ES2858648T3

ES2858648T3 - Células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos y terapia celular que comprende las mismas

Info

Publication number: ES2858648T3
Application number: ES15735181T
Authority: ES
Inventors: Chul Won Ha; Jin A Kim
Original assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation
Current assignee: Samsung Life Public Welfare Foundation
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2021-09-30
Anticipated expiration: 2035-01-08
Also published as: KR20160036031A; US20160324901A1; JP2017502071A; EP3093340A1; KR101669038B1; US10232000B2; WO2015105357A1; KR101697141B1; JP6545690B2; CN106255747A; CN106255747B; KR20150083439A; EP3093340B1; EP3093340A4

Abstract

Un método in vitro o ex vivo para preparar células madre; caracterizado porque comprende una etapa de aislar células madre a partir de una porción basal de una capa de trofoblastos coriónicos (bCT); en el que las células madre a partir de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se derivan a partir de un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % como porción adyacente a una membrana coriónica de una capa de trofoblastos coriónicos total situada entre la membrana coriónica y una decidua.

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos y terapia celular que comprende las mismas

[Campo técnico]

El presente texto describe células madre derivadas de una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) que forma parte de los tejidos de la placenta, y una terapia celular que incluye las mismas.

[Técnica anterior]

Recientemente, la biotecnología ha propuesto la posibilidad de nuevas soluciones a los problemas alimentarios, ambientales y sanitarios como objetivo final del bienestar humano, y entre ellas, una técnica que usa células madre está surgiendo como una nueva técnica de tratamiento de enfermedades incurables. Para este tratamiento de enfermedades del ser humano, se han propuesto anteriormente trasplante de órganos, terapia génica y similares, pero una comercialización eficiente no es suficiente debido a rechazo inmunológico, escasez de órganos suministrados y falta de conocimiento sobre el desarrollo de vectores o genes de enfermedades. Como resultado, aumenta el interés en las células madre, y se reconocen células madre totipotentes que tienen capacidad para generar todos los órganos a través de proliferación y diferenciación para tratar la mayoría de las enfermedades y esencialmente resolver el daño orgánico. Además, muchos científicos han propuesto de diversas formas la posibilidad de usar células madre para tratamientos de la enfermedad de Parkinson que ha sido incurable, diversos cánceres, diabetes y lesiones de la médula espinal, y similares, así como para la regeneración de casi todos los órganos del cuerpo humano.

Las “células madre” se refieren a células que tienen capacidad de autorreplicación como células no diferenciadas y una capacidad de diferenciación en dos o más tipos diferentes de células. Las células madre se clasifican en células madre embrionarias y células madre adultas según el origen citológico. Las células madre embrionarias se derivan de un embrión o de un tejido genital fetal durante la generación, mientras que las células madre adultas se derivan de médula ósea, sangre del cordón umbilical, grasa, placenta, músculo, sinovio, cerebro, hígado, páncreas, y similares, que son tejidos del sujeto después de que se complete el crecimiento fetal. Dado que las células madre embrionarias tienen problemas éticos, existe una limitación para su uso como agente terapéutico celular, sin embargo, las células madre adultas pueden extraerse principalmente de grasa, sangre del cordón umbilical, médula ósea, placenta y similares y no tienen ningún problema ético.

De entre ellas, en el caso de las células madre derivadas de la placenta, usar la placenta desechada después del parto resulta ventajoso porque la extracción es fácil y puede garantizarse una gran cantidad de células madre fácilmente. Las células madre derivadas de la grasa o de la médula ósea se ven influidas por la edad o los estados de salud de los donantes de los que van a aislarse y extraerse, teniendo una limitación en la capacidad de proliferación o diferenciación y una gran variabilidad. Sin embargo, la capacidad de las células madre derivadas de la placenta no se ve casi influida según parámetros tales como la edad de los donantes como células madre que pueden obtenerse en la etapa más temprana entre las células madre adultas, y también, tales células madre tienen excelentes capacidades de proliferación y diferenciación. Además, a partir de las células madre derivadas de la placenta, puede aislarse un grupo de células madre que puede usarse para diversas enfermedades tales como trastornos del sistema nervioso, enfermedades hepáticas y enfermedades musculoesqueléticas.

Debido a las ventajas mencionadas anteriormente, se han realizado activamente investigaciones sobre las células madre derivadas de la placenta. Por ejemplo, en el registro de patentes de Corea n.° 818214, se propone un método de aislamiento de células madre a partir de una membrana amniótica o de un decidua usando un medio que incluye N-acetil-L-cisteína (NAC), y en el registro de patentes de Corea n.° 871984, se propone un método de cultivo de células madre derivadas de una membrana amniótica, una membrana serosa, una decidua basal y un tejido de placenta usando un medio que incluye un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). Sin embargo, hasta ahora, no se han realizado aún investigaciones sobre células madre derivadas de una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que forma parte de los tejidos de la placenta.

[Divulgación]

[Problema técnico]

En tales circunstancias, los presentes inventores han realizado estudios intensivos para desarrollar células madre que tienen una capacidad de células madre más excelente a partir de las células madre derivadas de la placenta. Como resultado, los presentes inventores han completado la presente divulgación aislando una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) que es una capa tisular correspondiente a un grosor de aproximadamente el 25 % como porción adyacente a una membrana coriónica en una capa de trofoblastos coriónicos total (tCT) de la placenta para preparar células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos y verificar que las células madre derivadas de la porción basal de la capa trofoblastos coriónicos (bCT) que forma parte de los tejidos de la placenta presentan una característica de crecimiento uniforme, y excelentes características de proliferación y diferenciación como células madre pluripotentes, en comparación con las células madre convencionales derivadas de la placenta completa u otros tejidos, y presentan un excelente efecto de regeneración tisular en un modelo animal de defecto tisular.

Por consiguiente, un objeto de esta invención es proporcionar células madre derivadas de una porción basal de una capa de trofoblastos coriónicos (bCT) que forma parte de los tejidos de la placenta.

Otro objeto de esta invención es proporcionar un agente terapéutico celular y una composición para la regeneración de tejidos que incluye células madre derivadas de una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos o células diferenciadas a partir de las células madre como principio activo.

[Solución técnica]

Un aspecto del presente texto describe células madre derivadas de una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) que forma parte de los tejidos de la placenta.

Otro aspecto del presente texto describe un agente terapéutico celular que incluye células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) o células diferenciadas a partir de las células madre como principio activo.

Otro aspecto más del presente texto describe una composición para regenerar tejidos que incluye células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) o células diferenciadas a partir de las células madre como principio activo.

Según un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro o ex vivo para la preparación de células madre; caracterizado porque comprende una etapa de aislar células madre a partir de una porción basal de una capa de trofoblastos coriónicos (bCT); en el que las células madre de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se derivan de un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % como porción adyacente a una membrana coriónica de una capa de trofoblastos coriónicos total situada entre la membrana coriónica y una decidua.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro o ex vivo para preparar un agente terapéutico celular que incluye células madre como agente activo; caracterizado porque comprende una etapa de proporcionar células madre a partir de una porción basal de una capa de trofoblastos coriónicos (bCT); en el que las células madre de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se derivan de un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % como porción adyacente a una membrana coriónica de una capa de trofoblastos coriónicos total situada entre la membrana coriónica y una decidua.

Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método in vitro o ex vivo para preparar una composición para la regeneración de tejidos que comprende células madre como agente activo; caracterizado porque comprende una etapa de proporcionar células madre a partir de una porción basal de una capa de trofoblastos coriónicos (bCT); en el que las células madre de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se derivan de un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % como porción adyacente a una membrana coriónica de una capa de trofoblastos coriónicos total situada entre la membrana coriónica y una decidua.

Además, otro objeto de la invención se refiere a un método in vitro o ex vivo de diferenciación de células madre; caracterizado porque comprende una etapa de proporcionar células madre a partir de una porción basal de una capa de trofoblastos coriónicos (bCT); en el que las células madre de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se derivan de un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % como porción adyacente a una membrana coriónica de una capa de trofoblastos coriónicos total situada entre la membrana coriónica y una decidua; y diferenciar las células madre.

[Efectos ventajosos]

Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos pueden presentar una característica de crecimiento uniforme y excelentes características de proliferación y diferenciación en comparación con las células madre convencionales derivadas de la placenta completa u otros tejidos, y pueden presentar un excelente efecto de regeneración tisular en un modelo animal de defecto tisular, y por tanto pueden usarse de manera útil como agente terapéutico celular.

[Descripción de los dibujos]

La figura 1 es un diagrama que ilustra fotografías de la sección transversal de una membrana coriónica (CM), una membrana coriónica y una capa de trofoblastos coriónicos (CMT), una capa de trofoblastos coriónicos total (tCT), una porción superior de la capa de trofoblastos coriónicos (uCT) y una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) que son partes de los tejidos de la placenta (Pla).

La figura 2 es un diagrama que ilustra fotografías (x100) que se obtienen observando, mediante un microscopio, las formas celulares antes del subcultivo (P0) y después del subcultivo a largo plazo (P31) de células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) según una realización a modo de modo ejemplo de la presente invención.

La figura 3 es un diagrama que ilustra fotografías (x100) que se obtienen observando, mediante un microscopio, las formas celulares antes del subcultivo (P0) y después del subcultivo a largo plazo (P29) de células madre derivadas de placenta completa.

La figura 4 es un diagrama que ilustra los tiempos de duplicación de la población de células madre derivadas de placenta completa, cada tejido fino de la placenta y otros tejidos.

La figura 5 es un diagrama que ilustra las unidades formadoras de colonias de células madre derivadas de placenta completa, cada tejido fino de la placenta y otros tejidos.

La figura 6 es un diagrama que ilustra un resultado de análisis de células parenquimatosas para verificar la expresión de un factor de superficie característico de las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT).

La figura 7 es un diagrama que ilustra los resultados de tinción para observar los grados de diferenciación de las células madre derivadas de placenta completa, cada tejido fino de la placenta y otros tejidos en adipogénicas (adipogénesis), condrogénicas (condrogénesis) u osteogénicas (osteogénesis), respectivamente.

La figura 8 es un diagrama que ilustra los resultados cuantificados obtenidos después de la tinción con safranina-O para observar el grado de diferenciación de las células madre derivadas de la placenta completa, cada tejido fino de la placenta y otros tejidos en condrogénicas.

La figura 9 es un diagrama que ilustra los resultados cuantificados obtenidos después de realizar tinción inmunohistoquímica usando colágeno tipo II para observar el grado de diferenciación de las células madre derivadas de la placenta completa, cada tejido fino de la placenta y otros tejidos en condrogénicas.

La figura 10 es un diagrama que ilustra los resultados cuantificados obtenidos después de la tinción con fosfato alcalino para observar el grado de diferenciación de las células madre derivadas de la placenta completa, cada tejido fino de la placenta y otros tejidos en osteogénicas.

La figura 11 es un diagrama que ilustra los resultados cuantificados obtenidos después de la tinción con rojo de alizarina S para observar el grado de diferenciación de las células madre derivadas de la placenta completa, cada tejido fino de la placenta y otros tejidos en osteogénicas.

La figura 12 es un diagrama que ilustra los resultados cuantificados obtenidos después de la tinción con aceite rojo O para observar el grado de diferenciación de las células madre derivadas de la placenta completa, cada tejido fino de la placenta y otros tejidos en adipogénicas.

La figura 13 es un diagrama que ilustra los resultados de la verificación de un efecto de regeneración del cartílago mediante tinción con H&E y safranina-O tras trasplantar las células madre derivadas de sangre del cordón umbilical (UCB) o las células madre derivadas de una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) a un modelo animal de daño en el cartílago.

La figura 14 es un diagrama que ilustra los resultados de la verificación de un efecto de regeneración del cartílago a través de cuantificación usando la puntuación macroscópica de la Sociedad internacional de reparación del cartílago (ICRS) después del trasplante de las células madre derivadas de sangre del cordón umbilical (UCB) o las células madre derivadas de una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) a un modelo animal de daño en el cartílago.

[Modos de la divulgación]

A continuación en el presente documento, la presente divulgación se describirá en detalle.

El presente texto describe células madre derivadas de una porción basal de una capa de trofoblastos coriónicos (bCT) que forma parte de los tejidos de la placenta.

En la presente invención, las “células madre” se refieren a células que tienen capacidad de autorreplicación y una capacidad de diferenciación en dos o más tipos diferentes de células. Las células madre pueden clasificarse en células madre totipotentes, células madre pluripotentes y células madre multipotentes según su capacidad de diferenciación.

En la presente invención, las “células madre totipotentes” son células que tiene una propiedad totipotente que pueden diferenciarse en un sujeto completo, las células hasta 8 estadios celulares después de la fertilización del óvulo y el espermatozoide tienen la propiedad totipotente, y la célula madre totipotente significa la célula que va a diferenciarse en un sujeto completo cuando las células se aíslan, y luego, se trasplantan al útero. En la presente invención, las “células madre pluripotentes” son células que pueden diferenciarse en diversas células y tejidos derivados de capas de ectodermo, mesodermo y endodermo, y se derivan de una masa celular interna en el blastocisto que se muestra después de 4 a 5 días de la fertilización, que se denominan células madre embrionarias. Las células madre pluripotentes significan células que se diferencian en diversas células de tejidos diferentes, pero que no forman un organismo nuevo. En la presente invención, las “células madre multipotentes” se refieren a células que pueden diferenciarse en células específicas solo que forman un tejido y un órgano incluyendo células madre. Para los fines de la presente divulgación, las “células madre” pueden ser preferiblemente las células madre multipotentes.

En la presente invención, la “placenta” se refiere a un tejido in vivo hecho para el feto durante el embarazo y que tiene una forma de disco que tiene un peso de 500 a 600 g, un diámetro de 15 a 20 cm y un grosor de 2 a 3 cm. Un lado de la placenta está en contacto con la madre y el otro lado de la misma está en contacto con el feto, y los nutrientes y el oxígeno se transfieren entre la sangre de la madre y el vaso sanguíneo del feto entremedias. La placenta puede dividirse en gran medida en tres capas de la membrana amniótica, la membrana coriónica y la decidua, y más particularmente, en el epitelio amniótico, la membrana del amnios, la membrana coriónica, la capa de trofoblastos coriónicos y la decidua. En la figura 1 se ilustra brevemente una vista transversal de la placenta.

En la presente invención, la “porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos” se refiere a una capa tisular correspondiente a un grosor de generalmente 5 a 6 mm aproximadamente, como un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % de la porción adyacente (cercana) a una membrana coriónica de la capa de trofoblastos coriónicos situada entre la membrana coriónica y la decidua.

En la presente invención, la “capa de trofoblastos coriónicos” se refiere a un tejido que une un óvulo a la pared uterina y suministra nutrientes al embrión, como una capa de ectodermo del embrión situada fuera de las vesículas germinales. La membrana coriónica y la membrana amniótica se derivan de la capa de trofoblastos coriónicos y una capa intracelular de la capa de trofoblastos coriónicos cubre las vellosidades y se denomina citotrofoblasto celular.

En la presente invención, la “membrana coriónica” se refiere a una capa celular de la capa más externa de un embrión en una embriología humana.

En la presente invención, la “decidua” se refiere a la mucosa uterina que cae después de la expulsión.

Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos pueden obtenerse cultivando y luego recogiendo las células obtenidas realizando una reacción enzimática al añadir una disolución enzimática a la porción basal del tejido de capa de trofoblastos coriónicos aislado de la placenta en un medio al que se añaden suero bovino fetal y antibióticos sin el uso de factores de crecimiento. La enzima incluye tripsina, colagenasa, dispasa, ADNasa, ARNasa, proteasa, lipasa, hialuronidasa, elastasa y similares, pero no se limita a las mismas. La colagenasa incluye colagenasa A, I, II, III o IV.

Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos presentan las siguientes características:

(a) una característica morfológica en forma celular fibroblástica;

(b) una capacidad de proliferación durante un período prolongado a fin de alcanzar el número de pases de 25 a 30 o más;

(c) una capacidad de diferenciación en adipogénica, condrogénica u osteogénica;

(d) una capacidad de formación de colonias;

(e) características inmunológicas positivas para CD44, CD73, CD90 y CD105; y

(f) características inmunológicas negativas para CD31, CD34, CD45 y HLA-DR.

Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos pueden diferenciarse en diferentes tipos de células, y por ejemplo, pueden diferenciarse en diversos tipos de células, tales como adipogénicas, condrogénicas, osteogénicas, neuronas, ligamentos y tenocitos, pero la presente divulgación no se limita a las mismas.

En la presente invención, la “diferenciación” generalmente se refiere a un fenómeno en el que un límite relativamente simple se divide en dos o más partes cualitativamente diferentes y, en particular, significa un fenómeno en el que se especifican estructuras o funciones diferentes mientras las células se dividen, proliferan y crecen, es decir, se cambian formas o funciones de modo que las células, los tejidos y similares del organismo realicen tareas dadas. Por otra parte, la “no diferenciación” significa un estado en el que no se produce la diferenciación mencionada anteriormente y se incluyen además características como las células madre.

Un método de diferenciación de las células madre puede realizarse según un método conocido existente y no está particularmente limitado al mismo. Por ejemplo, el método puede ser un método de diferenciación de las células madre en adipogénicas mediante el cultivo de las células madre en un medio que incluye dexametasona, indometacina, insulina y 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX); un método de diferenciación de las células madre en condrogénicas mediante el cultivo de las células madre en un medio que incluye dexametasona, proteína morfogenética ósea 6 (BMP-6), factor de crecimiento transformante beta (TGF-P), ácido ascórbico y L-prolina; un método de diferenciación de las células madre en osteogénicas mediante el cultivo de las células madre en un medio que incluye dexametasona, ácido ascórbico, p-glicerofosfato y ácido ascórbico 2-fosfato; y similares.

Como método de medición del grado de diferenciación de las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos diferenciada por el método descrito anteriormente, puede usarse un método de análisis de células parenquimatosas, un método inmunocitoquímico, un método de medición de un marcador de superficie celular o un cambio en la forma usando una PCR o un perfil de expresión génica, un método de examen de un cambio morfológico de las células usando un microscopio óptico o un microscopio confocal, un método de medición de un cambio en un perfil de expresión génica, y similares, que se conocen en la técnica relacionada, pero no se limitan a los mismos. Preferiblemente, puede usarse RT-PCR, un método de tinción con aceite rojo O, un método de tinción con safranina O, un método de tinción inmunohistoquímica de colágeno tipo II, un método de tinción con fosfato alcalino (ALP), un método de tinción con rojo de alizarina S, o similares.

Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) presentan características de crecimiento uniforme, y una excelente característica de proliferación y diferenciación en comparación con las células madre convencionales derivadas de la placenta completa u otros tejidos, y presentan un excelente efecto de regeneración tisular en un modelo animal de defecto tisular.

Por consiguiente, el presente texto describe un agente terapéutico celular que incluye células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos o células diferenciadas de las células madre como principio activo.

Las células diferenciadas no están particularmente limitadas, sino que incluyen adipogénicas, condrogénicas, osteogénicas, neuronas, ligamentos, tenocitos y similares y pueden seleccionarse según un propósito terapéutico.

El término “agente terapéutico celular” en la presente invención, como fármaco (regulaciones de la FDA estadounidense) usado para tratar, diagnosticar y prevenir usando células y tejidos preparados a través de aislamiento del ser humano, cultivo y una manipulación específica, significa un fármaco usado para tratar, diagnosticar y prevenir enfermedades usando las células a través de una serie de acciones tales como proliferación in vitro y cribado de las propias células vivas, homogéneas o heterogéneas para restaurar las funciones de células o tejidos, cambiar una característica biológica de las células por otro método, y similares.

Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos puede usarse en diversos tipos de protocolos de tratamiento que se controlan, se refuerzan, se tratan o se reemplazan injertando, trasplantando o infundiendo una colonia celular de tejidos u órganos del cuerpo, por ejemplo, una colonia de las células madre o de las células diferenciadas. Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) pueden convertirse en un tejido nuevo o cambiado o unirse a una estructura o tejido biológico reemplazando o reforzando un tejido existente.

Preferiblemente, el agente terapéutico celular del presente texto puede usarse para tratar el daño en el cartílago, defecto del cartílago, defecto óseo, defecto de tendón-ligamento o defecto de tejido graso.

En la presente invención, el “defecto del cartílago” tiene un significado que incluye daño, defecto o falta del cartílago incluido en el cuerpo, y por ejemplo, incluye lesión del cartílago, desgarro del cartílago, condromalacia, necrosis del cartílago, osteocondritis, pérdida de cartílago, osteoartritis, o similares, pero la presente divulgación no se limita a los mismos.

Además, las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se trasplantan a la articulación para tratar lesiones del cartílago articular o se trasplantan a una porción de tendón o ligamento para su uso para tratamiento o prevención. Por ejemplo, las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se trasplantan a la articulación o la porción de tendón o ligamento para promover la recuperación o el ajuste en la porción dañada del tejido o pueden usarse para reconfigurar el tejido de la articulación (por ejemplo, articulación de la rodilla y similares) usando un material derivado de las células madre tales como construcciones de tejido de cartílago derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos o tratando el tejido mediante métodos tales como regeneración.

Una cantidad preferible de trasplante del agente terapéutico celular varía según el estado y el peso del sujeto, el grado de la enfermedad, la forma del fármaco y la vía y período de trasplante, pero pueden seleccionarla adecuadamente los expertos en la técnica. El trasplante puede realizarse una o varias veces al día, y la cantidad de trasplante no limita el alcance de la presente divulgación ni siquiera en cualquier forma.

Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) presentan una excelente proliferación y diferenciación y un excelente efecto de regeneración tisular.

Por consiguiente, el presente texto describe una composición para regenerar tejidos que incluye células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos o células diferenciadas de las células madre como principio activo.

Los tejidos no están particularmente limitados, sino que incluyen tejidos tales como cartílago, grasa, hueso, nervio, ligamento y tendón.

El cartílago incluye cartílago hialino, fibrocartílago, cartílago elástico o similares y, por ejemplo, cartílago articular, cartílago de oreja, cartílago nasal, cartílago de codo, menisco, cartílago de rodilla, cartílago costal, cartílago de tobillo, cartílago traqueal, cartílago laríngeo o cartílago espinal, pero el presente texto no se limita a los mismos.

La grasa incluye todas las grasas independientemente de la posición en el cuerpo, y por ejemplo, incluye grasa subcutánea, omento, mesenterio, grasa de médula ósea, grasa retroperitoneal, etc., pero no se limita a las mismas.

A continuación en el presente documento, la presente divulgación se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Los ejemplos son para describir la presente divulgación en detalle y el alcance de la presente divulgación no está limitado por los ejemplos.

Ejemplo 1: Preparación de células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que forma parte de los tejidos de la placenta

Se recogió la placenta de la madre que accedió a la donación en un parto por cesárea normal en e1Hospital Samsung de Seúl según las directrices de la Comisión de ética de pruebas clínicas de1Hospital Samsung de Seúl. La placenta recogida se colocó en un recipiente estéril y luego se transfirió, se retiró la membrana amniótica del tejido de placenta transferido y luego una porción basal de tejido la capa de trofoblastos coriónicos que corresponde a un grosor de aproximadamente el 25 % de una porción adyacente (cercana) a la membrana coriónica de la capa de trofoblastos coriónicos total (tCT) situada entre la membrana coriónica (CM) y la decidua (CC) se aisló cuidadosamente usando una pinza W esterilizada y un bisturí. La porción basal aislada del tejido de capa de trofoblastos coriónicos se transfirió a una placa de 150 mm y se lavó de 8 a 10 veces usando PBS para eliminar la sangre y las células sanguíneas. La porción basal lavada del tejido de capa de trofoblastos coriónicos se transfirió a un tubo de 50 ml, se le añadió un medio DMEM que incluía el 0,2 % de colagenasa y luego se hizo reaccionar durante de 2 a 3 horas usando un agitador a 37 °C para obtener células derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos. Las células obtenidas derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se filtraron con una malla de 70 |im para eliminar el tejido no descompuesto, se le añadió un medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos y luego se centrifugó durante 4 min a 25 °C y 1000 rpm. Se retiró el sobrenadante y luego se les añadió a las células precipitadas restantes un medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos sin factor de crecimiento y se cultivaron en una condición de 37 °C y el 5 % de CO². Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se obtuvieron mediante el cribado de las células unidas a la parte inferior del recipiente de cultivo del cultivo.

Ejemplo comparativo 1: Preparación de células madre derivadas de otros tejidos

1-1. Preparación de células madre derivadas de placenta completa

Se trituró el tejido de placenta completa y se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre y las células sanguíneas del tejido de la placenta. Al tejido de la placenta lavada se le añadió un medio DMEM que incluía colagenasa al 0,2 % y se hizo reaccionar usando un agitador a 37 °C para obtener células placentarias. Las células de placenta obtenidas se filtraron con una malla de 70 |im para eliminar el tejido no degradado, se les añadió un medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos, y luego se centrifugaron durante 4 min a 25 °C y 1000 rpm. Se eliminó el sobrenadante y se les añadió a las células precipitadas restantes un medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos sin factor de crecimiento y se cultivaron en condiciones de 37 °C y el 5 % de CO². Las células madre derivadas de la placenta completa (Pla) se obtuvieron mediante el cribado de las células unidas a la parte inferior del recipiente de cultivo del cultivo.

1-2. Preparación de células madre derivadas de una parte de los tejidos de la placenta

Se aislaron tejidos de una membrana coriónica (CM), una membrana coriónica y capa de trofoblastos coriónicos (CMT), una capa de trofoblastos coriónicos total (tCT) y una porción superior de la capa de trofoblastos coriónicos (uCT) que eran partes de los tejidos de la placenta, respectivamente. Más particularmente, se desprendió una membrana amniótica del tejido de la placenta completa usando la pinza W y un bisturí y se retiró cuidadosamente la decidua para aislar la membrana coriónica y la capa de trofoblastos coriónicos (CMT), y luego una parte de la CMT se aisló en la membrana coriónica (CM) y la capa de trofoblastos coriónicos total (tCT). Con el fin de aislar la porción superior de la capa de trofoblastos coriónicos (uCT) de la capa de trofoblastos coriónicos total (tCT), un tejido que corresponde a aproximadamente el 75 % del grosor de una porción adyacente (cercana) a la decidua en la tCT situada entre la CM y la Dc excepto para la porción de la capa de trofoblastos coriónicos del ejemplo 1 se aisló cuidadosamente usando una pinza W esterilizada y un bisturí. Los tejidos parciales de la placenta aislados a través del proceso se transfirieron a una placa de 150 mm y se lavaron de 8 a 10 veces usando PBS para eliminar la sangre y las células sanguíneas. Los tejidos parciales de la placenta lavada se transfirieron a un tubo de 50 ml, se les añadió un medio DMEM que incluía colagenasa 0,2 % y se hicieron reaccionar durante de 2 a 3 horas usando un agitador a 37 °C para obtener células derivadas de la CM, la CMT, la tCT y la uCT, respectivamente. Las células obtenidas se filtraron con una malla de 70 |im para eliminar el tejido no descompuesto, se les añadió un medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos, y luego se centrifugaron durante 4 min a 25 °C y 1000 rpm. Se eliminó el sobrenadante, se añadió un medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos sin factor de crecimiento en las células precipitadas restantes, y las células se cultivaron en condiciones de 37 °C y el 5 % de CO². Las células madre derivadas de las células derivadas de la CM, la CMT, la tCT y la uCT se obtuvieron mediante el cribado de las células unidas a la parte inferior del recipiente de cultivo del cultivo, respectivamente.

1-3. Aislamiento de células madre derivadas de la médula ósea

La médula ósea se transfirió a un tubo de 50 ml, se lavó con la misma cantidad de PBS y se centrifugó durante 10 min a 25 °C y 2580 rpm. Después de repetir el proceso de lavado dos veces, se retiró un sobrenadante y luego se suspendió la médula ósea precipitada restante con la misma cantidad de PBS (total 5 ml), y luego la disolución se transfirió lentamente a una disolución preparada de Ficoll de 25 ml y se centrifugó durante 30 min a 25 °C y 2580 rpm. Solo se aisló y se lavó una capa celular intermedia de tres capas aisladas por la diferencia de densidad, y luego se centrifugó durante 5 min a 25 °C y 2580 rpm. A las células obtenidas a través del proceso se les añadió un medio DMEM que incluía suero fetal bovino y antibióticos sin factor de crecimiento y se cultivaron en condiciones de 37 °C y el 5 % de CO²para obtener células madre derivadas de la médula ósea.

1-4. Aislamiento de células madre derivadas de la sangre de cordón umbilical

Se transfirió sangre de cordón umbilical a un tubo de 50 ml, se lavó con la misma cantidad de PBS y se centrifugó durante 10 min a 25 °C y 2580 rpm. Después de repetir el proceso de lavado dos veces, se eliminó el sobrenadante y luego se suspendió la sangre de cordón umbilical precipitada restante con la misma cantidad de PBS (total 5 ml), y luego se transfirió lentamente la disolución sobre una disolución preparada de Ficoll de 25 ml y se centrifugó durante 30 min a 25 °C y 2580 rpm. Solo se aisló y se lavó una capa celular intermedia de tres capas aisladas por la diferencia de densidad, y luego se centrifugó durante 5 min a 25 °C y 2580 rpm. A las células obtenidas a través del proceso se les añadió un medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos sin factor de crecimiento y se cultivaron en condiciones de 37 °C y el 5 % de CO²para obtener células madre derivadas de la sangre de cordón umbilical.

1-5. Aislamiento de células madre derivadas de tejido adiposo o sinovial

Se transfirió un tejido adiposo o sinovial a una placa de 150 mm y se lavó de 2 a 3 veces usando PBS para eliminar la sangre y las células sanguíneas. Después de cortar finamente el tejido adiposo o sinovial, se transfirió cada tejido a un tubo de 50 ml, se le añadió un medio DMEM que incluía colagenasa al 0,2 % y luego se hizo reaccionar usando un agitador a 37 °C para obtener células adiposas o sinoviales. Las células adiposas o sinoviales obtenidas se filtraron con una malla de 70 |im para eliminar el tejido no descompuesto, se les añadió un medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos, y luego se centrifugaron durante 4 min a 25 °C y 1000 rpm. Se eliminó el sobrenadante, y luego se les añadió a las células precipitadas restantes un medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos sin factor de crecimiento y se cultivaron en una condición de 37C y el 5 % de CO²para obtener células madre derivadas de adiposo o sinovial.

Ejemplo 2: Subcultivo de células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que forma parte de los tejidos de la placenta

Las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que formaba parte de los tejidos de la placenta obtenidas en el ejemplo 1 se lavaron con PBS y se cultivaron reemplazando el medio DMEM que incluía suero bovino fetal y antibióticos sin factor de crecimiento cada de 2 a 3 días. Cuando las células madre se hicieron crecer hasta el 80 % o más, las células madre se trataron con TryPLE para aislarse del recipiente de cultivo, y las células madre aisladas se diluyeron en una razón de 1/4 y luego se cultivaron en otro recipiente de cultivo para realizar un subcultivo. Mientras se realizaba repetidamente el subcultivo, se midió el número de pase que no se subcultivó en absoluto, y se observaron las formas celulares antes del subcultivo (P0) y después del subcultivo a largo plazo con un microscopio. Además, usando las células madre derivadas de la placenta completa (Pla) obtenidas en el ejemplo comparativo 1, se realizó el subcultivo mediante el mismo método y luego se observaron las formas celulares antes del subcultivo (P0) y después del subcultivo a largo plazo con un microscopio. Los resultados se ilustran en las figuras 2 a 3.

Tal como se ilustra en la figura 2, se verificó que las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) presentaban una excelente proliferación hasta que el número de pases alcanzó 31, y fue posible el cultivo a largo plazo.

Además, tal como se ilustra en la figura 3, se verificó que las células madre derivadas de la placenta completa (Pla) presentaban una característica morfológica en forma de fibroblasto desde una fase temprana del subcultivo y se mezclaron una pluralidad de células que tenían diferentes formas distintas de una forma. Es decir, en comparación con la figura 2, en las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos antes y después del subcultivo, solo se mantuvieron específicamente células individuales, pero en las células madre derivadas de la placenta completa, se mezclaron las células que tenían diferentes formas.

Ejemplo 3: Análisis de la capacidad de formación de colonias de células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que forma parte de los tejidos de la placenta

Se verificó el tiempo de duplicación de la población y la capacidad de formación de colonias de las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos como parte de los tejidos de la placenta obtenidos en el ejemplo 1. Más particularmente, en las células madre derivadas de la porción basal de capa de trofoblastos coriónicos obtenidas en el ejemplo 1, el primer subcultivo se realizó mediante el método del ejemplo 2, y las células madre se sembraron por 5 x 103 en una placa de 100 mm en el momento en que se completó el subcultivo y luego se cultivaron en un medio DMEM que incluía suero fetal bovino y antibióticos sin factor de crecimiento durante 10 días. Se midió el tiempo (tiempo de duplicación de la población) que tarda en duplicarse el número de células madre de P2 a P6 y se contó el número de colonias formadas en las células madre realizando un método de tinción de Giemsa en las células madre cultivadas. Además, usando las células madre derivadas de la placenta completa, se midieron otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos obtenidos en el ejemplo comparativo 1, el tiempo de duplicación de la población y la capacidad de formación de colonias mediante el mismo método. En el caso de la capacidad de formación de colonias, el valor de resultado de las células madre derivadas de la placenta completa se convirtió al 100 %. Los resultados se ilustran en las figuras 4 a 5.

Tal como se ilustra en la figura 4, se verificó que las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) tenían un tiempo de duplicación de la población muy corto en comparación con las células madre derivadas de la placenta completa, otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos y la proliferación celular fue rápida.

Tal como se ilustra en la figura 5, se verificó que las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) presentaban una capacidad de formación de colonias significativamente excelente en comparación con las células madre derivadas de la placenta completa, otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos.

Ejemplo 4: Análisis del marcador de superficie de células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que forma parte de los tejidos de la placenta

Con el fin de verificar las propiedades inmunológicas de las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos como parte de los tejidos de la placenta obtenidos en el ejemplo 1, se realizó la siguiente prueba. En primer lugar, las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se lavaron con PBS y se trataron con TryPLE para recoger las células madre y se centrifugaron durante 4 min a 1000 rpm. Después de que se eliminara el sobrenadante, con el fin de suprimir la unión inespecífica, se lavaron las células madre mediante la adición de una disolución mixta de FBS al 2 % y se añadió PBS y luego se centrifugó durante 5 min a 1000 rpm. Después de que se eliminara el sobrenadante, las células madre se suspendieron en el PBS y se dividieron en un matraz redondo especializado para citómetro de flujo en 1 x 105 células. Se añadió un anticuerpo monoclonal de ratón anti-ser humano conjugado con PE en el presente documento, respectivamente, y las células madre se incubaron durante 30 min en hielo y luego se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm. Después de eliminar el sobrenadante de nuevo, las células madre se lavaron con el PBS y se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm. El proceso se repitió dos veces. Finalmente, después de que se eliminara el sobrenadante, se aislaron las células madre y se analizaron las propiedades inmunológicas usando un citómetro de flujo (FACS). Además, se analizaron por el mismo método las propiedades inmunológicas de las células madre derivadas de la placenta completa, otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos obtenidos en el ejemplo comparativo 1. Los resultados se ilustran en la tabla 1 y la figura 6.

[Tabla 1]

Tal como se muestra en la tabla 1 y la figura 6, se verificó que las células madre derivadas de la porción basal de capa de trofoblastos coriónicos (bCT) presentaban características de expresión de marcador positivo para CD44, CD73, CD90 y CD105 y características de expresión de marcador negativo para CD31, CD34, CD45 y HLA-DR.

Ejemplo 5: Verificación de la capacidad de diferenciación en condrocitos de células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que forma parte de los tejidos de la placenta

Con el fin de verificar la diferenciación en condrocitos de las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que formaba parte de los tejidos de la placenta obtenidos en el ejemplo 1, las células madre fueron cultivadas durante 3 semanas en un medio inducido de diferenciación condrogénica conocido (un medio DMEM que incluía dexametasona 0,1 |iM, ácido ascórbico 50 |ig/ml, L-prolina 40 |ig/ml, TGF-P3 10 ng/ml, BMP-6500 ng/ml y premezcla de ITS 50 mg/ml) para inducir la diferenciación en células condrogénicas. Con el fin de medir el grado de diferenciación de las células madre en condrogénicas, se realizaron un método de tinción con safranina-O y un método de tinción inmunohistoquímica usando colágeno tipo II según el método conocido existente. Además, el grado de diferenciación de las células madre derivadas de la placenta completa, otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos obtenidos en el ejemplo comparativo 1 en condrogénicas se midió por el mismo método. Los resultados se ilustran en las figuras 7 a 9.

Tal como se ilustra en las figuras 7 a 9, se verificó que las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) tenían la excelente capacidad de diferenciación en condrogénicas que pueden diferenciarse uniformemente en condrocitos en comparación con las células madre derivadas de la placenta completa, otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos.

Ejemplo 6: Verificación de la capacidad de diferenciación en osteoblastos de células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que forma parte de los tejidos de la placenta

Con el fin de verificar la diferenciación en osteoblastos de las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que formaba parte de los tejidos de la placenta obtenidos en el ejemplo 1, las células madre se cultivaron durante 4 semanas en un medio inducido de diferenciación osteogénica conocida (un medio DMEM que incluía FBS al 10 %, el 1 % de antibióticos, dexametasona 100 |iM, ácido ascórbico-2-fosfato 50 mM, p-glicerofosfato 10 |iM y ácido ascórbico 250 |iM) para inducir la diferenciación en las osteogénicas. En este caso, en el momento en que transcurrieron dos semanas después del inicio de la inducción de la diferenciación, se realizó un método de tinción con fosfato alcalino (ALP) según el método conocido existente, y en el momento en que transcurrieron cuatro semanas, se realizó un método de tinción con rojo de alizarina S según el método conocido existente para analizar la diferenciación en osteogénicas. Además, se midió por el mismo método el grado de diferenciación de las células madre derivadas de la placenta completa, otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos obtenidos en el ejemplo comparativo 1 en osteogénicas. Los resultados se ilustran en las figuras 7, 10 y 11.

Tal como se ilustra en las figuras 7, 10 y 11, se verificó que las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) tenían una excelente capacidad de diferenciación en osteogénicas que pueden diferenciarse uniformemente en osteoblastos en comparación con las células madre derivadas de la placenta completa, otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos.

Ejemplo 7: Verificación de la capacidad de diferenciación en adipocitos de células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que forma parte de los tejidos de la placenta

Con el fin de verificar la diferenciación en adipocitos de las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos como parte de los tejidos de la placenta obtenidos en el ejemplo 1, a las células madre se les añadió alternativamente un medio inducido de diferenciación adipogénica (medio DMEM que incluía FBS al 10 %, el 1 % de antibióticos, dexametasona 1 |iM, indometacina 20 |iM, insulina 10 |iM y 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) 50 |iM)) y un medio inducido de diferenciación adipogénica (un medio DMEM que incluía FBS al 10%, el 1 % de antibióticos e insulina 10 |iM) para inducir la diferenciación en células adipogénicas. Con el fin de medir la diferenciación de las células madre en las adipogénicas, se realizó tinción con aceite rojo O según el método conocido existente. Además, se midió por el mismo método la diferenciación de las células madre derivadas de la placenta entera, otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos obtenidos en el ejemplo comparativo 1 en adipogénicas. Los resultados se ilustran en las figuras 7 y 12.

Tal como se ilustra en las figuras 7 y 12, se verificó que las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) tenían una excelente capacidad de diferenciación en células adipogénicas que pueden diferenciarse uniformemente en adipocitos en comparación con las células madre derivadas de la placenta completa, otros tejidos parciales de la placenta y otros tejidos.

Ejemplo 8: Verificación de efectos como agente terapéutico celular en el modelo animal de daño en el cartílago de células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos que forma parte de los tejidos de la placenta

Con el fin de verificar los efectos de las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos como parte de los tejidos de la placenta obtenidos en el ejemplo 1 como agente terapéutico celular en un modelo animal de defecto tisular, se realizó la siguiente prueba. Más particularmente, con el fin de preparar un modelo animal de daño en el cartílago articular de conejo, después de que se seleccionara un conejo sano y se anestesiara con una cantidad apropiada de ketamina y Rompun según el peso, se verificó que el conejo tenía suficiente anestesia general, y después se afeitaron las articulaciones de la rodilla de ambas extremidades pélvicas y se fijaron con una escayola mientras se mantenía la postura. Las dos articulaciones de la rodilla se desinfectaron con povidona, se detectó la rótula y se verificó su ubicación, se llegó al interior de las articulaciones de la rodilla mediante un enfoque paramediano a lo largo de una línea de corte a través de la parte superior y la parte inferior de la articulación de la rodilla y el interior de la rótula, se flexionó la articulación de la rodilla mientras que la rótula estaba flexionada hacia fuera, y luego se observó el interior de la articulación. Después de verificarse que no existía hallazgo patológico específico, se hizo un arañazo con un punzón afilado en la parte superior de 1 mm desde un extremo frontal de la escotadura intercondílea de la rótula, se hizo un agujero que tenía un diámetro de 3 mm y una profundidad de 5 mm con un taladro basándose en el arañazo para dañar el grosor completo del cartílago. Como tal, se verificó que después de 8 semanas y 16 semanas después de inducir el daño en el cartílago, se observó la porción de daño y la porción de daño en el cartílago no se curó de manera natural. Después de que las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se mezclaran con ácido hialurónico usando una jeringa, se trasplantaron 500 |il a la porción de daño en el cartílago realizada en la parte derecha del modelo animal (se prepararon 500 |il suficientemente por comodidad de operación considerando un caso en el que la cantidad de la composición era insuficiente o se cometió un error durante la operación). Después de eso, después de que la rótula regresara a su ubicación original, se suturó el tejido blando alrededor de la rótula con un hilo absorbente y se suturó la piel con un hilo no absorbente. Como grupo de control positivo, se trasplantó un volumen igual de la mezcla de ácido hialurónico y células madre derivadas de la sangre de cordón umbilical en la pata opuesta. Después de verificar que el conejo se despertó de la anestesia, se permitió que el conejo se moviera libremente, y se administraron analgésicos y antibióticos con el fin de prevenir la infección durante 5 días después de la operación. Después de 8 semanas y 16 semanas, se realizaron tinción con H&E y safranina O mediante la obtención de trozos de la porción de cartílago articular en la que se habían realizado el daño y el tratamiento del conejo, y se analizó el nuevo cartílago mediante cuantificación usando la puntuación macroscópica de la Sociedad internacional de reparación del cartílago (ICRS). Los resultados se ilustran en las figuras 13 y 14.

Tal como se ilustra en las figuras 13 y 14, en un grupo trasplantado con las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) el grosor era dos veces o más grande que todo el grosor de la capa celular de cartílago recién generada que en un grupo trasplantado con las células madre derivadas de la sangre del cordón umbilical. Por consiguiente, se verificó que las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT) pueden generar las células condrogénicas en la porción de cartílago articular dañado con excelente eficacia para tratar eficazmente el daño del cartílago articular.

A través del resultado de la prueba, se verificó que las células madre derivadas de la placenta completa existente se mezclaron con las células madre derivadas de los tejidos parciales que tenían diversas características y por tanto no se presentaba uniformemente diferenciación en diferentes células. Sin embargo, se verificó que las células madre derivadas de la porción basal de la capa trofoblastos coriónicos que formaba parte de los tejidos de la placenta presentaban excelentes características en comparación con las células madre derivadas de la placenta completa existente en cuanto a una excelente diferenciación y uniformidad para diversas características de otras células madre. Particularmente, las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos presentaban un patrón consistente en características de crecimiento, proliferación, morfología y diferenciación en comparación con las células madre derivadas de la membrana coriónica (CM), la membrana coriónica y la capa de trofoblastos coriónicos (CMT), la capa de trofoblastos coriónicos total (tCT) y la porción superior de la capa de trofoblastos coriónicos (uCT) que son otras partes de los tejidos de la placenta y presentaban la característica más excelente de las células madre. Por tanto, puede observarse que las células madre derivadas de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos pueden mejorar la eficiencia de diferenciación en una célula deseada y usarse como agente terapéutico celular en diversas enfermedades.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método in vitro o ex vivo para preparar células madre; caracterizado porque comprende una etapa de aislar células madre a partir de una porción basal de una capa de trofoblastos coriónicos (bCT); en el que las células madre a partir de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se derivan a partir de un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % como porción adyacente a una membrana coriónica de una capa de trofoblastos coriónicos total situada entre la membrana coriónica y una decidua.
2. El método según la reivindicación 1, en el que las células madre son positivas para los marcadores de superficie CD44, CD73, CD90 y CD105.
3. El método según la reivindicación 1, en el que las células madre son negativas para los marcadores de superficie CD31, CD34, CD45 y HLA-DR.
4. Un método in vitro o ex vivo para preparar un agente terapéutico celular que incluye células madre como principio activo; caracterizado porque comprende una etapa de proporcionar células madre a partir de una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT); en el que las células madre a partir de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se derivan a partir de un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % como porción adyacente a una membrana coriónica de una capa de trofoblastos coriónicos total situada entre la membrana coriónica y una decidua.
5. El método según la reivindicación 4, en el que las células madre tienen la capacidad de diferenciarse en células condrogénicas, adipogénicas, osteogénicas, neuronas, ligamentos y tenocitos.
6. Un método in vitro o ex vivo para preparar una composición para regenerar tejidos que comprende células madre como principio activo; caracterizado porque comprende una etapa de proporcionar células madre a partir de una porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos (bCT); en el que las células madre a partir de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se derivan a partir de un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % como porción adyacente a una membrana coriónica de una capa de trofoblastos coriónicos total situada entre la membrana coriónica y una decidua.
7. El método según la reivindicación 6, en el que el tejido comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cartílago, grasa, hueso, nervio, ligamento y tendón.
8. El método según la reivindicación 7, en el que el cartílago es cartílago hialino, fibrocartílago o cartílago elástico.
9. El método según la reivindicación 7, en el que se selecciona el cartílago del grupo que consiste en cartílago articular, cartílago de oreja, cartílago nasal, cartílago de codo, menisco, cartílago de rodilla, cartílago costal, cartílago de tobillo, cartílago traqueal, cartílago laríngeo y cartílago espinal.
10. Un método in vitro o ex vivo de diferenciación de células madre; caracterizado porque comprende una etapa de proporcionar células madre a partir de una porción basal de una capa de trofoblastos coriónicos (bCT); en el que las células madre a partir de la porción basal de la capa de trofoblastos coriónicos se derivan a partir de un tejido correspondiente a un grosor del 20 al 30 % como porción adyacente a una membrana coriónica de una capa de trofoblastos coriónicos total situada entre la membrana coriónica y una decidua; y diferenciar las células madre.
11. El método según la reivindicación 10, en el que las células madre se diferencian en células adipogénicas, condrogénicas, osteogénicas, neuronas, ligamentos y tenocitos.