DE60208042T2

DE60208042T2 - Zusammensetzung zur behandlung von schäden des gelenkknorpels

Info

Publication number: DE60208042T2
Application number: DE60208042T
Authority: DE
Inventors: Chul-Won Ha; Yoon-Sun Yang; Sung-Eun Kangnam-ku YANG
Original assignee: Medipost Co Ltd
Current assignee: Medipost Co Ltd
Priority date: 2001-08-14
Filing date: 2002-08-14
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2022-08-15
Also published as: US20090022698A1; EP1416944A1; CN1272022C; US7459307B2; JP2012107026A; EP1416944A4; US20090047261A1; US20040151703A1; ATE312615T1; JP2005501101A; KR20030015160A; EP1416944B1; KR100494265B1; DE60208042D1; CN1543353A; WO2003015802A1; JP4959916B2; US20090060885A1; JP5597817B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden oder Knorpelverlust oder Knorpeldefekt.
Beschreibung des Standes der Technik
Der artikuläre Knorpelschaden führt zu Schmerzen in der artikulären Region, Fehler in der artikulären Bewegung, usw., und senkt die Lebensqualität sowie die Produktivität. Es ist insbesondere schwierig, den artikulären Knorpelschaden vollständig zu behandeln, da die natürliche Heilkraft sehr gering ist und der Knorpelschaden mit Schäden des gesamten Gelenks verbunden ist, weil er kontinuierlich fortschreitet, wenn er einmal eingesetzt hat.
Bisher entwickelte Methoden zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden umfassen Chondroplastik, Osteochondrale Transplantation, Autologe Chondrozytentransplantation, usw.
Chrondroplastik ist die am häufigsten verwendete Methode der oben aufgeführten Methoden. Die arthroskopische Operation, welche die repräsentative Methode ist, ist eine Methode, in der Diagnose und Operation gleichzeitig durchführt werden können, während das Innere des Gelenks auf einem Fernsehmonitor durch das Einführen eines Arthroskops, auf dem eine kleine Kamera montiert ist, in den Gelenkhohlraum durch ein kleines Loch von weniger als 1 cm, vergrößert und beobachtet wird.
Die oben genannte Methode ist vorteilhaft, weil es möglich ist, den Schmerz und die Belastung des Patienten zu reduzieren, da ein direkter Schnitt des Gelenkes nicht nötig ist, und es sofort geheilt werden kann, nachdem geringfügige Gewebeschäden durch das Arthroskop beobachtet werden. Allerdings ist diese Chrondroplastik nicht zufriedenstellend effektiv in Bezug auf die funktionellen Aspekte, weil größtenteils Faserknorpel, anstatt Hyalinknorpel, der eigentlich für die Gelenke erforderlich ist, produziert wird.
Währenddessen ist osteochondrale Transplantation ein Verfahren, Hyalinknorpel herzustellen, indem sowohl Knorpel wie auch die subkartilaginären Anteile, die schon in den normalen Teilen des Patienten produziert wurden, gesammelt werden und durch richtige Öffnungen in den geschädigten Teil des artikulären Knorpels transplantiert werden. Dieses Verfahren ist bei einigen Patienten erfolgreich gewesen. Allerdings kann nicht gesagt werden, daß dieses Verfahren eine perfekte Behandlungsmethode ist, weil es ein Problem mit Rissen zwischen den transplantierten Teilen und dem ursprünglichen Gewebe gibt und es kein allgemein anwendbares Verfahren ist, da es nur bei Patienten angewandt werden kann, bei denen die autologe Transplantation möglich ist. Außerdem darf mittels dieser Methode nicht operiert werden, wenn der geschädigte Anteil groß ist, da der gespendete Anteil limitiert ist und es wahrscheinlich ist, dass Komplikation im gespendeten Anteil auftreten. Zusätzlich ist der Ablauf der Operation vergleichsweise kompliziert und es ist manchmal nicht möglich arthroskopische Operation durchzuführen. In anderen Worten hat das oben genannte Verfahren Schwächen, wie beispielsweise neue Schmerzen im gespendeten Teil und kann zu Komplikationen führen, wie eine langsame Rehabilitation mit Schmerzen, Brüchen, Blutungen und Narben nach der Operation.
Autologe Chondrozytentransplantation ist eine seit kurzem angewandte Methode, den Teil des Knorpels, der durch die Vermehrung dieser Zellen beschädigt wurde, aufzufüllen, indem Chondrozyten aus Knorpelgewebe, das aus dem normalen Teil des Patienten gesammelt wurde, soweit wie notwendig extern kultiviert und gezüchtet werden, ein Platz mit Periosteum gesichert wird und diese zusammen mit Kulturmedium in den geschädigten Teil des Knorpels injiziert werden.
Verglichen mit der Osteochondralen Transplantationsmethode, in der bereits produziertes Knorpelgewebe in den geschädigten Teil injiziert wird, ist hier die Wahrscheinlichkeit, Hyalinknorpel zu reproduzieren, größer, da der transplantierte Teil vergleichsweise gut mit dem normalen Teil verschmilzt, weil der geschädigte Teil mit transplantierten Chondrozyten gefüllt wird, die direkt in dem geschädigten Teil vermehrt werden. Allerdings gibt es noch Schmerzen, Nachwirkungen und wirtschaftliche Belastungen für den Patienten, aufgrund der zweifachen Operation und der Operationsablauf ist auch kompliziert und schwierig, weil es notwendig ist, die Operation durchzuführen, um Chondrozyten zu sammeln und während der Transplantation werden die extern gezüchteten in den geschädigten Teil des Knorpels transplantiert.
Zusätzlich gibt es Probleme mit Chondrozyten, da es eine beachtliche Zeit braucht, um die für die Transplantation benötigte Anzahl an Zellen aus der externen Züchtung zu gewinnen, da die Vermehrung und der Wachstum der gesammelten Zellen nicht aktiv ist, weil die gesammelten Chondrozyten in den meisten Fällen von ausgewachsenen Erwachsenen gewonnen werden; die Behandlung selbst könnte nicht erreicht werden, wenn die Zellen die Fähigkeit zur Vermehren völlig verlieren; und die Expressionsform der Zellen ist verändert, weil die Chrondrozyten extern gezüchtet werden. Es ist auch bedenklich, dass die Lebensdauer von Knorpel, der aus ausgewachsenen Zellen gezüchtet wurde, nicht lang wäre. Und, im Falle der zweiten Operation, sind Komplikationen wie Schmerzen, Narben, usw., nach der Operation unvermeidlich, weil es notwendig ist, einen beträchtlichen Schnitt zu machen, da keine arthroskopischen Operationsmethoden bis jetzt entwickelt wurden.
Es ist berichtet worden, dass es eine Methode gibt, mesenchymale Stammzellen (MSCs), welche Vorläuferzellen der Chondrozyten und Osteoblasten sind, aus mesenchymalem Gewebe, wie autologes Knochenmark, Muskeln, Haut, usw., zu gewinnen, diese ex vivo zu vermehren, und zusammen mit Polymeren in den geschädigten Teil des Gelenkknorpels zu injizieren.
Es ist gezeigt worden, dass die Fähigkeit der Zellen sich zu Vermehren in der oben beschriebenen Methode Knorpelschäden zu behandeln, indem mesenchymale Stammzellen aus Erwachsenen Individuen gewonnen werden, etwas besser ist als bei der autologen Chondrozytentransplantation, weil mehr undifferenzierte Zellen gewonnen werden und ex vivo gezüchtet werden. Allerdings zeigt die oben beschriebene Methode immer noch eine schwache Fähigkeit, Zellen zur Behandlung von verschiedenen Arten von Knorpelschäden vollständig zu vermehren. Außerdem ist für die oben beschriebene Methode ein schwieriges Verfahren zur Gewinnung von Knochenmark notwendig und ist eingeschränkt weil der Bau einer Infrastruktur, wie Banken zur Aufbewahrung von Knochenmark, schwach ist.
Wie oben beschrieben, sind die bist jetzt entwickelten Methoden zur Behandlung von Gelenkknorpelschäden problematisch in Bezug auf ihre chirurgischen Verfahren und Wirkungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden oder Verlust oder Defekt bereitzustellen, die aus zellulären Komponenten, die aus Nabelschnurblut abgetrennt, vermehrt und/oder differenziert wurden und biokompatiblen Polymeren besteht, die durch relativ einfache Verfahren zu einer besseren Wirkung in der Behandlung von artikulärem Knorpelschaden führt.
Die Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung ist dadurch charakterisiert, dass sie aus zellulären Komponenten, die aus Nabelschnurblut abgetrennt, vermehrt und/oder differenziert wurden, deren Kulturmedien und biokompatiblen Polymeren, zusammengesetzt ist.
Die zellulären Komponenten der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegende Erfindung sind eine oder mehrere zelluläre Komponente(n), wie aus Nabelschnurblut gewonnene oder kultivierte abgeleitete mesenchymale Stammzellen und/oder mesenchymale Stammzellen/Vorläuferzellen, Vorläuferzellen, die aus oben genannten mesenchymalen Stammzellen und/oder mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen differenziert wurden, Chondrozyten und/oder Osteozyten, die aus genannten aus Nabelschnurblut gewonnenen mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen differenziert wurden.
In der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung, wird das Nabelschnurblut, welches das Ursprungsgewebe der zellulären Komponenten ist, als das Blut definiert, das aus der Nabelschnur, welches die Plazenta und den Fötus verbindet, gewonnen wird.
Von den zellulären Komponenten der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung, können aus Nabelschnurblut gewonnene mesenchymale Stammzellen unter den richtigen Bedingungen für die Differenzierung zu mesenchymalem Gewebe, wie Knochen, Knorpel, Fettgewebe, Muskeln, Sehnen, usw., differenziert werden da sie, im Gegensatz zu den typischen Stromazellen des Knochenmarks, multipotent sind. Außerdem können mesenchymale Stammzellen aus Nabelschnurblut unter den richtigen Bedingungen vermehrt werden, ohne dass sie als spezielle Zellen oder Gewebe differenziert sind, da sie die Fähigkeit haben, sich selbst zu erneuern.
Die zellulären Komponenten der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung umfassen Vorläufer aller Zellen, die aus mensenchymalen Stammzellen des Nabelschnurblutes stammen, die durch Verfahren zur Differenzierung von mensenchymalen Stammzellen aus Nabelschnurblut zu Chondrozyten oder Osteozyten, Chondroblasten, Osteoblasten, usw., gewonnen werden können.
Die zellulären Komponenten der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung können eine bessere Fähigkeit haben, sich zu vermehren und zu differenzieren, da sie Zellen sind die, im Vergleich zu Zellen, die aus Zellen stammen, die mensenchymale Stammzellen aus Geweben von Erwachsenen wie beispielsweise Knochenmark, Muskeln, Haut, usw., umfassen, aus jüngeren Zellen stammen.
Es ist viel einfacher, bei der Sammlung und Gewinnung von Ursprungsgeweben der zellulären Komponenten der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung, die zellulären Komponenten zu sammeln, als Zellen aus Geweben von Erwachsenen, wie beispielsweise Knochenmark, usw., zu gewinnen, da dieses chirurgische Verfahren erfordert.
Darüber hinaus ist es einfacher, einen Spender für Nabelschnurblut zu finden, da die Lagerung und Aufbewahrung von Nabelschnurblut bei der Geburt ausführbarer ist und das gelagerte Blut nach dem Auftauen einfach verwendet werden kann. Eine routinemäßige Lagerung von Knochenmark, die sich mit der von Nabelschnurblut vergleichen lässt, ist unmöglich.
Da die zellulären Komponenten der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung Zellen sind, in denen das Histokompatibilitätsantigen HLA-DR (Klasse II), das die Hauptursache für Abstossungsreaktionen in der Interpolation oder Organtransplantation ist, nicht exprimiert wird, kann sowohl autologes Nabelschnurblut wie auch allogenes Nabelschnurblut verwendet werden, wodurch es möglich ist, Immunreaktionen wie beispielsweise Abstossungsreaktion, usw., die bei konventionellen Transplantationsoperationen Probleme bereiten, zu verhindern oder zu minimieren.
Das Kulturmedium der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung dient der Suspension der zellulären Komponenten. Allgemein verwendete Zellkulturmedien wie beispielsweise „McCoys 5A media (Gibco)", „Eagle's base media", „CMRL media", „Glasgow minimum essential media", „Ham's F-12 media", Iscove's modified Dulbecco's media", „Liebovitz' L-15 media", „RPMI 1640 media", usw., können verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung können, bei Bedarf, ein oder mehrere sekundäre Komponenten dem Kulturmedium hinzugefügt werden. Das heißt, dass ein oder mehrere Komponenten ausgewählt aus fötalem Serum vom Kalb, Pferd, Menschen, usw.; Antibiotika wie beispielsweise Penicillin G, Gentamycin, Streptomycin sulfat, usw. zur Vorbeugung gegen Kontamination durch Mikroorganismen; Antimykotika wie beispielsweise Amphotericin B, Nystatin, usw.; verwendet werden können.
Biokompatible Polymere der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine oder mehrere der Eigenschaften ausgewählt aus der Biokompatibilität, der Biodegradation und der Fähigkeit, die Zellernährung anzureichern und der Fähigkeit, die Bildung von intrazellulärem Substrat zu fördern, aufweisen. Biokompatible Polymere der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung haben eine halbfeste oder gelähnliche Eigenschaft in einem Maße, das dem von Salben oder Pasten ähnelt, wie auch die mechanische Festigkeit und Flexibilität in dem für die zelluläre Transplantation und Regeneration von Knorpelgeweben oder Knochen angemessenen Ausmaß.
Dementsprechend kann die Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung die Proliferation und die Differenzierung von Chondrozyten, die zusammen transplantiert werden, beschleunigen da sie sich ständig an der geschädigten Stelle befindet, weil sie nach der Transplantation eine konstante Form beibehält. Diese Form ist für die Operation praktisch, da sie sich leicht verändern lässt, um sich an die unterschiedliche 3-dimensionale Geometrie der geschädigten Knorpelregion anzupassen.
Biokompatible Polymere, die in der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können ein oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus natürlichen Polymeren, wie beispielsweise Proteinen, Polysacchariden, usw.; synthetischen Polymeren umfassend Hydroxysäuren und ihre Derivate; und organischen Polymeren, die gemäß ihrer chemischen Bindung ein 3-dimensionales Gerüst oder Gitter bilden und ihren Derivaten und transformierten Verbindungen, sein. Zum Beispiel umfassen die Proteine unter den natürlichen Polymere Fibrin, Gelatine und Kollagen; die Saccharide unter den natürlichen Polymeren umfassen Hyaluronsäure, usw.; synthetische Polymere umfassen Polyphosphazen, Polyacrylat, Polymilchsäure und Polyglykolsäure; und die organischen Polymere umfassen Pluronsäure, Alginsäure und dessen Salze, usw.
Es ist möglich, die mechanische Festigkeit und Flexibilität der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung zu fördern, indem Chitosanfaser hinzugefügt werden.
Wenn ein Polymer in der vorliegenden Erfindung einzeln verwendet wird, ist es möglich, dessen Konzentration an dessen Molekulargewicht und Eigenschaften anzupassen. Die Endkonzentration von Pluronsäure, wenn sie alleine verwendet wird, ist 30%, nachdem sie mit Zellen vermischt wurde, und die Endkonzentration von Hyaluronsäure ist vorzugsweise 3–4%, nachdem sie mit Zellen vermischt wurde, wenn sie alleine verwendet wird.
Wenn mehrere Polymere in der vorliegenden Erfindung als Mischung verwendet werden, sollten sie vorzugsweise so durch Mischen hergestellt werden, dass die Endkonzentration von Pluronsäure nachdem es mit den Zellen vermischt wurde 15–30% beträgt, und die Endkonzentration von Hyaluronsäure 2–4% beträgt.
Wenn Chitosanfaser in der vorliegenden Erfindung zu der Polymermischung der oben genannten Pluronsäure und Hyaluronsäure hinzugefügt werden, sollten vorzugsweise die gleichen Mengen Chitosanfaser zu der oben genannten Polymermischung hinzugefügt und mit der Polymermischung vermischt werden.
Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden und Methoden zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden werden unten aufgeführt.
Das Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung umfaßt die Schritte der Gewinnung von Nabelschnurblut; Abtrennung, Vermehrung und/oder Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Nabelschnurblut; und Mischung dieser mesenchymalen Stammzellen mit Polymeren. Im Folgenden wird jeder Schritt detailliert beschrieben:
Im Schritt der Gewinnung des Nabelschnurblutes wird das Nabelschnurblut, im Fall einer normalen vaginalen Entbindung, aus der Nabelvene, die vollständig extern extrahiert wird, während die Plazenta nach der Entbindung in der Gebärmutter bleibt, und im Fall eines Kaiserschnitts, aus der Nabelvene, wenn die Plazenta nach der Entbindung vollständig aus der Gebärmutter entfernt wurde, gesammelt.
Während der Gewinnung des Nabelschnurblutes aus der Nabelvene, die nach der Entbindung gemäß der vorliegenden Erfindung vollständig außerhalb der Gebärmutter extrahiert ist, wird es, nachdem das Kind geboren wurde, auf sterile Art aus der Nabelvene gesammelt, die die Plazenta mit dem Fötus verbindet, wobei beide Verfahren zur Gewinnung des Nabelschnurblutes, sowohl vor Entfernen der Plazenta, wie auch extern nach Entfernen der Plazenta, verwendet werden können. Nachdem die Nabelvene gesichert wurde, wird das Nabelschnurblut mittels einer Nadel in einem Beutel, das ein Antikoagulans enthält, gesammelt.
Alle Verfahren aus dem Stand Technik, einschließlich dem in der Koreanischen Patentanmeldung Nummer 10-2002-0008639 und denen in Pittinger MF, Mackay AM, et al., Science 1999; 284: 143–7, Lazarus HM, Haynesworth SE, et al., Bone Marrow Transplant 1995; 16: 557–64 können im Verfahren zur Abtrennung und Vermehrung von mesenchymalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut, die wie oben beschriebenen gewonnen wurden, verwendet werden. Unter diesen wird ein Beispiel wie folgt beschrieben:
Mononukleare Zellen werden durch Zentrifugationstrennung des Nabelschnurblutes abgetrennt und mehrmals gewaschen, um Fremdkörper zu entfernen. Wenn sie nach dem waschen ausplattiert und in einer Kulturschale und/oder Flasche und/oder einem anderen Behälter kultiviert werden, vermehren sich die Zellen und bilden eine einzelne Schicht. Davon sind die mensenchymalen Zellen und/oder Stammzellen/Vorläuferzellen diejenigen, deren Form bei Betrachtung durch ein inverses Mikroskop homogen ist und die sich als Kolonien langer spindelförmiger Zellen vermehren. Danach, wenn die Zellen so weit gewachsen sind, dass sie zusammenfließen, kann eine Subkultur angesetzt werden, damit die Zellen sich so lange vermehren, bis die erforderliche Anzahl von Zellen erreicht ist.
Mesenchymale Stammzellen und Stammzellen/Vorläuferzellen, die aus Nabelschnurblut stammen, können direkt oder nachdem sie das Differenzierungsverfahren abgeschlossen haben, für die Operation eingesetzt werden.
In Bezug auf das Verfahren, das zur Differenzierung der mesenchymalen Stammzellen, die aus Nabelschnurblut stammen, verwendet wird, kann jedes angemessene Verfahren, das zur Gewinnung der gewünschten Zellen gebräuchlich ist, ausgewählt werden (Barry F, Boynton RE, et al., Exp cell Res 2001; 268: 189–200; Jaiswal N, Haynesworth SE, et al., J Cell Biochem 1997; 64: 295–312). Unter diesen wird ein Beispiel wie folgt beschrieben:
Während Zellen aus Nabelschnurblut in angemessenen chondrogenen oder osteogenen Differenzierungsmedien kultiviert werden, wird das Ausmaß der Differenzierung durch Messung der Expression von Enzymen, Analyse des Immunexpressionstyps, histochemische Färbung, histoimmunologische Färbung, molekularbiologische Untersuchung oder Analyse des zellulären Mediums bestätigt. Mesenchymale Stammzellen, die auf diese Art hergestellt wurden, sowie die aus ihnen differenzierten Zellen können direkt für die Operation eingesetzt werden oder gefroren gelagert, bei Bedarf aufgetaut und für die Verwendung nochmals vermehrt werden.
Die Methode, die Zellen des gegenwärtigen Verfahrens gefroren zu halten, wird gemäß der bekannten Methode ausgeführt (Doyle et al., 1995). Das Medium, das zur gefrorenen Haltung verwendet wird, besteht aus 10–20% FBS (Fötalem Rinderserum), 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) und 5–10% Glycerol. Die Zellen werden so suspendiert, dass ungefähr 1 × 10⁶ bis 5 × 10⁶ Zellen in 1 ml des oben beschriebenen Mediums vorhanden sind.
Die genannte Zellsuspension wird zum Einfrieren bei niedriger Temperatur in Glas- oder Plastikampullen verteilt, versiegelt und in ein programmgesteuertes Einfriergerät, dessen Temperatur vorher eingestellt wurde, getan. Es ist vorzuziehen, ein Programm zu verwenden, das eine Temperaturänderung von –1°C/min ermöglicht, wenn Zellen eingefroren werden, da die Schädigung der Zellen, wenn sie danach auftauen, so reduziert wird. Sobald die Temperatur der Ampullen –180°C erreicht, werden sie in einen Lagerungstank mit flüssigem Stickstoff übertragen. Die gefroren gehaltenen Zellen können einige Jahre gelagert werden. Ob die Entwicklungsfähigkeit der Zellen erhalten ist, sollte in Abständen, mindestens aber alle fünf Jahre, überprüft werden. Wenn die gefroren gelagerten Zellen aufgetaut werden, sollten die Ampullen schnell aus dem Tank mit flüssigem Stickstoff in ein Wasserbad, dessen Temperatur auf 37°C eingestellt wurde, überführt werden. Der aufgetaute Inhalt der Ampullen wird sofort in ein Kontainer zur Vermehrung umgesetzt, in dem das Medium mit 10% FBS und 5% ES in einem sterilen Zustand enthalten ist. Die Dichte der Zellen auf dem Kulturmedium wird so eingestellt, dass 3 × 10⁵ bis 6 × 10⁵ Zellen pro ml Medium vorhanden sind. Es wird jeden Tag mit einem inversen Mikroskop überprüft, ob die Zellen sich vermehrt haben. Wenn die richtige Zelldichte erreicht ist, werden die Zellen zur Subkultivierung in neues Medium übertragen.
Die wie oben beschriebenen vermehrten Zellen werden im richtigen Medium suspendiert, oder, nach der Mischung mit Polymeren, direkt in die Region des artikulären Knorpelschadens transplantiert. Es kann, mit anderen Worten, ein Verfahren verwendet werden, um die in Medium suspendieren Zellen, die nicht mit den Polymeren gemischt sind, in einen Raum, der aus angemessenen Biomembranen wie Periosteum, usw., in der Region des artikulären Knorpelschadens, zu injizieren und diesen abzudichten, damit die suspendierten Zellen nicht durch Risse in diesem Periosteum auslaufen und alle aufgeschnittenen Operationsstellen zuzunähen. Alternativ können die oben genannten Zellen mit angemessenen Polymeren vermischt werden und in einer Form, die der einer Salbe oder Paste ähnelt, verwendet werden. Es ist in jedem Fall vorteilhaft eine Endkonzentration von 1 × 10⁶ bis 5 × 10⁷ Zellen in 1 ml der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu haben. Die Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die verwendet wird, kann, je nach Größe des Teilbereichs des artikulären Knorpelschadens, der geheilt werden soll, erhöht oder verringert werden und es ist im Allgemeinen vorteilhaft, im Fall von Kniegelenken bei Erwachsenen, die eine Größe von 2 cm² haben, ungefähr 2 ml zu verwenden.
Beim Verfahren zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden durch die Verwendung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird der Anteil des artikulären Knorpels, der operiert werden soll, beobachtet, vorzugsweise durch eine arthroskopische Operation, der geschädigte Anteil wird vorbereitet um die Operation zu erleichtern und die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird der geschädigten Stelle zugeführt und es wird, vorzugsweise durch ein Arthroskop, bestätigt, daß sie stabil positioniert ist. Die Form der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann so formuliert werden, daß sie in den geschädigten Anteil hineinpaßt, bevor sie auf die Läsion aufgetragen wird, oder sie kann angepaßt werden, nachdem sie auf den geschädigten Anteil aufgetragen wurde.
Wie oben beschrieben kann das Verfahren zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden durch die Verwendung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Bequemlichkeit der Prozeduren sichern und Schmerzen, Folgekrankheiten und Morbidität eines Patienten reduzieren, da der artikuläre Knorpelschaden durch arthroskopische Operation ausreichend geheilt werden kann, im Gegensatz zu konventionellen Zelltransplantationsverfahren, bei denen mehrere Operationen notwendig sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Das Vorangegangene und andere Gegenstände, Aspekte und Vorteile werden durch die folgende detaillierte Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unter Bezug auf die Zeichnungen besser verstanden werden, in denen:
1a und 1b sind die Diagramme, in denen die Viskosität und Festigkeit eines Polymers, das durch die Mischung von Pluronsäure und Hyaluronsäure und durch die Mischung von Chitosanfasern, Pluronsäure und Hyaluronsäure hergestellt wurde, bestätigt wird;
2a und 2b sind Diagramme, in denen die Ergebnisse der Behandlung eines Anteils von artikulärem Knorpelschaden eines Hasen mit der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gezeigt werden; und
3a und 3b sind Diagramme, in denen der vergrößerte Anteil des Knorpels, der durch die Zusammensetzung der Erfindung neu produziert wurde, gezeigt wird.
Detaillierte Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ausführlicher dargestellt. Der Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung wird, jedoch, nicht durch diese bevorzugte Ausführungsform eingeschränkt und könnte für die menschliche Anwendung geändert werden.
In Bezug auf die Zeichnungen werden in der folgenden bevorzugten Ausführungsform Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden durch die Verwendung des genannten dargestellt.
Erstens, werden zelluläre Komponenten abgetrennt und wie folgt vermehrt, um die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung herzustellen:
Mononukleare Zellen werden durch Zentrifugationstrennung des Nabelschnurblutes abgetrennt und mehrmals gewaschen, um Fremdkörper zu entfernen. Wenn sie nach dem waschen ausplattiert und in einer Kulturschale und/oder Flasche und/oder einem anderen Behälter kultiviert werden, vermehren sich die Zellen und bilden eine einzelne Schicht. Davon sind die mensenchymalen Zellen und/oder Stammzellen/Vorläuferzellen diejenigen, deren Form bei Betrachtung durch ein inverses Mikroskop homogen ist und die sich in Form von Kolonien langer spindelförmiger Zellen vermehren. Danach, wenn die Zellen so weit gewachsen sind, dass sie zusammenfließen, kann eine Subkultur angesetzt werden, damit die Zellen sich so lange Vermehren, bis die erforderliche Anzahl von Zellen erreicht ist.
Mesenchymale Stammzellen und/oder Stammzellen/Vorläuferzellen, die aus Nabelschnurblut wie oben beschrieben gewonnen wurden, werden mit Trypsin behandelt, gewaschen, in ein DMEM Medium suspendiert und so vorbereitet, dass sie in folgenden Schritten mit dem Polymer gemischt werden können.
Zweitens, werden Polymere wie folgt für die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hergestellt und die chemischen, biologischen und/oder mechanischen Eigenschaften der Polymere werden durch die Ausführung von Experimenten, die deren chemische, biologische und/oder mechanische Stärke vorhersagen, bestätigt.
Um die mechanische Festigkeit der Polymere anhand von der Konzentration oder der Zugabe oder der Reduktion von Bestandteilen, die Polymere umfassen, zu bestätigen, wurde ein Polymer mit einer Endkonzentration von 30% Pluronsäure, ein Polymer mit einer Endkonzentration von 4% Hyaluronsäure, ein Polymer mit unterschiedlichen Endkonzentrationen Hyaluronsäure und einer Endkonzentration von 15% Pluronsäure und ein Polymer mit einer Mischung von Hyaluronsäure und Pluronsäure und der gleichen Menge Chitosanfaser, hergestellt, in denen die Endkonzentrationen Hyaluronsäure jeweils 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0% und 4,0% betragen.
Jedes Polymer wird durch die Mischung der genannten Bestandteile hergestellt und es wird ausgewertet, ob jedes die richtigen angemessenen Eigenschaften besitzt.
Das Ergebnis, wie in 1a gezeigt, ist eine relativ hohe mechanische Festigkeit in dem Fall des Polymers, das unterschiedliche Endkonzentrationen Hyaluronsäure und eine Endkonzentration von 15% Pluronsäure enthält. Es wurde aber beobachtet, dass die mechanische Festigkeit geringer ist, wenn die Konzentration von Hyaluronsäure verringert wird. Es wurde insbesondere beobachtet, dass das Polymer an der Wand des Röhrchens herunterfließt, wenn eine Endkonzentration von weniger als 0,5% Hyaluronsäure vorhanden ist, da die mechanische Festigkeit deutlich verringert ist.
Andererseits zeigt das Polymer mit der oben genannten Konzentration an Pluronsäure und Hyaluronsäure und zusätzlich der gleichen Menge Chitosanfaser die Flexibilität, die gut dazu geeignet ist, die Form zu verändern, wenn es auf die geschädigte Region aufgetragen wird, während es seine mechanische Form unabhängig von der Hyaluronsäurekonzentration aufrecht erhält. Das Polymer, das eine Endkonzentration von 30% Pluronsäure enthält, zeigt auch die richtige mechanische Festigkeit und Flexibilität.
Es ist dementsprechend möglich, ein Polymer mit der angemessenen Festigkeit und Flexibilität auszuwählen, um es im richtigen Ausmaß für die Behandlung der Region des Knorpelschadens und seiner gemischten Zusammensetzung zu verwenden.
Drittens, um die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird von den oben hergestellten Polymeren, zum Beispiel, ein Polymer mit einem Endgehalt von 30% Pluronsäure ausgewählt, von dem 0,3 g mit ungefähr 0,9 ml DMEM Medium ausreichend vermischt werden. Danach wird die Zellsuspension aus dem ersten Schritt, worin 1 × 10⁷ Zellen enthalten sind, durch Zentrifugationstrennung konzentriert, der Überstand wird verworfen, und das Polymer, das im zweiten Schritt hergestellt wurde, wird nur dem Zellteil beigefügt. Eine angemessene Menge des Mediums wird dem genannten dann beigefügt, um ein Endvolumen von 1 ml zu erhalten. Die Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden wird also so hergestellt, dass sie 30% (0,3 g) des Polymers und 1 × 10⁷ Zellen in 1 ml Medium enthält. Wenn die Menge größer wird, werden diese im gleichen Verhältnis gemischt.
Viertens, wird der artikuläre Knorpelschaden durch die Verwendung der Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung behandelt.
Um Modelle für artikulären Knorpelschaden zu entwickeln, wird ein gesunder Hase ausgewählt, und angemessene Mengen Ketamin (35 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) werden im Verhältnis zum Körpergewicht intramuskulär injiziert. Nachdem sichergestellt wurde, daß die Anästhesie des Hasen vollkommen ist, werden die Kniegelenke beider Beine rasiert und mit einem Pflaster fixiert, während die Rückenlage beibehalten wird. Beide Kniegelenke werden mit Betadin desinfiziert, ihre Position wird durch Austasten mit den Fingern bestätigt, wonach das Innere des Gelenks beobachtet wird, indem das Innere der Kniegelenke durch eine paramediane Schnittlinie, die durch die oberen und die unteren Teile der Kniegelenke und der Innenseite der Kniescheibe verläuft, und dem Beugen des Knies, während die Kniescheibe zur äußeren Seite gedrückt wird, erreicht wird.
Nachdem sichergestellt wird, das es keine speziellen pathologischen Befunde gibt, wird eine zentralisierte Vertiefung an einer Position 4 mm über dem oberen Ende der zentralen interchondylaren Einschnitts des distalen Femur mit einem spitzzulaufenden Nadelbohrer gemacht, und ein Loch mit einem Durchmesser von 3 mm und einer Tiefe von 3 mm wird um die Narbe mit einem Bohrer gebohrt. Ein Ausstanzer mit einem Durchmesser von 3 mm kann für die gleiche Region verwendet werden und ein Defekt der ganzen Knorpelbreite wird erzeugt. Die geschädigte Region wird nach der oben beschriebenen Induktion des Knorpelschadens 3–4 Monate beobachtet. Und es wird bestätigt, dass die geschädigte Knorpelregion nicht von selbst heilt.
Währenddessen werden 0,25 ml der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die im dritten Schritt hergestellt wurde injiziert und mit einer Spritze in die geschädigte Knorpelregion des Hasen geschoben.
Danach wird die Kniescheibe an ihre ursprüngliche Position zurückgebracht, weiche Gewebe um das Knie werden mit resorbierbaren Nähten repariert, und die Haut wird mit Nähten geschlossen, die nicht resorbierbar sind. Das Bein auf der anderen Seite wird als Kontrollgruppe angesehen, bei dem nur die biologisch abbaubaren Polymere eingesetzt werden.
Nachdem bestätigt wird, dass der Hase nach der Anästhesie wieder zu Bewusstsein kommt, darf er sich frei bewegen und es werden bis zum nächsten Tag Antibiotika verabreicht, um nach der Operation einer Entzündung vorzubeugen. Nach 11 Wochen werden Schnitte der artikulären Knorpelregionen, die beschädigt und behandelt wurden, von jedem Hasen erhalten und auf neu gebildeten Knorpel untersucht. Die Ergebnisse des Vergleichs werden in 2a und 2b gezeigt.
Wie in 2a und 2b gezeigt, ist die gesamte Dicke der reparierten Schichten, die nach dem Auftragen der Zusammensetzung der Erfindung neu gebildet wurden, mehr als doppelt so groß (2b) als wenn nur das Polymer aufgetragen wird (2b).
2a und 2b werden vergrößert und in 3a und 3b gezeigt, um die Eigenschaft des neu gebildeten reparierten Knorpelgewebes zu vergleichen. Wie in 3a und 3b gezeigt, wird Knorpelgewebe, mit fast gleicher Erscheinungsform wie die des ursprünglichen normalen Knorpelgewebes (rechte Seite) neu produziert (linke Seite), wenn die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung aufgetragen wird (3b), obwohl die Zelldichte höher ist als das der normalen Knorpelgewebe. Andererseits ist die Form der Zellen im Vergleich zu der von normalen Zellen grob und die Dichte hat sich als gering herausgestellt, wenn nur das Polymer aufgetragen wird (3a).
Dementsprechend wurde beobachtet, dass die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit hat, mit überlegener Effizienz Knorpelgewebe in der geschädigten Region des artikulären Knorpelgewebes zu produzieren, und artikulären Knorpelschaden effektiv zu behandeln.
Zusammenfassend zeigt die Zusammensetzung zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden der vorliegenden Erfindung ausgezeichnete Effekte in histologischen Aspekten der Behandlung von Knorpelschaden. Im Vergleich zu den konventionellen Behandlungsmethoden für artikulären Knorpelschaden kann die Behandlungsmethode, in der die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, die Zeit, den Aufwand und die Kosten der Behandlung von artikulärem Knorpelschaden verringern, da die betreffende Methode die Wirkung hat, durch die Verwendung von einfachen Verfahren, wie die arthroskopische Operation oder noch einfachere Operationen, den artikulären Knorpelschaden zureichend zu reparieren.
Obwohl die Erfindung anhand einer einzigen bevorzugten Ausführungsform beschrieben wurde, werden Fachleute erkennen, daß die Erfindung mit Abwandlungen im Bereich der angehängten Ansprüche ausgeführt werden kann.

Claims

Zusammensetzung bestehend aus zellulären Komponenten, die aus Nabelschnurblut abgetrennt, vermehrt und/oder differenziert wurden, deren Kulturmedien, und biokompatiblen Polymeren, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten zellulären Komponenten eine oder mehrere zelluläre Komponente(n), die von der Nabelschnur abgeleitete mesenchymale Stammzellen, mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen, Vorläuferzellen, die aus von der Nabelschnur abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen stammen, und Chondrozyten oder Osteozyten die aus besagten mesenchymalen Stammzellen/Vorläuferzellen differenziert wurden, sind.
Die Zusammensetzung von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagte biokompatible Polymere eine oder mehrere der Eigenschaften gehörend zur Biokompatabilität, zum biologischen Abbau, und zur möglichen Fähigkeit zur Förderung der Ernährung der Zellen zu dienen, und zur möglichen Fähigkeit die Bildung von intrazellulärem Substrat zu Fördern, haben.
Die Zusammensetzung von Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagte biokompatible Polymere aus einem oder mehreren Komponenten, ausgewählt aus natürlichen Polymeren wie Proteinen und Polysacchariden; synthetischen Polymeren die Hydroxysäuren oder ihre Derivate umfassen; und organischen Polymeren welche die 3-dimensionale Netzstruktur nach der chemischen Bindung und ihren Derivaten und transformierten Verbindungen bestehen.
Die Zusammensetzung von einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass besagte biokompatible Polymere aus einem oder mehreren Komponenten, ausgewählt aus Fibrin, Gelatine, Kollagen, Hyaluronsäure, Polyphosphazen, Polyacrylat, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Pluronsäure, Alginsäure und dessen Salze in jeder Form und Konfiguration, bestehen.
Die Zusammensetzung von einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten biokompatiblen Polymere diejenigen sind, bei denen eine Form von Chitosan hinzugefügt wird.
Die Zusammensetzung von Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten biokompatiblen Polymere so hergestellt werden, dass der endgültige Gehalt an Pluronsäure, nachdem diese mit den Zellen gemischt wurde, 30% beträgt.
Die Zusammensetzung von Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten biokompatiblen Polymere so hergestellt werden, dass der endgültige Gehalt an Hyaluronsäure, nachdem diese mit den Zellen gemischt wurde, 3–4% beträgt.
Die Zusammensetzung von Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten biokompatiblen Polymere die Mischung ist, die so hergestellt wird, dass der endgültige Gehalt an Pluronsäure, nachdem diese mit den Zellen gemischt wurde, 15–30% beträgt, und der endgültige Gehalt an Hyaluronsäure 2–4% beträgt.
Die Zusammensetzung von Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten biokompatiblen Polymere so hergestellt werden, dass Chitosan zur besagten Mischung aus Pluronsäure und Hyaluronsäure beigefügt wird.
Die Zusammensetzung von einem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass 1 × 10⁶ bis 5 × 10⁷ zelluläre Komponenten in 1 ml von besagter Zusammensetzung endgültig enthalten sind.
Die Zusammensetzung von einem der Ansprüche 1–10 zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung von einer Zusammensetzung von einem der Ansprüche 1–10 für die Herstellung von einem Medikament zur Behandlung von artikulärem Knorpelschaden oder Knorpelverlust oder Knorpeldefekt.