KR100818216B1

KR100818216B1 - Ｃｒｉｐｔｏ－１ 및 Ｏｃｔ４를 동시 발현하는 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 또는 종양 줄기세포 및 그 확인방법

Info

Publication number: KR100818216B1
Application number: KR1020060099052A
Authority: KR
Inventors: 강경선
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2006-10-11
Filing date: 2006-10-11
Publication date: 2008-04-01

Abstract

본 발명은 Cripto-1 및 Oct4를 동시 발현하는 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 또는 종양 줄기세포 및 그 확인방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, (a) 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 또는 종양 줄기세포 후보군을 Cripto-1 및 Oct4와 결합하는 항체를 이용하여 면역염색하는 단계; 및 (b) 상기 면역염색 결과, 상기 Cripto-1 및 Oct4 모두에 대하여 양성을 나타내는 줄기세포 후보군을 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 또는 종양 줄기세포로 확인하는 단계를 포함하는 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 또는 종양 줄기세포의 확인방법 및 상기 방법으로 확인된 다분화능 줄기세포에 관한 것이다.

본 발명에 따른 다분화능 줄기세포의 확인방법은 기존에 다분화능 줄기세포의 표지인자인 Oct4 뿐만 아니라, 또 다른 미분화 상태 표지 인자인 Cripto-1을 성체 줄기세포에서 동시 발현함으로써 진정한 미분화 상태의 성체 줄기세포임을 확인하는데 유용하다.

지방, 성체 줄기세포, NAC, Oct4, Cripto-1

Description

Ｃｒｉｐｔｏ－１ 및 Ｏｃｔ４를 동시 발현하는 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 또는 종양 줄기세포 및 그 확인방법{Multipotent Stem Cell or Cancer Stem Cell Simultaneously Expressing Cripto-1 and Oct4 Derived from Human Adipose Tissue or Cancer and Method for Identifying the Same}

도 1은 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 확인하기 위한 primitive 줄기 세포 마커인 Cripto-1 및 Oct4를 이용해 면역염색한 결과를 나타낸 결과를 400배율로 촬영한 사진이다 (A 및 B: 일차항체인 Oct4 또는 Cripto-1 항체를 넣지 않고, 각각 형광이 표지된 일차항체를 인식하는 이차항체 Alexa 488 및 Alexa 555만 넣은 대조군; C: 핵염색을 위해 hoechst 염색 사진; 및 D: A, B 및 C를 병합한 사진).

도 2는 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 후보군을 본 발명의 확인방법에 따라 primitive 줄기 세포 마커인 Cripto-1 및 Oct4를 이용해 면역염색한 후 400배 배율로 촬영한 사진이다 (A: Cripto-1 발현사진; B: Oct4 발현사진; C: hoechst 염색사진; 및 D: A, B 및 C의 병합사진).

도 3은 본 발명에 따라 확인된 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 100배 배율로 촬영한 사진이다.

도 4는 본 발명에 따라 확인된 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 면역염색을 이용하여 Nestin, Oct4, SH2, SH3/4가 발현한 결과를 100배 배율로 나타낸 사진이다.

21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.

이에 줄기세포연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자들이 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기 까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다.

성체 줄기세포는 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 채취, 줄기세포를 발전시킨 것으로 특정 조직으로만 분화되는 특징이 있다. 그러나, 최근에는 성체줄기 세포를 이용, 간세포 등 각종 여러 조직으로 분화시키는 실험이 성공을 거두고 있어 주목된다.

상기 다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(C.M. Verfaillie, Trends Cell Biol ., 12:502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기 세포의 소스이지만, 다분화능 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다(J.G. Toma et al ., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al, Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al ., Exp . Hematol ., 30:896, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직내에 줄기 세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도 하지않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다. 즉, 줄기 세포들을 분리하여 체외에서 보존하기가 매우 어렵다는 단점이 있다.

이에 대해, 최근, 지방 조직이 다분화능 줄기세포의 새로운 소스임이 밝혀졌다(B.Cousin et al ., BBRC., 301:1016, 2003; A. Miranville et al ., Circulation , 110:349, 2004; S. Gronthos et al ., J. Cell Physiol., 189:54, 2001; M.J.Seo et al ., BBRC., 328:258, 2005). 즉, 지방추출(liposuction)에 의해 얻어진 인간 지방조직에 미분화 세포군이 포함되어 있고, 이것은 in vitro상에서 지방세포, 골형성세포, 근원세포 및 연골모세포로의 분화능을 갖는 세포라는 사실이 보고되었다(P.A.Zuk et al ., Tissue Eng ., 7:211, 2001; A.M Rodriguez et al ., BBRC., 315:255, 2004). 이러한 지방 조직은 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있어, 기존의 단점을 보완하는 새로운 줄기세포의 소스로 주목받고 있는 것이다.

또한, 최근 연구에서는 지방 조직 유래 세포가 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있음이 동물 모델 실험을 통하여 알려짐으로써, 줄기세포의 새로운 소스로서 두각을 나타내고 있다.

지금까지 알려진 지방 유래 줄기세포로는 상피세포로 분화가능한 인간 지방 유래 성체 줄기 세포(Martin Brzoska et al., BBRC, 330:142, 2005), 골 형성 및 지방 세포로 분화가능한 인간 지방 유래 성체 줄기세포(Ying Cao et al., BBRC, 332:370, 2005), 신경세포로 분화가능한 인간 지방 유래 성체 줄기세포(Kristine M. Safford et al ., BBRC, 294:371, 2005), 지방세포로 분화가능한 쥐 지방 유래 줄기세포(Rei Ogawa et al ., BBRC, 319:511, 2004), 골 형성 및 연골 형성세포로 분화가능한 쥐 지방 유래 줄기세포(Rei Ogawa et al ., BBRC, 313:871, 2004), 연골세포로 분화가능한 인간 지방 유래 줄기세포(Hani A. Awad et al., Biomaterials, 25:3211, 2004), 신경 세포로 분화가능한 쥐 지방 유래 줄기세포(Juri Fujimura et al., BBRC, 333:116, 2005) 및 골세포, 연골세포, 신경세포 또는 근육세포로 분화가능한 지방 유래 줄기세포(미국특허공보 제6,777,231호) 등이 있다.

한편, Oct4는 줄기세포에서 미분화상태 표지인자로써 잘 알려져 있고, 기술분야에서는 대한민국특허출원 제10-2004-0105716호 "인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체", 대한민국특허출원 제10-2004-0096780호 "포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 오씨티-4 유전자 발현 억제용 이중나선 알엔에이", 대한민국특허출원 제10-2006-0092128호 "파골세포 기반 적소 유사 구조에 의해 증식능이 증가된 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포 및 그 제조방법" 등에서 나타난 바와 같이, 미분화상태의 줄기세포임을 입증하기 위한 실험으로 Oct4 발현능 실험을 하는 것이 통상이다. 이에 비해, Cripto-1은 미국특허 7,078,176 "Cripto-1의 탐지 및 정량"에서 나타난 바와 같이, 여성의 유선(mammary gland)의 최말단 부위에 줄기세포에서 처음으로 발견되었고, 이후 미분화상태 표지인자임을 나타내는지 여부에 대한 연구가 계속되었다. 그러나, 현재까지 Oct4를 미분화상태 표지인자로 하여 줄기세포임을 확인하는데 그쳤고, 성체 줄기세포에서 Cripto-1을 미분화상태 표지인자로 하여 확인한 연구는 없었다.

이에 본 발명자들은 기존에 알려진 다분화능 줄기세포의 표지인자인 Oct4 뿐만 아니라, 또 다른 미분화 상태 표지 인자인 Cripto-1을 성체 줄기세포에서 동시 발현함으로써 미분화상태임이 확실한 성체 줄기세포를 선별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 미분화상태 표지인자인 Cripto-1 및 Oct4를 동시발현하는 지방 조직 유래 다분화능 줄기세포 또는 종양 줄기세포 및 그 확인방법을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 다음의 단계를 포함하는 지방조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포의 확인방법을 제공한다:

(a) 지방조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포 후보군을 Cripto-1 및 Oct4와 결합하는 항체를 이용하여 면역염색하는 단계; 및

(b) 상기 면역염색 결과, 상기 Cripto-1 및 Oct4 모두에 대하여 양성을 나타내는 줄기세포 후보군을 지방조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포로 확인하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 지방조직 유래 줄기세포 후보군은 인간 지방조직 유래 펠렛을 NAC 함유 배지에서 배양한 다음, 줄기세포 후보군을 회수하여 수득되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는 유세포분석기를 이용하여 Cripto-1 및 Oct4 모두에 대해 양성을 나타내는 줄기세포 후보군을 지방조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포로 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 확인된 줄기세포를 선택하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 분리되고, 다음과 같은 특성을 가지는 다 분화능 줄기세포를 제공한다:

(a) Cripto-1 및 Oct4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; 및

(b) 내배엽, 중배엽, 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명은 또한, 줄기세포 확인인자 Cripto-1 및 Oct4 검출용 바이오마커를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오마커는 줄기세포 확인인자인 Cripto-1 및 Oct4의 항체인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 종양 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Cripto-1 및 Oct4를 동시 발현하는 인간 유방 및 복부 등의 체 지방 조직에서 분리된 다분화능 줄기세포의 확인방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Cripto-1 및 Oct4를 동시 발현하는 종양 줄기세포의 확인방법에 관한 것으로, 구체적으로는 하기 인간 유방 및 복부 등의 체지방 조직에서 분리된 다분화능 줄기세포의 확인방법을 동일하게 적용하여, 종양 줄기세포를 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 우선, 다음과 같은 방법을 통하여, 인간 유방 및 복부 등의 체 지방조직으로부터 다분화능 줄기세포 후보군을 분리 및 정제한다. 인간 지방조직을 분리하여, PBS로 세척한 다음, 조직을 잘게 자른 후 collagenase type1 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 이용해 37℃에서 2시간동안 digestion한다. PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리하여, 상층액은 suction하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리한다. 100㎛ mesh에 필터링하여 debris를 제거한 후 PBS로 세척하고, DMEM(10% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid) 배지에 인큐베이션한다. 하룻밤 지난 후 붙지않은 세포들은 PBS로 세척하고, K-NAC media(Keratinocyte-SFM media + 2mM NAC + 0.2mM ascorbic acid + 0.09mM calcium+ 5ng/ml rEGF + 50㎍/ml BPE + 5㎍/ml Insulin + 74ng/ml Hydrocortisone)를 2일마다 교체하면서 배양하여 인간 유방 및 복부 등의 체 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 후보군을 분리한다.

다음으로, 상기에서 수득한 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 후보군을 PBS로 세 번 세척하고, 4% paraformaldehyde을 함유한 PBS로 고정한 다음, PBS로 세 번 세척한 후, 0.2% Triton-X100를 함유한 PBS로 침투(permeabilization)시킨다. 그 다음, PBS로 세 번 세척한 후, 10% NGS로 1시간동안 반응시키고, 일차항체인 Oct4 또는 Crito-1을 함유한 PBS에 하룻밤동안 반응시킨다. PBS로 3회 세척하고, 형광이 표지되고 상기 일차항체를 인식할 수 있는 이차항체로 암실에서 1시간동안 반응시킨다. PBS로 세 번 세척한 후, mounting 한 후 현미경으로 촬영하여, Cripto-1 및 Oct4를 모두 발현하는지 여부를 확인함으로써 상기 줄기세포 후보군으로부터 최종적으로 줄기세포를 확인한다.

상기에서 수득한 인간 지방조직 유래 줄기세포액으로부터 목적의 표면항원을 발현하고 있는 다분화능 줄기세포를 수득하는 방법으로서는 소팅 기능을 가진 플로 우 사이토미터를 사용한 FACS 법(Int . Immunol ., 10(3):275, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 다분화능 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법(J. Immunol ., 141(8):2797, 1998) 등이 있다. 또한, 대량의 배양액 등으로부터 다분화능 줄기세포를 수득하는 방법으로서는, 세포의 표면에 발현되어 분자(이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 이를 칼럼으로서 사용하는 방법이 있다.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로서는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 들 수 있다. 어떠한 방법도 세포의 표면항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 대한 형광을 측정하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광물질의 종류를 조합함으로서, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 여기에 사용가능한 형광물질로는, FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등이 있다.

플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로서는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차항체와 목적 세포샘플을 혼합하고, 얼음 위에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음물에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다.

각종 표면 항원으로서는 조혈관련항원, 중간엽계 세포의 표면 항원 또는 신경계 뉴런의 특이항원 등을 들 수 있다. 상기 조혈관련 항원으로는 CD34, CD45 등이 있고, 중간엽계 세포의 표면 항원으로는 SH-2, SH-3 등을 들 수 있으며, 신경계 뉴런의 특이항원으로는 NSE, GFAP 등을 들 수 있다. 전술한 각종 표면 항원을 인식하는 항체를 단독 혹은 조합하여 사용함으로서, 목적하는 세포를 취득할 수 있다.

상기 확인방법에 따라 수득된 본 발명에 따른 다분화능 성체 줄기세포를 플로우 사이토미터를 이용하여 분석한 결과, CD73, CD90, CD29, CD44, CD105에 대해서는 양성반응을 보였다. 또한, 다른 항원에 대한 면역표현형을 확인한 결과, CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내었다.

본 발명은 또한, 지방 조직에 국한되지 않고, 다른 조직 유래 성체 줄기세포를 확인 및 분리하는데 적용가능함은 당업계 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예는 지방조직 유래 다분화능 줄기세포에 관한 것이나, 이를 종양 줄기세포에 용이하게 적용하여 Cripto-1 및 Oct4 동시발현하는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 지방조직에서 다분화능 줄기세포 후보군의 분리

서울대학교 유방암센터에서 분양받은 여성의 유방조직 또는 복부 등의 인간의 체지방에서 지방조직을 분리하여 PBS로 세척하였다. 조직을 잘게 자른 후 collagenase type1 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM media를 이용해 37℃에서 2시간동안 digestion하였다. PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액은 suction하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100㎛ mesh에 필터링하여 debris를 제거한 후 PBS로 세척하였다. DMEM(10% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid) 배지에 인큐베이션하였다. 하룻밤 지난 후 붙지않은 세포들은 PBS로 세척하고, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5ng/ml rEGF, 50㎍/ml BPE, 5㎍/ml 인슐린 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media을 3일마다 교체하면서 배양하여 다분화능 줄기세포 후보군을 분리하였다.

실시예 2: 지방조직 유래 줄기세포의 Cripto -1 및 Oct4 의 동시발현 확인

실시예 1에서 수득한 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 후보군을 PBS로 세 번 세척하고, 4% paraformaldehyde을 함유한 PBS로 20분간 고정하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 0.2% Triton-X100를 함유한 PBS로 10분간 침투(permeabilization)시켰다. PBS로 세 번 세척한 후, 10% NGS로 1시간동안 반응시키고, 일차항체인 Oct4 또는 Cripto-1을 함유한 PBS에 하룻밤동안 반응시켰다. PBS로 3회 세척하고, 일차항체를 인식할 수 있는 형광표지된 항체인 이차항체인 Alexa 488 또는 Alexa 555 (Invitrogen, USA)로 암실에서 1시간동안 반응시킨다. PBS로 세 번 세척한 후, mounting 한 후 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)으로 촬영하였다.

도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, Cripto-1은 세포질 및 세포막에서 발현하며, Oct4는 핵에서 발현하는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통하여 Cripto-1 및 Oct4를 동시발현하는 줄기세포를 확인할 수 있었다. 즉, 도 1에서 나타난 바와 같이, 일차항체인 Oct4 및 Cripto-1를 빼고, 이차항체인 Alexa 488 또는 555만을 붙임으로서, 본 면역염색반응이 이차항체의 비특이적 반응에 의한 것이 아님이 입증되었고, 도 2에 나타난 바와 같이, 일반적인 면역염색방법을 이용한 면역염색 반응이 일차항체인 Oct4 및 Cripto-1에 특이적 반응에 의한 것임이 입증된 것이다. 도 1 및 도 2의 C는 hoechst 33342로 염색한 핵 염색사진을 400배율로 촬영한 사진이다. 도 3은 상기 방법으로 확인된 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 100배 배율로 촬영한 사진이다.

실시예 3: 지방 유래 다분화능 줄기세포의 면역학적 특성

실시예 2에서 수득한 지방조직 유래 다분화능 줄기세포를 PBS로 세척하고, 트립신 처리한 뒤 세포를 수거하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 2% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 세척한 후 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 세포를 PBS에 부유시켜 sample수 만큼 1 ×10⁵ cell을 분주하였다. 각 well에 antibody(R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)를 넣고, 얼음에 40분동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 뒤 PBS로 세척하고 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 다시 한번, 상기 상층액 제거후 PBS로 세척하고 1000rpm에서 5분동안 원심분리하는 과정을 반복하였다. 상층액을 제거한 후 1% paraformaldehyde을 넣어서 single화 하고, 유세포분석기(플로우 사이토미터)를 이용해 분석하였다.

그 결과, 아래에 표 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 지방조직 유래 성체 줄기세포는 CD73에 대해서는 91%, CD90에 대해서는 97%, CD29에 대해서는 96%, CD44에 대해서는 83%, CD105에 대해서는 80%의 양성반응을 보였다. 또한, 다른 항원에 대한 면역표현형을 확인한 결과, CD33, CD34, CD45, CD4, CD31, CD62p, CD14 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타내었다.

지방유래 줄기세포의 표면항원분석(FACS analysis)

Antigen	AD-MSCs
CD73	+
CD90	+
CD29	+
CD44	+
CD105	+
CD33	-
CD34	-
CD45	-
CD4	-
CD31	-
CD62p	-
CD14	-
HLA-DR	-

실시예 4: 지방조직 유래 줄기세포의 면역염색 분석

상기 실시예 2에서 수득된 지방조직 유래 줄기세포를 PBS로 세 번 세척하고, 4% paraformaldehyde을 함유한 PBS로 30분간 고정하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 0.1% Triton- X100을 함유한 PBS로 10분간 침투(permeabilization)시킨다. PBS로 세 번 세척한 후, 10% NGS로 1시간동안 반응시키고, 일차항체를 함유한 PBS에 하룻밤동안 반응시킨다. PBS로 3회 세척하고, 이차항체로 암실에서 1시간동안 반응시켰다. PBS로 세 번 세척한 후, mounting하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 다분화능 줄기세포는 신경 전구세포의 마커라고 할 수 있는 Nestin, 미분화상태의 세포 마커라고 할 수 있는 Oct4 및 중간엽 줄기세포의 마커인 SH2(CD105), SH3/4(CD73)에 대하여 양성반응을 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 지방 조직 유래 다분화능 줄기세포의 확인방법은 기존에 다분화능 줄기세포의 표지인자인 Oct4 뿐만 아니라, 또 다른 미분화 상태 표지 인자인 Cripto-1을 성체 줄기세포에서 동시 발현함으로써 미분화 상태에 좀더 가까운 진정한 성체 줄기세포임을 확인하는데 유용하다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 지방조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포의 확인·분리 방법:

(a) 지방조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포 후보군을 Cripto-1 및 Oct4와 결합하는 항체를 이용하여 면역염색하는 단계;

(b) 상기 면역염색 결과, 상기 Cripto-1 및 Oct4 모두에 대하여 양성을 나타내는 줄기세포 후보군을 지방조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포로 확인하는 단계; 및

(c) 상기 확인된 줄기세포를 선택하여 분리하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계는 유세포분석기를 이용하여 Cripto-1 및 Oct4 모두에 대해 양성을 나타내는 줄기세포 후보군을 지방조직 유래 성체 줄기세포 또는 종양 줄기세포로 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
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