KR102492885B1 - 융모막판 인접 융모 유래 줄기세포 및 이를 포함하는 조직재생용 세포 치료제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위이고, 융모 기저부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포는 다른 태반 조직 유래 줄기세포와 비교하여 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성을 나타내고, 연골, 골 및 지방으로의 분화능이 현저히 우수하므로 연골, 골 및 지방의 재생이 필요한 다양한 조직 재생 치료, 특히 연골 재생 및 골 관절염 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

융모막판 인접 융모 유래 줄기세포 및 이를 포함하는 조직재생용 세포 치료제 {Stem cells derived from villi adjacent to chorionic plate and cellular therapeutic agents comprising the same}
본 발명은 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.
줄기세포 (stem cell) 란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포 (totipotent stem cell), 전능성 (전분화능) 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다능성 (다분화능) 줄기세포 (multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 만능 줄기세포 (totipotent stem cell) 는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cells) 는 외배엽, 중배엽, 내배엽 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포 (blastocyst) 의 안쪽에 위치한 내세포괴 (inner cell mass)에서 유래하며 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다분화능 줄기세포 (multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다. 상기와 같은 다분화능 줄기세포의 소스로는 성체 골수, 피부, 혈관, 근육 등이 알려져 있고, 조직공학, 유전자 치료분야 및 세포치료제 분야 등에도 이러한 줄기세포들이 급속도로 적용되고 있으며, 이외에도 여러 조직으로부터 줄기세포를 얻고, 이에 대한 다양한 응용이 절실히 요구되고 있는 상황이다.
태반은 여성이 임신했을 때, 자궁벽에서 발생하는 장기로 혈관조직이 풍부한 원반형 형태를 보이며, 태아의 영양섭취와 호흡, 배설 등이 모두 태반을 통해 이루어진다. 일생의 건강이 태아시기에 결정된다는 과학적 연구 결과들이 보고되면서, 임신 기간 중의 태반의 중요성이 부각되고 있으며, 이에 관련된 여러 가지 물질들의 상호관계를 규명하고자 많은 노력이 시도되고 있다. 태반은, 주수별, 위치별 다양한 형태의 세포들로 구성되어 있는데, 아직은 그 활용범위가 극히 제한적으로 이루어지고 있다.
최근에는, 태반조직으로부터 분리된 줄기세포에 관한 연구들도 진행되고 있다. 종래의 태반 조직 유래 줄기세포는 출산 시에 얻을 수 있는 만삭 태반의 일부 조직으로부터 유래된 줄기세포가 대부분이었다. 그러나 태반은 자궁에 붙어있는 기저막, 태반의 중심조직으로 모체와 태아 혈액간에 물질 교환을 매개하는 융모조직, 태반의 안쪽으로 태반을 덮고 있으면서 태아와 양막을 싸고있는 융모막 등 다양한 조직으로 이루어져 있으며, 아직까지 이들 세부 조직에 대한 연구는 널리 알려지지 않았다. 한편 대한민국 특허등록 제818214호에는 NAC(N-acrtyl-L-cysteine) 함유 배지를 이용하여 양막 또는 탈락막으로부터 줄기세포를 분리하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허등록 제871984호에는 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor) 함유 배지를 이용하여 양막, 장막, 기저 탈락막 및 태반 조직으로부터 유래된 줄기세포의 다분화능에 관해 개시하고 있다.
그러나 종래 해부학적으로 알려진 태반 구조 구별방법에 구애되지 않고 태반을 세분화하고, 세분화된 부위로부터 얻어지는 줄기세포 및 이의 효과에 대해서는 아직까지 널리 보고되지 않았다.
이에 본 발명자들은 종래 태반 조직 구별법에 구애되지 않고, 새로운 태반의 세부 부위를 정의하고 이에 따른 줄기세포의 특성을 연구하던 중, 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 를 수득하였으며 이로부터 분리된 줄기세포가 전체 태반, 전체 융모 및 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외한 나머지 부분의 융모 유래 줄기세포와 비교하여 CD 마커 발현 패턴이 상이하고 연골, 골 및 지방으로의 분화능이 모두 현저히 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포를 제공하는 것이며, 상기 융모막판 인접 융모는 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위이고, 융모 기저부위를 포함하는 것이다. 또한 본 발명의 또다른 목적은 상기 융모막판 인접 융모 조직 유래 줄기세포를 이용한 세포 치료제, 조직 재생용 조성물, 이들의 분리 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포로, 상기 융모막판 인접 융모는 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 전체 융모 길이 중 융모막판 인접 부위에서부터 30% 길이까지인 부위이고, 융모 기저부위를 포함하는 것인 줄기세포를 제공한다.
또한 본 발명은 1) 전체 융모 중, 융모막판 인접 부위에서부터, 전체 융모 길이 중 융모막판 인접 부위에서부터 30% 길이까지인 부위를 절단하여 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 를 얻는 단계; 및 2) 융모막판 인접 융모로부터 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 유래 줄기세포의 분리 수득 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 세포치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위이고, 융모 기저부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포는 다른 태반 조직 유래 줄기세포와 비교하여 균질한 성장 특성, 우수한 증식 특성을 나타내고, 연골, 골 및 지방으로의 분화능이 현저히 우수하므로 연골, 골 및 지방의 재생이 필요한 다양한 조직 재생 치료, 특히 연골 재생 및 골 관절염 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 융모막판 (Chorionic plate) 및 전체 융모 (CV) 및 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 를 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 태반 전체 유래 줄기세포 (Pla), 융모 전체 유래 줄기세포 (CV), 융모막판 인접 융모 (VCP) 유래 줄기세포 (CV1), 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외(CV-VCP)한 융모 유래 줄기세포 (CV2) 를 배양한 후 세포 형태를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3의 A는 태반 전체 유래 줄기세포 (Pla), 융모 전체 유래 줄기세포 (CV), 융모막판 인접 융모 (VCP) 유래 줄기세포 (CV1), 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외한 부위 (CV-VCP) 유래 줄기세포 (CV2) 의 집락형성능을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 B는 CV1 의 집락 크기를 나타낸 도이다.
도 4는 P2 내지 P6계대 배양에 따른 태반 전체 유래 줄기세포 (Pla), 융모 전체 유래 줄기세포 (CV), 융모막판 인접 융모(VCP) 유래 줄기세포 (CV1), 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외한 부위(CV-VCP) 유래 줄기세포 (CV2) 의 집단 배가 시간을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 태반 전체 유래 줄기세포 (Pla), 융모 전체 유래 줄기세포 (CV), 융모막판 인접 융모 (VCP) 유래 줄기세포 (CV1), 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외한 부위 (CV-VCP) 유래 줄기세포 (CV2) 의 연골세포 분화능을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 A 는 사포린 O 염색결과를 나타낸 도이다. 도 5의 B 는 타입 II 콜라겐 염색 결과를 나타낸 도이다. 도 5의 C 는 GAG 함량 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 태반 전체 유래 줄기세포 (Pla), 융모 전체 유래 줄기세포 (CV), 융모막판 인접 융모 (VCP) 유래 줄기세포 (CV1), 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외한 부위(CV-VCP) 유래 줄기세포 (CV2) 의 골세포 분화능을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 6의 A 는 ALP 염색결과를 나타낸 도이다. 도 6의 B 는 Alizarin red S 염색 결과를 나타낸 도이다. 도 6의 C 는 칼슘 함량 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 태반 전체 유래 줄기세포 (Pla), 융모 전체 유래 줄기세포 (CV), 융모막판 인접 융모 (VCP) 유래 줄기세포 (CV1), 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외한 부위(CV-VCP) 유래 줄기세포 (CV2) 의 지방세포 분화능을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 7의 A 는 Oil red O 염색결과를 나타낸 도이다. 도 7의 B 는 Oil red O 염색결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 연골 손상 동물모델에서 CV1을 투여한 후 연골 재생 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 연골 손상 동물모델에서 CV1을 투여한 후 OARSI score 를 측정하여 관절염 진행과정에서 연골 보호 및 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포 및 이를 포함하는 조직재생용 세포 치료제, 조직 재생용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에서 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화능에 따라, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능(다능성) 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있다.
본 발명에서 "태반(placenta)"이란, 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 생체 내 조직을 의미하는데, 무게 500-600 g, 지름 15-20 cm, 두께 2-3 cm 정도의 원반형태이다. 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며, 그 사이에서 모체의 혈액과 태아의 혈관 사이에 영양분 및 산소의 전달이 이루어지게 된다. 태반은 크게 양막, 융모막, 탈락막의 3층으로 구분할 수 있고, 보다 상세하게는 양막 상피, 양막, 융모막, 영양막, 탈락막으로 구분 할 수 있다.
본 발명의 “융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP)” 는 융모 기저부위를 포함하는 부위로, 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위일 수 있고, 보다 구체적으로 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3 지점까지에 해당하는 융모막판 인접 부위 쪽에서 시작되는 연속적인 부위까지일 수 있으며, 바람직하게는 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/5 지점까지 내지 1/3 지점까지인 부위, 즉 전체 융모 중 융모막판 인접 부위를 시작점으로 하여 전체 융모 길이 중 20 % 까지 내지 33% 길이까지인 연속적인 부위, 예컨대 융모막판 인접 부위를 시작점으로 하여 전체 융모 길이의 20% 까지, 21% 까지, 22% 까지, 23% 까지, 24% 까지, 25% 까지, 26% 까지, 27% 까지, 28% 까지, 29% 까지, 30% 까지일 수 있다. 본 발명의 융모막판 인접 융모를 도 1에 도식화하여 나타내었다.
본 발명의 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포는 CD273, CD275 및/또는 CD321 에 대하여 음성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하며, 이는 전체 태반(Pla) 유래 줄기세포, 전체 융모 (CV) 유래 줄기세포 및 전체 융모에서 본 발명에서 정의된 융모막판 인접 융모를 제외한 나머지 부분의 융모 (CV-VCP) 유래 줄기세포가 CD273, CD275 및 CD321 에 대하여 양성의 표면인자 발현 특성을 나타내는 것과 다른 고유한 특징으로, 본 발명의 줄기세포가 다른 줄기세포와 구별되는 줄기세포임을 나타낼 수 있다.
본 발명의 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포는 종합적으로 CD44, CD73, CD90, CD105, CD49e, CD140b, CD142 에 대하여 양성, 및 CD31, CD34, CD45, CD273, CD275, CD321, HLA-DR 에 대하여 음성의 표면인자 마커 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명의 줄기세포는 태아 세포 기원 (cell origin) 의 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 태반은 태아와 모체 유래의 특성을 나타내는 고유한 조직으로 자궁에 붙어있는 기저막, 태반의 중심조직으로 모체와 태아 혈액간에 물질 교환을 매개하는 융모조직, 태반의 안쪽으로 태반을 덮고 있으면서 태아와 양막을 싸고있는 융모막 등 개별적 특성을 나타내는 조직들로 이루어져 있다. 따라서 태반 유래 줄기세포라고 할지라도 수득 위치에 따라 세포의 기원이 상이하게 나타날 수 있으며, 영양막 유래 줄기세포는 모체 세포 기원, 융모 유래 줄기세포는 태아 세포 기원, 전체 태반 유래 줄기세포의 경우 태아 및 모체 모두에서 기원하는 줄기세포인 것으로 알려져 있다. 본 발명의 융모막판 인접 융모 조직 유래 줄기세포는 염색체 형 분석을 통해 확인한 결과 태아 유래의 세포 염색체 형을 갖는 것을 확인하였다. 이는 융모막판 인접 융모를 제외한 나머지 부분의 융모 (CV-VCP) 유래 줄기세포가 모체 유래의 염색체 형을 나타낸다는 점에서 동일한 융모 유래 줄기세포라도 세부적인 수득 부위 위치에 따라 세포 기원을 달리하고 다른 특성을 나타내는 세포임을 보여줄 수 있는 결과이다.
또한 본 발명의 줄기세포는 1) 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위인 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직을 얻는 단계; 및 2) 융모막판 인접 융모로부터 줄기세포를 수득하는 단계; 를 통해 수득되는 것을 특징으로 하는 줄기세포일 수 있다.
또한 본 발명은 1) 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위인 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직을 얻는 단계; 및 2) 융모막판 인접 융모로부터 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 유래 줄기세포의 분리 수득 방법에 관한 것이다.
상기 방법 중 1) 단계는 융모막판 인접 융모를 전체 융모로부터 수득하는 단계로, 당 분야에 알려진 방법을 제한없이 사용하여 융모막판 인접 융모를 수득할 수 있다. 이때 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위를 멸균된 포셉과 메스로 절단하여 융모막판 인접 융모를 수득할 수 있으며, 보다 구체적으로 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3 지점까지에 해당하는 부위를 절단하여 융모막판 인접 부위 쪽에서 시작되는 연속적인 부위를 수득할 수 있다. 바람직하게는 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/5 지점까지 내지 1/3 지점까지인 부위, 즉 전체 융모 중 융모막판 인접 부위를 시작점으로 하여 전체 융모 길이 중 20 내지 33% 길이까지인 연속적인 부위를 절단하여 수득할 수 있으며, 이러한 절단에 의하여 전체 융모를 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 와 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외한 나머지 융모인 CV-VCP 부위로 분리할 수 있다. 융모막판 인접 융모는 융모 기저부위를 포함하며, CV-VCP 부위는 융모의 말단 부위를 포함한다.
상기 2) 단계는 1) 단계에서 수득된 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 로부터 줄기세포를 수득하는 단계로 융모막판 인접 융모 조직에 효소 용액을 가하여 효소반응을 수행하여 얻어진 세포를, 성장 인자를 사용하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 배지에서 배양한 다음 회수함으로써 수득될 수 있다. 상기 효소에는 트립신(Trypsin), 콜라게나아제(collagenase), 디스파아제(dispase), DNase, RNase, 프로테아제(protease), 리파아제(lipase), 히알루로니다아제(hyaluronidase) 및 엘라스타제 (elastase) 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 콜라게나아제는 콜라게나아제 A, I, II, III 또는 IV 등을 포함한다.
본 발명의 방법에 따르면, 융모 중에서도 융모막판 인접 융모 부위에서 특이적으로 줄기세포를 분리해 낼 수 있으며, 이와 같은 방법으로 분리된 줄기세포는 전체 융모, CV-VCP 융모, 태반 유래 줄기세포와 달리 CD273, CD275 및 CD321 에 대하여 음성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 방법을 통해 수득된 줄기세포는 다른 조직 유래 줄기세포와 비교하여 섬유아세포 모양의 형태적 특성을 나타내고 단일의 세포만을 특이적으로 유지할 수 있으며, 집락 형성능이 우수하고 우수한 증식능을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 융모막판 인접 융모 부위에서 유래된 줄기세포는 서로 다른 종류의 세포로 분화할 수 있으며, 예를 들어, 지방세포, 연골세포, 골세포, 신경세포, 인대세포 또는 건세포(tenocyte) 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "분화(differentiation)"란, 일반적으로 비교적 단순 한계가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계로 분리되는 현상을 의미하는데, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 현상을 의미한다. 상대적으로, "미분화"란 상술한 분화가 일어나지 않은, 아직 줄기세포로써의 특징을 함유하고 있는 상태를 의미한다.
줄기세포를 분화시키는 방법은 종래 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 인슐린 및 IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)를 포함하는 배지에서 배양하여 지방세포로 분화시키는 방법; 상기 줄기세포를 덱사메타손, BMP-6(bone morphogenetic protein 6), TGF-βgrowth factor beta), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 L-프롤린(L-proline)을 포함하는 배지에서 배양하여 연골세포로 분화시키는 방법; 상기 줄기세포를 덱사메타손, 아스코르브산, β글리크로포스페이트(β및 아스코르브산-2-포스페이트(ascorbic acid-2-phosphate)를 포함하는 배지에 배양하여 골세포로 분화시키는 방법 등을 사용함이 바람직하다.
상기 방법으로 분화된 융모막판 인접 융모 부위에서 유래된 줄기세포의 분화 정도를 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 당해 분야에 공지된 기법인 유세포 분석방법, 면역세포화학적 방법, PCR 또는 유전자-발현 프로파일을 사용하여 세포 표면 표지 또는 형태의 변화를 측정하는 방법, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태변화를 조사하는 방법, 유전자 발현 프로파일의 변화를 측정하는 방법 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 RT-PCR, Oil-red O 염색법, Safranin O 염색법, Type II collagen 면역조직화학 염색법, ALP(alkaline phosphate) 염색법 또는 Alizarin red S 염색법 등을 이용할 수 있다.
또한 본 발명은 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위이고, 융모 기저부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 융모막판 인접 융모 조직으로부터 유래된, 융모막판 인접 융모 조직 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 세포치료제 또는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포는 집락 형성능이 우수하고 우수한 증식능을 나타낼 뿐만 아니라, 지방세포, 연골세포, 골세포, 신경세포, 인대세포 또는 건세포(tenocyte) 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있으므로, 조직 재생을 목적으로 하는 세포 치료제 및 조직재생용 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명에서 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포는 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 분화세포 군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 조정, 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 본 발명의 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 세포치료제는 지방, 연골, 골, 신경, 인대 및 건으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 조직을 재생하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 있어 연골은 유리연골, 섬유 연골 또는 탄성연골을 제한없이 포함할 수 있으며, 상기 연골은 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 관연골, 후두연골 및 척추 연골로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
따라서 본 발명의 세포치료제는 골 결손, 건-인대 결손, 지방조직 결손, 연골 괴사, 골연골염, 연골파열, 연골외상, 관절염, 연골결핍 또는 선천성 기관연화 치료용일 수 있다.
또한, 본 발명의 세포치료제 또는 조직 재생용 조성물은 관절 내 또는 관절 강에 직접 투여될 수 있으며, 이 경우 주사제 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포는 연골, 골, 지방 등으로 분화될 수 있는 분화능이 뛰어난 줄기세포이므로, 관절, 연골, 건 또는 인대 부위에 투여함으로써, 다양한 병변, 예컨대 관절 연골의 병변을 치료하거나 예방할 수 있다. 특히 본 발명의 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포를 관절 내 투여하면 연골 표면을 부드럽고 손상이 거의 없는 상태로 재생시킬 수 있으며, 관절염이 진행되지 않도록 연골을 보호 및 재생할 수 있다.
특히 본 발명의 세포 치료제 또는 조직 재생용 조성물은 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포를 직접 투여하기 위하여 주사제 형태로 제형화 될 수 있으며, 이 경우, 주사제에 적합하도록 하이드로겔을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 세포 치료제에 사용할 수 있는 하이드로겔은 주사제에 적합한 당 분야에 공지된 하이드로겔을 제한없이 포함할 수 있으며, 소장점막하 조직, 히알루론산(hyalurinic acid), 카복시메틸셀룰로오스(CMC, carboxymethylcellulose), 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(poly(N-isopropylacrylamide)), β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 플루로닉(Poly(ethylene oxide)poly(propylene oxide)poly(ethyleneoxide), Pluronic), 피브린, 폴리에틸렌옥사이드 (PEO) 및 카복시메틸셀룰로오스(CMC)와 폴리에틸렌이민(PEI)의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 히알루론산 및 플루로닉를 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포와 혼합하여 사용하였다.
본 발명의 세포치료제의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포는 증식능과 분화능이 우수하여 조직 재생 효과가 우수하며, 조직 재생용 세포 치료제에서 기술된 내용과 중복되는 내용은 명세서 기재의 복잡성을 피하기 위해 생략한다.
이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 태반 융모막판 인접 융모 분리 및 줄기세포 수득
태반 조직으로부터 양막을 벗겨 내고, 탈락막을 멸균된 가위를 이용하여 제거한 후, 약 5*5*3cm 크기의 전체 영양막층(chorion)을 얻어 150㎜ 디쉬에 옮긴 후, PBS를 이용하여 5번이상 세척하여 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 융모만을 분리해 내기 위해, 전체 영양막을 villi 와 intervillous 로 다시 분리한 후, 분리된 융모를 PBS를 이용하여 남아있는 혈액 및 혈구세포를 제거하기 위해 5번 이상 세척하였다. 세척된 전체 길이 융모 중 융모막판으로부터 약 20% 까지의 길이 (전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/5 지점까지의 길이) 에 해당하는 융모막판 (chorionic plate) 인접 부위에 해당하는 융모 조직만을 절단하여 멸균된 포?과 메스를 이용하여 수득하였다. 이렇게 얻은, 융모의 기저 부분을 포함하는 절단부 융모 조직을 전체 융모 (chorionic villi, CV) 와 구별하기 위하여 융모막판 인접 융모(villi adjacent to chorionic plate, VCP) 로 정의하였다. 융모막판 인접 융모를 도식화하여 도 1에 나타내었다.
융모막판 인접 융모 (이하, VCP) 를 50ml 튜브에 옮긴 후, 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 a-MEM 배지를 가하고 37℃ 조건에서 교반기를 이용하여 2시간 정도 반응시켜 VCP 로부터 유래된 세포를 수득하였다. 수득한 VCP로부터 유래된 세포를 100 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 a-MEM 배지를 가한 후 25℃, 1500rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 a-MEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 VCP 로부터 유래된 줄기세포를 수득하였다. 수득된 줄기세포는 “CV1”으로 지칭하였다.
비교예 1: 타 조직 유래 줄기세포의 수득
1-1. 태반 전체로부터 유래된 줄기세포의 수득
전체 태반 조직을 약 5*5*3cm 정도를 세절하고, PBS로 세척하여 태반 조직으로부터 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 상기 세척된 태반 조직에 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 a-MEM 배지를 가하고 37℃ 조건에서 교반기를 이용하여 반응시켜 태반 세포를 수득하였다. 상기 수득한 태반 세포를 100 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 a-MEM 배지를 가한 후 25℃, 1000rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 a-MEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 태반 전체(Whole placenta, Pla) 유래 줄기세포를 수득하였다.
1-2. 태반 세부조직으로부터 유래된 줄기세포의 수득
태반 조직으로부터 양막을 벗겨내고 탈락막을 제거한 뒤, 약 5*5*3cm 크기의 영양막층 전체를 얻어 150㎜ 디쉬에 옮긴 후, PBS를 이용하여 5번이상 세척하여 혈액 및 혈구세포를 제거하였다. 융모만을 분리해 내기 위해, 영양막 전체를 villi 와 intervillous 로 다시 분리한 후, 분리된 융모를 PBS를 이용하여 남아있는 혈액 및 혈구세포를 제거하기 위해 5번 이상 세척하였다. 전체 융모 (chorionic villi, CV) 에서 실시예 1에 기재된 융모막판 인접 융모(villi adjacent to chorionic plate, VCP) 를 제외한 나머지 조직 부분을 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외한 의미로 CV-VCP 로 정의하였다. 전체 융모 또는 CV-VCP 조직을 50ml 튜브에 옮긴 후, 0.2% 콜라게나아제를 첨가한 a-MEM 배지를 가하고 37℃ 조건에서 교반기를 이용하여 2시간 정도 반응시켜 각각의 조직으로부터 유래된 세포를 수득하였다. 수득한 세포는 100 ㎛ 메쉬에 여과하여 분해되지 않은 조직을 제거하고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 a-MEM 배지를 가한 후 25℃, 1500rpm에서 4분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전된 세포에 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 a-MEM 배지를 가하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 상기 배양물에서 배양 용기의 바닥에 부착된 세포를 선별하여 영양막층 전체 융모에서 유래된 줄기세포를 “CV” 로, CV-VCP 로부터 유래된 줄기세포를 “CV2” 로 지칭하였다.
실시예 2: 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1 배양 및 세포 형태
상기 실시예 1 에서 수득한 CV1 줄기세포를 PBS로 세척한 후, 성장인자를 포함하지 않고, 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 a-MEM 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하였다. 상기 줄기세포가 80% 이상 성장한 시점에서 트리플(TryPLE)을 처리하여 줄기세포를 배양 용기에서 분리하고, 분리된 줄기세포를 1/5의 비율로 희석한 다음, 다른 배양 용기에서 배양하는 방법으로 계대 배양을 수행하였다. 배양한 이후의 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다. 또한, 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체(Whole placenta, Pla) 및 다른 세부 조직 유래 줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 계대 배양을 수행한 후, 배양한 이후의 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 각 도 2 에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 CV1 줄기세포는 섬유아세포 모양의 형태적 특성을 나타내고 단일의 세포만을 특이적으로 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 태반 전체(Whole placenta, Pla) 및 다른 세부 조직유래 줄기세포는 섬유아세포 모양의 형태적 특성을 나타냈으나, 다수의 서로 다른 형태의 세포가 혼합되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명에 따른 CV1 줄기세포와 비교하면, 계대 배양 전후로 CV1 줄기세포는 단일 세포만을 특이적으로 유지하였으나, 태반 전체 및 다른 세부 조직 유래 줄기세포로부터 유래된 줄기세포는 서로 다른 형태의 세포가 혼합되어 있음을 확인하였다.
실시예 3: 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1의 집락형성능 분석
상기 실시예 1에서 CV1 줄기세포의 집락형성능을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 CV1 줄기세포를 상기 실시예 2의 방법으로 첫 번째 계대 배양을 수행하고, 상기 계대 배양이 종료되는 시점에서 100㎜ 디쉬에 5 X 103개씩 접종(seeding)한 후, 14일 동안 성장인자를 포함하지 않고 우태아 혈청 및 항생제가 첨가된 a-MEM 배지에서 배양하였다. 그 후 각 줄기세포에서 몇 개의 집락이 형성되는지를 계수하였다. 또한, 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체 및 다른 태반 세부조직 유래 줄기세포를 이용하여, 동일한 방법으로 집단 배가 시간 및 집락형성능을 측정하였다. 집락형성능의 경우 태반 전체 유래 줄기세포의 결과값을 100%로 하여 환산하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4 에 나타내었다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, VCP 로부터 유래된 CV1 줄기세포는 태반 전체 (Pla), 전체 융모 유래 (CV), 전체 융모에서 융모막판 인접 융모를 제외한 융모 CV-VCP 유래 CV2 줄기세포와 비교하여 집락 형성능이 현저하게 우수한 것을 확인하였고 도 3B 에 나타낸 바와 같이 VCP 로부터 유래된 CV1 줄기세포는 집락의 크기가 3~4mm 이상 형성되는 것을 확인하였다.
이를 통해 CV1 은 CV2 줄기세포와 비교하여 2배 이상의 집락형성능을 나타내어 전체 융모 및 다른 융모 부위 유래 줄기세포와 비교하여 집락 형성능이 매우 뛰어난 줄기세포임을 확인하였다.
또한 도 4에 나타낸 바와 같이, 집단 배가시간은 P2 내지 P4 까지는 비슷하게 유지되었으나, P5 이후에는 본 발명의 CV1 줄기세포가 가장 낮은 집단 배가 시간을 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1이 우수한 증식능을 가진 줄기세포임을 확인하였다
실시예 4: 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1의 표면 마커 분석
상기 실시예 1에서 수득한 CV1의 면역학적 특성을 확인하기 위해 242개 Human Cell Surface Marker Screening Panel을 이용하여 표면 마커를 분석하였다.
먼저, 실시예 1에 따라 융모막판 인접 융모를 수득하고 이를 PBS로 세척하고, 트리플 처리한 뒤 줄기세포를 수거하여 1200rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 PBS로 줄기세포를 세척한 후, 1200rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거한 후 줄기세포를 PBS에 부유시켜 40μm cell strainer 를 통과시켜 세포 및 BD Pharmingen Stain Buffer + EDTA 를 준비하여 혼합한다. Falcon®둥근 바닥 96 웰 플레이트 (Cat. 353910) 각 well 에 100㎕씩 분주하였다 (100,000개/well). 그 후, 각 well 에 해당되는 antibody를 20㎕씩 분주하였다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션 한 후, 세척을 위해 BD Pharmingen Stain Buffer + EDTA 를 각 well 에 첨가한 뒤, 1200rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 다시 조심스럽게 상층액을 제거한 뒤 BD Pharmingen Stain Buffer + EDTA 로 세척하고 1200rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. 그 후 2차 항체를 각 well 에 100㎕씩 분주하였다. 세척을 위해 BD Pharmingen Stain Buffer + EDTA 를 각 well 에 첨가한 뒤, 1200rpm에서 5분 동안 원심 분리하였고, 상등액을 제거하고, PBS를 이용하여 조심스럽게 세척 과정을 2번 반복하였다. 상등액을 제거하고, BD Pharmingen Stain Buffer + EDTA 각 well 에 150㎕씩 분주하였다. Well 당 최소 10,000 개 이상의 세포를 플로우사이토미터(FACS)를 이용해 표면 마커를 분석하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체 및 다른 태반 세부조직 유래 줄기세포의 표면 마커를 분석하였다. 그 결과를 표 1, 2에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112019095836612-pat00001
[표 2]
Figure 112019095836612-pat00002
표면 마커 발현량이 5% 미만인 경우 음성 마커로 분리하며, 6% 이상인 경우 그 발현량에 따라 양성 마커 중에서도 6% 이상 30% 미만인 경우 low, 30 내지 70% 미만인 경우 middle, 70% 이상인 경우 High 로 분류하였고 이러한 기준에 따라 표 1 및 2의 마커 발현값을 기준으로 정리하여 표 3 및 4 에 마커 발현을 표시하였다.
[표 3]
Figure 112019095836612-pat00003
[표 4]
Figure 112019095836612-pat00004
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 CV1 은 전체 태반 및 융모 유래 줄기세포 CV 와 달리 CD273, CD275, CD321 마커가 음성인 것으로 확인됐으며, 특히 이러한 발현은 융모막판 인접 융모를 제외한 융모 CV-VCP 유래 줄기세포인 CV2 와도 다른 결과인 바, 다른 비교 줄기세포와는 완전히 다른 CD 마커 발현 특성을 나타내는 새로운 줄기세포인 것을 확인하였다.
또한 상기와 같은 결과는 융모 전체로부터 유래된 줄기세포들은 다양한 CD 마커 발현 패턴을 나타내는 줄기세포들이 혼재되어 있는 상태인 것을 보여주는 결과로 본원 발명과 같이 융모막판 인접 융모로부터 줄기세포를 세분화하여 분리하는 경우 보다 균일한 줄기세포를 수득할 수 있다는 사실을 확인할 수 있다.
실시예 5: 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1의 세포기원 비교
상기 실시예 1에서 수득한 CV1가 전체 태반 또는 융모 유래 줄기세포, 융모막판 인접 융모를 제외한 융모 CV-VCP 유래 줄기세포인 CV2와 비교하여 세포의 기원이 상이한 다른 세포군에 속하는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
태반은 모체 및 태아 유래의 세포가 혼재되어 있는 특수한 기관으로 태반은 모체 및 태아에서 유래된 세포가 모두 존재하며, 통상 영양막은 모체 기원인 것으로 융모는 태아 유래인 것으로 알려져 있다. 이에 따라 실시예 1 에서 수득한 CV1 와 비교예 1의 세포들의 세포 기원을 확인하기 위한 실험을 수행하였으며, 임상에 많이 적용되는 것으로 알려진 P5 에서 수득한 세포를 슬라이드에 도말하고 여기에 Cy3 (red) 및 fluorescein isothiocyanate (green) 로 각각 라벨링 된 X 및 Y 염색체 probe를 사용하여 염색 하였다 (Vysis, Downers Grove, IL, USA). 슬라이드 분석은 세포 핵에 DAPI 를 염색한 후, X1000 배율 하에 스펙트럼 red 및 green 필터를 이용하여 확인한 후, 세포에 발현되는 X, Y 염색체를 카운트하여 세포 기원을 확인하여 결과를 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure 112019095836612-pat00005
표 5에 나타낸 바와 같이, Pla 의 경우 초기 passage 에서는 XX와 XY가 혼재될 수 있으나, P5 에서는 100% XX 이거나 100% XY 가 나타나는 것을 확인하였고, CV와 CV1의 경우 XY 인 것을 확인하였다. 반면 CV2는 P5 에서 100% XX 세포 기원인 것을 확인하였다.
즉 표 5에 나타낸 바와 같이 CV1 세포는 모체가 아닌 태아 유래의 세포 염색체 형을 나타낸 반면, CV2 는 모체 유래의 염색체 형을 나타내어 상호 상이한 기원을 가진 줄기세포임을 확인하였다.
실시예 6: 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1의 연골세포 분화능 확인
상기 실시예 1에서 수득한 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1의 연골세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 연골세포 분화 유도 배지(0.1μM 덱사메타손, 50㎍/㎖ 아스코르브산, 40㎍/㎖ L-프롤린, 10ng/㎖ TGF-β3, 500ng/㎖ BMP-6, 50mg/ml ITS premix가 포함된 DMEM 배지)에서 3주 동안 배양하여 연골세포로의 분화를 유도하였다. 상기 줄기세포의 연골세포로의 분화 정도를 측정하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 Safranin-O 염색 및 Type II 콜라겐을 이용한 면역화학염색법을 수행하였다. 또한 3주 동안 배양 후, Glycan sulfated GAG assay kit (Biocolor Ltd., Carrickfergus, County Antrim, UK)를 사용하여 Sulfated glycosaminoglycan (GAG) 함량을 측정 하였다. 흡광도는 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 파장 656 nm에서 96-웰 플레이트에서 측정 하였고 결과를 도 5 에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 CV1 줄기세포는 CV 와 CV2 에 비해 우수한 연골세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 7: 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1 의 골세포로의 분화능 확인
상기 실시예 1에서 수득한 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1 줄기세포의 골세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 골세포 분화 유도 배지(10% FBS, 1% anti-biotics, 100μM 덱사메타손, 50mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10μM β-글리크로포스페이트, 250μM 아스코르브산이 포함된 DMEM 배지)에서 4주 동안 배양하여 골세포로의 분화를 유도하였다. 이때, 분화유도 시작 후 2주가 경과한 시점에서는 종래 공지된 방법에 따라 ALP(Alkaline phosphate) 염색법으로 염색하였고, 4주가 경과한 시점에서는 종래 공지된 방법에 따라 Alizarin red S 염색법으로 염색함으로써, 골세포로의 분화 정도를 분석하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체 및 다른 태반 세부조직 유래 줄기세포의 골세포로의 분화능을 4주가 경과한 시점에서 세포내 칼슘 측정을 하기 위해 24시간동안 0.6M HCl 을 처리하여 37℃ 에서 보관 후, o-cresolphthalein complexone method (Pointe Scientific, Canton, MI, USA )를 이용하여 565nm 에서 흡광도를 측정 후 칼슘농도를 표준화하고 정량화하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1 은 CV 와 CV2 에 비해 골세포로 분화될 수 있는 우수한 골세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 8: 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1 의 지방세포로의 분화능 확인
실시예 1에서 수득한 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 확인하기 위하여, 줄기세포를 공지된 지방세포 분화 유도 배지 1(10% FBS, 1% Anti-biotics, 1μM 덱사메타손, 20μM 인도메타신, 10 μM 인슐린, 50μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)가 포함된 DMEM 배지) 및 지방세포 분화 유도 배지 2(10% FBS, 1% Anti-biotics, 10μM 인슐린이 포함된 DMEM 배지)를 3~4일씩 교대로 가하여 3주 동안 배양하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 상기 줄기세포의 지방세포로의 분화 정도를 측정하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 Oil red O 염색을 수행하였다. 또한, 동일한 방법으로 상기 비교예 1에서 수득한 태반 전체, 다른 태반 세부조직 유래 및 타 조직 유래 줄기세포의 지방세포로의 분화능을 100% 이소프로판올 용액을 처리하여 지질을 용해시켜 500 nm에서의 흡광도를 측정하였고 그 결과를 도 7 에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 CV1 줄기세포는 CV 와 CV2 에 비해 우수한 우수한 지방세포 분화능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 9: 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1 의 관절염 동물모델에서 세포 치료제로서의 효과 검증
상기 실시예 1에서 수득한 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1 으로부터 유래된 줄기세포의 연골 손상 동물모델에서 세포 치료제로서의 효과를 검증하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로, wistar 래트(rat, male, 12주령)에 관절염 동물모델을 제작하기 위하여, 건강한 래트를 선택하여 체중에 따른 적절한 양의 케타민과 럼푼으로 주사마취 한 후, 래트가 충분히 전신마취가 되었음을 확인하고, 양쪽 하지의 슬관절 부위를 면도한 후, 자세를 유지시키면서 반창고로 고정하였다. 양측 슬관절 부위를 포비돈으로 소독하고, 슬개골을 촉지하여 위치를 확인한 후, 슬관절의 위, 아래, 슬개골의 내측을 지나는 절개선을 따라 방정중 접근(paramedian approach)으로 슬관절 내에 도달하고, 슬개골을 외측으로 젖히면서 슬관절을 굴곡시켜 관절 내부를 관찰하였다. 특이한 병적 소견이 없음을 확인한 후, 반월상 연골판에 손상을 주어 destabilization of the medial meniscus (DMM) 모델을 만들었다. 상기와 같이 손상을 유발한지 8주 후에, 주사기를 이용하여 CV1 줄기세포현탁액 1ml 를 히알루론산 5% 및 플루로닉 10% 와 혼합한 후 20㎕를 상기 동물 모델의 관절강으로 주입하였다. 래트가 마취에서 깨어나는 것을 확인한 후 자유롭게 움직일 수 있도록 허용하였으며, 수술 후 3일간 감염을 막기 위해 진통제와 항생제를 투여하였다. 투여 후 8주와 12주가 경과한 후, 각 래트로부터 손상 및 치료를 수행하였던 관절 부위의 절편을 얻어 H&E 염색과 Safranin O 염색을 수행하였으며, OARSI score를 이용한 정량화를 통해 새로 형성된 연골 재생 정도를 분석하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 각각 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, CV1 줄기세포를 주입하고 8주와 12주 후에 saline 을 주입한 대조군에 비해 연골 표면이 부드럽고, 연골 손상이 거의 없이 재생되는 것을 확인하였다.
또한 도 9에 나타낸 바와 같이, OARSI score 결과에서는 8주 후 대조군(8.6±0.5)에 비해 CV1 줄기세포를 주입한 군(3.8±0.8)에서 낮은 score 를 보였고, 16주에서도 대조군(9.6±0.5)에 비해 CV1 줄기세포를 주입한 군(3.0±0.7)에서 낮은 score 를 보였다. 따라서 CV1 줄기세포는 관절염 진행과정에서 더 이상 관절염이 진행되지 않도록 연골을 보호 및 재생시켜 주는 역할을 하는 것으로 나타나는 것을 알 수 있었다.
이상의 실험 결과를 통하여, 종래의 태반 전체로부터 유래한 줄기세포가 다양한 특성을 가지는 세부조직으로부터 유래된 줄기세포가 혼합되어 있어 서로 다른 세포로 분화하는 능력이 균일하게 나타나지 않는데 반해, 본 발명에 따른 태반의 세부조직인 융모막판 인접 융모로부터 유래된 줄기세포 CV1 줄기세포는 우수한 분화능과 기타 줄기세포의 여러 특성에 대한 균질성의 측면에서 볼 때, 종래의 태반 전체 유래 줄기세포에 비하여 우수한 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명에 따른 CV1 줄기세포는 다른 태반 세부조직 유래 줄기세포보다 성장, 증식, 형태 및 분화의 특성에서 일관된 양상을 보여 주었고, 가장 우수한 줄기세포의 특성을 보여주었다. 따라서 상기 CV1 줄기세포를 이용할 경우 목적하는 세포로의 분화 효율을 향상시킬 수 있으며, 다양한 질환에서 세포치료제로 유용하게 이용할 수 있음을 확인하였다.

Claims (16)

  1. 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직 유래 줄기세포로, 상기 융모막판 인접 융모는 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위이고, 융모 기저부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 융모막판 인접 융모 조직 유래 줄기세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 CD273, CD275 또는 CD321 에 대하여 음성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 CD44, CD73, CD90, CD105, CD49e, CD140b, CD142 에 대하여 양성, 및 CD31, CD34, CD45, CD273, CD275, CD321, HLA-DR 에 대하여 음성의 표면인자 마커 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 태아 세포 기원 (cell origin) 의 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는
    1) 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위를 절단하여 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 를 얻는 단계; 및
    2) 융모막판 인접 융모로부터 줄기세포를 수득하는 단계; 를 통해 수득되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
  6. 1) 전체 융모 중 융모막판 인접 부위에서부터, 융모막판 인접 부위로부터 융모 말단까지 거리의 1/3 지점까지인 부위인 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 조직을 얻는 단계; 및
    2) 융모막판 인접 융모로부터 줄기세포를 수득하는 단계; 를 포함하는 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 유래 줄기세포의 분리 수득 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 융모막판 인접 융모로부터 수득된 줄기세포는 CD273, CD275 또는 CD321 에 대하여 음성의 표면인자 발현 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 융모막판 인접 융모 (villi adjacent to chorionic plate, VCP) 유래 줄기세포의 분리 수득 방법.
  8. 제1항의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 세포치료제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조직은 지방, 연골, 골, 신경, 인대 및 건으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 조직 재생용 세포 치료제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 연골은 유리연골, 섬유연골 또는 탄성연골인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 세포 치료제.
  11. 제9항에 있어서, 상기 연골은 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 관연골, 후두연골 및 척추 연골로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 세포 치료제.
  12. 제8항에 있어서, 상기 세포치료제는 골 결손, 건-인대 결손, 지방조직 결손, 연골 괴사, 골연골염, 연골파열, 연골외상, 관절염, 연골결핍 또는 선천성 기관연화 치료용인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 세포치료제.
  13. 제8항에 있어서, 상기 조직재생용 세포 치료제는 주사제인 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 세포 치료제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조직 재생용 세포 치료제는 하이드로겔을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 세포 치료제.
  15. 제14항에 있어서, 상기 하이드로겔은 소장점막하 조직, 히알루론산(hyalurinic acid), 카복시메틸셀룰로오스(CMC, carboxymethylcellulose), 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(poly(N-isopropylacrylamide)), β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 플루로닉(Poly(ethylene oxide)poly(propylene oxide)poly(ethyleneoxide), Pluronic), 피브린, 폴리에틸렌옥사이드 및 카복시메틸셀룰로오스(CMC)와 폴리에틸렌이민(PEI)의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 조직 재생용 세포 치료제.
  16. 제1항의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물.
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