KR20080104844A

KR20080104844A - 태반-유래 영양막 줄기 세포의 분리방법

Info

Publication number: KR20080104844A
Application number: KR1020070052204A
Authority: KR
Inventors: 김기진; 신경선; 나규환
Original assignee: 포천중문의과대학교 산학협력단; (주) 차바이오텍
Priority date: 2007-05-29
Filing date: 2007-05-29
Publication date: 2008-12-03
Also published as: WO2008146991A1

Abstract

본 발명은 (a) 분리된 태반으로부터 태반 융모(placental villi)를 얻는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 태반 융모에 트립신, DNase, 및 디스파제(Dispase)를 함유하는 효소 용액을 가하여 효소반응을 수행하고, 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 가하여 효소반응을 정지시키는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 반응액을 원심분리하여 회수된 세포를 밀도-구배(density-gradient) 분리법에 의해 세포영양막(cyto-trophoblast)을 분리하는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 세포를 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 영양막 줄기 세포의 분리방법을 제공한다.

영양막 줄기 세포, 태반

Description

태반-유래 영양막 줄기 세포의 분리방법{Process for the isolation of placenta-derived trophoblast stem cells}

도 1a 내지 도 1c는 각각 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 영양막 줄기 세포의 형태, 핵형분석, 및 세포주기를 측정한 결과를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 영양막 줄기 세포에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 영양막 줄기 세포에 대한 면역세포학적 분석 결과를 나타낸다.

도 4은 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 영양막 줄기 세포로부터 발현되는 유전자에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다.

도 5는 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 영양막 줄기 세포를 누드 마우스(nude mice)의 피하조직에 이식하고 침윤성을 평가한 결과를 나타낸다.

본 발명은 태반-유래 영양막 줄기 세포를 고순도로 분리하는 방법에 관한 것이다.

태반은 여성이 임신했을 때, 자궁벽에서 발생하는 장기로 혈관조직이 풍부한 원반형 형태를 보이며, 태아의 영양섭취와 호흡, 배설 등이 모두 태반을 통해 이루어진다. 일생의 건강이 태아시기에 결정된다는 과학적 증거들이 보고되면서, 임신기간 중 태반의 중요성이 부각되었고, 이에 관련된 여러 가지 물질들의 상호관계들을 규명하고자 많은 노력이 시도되고 있다. 태반은 주수별, 위치별 다양한 형태의 세포들로 구성되어 있는데, 아직 그 활용범위가 극히 제한적으로 이루어지고 있다.

영양막 세포는 그 분류와 기능에 대한 연구 및 세포주 구축은 아직 국내, 외적으로 미약한 실정이다. 현재까지 마우스에서 연구된 일부 영양막 세포주의 확립과 규명은 영양막 발생과 태반 형성연구에 새로운 세포배양 시스템을 제공하였으나, 다른 포유류에서의 연구는 아직 명확하게 보고되고 있지 않다.

태반은 포유류 종간에 가장 다양한 장기로 영양막 발생에 있어서 인간과 마우스 사이에는 상당한 차이가 있어, 마우스에서 확립된 영양막 세포주를 이용하여 인간의 불임 및 태반 부전(placental insufficiencies)의 기전을 규명하는 것은 매우 어려운 실정이다. 배반포(blastocyst) 형성은 사람과 마우스 사이에 유사하나, 착상 후 과정은 매우 큰 차이를 나타낸다. 마우스의 영양막배엽은 빠른 증식을 하고, 착상이 끝나면 배자밖 외배엽(extraembryonic ectoderm, ExE)를 형성하는데 반하여, 사람의 영양막배엽 세포 다수는 세포융합을 거쳐 다핵 융합영양막세포(multinucleated syncytiotrophoblast)가 되며, 융합영양막과 배자위판 사이에는 이배수체 영양막세포인 세포영양막 (cytotrophoblast)의 단층으로 구성된다. 또한, 영양막 세포는 임신 주수별, 태반의 위치별 다른 형태와 기능을 갖고 있어 전 세계 적으로 매우 제한적인 영양막 세포주가 태반 부전 및 불임연구에 활용되고 있다.

따라서, 인간의 영양막 세포의 분리방법, 특히 영양막 줄기 세포의 분리방법을 개발하는 것이 당업계에 요구되고 있다.

최근 미국특허 공개 제2006/0211110호는 인간의 영양막 줄기 세포를 분리하는 방법을 개시한 바 있다. 미국특허 공개 제2006/0211110호에 따르면, 복강경(laparoscopy) 방법으로 임신 4-5 중의 임산부로부터 초기 단계의 융모막 융모(trophoblastic villi), 즉 융모막 융모(chorionic villi)로부터 트립신/EDTA 등의 효소처리에 의해 영양막 줄기 세포를 분리한다.

그러나, 상기 미국특허 공개 제2006/0211110호에서 개시한 분리방법은 임산부를 대상으로 복강경 시술을 시행하여야 하므로, 침습적인 과정을 수행하여야 한다. 즉, 임신 초기에 태아의 유전적 이상을 검사하기 위해 실시하는 복강경에 의한 융모막 검사(Chorionic Villi Sampling, CVS)를 필수적으로 수행하여야 하며, 이는 카테터를 자궁 경부나 배를 통하여 자궁 내로 삽입하여 융모를 검출하여야 하므로 시술이 어려울 뿐만 아니라 매우 침습적이다. 더욱이, 상기 복강경 시술 과정에서 태아의 유산 가능성을 배제할 수 없으므로 줄기 세포 분리방법으로서 적용하는데 한계가 있다.

또한, 상기 미국특허 공개 제2006/0211110호에서 개시한 분리방법에 따라 얻어지는 영양막 줄기 세포는 임신 초기 단계의 임산부로부터 얻은 융모막 융모로부터 분리된 것으로, Oct-4 양성을 나타낸다. 영양막 세포가 배아 줄기 세포의 기원인 내부 세포괴(inner cell mass)와 달리 OCT-4의 발현이 감소됨으로써 영양막세포 로 분리되는 점을 감안할 때, 상기 특허로부터 얻은 영양막 줄기 세포는 배아 줄기 세포의 특성을 함께 나타내므로 순수한 영양막 줄기 세포와 구분된다.

본 발명자들은 임산부에 대한 침습적인 시술이 필요 없고, 윤리성의 문제가 없는 태반으로부터 영양막 줄기 세포를 고순도로 분리할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 태반으로부터 태반 융모를 수거하고, 이를 효소처리한 후, 밀도-구배(density-gradient) 분리법에 의해 세포영양막(cyto-trophoblast)을 분리한 다음, 이를 배양하였을 때, 높은 순도로 영양막 줄기 세포를 분리할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 태반의 태반 융모(plecental villi)로부터 영양막 줄기 세포를 고순도로 분리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, (a) 분리된 태반으로부터 태반 융모(placental villi)를 얻는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 태반 융모에 트립신, DNase, 및 디스파제(Dispase)를 함유하는 효소 용액을 가하여 효소반응을 수행하고, 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 가하여 효소반응을 정지시키는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 반응액을 원심분리하여 회수된 세포를 밀도-구배(density-gradient) 분리법에 의해 세포영양막(cyto-trophoblast)을 분리하는 단계; 및 (d) 단계(c)에서 얻어진 세포를 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함하는 영양막 줄기 세포의 분리방법이 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 영양막 줄기 세포의 분리방법은 출산 후 폐기되는 태반을 사용함으로써, 임산부를 대상으로 하는 침습적인 과정 즉 임신 초기의 복강경 시술을 시행할 필요가 없으며 나아가 유산 가능성을 완전히 배제할 수 있다. 또한, 얻어지는 영양막 줄기 세포의 특성(Nanog, Sox2 등의 유전자에 대한 양성 및 Oct-4 에 대한 음성)을 가짐으로써, 종래의 분리방법(미국특허공개 제2006/0211110호)에 따라 얻어진 줄기 세포와 달리 순수한 영양막 줄기 세포의 분리가 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 분리방법은 순수한 영양막 줄기 세포를 분리할 수 있어, 얻어진 영양막 줄기세포를 이용하여 불임치료와 관련된 신약후보물질 스크리닝, 독성 검사 등에 활용할 수 있다.

본 발명의 분리방법은 분리된 태반으로부터 태반 융모(placental villi)를 얻는 단계[단계 (a)]를 포함한다. 상기 태반은 건강한 산모로부터 출산 후 분리되어 폐기되는 태반을 사용할 수 있다. 즉, 상기 "분리된 태반"이라 함은 산모의 모체로부터 출산 후 분리되는 태반을 의미한다. 상기 분리된 태반은 분리된 후 신속하게 멸균된 용기 및 얼음에 담아 보관될 수 있다. 상기 분리된 태반으로부터 태반 융모를 얻는 단계는 통상의 해부학적 방법 예를 들어, 태반 내에 존재하는 태반 융모들을 멸균된 가위로 여러 부위로 잘라냄으로써 얻을 수 있다. 얻어진 태반 융모는 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 등)이 포함된 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 2 회 이상, 바람직하게는 약 5 회, 세척함으로써, 조직에 존재하는 혈액 등의 오염물질들을 제거하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 수거된 태반 융모는 직접 효소처리하거나, 바람직하게는 멸균된 가위 등을 사용하여 더 잘게 조각화시킨 후 효소처리할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 태반 융모를 멸균된 가위 등을 사용하여 더 잘게(예를 들어, 약 1 mm 이하, 즉 거의 혼탁액 수준으로) 조각화시킨 후, 조각화된 세포를 세척하고, 약 1000 rpm에서 약 5 분 동안 원심분리하여 세포를 농축한 다음, 효소처리할 수 있다. 상기 세척은 HBSS (Hank's balanced salt solution) 등의 완충액을 사용하여 2∼3회 수행될 수 있으며, 상기 원심분리는 1000∼1200 rpm에서 약 5∼10 분 동안, 바람직하게는 약 1,000 rpm에서 약 5 분 동안 수행될 수 있다.

단계(b)의 효소 처리 단계는 태반 융모에 트립신, DNase, 및 디스파제(Dispase)를 함유하는 효소 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 트립신, DNase, 및 디스파제의 농도는 크게 제한되지 않으며, 예를 들어, 약 20 mg의 트립신, 10 mg/ml의 DNase, 1.2 U/ml의 디스파제를 함유한 용액을 사용할 수 있다.

영양막 줄기 세포는 상대적으로 태만 융모의 내부에 위치하므로, 필요할 경우, 상기 효소 처리 및 효소 반응 정지 과정을 반복하여 수행함으로써 영양막 줄기 세포의 회수량을 높일 수 있다. 즉, 상기 효소처리/효소반응억제 과정을 1회 또는 2회 수행할 수 있으며, 효소처리/효소반응억제 과정을 1회 수행하는 경우 약 1 시간 동안 효소처리 과정을 수행할 수 있고, 효소처리/효소반응억제 과정을 2회 수행하는 경우 각각 약 30 분씩 효소처리 과정을 수행할 수 있다.

본 발명의 분리방법은 상기 효소반응 단계를 상대적으로 저온 즉, 약 20∼30 ℃, 바람직하게는 실온에서 서서히 수행한다. 통상적인 효소반응이 약 37 ℃에서 수행됨에 반해, 상대적으로 저온 즉, 약 20∼30 ℃, 바람직하게는 실온에서 서서히 효소반응을 수행할 경우, 세포의 손상을 크게 낮출 수 있음이 새롭게 밝혀졌다.

효소 반응 정지 단계를 수행한 후, 얻어지는 세포는 약 1,000 rpm으로 약 5분 동안 원심분리함으로써 회수할 수 있다.

본 발명의 분리방법은 밀도-구배(density-gradient) 분리법에 의해 단계(b)에서 얻어진 세포로부터 세포영양막(cyto-trophoblast)을 분리하는 단계[단계 (c)]를 포함한다. 효소 처리에 의해 얻어지는 영양막 세포는 영양막 줄기 세포인 세포영양막(cyto-trophoblast)과 분화되어 융합된 형태인 융합세포영양막(syncytio-trophoblast)와의 혼합되어 있으므로, 이들 세포의 밀도 차(세포영양막의 비중: 약 1.062-1.048, 융합세포영양막의 비중: 1.013-1.039)를 이용한 밀도-구배(density-gradient) 분리법을 수행함으로써 세포영양막 만을 분리할 수 있다. 상기 밀도-구배 분리법으로는 피콜 밀도-구배(Picoll desity-gradient) 분리법을 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 피콜 밀도-구배 분리를 수행하고, 30∼70 % 층 사이에 존재하는 세포들을 분리함으로써 세포영양막을 분리할 수 있다. 구체적으로는 단계(b)에서 얻어진 세포를 HBSS (Hank's balanced salt solution)와 혼합한 용액을 피콜 밀도-구배 용액(70%, 30%, 10%)에 가하고, 약 2,000 rpm에서 약 20 분간 원심분리한 다음, 30∼70 % 층 사이에 존재하는 세포들을 분리함으로써 세포영양막을 분리할 수 있다.

본 발명의 분리방법은 상기와 같이 얻어진 세포를 줄기 세포 배양 배지, 예를 들어 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계를 포함한다. 상기 배지의 구체적인 예로는 10 %의 소 태아 혈청, 1 %의 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM의 L-글루타민, 100 uM의 베타-머캅토에탄올, 1 ug/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4)가 첨가된 alpha-MEM가 사용될 수 있다. 상기 배양은 통상의 배양 조건 예를 들어, 37 ℃, CO₂ 배양기 중에서 수행될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1. 영양막 줄기 세포의 분리

정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 상기 산모로부터 얻은 정상 태반을 신속히 멸균된 용기 및 얼음에 담아 이동시킨 후 육안적으로 태반의 형태학적 및 구조학적 특징을 기록하였다. 태반 내에 존재하는 태반 융모(placental villi)들을 멸균된 가위로 여러 부위 잘라낸 후 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)가 포함된 인산완충식염수로 5 회 수세하여 조직에 존재하는 혈액들을 제거하였다.

충분히 혈액이 제거되어 핑크빛을 내는 태반 융모들을 소독된 가위를 이용하여 아주 잘게(약 1 mm 이하) 자른 후 멸균된 HBSS 용액으로 3차례 수세한 후 1,000 rpm에서 5 분간 원심분리하였다.

상층액을 제거한 후 남은 세포에 20 mg의 트립신, 10 mg/ml의 DNase, 1.2 U/ml의 디스파제를 함유하는 혼합된 효소용액 (cocktailed enzyme solution) 10 ml을 첨가한 후 실온에서 천천히 혼합하면서 30 분 동안 반응시켰다. 효소액을 50 ml 코니컬 튜브에 옮기고, 소 태아 혈청 1 ml을 가하여 효소반응을 정지시켰다. 남아있는 세포층에 새로운 혼합된 효소용액 (cocktailed enzyme solution) 10 ml을 첨가한 후 실온에서 천천히 혼합하면서 30 분 동안 반응시킨 다음, 다시 소 태아 혈청 1 ml을 가하여 효소반응을 정지시킨 다음, 1,000 rpmn으로 5 분간 원심분리하였다.

상층액을 제거하고 남은 세포들을 HBSS 1 ml와 혼합하였다. 각 농도별로 준비된 피콜 밀도-구배 용액(70%, 30%, 10%)을 3 ml씩 15 ml 코니컬 튜브에 천천히 옮긴 후 HBSS 용액으로 혼합된 세포 포함 용액 1 ml을 조심스레 첨가한 후, 약 2,000 rpm에서 20 분간 원심분리하였다. 피콜 밀도-구배 10%, 30% 층을 제거한 후, 70%층과 30%층 사이에 존재하는 희고 얇은 층에 있는 세포들을 수확하였다.

수확한 세포들은 HBSS 용액으로 3차례 수세한 후, 배양액 (10 %의 소 태아 혈청, 1 %의 페니실린-스트렙토마이신, 2 mM의 L-글루타민, 100 uM의 베타-머캅토에탄올, 1 ug/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4)가 첨가된 alpha-MEM) 3 ml에 첨가한 후, 잘 혼합하여 T25 플라스크에 넣어 37℃, CO₂ 배양기 중에서 배양하였다.

2007년 1월 15일 분리를 시작으로, 세포의 성장 속도를 고려하여 약 5일에 한번씩 계대배양을 실시하였고, 10번째 계대까지 배양된 세포들을 세포 특징 분석 후 CHA-TBSC-1로 명명였다.

실시예 2. 형태학적 특성 분석

실시예 1에서 얻은 영양막 줄기 세포(CHA-TBSC-1)를 위상차(Phase contrast) 현미경으로 관찰한 결과는 도 1a와 같다. 또한, Mycoplasma Detection kit ((주)인트론바이오테크놀로지)로 측정한 마이코플라스마 시험(mycoplasma test) 결과 음성임을 확인하였고, colcemid (Invitrogen) 처리와 KCl 저장액 (0.075M KCl) 처리, 그리고 Trypsin-Giemsa 염색 후 CytoVision (Applied Imaging 사)을 이용하여 핵형을 분석한 결과, 46 XX로 판명되었다 하여 핵형을 분석한 결과, 46 XX로 판명되었다 (도 1b). 또한, Propidium Iodide (PI) 염색 후 유세포 분석기 (FACS, Beckman사)를 이용하여 세포주기를 측정한 결과, 일반적인 세포주기의 형태보다 좀 더 빠른 세포주기의 형태가 관찰되었다 (도 1c).

상기 결과로부터, 태반유래 세포가 영양막 세포의 형태를 보이며, 마이코프라즈마 음성이면서 정상 핵형을 갖고 있고, 세포 분열이 빠른 안전한 새로운 세포임을 알 수 있다.

실시예 3. 유세포 분석 (Fluorescence activated cell sorting, FACS) 및 면역세포학적 분석

다양한 항체를 이용하여 태반유래 영양막 세포의 표면에 존재하는 특정항원 을 분석하고자 유세포 분석을 실시하였다. 즉, 80%정도 자란 세포들을 세포분리 용액 (Cell dissociation buffer, GIBCO사)을 1ml 첨가하여 배양용기로부터 세포들을 분리한 후 각각 녹색 형광물질과 적색 형광물질이 표지되어있는 CD13, CD71, CD178, CD44, CD45, CD105, CD90, CD95, HLA-ABC, HLA-DR, HLA-G, cytokeratin 7 그리고 Vimentin 등과 같은 여러 인간 특이적인 항체들을 실온에서 1시간 반응시킨 후 인산완충용액 (PBS buffer) 를 이용하여 3회 수세한 후 유세포 분석기를 이용하여 유세포 분석을 실시하였으며, 그 결과는 도 2와 같다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 분리한 태반의 영양막 줄기 세포는 CD13 양성 (≥99.71), CD71 음성 (≤0.01), CD178 음성 (≤4.58), CD44 양성 (≥98.54), CD105 음성 (≤1.55), CD90 양성 (≥99.74), CD95 양성 (≥94.40)으로 나타났으며, HLA-ABC 양성 (≥99.42), HLA-DR 음성 (≤0.21), 그리고, 영양막세포의 특징인 CD45 음성 (≤0.32), vimentin 음성 (≤4.67), HLA-G 양성 (≥4.59), cytokeratin 7 양성 (≥98.25)로 확인되었다.

또한, 면역세포학적 분석을 실시하기 위하여 유리 슬라이드 위에서 배양한 세포들을 메탄올로 4℃에서 10분간 고정한 후 비특이적 단백질의 반응을 억제하고자 블록킹용액 (DAKO)으로 10분간 처리 후, 인간 영양막 세포 특이적 단일항체 cytokeratin 7 항체 및 HLA-G 항체를 제 1차 항체로 사용하여, 실온에서 1시간동안 반응시킨다. PBS 용액으로 수세 후 녹색 형광으로 표지된 제 2차 항체를 30분간 반응시킨 후 Propidium Iodide (PI)을 이용하여 세포 핵을 대조 염색하였다. 그 결과는 도 3a(cytokeratin 7) 및 도 3b(HLA-G)와 같다.

상기 결과로부터, 태반에서 분리 및 배양한 세포가 영양막 세포임을 알 수 있다.

실시예 4. RNA 수준에서의 줄기 세포 관련 유전자들의 발현 분석

본 발명에 따라 분리한 영양막 줄기 세포(CHA-TBSC-1)로부터 발현되는 유전자에 대한 RT-PCR 분석을 수행하였다. 즉, 태반유래 영양막 줄기 세포가 T25 flask에서 약 80% 정도 자랐을 때 세포들을 회수하여 TRIZOL을 이용한 세포 용해(lysis) 단계, 역전사 효소(Reverse transcriptase)를 이용한 cDNA 합성 단계, 유전자 특이적 염기서열과 Tag. DNA 폴리머라제를 이용한 PCR 증폭 단계, 그리고 증폭된 PCR 산물을 아가로즈 겔상에서 전기영동하여 증폭된 유전자의 유무를 확인하는 RT-PCR 분석을 수행하였다. 각 유전자의 증폭에 사용된 프라이머 서열, PCR 반응액의 조성은 및 PCR 반응조건은 각각 표 1 내지 표 3과 같다.

유전자	서열번호	서 열	Tm (℃)	size (bp)
Oct_4	1	F: ACA CTC GGA CCA CGT CTT TC	54	300
	2	R: CGT TCT CTT TGG AAA GGT GTT C
nanog	3	F: TTC TTG ACT GGG ACC TTG TC	54	200
	4	R: GCT TGC CTT GCT TTG AAG CA
sox2	5	F: GGG CAG CGT GTA CTT ATC CT	52	200
	6	R: AGA ACC CCA AGA TGC ACA AC
hNF-68	7	F: TTT CCT CTC CTT CTT CTT CAC CTT C	58	700
	8	R: GAG TGA AAT GGC ACG ATA CCT A
h cardiac actin	9	F: AGT GGT GAC AAA GGA GTA GCC A	58	500
	10	R: GGA GTT ATG GTG GGT ATG GGT C
h AFP	11	F: GCT TCG CTT TGC CAA TGC TT	55	500
	12	R: ATG CTG CAA ACT GAC CAC GC
CDX-2	13	F: AGTGAAAACCAGGACGAAAGACAAA	55	337
	14	R: CACTGAGGCTTGCAGGGAAGACAC
Cytokeratin 7	15	F: ACA GAG CTG CAG TCC CAG AT	57	500
	16	R: GTA GGT GGC GAT CTC GAT GT
HLA-G	17	F: GCG GCT ACT ACA ACC AGA GC	58	900
	18	R: GCA CAT GGC ACG TGT ATC TC
TERT	19	F: GAG CTG ACG TGG AAG ATG AG	55	300
	20	R: CTT CAA GTG CTG TCT GAT TCC AAT G
b-actin	21	F: TCC TTC TGC ATC CTG TCA GCA	58	300
	22	R: CAG GAG ATG GCC ACT GCC GCA

PCR 반응액	용적
cDNA	2~3 ul
10 X h-taq bfr	2.5 ul
10mMd NTP mix	0.5 ul
Primer 1 (10pmol)	1 ul
Primer 2 (10pmol)	1 ul
5 X Band doctor	0 (X0)or 2.5(X0.5) ul
h-Taq.(2.5U/ul)	0.25 ul
D.W - DEPC	X ul
총량	25 ul

	95 ℃	Tm ℃	72 ℃	사이클
변성	15 min			1
증폭	20 sec	40 sec	1min	40
최종			5 min	1

상기와 같이 수행한 RT-PCR 분석결과는 도 4와 같다. 영양막 세포의 분화는 배반포(blastocyst) 단계에서 Oct-4의 발현이 감소되면서 내부 세포괴(inner cell mass, ICM) 부분과 영양막배엽(trophectoderm)으로 구분되면서 점차적으로 영양막배엽이 태반의 약 40-50%를 구성하는 영양막으로 분화다. 또한, 세포의 자가증식을 위한 Nanog과 Sox2 유전자의 발현은 영양막 줄기 세포의 중요한 특징을 차지하고 있으며, 각 내배엽, 중간엽 그리고 외배엽으로의 분화후 발현되는 AFP(alpha fetoprotein), cardiac actin, 그리고 neuronal factor 68 (NF68) 등과 같은 대표적인 유전자의 발현은 구축된 영양막 줄기세포의 다양한 분엽으로의 분화가능성을 보여주고 있으며, 영양막 세포 특이적으로 발현되는 CDX-2, cytokeratin 7, 그리고 HLA-G의 발현은 순수하게 분리된 영양막 세포임을 확인할 수 있는 증거가 되며, 증식에 관련된 TERT gene의 발현 또한 영양막 줄기세포의 특징이라 할 수 있다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 분리방법에 따라 얻어진 영양막 줄기 세포는 순수한 영양막 줄기 세포의 특성을 나타낸다.

실시예 5. 영양막 세포의 침윤 기능 분석

영양막 줄기 세포의 특징적인 기능 중 하나가 다양한 기질 분해 효소를 분비함으로써 조직에서 침윤성을 나타내는 점이다. 40 g의 웅성 누드 마우스(nude mice)의 피하조직에 실시예 1에서 제조된 적색 형광 표지 영양막 줄기 세포(CHA-TBSC-1)를 1 x 10⁶의 농도로 이식하고, 4주 동안 형광물질 탐지 기계인 Xenogen을 이용하여 정착 및 침윤 정도를 확인한 결과(도 5), 본 발명에 따라 제조된 영양막 줄기 세포가 침윤성을 나타내었다.

<110> CHABIOTECH CO., LTD. College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Process for the isolation of placenta-derived trophoblast stem cells <130> PN0116 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 acactcggac cacgtctttc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 cgttctcttt ggaaaggtgt tc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 ttcttgactg ggaccttgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 gcttgccttg ctttgaagca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 gggcagcgtg tacttatcct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 agaaccccaa gatgcacaac 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 tttcctctcc ttcttcttca ccttc 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 8 gagtgaaatg gcacgatacc ta 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 agtggtgaca aaggagtagc ca 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 10 ggagttatgg tgggtatggg tc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 gcttcgcttt gccaatgctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 12 atgctgcaaa ctgaccacgc 20 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 13 agtgaaaacc aggacgaaag acaaa 25 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 14 cactgaggct tgcagggaag acac 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 15 acagagctgc agtcccagat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 16 gtaggtggcg atctcgatgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 17 gcggctacta caaccagagc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 18 gcacatggca cgtgtatctc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 19 gagctgacgt ggaagatgag 20 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 20 cttcaagtgc tgtctgattc caatg 25 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 21 tccttctgca tcctgtcagc a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 22 caggagatgg ccactgccgc a 21

Claims

(a) 분리된 태반으로부터 태반 융모(placental villi)를 얻는 단계;

(b) 단계(a)에서 얻어진 태반 융모에 트립신, DNase, 및 디스파제(Dispase)를 함유하는 효소 용액을 가하여 효소반응을 수행하고, 소 태아 혈청(fetal bovine serum)을 가하여 효소반응을 정지시키는 단계;

(c) 단계(b)에서 얻어진 반응액을 원심분리하여 회수된 세포를 밀도-구배(density-gradient) 분리법에 의해 세포영양막(cyto-trophoblast)을 분리하는 단계; 및

(d) 단계(c)에서 얻어진 세포를 소 태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지 중에서 배양하는 단계

를 포함하는 영양막 줄기 세포의 분리방법.
제1항에 있어서, 단계(b)의 효소반응이 상기 태반 융모를 조각화시킨 후 상기 효소 용액을 가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제2항에 있어서, 단계(b)의 효소반응이 상기 태반 융모를 조각화시킨 후, 조각화된 세포를 세척하고, 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 세포를 농축한 다음, 상기 효소 용액을 가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 단계(b)의 상기 효소반응 및 효소반응 정지 과정을 2 회 반복하여 수행하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제4항에 있어서, 단계(b)의 상기 효소 반응이 각각 30 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)의 상기 효소반응이 20∼30 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제6항에 있어서, 단계(b)의 효소반응이 실온에서 수행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 단계(c)의 밀도-구배 분리법이 피콜 밀도-구배 분리법인 것을 특징으로 하는 분리방법.
제8항에 있어서, 상기 피콜 밀도-구배 분리를 수행하고, 30∼70 % 층 사이에 존재하는 세포들을 분리함으로써 세포영양막(cyto-trophoblast)을 분리하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(e)의 배지가 10 %의 소 태아 혈청, 1 %의 페니실 린-스트렙토마이신, 2 mM의 L-글루타민, 100 uM의 베타-머캅토에탄올, 1 ug/ml의 헤파린, 및 25 ng/ml의 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor-4, FGF-4)가 첨가된 alpha-MEM 인 것을 특징으로 하는 분리방법.