KR100834718B1 - 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뼈 형성능이 있는 세포를 히아루론산을 이용하여 표면처리 한 후 순환기 내로 주사함으로써 부분적 혹은 전신적으로 광범위하게 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 이를 위해 (가) 동물의 골수로부터 뼈 형성능이 있는 자기유래 세포를 분리하는 단계; (나) 상기 분리된 세포를 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식 배양시켜 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액을 제조하는 단계; 및 (다) 상기 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액에 생체 기질 성분인 100만MW(molecular weight)이하의 저분자 형태의 히아루론산(hyaluronic acid)을 혼합하여 세포 표면처리하는 단계;가 포함되어 구성된다.
상기와 같이 구성된 본 발명은 뼈 형성능이 있는 세포를 히아루론산을 이용하여 표면처리 한 후 순환기 내로 주사함으로써 부분적 혹은 전신적으로 광범위하게 뼈 재생을 도모할 할 수 있도록 한 것이며, 특히 뼈 형성 치료제를 혈류를 통하여 주입하면 잔존하는 뼈조직 구조를 파괴하지 않고 뼈 형성이 필요한 부위에 고루 뼈 형성세포를 전달하게 되므로 광범위한 뼈 재생이 필요한 골다공증을 비롯한 각종 질환을 치료할 수 있게 되고, 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.
뼈 형성세포, 골다공증, 히아루론산, 세포코팅.
Description
도 1 은 본 발명에 적용된 뼈 형성 촉진 세포조성물의 제조과정을 도시한 흐
름도.
도 2 는 본 발명에 적용된 뼈 형성 촉진 세포조성물의 사진.
본 발명은 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 뼈 형성능이 있는 세포를 히아루론산을 이용하여 표면처리 한 후 순환기 내로 주사함으로써 부분적 혹은 전신적으로 광범위하게 뼈 재생을 도모할 할 수 있도록 한 것이며, 특히 뼈 형성 치료제를 혈류를 통하여 주입하면 잔존하는 뼈조직 구조를 파괴하지 않고 뼈 형성이 필요한 부위에 고루 뼈 형성세포를 전달하게 되므로 광범위한 뼈 재생이 필요한 골다공증을 비롯한 각종 질환을 치료할 수 있게 되고, 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.
주지하다시피 골다공증은 뼈의 구성성분이 서서히 소실되면서 뼈에 거친 경석이나 스펀지처럼 작은 구멍이 많이 나서 쉽게 부러지는 상태를 말하며 정상적인 뼈에 비하여 뼈 안에 구멍이 많이 생기는 질병이라고 할 수 있고 뼈 자체의 무게가 줄어들고, 미세구조가 얇아지고 약해지므로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 부러질 수 있는 상태가 된다. 평소에 통증이나 아무런 증상 없이 조용히 진행되다가 어느날 갑자기 뼈가 부러지게 되면 그때야 비로소 골다공증이 있음을 알게 되며 가볍게 넘어졌는데도 손목이나 골반, 척추 뼈가 부러지고 심한 고통이 있고 특히 골반과 척추골절은 통증이 매우 심하고 수술을 필요로 하며 수개월 동안 누워서 지내야 하는 고통을 감수해야 할 뿐만 아니라 회복 후에도 신체장애가 잔존하는 것으로 알려져 있다.
뼈는 계속해서 분해되고 교체되는데, 즉, 파골세포가 오래된 뼈를 파괴, 흡수하며 조골세포가 대신 새로운 뼈를 만드는 리모델링 프로세스가 지속 된다. 뼈조직의 이러한 항상성이 깨어져서 뼈의 흡수속도가 재생속도를 초과하면 골다공증이 발생하게 되는 데 그 원인은 다양한 요인들, 즉 여성, 마르고 작은 체형, 고령, 골다공증 가족력, 폐경(자궁적출술도 포함), 월경불순(생리가 거르는 경우), 신경쇠약, 부신피질호르몬이나 항경련제를 쓴 경우, 남자에서 저 남성 호르몬 증인 경우, 운동부족, 흡연, 과음, 아시아인과 코카시아인(아프리카와 히스파닉 미국인은 덜함), 조기 폐경(45세 이전)된 여성, 카페인과 알코올의 과도한 섭취, 그리고 칼슘 섭취 부족 등의 가종 요인들의 결합에 의하여 발생하는 것으로 알려져 있다.
골다공증은 미국보다 아시아인의 발생률이 더 높아서 2,899만명 이상의 미국인이 앓고 있으며( 그 중 80%가 여성) 오늘날 1,000만인이 이미 이 질환을 가지고 있고 1,800만명 이상은 저밀도이라서 골다공증의 위험이 증가가 예상된다. 50세 이상 미국의 백인들은 2명 중 1명 여성과 8명 중 1명 남성이 골다공증과 관계되는 골절 경험한 바가 있고 50세 이상 아프리카 미국인의 10%가 골다공증, 30%는 저밀도로 골다공증 위험에 노출되어 있다. 골다공증에 의해 연간 150만 이상 골절을 일으키며, 이 중 300,000명은 고관절골절, 700,000명은 척추골절, 250,000명은 손목골절, 300,000명은 기타골절을 일으킨다고 알려져 있다. 미국의 경우 매년 12,000,000회의 골절이 발생하며 그 중 골반골절이 147,000회에서 250,000회를 차지하고, 그 중 80%가 가벼운 외상에 의한 것이며 여성의 약 40%가 80세에 이를 때까지 적어도 한 번의 척추골절을 경험하게 되고, 80대 후반이 되면 여성의 3분의 1과 남성의 6분의 1이 골반골절을 경험하게 된다. 골반골절환자의 25%에서 50%는 치료 후에도 혼자 걸을 수가 없고, 이러한 골절은 사망률과도 연관성이 있다고 알려져 있다.
상기한 골다공증을 치료하기 위하여 개발된 치료 방법 중 비스포스포네이트나 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 등과 같이 기존에 확립된 골다공증 치료법은 일차적으로 뼈의 흡수를 억제하는 것으로 추가적인 골 소실을 억제하는 효과 있어서 골다공증의 진행을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한 골다공증 등의 원인에 의한 국소부위의 골절이나 골 재생이 필요한 부위에는 골 이식이나 자기유래뼈세포치료제 등을 사용하여 골유합이나 골 재생을 도모할 수 있다.
그러나 상기 종래기술은 파골세포의 활동을 억제하여 골 흡수를 방지 함으로써 추가적인 골다공증의 진행을 차단하므로, 실재적인 골 재생을 촉진하지는 못하는 문제가 있다. 또한 상기의 골 이식이나 자기유래 뼈 세포치료제 등을 사용하는 경우 광범위한 부위의 생물학적 골 재생을 얻기는 어려운 단점이 있다.
그리고 골 이식에 의한 골 재생의 단점을 극복하기 위하여 세포치료제 개발은 가속화되고 있으나 부착성 세포의 전신적 적용이나 혈류를 통한 시술은 어려운 것으로 알려져 있다. 이는 부착성 세포의 경우 적절한 기질에 부착되어 있지 않으면 사멸하므로 혈류를 통한 세포주입이 불가하기 때문이다.
좀더 종래의 기술을 살펴보면, 국소부위에 뼈 결손이나 뼈 괴사가 발생한 경우 동종 골이식, 자가 골이식, 혹은 국소용 자기유래 뼈세포치료제 이식 등을 이용한 치료방법을 사용하였고 골다공증과 같은 광범위한 부위의 골 결손이 발생한 경우 비스포스포네이트등의 골 흡수 억제제를 사용하는 치료방법을 사용해왔다. 동종 골이식은 질병의 전파가능성, 이식재의 공급부족, 면역적인 문제, 그리고 자기조직으로의 완전한 재생의 어려움 등이 문제점으로 남아있으며 자가 골이식은 이러한 문제점들을 보완해주나 공여부위의 확보 곤란, 공여부위의 병적현상 등의 문제가 존재한다. 이러한 골이식의 문제점들을 해결하기 위하여 개발된 치료법이 자기유래 뼈세포치료제이며 골수로부터 분리된 뼈 형성 전구세포들을 대량증식시키고 뼈형성 세포로 분화시켜 뼈 재생이 필요한 부위에 이식하여 국소적인 뼈 재생을 도모할 수 있는 기술로 알려져 있다. 그러나 상기의 기술들은 모두 국소적인 뼈 재생에만 사용될 수 있고 비어 있는 뼈 공간을 채워주는 역할만 기대할 뿐, 광범위하게 분포된 뼈 결핍 현상, 예를 들면 골다공증에 의한 전신적인 뼈 결핍 현상 및 골괴사증에 의한 광범위한 골결핍증 등을 치료하기는 어려운 단점이 있다. 또한 골다공증을 치료하기 위해 사용되는 골흡수 억제제는 골재생 촉진능력이 부재하여 골다공증에의한 광범위한 골손상을 치료하는 데는 한계가 존재한다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 제반 문제점을 해소하기 위하여 안출한 것으로, 골수로부터 뼈 형성능이 있는 세포를 분리하는 단계와, 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액을 제조하는 단계 그리고 세포표면 처리에 의해 뼈 형성능이 있는 세포 치료제를 제조하는 단계가 구비됨을 제1목적으로 한 것이고, 제2목적은 뼈 형성능이 있는 세포를 히아루론산을 이용하여 표면처리 한 후 순환기 내로 주사함으로써 부분적 혹은 전신적으로 광범위하게 뼈 재생을 도모할 할 수 있도록 한 것이며, 제3목적은 뼈 형성 치료제를 혈류를 통하여 주입하면 잔존하는 뼈 조직 구조를 파괴하지 않고 뼈 형성이 필요한 부위에 고루 뼈 형성세포를 전달하게 되므로 광범위한 뼈 재생이 필요한 골다공증을 비롯한 각종 질환을 치료할 수 있게 되고, 제4목적은 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물 및 그 제조방법을 제공한다.
이러한 목적 달성을 위하여 본 발명은 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물의 제조방법에 있어서, (가) 동물의 골수로부터 뼈 형성능이 있는 자기유래 세포를 분리하는 단계; (나) 상기 분리된 세포를 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식 배양시켜 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액을 제조하는 단계; 및 (다) 상기 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액에 생체 기질 성분인 100만MW(molecular weight)이하의 저분자 형태의 히아루론산(hyaluronic acid)을 혼합하여 세포 표면처리하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물의 제조방법이 포함된다.
또한 본 발명은 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물에 있어서, 상기 뼈 형성능이 있는 자기유래세포를 골수로부터 분리하되, 상기 자기유래세포는 시술 전 7~10일전 조골 전구 세포로의 기능을 향상시키기 위해서 α-MEM에 비타민C (ascorbic acid) 40~60mg/L량으로 첨가된 배지에서 배양 함유하고, 이후 상기 분리된 세포를 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식 배양시켜 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액을 제조하며, 이어서 상기 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액에 생체 기질 성분인 100만MW(molecular weight)이하의 저분자 형태의 히아루론산(hyaluronic acid)을 혼합하되, 상기 저분자 형태의 히아루론산은 1×106~1×107개의 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액 10~20ml 당 0.01~0.03(vol%)가 함유되고, 저분자 형태의 히아루론산을 뼈 형성능이 있는 세포의 세포표면에 분포하는 CD44(cluster designation 44)에 결합시키되, 상기 저분자 형태의 히아루론산과 뼈 형성능이 있는 세포를 36~38℃의 CO2배양기에서 1~ 2시간 반응시켜 세포표면에 히아루론산을 부착시키고 이후 세포 표면에 부착되지 않은 히아루론산을 제거하여 이루어짐을 특징으로 하는 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물을 제공한다.
이하에서는 이러한 목적 달성을 위한 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 적용된 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물 및 그 제조방법은 도 1, 2 에 도시된 바와 같이 구성되는 것이다.
하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.
그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 설정된 용어들로서 이는 생산자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있으므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
먼저, 본 발명의 구성을 설명하기에 앞서 골다공증에 대한 부연 설명을 하면, 골다공증과 같은 광범위한 부위의 골결손이 발생한 경우 비스포스포네이트 등의 골흡수 억제제를 사용하는 치료방법 등이 있으며, 이러한 동종골이식은 질병의 전파가능성, 이식재의 공급부족, 면역적인 문제, 그리고 자기조직으로의 완전한 재생의 어려움 등이 문제점으로 남아있으며 자가골 이식은 이러한 문제점들을 보완해주나 공여부위의 확보 곤란, 공여부위의 병적현상 등의 문제가 존재한다. 이러한 골이식의 문제점들을 해결하기 위하여 개발된 치료법이 자기유래 뼈세포 치료제이며 골수로부터 분리된 뼈 형성 전구세포들을 대량증식시키고 뼈형성 세포로 분화시켜 뼈 재생이 필요한 부위에 이식하여 국소적인 뼈 재생을 도모할 수 있는 기술로 알려져 있다. 하지만 액상의 뼈형성세포 현탁액을 주입했을 때, 부착성 세포인 뼈형성 세포의 생존성과 혈류를 통해 치료 목적인 골결손 부위가 아닌 다른 장기로의 이동가능성을 내포하고 있어 보다 효과적으로 골 생성을 위해서는 세포의 생존성 확보와 치료 목적부위로의 정확한 이동이 요구된다. 뼈 형성능이 있는 세포와 생체기질 성분을 혼합하여 세포 표면 처리된 뼈 형성 촉진 세포 치료제는 cell therapy에 기반을 둔 액상의 뼈형성 세포 현탁액 주입법을 한 차원 승화시킨 제품이라 할 수 있다. 기존의 세포만 이식하는 액상의 뼈형성 세포 현탁액을 주입했을 때, 부착성 세포인 뼈형성 세포의 생존성과 혈류를 통해 치료 목적인 골결손 부위가 아닌 다른 장기로의 이동가능성을 내포하고 있어 보다 효과적으로 골 생성을 위해서는 세포의 생존성 확보와 치료 목적부위로의 정확한 이동이 요구된다. 이에 반해 본 발명에 따른 뼈 형성능이 있는 세포와 생체 기질 성분이 결합된 3차원 뼈 형성 촉진 세포 치료제는 뼈 형성능이 세포와 생체기질이 결부되어 있어 혈류로 주입시 세포의 생존성과 골 결손부위로만 이동할 수 있어 효과적으로 골다공증, 연골재생, 성장기 뼈발육 등과 같은 광범위한 골 결손을 치료할 수 있다.
이하 골다공증, 연골재생, 성장기 뼈발육 등과 같은 치료하기 위한 본 발명의 구성을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
즉, 본 발명은 (가) 동물의 골수로부터 뼈 형성능이 있는 세포를 분리하는 단계를 제공하게 된다.
이때 본 발명에 적용된 상기 (가) 단계에서의 뼈 형성능이 있는 세포는 자기 유래세포가 사용됨이 바람직하다.
그리고 상기 뼈 형성능이 있는 자기유래세포는 시술 전 7~10일전 조골 전구 세포로의 기능을 향상시키기 위해서 α-MEM에 비타민C (ascorbic acid) 40~60mg/L량으로 첨가된 배지에서 배양된 자기유래세포임을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 (나) 상기 분리된 세포를 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식 배양시켜 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액을 제조하는 단계를 제공하게 된다.
이후 본 발명은 (다) 상기 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액에 생체 기질 성분을 혼합하여 세포 표면처리하는 단계;를 거치므로 뼈 형성능이 있는 세포의 생존성과 골강 내부로 이동성· 정착성을 향상시키기게 된다.
본 발명은 또한 상기 (다) 단계에서 생체 기질 성분은 100만MW(molecular weight)이하의 저분자 형태의 히아루론산(hyaluronic acid)을 사용함을 특징한다.
그리고 상기 저분자 형태의 히아루론산을 1×106~1×107개의 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액 10~20ml 당 0.01~0.03(vol%)로 첨가되는 단계; 저분자 형태의 히아루론산을 뼈 형성능이 있는 세포의 세포표면에 분포하는 CD44(cluster designation 44)에 결합시키되, 상기 저분자 형태의 히아루론산과 뼈 형성능이 있는 세포를 36~38℃의 CO2배양기에서 1~ 2시간 반응시켜 세포표면에 히아루론산을 부착시키는 단계; 및 이후 세포 표면에 부착되지 않은 히아루론산을 제거하는 단계;를 제공하게 된다.
한편, 본 발명은 상기와 같은 각 단계에 의해 뼈 형성능 있는 자기유래세포와 저분자 형태의 히아루론산이 함유되어 표면 코팅된 뼈 형성 촉진 세포조성물을 제공하게 된다.
특히 본 발명은 상기 뼈 형성능이 있는 자기유래세포를 골수로부터 분리하되, 상기 자기유래세포는 시술 전 7~10일전 조골 전구 세포로의 기능을 향상시키기 위해서 α-MEM에 비타민C (ascorbic acid) 40~60mg/L량으로 첨가된 배지에서 배양 함유하고, 이후 상기 분리된 세포를 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식 배양시켜 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액을 제조하며, 이어서 상기 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액에 생체 기질 성분인 100만MW(molecular weight)이하의 저분자 형태의 히아루론산(hyaluronic acid)을 혼합하되, 상기 저분자 형태의 히아루론산은 1×106~1×107개의 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액 10~20ml 당 0.01~0.03(vol%)가 함유되고, 저분자 형태의 히아루론산은 뼈 형성능이 있는 세포의 세포표면에 분포하는 CD44(cluster designation 44)에 결합시키기 위해 36~38℃의 CO2 배양기에서 1~2시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 한다.
그리고 본 발명은 상기 자기유래세포 표면에 동맥, 정맥을 통한 혈류로 주입할 수 있도록 히아루론산이 부착된 형태로 이루어진다.
한편 본 발명은 상기의 구성부를 적용함에 있어 다양하게 변형될 수 있고 여 러 가지 형태를 취할 수 있다.
그리고 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
상기와 같이 구성된 본 발명 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물 및 그 제조방법의 실시예 및 효과를 설명하면 다음과 같다.
우선, 본 발명은 뼈 형성능이 있는 세포의 세포표면에 분포하는 CD44에 100만MW 저분자 형태의 히아루론산을 부착시키는 것은 부착성 세포인 뼈 형성능 있는 세포는 지지체가 있어야 생존하기에 생존기간을 늘리고, 저분자 형태의 히아루론산이 뼈 형성능이 있는 세포에 부착되었을 때 골내로 이동성이 높아진다. 반면, 고분자형태의 히아루론산을 세포에 부착시 크기의 증가, 엉김에 의한 혈류 이동성이 낮아진다. 또한, 세포 현탁액 10~20ml 당 0.01(vol%) 미만으로 저분자 형태의 히아루론산을 혼합하게 되면 뼈 형성능이 있는 세포에 부착되는 저분자 형태의 히아루론산의 량과 저분자 형태의 히아루론산과 결합한 뼈 형성능이 있는 세포 수가 적어져 효율성이 떨어진다. 따라서, 세포현탁액 10~20ml 당 0.01(vol%)로 저분자 형태의 히아루론산을 혼합하여 적정 농도를 적용 시켰다.
또한, 저분자 형태의 히아루론산과 뼈 형성능이 있는 세포가 결합 될 때 세포가 지속적으로 생존해야 하고, 저분자 형태의 히아루론산이 부착된 후 반응 용기에서 정착하지 않도록, 적정한 생육 환경을 갖춘 상태인 37℃의 CO2배양기에서 반응을 시키고 통상 부유된 뼈 형성능이 있는 세포가 지지체에 부착되어 생육을 위한 정착하는 시간을 고려 최적의 반응시간인 1~ 2시간 동안 반응시킨다.
그리고, 뼈 형성능이 있는 세포에 부착되지 않은 저분자 형태의 히아루론산이 치료제 생산 과정 중에 엉겨붙어 치료제의 점도변화 및 세포생존에 영향을 주기때문에, 원심분리법을 부착되지 않은 저분자 형태의 히아루론산이 부착된 뼈 형성능이 있는 세포를 2번 이상 세척하여 이를 제거한다. 세척된 저분자 형태의 히아루론산이 세포표면에 부착된 뼈 형성능이 있는 세포를 시술 전까지 생존성을 높이기 위하여 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)에 pH완충역할을 하는 12.5~25mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-eth-anesulfonic acid)첨가된 주입액에 현탁 한다.
1. 골수를 채취시 구체적인 예
동물의 경우 대퇴골 골두를 채취; 개체에 따라 다름, 사람의 경우 대퇴골 골두(ilica crest)에서 20~50ml의 골수 채취
(1) 채취할 때 이용하는 용액 조성
- Low glucose DMEM 450ml
- FBS 50ml
- L-glutamin 5ml
- Gentamicin(100㎍/ml) 1ml
- Heparin(10 IU/ml) 500㎕ → HBSS 10ml + 100,000 unit Heparin
- HEPES 25mM
(2) 채취된 골수 및 대퇴골 골두를 채취때 이용하는 용액에 혼합 하여 냉장 보관하여 이동.
2. 유핵세포 분리 구체적인 예
(1). 골수에서 세포배양
- HBSS : Final 농도 100ug/mL gentamicin and 2.5ug/mL fungizone 되도록 첨가
- 10% low glucose MEM(with gentamicin and fungizone)
- 항생제 농도: final 50ug/mL gentamicin and 2.5ug/mL fungizone
1) Transfer bottle을 5ml HBSS로 세척하여 50ml tube로 옮긴다.
2) 원심분리(1200 rpm, 5min)한다.
3) washing 한다.
4) 새로운 50ml 튜브에 sieve를 장착한다.
5) 10ml HBSS를 가한 후 뚜껑을 덮고 세게 50회 튜브를 두드린다.
6) Sup.을 따서 sieve로 걸러 모은다.
7) 다시 10ml HBSS를 가한 후 뚜껑을 덮고 세게 50회 튜브를 두드린다.
8) Sup.을 따서 sieve로 걸러 모은다.
9) 모아진sup.(30ml+뼈자른 soup 10 ml)을 원심분리(1200 rpm, 5min)한다.
10) Sup.을 버리고 10% low glucose MEM(항생제 첨가) 10ml로 현탁하여 T-25 flask에 2개로 나누어 seeding한 후 37℃, CO2에서 배양한다.
(2) 골수내 뼈로부터 세포배양
- 0.2% collagenase : Type II collagenase를 0.2%가 되도록 HBSS에 녹인 후 0.2um syringe filter로 filter한다.
- 10% FBS Low glucose DMEM(with final 100ug/mL gentamicin ):중화 및 washing용
- 10% FBS Low glucose DMEM(with gentamicin and fungizone) 항생제 농도: final 50ug/mL gentamicin and 2.5ug/mL fungizone
1) 8번에서 sup.을 따고 남은 뼈에 10ml HBSS를 가한 후 dish로 옮겨 뼈에 붙은 근육 및 이물질을 제거하고 뼈를 자른다.
2) 뼈만 50 ml 튜브로 옮기고 3ml 0.2% collagenase용액을 가해 37℃에서 over night한다.
3) 뼈를 제외한 이물질은 버리고 남은soup은 방법 1의 8)번 단계로 가서 함께 처리한다.
4) 10% Low glucose DMEM 10 ml을 가해 중화시킨다.
5) Sup.을 따서 sieve로 걸러 모은다.
6) 10% Low glucose DMEM 10 ml을 가해 흔들어준 후 sup.을 따서 sieve로 걸러 모은다.
7) 10% Low glucose DMEM 10 ml을 가해 흔들어준 후 sup.을 따서 sieve로 걸러 모은다.
8) 모아진 sup.을 원심분리(1200 rpm, 5min)한다.
9) Sup.을 버리고 10% Low glucose DMEM(항생제 첨가) 10ml로 현탁하여 T-25 flask에 2개로 나누어seeding한 후 37℃, CO2에서 배양한다.
3. 배양 방법 구체적
분리된 유핵세포를 10% FBS Low glucose DMEM에 배양, 세포수를 늘린다. 3~4주 소요 계대 배양시 일정수의 세포를 저장한다.
1). 계대배양(subculture)
1. HBSS washing 3회
2. trypsin 2 or 4ml씩 처리후 3-5분간 incubation
3. FBS 1 or 2ml씩 처리해 흔들어 주면서 중화
4. (cell strainer로 걸러서) 15ml tube로 옮기고 배지 10ml로 washing해 1,200rpm, 5분 centrifuge
5. suction하고 tapping해 suspension한 후 tube에 모아 다시 5ml로 tube washing
6. flask 에 seeding
7. 남은 cell은 stock
2) Freezing protocol
1. 미리 냉동 보관된 Freezing media(FBS:DMSO=9:1)를 warming하여 4℃ 냉장고에 보관한다
2. 세포를 현미경하에 관찰하고 무균작업대에서 QC용 샘플 채취한다
3. 배양 배지를 제거한 후 HBSS용액 일정량으로 washing하고 제거를 3회 반복한다
4. 각 용기마다 trypsin 처리 후 5분간 incubation
5. FBS로 중화시켜 흔들어 준 후 배지를 이용해 flask washing 한 후 15ml tube로 옮겨 centrifuge 5분
6. 상층액을 제거하고 10ml 배지에 세포를 부유시켜 Coulter counter 측정한다
7. centrifuge 5분 후 Freezing media과 세포를 혼합해 vial당 2X106 ∼1.5X107 범위에서 1.8ml씩 보관한다
8.작업시 4℃에서 최대 2시간 이하로 보관 가능하다
9. -70℃에서 이중 밀폐용기로 overnight(최대 72시간까지) 동결 보관한다
10. 다음날 -196℃ 액화질소 탱크에 장기간 보관한다.
4. 일정기간 배양하는 구체적인 특징
뼈 형성능이 있는 자기 유래 세포의 조골 전구 세포로의 기능을 향상 시켜 치료제의 효능을 높이고자 시술 전 7~10일전 10% FBS α-MEM에 비타민C (ascorbic acid) 50mg/L량으로 첨가된 배지로 바꾸어서 배양.
5. 세포와 저분자형태의 히아루론산 반응
세포 수집
1). 각각의 T-150 flask 5ea에 배양된 세포를 trypsin을 처리하여 수집한다. (cell strainer로 거름)
2). 수집된 세포의 수를 측정하여 1ⅹ107cells를 취한다.
1. 50ul DMSO를 CM-DiI(3H-Indolium, 5-[[[4-(chloromethyl) benzoyl]amino]methyl]-2-[3-(1,3-dihydro- 3,3-dimethyl-1-octadecyl-2H-indol-2- ylidene)-1-propenyl]-3,3-dimethyl-1- octadecyl-, chloride) tube(50ug)에 분주한다.
2. 2ml HBSS에 25ul CM-DiI를 넣어 형광표지 할 준비를 한다.
3. 수집된 cell에 CM-DiI를 처리하여 Ø10cm petridish에 분주한다. (25ul DMSO/2ml HBSS)
4. 37℃에서 5min 동안 incubation.
5. 4℃에서 15min동안 incubation.
6. FBS 1ml 첨가 하여 형광표지를 멈춘다.
※ 알루미륨 호일로 감싸 빛을 차단 후 아래 단계 시험 한다.
7. 원심 분리(1200rpm, 5min)하여 HBSS로 washing한다.
8. 원심 분리하여 HBSS로 washing한다.
9. 2ml HA를 첨가한 20ml 배지(10% FBS Low glucose DMEM)로 현탁 한다.
10. 37℃에서 90분 가량 incubation 한다.
11. 30ml HBSS를 가해 세포를 수집한다.
12. 원심분리하여(1200rpm, 5min) coating된 세포를 남기고 supernatant를 제거한다.
13. 20ml 12.5mM HEPES 첨가된 DMEM를 가해 세포를 재현탁 한다.
14. 원심분리하여 세포를 12.5mM HEPES 첨가된 Low glucose DMEM로 2회 washing 한다.
15. cell pellet를 400ul의 12.5mM HEPES 첨가된 Low glucose DMEM DMEM로 현탁 한다.
16. 호일로 감싼(형광표지때문) 후 4℃ 상태로 운반.
6. 37℃ 1~2시간 반응 및 CO2 배양기에서 배양하는 이유
저분자 형태의 히아루론산과 뼈 형성능이 있는 세포가 결합될 때 세포가 지속적으로 생존해야 하고, 저분자 형태의 히아루론산이 부착된 후 반응 용기에서 정착하지 않도록, 적정한 생육 환경을 갖춘 상태인 37℃ CO2배양기에서 반응을 시키고 통상 부유된 뼈 형성능이 있는 세포가 지지체에 부착되어 생육을 위한 정착하는 시간을 고려 최적의 반응시간인 1~ 2시간동안 반응시킨다.
7. 세척과정 및 히아루론산 제거 이유
뼈 형성능이 있는 세포에 부착되지 않은 저분자 형태의 히아루론산이 치료제 생산 과정 중에 엉겨붙어 치료제의 점도변화 및 세포생존에 영향을 주기 때문에, 원심분리법을 부착되지 않은 저분자 형태의 히아루론산이 부착된 뼈 형성능이 있는 세포를 2번 이상 세척하여 이를 제거한다.
이하 본 발명의 구체적인 실시예를 설명하면 다음과 같다.
<실시예 1> rat에 시술 한 예
동물 모델인 rat의 대퇴골두에서 골수를 채취하여 효소 처리하여 유핵세포를 분리한다. 골형성 유도제를 처리하여 뼈 형성능이 있는 세포로 분화시킨 후 다량 배양한다. 세포표면을 처리할 히아루론산(hyaluronic acid)은 100만MW이하의 저분자량 형태인 것을 사용한다. 뼈 형성능이 있는 세포와 배지가 혼합된 용기에 히아루론산 을 주입하여 균일하게 분포시킨 후 37℃ CO2배양기에서 90분 동안 반응시켜 세포표면을 처리한다. 난소적출술(OVX)을 통한 골다공증이 유발된 rat에 저분자량의 히아루론산이 표면처리된 뼈 형성능 세포의 동맥과 정맥에 주입하였다.
[결과]
광범위한 골 손실의 대표적인 난소적출술(OVX)을 통한 골다공증, 연골재생, 성장기 뼈발육 등이 필요한 rat에 저분자량의 히아루론산이 표면처리된 뼈 형성능 세포를 주입하여 아래의 그림과 같이 골다공증의 치유 효과를 확인하였다.
난소적출술(OVX)을 통한 골다공증, 연골재생, 성장기 뼈발육 등이 필요한 rat의 femur(B)와 비교시 뼈 형성능이 있는 세포를 정맥과 동맥에 주입(C, D, E)한 rat을 보면 골 손실이 적은 것으로 확인되었으며, 세포표면 처리하지 않은(C) 것 것에 비해 저분자량의 히아루론산를 세포표면 처리한(D, E) 것이 골다공증, 연골재생, 성장기 뼈발육 등이 치유됨을 확인할 수 있었다.
그림 ) rat의 femur와 각각의 tubercular 확대한 X-ray사진
A: 정상 rat,
B: 난소적출술을 통한 골다공증이 유발된 rat.
C: 난소적출술을 통한 골다공증이 유발된 rat에 뼈 형성능이 있는 세포를 정맥에 주입.
D: 난소적출술을 통한 골다공증이 유발된 rat에 저분자량의 히아루론산를 세포표면 처리한 뼈 형성능이 있는 세포를 정맥에 주입.
E; 난소적출술을 통한 골다공증이 유발된 rat에 저분자량의 히아루론산를 세 포표면 처리한 뼈 형성능이 있는 세포를 동맥에 주입
<실시예 2> NOD/SCID mouse(non-obese diabetic severe Combined Immuno-Deficiency mouse)에 사람 유래 세포를 시술한 예.
사람의 뼈 형성능이 있는 세포와 배지가 혼합된 용기에 저분자 형태의 히아루론산을 주입하여 균일하게 분포시킨 후 37℃ CO2배양기에서 120분 반응시켜 세포표면을 처리한다. 면역결핍된 NOD/SCID mouse에 각각 형광 표지된 사람유래 뼈 형성성 있는 세포를 혈류로 주입하여 사람 유래 세포의 세포 이동성과 골내 분포 및 정착성을 아래 그림과 같이 확인하였다.
[결과]
그림) 혈류로 주입된 뼈 형성능이 있는 세포의 이동성 및 정착성 확인
혈관을 통해 대퇴골로 이동한, 저분자량의 히아루론산를 세포표면 처리한 뼈 형성능이 있는 형광 표지된 세포의 이동성, 분포 및 정착성 확인을 위하여 대퇴골 횡단면을 확대(A,B) 하여 형광 현미경을 통하여 형광표지된 세포(C)를 관찰 함으로써 혈류로 주입된 저분자량의 히아루론산를 세포표면 처리한 뼈 형성능이 있는 형광 표지된 세포가 골내로의 이동하였음과 정착하였음을 확인하였다.
상기에서 상세히 살펴본 바와 같이 본 발명은 골수로부터 뼈 형성능이 있는 세포를 분리하는 단계와, 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액을 제조하는 단계 그리고 세포표면 처리에 의해 뼈 형성능이 있는 세포 치료제를 제조하는 단계에 의해 혈류를 통해 뼈 형성세포를 전달함으로써 광범위한 부위의 뼈 재생을 도모할 수 있도록 한 것이다.
본 발명은 특히 뼈 형성능이 있는 세포를 히아루론산을 이용하여 표면처리 한 후 순환기 내로 주사함으로써 부분적 혹은 전신적으로 광범위하게 뼈 재생을 도모할 할 수 있도록 한 것이다.
더하여 본 발명은 뼈 형성 치료제를 혈류를 통하여 주입하면 잔존하는 뼈 조직 구조를 파괴하지 않고 뼈 형성이 필요한 부위에 고루 뼈 형성세포를 전달하게 되므로 광범위한 뼈 재생이 필요한 골다공증을 비롯한 각종 질환을 치료할 수 있도록 한 것이다.
이로 인해 본 발명은 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (8)
- 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물의 제조방법에 있어서,(가) 동물의 골수로부터 뼈 형성능이 있는 자기유래 세포를 분리하는 단계;(나) 상기 분리된 세포를 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식 배양시켜 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액을 제조하는 단계; 및(다) 상기 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액에 생체 기질 성분인 100만MW(molecular weight)이하의 저분자 형태의 히아루론산(hyaluronic acid)을 혼합하여 세포 표면처리하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물의 제조방법.
- 삭제
- 제 1 청구항에 있어서,상기 뼈 형성능이 있는 자기유래세포는 시술 전 7~10일전 조골 전구 세포로의 기능을 향상시키기 위해서 α-MEM에 비타민C (ascorbic acid) 40~60mg/L량으로 첨가된 배지에서 배양된 자기유래세포임을 특징으로 하는 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물의 제조방법.
- 삭제
- 제 1 청구항에 있어서,상기 저분자 형태의 히아루론산을 1×106~1×107개의 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액 10~20ml 당 0.01~0.03(vol%)로 첨가되는 단계;저분자 형태의 히아루론산을 뼈 형성능이 있는 세포의 세포표면에 분포하는 CD44(cluster designation 44)에 결합시키되, 상기 저분자 형태의 히아루론산과 뼈 형성능이 있는 세포를 36~38℃의 CO2배양기에서 1~ 2시간 반응시켜 세포표면에 히아루론산을 부착시키는 단계; 및이후 세포 표면에 부착되지 않은 히아루론산을 제거하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물의 제조방법.
- 삭제
- 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물에 있어서,상기 뼈 형성능이 있는 자기유래세포를 골수로부터 분리하되, 상기 자기유래세포는 시술 전 7~10일전 조골 전구 세포로의 기능을 향상시키기 위해서 α-MEM에 비타민C (ascorbic acid) 40~60mg/L량으로 첨가된 배지에서 배양 함유하고, 이후 상기 분리된 세포를 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식 배양시켜 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액을 제조하며, 이어서 상기 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액에 생체 기질 성분인 100만MW(molecular weight)이하의 저분자 형태의 히아루론산(hyaluronic acid)을 혼합하되, 상기 저분자 형태의 히아루론산은 1×106~1×107개의 뼈 형성능이 있는 세포 현탁액 10~20ml 당 0.01~0.03(vol%)가 함유되고, 저분자 형태의 히아루론산을 뼈 형성능이 있는 세포의 세포표면에 분포하는 CD44(cluster designation 44)에 결합시키되, 상기 저분자 형태의 히아루론산과 뼈 형성능이 있는 세포를 36~38℃의 CO2배양기에서 1~ 2시간 반응시켜 세포표면에 히아루론산을 부착시키고 이후 세포 표면에 부착되지 않은 히아루론산을 제거하여 이루어짐을 특징으로 하는 뼈 재생을 도모하는 뼈 형성 촉진 세포조성물.
- 삭제
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