CN105664255B - 一种天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，该方法具体包括将哺乳动物任意软骨联合骨组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞软骨联合骨材料。本发明同时实现对全身任意软骨联合骨组织进行彻底去细胞化处理，更加高效便捷的获得均一性高的脱细胞软骨联合骨材料；本发明在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，本发明可以用于全身任意部位的骨科疾病。
Description
技术领域
本发明属于骨软骨组织修复及其再生技术领域，尤其涉及一种天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料的制备方法。
背景技术
当前，骨关节炎、软骨缺损等疾病是严重威胁着人类健康，而关节软骨修复依然是临床的一大难题。为此，人工生物材料正逐步运用于病人的软骨组织修复。但是，由于生物相容性、降解性、透明软骨难以再生等不足，使得目前仍然没有合适的材料能够真正替代健康的软骨组织，实现其原有的生理功能需求。此外，软骨的损伤往往引起软骨下骨的损伤及退变，骨软骨病变在临床上十分常见，限制了关节的活动并且带给病人难以忍受的痛苦。而目前对于同时修复软骨联合骨的生物材料还基本无报道
天然组织来源的细胞外基质(ECM)含有正常组织或器官细胞所需的各种生化因子，具有天然宏观及超微三维的立体结构，并且拥有天然组织的生物力学性能。目前，运用动物(牛、猪)和异体人来源的脱细胞软骨用于修复动物关节断骨缺损有一定的研究报道。然而，目前还未有人报道采用骨联合软骨的脱细胞材料来修复软骨或软骨联合骨的病变。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出了一种天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料的制备方法。本发明同时对软骨联合骨组织上的软骨细胞和骨细胞进行完全去细胞化处理，且条件温和、无ECM损害、快速稳定。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：天然组织来源的脱细胞软骨联合骨材料的制备方法，将哺乳动物任意软骨联合骨组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞软骨联合骨材料。
哺乳动物任意软骨联合骨组织为四肢长骨关节软骨联合骨组织。
含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液摩尔浓度为1％-5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
有机溶剂溶液为等体积比的氯仿和甲醇溶液、摩尔浓度10％-100％的丙酮溶液或摩尔浓度30％-70％的乙醇溶液；
含Triton X的PBS缓冲液为浓度1％-10％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液；
含SDS的PBS缓冲液为摩尔浓度0.5％-10％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-20mmol/L的Tris；
含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.01-0.5mg/ml；
上述天然组织来源的软骨联合骨材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取哺乳动物全身任意软骨联合骨组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、毛发和韧带；
(2)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床150rpm震荡8-24小时；
(3)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床150rpm震荡脱脂2-12小时；
(4)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡3-72小时；
(5)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡2-96小时；
(6)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床150rpm震荡1-12小时；
(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床150rpm震荡72小时，即得天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料。
混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1；步骤(4)-(6)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1。
步骤(2)-(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。
上述制备方法得到的天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料。
针对目前用于软骨和软骨联合骨修复和再生的骨材料及其制备方法存在的问题，发明人建立了一种天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，该法将哺乳动物任意软骨联合骨组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得软骨联合骨脱细胞材料。本发明能同时对软骨联合骨组织上的软骨细胞和骨细胞进行完全去细胞化处理，且条件温和、无ECM损害、快速稳定，所得软骨联合骨材料具有生物相容性好、可塑性强、生物力学强度高等优点，可用于修复临床上各类病因造成的软骨缺损和骨关节炎等软骨和软骨联合骨再生、修复障碍。
相对于现有技术，本发明的显著进步在于：
(1)本发明运用一种脱细胞方案即可同时实现对全身任意软骨联合骨组织进行彻底去细胞化处理，更加高效便捷的获得均一性高的脱细胞软骨联合骨材料。
(2)本发明在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常软骨和骨组织的成分和结构。
(3)本发明可以为病人订制具有个体化、可供移植的软骨及软骨联合骨脱细胞材料，并且高效制备脱细胞材料可满足临床上复杂多样的软骨和软骨联合骨修复填补需求，也可以将其研磨制成粉末，将正常自身软骨和软骨联合骨组织中所含有的生化因子溶解，用于全身任意部位的骨科疾病。
附图说明
图1是本发明的软骨联合骨材料大体外观图；
图2是软骨联合骨脱细胞材料的HE染色无细胞及无细胞核成分残留图；
图3是软骨联合骨脱细胞材料的DAPI染色无细胞及无细胞核成分残留图；
图4是软骨联合骨脱细胞材料DNA定量检测几乎不含有DNA成分图；
图5是软骨联合骨脱细胞材料的胶原定量检测保留大量胶原成分图；
图6是软骨联合骨脱细胞材料的天狼星红染色胶原定性检测保留大量胶原成分图；
图7是软骨联合骨脱细胞材料扫描电镜检测软骨和骨细胞外基质排布和空间立体结构完整保留图；
图8是CCK-8检测软骨联合骨脱细胞材料无细胞毒性；
图9是软骨联合骨脱细胞材料修复兔子关节软骨联合骨缺损的12周修复效果图(H&E染色)；
图10软骨联合骨脱细胞材料修复兔子关节软骨联合骨缺损的12周修复效果图(番红固绿染色)。
具体实施方式
实施例1脱细胞松软骨联合骨材料的制备和研究
(1)取猪股骨头软骨联合骨，转移至4℃环境中，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、毛发和韧带等组织；取材大小视临床实际手术需要而定,通常大小为1cm*0.5cm*1cm。
(2)在1000ml摩尔浓度为1％含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml)中，恒温45℃摇床150rpm震荡24小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(3)在1000ml有机溶剂溶液(等体积比的氯仿和甲醇溶液)中，恒温45℃摇床150rpm震荡脱脂12小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(4)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度1％的Triton X-100)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡72小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(5)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(SDS浓度为0.5％，混合1mmol的Tris)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡96小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(6)在300ml含DNA酶的PBS缓冲液中(DNA酶浓度为0.01mg/ml)，加入60ml青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床150rpm震荡12小时，并用生理盐水冲洗5小时；
(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床150rpm震荡72小时，即得天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料，液氮中保存，待手术时取出。
其中，混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1。
对本例所得天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料进行组织学评价、抗原成分定量检测和成骨修复能力检测，结果如图1-10。通过图1和2显示完全脱细胞软骨联合骨材料大体结构保留完好，细胞外基质保留完整，细胞核成分完全去除，无细胞及其碎片残留；图3DAPI染色进一步提示材料中细胞核成分呈阴性，抗原性得到完全去除；图4的DNA抗原成分定量检测说明通过去细胞DNA去除率可以达到95％以上；图5和图6的胶原定量和定性检测发现细胞外基质主要胶原成分得到很好保留；图7的扫描电镜先是软骨联合骨微观结构保留完整；图8的CCK-8细胞毒性检测表明软骨联合骨脱细胞材料无细胞毒性，生物相容性高；图9和图10的兔子关节软骨联合骨缺损的12周修复实验表明该材料可以显著的修复关节软骨，实现软骨再生。
实施例2脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪股骨头软骨联合骨，步骤(2)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(浓度为5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml)中，恒温45℃摇床150rpm震荡8小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例3脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪股骨头软骨联合骨，步骤(2)在1000ml含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液(浓度为3％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml)中，恒温45℃摇床150rpm震荡12小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例4脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪股骨头软骨联合骨，步骤(4)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度5％的Triton X-200)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡3小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例5脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪股骨头软骨联合骨，步骤(4)在1000ml含Triton X的PBS缓冲液(浓度10％的Triton X-100)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡50小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例6脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪膝关节软骨联合骨，步骤(5)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(SDS浓度为10％，混合20mmol的Tris)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡2小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例7脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪膝关节软骨联合骨，步骤(5)在1000ml含SDS的PBS缓冲液(SDS浓度为6％，混合8mmol的Tris)中，加入100ml青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡30小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例8脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪膝关节软骨联合骨，步骤(6)在300ml含DNA酶的PBS缓冲液中(DNA酶浓度为0.5mg/ml)，加入60ml青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床150rpm震荡1小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例9脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪膝关节软骨联合骨，步骤(6)在300ml含DNA酶的PBS缓冲液中(DNA酶浓度为0.3mg/ml)，加入60ml青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床150rpm震荡8小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例10脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪膝关节软骨联合骨，步骤(3)在1000ml有机溶剂溶液(摩尔浓度70％的乙醇溶液)中，恒温45℃摇床150rpm震荡脱脂2小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
实施例11脱细胞软骨联合骨材料的制备和研究
取猪膝关节软骨联合骨，步骤(3)在1000ml有机溶剂溶液(摩尔浓度10％的丙酮溶液)中，恒温45℃摇床150rpm震荡脱脂2小时；其余参考实施例1的方法进行，得到脱细胞软骨联合骨材料。
对实施例2-11所得脱细胞软骨联合骨材料分别进行组织学评价、抗原成分定量检测和软骨修复能力检测，结果与实施例1类似，这表明脱细胞软骨联合骨材料可通过上述多种方法制得，并且对其进行组织学评价、抗原成分定量检测和软骨修复能力检测均说明材料已经完全去除细胞成分，无明显抗原成分残留；将其运用于兔子一类的大动物软骨缺损模型修复中可以达到很好的软骨修复再生效果。脱细胞软骨联合骨材料可以作为临床上软骨和软骨联合骨缺损移植等病人的安全可靠、有效、快速的替代材料。
Claims (1)
1.一种天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)取哺乳动物全身任意软骨联合骨组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、毛发和韧带；
(2)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床150rpm震荡8-24小时；其中含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液摩尔浓度为1％-5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；
(3)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床150rpm震荡脱脂2-12小时；有机溶剂溶液为等体积比的氯仿和甲醇溶液、摩尔浓度10％-100％的丙酮溶液或摩尔浓度30％-70％的乙醇溶液；
(4)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素的混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡3-72小时；含Triton X的PBS缓冲液为浓度1％-10％的Triton X-200或TritonX-100的PBS缓冲液；含Triton X的PBS缓冲液与混合抗菌液的体积比为10:1；
(5)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素的混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡2-96小时；含SDS的PBS缓冲液为摩尔浓度0.5％-10％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-20mmol/L的Tris；含SDS的PBS缓冲液与混合抗菌液的体积比为10:1；
(6)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素的混合抗菌液，37℃摇床150rpm震荡1-12小时；含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.01-0.5mg/ml；含DNA酶的PBS缓冲液与的混合抗菌液的体积比为5:1；
(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床150rpm震荡72小时，即得天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料；
步骤(2)-(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。
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