니코틴아미드 또한 이 단계에서 첨가할 수 있다 (예를 들어, 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 예를 들어 10 mM). 이 단계는 1 일 내지 10 주, 3 일 내지 10 주, 1 주 내지 10 주, 1 주 내지 8 주, 1 주 내지 4 주 동안, 예를 들어 적어도 1 일, 적어도 2 일, 적어도 3 일, 적어도 5 일, 적어도 1 주, 적어도 9 일, 적어도 10 일, 적어도 2 주, 적어도 3 주, 적어도 4 주, 적어도 5 주, 적어도 6 주, 적어도 7 주, 적어도 8 주, 적어도 9 주, 적어도 10 주 동안 수행할 수 있다.

일부 실시양태에 따라, 이 단계를 약 8 일 내지 약 2 주 동안 수행한다. 이 분화 단계를 본원에서 상기 기재된 바와 같이 낮은 또는 정상 대기 산소 조건에서 수행할 수 있다.

단계 (b^*): 지시된 분화의 두번째 단계 이후에 (즉, 부착성 기질 상에서 니코틴아미드 및 액티빈 A의 존재 하에 배양; 단계 (b)), 추가의 분화된 세포를 임의적으로 부착성 기질 상에서 후속 분화 단계에 적용하며, 니코틴아미드 (예를 들어, 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 예를 들어 10 mM)의 존재 하에 액티빈 A의 부재 하에 배양한다. 이 단계를 적어도 1 일, 2, 일, 5 일, 적어도 1 주, 적어도 2 주, 적어도 3 주 또는 심지어 4 주 동안 수행할 수 있다. 이 분화 단계는 또한 본원에서 상기 기재된 바와 같이 낮은 또는 정상 대기 산소 조건에서 수행할 수 있다.

ESC가 분화되는 염기성 배지는 시험관내 세포 성장을 뒷받침하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 공지된 세포 배양 배지, 전형적으로 정의된 염기 용액을 포함하는 배지이며, 이는 염, 당, 아미노산, 및 배양물 중에서 세포를 생존가능한 상태로 유지시키는데 필요한 임의의 다른 영양분을 포함한다. 구체적인 실시양태에 따라, 염기성 배지는 조건화된 배지가 아니다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 상업적으로 입수가능한 염기성 배지의 비제한적인 예는 뉴트리스템^® (ESC 분화의 경우 bFGF 및 TGF 없음, ESC 확장의 경우 bFGF 및 TGF 있음), 뉴로바잘(NEUROBASAL)™, KO-DMEM, DMEM, DMEM/F12, 셀그로(CELLGRO)™ 줄기 세포 성장 배지, 또는 엑스-비보(X-VIVO)™를 포함한다. 염기성 배지를 세포 배양을 다루는 관련 기술분야에 공지된 다양한 작용제로 보충할 수 있다. 하기는 본 개시내용에 따라 사용되는 배양물에 포함될 수 있는 다양한 보충물에 대한 비제한적인 참조이다: 혈청 또는 혈청 대체물 함유 배지, 예컨대 비제한적으로 녹아웃 혈청 대체물 (KOSR), 뉴트리도마(NUTRIDOMA)-CS, TCH™, N2, N2 유도체, 또는 B27 또는 조합물; 세포외 매트릭스 (ECM) 성분, 예컨대 비제한적으로 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 및 젤라틴. 이어서, ECM을 사용하여, 성장 인자의 TGFβ 수퍼패밀리의 1종 이상의 구성원; 항박테리아제, 예컨대 비제한적으로 페니실린 및 스트렙토마이신; 및 비필수 아미노산 (NEAA), 배양물 중에서 SC의 생존을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 공지된 뉴트로핀, 예컨대 비제한적으로 BDNF, NT3, NT4를 운반할 수 있다.

일부 실시양태에 따라, ESC의 분화에 사용되는 배지는 뉴트리스템^® 배지 (바이올로지컬 인더스트리즈(Biological Industries), 06-5102-01- IA)이다.

일부 실시양태에 따라, ESC의 분화 및 확장은 이종이 없는 조건 하에 수행된다.

다른 실시양태에 따라, 증식/성장 배지에는 이종 오염물이 전혀 없으며, 즉, 동물 유래된 성분, 예컨대 혈청, 동물 유래된 성장 인자 및 알부민이 없다. 따라서, 이들 실시양태에 따라, 배양을 이종 오염물의 부재 하에 수행한다.

이종이 없는 조건 하에 ESC의 다른 배양 방법은 미국 특허 출원 번호 20130196369에 제공되어 있으며, 그의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

RPE 세포를 포함하는 제제는 우수 제조 관리기준 (GMP)에 따라 (예를 들어, 제제는 GMP-적합판정임) 및/또는 현행 우수 조직 관리기준 (GTP)에 따라 (예를 들어, 제제는 GTP-적합판정일 수 있음) 제조될 수 있다.

분화 단계 동안에, 배아 줄기 세포는 그들의 분화 상태에 대해 모니터링될 수 있다. 세포 분화는 분화의 지표인 것으로 공지된 세포 또는 조직-특이적 마커의 실험 시에 결정될 수 있다.

조직/세포 특이적 마커는 관련 기술분야에 널리 공지된 면역학적 기술을 이용하여 검출될 수 있다 [Thomson JA et al., (1998). Science 282: 1145-7]. 그 예에는 막-결합된 또는 세포내 마커에 대한 유세포 분석, 세포외 및 세포내 마커에 대한 면역조직화학, 및 분자 마커에 대한 효소적 면역검정이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

상기 기재된 분화 단계 이후에, 착색된 및 착색되지 않은 세포 둘 다를 포함하는 혼합된 세포 집단을 수득할 수 있다. 이 측면에 따라, 혼합된 세포 집단의 세포를 플레이트로부터 제거한다. 일부 실시양태에서, 이는 효소적으로 수행된다 (예를 들어, 트립신 사용, (트리플 셀렉트); 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/021973을 참조하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨). 본 발명의 이 측면에 따라, 배양물로부터 제거된 (그리고 후속적으로 확장된) 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%는 착색되지 않은 세포이다. 다른 실시양태에서, 이는 기계적으로 - 예를 들어 세포 스크레이퍼를 사용하여 수행된다. 추가의 다른 실시양태에서, 이는 화학적으로 (예를 들어, EDTA) 수행된다. 효소적 및 화학적 처리의 조합 또한 고려된다. 예를 들어, EDTA 및 효소적 처리가 이용될 수 있다. 추가로, 배양물로부터 제거된 (그리고 후속적으로 확장된) 세포의 적어도 10%, 20% 또는 심지어 30%는 착색된 세포이다.

본 개시내용의 이 측면에 따라, 배양물 중의 모든 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%가 제거된다 (그리고 후속적으로 확장됨).

세포의 혼합된 집단의 확장은 세포외 매트릭스, 예를 들어, 젤라틴, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 (예를 들어, 라미닌 521), 피브로넥틴 및 폴리-D-리신 상에서 수행될 수 있다. 확장을 위해, 세포를 혈청-무함유 KOM, 혈청 포함 배지 (예를 들어, 20% 인간 혈청을 갖는 DMEM) 또는 뉴트리스템^® 배지 (06- 5102-01- IA, 바이올로지컬 인더스트리즈) 상에서 배양할 수 있다. 이들 배양 조건 하에, 적합한 조건 하에 계대한 후에, 정제된 RPE 세포의 집단이 수득되도록 착색된 세포 대 착색되지 않은 세포의 비를 증가시킨다. 이러한 세포는 특징적인 다변형 형상 모폴로지 및 RPE 세포의 색소 침착을 나타낸다.

한 실시양태에서, 확장은 니코틴아미드 (예를 들어, 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 예를 들어 10 mM)의 존재 하에 및 액티빈 A의 부재 하에 수행된다.

세포의 혼합된 집단을 현탁액 중에서 (미세-담체와 함께 또는 그 없이) 또는 단층으로 확장시킬 수 있다. 단층 배양물 중에서 또는 현탁액 배양물 중에서 세포의 혼합된 집단의 확장을 관련 기술분야에 정통한 사람들에게 널리 공지된 방법에 의해 생물반응기 또는 다중/하이퍼 스택에서 대규모 확장으로 변형시킬 수 있다.

일부 실시양태에 따라, 확장기는 적어도 1 주, 적어도 2 주, 적어도 3 주, 적어도 4 주, 적어도 5 주, 적어도 6 주, 적어도 7 주, 적어도 8 주, 적어도 9 주 또는 심지어 10 주 동안 수행된다. 바람직하게는, 확장기는 1 주 - 10 주, 더욱 바람직하게는 2 주 - 10 주, 더욱 바람직하게는, 3 주 - 10 주, 더욱 바람직하게는 4 주 - 10 주, 또는 4 주 - 8 주 동안 수행된다.

추가의 다른 실시양태에 따라, 세포의 혼합된 집단을 확장기 동안에 적어도 1회, 확장기 동안에 적어도 2회, 확장기 동안에 적어도 3회, 확장기 동안에 적어도 4회, 확장기 동안에 적어도 5회, 또는 확장기 동안에 적어도 6회 계대한다.

본 발명자들은, 세포를 효소적으로 수집할 때, 8 계대 초과, 9 계대 초과 및 심지어 10 계대 초과 (예를 들어, 11-15 계대) 동안 계속 확장시킬 수 있음을 확인하였다. 총 세포 배가의 수는 30 초과, 예를 들어, 31, 32, 33, 34 또는 그 초과로 증가될 수 있다. (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2017/021973을 참조하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨).

본원에 기재된 방법에 따라 생성된 RPE 세포의 집단은 수많은 상이한 파라미터에 따라 특징분석될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 수득된 RPE 세포는 다변형 형상을 갖고, 착색될 수 있다.

본원에 개시된 세포 집단에는 일반적으로 미분화된 인간 배아 줄기 세포가 전혀 없음을 이해할 것이다. 일부 실시양태에 따라, 예를 들어 FACS에 의해 측정 시, 1:250,000개 미만의 세포는 Oct4+TRA-1-60+ 세포이다. 세포는 또한 PCR에 의해 측정 시 GDF3 또는 TDGF의 발현을 (5,000배 초과로) 하향 조절할 수 있었다. 이 측면의 RPE 세포는 배아 줄기 세포 마커를 발현하지 않는다. 상기 1종 이상 배아 줄기 세포 마커는 OCT- 4, NANOG, Rex- 1, 알칼리 포스파타제, Sox2, TDGF- 베타, SSEA-3, SSEA-4, TRA- 1-60, 및/또는 TRA-1-81을 포함할 수 있다.

치료적 RPE 세포 제제는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% RPE 세포를 포함하도록 비-RPE 세포와 관련하여 실질적으로 정제될 수 있다. 치료적 RPE 세포 제제는 본질적으로 비-RPE 세포를 함유하지 않을 수 있거나 또는 RPE 세포로 이루어질 수 있다. 예를 들어, RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제는 약 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 비-RPE 세포 유형을 포함할 수 있다. 예를 들어, RPE 세포 제제는 약 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002%, 또는 0.0001% 미만의 비-RPE 세포를 포함할 수 있다.

RPE 세포 제제는 비-RPE 세포와 관련하여 뿐만 아니라 다른 성숙 수준의 RPE 세포와 관련하여 실질적으로 순수할 수 있다. 제제는 비-RPE 세포와 관련하여 실질적으로 정제될 수 있고, 성숙한 RPE 세포에 대해 강화될 수 있다. 예를 들어, 성숙한 RPE 세포에 대해 강화된 RPE 세포 제제에서, RPE 세포의 적어도 약 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99% 또는 100%는 성숙한 RPE 세포이다. 제제는 비-RPE 세포와 관련하여 실질적으로 정제될 수 있고, 성숙한 RPE 세포가 아니라 분화된 RPE 세포에 대해 강화될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포의 적어도 약 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 성숙한 RPE 세포가 아니라 분화된 RPE 세포일 수 있다.

본원에 기재된 제제에는 박테리아, 바이러스 또는 진균 오염 또는 감염, 예컨대 비제한적으로 HIV 1, HIV 2, HBV, HCV, HAV, CMV, HTLV 1, HTLV 2, 파보바이러스 B19, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, 또는 헤르페스바이러스 1 및 2, SV40, HHV5, 6, 7, 8, CMV, 폴리오마 바이러스, HPV, 엔테로바이러스의 존재가 실질적으로 없을 수 있다. 본원에 기재된 제제에는 마이코플라즈마 오염 또는 감염이 실질적으로 없을 수 있다.

본원에 개시된 세포 집단을 특징분석하는 또 다른 방식은 마커 발현에 의한 것이다. 따라서, 예를 들어, 면역염색에 의해 측정 시 세포의 적어도 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%는 베스트로핀 1을 발현할 수 있다. 한 실시양태에 따라, 세포의 80-100%는 베스트로핀 1을 발현한다.

다른 실시양태에 따라, 면역염색에 의해 측정 시 세포의 적어도 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% 또는 100%는 소안구증-연관된 전사 인자 (MITF)를 발현한다. 예를 들어, 세포의 80-100%는 MITF를 발현한다.

다른 실시양태에 따라, 면역염색에 의해 측정 시 세포의 적어도 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% 또는 100%는 소안구증-연관된 전사 인자 (MITF) 및 베스트로핀 1을 둘 다 발현한다. 예를 들어, 세포의 80-100%는 MITF 및 베스트로핀 1을 공동-발현한다.

다른 실시양태에 따라, 면역염색에 의해 측정 시 세포의 적어도 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% 또는 100%는 소안구증-연관된 전사 인자 (MITF) 및 Z0-1을 둘 다 발현한다. 예를 들어, 세포의 80-100%는 MITF 및 Z0-1을 공동-발현한다.

다른 실시양태에 따라, 면역염색에 의해 측정 시 세포의 적어도 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% 또는 100%는 Z0-1 및 베스트로핀 1을 둘 다 발현한다. 예를 들어, 세포의 80-100%는 Z0-1 및 베스트로핀 1을 공동-발현한다.

또 다른 실시양태에 따라, 면역염색 또는 FACS에 의해 측정 시 세포의 적어도 50%, 60% 70% 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% 또는 100%는 쌍형성 박스 유전자 6 (PAX-6)을 발현한다.

또 다른 실시양태에 따라, 면역염색에 의해 측정 시 세포의 적어도 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% 또는 100%는 세포성 레틴알데히드 결합 단백질 (CRALBP)을 발현한다. 예를 들어, 세포의 85-100%는 CRALBP를 발현한다.

또 다른 실시양태에 따라, 세포의 적어도 50%, 60% 70%, 80%, 85%, 87%, 89%, 90%, 95%, 97% 또는 100%는 면역염색에 의해 측정 시 세포성 멜라닌세포 계통-특이적 항원 GP100 (PMEL17)을 발현한다. 예를 들어, 세포의 85-100%는 PMEL17을 발현한다.

RPE 세포는 전형적으로 최종 분화를 나타내는 마커, 예를 들어 베스트로핀 1, CRALBP 및/또는 RPE65를 공동-발현한다. 또한, 본원에 기재된 RPE 세포는 RPE 일차 섬모에 대한 마커, 예컨대 ARL13B 및 GT335를 발현할 수 있다.

확장기 이후에, RPE 세포를 포함하는 세포 집단이 수득되며, 그의 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%가 CRALBP+ PMEL1 7+이다.

특정 실시양태에서, RPE 세포 조성물은 하기 방법에 따라 생성될 수 있다: (1) 인간 혈청 알부민 (HSA)을 갖는 NUT+ 중에서 2 주 동안 중심 웰 (CW) 플레이트에서 hUCF 상에서 hESC를 배양하고, (2) HSA를 갖는 NUT+ 중에서 4 내지 5 주 동안 (또는 원하는 양의 세포일 때까지) CW 플레이트에서 hUCF 상에서 hESC를 확장시키기 위해 기계적으로 계대하고, (3) HSA를 갖는 NUT+ 중에서 추가 1 주 동안 6 cm 플레이트에서 hUCF 상에서 (예를 들어, 콜라게나제를 사용하여) hESC 콜로니를 계속 확장시키고, (4) 니코틴아미드 (NIC)를 갖는 NUT- 중에서 약 1 주 동안 약 5개의 6 cm 플레이트로부터 1개의 히드로셀로 콜로니를 전달함으로써 구상체 (SB)를 제조하고, (5) NIC를 갖는 NUT- 중에서 약 1 주 동안 SB를 6-웰 플레이트의 2-3개 웰로 전달함으로써 Lam511 상에서 SB를 평탄화시키고, (6) NIC 및 액티빈을 갖는 NUT- 중에서 약 1 내지 2 주 동안 Lam511 상에서 부착성 세포를 배양하고, 배지를 NIC를 갖는 NUT-로 교체하고, 1 내지 3 주 동안 배양하고, (7) 효소, 예컨대 트리플 셀렉트를 사용하여 착색된 세포에 대해 강화시키고, (8) 20% 인간 혈청 및 NUT- 중에서 약 2 내지 9 주 동안 (배지 교체) 플라스크에서 젤라틴 상에서 RPE 세포를 확장시키고, (9) RPE 세포를 수확한다.

RPE 세포의 확장된 집단의 수확은 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 (예를 들어, 효소, 예컨대 트립신을 사용하여, 또는 화학적으로 EDTA 등을 사용하여) 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, RPE 세포를 적절한 용액, 예컨대 PBS 또는 BSS 플러스를 사용하여 세척할 수 있다. 일부 실시양태에서, RPE 세포를 수확하거나 강화시킨 후에 효소 중화 용액을 사용할 수 있다. 중화 용액은 예를 들어 인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민을 갖거나 또는 갖지 않는 배지를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, HS 또는 HAS를 갖거나 또는 갖지 않는 효소 중화 용액 중에서 장기간 인큐베이션은 세포 생존력 또는 세포 회복률에 대해 효과를 갖지 않는다.

다른 실시양태에서, 동결보존을 위한 RPE 세포를 제형화하고, 해동 직후에 대상체에게 투여하기 전에, RPE 세포를 여과할 수 있다. 일부 실시양태에서, 여과후 세포의 퍼센트 생존력은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 일부 실시양태에서, 중화 용액 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 여과후 세포의 퍼센트 생존력은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.

수확한 후에, RPE 세포의 확장된 집단을 구체적인 치료 용량 (예를 들어, 세포의 개수)으로 제형화할 수 있고, 클리닉으로 운송하기 위해 동결보존시킬 수 있다. 이어서, 해동 직후에 추가로 가공하지 않고 즉시 투여가능한 (RTA) RPE 세포 치료 조성물을 투여할 수 있다. 동결보존에 적합한 배지의 예에는 90% 인간 혈청/10% DMSO, 배지 3 10% (CS10), 배지 2 5% (CS5) 및 배지 1 2% (CS2), 스템 셀 뱅커(Stem Cell Banker), 프라임(PRIME) XV^® 프리지스(FREEZIS), 하이포써모솔(HYPOTHERMOSOL)^®, CSB, 트레할로스 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 여과후 세포의 퍼센트 생존력은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 다른 실시양태에서, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 여과후 세포의 퍼센트 회복률은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.

추가의 실시양태에서, 중화 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 후에, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 여과후 세포의 퍼센트 생존력은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 다른 실시양태에서, 중화 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 후에, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 여과후 세포의 퍼센트 회복률은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.

추가의 다른 실시양태에서, 중화 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 후에, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장하고, 동결보존된 조성물을 해동한 후에, 여과후 세포의 퍼센트 생존력은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 추가의 다른 실시양태에서, 중화 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 후에, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장하고, 동결보존된 조성물을 해동한 후에, 여과후 세포의 퍼센트 회복률은 적어도 약, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.

일부 실시양태에서, 중화 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 후에, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장하고, 동결보존된 조성물을 해동한 후에, 여과후 RPE 세포는 약 1,500 ng/mL/일 내지 약 4,500 ng/mL/일, 약 2,000 ng/mL/일 내지 약 3,000 ng/mL/일의 PEDF를 분비할 수 있다. 다른 실시양태에서, 중화 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 후에, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장하고, 동결보존된 조성물을 해동한 후에, 여과후 RPE 세포는 14 일 내에 적어도 약 1.2x10⁶ 내지 5 x10⁶, 또는 약 2.5x x10⁶ 내지 약 4 x10⁶ 세포로 확장될 수 있다.

일부 실시양태에서, 중화 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 실온에서 저장한 여과후 RPE 세포의 퍼센트 생존력은 적어도 약, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 실온에서 저장한 여과후 RPE 세포의 퍼센트 생존력은 적어도 약, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 추가의 실시양태에서, 중화 용액 중에서 실온에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 후에, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 실온에서 저장한 여과후 세포의 퍼센트 생존력은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 더욱 추가의 실시양태에서, 중화 용액 중에서 실온에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 저장한 후, 동결보존 배지 중에서 약 0 내지 약 8 시간 동안 실온에서 저장한 여과후 세포의 퍼센트 회복률은 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 140%, 150%이다.

해동후 즉시 투여가능한 (RTA) 적용에 적절한 동결보존 배지 중에서 제형화된 RPE 세포는 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물 중에서 현탁된 RPE 세포를 포함할 수 있다. 이 동결보존 배지의 예는 상표명 크리오스토르(CRYOSTOR)^®로 상업적으로 입수가능하고, 바이오라이프 솔루션즈, 인크.(BioLife Solutions, Inc.)에 의해 제작된다.

DMSO는 동결보존 과정 동안에 세포를 죽일 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지하기 위해 동해방지제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동해방지성 RPE 세포 치료 조성물은 약 0.1% 내지 약 2% DMSO (v/v)를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 약 1% 내지 약 20% DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 약 2% DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 약 5% DMSO를 포함한다.

일부 실시양태에서, 해동후 즉시 투여가능한 (RTA) 적용에 적절한 동결보존 배지 중에서 제형화된 RPE 세포 치료제는 DMSO를 함유하지 않는 동결보존 배지 중에서 현탁된 RPE 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, RTA RPE 치료용 세포 조성물은 DMSO (디메틸 술폭시드, (CH₃)₂SO) 또는 임의의 다른 쌍극성 비양성자성 용매 없이 트롤록스, Na+, K+, Ca2+, Mg2+, c1-, H2PO4-, HEPES, 락토비오네이트, 수크로스, 만니톨, 글루코스, 덱스트란-40, 아데노신, 글루타티온 중에서 현탁된 RPE 세포를 포함할 수 있다. 이 동결보존 배지의 예는 상표명 하이포써모솔^® 또는 하이포써모솔^®-FRS로 상업적으로 입수가능하며, 또한 바이오라이프 솔루션즈, 인크.에 의해 제작된다. 다른 실시양태에서, 해동후 즉시 투여가능한 적용에 적절한 동결보존 배지 중에서 제제화된 RPE 세포 조성물은 트레할로스 중에서 현탁된 RPE 세포를 포함할 수 있다.

RTA RPE 세포 치료 조성물은 RPE 이식, 통합, 생존, 효력 등을 뒷받침하는 추가의 인자를 임의적으로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 본원에 기재된 RPE 세포 제제의 기능의 활성화제를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 니코틴아미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 약 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 예를 들어 10 mM 농도의 니코틴아미드를 포함한다. 다른 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 레티노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 약 0.01-100 mM, 0.1-100 mM, 0.1-50 mM, 5-50 mM, 5-20 mM, 예를 들어 10 mM 농도의 레티노산을 포함한다.

일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 브루크 막으로 RPE 세포 제제의 부착을 증가시키는 것으로 확인된 다양한 인테그린의 활성화제, 예컨대 본원에 기재된 것들을 포함하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 약 5 μM 내지 1,000 μM 농도의 세포외 망가니즈 (Mn2+)를 포함한다. 다른 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 배좌-특이적 모노클로날 항체, TS2/16을 포함한다.

다른 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 또한 RPE 세포 면역 조절 활성의 활성화제를 포함하도록 제형화될 수 있다.

일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 ROCK 억제제를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 자유 라디칼의 스케빈징, pH 완충, 교질삼투성/삼투성 보조 및 이온 농도 균형의 유지에 의해 냉동 및 해동 과정 동안에 분자 세포 스트레스를 감소시키는 성분을 포함하는 배지 중에서 제형화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 해동후 즉시 투여가능한 적용에 적절한 동결보존 배지 중에서 제형화된 RPE 세포 치료제는 1종 이상의 면역억제성 화합물을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 해동후 즉시 투여가능한 적용에 적절한 동결보존 배지 중에서 제형화된 RPE 세포 치료제는 1종 이상의 면역억제성 화합물의 느린 방출을 위해 제형화된 1종 이상의 면역억제성 화합물을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 제형과 함께 사용하기 위한 면역억제성 화합물은 하기 면역억제성 약물의 부류에 속할 수 있다: 글루코코르티코이드, 세포분열 억제제 (예를 들어 알킬화제 또는 항대사물질), 항체 (폴리클로날 또는 모노클로날), 이뮤노필린에 대해 작용하는 약물 (예를 들어, 시클로스포린, 타크롤리무스 또는 시롤리무스). 추가의 약물에는 인터페론, 오피오이드, TNF 결합 단백질, 미코페놀레이트 및 소형 생물학 작용제가 포함된다. 면역억제성 약물의 예에는 중간엽 줄기 세포, 항-림프구 글로불린 (ALG) 폴리클로날 항체, 항-흉선세포 글로불린 (ATG) 폴리클로날 항체, 아자티오프린, BAS 1LI X IMAB® (항-I L-2Ra 수용체 항체), 시클로스포린 (시클로스포린 A), 다클리주맙(DACLIZUMAB)® (항-I L-2Ra 수용체 항체), 에베롤리무스, 미코페놀산, 리툭시맙(RITUX IMAB)® (항-CD20 항체), 시롤리무스, 타크롤리무스, 타크롤리무스 및 또는 미코페놀레이트 모페틸이 포함된다.

대상체에게 투여될 수 있는 생존가능한 세포의 개수는 전형적으로 용량당 적어도 약 50,000 내지 약 5x10⁶개이다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 100,000개의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 150,000개의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 200,000개의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 250,000개의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 300,000개의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 350,000개의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 400,000개의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 450,000개의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 500,000개의 생존가능한 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 적어도 600,000, 적어도 700,000, 적어도 800,000, 적어도 900,000, 적어도 1,000,000, 적어도, 2,000,000, 적어도 3,000,000, 적어도, 4,000,000, 적어도 5,000,000 적어도 6,000,000, 적어도 7,000,000, 적어도 8,000,000, 적어도 9,000,000, 적어도 10,000,000, 적어도 11,000,000, 또는 적어도 12,000,000개의 생존가능한 세포를 포함한다.

일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 RTA RPE 제형의 부피는 약 50 μL 내지 약 100 μL, 약 25 μL 내지 약 100 μL, 약 100 μL 내지 약 150 μL, 또는 약 10 μL 내지 약 200 μL이다. 특정 실시양태에서, 10 μL 내지 200 μL의 2회 용량의 RTA RPE 제형이 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, RTA RPE 제형의 부피는 대상체 눈의 망막하 공간으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 망막하 전달 방법은 유리체 경우 또는 맥락막상일 수 있다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 제형의 부피는 대상체의 눈으로 주사될 수 있다.

특정 실시양태에서, RTA RPE 치료용 세포 조성물은 약 100,000개 세포/mL 내지 약 1,000,000개 세포/mL의 세포 농도로 제형화될 수 있다. 특정 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료제는 약 1,000,000개 세포/mL, 약 2,000,000개 세포/mL, 약 3,000,000개 세포/mL, 약 4,000,000개 세포/mL, 약 5,000,000개 세포/mL, 6,000,000개 세포/mL, 7,000,000개 세포/mL, 8,000,000개 세포/mL, 약 9,000,000개 세포/mL, 약 10,000,000개 세포/mL, 약 11,000,000개 세포/mL, 약 12,000,000개 세포/mL, 13,000,000개 세포/mL, 14,000,000개 세포/mL, 15,000,000개 세포/mL, 16,000,000개 세포/mL, 약 17,000,000개 세포/mL, 약 18,000,000개 세포/mL, 약 19,000,000개 세포/mL, 또는 약 20,000,000개 세포/mL의 세포 농도로 제형화될 수 있다.

일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 동결보존될 수 있고, 약 -4℃ 내지 약 -200℃의 온도에서 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 동결보존될 수 있고, 약 -20℃ 내지 약 -200℃의 온도에서 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 동결보존될 수 있고, 약 -70℃ 내지 약 -196℃의 온도에서 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결보존에 적절한 온도 또는 동결보존 온도는 약 -4℃ 내지 약 -200℃의 온도, 또는 약 -20℃ 내지 약 -200℃, -70℃ 내지 약 -196℃의 온도를 포함한다.

일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 일 동안 냉동 저장될 수 있다. 다른 실시양태에서, RPE 세포는 약 1.5 내지 48 개월 동안 냉동 저장될 수 있다. 다른 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 퍼센트 생존력 또는 세포 회복률에서의 감소 없이 약 1 내지 약 48 개월 동안 냉동 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 안정성을 유지하면서 2-8℃에서 적어도 약 38 시간 동안 저장될 수 있다.

일부 실시양태에서, RTA RPE 세포 치료 조성물은 퍼센트 생존력, 퍼센트 세포 회복률, 또는 효력에서의 감소 없이 8,000 마일에 걸쳐 냉동 운송될 수 있다.

관련 기술분야에 정통한 사람이라면, RPE 세포의 유도가 큰 이익을 갖는다는 것을 잘 이해할 것이다. 이들은 그들의 생존, 재생 및 기능을 촉진시키기 위해 새로운 약물의 개발을 위한 시험관내 모델로서 사용될 수 있다. RPE 세포는 RPE 세포에 대한 독성 또는 재생 효과를 갖는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝을 제공할 수 있다. 이들은 광수용체 세포의 발달, 분화, 유지, 생존 및 기능에 중요한 메카니즘, 새로운 유전자, 가용성 또는 막-결합된 인자를 알아내기 위해 사용될 수 있다.

본원에 기재된 RPE 세포는 또한 망막 변성 및 다른 변성 장애에서 기능부전된 또는 퇴화된 RPE 세포의 이식, 대체 및 보충을 위해 RPE 세포의 비제한적인 공급원으로서 작용할 수 있다. 추가로, 유전자 변형된 RPE 세포는 이식 후에 눈 및 망막에서 유전자를 운반하고 발현하기 위한 벡터로서 작용할 수 있다.

RPE 세포가 치료제로서 작용할 수 있는 눈의 상태에는 일반적으로 망막 기능장애, 망막 손상 및/또는 망막 색소 상피의 손실과 연관된 망막 질환 또는 장애가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 상태의 비제한적인 목록은 색소성 망막염, 레베르 선천성 흑암시, 유전성 또는 후천성 황반 변성, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 비-삼출성 (건성) AMD, 지도형 위축 (GA), 베스트병, 망막 박리, 뇌회형 위축, 맥락막결손, 패턴 이영양증 뿐만 아니라 RPE의 다른 이영양증, 스타르가르트병, 광, 레이저, 염증, 감염, 방사선, 신생혈관 또는 외상성 손상 중 어느 하나에 의해 야기된 손상으로 인한 RPE 및 망막 손상을 포함한다.

본 발명의 이 측면의 세포를 이용하여 치료될 수 있는 예시적인 변성 장애에는 파킨슨, ALS, 다발성 경화증, 헌팅톤병, 자가면역 뇌척수염, 당뇨병성 신경병증, 알츠하이머 및 간질을 비롯하여 이로 제한되지 않는 신경변성 장애가 포함된다.

치료될 수 있는 대상체에는 영장류 (예컨대, 인간), 개, 고양이, 유제류 (예를 들어, 말, 소, 돼지 (예를 들어, 돼지)), 조류, 및 다른 대상체가 포함된다. 상업적으로 중요한 인간 및 비-인간 동물 (예를 들어, 가축 및 사육 동물)은 특별한 관심의 대상이다. 치료될 수 있는 예시적인 포유동물에는 개; 고양이; 말; 소; 양; 쥐 등 및 영장류, 특히 인간이 포함된다. 비-인간 동물 모델, 특히 포유동물, 예를 들어 영장류, 뮤린, 토끼 등은 실험적 연구를 위해 사용될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이 생성되는 RPE 세포는 대상체의 눈 또는 다른 위치 (예를 들어, 뇌) 내의 다양한 표적 부위에 이식될 수 있다. 한 실시양태에 따라, RPE 세포는 눈의 망막하 공간으로 이식되며, 이는 RPE의 정상 해부학적 위치 (광수용체 외측 분절과 맥락막 사이)이다. 또한, 세포의 이동 능력 및/또는 긍정적인 파라크린 효과에 따라, 유리체 공간, 내부 또는 외부 망막, 망막 주변 및 맥락막내를 비롯하여 이로 제한되지 않는 추가의 안구 구획으로의 이식이 고려될 수 있다.

이식은 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. RPE 이식을 수행하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,962,027, 6,045,791, 및 5,941,250 및 [Eye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol March 1997; 235(3):149-58; Biochem Biophys Res Commun Feb. 24, 2000; 268(3): 842-6; Opthalmic Surg February 1991; 22(2): 102-8]에 기재되어 있다. 각막 이식을 수행하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,755,785, 및 [Eye 1995; 9 (Pt 6 Su):6-12; Curr Opin Opthalmol August 1992; 3 (4): 473-81; Ophthalmic Surg Lasers April 1998; 29 (4): 305-8; Ophthalmology April 2000; 107 (4): 719-24; 및 Jpn J Ophthalmol November-December 1999; 43(6): 502-8]에 기재되어 있다. 주로 파라크린 효과가 이용되는 경우, 세포는 또한 숙주 면역 시스템에 대한 세포의 노출을 감소시키는 반투과성 용기 내에 캡슐화된 눈에서 전달되고 유지될 수 있다 (Neurotech USA CNTF delivery system; PNAS March 7, 2006 vol. 103(10) 3896-3901).

투여 단계는 그를 필요로 하는 눈에 RPE 세포의 안내 투여를 포함할 수 있다. 안내 투여는 망막하 공간으로 RPE 세포의 주사를 포함할 수 있다.

한 실시양태에 따라, 파스 평면 유리체절제 수술 후에 작은 망막 개구부를 통해 망막하 공간으로 세포를 전달하거나 또는 직접 주사함으로써 이식을 수행한다.

특정 실시양태에서, 투여는 유리체절제 후에, 작은 망막 절개를 통해 캐뉼라를 통해 황반 영역에서 망막하 공간으로 RTA 치료용 세포 조성물을 전달하는 것을 포함할 수 있다. 세포 용량에 따라 총 부피 50-100 μL의 세포 현탁액을 GA 확장에 대한 잠재적인 위험이 있는 영역에 이식할 수 있다.

일부 실시양태에서, RTA 치료용 세포 조성물을 GA (존재하는 경우)의 영역들 사이의 경계 및 더욱 잘 보존된 중심와 외부의 망막 및 RPE 층을 따라, 유리체절제 후에 작은 망막 절개를 통해 황반 영역에 생성된 망막하 공간에 전달하는 단일 수술 절차를 수행한다. 개검기를 배치한 후에, 표준 3-포트 유리체절제를 수행할 수 있다. 이는 23G 또는 25G 주입 캐뉼라 및 2개의 23G 또는 25/23G 포트 (투관침)의 배치를 포함할 수 있다. 이어서, 23G 또는 25G 장비를 사용하여 코어 유리체절제를 수행한 후, 후방 유리체 면을 박리시킬 수 있다. RTA 치료용 세포 조성물을 후방극 내의 예정된 부위에서 망막하 공간으로 주사할 수 있으며, 바람직하게는 GA (존재하는 경우)의 경계에 근접하여 여전히 비교적 보존된 영역에서 망막을 관통할 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포 조성물은 맥락막상 주사에 의해 투여된다.

RPE 세포는 다양한 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, RPE 세포는 매트릭스와 함께 단일 세포 현탁액의 형태로 표적 부위로 도입될 수 있거나, 또는 매트릭스 또는 막, 세포외 매트릭스 또는 기질, 예컨대 생분해성 중합체 또는 조합물 상에 부착될 수 있다. RPE 세포는 또한 매트릭스 또는 스캐폴드 상에 인쇄될 수 있다. RPE 세포는 또한 다른 망막 세포, 예컨대 광수용체와 함께 이식될 수 있다 (공동-이식). 치료의 효과는 시각 및 안구 기능 및 구조의 상이한 측정, 예컨대 무엇보다도, 최대 교정 시력 (BCVA), 어두움 및 빛-적응된 상태에서 시야 측정 또는 미세시야 측정에 의해 측정 시 빛에 대한 망막 민감도, 전장, 다초점, 초점 또는 패턴 망막전위도검사 5 ERG), 대비 민감도, 읽기 속도, 색각, 임상 생체현미경 검사, 안저 촬영, 광간섭 단층촬영 (OCT), 안저 자가-형광 (FAF), 적외선 및 다색 영상화, 플루오레세인 또는 ICG 혈관촬영, 적응 광학, 및 시각 기능 및 안구 구조를 평가하기 위해 사용되는 추가의 수단에 의해 평가될 수 있다.

대상체에게 RPE 세포의 투여 이전에 또는 그와 동시에 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론 또는 메틸프레드니솔론, 프레드포르테를 투여할 수 있다. 또 다른 실시양태에 따라, 대상체에게 RPE 세포의 투여 이전에 또는 그와 동시에 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론 또는 메틸프레드니솔론, 프레드포르테를 투여하지 않는다.

면역억제성 약물은 치료 이전에, 그와 동시에 및/또는 그 이후에 대상체에게 투여될 수 있다. 면역억제성 약물은 하기 부류에 속할 수 있다: 글루코코르티코이드, 세포분열 억제제 (예를 들어 알킬화제 또는 항대사물질), 항체 (폴리클로날 또는 모노클로날), 이뮤노필린에 대해 작용하는 약물 (예를 들어 시클로스포린, 타크롤리무스 또는 시롤리무스). 추가의 약물에는 인터페론, 오피오이드, TNF 결합 단백질, 미코페놀레이트 및 소형 생물학 작용제가 포함된다. 면역억제성 약물의 예에는 다음이 포함된다: 중간엽 줄기 세포, 항-림프구 글로불린 (ALG) 폴리클로날 항체, 항-흉선세포 글로불린 (ATG) 폴리클로날 항체, 아자티오프린, BAS 1LI X IMAB® (항-I L-2Ra 수용체 항체), 시클로스포린 (시클로스포린 A), 다클리주맙® (항-I L-2Ra 수용체 항체), 에베롤리무스, 미코페놀산, 리툭시맙® (항-CD20 항체), 시롤리무스, 타크롤리무스, 타크롤리무스 및 또는 미코페놀레이트 모페틸.

대안적으로, RTA RPE 세포 치료 조성물은 면역억제성 약물을 사용하지 않고 투여될 수 있다.

항생제는 치료 이전에, 그와 동시에 또는 그 이후에 대상체에게 투여될 수 있다. 항생제이 예에는 오플록스, 겐타미신, 클로람페니콜, 토브렉스, 비가목스, 또는 안구 사용을 위해 승인된 임의의 다른 국소 항생제 제제가 포함된다.

본 개시내용에 따라 제형화된 RTA RPE 세포 치료제는 대상체의 눈에 주사하기 전에 최종 투여 제형의 준비를 위해 GMP 시설의 이용을 필요로 하지 않는다. 본원에 기재된 RTA RPE 세포 치료제 제형은 임상 지역으로 직접 운송될 수 있는 최종 투여 제형을 포함하는 무독성 동결용액 중에서 동결보존될 수 있다. 필요한 경우, 제형을 해동시키고, 임의의 중간 준비 단계를 수행할 필요 없이 대상체의 눈에 투여할 수 있다.

RPE 세포는 영양분, 물, 및 이온 수송, 빛 흡수, 탈락된 광수용체 외측 분절 (POS)의 식균작용, 시각 회로에 중요한 모든-트랜스-망막의 11-시스-망막으로의 재이성질체화, 면역 조절, 필수 인자의 분비, 및 혈관-망막 장벽의 형성을 비롯하여 광수용체 생존에 중요한 여러 과정을 수반한다. 도 15에 제시된 바와 같이, RPE 단층은 PR과 맥락막모세혈관층 (CC) 사이에서 분극화된 대사 게이트키퍼로서 작용한다. RPE는 정단에서 기저측부로의 구조적 및 기능적 극성을 갖는다. 정단측 상에서, RPE 세포는 POS와의 직접 접촉을 가능하게 하는 다중 융모를 형성하고, 글루코스 및 비타민 A와 같은 분자를 맥락막모세혈관층에서 PR로 수송한다. 기저측 상에서, RPE 세포는 예컨대 CO2, 락테이트 및 물과 같은 대사물을 맥락막모세혈관층으로 수송하고, 혈관-망막 장벽을 생성하는, 맥락막으로부터 RPE를 분리시키는 아래쪽 기저 브루크 막 (BM)을 생성한다. 측부 벽 상에서, 인접한 RPE 세포는 치밀 이음부를 형성한다.

장벽 기능을 이용하여, 세포들 사이에 형성된 치밀 이음부를 측정함으로써 RPE 세포 배양물의 효력을 결정할 수 있다. RPE 치밀 이음부는 RPE 단층을 가로지르는 이온 및 물의 세포간 이동을 제한하고, RPE 수송자의 정확한 정단-기저 분포를 유지한다. 본원에 개시된 RPE 세포 조성물은 100Ω 초과의 상피 통과 전기 저항 (TEER)을 발생시키는 능력에 의해 측정되는 장벽 기능을 나타낸다.

또한, RPE 세포는 맥락막 모세혈관층 내피 및 광수용체의 구조적 온전성을 유지하는데 도움이 되는 다양한 신경영양 인자, 예컨대 섬유모세포 성장 인자 (bFGF 및 aFGF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 색소 상피-유래된 인자 (PEDF), 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 등을 분비한다. RPE 세포는 또한 눈의 면역 특권 성질을 확립하는데 중요한 항염증성 시토카인, 예컨대 형질전환 성장 인자 (TGF)-β를 분비한다. 본원에 기재된 RTA 치료용 세포 조성물에서 사용되는 RPE 세포는 신경영양 인자를 분비할 수 있다. 본원에 개시된 RPE 세포 조성물은 또한 RPE 성장 및 혈관 형성을 각각 증강시키는 분극화된 PEDF 및 VEGF 분비를 입증한다.

상이한 세포 배양 배지는 세포의 확장 효율에 대한 효과를 가질 수 있다. 그러나, 본원에 개시된 RPE 세포 조성물은 DMSO를 포함하는 배지 제형 중에서 현탁된 후에 확장하는 능력을 입증한다.

본원에 개시된 RPE 세포 조성물은 죽은 세포를 제거할 필요 없이 제형이 세포 치료제의 즉시 주사를 위해 사용되게 하는 해동후 생존가능한 세포의 백분율을 나타낸다. 밀리리터당 세포에 의해 측정되는 본원에 개시된 RPE 세포 조성물의 퍼센트 수율은 대규모 임상 사용 요건을 충족시키기 위해 최적화된 제형을 특징이다.

실시예 1

본원에서는 이종이 없는 GMP 제작 조건 하에 지시된 분화 과정을 통해 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로부터 유래된 RPE 세포의 세포 현탁액이 사용된다. 이들 세포를 방사선 조사된 인간 탯줄 섬유모세포 피더 (hUCF) 상에서 확장시켰다. 이어서, 니코틴아미드 및 액티빈 A를 사용하여 확장된 hESC를 망막 색소 상피 (RPE) 세포로 분화시켰다. 이어서, RPE 세포를 확장시키고, 동결보존 배지 중에서 동결보존시켰다.

재조합 인간 비트로넥틴 (rhVTN) 상에 또는 재조합 인간 젤라틴 (rh젤라틴) 상에 시딩된 방사선 조사된 이종이 없는 GMP-등급 CRD008 hUCF 상에서 이종이 없는 GMP 등급 HAD-C 102 hESC를 콜로니로서 확장시켰다. hESC 확장을 성장 인자 염기성 FGF 및 TGF 베타 (바이올로지컬 인더스트리즈) 외에도 인간 혈청 알부민을 함유하는 뉴트리스템^® 배지의 존재 하에 수행하였다. 이어서, 확장된 hESC를 현탁액 배양물로 옮겨서, 정상 (대기) O₂ 조건 하에 지시된 방식으로 분화를 개시하였다.

구상체 (SB)를 형성한 다음, 신경 운명을 향해 및 후속적으로 RPE 세포 운명을 향해 계속해서 지시된 분화 조건 하에 부착성 세포 배양물로서 플레이팅하였다.

분화기의 종료 시에, 세포를 하기 2가지 기술을 이용하여 수확하고 확장시켰다: 1) 착색되지 않은 영역을 수동으로 절제하고, 제거하였고, 나머지 착색된 세포 영역은 효소적으로 수집하였고, 2) 세포 (착색된 및 착색되지 않은)를 효소적으로 수집하였다. 이어서, 세포를 시딩하고, 니코틴아미드의 존재 및 부재 하에 제조자의 지시에 따라 rh젤라틴 피복된 세포 배양 플레이트의 상단에서, 또는 라미닌 521, 피브로넥틴, 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV의 상단에서 3 계대 동안 확장시켰다. 세포를 수확하였고, 90% 인간 혈청 및 10% DMSO로 구성된 동결-배지 중에서 및 혈청 무함유의 이종이 없는 GMP 등급 동결-배지 (배지 2 (CS5) 및 배지 1 (CS2), 바이오라이프 솔루션즈) 중에서 계대 2 (P2)에서 동결보존시켰다.

실시예 2

1.5x10⁶ 및 5x10⁶의 세포 밀도에서 5% 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 갖는 동결보존 배지 (배지 2, CS5) 중에서 동결보존된 치료적 RPE 세포에 대해 해동후 활력 및 생존력을 평가하였다. 결과를 제어된 냉동 기계 (예를 들어, 이소프로판올 함유 느린 냉각 장치)를 사용하여 10% DMSO를 갖는 90% 인간 혈청 (HS) 중에서 동결보존된 세포의 결과와 비교하였다. 각각의 동결보존 배지에서 냉동된 각각의 조성물의 3개 바이알을 해동시킨 후, 세포 계수기를 사용하여 생존력을 시험하였다. 이어서, 각각의 바이알의 세포를 24 시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 웰당 20% 인간 혈청을 함유하는 2 mL DMEM의 최종 부피에서 0.5 x 10⁶ 생존가능한 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 시딩하였다. 인큐베이션 기간의 종료 시에, 배양물을 PBS로 세척하였다. 트리플 셀렉트 처리후, 세포 계수기를 사용하여 세포를 나열하였다. 이어서, 생존가능한 부착된 세포의 평균 개수를 웰당 시딩된 세포의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 퍼센트 활력을 계산하였다.

도 1에 제시된 바와 같이, 결과는 본원에서 사용된 배지 중에서 동결보존된 RPE 세포가 90% 인간 혈청 및 10% DMSO (HS/DMSO)로 구성된 동결보존 배지와 비교할 때 유사한 해동후 생존력 및 보다 양호한 해동후 활력 (해동 24 시간후 보다 양호한 % 세포 부착)을 가졌음을 입증한다.

실시예 3

실시예 1에 기재된 바와 같이 이종이 없는 GMP-등급 시약, 이종이 없는 GMP-등급 세포 (방사선 조사된 CRD008 상에서 성장된 HAD-C 102-hESC)를 사용하여 치료적 RPE 세포 조성물을 제형화하였다.

RPE 순도의 측정을 위한 CRALBP⁺PMEL17⁺ 세포의 평가를 분화기의 종료 시에 수행하였. 표 1a 및 표 1b에 제시된 바와 같이, RPE 세포의 순도는 CS2 (배지 1) 또는 CS5 (배지 2)에 의해 제형화된 모든 RTA RPE 세포 치료 조성물의 경우 적어도 98.76% 또는 그 초과였다.

RPE 세포 사이에 생성된 치밀 이음부는 혈액-망막 장벽 및 분극화된 PEDF 및 VEGF 분비를 가능하게 한다. PEDF는 정단측으로 분비되고, 여기서 그는 혈관형성 억제성 및 향신경성 성장 인자로서 작용한다. VEGF는 주로 기저측으로 분비되고, 여기서 그는 맥락막 내피 상에서 혈관형성 촉진 성장 인자로서 작용한다. RPE 분극화 (장벽 기능 및 분극화된 PEDF 및 VEGF 분비)를 생성 과정의 종료 시에 세포에서 트랜스웰 시스템에서 측정하였다. 표 1a 및 1b에 제시된 바와 같이, 장벽 기능/상피 통과 전기 저항 (TEER) 뿐만 아니라 PEDF 및 VEGF의 분극화된 분비가 입증되었다.

대조군 샘플 (Ctrl)을 10% DMSO 및 90% 인간 혈청 중에서 동결보존시켰다.

표 1a. 생산 실행 (PR) 1 및 2에 대해 배지 1 (CS2) 및 배지 2 (CS5) 중에서 동결보존된 치료적 RPE 세포의 특징분석

표 1b. 실험 (PR) 3 및 4에 대해 배지 1 (CS2) 및 배지 2 (CS5) 중에서 동결보존된 치료적 RPE 세포의 특징분석

실시예 4

RTA RPE 세포 치료 조성물 상에서 안정성 검정을 수행하였다. 실시예 1의 방법에 따라 생성된 세포를 동결보존 이전에 2% DMSO를 함유하는 배지 1 (CS2) 또는 5% DMSO (CS5)를 함유하는 배지 2 중에서 3 시간 이하 동안 현탁시켰다. CS2 및 CS5 중에서 3 시간 인큐베이션 후에 동결보존된 치료적 RPE 세포는 동결보존 이전에 1 시간 미만 동안 인큐베이션한 세포와 유사한 해동후 생존력, 활력 및 수율을 나타내었다. 안정성 결과는 표 2에 제시되어 있다.

표 2. 해동후 치료적 RPE 세포의 안정성 (동결보존 이전에 배지 1 (CS2) 및 배지 2 (CS5) 중에서 인큐베이션)

또한, 동결보존 이전에 CS2 또는 CS5 중에서 3 시간 동안 인큐베이션한 세포는, 표 3에 제시된 바와 같이, 100 Ω 초과의 상피 통과 전기 저항 (TEER)을 생성하고, 분극화된 방식으로 VEGF 및 PEDF를 분비하는 능력에 의해 측정되는, 장벽 기능 (RPE 세포 사이의 치밀 이음부)을 생성하는 능력을 입증하였다. (도 15 또한 참조).

표 3. 해동후 배지 1 (CS2) 및 배지 2 (CS5) 중에서 치료적 RPE^® 세포의 TEER, 및 PEDF 및 VEGF의 분극화된 분비 (동결보존 이전에 배지 중에서 인큐베이션)

상기 기재된 RPE 세포 치료 조성물에 대해 해동후 안정성을 평가하였다. RPE 세포 조성물을 2% DMSO를 함유하는 배지 1 (CS2) 또는 5% DMSO를 함유하는 배지 2 (CS5) 중에서 제형화하고, 동결보존 이전에 3 시간 이하 동안 인큐베이션하였다. 생존력, 살아있는 세포 수율, 및 효력을 동결보존 이후에 대략 2 내지 8℃에서 0 시간, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 5 시간, 6 시간 및 24 시간 시점에서 상기 기재된 바와 같이 측정하였다.

RPE 세포는 2% DMSO를 함유하는 배지 1 (CS2) 또는 5% DMSO를 함유하는 배지 2 (CS5) 중에서 동결보존 이전에 적어도 약 3 시간 동안 및 동결보존 이후에 적어도 약 1 시간 동안 또는 동결보존 이전에 적어도 약 2 시간 동안 및 동결보존 이후에 적어도 약 5 시간 동안 안정한 것으로 확인되었다.

실시예 5

즉시 투여가능한 (RTA) RPE 세포 치료 조성물 제형과 함께 사용하기 위한 3가지 동결보존 용액의 안전성을 Balb/c 마우스에게 망막하 주사한 후에 평가하였다.

총 36 마리의 Balb/c 마우스를 사용하였고, 각 그룹에 9 마리씩 4개의 그룹으로 나누었다 (각각의 종료 시점에 대해 n=3; 투여후 1, 3 및 10 일째). 이들 그룹은 1개의 비히클 (BSS 플러스, 알콘 래보러토리즈(Alcon Laboratories)) 대조군 그룹, 및 시험 항목 (BSS 플러스에 의해 1:1 v/v로 희석된 CS5, CS2 및 CS2)을 제공한 3개의 처리된 그룹을 함유하였다. 모든 동물을 왼쪽 눈으로 망막하 주사를 통한 다양한 처리에 의해 투여하였다. 절차는 주사하기 2 분 전에 IP로 제공되는 75 mg/kg의 케타민/메데토미딘을 사용하여 마취 하에 수행되었다.

연구하는 동안, 이환율 및 사망률, 체중, 및 전반적인 임상 관찰 뿐만 아니라 외부 및 내부 눈 검사를 수행하였다. 눈 평가는 수의학 안과 의사에 의해 순응 동안에 (투여하기 전에 기준선 측정) 1회 및 그후 각각의 종료일에 수행되었다. 눈 평가는 다음을 포함하였다: 슬릿 램프 생체현미경검사를 이용하는 전방 분절 및 수정체의 검사 및 간접적인 검안경 검사를 이용하는 안저 검사. 동물을 투여후 1, 3 및 10 일째에 희생시켰고, 주사된 눈에 대해 조직병리학 검사를 수행하였다.

수의학 안과 의사 및 광범위한 공인 수의학 병리학자에 의해 수행된 임상적, 안과적 및 조직병리학적 검사는 RTA RPE 제형의 망막하 투여 이후에 10 일의 추적 조사 내에 주요한 처리-관련된 또는 독성학적으로 유의한 효과를 입증하지 않았다. 염증의 조직병리학적 평가는 하기 기준에 따라 호중구, 림프구, 대식세포, 및 비만 세포를 기반으로 하였다: 염증성 세포의 부재에 의해 나타나는 염증 없음, x10 배율 필드당 10개 이하의 세포에 의해 나타나는 가벼운 염증, x10 배율 필드당 약 10 내지 20개 세포에 의해 나타나는 중간 정도의 염증, 및 x10 배율 필드당 20개 초과의 세포에 의해 나타나는 강한 염증.

도 2 및 도 3에 제시된 바와 같이, 대조군 그룹에서 비처리된 동물의 본래의 눈 및 동물의 비처리된 오른쪽 눈의 조직병리학적 평가는 병리학적 변화를 전혀 나타내지 않았다.

처리된 눈 (왼쪽 눈)의 조직병리학적 평가는, 종료 1 일째에, BSS 플러스:CS2 (1:1 v/v)로 처리된 그룹의 동물만이 강한 염증 징후를 보였음을 나타내었다. BSS 플러스, CS5 또는 CS2로 처리된 다른 모든 동물은 가벼운 내지 중간 정도의 염증을 나타내었다. BSS 플러스로 치료되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 처리된 눈의 조직병리학적 슬라이드의 영상은 도 4a 및 도 4b에 제시된다. 이들 슬라이드는 공막의 가벼운 침윤 및 약간의 손실된 대식세포 및 림프구와 함께 가벼운 염증을 나타낸다. (각각 x4 및 x20 배율 필드에서 염색된 H&E). 도 5a 및 도 5b는 CS5로 처리되고 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 처리된 눈의 조직병리학적 슬라이드의 영상을 제시한다. 이들 슬라이드는 공막의 침윤, 일부 대식세포 및 약간의 호중구와 함께 중간 정도의 염증을 나타낸다. (각각 x4 및 x20 배율 필드에서 염색된 H&E). CS2로 처리되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 처리된 눈의 조직병리학적 슬라이드의 영상이 도 6a 및 도 6b에 제시된다. 이들 슬라이드는 각막에서 대식세포 및 호중구와 함께 중간 정도의 염증을 나타낸다. (각각 x4 및 x20 배율 필드에서 염색된 H&E).

CS2 또는 BSS 플러스:CS2로 처리된 대부분의 동물이 종료 1 일째에 전방 챔버에서 최소의 피브린 침착을 나타내었지만, 이들 급성 변화는 단기 반응을 입증한다. 도 7a는 BSS 플러스:CS2로 처리되고 연구 1 일째에 희생된 동물로부터 취한 처리된 눈의 조직병리학적 슬라이드의 영상을 제시하며, 공막의 중간 정도의 침윤과 함께 강한 염증을 나타낸다. (x4 배율 필드에서 H&E 염색됨).

도 7b는 공막에서 림프구 옆의 우측 하단 코너에 제시된 피브린 침착을 나타낸다. (x20 배율 필드에서 H&E 염색됨).

종료 3 일째에, CS5 또는 CS2로 처리된 모든 동물은 대식세포 및 분열중인 섬유모세포를 특징으로 하는 국소 공막 육아종성 반응 (가벼운 내지 중간 정도의 염증)을 나타내었다. 대식세포는 BSS 플러스로 치료된 동물에서도 관찰되었지만, 이들은 섬유모세포 활성화 없이 상이한 패턴 및 세포 농도를 나타내었고, 주사된 물질과 관련이 없었다. 이들 결과는 일반적으로 이물질에 대한 초기 단계 반응의 전형적인 패턴을 나타낸다. 결과적으로, 종료 10 일째에, BSS 플러스, CS5 또는 CS2로 처리된 모든 동물은 염증없음 또는 가벼운 염증을 나타내었고, 피브린 침착을 나타내지 않았다. 또한, BSS 플러스:CS2로 처리된 한 마리의 동물만이 중간 정도의 염증을 나타낸 반면에, 다른 모든 동물은 가벼운 염증을 나타내었다.

BSS 플러스로 치료되고 연구 3 일째에 희생된 동물에서 공막의 중간 정도의 침윤 및 몇몇 대식세포와 함께 중간 정도의 염증을 입증하는 조직병리학적 영상이 도 8a 및 도 8b에 제시된다. 도 9a 및 도 9b는 국소 과립화 반응 및 몇몇 대식세포 및 섬유모세포와 함께 강한 염증의 조직병리학적 영상을 제시하며, 이는 CS5로 처리되고 연구 3 일째에 희생된 동물에서 초기 단계의 일시적인 이물질 반응을 나타낸다. 도 10a 및 도 10b는 CS2로 처리되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터의 조직병리학적 영상이고, 몇몇 대식세포 및 섬유모세포와 함께 강한 염증을 나타내며, 이는 또한 초기 단계의 일시적인 이물질 반응을 입증한다. 가벼운 염증 및 가벼운 부종을 갖는, BSS 플러스:CS2로 처리되고 연구 3 일째에 희생된 동물로부터의 조직병리학적 영상은 도 11a 및 도 11b에 제시된다. 도 12a 및 도 12b는 BSS 플러스로 치료되고 연구 10 일째에 희생된 동물로부터의 조직병리학적 영상을 제시하며, 약간의 대식세포와 함께 가벼운 염증을 나타낸다. 도 13a 및 도 13b는 CS5로 처리되고 연구 10 일째에 희생된 동물로부터의 조직병리학적 영상을 제시하며, 약간의 대식세포와 함께 가벼운 염증을 나타낸다. 도 14a 및 도 14b는 CS2로 처리되고 연구 10 일째에 희생된 동물로부터의 조직병리학적 영상을 제시하며, 약간의 대식세포와 함께 가벼운 염증을 나타낸다.

조직병리학적 평가 결과는, 10 일 추적 조사 이후에 대조군과 비교하여 BSS 플러스, CS5, CS2 또는 BSS 플러스:CS2의 망막하 투여 이후에 주요한 처리-관련된 및/또는 독성학적으로 유의한 효과를 나타내지 않았음을 입증한다. 처리된 눈의 조직병리학적 평가는 BSS 플러스, CS5 및 CS2로 처리된 그룹에서 종료 3 일째에 이물질에 대한 전형적인 초기 단계 반응을 나타내었다. 그러나, 이 반응은 일시적이었고, 10 일째까지 가라앉아서 주사된 부위에 매우 미미한 대식세포 침윤을 남겼다. 어떠한 동물의 망막에서나 다른 곳에서도 괴사는 존재하지 않았다.

실시예 6

착색된 세포의 효소적 강화 (단리/수확) 및 NUTS(-)+인간 혈청 알부민 (HSA) 및 NUTS(-) (인간 혈청 (HS) 없음)를 포함하는 효소 중화 용액을 이용하여 RTA RPE 세포 치료 조성물을 제형화하였고, 동결배지를 첨가하기 전에 및 첨가한 후에 안정성에 대해 평가하였다.

세포를 시딩하고, 계대 4 이하로 T25, T75 및 T175 플라스크에서 확장시켰다. 약 90% 초과의 다변형성에 도달한 후에, 세포를 트리플 셀렉트 (1X) 중에서 약 50 분 이하 동안 37℃/5%CO₂에서 인큐베이션하였다. 세포를 풀링하고, 얼음 상에 두었다. 플라스크를 동등한 부피의 PBS (-)로 1회 세척하였고, 세척물을 세포 풀에 첨가하였다. PBS (-)를 개선된 효소-중화를 위해 NUTS (-)로 대체하였고, 세포 스트레스를 감소시켰다.

이어서, 세포 풀을 샘플링하였고 (180 μL PBS (-) 중 20 μL), 세포 계수기, 예컨대 NC-200 세포 계수기를 사용하여 계수하였다. 이어서, 세포 풀을 그룹 (G1, G2 및 G3)에 대해 다양한 켄칭 용액으로 분취하였다. 이어서, 각각의 그룹으로부터의 세포를 계수하고, 여과하고, 4℃에서 세포 조성물 안정성 분석을 위해 분취하였다.

분석한 효소 중화 용액 유형에는 하기가 포함되었다:

ㆍ 그룹 1 (G1) - 20% 인간 혈청 (HS) / DMEM (HS 양성 대조군 그룹)

ㆍ 그룹 2 (G2) - 인간 혈청 알부민 (HSA)을 갖는 뉴트리스템 (-)

ㆍ 그룹 3 (G3) - 뉴트리스템 (-) (NUTS)

각각의 켄칭 그룹, G1, G2 및 G3을 탄뎀 500-200-40-마이크로미터 순차적 여과 시스템에 통과시켰다. 여과된 세포 용액을 4℃에서 유지하였고, 세포 생존력을 여과후 0, 2 및 4 시간 시점에서 시험하였다.

여과후 각각의 시점의 종료 시에, 세포를 계수하고, 약 220g에서 약 5 분 동안 원심분리하였고, 상청액을 폐기하였고, 펠렛을 약 5-10 mL CS5 중에서 재현탁시키고, 샘플링하고, 계수하였다 (180 μL 20% HS/DMEM 중 20 μL). 계수 결과를 기반으로 하여, 세포를 CS5 중에서 희석하여 2x10⁶ 세포/mL의 최종 농도를 수득하였다. 동결보존 이전 안정성 분석을 위해 세포를 4℃에서 상이한 시간 동안 (0, 2, 3 또는 4 시간) 두었고, 그 후에 RPE 세포+동결배지 조성물을 크리오바이알로 분취하였다. 3개의 크리오바이알을 무작위로 샘플링하였고, 세포를 계수하고, 동결보존하였다.

바이알을 37℃ 수조 약 2.5 분 동안 해동시켰다. 계수를 위해 세포를 즉시 샘플링하였고 (180 μL 20% HS/DMEM 중 20 μL), 세포 현탁액을 따뜻한 20% HS/DMEM 배양 배지의 적가에 의해 희석하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 추가의 분석을 위해 얼음 상에 두었다.

회복률 백분율은 2x10⁶ 세포/mL의 최종 목표 농도를 기반으로 하여 계산되었다.

순차적 여과 이후에, 상이한 효소 중화 용액 중의 여과된 세포 현탁액을 4℃에서 유지하였고, 여과후 0, 2 및 4 시간에서의 세포 생존력을 평가하였다.

표 4. 여과후 세포 조성물 생존력

모든 시점에서 모든 그룹에서의 생존력은 표 4에 제시된 바와 같이 98% 또는 99%로 유지되었다. 0 시간 시점의 G1 (대조군 그룹)과 비교하여 상이한 시점에서 (0, 2 및 4 시간) 2가지 중화 용액 제형 그룹 G2 및 G3 사이에 유의한 차이가 발견되지 않았다. 도 16은 대조군 그룹 G1과 비교하여 여과후 시간에 걸쳐 4℃에서 G2 (NUTS(-)+HSA) 및 G3 (NUTS(-)) 그룹의 생존력을 제시한다.

세포 회복률 및 생존력은 냉동 과정 이전에 (동결보존 이전) 동결보존 용액 내에서 평가되었다. 세포 치료 조성물 (여과후)을 4℃에서 0, 2 및 4 시간 동안 유지시켰다. 이어서, 각각의 용액을 원심분리하고, 2x10⁶ 세포/mL의 최종 농도로 동결보존 용액, CS5 중에서 재현탁시켰다. 다음으로, 동결보존 용액 (동결보존 + 세포 치료 조성물, 동결보존 이전) 내에서 세포를 4℃에서 0, 2, 3 및 4 시간 동안 유지시킨 후, 1 mL 크리오바이알로 분취하였다. 각각의 그룹으로부터의 3개의 바이알을 샘플링하고 계수하여, 바이알을 동결보존하기 전에 생존력 및 회복률 백분율을 평가하였다.

0 시간 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 0, 2, 3 및 4 시간 동안 인큐베이션한, 냉동 과정 이전의 세포 치료 조성물의 세포 생존력 및 회복률을 표 4A에서 함께 요약된다. 표 4B 및 4C는 0, 2, 4 시간 동안 인큐베이션, 이어서 동결보존 용액 (세포 + CM) 중에서 0, 2, 3, 4 시간 동안 인큐베이션한 세포 조성물을 포함한다. 대조군 그룹 (G1)을 동결보존 이전에 세포 조성물의 경우 0 시간 및 세포 + CM의 경우 0 시간 시점에만 평가하였다.

표 5A. 중화 용액 중에서 0 시간 인큐베이션, 이어서 동결배지 (세포 + CM) 중에서 0, 2, 3 및 4 시간 동안 인큐베이션한 세포 치료 조성물의 동결보존 이전 생존력 및 회복률.

표 5A, 도 17a 및 도 17b에 제시된 바와 같이, 동결보존 이전에, 0 시간 시점 치료용 세포 조성물 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 0 시간 인큐베이션에서, G1 대조군 그룹과 비교하여 두 중화 그룹, G2 및 G3 사이에 생존력 및 회복률에서의 유의한 차이가 검출되지 않았다. 더욱이, 동결보존 이전에, 중화 용액 중에서 0 시간 치료용 세포 조성물 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 2, 3 및 4 시간 인큐베이션은 G1 대조군 그룹과 비교하여 G2 및 G3 그룹 둘 다에서 세포의 생존력 또는 회복률에서의 감소를 나타내지 않았다. 생존력은 시간에 걸쳐 95% 초과로 유지되었고, 3가지 그룹 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 추가로, 모든 그룹의 회복률은 75%-100%의 범위로 유지되었다.

표 5B. 동결보존 이전에, 2 시간 치료용 세포 조성물 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 0, 2, 3 및 4 시간 인큐베이션한 후에, 동결보존 이전 세포 생존력 및 세포 회복률.

표 5C. 동결보존 이전에, 4 시간 치료용 세포 조성물 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 0, 2, 3, 4 시간 인큐베이션한 후에, 동결보존 이전 세포 생존력 및 세포 회복률.

표 5B 및 5C 및 도 18a, 도 18b, 도 19a 및 도 19b는, 동결보존 이전에, RPE 치료용 세포 조성물을 중화 용액 중에서 2 및 4 시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 동결배지 중에서 0-4 시간 동안 인큐베이션하였을 때, 두 그룹 G2 (HSA를 갖는 뉴트리스템(-) 중의 세포 조성물) 및 G3 (뉴트리스템(-) (NUTS) 중의 세포 조성물)에 대해 유사한 세포 생존력 및 회복률 값이 확인됨을 제시한다. 이 검정은, 동결보존 이전에, 중화 용액 또는 동결배지 중에서 장기간 인큐베이션하였을 때 세포 생존력 또는 세포 회복률에 대해 유의한 효과가 없었음을 입증하였다.

실시예 7

세포는 동결보존 동안에 해동후 불량한 생존율로 이어질 수 있는 스트레스를 겪을 수 있다. 추가로, 수확 절차 동안에 세포에 대한 스트레스는 해동후 세포 생존력 및 회복률에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, RTA 치료용 세포 조성물의 세포 생존력 및 회복률을 해동후 평가하였다. 동결보존 이전에, 상이한 중화 용액 (상기 기재된 바와 같이 G1, G2 및 G3) 중에서 0 시간 동안 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 0, 2, 3 및 4 시간 동안 인큐베이션한 치료용 세포 조성물을 동결보존후 생존력 및 회복률에 대해 평가하였다.

표 6은 치료용 세포 조성물을 효소 중화 용액 중에서 0 시간 동안, 이어서 동결배지 중에서 0, 2, 3 및 4 시간 동안 인큐베이션하고 (동결보존 이전에), 동결보존시킨 다음, 해동하였을 때 수득된 생존력 및 안정성 결과를 요약한다.

표 6. 0 시간 세포 + 중화 용액 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 0, 2, 3 및 4 시간 인큐베이션의 해동후 생존력 및 회복률

동결보존 이전에 동결배지 중에서 상이한 인큐베이션 시간에 의한 세포 생존력 및 회복률의 분석은, 생존력이 모든 시점에서 모든 그룹에서 약 90% 초과로 유지되었고, 회복률이 약 75%-100%의 범위였음을 나타내었다.

도 20a에 제시된 바와 같이, 그룹들 사이에서 세포 생존력에서 유의한 차이가 없었으며, 생존력은 전체 동결보존 이전 시간 범위에 걸쳐서 약 95% 초과로 유지되었고, G1 대조군 그룹의 생존력에 필적하였다. 도 20b에 제시된 회복률 결과의 분석은 그룹 G4에 대해 보다 높은 회복률 값을 나타내었고, 이는 동결보존 이전 2 시간째에 피크였고, 이어서 동결보존 이전 3 및 4 시간 후에 약간 감소하였다. 그러나, 회복률은 약 80%-100%의 범위로 유지되었다.

치료용 세포 조성물을 중화 용액 중에서 0, 2 및 4 시간 동안 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 0, 2, 3 및 4 시간 동안 인큐베이션하였을 때 수득된 해동후 결과가 표 7에 제시된다. 이들 결과는 동결보존 이전에 CS5에 대한 세포의 장기간 노출에 대한 해동후 생존력 및 회복률의 관계를 입증하였고, 이는 다시 효소 중화 용액 중에서 세포의 장기간 인큐베이션에 의해 영향을 받을 수 있다.

표 7. 효소 중화 용액 중에서 0, 2, 4 시간 동안 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 (동결보존 이전) 0, 2, 3 및 4 시간 동안 인큐베이션한 세포의 해동후 생존력 및 회복률

두 그룹 G2 및 G3에 대해 측정된 생존력은 93% 초과로 확고하였고, 모든 시점에 걸쳐 그룹 G2 및 G3 사이에 유의한 차이가 없었다. 두 그룹의 회복률은 유의한 차이를 나타내지 않았다. 그룹 G2에 대한 회복률은 75%±3.3이었고, 그룹 G3에 대한 회복률은 81%±7.1이었다.

이들 결과는, 중화 용액 (HSA를 갖는 (그룹 G2) 및 HSA를 갖지 않는 (그룹 G3) NUT(-))이 세포 회복률 또는 세포 생존력을 손상시키지 않았음을 입증한다. HSA를 갖는 또는 갖지 않는 (G2 & G3) 두 켄칭 그룹 사이에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. HS를 갖지 않는 효소 중화 용액에 대한 세포 생존력 및 세포 회복률 결과는 동결보존 이전 및 이후 둘 다의 경우 HS를 포함하는 효소 중화 용액 (G1)에 필적하였다.

또한, HS를 갖지 않는 효소 중화 용액 및 여과 단계를 포함하는 세포 수확 절차는 세포의 생존력을 손상시키지 않았다 (표 4). 세포 회복률 및 생존력의 동결보존 이전 및 해동 이후 분석은 대조군 그룹 (G1)과 비교하여 그룹 G2 및 G3 사이에서 유의한 차이를 나타내지 않았다 (표 5-7). 최상의 퍼센트 회복률 및 생존력은 세포를 효소 중화 용액 중에서 2 시간 이하 동안 인큐베이션, 이어서 동결배지 중에서 3 시간 이하 동안 인큐베이션하였을 때 관찰되었다. 그러나, 효소 중화 용액 또는 동결배지 중에서 적어도 4 시간의 인큐베이션 시간은 세포 생존력 또는 세포 회복률에서 유의한 감소를 일으키지 않았다.

세포를 수확하고, 동결보존시키고, 해동한 후에, PEDF 분비 및 세포 확장 능력 또한 측정하였다. 결과는 표 8에 제시된다.

표 8. 효소 중화 용액을 갖는 RPE 세포 조성물 (세포) 및 RTA RPE 세포 조성물 (세포+CM) 인큐베이션 시간에 대해 수확 및 동결보존 이후에 세포의 PEDF 분비 및 확장 능력

ND - 데이터 없음

표 8에 제시된 바와 같이, 해동 시에, 세포는 PEDF를 분비하고 확장하는 그들의 기능적 능력을 유지하였다. 결과는, 측정된 모든 시점에서 HS를 갖지 않는 2가지 효소 중화 용액 그룹 (G2, G3) 사이에서 또는 이들 그룹과 HS를 갖는 효소 중화 용액 그룹 (G1) 사이에서 유의한 차이가 없음을 나타내었다.

실시예 8

표 9에 제시된 바와 같이, 치료용 세포 조성물을 실온에서 (RT) 및 약 2-8℃의 온도에서 인큐베이션한 후에 여과후 안정성 (% 생존력 및 % 회복률)에 대해 평가하였다.

표 9. 인큐베이션 시간

세포를 효소적으로 (예를 들어, 트리플 셀렉트) 수확하였다. 효소를 뉴트리스템 (-) (NUTS)을 사용하여 중화시켰다. 순차적 여과 이후에, 여과된 세포 현탁액 (세포 풀)을 두 그룹으로 나누었고, 제1 그룹 ("세포 2-8℃")은 약 2-8℃에서 유지되었고, 제2 그룹 ("세포 RT")은 RT에서 유지되었다. 두 그룹의 세포 생존력 및 세포 농도를 0 시점에서 및 인큐베이션 2 시간 후에 평가하였다.

표 10에 제시된 바와 같이, 동결보존 이전에 약 2-8℃ 또는 RT에서 인큐베이션한 세포 조성물의 그룹 사이에서 세포 생존력 및 세포 농도에서 유의한 차이가 없었다. 유사하게, 도 22에 제시된 바와 같이, 그룹들 사이에 퍼센트 회복률에서 유의한 차이가 없었다.

표 10. 2 시간 인큐베이션 후에 세포 생존력 및 세포 농도

2 시간 인큐베이션 후에, 두 그룹을 원심분리하고, 2x10⁶ 세포/ml의 최종 농도로 동결보존 용액, CS5 중에서 재현탁시켰다. "세포 2-8℃" 그룹을 4가지 하위-그룹 (세포+CM -그룹 1-4)으로 나누었고, 이를 2-8℃에서 인큐베이션하였다. 세포+CM -그룹 1을 0 시간 시점에서 세포 농도 및 세포 생존력에 대해 계수하였고, 동결보존시켰다 (n=29 크리오바이알). 세포+CM -그룹 2는 2-8℃에서 인큐베이션 2 시간 후에 계수하였고, 세포+CM -그룹 3은 4 시간 후에 샘플링하였고, 세포+CM -그룹 4는 인큐베이션 6 시간 후에 세포 농도 및 세포 생존력에 대해 계수하였다. 다양한 인큐베이션 시점에서, 계수를 완료하였을 때, 세포+CM -그룹 2-4를 각각의 크리오바이알 (각각 n= 30, 30 및 29 크리오바이알)에 1 ml를 분취함으로써 동결보존시켰다. "세포+CM RT"를 2, 4 및 6 시간 시점에서 생존력 및 세포 농도에 대해 샘플링하였다. 6 시간 인큐베이션 후에, 이 그룹을 또한 동결보존시켰다 (n=22 크리오바이알).

표 11. 동결배지 중에서 치료용 세포 조성물: 다양한 시점에서 세포 농도 및 세포 생존력.

표 11 및 도 23a 및 도 23b에 제시된 바와 같이, RT에서 세포 조성물 + 동결배지 그룹과 약 2-8℃에서 세포 조성물 + 동결배지 그룹 사이에 생존력에서 유의한 차이가 없었고, 시간에 걸쳐 모든 그룹에서 세포 생존력의 작은 감소가 있었다. 결과는 세포 회복률이 두 온도 조건, 약 2-8℃ 및 RT에서 적어도 6 시간에 걸쳐 모든 그룹 내에서 안정하게 유지되고, 냉동 과정 이전에 약 2-8℃에서 인큐베이션한 세포의 회복률이 약간 더 높다. RT에서 인큐베이션한 세포는 2 시간째에 회복률의 15% 감소를 나타내었으나, 회복률 및 생존력은 적어도 6 시간 동안 안정하게 유지되었다.

실시예 9

표 12에 제시된 바와 같이, 2가지 세포 해동 방법 (하나는 약 37℃의 수조를 포함하고, 다른 것은 자동화된 세포 해동 유닛을 포함함)을 세포 생존력, 회복률, 멸균성, 효력 및 동일성을 기반으로 하여 평가하였다.

표 12. 해동후 분석을 위한 시험 그룹 및 검정 시점.

V - 생존력 %, R - 회복률 %, I - 동일성, P - 효력, S - 멸균성

4 그룹의 RTA 치료용 세포 조성물 각각으로부터 2개의 바이알을 동시에 해동시켰고; 1개의 바이알은 자동화된 세포 해동 유닛 (예를 들어, 시그마-알드리치에 의한 토스타(ThawSTAR) 자동화된 해동 시스템)을 사용하였고, 두번째는 약 37℃의 표준 수조를 사용하였다. 이어서, 해동된 바이알을 얼음 상에 두었다. 각각의 바이알을 부드럽게 피펫팅하였고, 각각의 바이알로부터 20 μl의 2개의 샘플을 취하고, 180 μl의 NUTS (-) 중에서 희석하고, 볼텍싱하고, 계수하였다. 평균 생존력 및 회복률 백분율을 각각의 해동된 바이알에 대해 계산하였다.

생존력, 회복률, 멸균성, 효력 및 동일성에 대해 해동된 세포 조성물을 검정함으로써 4 시간 이하 동안 해동후 실온에서 RTA 치료용 세포 조성물의 안정성을 평가하였다. 측정된 TEER, 21 일째에 기저 PEDF/VEGF 비 분비 및 21 일째에 정단 VEGF/PEDF 비 분비에 의해 효력을 측정하였다. 회복률 백분율을 2x10⁶ 또는 5x10⁶ 세포/ml의 최종 목표 농도를 기반으로 하여 계산하였다.

표 13에 제시된 바와 같이, 자동화된 세포 해동 유닛을 사용하여 해동된 RTA 치료용 세포 조성물의 생존력 및 회복률 평균은 2가지 세포 농도 모두에서 약 37℃의 통상적인 수조를 사용하여 달성된 것에 필적하였다.

표 13. 상이한 세포 농도에서 자동화된 세포 해동 유닛을 사용하여 해동된 및 약 37℃의 수조를 사용하여 해동된 RTA 치료용 세포 조성물의 평균 생존력 및 회복률.

표 14에 제시된 바와 같이, 0, 2 및 4 시간 시점에서 각각의 그룹에 대한 평균 퍼센트 생존력은 적어도 83%였다. 시험한 모든 그룹의 평균 퍼센트 회복률은 0, 2 및 4 시간 시점에서 적어도 약 78%였다. 2 및 4 시간 실온 인큐베이션 후에 모든 그룹에서 생존력에서 약 4% 내지 10%의 약간의 감소 및 회복률에서 17% 이하의 감소가 있었다. 5x10⁶ 세포/mL 세포 농도의 평균 회복률은 모든 시점에서 2x10⁶ 세포/ml 농도의 것에 비해 더 높았다.

표 14. 생존력 및 회복률 평균.

도 24a 및 도 24b는 4-시간 인큐베이션 시간에 걸쳐 실온에서 해동된 RTA 세포 조성물의 생존력 및 회복률을 제시하는 그래프이다.

실시예 10

RTA 치료용 세포 조성물과 전달 디바이스의 상용성을 평가하였다. 전달 디바이스에는 약 0.63 mm의 외부 직경 및 약 0.53 mm의 내부 직경을 갖는 니들, 약 0.5 mm의 외부 직경 및 약 0.25 mm의 내부 직경을 갖는 모세관, 및 약 0.12 mm의 외부 직경 및 약 0.07 mm의 내부 직경을 갖는 팁을 포함하는, 더치 옵탈믹 리서치 센터 (Dutch Ophthalmic Research Center, D.O.R.C)에 의해 제작된 디바이스가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 4개의 배치를 포함하는 전달 디바이스 방출된 RTA 치료용 세포 조성물을 자동화된 해동 시스템을 사용하여 해동후 RT에서 2-시간 인큐베이션 시간 후에 생존력, 회복률 및 효력에 대해 검정하였다. 동결보존 이전에 여과 단계를 적용하지 않은 그룹 4를 제외하고는, 모든 RTA 세포 조성물을 실시예 6에 기재된 바와 같이 제형화하였다. 결과는 표 15에 제시된다.

표 15. 전달 디바이스로부터 방출 전에 RTA 세포 조성물의 안정성

시험한 그룹의 CRALBP/PMEL17 (동일성) 값 (표 15)은 모든 시점에서 시험한 모든 배치에 대해 98% 초과였다. 순 TEER 값 (14 일째)은 모든 그룹에서 100 Ω 초과로 잘 유지되었다. 시간이 지남에 따라 주로 그룹 1에서 및 4 시간후 그룹 4에서 점진적인 감소가 명확해졌다. 그룹 1 및 그룹 2로부터의 배치를 실온에서 4 시간 인큐베이션 후에 멸균성에 대해 시험하였고, 두 배치에 대해 성장은 관찰되지 않았다.

생존가능한 강력한 RTA 치료용 세포 조성물을 전달하기 위한 전달 디바이스의 상용성은 전달 디바이스 내에서 해동된 RTA 치료용 세포 조성물 (RT에서 2 시간 동안 인큐베이션하였음)을 방출시킴으로써 평가하였다. 제1 및 제2 용량 부피는 융통성을 허용하도록 시험하였다. 세포를 생존력, 회복률 및 효력에 대해 검정하였다. RTA 치료용 세포 조성물을 전달 디바이스에 로딩하기 전에 RT에서 2 시간 동안 유지시킨 후에 생존력 및 회복률 백분율에 대한 결과.

표 16. RT에서 2-시간 후에 생존력 및 회복률 (전달 디바이스 이전).

모든 그룹의 전달 디바이스 방출후 생존력 및 회복률 백분율이 표 17에 제시된다. 평균 생존력은 89% 내지 95%였다. 모든 그룹에 걸친 평균 총 회복률은 약 71% 내지 94%였다. 전달 디바이스 이전 회복률 결과와 비교하여 첫번째 100 μl의 회복률에서 8% 이하의 약간의 감소 및 두번째 100 μl 부피에서 16% 이하의 감소가 있었다 (회복률이 안정하게 유지된 그룹 2 제외).

표 17. 전달 디바이스 방출후 세포 생존력 및 회복률 결과.

그룹 4는 동결보존 이전에 여과 단계 없이 제형화되었다. 따라서, 감소된 회복률은 전달 디바이스에 잔류하는 세포 및 세포외 매트릭스 응집물과 관련된 것일 수 있다.

전달 디바이스 방출후 순 TEER (14 일 동안) 값이 표 18에 제시된다. 순 TEER 값은 약 154 Ω 내지 약 435 Ω의 범위였다. PEDF 정단/기저 비 (21 일째) 및 VEGF 기저/정단 비 (21 일째)에 대한 결과 또한 표 18에 제시된다.

표 18. 전달 디바이스 방출후 효력 결과.

그룹 1 및 3의 2x10⁶ 세포 용량에 대한 TEER 값이 5x10⁶ 세포 용량의 TEER 값 (그룹 2 및 4)에 비해 약간 더 높았지만, 시험한 모든 전달 디바이스 이후 샘플 그룹은 효력 검정 결과에 따라 생물학적 활성을 나타내었다.

실시예 11

동결운송기를 액체 질소로 로딩하고, 수송을 위해 준비하고, 실시예 10에 기재된 동결보존된 RTA 치료용 세포 조성물의 배치 (그룹 1-4)를 로딩하였다. 동결보존 이전에 여과 단계를 적용하지 않은 그룹 4를 제외하고는, 모든 RTA 세포 조성물을 실시예 6에 기재된 바와 같이 제형화하였다. RTA 치료용 세포 조성물을 이스라엘 예루살렘에서 메릴랜드주 프레데릭의 유에스-바이오레포지토리(US-biorepository)로 운송하였고, 액체 질소 냉동기의 증기 상에서 중간 저장하고, 생성물을 이스라엘 예루살렘으로 다시 운송하였다. 운송에는 단일 증기 상 동결운송기에 저장된 4개 배치 (그룹 1-4)의 항공 및 지상 수송이 포함되었고, 월드 쿠리어(World Courier)에 의해 수행되었다. 동결운송기는 대략 (-196℃) 내지 (-150℃)의 필요한 저장 조건을 제공하였고, 내부 데이터 로거(Data Logger)에 의해 모니터링되었다. 그룹 1-4를 외관, 생존력, 회복률, 효력 및 멸균성에 대해 검정하였다. 결과는 표 19에 제시된다.

표 19. 동결운송된 RTA 세포 조성물의 외관, 생존력, 회복률, 효력 및 멸균성.

^* 덩어리는 충전 및 마무리 절차 이전에 여과하지 않은 제형의 결과였다.

동결운송기의 온도가 -196℃ 미만으로 도달하지 않았지만, 이 온도는 세포 조성물의 온전성 및 품질에 대한 위험을 안고 있지 않으며, 액체 질소 데이터 로거의 보정된 범위 내에 있다.

결과는 CS5 동결배지 중에서 제형화된 동결보존된 RTA 세포 조성물의 안정성, 품질 및 온전성이, 이스라엘 예루살렘에서 메릴랜드주 프레데릭의 유에스-바이오레포지토리로의 제어된 운송, 액체 질소 냉동기의 증기 상에서 중간 저장 및 생성물의 이스라엘 예루살렘으로의 다시 운송 동안에 유지됨을 나타낸다.

실시예 12

RPE 세포 및 동결보존 용액을 포함하는 RTA 치료용 세포 조성물의 안전성을 NOD/SLID 마우스로의 망막하 주사 이후에 평가하였다. 5-9 주령의 총 40 마리의 암컷 NOD/SLID 마우스를 이용하였고, 각각의 그룹에서 4 또는 12 마리 동물의 4개의 그룹으로 나누었다 (각각의 종료 시점의 경우 n=1 또는 3; 투여후 1, 3, 7 및 14 일째).

4가지 조성물을 평가하였다. 표 20에 제시된 바와 같이, 그룹 1은 BSS 플러스를 투여하였고, 그룹 2는 CS5 동결배지를 투여하였고, 그룹 3은 RTA 치료용 세포 조성물 (RPE 세포 및 CS5를 포함함)을 투여하였고, 그룹 4는 BSS 플러스 중 RPE 세포를 투여하였다.

표 20. 실험 설계.

동물을 처음 24 시간 동안 주기적으로 관찰하고 (투여후 처음 4 시간 동안은 특별히 주의를 기울임), 그 후에는 종료시까지 매일 관찰하였다. 관찰은 국소 주사 부위, 피부, 털, 눈, 점막, 호흡기, 분비물 및 배설물 발생 (예를 들어, 설사) 및 자율 활성 (예를 들어, 누루, 타액 분비, 입모, 동공 크기, 비정상적인 호흡 패턴)에서의 임의의 변화에 대해 수행하였다. 기이한 거동, 떨림, 경련, 수면 및 혼수상태의 존재로서, 걸음걸이, 자세, 및 취급에 대한 반응에서의 변화 또한 포함된다. 이상, 독성 징후, 빈사 상태 및 예정되지 않은 사망은 관찰되지 않은 것으로 기록되었다. 눈 검사는 순응 동안에 및 각각의 종료일에 수의학 안과 의사에 의해 수행되었다. 모든 그룹으로부터의 모든 오른쪽 눈 (비처리된)에서 가시적인 병변 없음 (NVL)이 관찰되었다.

종료 시에, 동물을 CO2 질식에 의해 희생시키고, 상이한 눈 구조, 주요 조직 및 장기 시스템을 비롯하여 국소 주사 부위 (눈)를 검사하는 총 병리학을 수행하였다. 시신경을 비롯하여 동물을 적출시키고, 데이비슨(Davidson) 용액 중에서 고정시켰다. 모든 눈에 대해 조직병리학 검사를 실시하였다.

조직병리학 평가는 3 및 14 일째에 그룹 3 및 4로부터의 몇몇 세포-처리된 동물 (각각의 종료일 및 그룹에서 3 마리의 동물 중 1 마리)에서 대식세포 침윤의 존재를 나타내었다. 이들 발견은 아마도 인간 RPE 세포의 주사에 대한 늦은 면역 반응으로 인한 것이다. 그러나, 세포-처리된 그룹에서 대부분의 동물 (20/24)은 이식된 세포에 대해 어떠한 면역 반응도 나타내지 않았다. 세포로 처리하지 않은 그룹 1 및 2에서는, 호중구가 1, 3 및 7 일째에 관찰되었다 (3 마리의 동물에서). 호중구는 면역 반응의 초기 단계에서 일반적이지만, 대식세포의 결여는 늦은 반응이 없음을 나타낸다. 몇몇 세포-처리된 마우스 (4/24)에서 대식세포의 출현을 제외하고, 모든 그룹은 유사한 병리학을 나타내었으며, 이는 상기 발견이 절차-유도된 염증과 관련있을 가능성이 크다는 것을 나타낸다. 도 25a 및 도 25b는 각각 x4 및 x20 배율에서의 대표적인 조직학적 영상이며, RTA 제형 (세포 + CS5)으로 처리된 동물에서 가벼운 염증을 나타내었다. 수집된 데이터를 기반으로 하여, 10 일 추적 조사 이후에 비히클과 비교하여 치료용 세포 조성물의 망막하 투여 후에 주요한 처리-관련된 및/또는 독성학적으로 유의한 효과는 없었다.

실시예 13

상이한 제작 실행 동안에 제형화된 RTA RPE 치료용 세포 조성물의 비교가능성을 평가하기 위해, 몇몇 배치를 제조하였다. 먼저 적어도 1개의 hESC 앰풀을 해동시킴으로써 hESC를 기계적으로 계대하였다. 해동후, 앰풀로부터 회수된 10개의 단편을 피더 세포로부터 유래된 방사선 조사된 인간 제대의 단층을 함유하는 2개의 중심 웰 (CW) 플레이트 상에 시딩하고, 37℃/5% CO₂에서 '뉴트리스템 플러스'+HSA 배지 (또는 등가물) 중에서 인큐베이션하였다 (1개의 앰풀 → 10개의 콜로니 단편을 갖는 2개의 CW).

hESC 콜로니를 확장시키고, 총 45개의 중심 웰 플레이트에 도달할 때까지 약 3 주 더 매주 1회 계대하였다. 이어서, 콜로니를 약 2:1의 비로 피더를 갖는 6 cm 플레이트로 옮기고 (2개의 CW → 6 cm 플레이트), 37℃/5% CO₂에서 '뉴트리스템 플러스'+HSA 배지 중에서 약 6 일 동안 배양하였다.

구상체 (SB)를 형성하고, RPE 지시된 분화 과정을 개시하기 위해, hESC 콜로니를 6 cm 플레이트로부터 수집하고, 약 5:1의 비로 플레이트 (예컨대, 히드로셀™ (눈크)) (비-부착성 표면)로 옮기고 (5 x 6 cm 플레이트 → 플레이트), 37℃/5% CO₂ /5%O₂에서 니코틴아미드로 보충된 '뉴트리스템 마이너스' 배지 중에서 약 1 주 동안 배양하였다. SB 형성 약 1 주 후에, SB를 수집하였고, 피펫팅에 의해 작은 단편으로 분해하였다. SB 단편을 라미닌 511 (바이오라미나, 스웨덴 스톡홀름) 또는 등가물로 코팅된 6 웰 플레이트 상에 시딩하고, 니코틴아미드 및 액티빈 A의 존재 하에 (분화 단계에 따라 달라지는 니코틴아미드 및 액티빈 A의 조합) 뉴트리스템 마이너스 또는 등가물 중에서 약 37℃/5% CO₂ /5% O₂에서 약 5 주 동안 및 37℃/5% CO₂에서 약 1 주 동안 배양하였다. 분화 단계의 종료 시에, 착색된 세포를 효소적으로 강화시키고, 재조합 인간 젤라틴 코된 T175 (175 cm²) 플라스크로 옮기고 (P0), 뉴트리스템 마이너스 중에서 (처음 2-3 일 동안 20% 인간 혈청/DMEM) 37℃/5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

세포를 대략 14 일째에 수확하고, rh-젤라틴 코팅된 T175 플라스크로 계대하고, 뉴트리스템 마이너스 중에서 (처음 2-3 일 동안 20% 인간 혈청/DMEM) 약 37℃/5% CO₂에서 인큐베이션하였다 (P1). 세포를 12 일째에 수확하고, rh-젤라틴 코팅된 T175 플라스크로 계대하고, 뉴트리스템 마이너스 중에서 (처음 2-3 일 동안 20% 인간 혈청/DMEM) 37℃/5% CO₂에서 인큐베이션하였다 (P2).

P2 계대후 10 일째에, T175 플라스크를 수확하고, 500-200-40 μm 세포 스트레이너 시스템의 순차적 탄뎀을 이용하여 여과한 다음, 풀링하였다. 이 시점에서 세포의 총 개수는 적어도 약 551x10⁶ 세포일 수 있다. 세포를 원심분리하고, 동결배지 (예컨대, 크리오스토르 5 (바이오라이프 솔루션즈 인크., 워싱턴주 보첼)) 중에서 재현탁시키고, 계수하여, 약 1x10⁶ 세포/ml, 약 2x10⁶ 세포/ml, 약 3x10⁶ 세포/ml, 약 4x10⁶ 세포/ml, 약 5x10⁶ 세포/ml, 약 6x10⁶ 세포/ml, 약 7x10⁶ 세포/ml, 약 8x10⁶ 세포/ml, 또는 약 9x10⁶ 세포/ml의 최종 농도에 도달하였다. 이 세포 현탁액을 크리오바이알로 분배할 때까지 2-8℃에서 유지시킬 수 있다. 이어서, RTA 치료용 세포 조성물을 제어된-속도 냉동기에서 동결보존시킬 수 있고, 이어서 증기 상 LN2 냉동기로 옮길 수 있다. 이용될 수 있는 냉동 프로파일의 예에는 하기가 포함된다:

ㆍ 4℃에서 대기

ㆍ 4℃에서 1 분 동안 유지

ㆍ -11℃로 1.00℃ /분 샘플

ㆍ -50℃로 30.00℃ /분 챔버

ㆍ -25℃로 15.00℃ /분 챔버

ㆍ -50℃로 1.00℃ /분 챔버

ㆍ -90℃로 10.00℃ /분 챔버

ㆍ 종료

또는

ㆍ 4℃에서 대기

ㆍ -4℃로 1.00℃ /분 샘플

ㆍ -40℃로 25.00℃ /분 챔버

ㆍ -12℃로 10.00℃ /분 챔버

ㆍ -40℃로 1.00℃ /분 챔버

ㆍ -90℃로 10.00℃ /분 챔버

ㆍ 종료

표 21은 hESC가 확장되고, RPE 세포로 분화되고, RPE 세포로서 확장됨에 따라 이들의 모폴로지 및 순도 결과를 제공한다. 표 21에 제시된 바와 같이, hESC는 상기 기재된 과정을 이용하여 성공적으로 확장되고 분화되었다.

표 21. RTA 배치 A에 대한 확장 및 분화기 동안에 세포의 분석

또한, 퍼센트 생존력, 세포 농도, 퍼센트 회복률, 및 순도를 배치 A에 대해 측정하였다. 결과는 표 22에 제시된다.

표 22. RTA 배치 A에 대한 퍼센트 생존력, 세포 농도, 퍼센트 회복률, 및 순도

배치 A에 대해 기재된 것과 같이 추가의 배치를 생성하고 분석하였다. 각각의 배치에 대한 세포 용량이 표 23에 제시된다.

표 23. 각각의 배치에 대한 세포 용량

배치 B-F에 대한 결과는 표 24 및 표 25에 제시된다.

표 24. 배치 B-F에 대한 모폴로지, 멸균성, 및 순도

^* 시험한 세포 조성물

표 25. 배치 B-F에 대한 퍼센트 생존력, 세포 농도, 퍼센트 회복률, 순도, 멸균성, PEDF 분비 및 VEGF 분비

표 24 및 표 25에 제시된 바와 같이, RTA RPE 치료용 세포 조성물의 제형 방법은 세포 모폴로지, 멸균성, 순도, 퍼센트 생존력, 세포 농도, 퍼센트 회복률, PEDF 분비 및 VEGF 분비 (효력)와 관련하여 재현가능하고 확고하다.

본원의 기재가 여러 상세한 내용을 함유하지만, 이들이 본 개시내용의 범위를 제한하지 않으며, 단지 본원의 바람직한 실시양태의 일부를 설명하기 위해 제공되는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본 개시내용의 범위가 관련 기술분야의 기술자에게 명백해질 수 있는 다른 실시양태를 충분히 포함한다는 것을 이해할 것이다.

청구범위에서, 단수로 언급된 요소는 명시적으로 나타내지 않는다면 "하나 및 단지 하나"를 의미하는 것이 아니라, 오히려 "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 개시된 실시양태의 요소에 대한 모든 구조적, 화학적 및 기능적 등가물은 본원에 명백히 참조로 포함되고, 본원의 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다. 추가로, 본 개시내용에서 어떠한 요소, 성분 또는 방법 단계도, 상기 요소, 성분 또는 방법 단계가 청구범위에서 명시적으로 인용되는지 여부와 무관하게, 대중에게 제공되는 것으로 의도되지 않는다. 본원의 어떠한 청구범위 요소도, 상기 요소가 명시적으로 어구 "을 위한 수단"을 이용하여 인용되지 않는다면, "수단 플러스 기능" 요소로 해석되어서는 안된다. 본원의 어떠한 청구범위 요소도, 상기 요소가 명시적으로 어구 "을 위한 단계"를 이용하여 인용되지 않는다면, "단계 플러스 기능" 요소로 해석되어서는 안된다.

Claims (79)

1. 대상체에서 망막 변성 질환의 진행을 늦추거나, 연령 관련 황반 변성 (AMD)의 진행을 늦추거나, 망막 변성 질환을 예방하거나, AMD를 예방하거나, 망막 색소 상피 (RPE)를 복원시키거나, RPE를 증가시키거나, RPE를 대체하거나 또는 RPE 결함을 치료하는 것 중 하나 이상을 포함하는 방법으로서, 대상체에게 RPE 세포 및 즉시 투여가능한 생체적합성 동결보존 배지를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 동결보존 배지가 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물을 포함하는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 동결보존 배지가 약 2% DMSO를 포함하는 것인 방법.
4. 제2항에 있어서, 동결보존 배지가 약 5% DMSO를 포함하는 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 동결보존 배지가 약 1% 내지 약 15% DMSO, 또는 약 0.5% 내지 약 7% DMSO, 또는 약 1.5% 내지 약 6.5% DMSO, 또는 약 1.5% 내지 약 3% DMSO, 또는 약 4% 내지 약 6% DMSO를 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 동결보존 배지가 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 것인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 변성 질환이 RPE 기능장애, 광수용체 기능장애, 리포푸신의 축적, 드루젠의 형성, 또는 염증 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 변성 질환이 색소성 망막염, 레베르 선천성 흑암시, 유전성 또는 후천성 황반 변성, 연령 관련 황반 변성 (AMD), 베스트병, 망막 박리, 뇌회형 위축, 맥락막결손, 패턴 이영양증, RPE 이영양증, 스타르가르트병, 광, 레이저, 감염, 방사선, 신생혈관 또는 외상성 손상 중 어느 하나에 의해 야기된 RPE 및 망막 손상 중 적어도 하나로부터 선택되는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, AMD가 지도형 위축 (GA)을 포함하는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 결함이 고령, 담배 흡연, 건강하지 못한 체중, 항산화제의 낮은 섭취, 또는 심혈관 장애 중 하나 이상으로부터 초래되는 것인 방법.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 결함이 선천성 이상으로부터 초래되는 것인 방법.
12. 시력의 회복을 필요로 하는 대상체에서 시력을 회복시키는 방법으로서, 대상체에게 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 물, 및 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
13. 시력의 회복을 필요로 하는 대상체에서 시력을 회복시키는 방법으로서, 대상체에게 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지; 및 RPE 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
14. 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서,
    (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고;
    (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고;
    (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 적어도 약 60% 내지 약 92%가 생존가능한 것인
    방법.
15. 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서,
    (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고;
    (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고;
    (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 50% 내지 약 120%인
    방법.
16. 제15항에 있어서, 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 65% 내지 약 70%였고; 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 64% 내지 약 97%였고; 해동 후에 세포의 수율이 적어도 약 59% 내지 약 82%였던 것인 방법.
17. 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서,
    (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고;
    (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고;
    (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동한지 약 24 시간 후에 세포의 활력이 적어도 약 30% 내지 약 112%였던 것인
    방법.
18. 제17항에 있어서, 해동한지 약 24 시간 후에 세포의 활력이 적어도 약 89% 내지 약 110%였고; 해동한지 약 24 시간 후에 세포의 활력이 적어도 약 76% 내지 약 112%였던 것인 방법.
19. 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서,
    (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고;
    (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고;
    (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 및 배양한지 약 8-18 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 3 내지 약 7배였던 것인
    방법.
20. 제19항에 있어서, 해동 및 배양한지 약 14 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 4.2 내지 약 5.4배였던 것인 방법.
21. 제19항에 있어서, 해동 및 배양한지 약 14 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 4.2 내지 약 4.9배였고; 해동 및 배양한지 약 14 일 후에 세포의 확장이 적어도 약 4.5 내지 약 5.4배였던 것인 방법.
22. 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서,
    (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지 중에서 RPE 세포를 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하고;
    (b) 동결보존 온도에서 세포 현탁액을 저장하고;
    (c) 동결보존된 세포 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 세포가 해동 후에 약 100 Ω 내지 약 1300 Ω의 장벽 기능 TEER; 약 3.5 내지 약 9.4의 PEDF 상부 대 하부 비; 약 1.2 내지 약 5의 VEGF 하부 대 상부 비; 또는 약 95% 내지 약 100%의 순도 중 하나 이상을 입증한 것인
    방법.
23. 제22항에 있어서, 세포가 약 107 내지 약 402 Ω; 또는 약 241 내지 약 715 Ω의 장벽 기능을 가졌던 것인 방법.
24. 제22항에 있어서, 세포가 약 5.1 내지 약 9.4; 또는 약 3.5 내지 약 9.4의 PEDF 상부 대 하부 비를 가졌던 것인 방법.
25. 제22항에 있어서, 세포가 약 1.2 내지 약 1.7; 또는 약 1.2 내지 약 1.9의 VEGF 하부 대 상부 비를 가졌던 것인 방법.
26. 제2항 및 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 퓨린 뉴클레오시드, 분지형 글루칸, 완충제, 및 극성 비양성자성 용매 중 1종 이상이 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 것인 방법.
27. 제2항 및 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 보존이 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 당 산이 락토비온산, 글리세르산, 크실론산, 글루콘산, 아스코르브산, 뉴라민산, 케토데옥시옥툴로손산, 글루쿠론산, 갈락투론산, 갈락투론산, 이두론산, 타르타르산, 뮤신산, 또는 사카르산을 포함하는 것인 방법.
29. 제27항에 있어서, 1종 이상의 염기가 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 포함하는 것인 방법.
30. 제27항에 있어서, 항산화제가 L-글루타티온, 아스코르브산, 리포산, 요산, 카로텐, 알파-토코페롤, 또는 유비퀴놀을 포함하는 것인 방법.
31. 제27항에 있어서, 1종 이상의 할라이드 염이 염화칼륨, 염화나트륨, 또는 염화마그네슘을 포함하는 것인 방법.
32. 제27항에 있어서, 염기성 염이 중탄산칼륨, 중탄산나트륨, 또는 아세트산나트륨을 포함하는 것인 방법.
33. 제27항에 있어서, 포스페이트 염이 인산칼륨, 인산나트륨, 또는 인산칼륨을 포함하는 것인 방법.
34. 제27항에 있어서, 1종 이상의 당이 덱스트로스, 수크로스를 포함하는 것인 방법.
35. 제27항에 있어서, 당 알콜이 만니톨, 소르비톨, 에리트리톨 또는 크실리톨을 포함하는 것인 방법.
36. 제27항에 있어서, 당 산, 염기, 할라이드 염, 염기성 염, 항산화제, 포스페이트 염, 당, 당 알콜 중 1종 이상이 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 것인 방법.
37. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 조성물이 망막하로 투여되는 것인 방법.
38. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 조성물이 전달 디바이스를 이용하여 투여되는 것인 방법.
39. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 디바이스가 니들, 모세관 및 팁을 포함하는 것인 방법.
40. 제39항에 있어서, 전달 디바이스가 약 0.63 mm의 외부 직경 및 약 0.53 mm의 내부 직경을 갖는 니들, 약 0.5 mm의 외부 직경 및 약 0.25 mm의 내부 직경을 갖는 모세관, 및 약 0.12 mm의 외부 직경 및 약 0.07 mm의 내부 직경을 갖는 팁을 포함하는 것인 방법.
41. 제38항에 있어서, 전달후 퍼센트 생존력이 약 85% 내지 약 99%이고, 전달후 퍼센트 회복률이 약 65% 내지 약 99%이고, 전달후 장벽 기능 TEER이 약 100 내지 약 600 Ω이고, PEDF 정단/기저 비가 약 2 내지 약 7이고, 전달후 VEGF 기저/정단 비가 약 1.5 내지 약 3인 방법.
42. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 망막하 공간으로 투여되는 것인 방법.
43. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 주사되는 것인 방법.
44. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 단일 용량 치료로서 투여되는 것인 방법.
45. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 투여후 염증을 야기하지 않는 것인 방법.
46. 제45항에 있어서, 염증이 염증과 연관된 세포의 존재를 특징으로 하는 것인 방법.
47. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 조성물이 유리체절제 없이 및 망막을 천공할 필요 없이 투여되는 것인 방법.
48. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 조성물이 맥락막상 주사에 의해 투여되는 것인 방법.
49. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 신경영양 인자: 섬유모세포 성장 인자 (bFGF 및 aFGF), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 색소 상피-유래된 인자 (PEDF), 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 중 1종 이상을 분비하는 것인 방법.
50. 제1항 내지 제6항 및 제12항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 1종 이상의 항염증성 시토카인을 분비하는 것인 방법.
51. 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서,
    (a) 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물을 포함하는 배지 조성물 중에서 RPE 세포를 현탁시키고;
    (b) 동결보존에 적절한 온도에서 세포 현탁액을 저장하고;
    (c) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 적어도 약 60% 내지 약 95%가 생존가능한 것인
    방법.
52. 제14항 또는 제51항에 있어서, 해동 후에 세포의 적어도 약 40% 내지 약 100%가 생존가능하고; 해동 후에 세포의 적어도 약 45% 내지 약 95%가 생존가능하고; 해동 후에 세포의 적어도 약 62% 내지 약 70%가 생존가능한 것인 방법.
53. 해동 직후에 대상체에게 투여하기 위한 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 제형화하는 방법으로서,
    (a) RPE 세포를 포함하는 세포의 집단으로 줄기 세포를 분화시키고;
    (b) RPE 세포를 효소적으로 수확하고;
    (c) 효소를 중화제에 의해 중화시키며, 여기서 중화제는 인간 혈청을 포함하지 않는 것이고;
    (d) 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물을 포함하는 배지 조성물 중에서 RPE 세포를 현탁시키고;
    (e) 동결보존에 적절한 온도에서 세포 현탁액을 저장하고;
    (f) 동결보존된 현탁액을 해동시키는 것을 포함하며, 여기서 해동 후에 세포의 적어도 약 70%가 생존가능한 것인
    방법.
54. 제53항에 있어서, RPE 세포가 중화제 중에서 약 1 내지 약 8 시간 동안 저장되며, 생존력이 약 10% 초과로 감소되지 않는 것인 방법.
55. 제14항, 제15항, 제17항, 제19항, 제22항, 제51항 및 제53항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포를 동결보존 이전에 배지 조성물 중에서 약 3 시간 동안 현탁시키며, 배지 중에서 1 시간 미만 동안 현탁시킨 RPE 세포와 비교하여 해동후 퍼센트 생존력이 약 10% 초과로 감소되지 않고, 해동후 퍼센트 수율이 20% 초과로 감소되지 않고, 해동후 활력이 10% 초과로 감소되지 않는 것인 방법.
56. 제14항, 제15항, 제17항, 제19항, 제22항, 제51항 및 제53항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포를 동결보존 이전에 배지 조성물 중에서 약 3 시간 동안 현탁시키며, 배지 중에서 1 시간 미만 동안 현탁시킨 RPE 세포와 비교하여 해동후 장벽 기능이 감소되지 않고, 해동후 PEDF 상부 대 하부 비가 10% 초과로 감소되지 않고, 해동후 VEGF 하부 대 상부 비가 감소되지 않는 것인 방법.
57. 제14항, 제15항, 제17항, 제19항, 제22항, 제51항 및 제53항 중 어느 한 항에 있어서, RPE 세포를 동결보존 이전에 배지 조성물 중에서 약 2 내지 3 시간 동안 현탁시키고, 해동후 퍼센트 생존력이 약 50 내지 약 75이고, 해동후 퍼센트 수율이 약 50 내지 약 95이고, 해동후 활력이 약 80 내지 약 120이고, 해동후 장벽 기능이 약 100 내지 약 750 Ω이고, 해동후 PEDF 상부 대 하부 비가 약 3 내지 약 7이고, 해동후 VEGF 하부 대 상부 비가 약 1 내지 3인 방법.
58. 제53항에 있어서, 단계 (c) 이후에 RPE 세포를 순차적으로 여과하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 퍼센트 생존력이 적어도 98%인 방법.
59. 제53항에 있어서, 단계 (c) 이후에 RPE 세포를 순차적으로 여과하고, RPE 세포를 배지 조성물 중에서 약 2-4 시간 동안 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 퍼센트 회복률이 약 80% 내지 약 95%인 방법.
60. 제53항에 있어서, 단계 (c) 이후에 RPE 세포를 순차적으로 여과하고, RPE 세포를 중화 용액 중에서 약 2 내지 약 4 시간 동안 인큐베이션하고, RPE 세포를 배지 조성물 중에서 약 2-4 시간 동안 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 퍼센트 생존력이 약 80% 내지 약 99%이고, 여기서 퍼센트 회복률이 약 70% 내지 약 95%인 방법.
61. 제53항에 있어서, 단계 (c) 이후에 RPE 세포를 순차적으로 여과하고, RPE 세포를 중화 용액 중에서 약 2 내지 약 4 시간 동안 인큐베이션하고, RPE 세포를 배지 조성물 중에서 약 2-4 시간 동안 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 해동후 퍼센트 생존력이 약 80% 내지 약 99%이고, 여기서 해동후 퍼센트 회복률이 약 70% 내지 약 95%이고, 여기서 PEDF 분비가 약 2,000 ng/ml/일 내지 약 3,000 ng/ml/일인 방법.
62. 제53항에 있어서, RPE 세포를 배지 조성물 중에서 약 2-6 시간 동안 실온에서 인큐베이션하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 퍼센트 생존력이 약 80% 내지 약 99%이고, 여기서 퍼센트 회복률이 약 80% 내지 약 120%인 방법.
63. 하기를 포함하는 조성물로서:
    (a) 아데노신, 덱스트란-40, 락토비온산, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산)), 수산화나트륨, L-글루타티온, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 인산칼륨, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 및 물; 및
    (b) RPE 세포,
    극저온 온도에서 저장될 수 있고 해동 직후에 대상체에게 즉시 투여가능한 조성물.
64. 하기를 포함하는 치료용 세포 조성물:
    (a) 퓨린 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신), 분지형 글루칸 (예를 들어, 덱스트란-40), 쯔비터이온성 유기 화학적 완충제 (예를 들어, HEPES (N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄술폰산))), 및 세포 내성 극성 비양성자성 용매 (예를 들어, 디메틸 술폭시드 (DMSO))를 포함하는 세포 보존 배지; 및
    (b) RPE 세포.
65. 제64항에 있어서, 퓨린 뉴클레오시드, 분지형 글루칸, 완충제, 및 극성 비양성자성 용매 중 1종 이상이 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 것인 치료용 세포 조성물.
66. 제64항에 있어서, 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 추가로 포함하는 치료용 세포 조성물.
67. 제66항에 있어서, 당 산이 락토비온산, 글리세르산, 크실론산, 글루콘산, 아스코르브산, 뉴라민산, 케토데옥시옥툴로손산, 글루쿠론산, 갈락투론산, 갈락투론산, 이두론산, 타르타르산, 뮤신산, 또는 사카르산을 포함하는 것인 치료용 세포 조성물.
68. 제66항에 있어서, 1종 이상의 염기가 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 포함하는 것인 치료용 세포 조성물.
69. 제66항에 있어서, 항산화제가 L-글루타티온, 아스코르브산, 리포산, 요산, 카로텐, 알파-토코페롤, 또는 유비퀴놀을 포함하는 것인 치료용 세포 조성물.
70. 제66항에 있어서, 1종 이상의 할라이드 염이 염화칼륨, 염화나트륨, 또는 염화마그네슘을 포함하는 것인 치료용 세포 조성물.
71. 제66항에 있어서, 염기성 염이 중탄산칼륨, 중탄산나트륨, 또는 아세트산나트륨을 포함하는 것인 치료용 세포 조성물.
72. 제66항에 있어서, 포스페이트 염이 인산칼륨, 인산나트륨, 또는 인산칼륨을 포함하는 것인 치료용 세포 조성물.
73. 제66항에 있어서, 1종 이상의 당이 덱스트로스, 수크로스를 포함하는 것인 치료용 세포 조성물.
74. 제66항에 있어서, 당 알콜이 만니톨, 소르비톨, 에리트리톨 또는 크실리톨을 포함하는 것인 치료용 세포 조성물.
75. 제66항에 있어서, 당 산, 염기, 할라이드 염, 염기성 염, 항산화제, 포스페이트 염, 당, 당 알콜 중 1종 이상이 US FDA에 의해 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 것인 치료용 세포 조성물.
76. 제63항 또는 제64항에 있어서, RPE 세포 농도가 약 100,000 내지 약 10,000,000개 세포/ml인 조성물.
77. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 조성물 중 세포의 개수가 약 100,000 내지 약 500,000개인 조성물.
78. 제64항에 있어서, 세포 보존 배지가 당 산 (예를 들어, 락토비온산), 1종 이상의 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨), 항산화제 (예를 들어, L-글루타티온), 1종 이상의 할라이드 염 (예를 들어, 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘), 염기성 염 (예를 들어, 중탄산칼륨), 포스페이트 염 (예를 들어, 인산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨), 1종 이상의 당 (예를 들어, 덱스트로스, 수크로스), 당 알콜 (예를 들어, 만니톨), 및 물 중 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 치료용 세포 조성물.
79. 제64항에 있어서, ROCK 억제제 또는 NA 중 1종 이상을 추가로 포함하는 치료용 세포 조성물.

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