JP2010507392A

JP2010507392A - 胎盤細胞集団で骨欠損を治療するための方法及び組成物

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Publication number: JP2010507392A
Application number: JP2009534633A
Authority: JP
Inventors: ダブリュー．エドインゲルジャメス; ジェイ．ハリリロベルト; ワングジア‐ルン; イエクイアン; エス．ラバズゾクリステン; ペレイラマリアン; ダウンアブラムソンサスチャ
Original assignee: アントフロゲネシスコーポレーション
Priority date: 2006-10-23
Filing date: 2007-10-23
Publication date: 2010-03-11
Also published as: ZA200902233B; US20190262406A1; NZ595854A; EP2420568A2; KR20090076989A; EP2418271A2; US8562972B2; JP2013216661A; NZ576194A; IL198008A; EP2418271A3; US10105399B2; US20170056452A1; WO2008051568A3; CA2667359A1; DK2084268T3; EP2420568A3; CA2850793A1; CA2667359C; EP3483263A1

Abstract

接着性胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞集団の使用方法、並びにそれらを培養し、急増させ、及び増殖させる方法を本明細書に示す。また、胎盤幹細胞を分化させる方法を本明細書に示す。さらに、胎盤幹細胞を使用して、対象への投与に好適な移植可能又は注射可能組成物を処方する方法を本明細書に示す。さらに、幹細胞、及び幹細胞を含む組成物で骨欠損を治療するための方法を本明細書に示す。
【選択図】なし

Description

(1.分野)
単離された胎盤細胞、例えば、胎盤潅流、接着性及び非接着性胎盤幹細胞、胎盤幹細胞の集団、該幹細胞を含む組成物、該幹細胞を得る方法、該幹細胞を含む組成物を処方する方法、並びに該幹細胞及び組成物で骨欠損を治療する方法を本明細書に示す。

(2. 背景)
ヒト幹細胞は、多様な成熟したヒト細胞系統を生成することのできる、全能性又は多能性前駆細胞である。幹細胞を、全部ではないが、多くの組織を再増殖して、生理学的且つ解剖学的な機能性を回復するために採用することができることを示す証拠が存在している。

数多くの異なる型の哺乳類の幹細胞が、特徴付けられている。例えば、Caplanらの米国特許第5,486,359号(ヒト間葉系幹細胞);Boyseらの米国特許第5,004,681号(胎児と新生児の造血幹細胞及び前駆細胞);Boyseらの米国特許第5,192,553号(胎児と新生児の造血幹細胞及び前駆細胞);Cell 114(6):第763〜766頁(2003)に掲載された、Beltramiらの論文(心臓幹細胞);J.Pathol.197(4):第510〜518頁(2002)に掲載された、Forbesらの論文(肝幹細胞)を参照。臍帯血及び、臍帯血由来の全体の有核細胞は、切除治療を受けた患者に対して、造血機能を部分的に或いは全体的に回復させるために、移植されて用いられてきた。

(3.概要)
単離された胎盤細胞、例えば、胎盤潅流、接着性又は非接着性胎盤幹細胞、胎盤幹細胞の集団、該細胞を含む組成物、該胎盤細胞を得る方法、該組成物を処方する方法、該細胞を使用して骨欠損を治療する方法を本明細書に示す。

骨欠損の修復に有用である単離された幹細胞、及びそのような幹細胞を含む細胞集団を本明細書に示し、該幹細胞は胎盤組織(例えば、羊膜、絨網膜、胎盤葉、臍帯等)に存在し、該胎盤組織から単離される。該胎盤幹細胞は、幹細胞の1つ以上の特徴を示し(例えば、幹細胞に関する標識を示し、分化されていない状態の培養状態で、少なくとも10〜20回で複製し、3つの胚葉を表する成体細胞に分化する等)、そして、組織培養基材(例えば、組織培養皿やマルチウェルプレートの表面のような組織培養プラスチック)に接着することができる。

一実施態様において、非接着性である単離された胎盤幹細胞を本明細書に示す。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD34⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD44^-である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、酵素消化によってヒト胎盤から単離されている。ある実施態様において、単離された幹細胞は、潅流によってヒト胎盤から単離されている。ある実施態様において、単離された幹細胞は、胎盤細胞の集団が鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記胎盤細胞の集団における鉱化マトリックスの形成を促進する。

別の実施態様において、非接着性である単離された胎盤細胞の集団を本明細書に示す。ある実施態様において、該集団は、CD34⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD44^-である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD34⁺及びCD44^-である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、前記細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-幹細胞である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、前記細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-幹細胞である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、増殖されている。ある実施態様において、該集団は、少なくとも1回継代されている。ある実施態様において、該集団は、少なくとも5回継代されている。ある実施態様において、該集団は、少なくとも10回継代されている。ある実施態様において、該集団は、少なくとも20回継代されている。ある実施態様において、該集団は、胎盤細胞の集団が鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに前記細胞の集団における鉱化マトリックスを形成させる、又はその形成を促進する。

別の態様において、CD34⁺及びCD44^-である単離された胎盤幹細胞の集団を本明細書に示す。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-幹細胞である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-幹細胞である。ある実施態様において、該集団は、増殖されている。ある実施態様において、該集団は、少なくとも1回継代されている。ある実施態様において、該集団は、少なくとも5回継代されている。ある実施態様において、該集団は、少なくとも10回継代されている。ある実施態様において、該集団は、少なくとも20回継代されている。ある実施態様において、該集団は、胎盤細胞の集団が鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに前記細胞の集団における鉱化マトリックスを形成させる、又はその形成を促進する。

一実施態様において、CD200⁺又はHLA-G⁺である単離された胎盤幹細胞を本明細書に示す。具体的な実施態様において、該幹細胞は、接着性である。別の具体的な実施態様において、前記細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺である。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の一集団から、前記集団が、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。

他の実施態様において、CD200⁺、HLA-G⁺幹細胞を含む、単離された胎盤細胞の集団を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。多様な実施態様において、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%、又はそれ以上の前記単離された胎盤細胞は、CD200⁺、HLA-G⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回の継代で、拡大されてきた。他の具体的な実施態様において、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、前記集団は、1個以上の胚様体様組織体を形成する。

他の実施態様において、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺である、単離された胎盤幹細胞を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。さらに他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。さらに具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において前記集団が培養されるとき、前記幹細胞は、該幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団由来の1個以上の胚様体様組織体の成長を促進する。

他の実施態様において、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺幹細胞を含む、単離された胎盤細胞の集団を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。多様な実施態様において、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%の前記単離された胎盤細胞は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。さらに具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回の継代で、拡大されてきた。他の具体的な実施態様において、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、前記集団は、1個以上の胚様体様組織体を形成する。

また、CD200⁺及びOCT-4⁺である、単離された胎盤幹細胞を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において前記集団が培養されるとき、前記幹細胞は、胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団由来の、1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。

他の実施態様において、CD200⁺、OCT-4⁺胎盤幹細胞を含む、単離された胎盤細胞の集団を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。多様な実施態様において、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%の前記単離された胎盤細胞は、CD200⁺、OCT-4⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、例えば少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回の継代で、拡大されてきた。他の具体的な実施態様において、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、前記集団は、1個以上の胚様体様組織体を形成する。

他の実施態様において、CD73⁺及びCD105⁺である、単離された胎盤幹細胞を本明細書に示し、該単離された幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において前記集団が培養されるとき、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT4⁺である。さらに具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。

さらに、CD73⁺、CD105⁺胎盤幹細胞を含む、単離された胎盤細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記集団は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において、1個以上の胚様体様組織体を形成する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。多様な実施態様において、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%の前記単離された胎盤細胞は、CD73⁺、CD105⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回の継代で、拡大されてきた。

さらに、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である、単離された胎盤幹細胞を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。さらに具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養される間、胎盤幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団由来の1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。

さらに、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺胎盤幹細胞を含む、単離された胎盤細胞の集団を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。多様な実施態様において、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%の前記単離された胎盤細胞は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回の継代で、拡大されてきた。他の具体的な実施態様において、前記集団は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、胚様体様組織体を形成する。

さらに、OCT-4⁺である単離された胎盤幹細胞を本明細書に示し、これは、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、前記幹細胞を含む、単離された胎盤細胞の集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。

また、OCT-4⁺胎盤幹細胞を含む、単離した胎盤細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記集団は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、1個以上の胚様体様組織体を形成する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、接着性である。多様な実施態様において、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%の前記単離された胎盤細胞は、OCT-4⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。さらに具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回の継代で、拡大されてきた。

さらに、以下の方法で作成された、本明細書に記載の接着性及び非接着性胎盤幹細胞の単離された集団を本明細書に示す。該方法は:臍帯血を除去し、潅流して、残留血液を除去した哺乳類の胎盤を潅流することと;前記胎盤を潅流液で潅流することと;前記潅流液を回収することであって、前記潅流後の潅流液は、胎盤幹細胞を含む細胞の集団を含むこと;及び、多数の前記胎盤幹細胞を前記細胞の集団から単離すること;を含む。具体的な実施態様において、該潅流液は、胎盤から染み出た後に、臍帯静脈と臍帯動脈をともに通過して、回収される。他の具体的な実施態様において、該潅流液は、臍帯静脈を通過して臍帯動脈から回収されるか、或いは、臍帯動脈を通過して臍帯静脈から回収される。

さらに、以下の方法で作成された、本明細書に記載の単離された胎盤幹細胞、又は胎盤幹細胞の単離された集団を本明細書に示し、該方法は、胎盤組織を、組織を分解する酵素とともに消化させて胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を得ることと、多数の胎盤幹細胞を、前記胎盤細胞の残留物から単離すること、を含む。具体的な実施態様において、前記胎盤組織は、胎盤全体、羊膜、絨毛膜、羊膜と絨毛膜の組合せ、又は前述したもののいずれかの組合せである。他の具体的な実施態様において、該組織を分解する酵素は、トリプシン又はコラゲナーゼである。

さらに具体的な実施態様において、単離された胎盤幹細胞を本明細書に示し、ここで前記幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して検出可能なより高い水準で、1個以上の遺伝子を発現する。ここで、前記1個以上の遺伝子は、ACTG2、ADARBl、AMIGO2、ATRS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAMl、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAKl、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTNl、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN及び/又はZC3H12Aであって、前記骨髄由来の幹細胞は、培養において、前記胎盤幹細胞の継代の回数と同等である、多くの継代を経る。さらに具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して検出可能なより高い水準で、ACTG2、ADARBl、AMIG02、ATRS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPRl26、GPRC5B、ICAMl、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRTl8、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAKl、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTNl、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、及びZC3H12Aを発現する。

より具体的な実施態様において、また、単離された胎盤幹細胞の集団を本明細書に示し、前記幹細胞の集団は、骨髄由来の間葉系幹細胞の集団と比較して検出可能なより高い水準で、1個以上の遺伝子を発現し、ここで、前記1個以上の遺伝子は、ACTG2、ADARBl、AMIG02、ATRS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAMl、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、ILl8、KRTl8、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAKl、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTNl、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、及び/又はZC3H12Aであり、前記骨髄由来の幹細胞の集団は、培養において、前記胎盤幹細胞の継代の回数と同等である、多くの継代を経る。そして、前記骨髄由来の間葉系幹細胞の集団は、前記単離された幹細胞の集団と同等である、多数の細胞を有する。さらに具体的な実施態様において、該単離された幹細胞の集団は、単離された骨髄由来の間葉系幹細胞の前記集団と比較して検出可能なより高い水準で、ACTG2、ADARBl、AMIGO2、ATRS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAMl、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAKl、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTNl、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、及びZC3H12Aを発現する。

また、細胞が胎盤から単離された1つ以上の胎盤細胞、例えば、本明細書に示す胎盤潅流液、胎盤潅流細胞又は胎盤幹細胞を含む組成物を本明細書に示す。好ましい実施態様において、胎盤細胞を含む組成物は、骨欠損の修復に有用である。したがって、胎盤潅流液、又は胎盤潅流液から単離された細胞、例えば、胎盤潅流液からの全有核細胞を含む組成物を本明細書に示す。

一態様において、胎盤潅流液又は胎盤潅流細胞、例えば、胎盤潅流液からの全有核細胞を含む組成物を本明細書に示す。

さらに、胎盤幹細胞を含む組成物であって、前記幹細胞が、非接着性である単離された胎盤幹細胞である組成物を本明細書に示す。ある実施態様において、該幹細胞は、CD34⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、酵素消化によってヒト胎盤から単離されている。ある実施態様において、該幹細胞は、潅流によってヒト胎盤から単離されている。ある実施態様において、該細胞は、胎盤細胞の集団が鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記胎盤細胞の集団における鉱化マトリックスの形成を促進する。

別の実施態様において、胎盤幹細胞を含む組成物であって、前記幹細胞が、CD34⁺及びCD44^-である単離された幹細胞である組成物を本明細書に示す。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、酵素消化によってヒト胎盤から単離されている。ある実施態様において、該幹細胞は、潅流によってヒト胎盤から単離されている。ある実施態様において、該細胞は、胎盤細胞の集団が鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記胎盤細胞の集団における鉱化マトリックスの形成を促進する。

ある実施態様において、該組成物は、本明細書に示す単離された幹細胞、及び前記幹細胞の骨形成細胞への分化を誘発する化合物を含む。ある実施態様において、該組成物は、本明細書に示す単離された幹細胞又は単離された幹細胞の集団、及び前記幹細胞の集団における複数の幹細胞の骨形成細胞への分化を誘発する化合物を含む。ある実施態様において、該化合物は、デキサメタゾン又はアスコルビン酸である。

ある実施態様において、単離された胎盤幹細胞を含む組成物であって、前記幹細胞がCD200⁺及びHLA-G⁺である組成物を本明細書に示す。具体的な実施態様において、該幹細胞は、接着性である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺及びHLA-G⁺である。

別の実施態様において、単離された胎盤幹細胞を含む組成物であって、前記幹細胞がCD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺である組成物を本明細書に示す。具体的な実施態様において、該幹細胞は、接着性である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺である。

別の実施態様において、単離された胎盤幹細胞を含む組成物であって、前記幹細胞がCD200⁺及びOCT-4⁺である組成物を本明細書に示す。具体的な実施態様において、該幹細胞は、接着性である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。

別の実施態様において、CD73⁺及びCD105⁺である単離された胎盤幹細胞を含む組成物であって、前記幹細胞は、胚様体の形成を可能にする条件下で、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団における胚様体の形成を促進する組成物を本明細書に提示する。具体的な実施態様において、該幹細胞は、接着性である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。

さらに別の実施態様において、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である単離された胎盤幹細胞を含む組成物を本明細書に提示する。具体的な実施態様において、該幹細胞は、接着性である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。

他の実施態様において、OCT-4⁺である単離された胎盤幹細胞を含む組成物を本明細書に示し、ここで、前記幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団内で、胚様体様組織体の形成を促進する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。さらに他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。

さらに、骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して検出可能なより高い水準で、1個以上の遺伝子を発現する胎盤幹細胞を含む組成物を本明細書に示し、前記1個以上の遺伝子は、ACTG2、ADARBl、AMIGO2、ATRS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJl0781、GATA6、GPRl26、GPRC5B、ICAMl、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、ILl8、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAKl、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTNl、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、及びZC3H12Aからなる群より選択され、前記骨髄由来の幹細胞は、培養において、前記胎盤幹細胞の継代の回数と同等である、多くの継代を経る。上記組成物のより具体的な実施態様において、前記幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して検出可能なより高い水準で、ACTG2、ADARBl、AMIGO2、ATRS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAMl、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAKl、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTNl、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、及びZC3H12Aを発現し、前記幹細胞の集団及び前記骨髄由来の間葉細胞の集団は、同数の細胞を有する。

他の具体的な実施態様において、前記組成物のいずれも、マトリックスを含む。より具体的な実施態様において、前記マトリックスは、3次元的骨格である。他のより具体的な実施態様において、前記マトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、又はビトロネクチンを含む。他のより具体的な実施態様において、前記マトリックスは、羊膜、又は羊膜由来の生体材料である。他のより具体的な実施態様において、前記マトリックスは、細胞外膜タンパク質を含む。他のより具体的な実施態様において、前記マトリックスは、合成化合物を含む。他のより具体的な実施態様において、前記マトリックスは、生物活性化合物を含む。他のより具体的な実施態様において、前記生物活性化合物は、成長因子、サイトカイン、抗体、又は、5000ダルトン未満の有機分子である。ある実施態様において、該マトリックスは、例えば、ポリ乳酸又はポリグリコール酸等の合成分解性ポリマーである。ある実施態様において、該マトリックスは、移植可能な骨格基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸β-三カルシウム基質、リン酸β-三カルシウム-コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、鉱化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質及びセラミック基質からなる群から選択される。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸β-三カルシウム基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸β-三カルシウム-コラーゲン基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、コラーゲン基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸カルシウム基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、鉱化ヒト胎盤コラーゲン基質である。

他の実施態様において、さらに、前述した幹細胞のうちのいずれ、又は前述した幹細胞集団のうちのいずれかによってならされた培地を含む組成物を本明細書に示す。具体的な実施態様において、そのような組成物のいずれも、胎盤から得られない幹細胞を含む。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胚性幹細胞である。他のより具体的な実施態様において、前記幹細胞は、間葉系幹細胞である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、骨髄由来の幹細胞である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、造血前駆細胞である。他のより具体的な実施態様において、前記幹細胞は、体性幹細胞である。さらにより具体的な実施態様において、前記体性幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、膵臓幹細胞、内皮幹細胞、心臓幹細胞、又は筋幹細胞である。

別の態様において、本明細書に示す胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞の集団によって調整された培地を含む組成物を本明細書に示す。ある実施態様において、該組成物は、本明細書に示す細胞集団、例えば、幹細胞集団によって調整された培地を含む。

また、細胞集団を作成する方法であって、基質に接着しない細胞を選択すること、及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、該方法は、CD34を発現し、かつCD44を発現しない細胞を選択すること、及び前記細胞の濃度を増加させ、例えば前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することをさらに含む。

ある実施態様において、細胞集団を作成する方法であって、(a)基質に接着しない、(b)CD34を発現し、CD44を発現しない、且つ(c)胎盤細胞の集団が、鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記胎盤細胞の集団における鉱化マトリックスの形成を促進する細胞を選択すること;及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成すること;を含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、該基質は、フィブロネクチンを含む。

ある実施態様において、該方法は、CD9、CD29、CD54、CD90、CD166又はそれらの組合せを発現する細胞を選択することをさらに含む。

ある実施態様において、該方法は、CD31、CD34、CD117、CD133、CD200又はそれらの組合せを発現する細胞を選択することをさらに含む。

ある実施態様において、該選択は、抗体を使用して遂行される。ある実施態様において、該選択は、流動細胞計測法を用いて遂行される。ある実施態様において、該選択は、磁気ビーズを使用して実施される。ある実施態様において、該選択は、蛍光活性化細胞分類によって遂行される。ある実施態様において、該細胞集団は、増殖される。

別の態様において、非接着性胎盤幹細胞の集団であって、前記細胞が凍結保存され、前記集団が容器内に収容されている非接着性胎盤幹細胞の集団を本明細書に示す。ある実施態様において、幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該細胞は、凍結保存され、前記集団は、容器内に収容され、前記幹細胞は、鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに鉱化マトリックスを形成する。ある実施態様において、該容器は、液体の静脈内送達に好適な袋である。ある実施態様において、該集団は、1×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10¹⁰個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該幹細胞は、5回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、10回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、15回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、20回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、前記容器内で増殖されている。ある実施態様において、該集団は、0.9%NaCl溶液に含まれる。

別の態様において、マトリックスを鉱化する能力を有する骨形成細胞を作成する方法であって、本明細書に示す複数の幹細胞又は本明細書に示す単離された幹細胞の集団を、前記幹細胞が骨形成細胞に分化する条件下で培養することを含み、前記培養が、前記骨形成細胞がカルシウム及び/又はリン酸塩に富む検出可能な量の鉱化マトリックスを生成する、又はその生成を促進するのに十分な時間にわたって行われる方法を本明細書に示す。ある実施態様において、骨形成細胞は、骨を生成する。

さらに別の態様において、マトリックスを処方するための方法であって、本明細書に示す幹細胞の集団を移植可能な骨格基質と組み合わせることを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、該幹細胞は、非接着性である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD34⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該集団は、1×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10¹⁰個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該幹細胞は、少なくとも5回、約5回又は5回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、少なくとも10回、約10回又は10回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、少なくとも15回、約15回又は15回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、少なくとも20回、約20回又は20回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、増殖されている。

ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸β-三カルシウム基質、リン酸β-三カルシウム-コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、鉱化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質及びセラミック基質からなる群から選択される。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸β-三カルシウム基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸β-三カルシウム-コラーゲン基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、コラーゲン基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸カルシウム基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、鉱化ヒト胎盤コラーゲン基質である。

別の態様において、注射可能組成物を処方するための方法であって、胎盤幹細胞の集団を注射可能ヒアルロン酸又はコラーゲンと組み合わせることを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、該幹細胞は、非接着性である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD34⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD44^-である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、前記幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該胎盤幹細胞は、接着性である。具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺であるか;CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺であるか; CD200⁺及びOCT-4⁺であるか; CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であるか; CD73⁺及びCD105⁺であり、かつ前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;又はOCT-4⁺であり、かつ該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;或いはそれらの組合せである。非接着性胎盤幹細胞のより具体的な実施態様において、単離されたCD200⁺、HLA-G⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺であり;単離されたCD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺であり;単離されたCD200⁺、OCT-4⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であり;前記CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞がCD34^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である請求項1の単離された細胞であり;1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたCD73⁺及びCD105⁺幹細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-であり;且つ/又は1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたOCT-4⁺は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。ある実施態様において、胎盤幹細胞の集団は、増殖されている。ある実施態様において、前記組成物は、注射可能ヒアルロン酸を含む。ある実施態様において、該組成物は、注射可能コラーゲンを含む。また、非接着性幹細胞の集団及び注射可能ヒアルロン酸又はコラーゲンを含む組成物を本明細書に示す。

別の態様において、対象における骨欠損を治療するための方法であって、該治療を必要とする対象に対して、本明細書に示す幹細胞の集団を含む移植可能又は注射可能組成物を投与することによって、該対象における骨欠損を治療することを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、骨欠損は、癌関連溶骨性病変、骨折、又は例えば固定を必要とする脊椎である。ある実施態様において、溶骨性病変は、多発性骨髄腫、骨癌又は転移癌に関連する。ある実施態様において、骨折は、偽関節骨折である。ある実施態様において、非接着性幹細胞の集団を含む移植可能組成物を該対象に投与する。ある実施態様において、移植可能組成物を例えば骨欠損の部位に外科移植する。ある実施態様において、非接着性幹細胞の集団を含む注射可能組成物を該対象に投与する。ある実施態様において、注射可能組成物を骨欠損の領域に外科投与する。ある実施態様において、注射可能組成物を全身投与する。

ある実施態様において、該幹細胞は、非接着性である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD34⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-である。ある他の実施態様において、該胎盤幹細胞は、接着性である。具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺であるか;CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺であるか; CD200⁺及びOCT-4⁺であるか; CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であるか; CD73⁺及びCD105⁺であり、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;又はOCT-4⁺であり、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;或いはそれらの組合せである。非接着性胎盤幹細胞のより具体的な実施態様において、単離されたCD200⁺、HLA-G⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺であり;単離されたCD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺であり;単離されたCD200⁺、OCT-4⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であり;前記CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞がCD34^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である請求項1の単離された細胞であり;1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたCD73⁺及びCD105⁺幹細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-であり;且つ/又は1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたOCT-4⁺は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。ある実施態様において、該集団は、増殖されている。

さらに別の態様において、細胞集団を作成する方法であって、a)基質に接着する、且つb)CD34を発現し、かつCD44を発現しない細胞を選択すること、及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、該方法は、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することをさらに含む。ある実施態様において、細胞集団を作成する方法は、(a)基質に接着する、(b)CD34を発現し、かつCD44を発現しない、且つ(c)胎盤細胞の集団が、鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における鉱化マトリックスの形成を促進する細胞を選択すること、及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む。ある実施態様において、前記基質は、フィブロネクチンを含む。ある実施態様において、a)基質に接着しない、且つb) CD34を発現し、かつCD44を発現しない細胞を選択すること、及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、該方法は、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することをさらに含む。ある実施態様において、細胞集団を作成する方法は、(a)基質に接着しない、(b)CD34を発現し、かつCD44を発現しない、且つ(c)胎盤細胞の集団が、鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における鉱化マトリックスの形成を促進する細胞を選択すること、及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む。ある実施態様において、前記基質は、フィブロネクチンを含む。ある実施態様において、該方法は、CD9、CD29、CD54、CD90、CD166又はそれらの組合せの少なくとも1つを発現する細胞を選択することを含む。ある実施態様において、該方法は、CD31、CD34、CD117、CD133、CD200又はそれらの組合せの少なくとも1つを発現する細胞を選択することを含む。

該幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-であり、該細胞は、凍結保存され、該集団は、容器内に収容される。ある実施態様において、該細胞は、凍結保存され、前記集団は、容器内に収容され、前記幹細胞は、鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに鉱化マトリックスを形成する。

ある実施態様において、該容器は、液体の静脈内送達に好適な袋である。ある実施態様において、該集団は、1×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10¹⁰個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該幹細胞は、5回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、10回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、15回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、20回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、前記容器内で増殖されている。ある実施態様において、該集団は、0.9%NaCl溶液に含まれる。

別の実施態様において、骨形成細胞を作成する方法であって、複数の胎盤幹細胞又は単離された胎盤幹細胞の集団を、前記幹細胞が骨形成細胞に分化する条件下で培養することを含み、前記培養が、前記骨形成細胞が、検出可能な量の鉱化カルシウムを生成する、又はその生成を促進するのに十分な時間にわたって行われる方法を本明細書に示す。

別の態様において、マトリックスを処方するための方法であって、胎盤幹細胞の集団を移植可能な骨格基質と組み合わせることを含み、前記幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である方法を本明細書に示す。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-である。ある他の実施態様において、該胎盤幹細胞は、接着性である。具体的な実施態様において、該接着性胎盤幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺であるか;CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺であるか; CD200⁺及びOCT-4⁺であるか; CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であるか; CD73⁺及びCD105⁺であり、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;又はOCT-4⁺であり、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;或いはそれらの組合せである。非接着性胎盤幹細胞のより具体的な実施態様において、単離されたCD200⁺、HLA-G⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺であり;単離されたCD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺であり;単離されたCD200⁺、OCT-4⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であり;前記CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞がCD34^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である請求項1の単離された細胞であり;1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたCD73⁺及びCD105⁺幹細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-であり;且つ/又は1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたOCT-4⁺は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。ある実施態様において、該集団は、1×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10¹⁰個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該幹細胞は、5回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、10回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、15回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、20回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該集団は、増殖されている。

ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸β-三カルシウム基質、リン酸β-三カルシウム-コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、鉱化ヒト胎盤コラーゲン基質及びヒアルロン酸基質からなる群から選択される。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸β-三カルシウム基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸β-三カルシウム-コラーゲン基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、コラーゲン基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、リン酸カルシウム基質である。ある実施態様において、移植可能な骨格基質は、鉱化ヒト胎盤コラーゲン基質及び/又は骨格である。

ある実施態様において、注射可能組成物を処方するための方法であって、胎盤幹細胞の集団を注射可能ヒアルロン酸又はコラーゲンと組み合わせることを含み、前記幹細胞が、CD34⁺及びCD44^-である方法を本明細書に示す。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該集団は、増殖されている。ある実施態様において、該幹細胞は、接着性である。ある実施態様において、該組成物は、注射可能ヒアルロン酸を含む。ある実施態様において、該組成物は、注射可能コラーゲンを含む。また、非接着性細胞の集団及び注射可能ヒアルロン酸又はコラーゲンを含む組成物を本明細書に示す。

さらに別の態様において、対象における骨欠損を治療するための方法であって、該治療を必要とする対象に対して、CD34⁺及びCD44^-である幹細胞の集団を含む移植可能又は注射可能組成物を投与することによって、該対象における骨欠損を治療することを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、骨欠損は、(a)癌関連溶骨性病変、(b)骨折、又は固定を必要とする脊椎である。ある実施態様において、溶骨性病変は、多発性骨髄腫、骨癌又は転移癌に関連する。ある実施態様において、骨折は、偽関節骨折である。ある実施態様において、非接着性幹細胞の集団を含む移植可能組成物を該対象に投与する。ある実施態様において、移植可能組成物を外科移植する。ある実施態様において、非接着性幹細胞の集団を含む注射可能組成物を該対象に投与する。ある実施態様において、注射可能組成物を骨欠損の領域に外科投与する。ある実施態様において、注射可能組成物を全身投与する。

ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、該集団は、増殖されている。

別の態様において、対象における骨欠損を治療するための方法であって、該治療を必要とする対象に対して、CD34^-である幹細胞の集団を含む移植可能又は注射可能組成物を投与することによって、該対象における骨欠損を治療することを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、骨欠損は、(a)癌関連溶骨性病変、(b)骨折、又は固定を必要とする脊椎である。ある実施態様において、溶骨性病変は、多発性骨髄腫、骨癌又は転移癌に関連する。ある実施態様において、骨折は、偽関節骨折である。ある実施態様において、接着性幹細胞の集団を含む移植可能組成物を該対象に投与する。ある実施態様において、移植可能組成物を外科移植する。ある実施態様において、接着性幹細胞の集団を含む注射可能組成物を該対象に投与する。ある実施態様において、注射可能組成物を骨欠損の領域に外科投与する。ある実施態様において、注射可能組成物を全身投与する。

非接着性胎盤幹細胞のより具体的な実施態様において、単離されたCD200⁺、HLA-G⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺であり;単離されたCD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺であり;単離されたCD200⁺、OCT-4⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であり;前記CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞がCD34^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である請求項1の単離された細胞であり;1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたCD73⁺及びCD105⁺幹細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-であり;且つ/又は1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたOCT-4⁺は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。ある実施態様において、該集団は、1×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁶個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁷個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁸個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、5×10⁹個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、1×10¹⁰個の前記幹細胞を含む。ある実施態様において、該幹細胞は、5回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、10回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、15回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該幹細胞は、20回以下の回数で継代されている。ある実施態様において、該集団は、増殖されている。

また、哺乳類の胎盤由来の幹細胞の集団を作成する方法を本明細書に示す。一実施態様において、例えば、(a)基材に接着され、かつ(b)CD200とHLA-Gを発現する細胞を選択すること;及び、前記細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成すること;を含む、細胞集団の作成方法を本明細書に示す。他の実施態様において、細胞集団の作成方法を本明細書に示すが、該方法は、(a)基材に接着され、かつ(b)CD73、CD105及びCD200を発現する細胞を選択すること;及び、前記細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成すること;を含む。他の実施態様において、細胞集団の作成方法を本明細書に示すが、該方法は、(a)基材に接着され、かつ(b)CD200及びOCT-4を発現する細胞を選択すること;及び、前記細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成すること;を含む。さらに他の実施態様において、細胞集団の作成方法を本明細書に示すが、該方法は、(a)基材に接着され、(b)CD73及びCD105を発現し、かつ(c)胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において胎盤細胞の集団とともに培養されるとき、1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する細胞を選択すること;及び、前記細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成すること;を含む。他の実施態様において、細胞集団の作成方法を本明細書に示すが、該方法は、(a)基材に接着され、かつ(b)CD73、CD105及びHLA-Gを発現する細胞を選択すること;及び、前記細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成すること;を含む。また、細胞集団の作成方法を本明細書に示すが、該方法は、(a)基材に接着され、(b)OCT-4を発現し、かつ(c)胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において胎盤細胞の集団とともに培養されるとき、1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する細胞を選択すること;及び、前記細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成すること;を含む。前述した方法のうちのいずれかの具体的な実施態様において、前記基材は、フィブロネクチンを含む。他の具体的な実施態様において、該方法は、ABC-pを発現する細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、該方法は、間葉系幹細胞に特異的な、少なくとも1つの特徴を示す細胞を選択することを含む。より具体的な実施態様において、間葉系幹細胞に特異的な前記特性は、CD29の発現、CD44の発現、CD90の発現、又はこれらの組合せの発現である。該方法の他の具体的な実施態様において、前記選択は、抗体を使用することにより達成される。他の具体的な実施態様において、前記選択は、フローサイトメトリーを使用することにより達成される。さらに他の具体的な実施態様において、前記選択は、磁性ビーズを使用することにより達成される。他の具体的な実施態様において、前記選択は、蛍光活性化細胞分類を利用することにより達成される。上記方法の具体的な実施態様において、前記細胞集団は、拡大される。

さらに、幹細胞株を生成する方法を本明細書に示し、該方法は、成長促進タンパク質をコードするDNA配列で幹細胞を形質転換させること;及び、前記幹細胞を、前記成長促進タンパク質の生成を促進する条件に露出させること;を含む。具体的な実施態様において、前記成長促進タンパク質は、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス、又はヒトパピローマウイルスE7タンパク質である。より具体的な実施態様において、前記DNA配列は、調節可能である。他の具体的な実施態様において、前記DNA配列は、テトラサイクリンによって調節可能である。他の具体的な実施態様において、前記成長促進タンパク質は、調節可能な活性を有する。他の具体的な実施態様において、前記成長促進タンパク質は、温度感受性突然変異体である。

さらに、凍結保存された幹細胞集団を本明細書に示す。例えば、CD200⁺、HLA-G⁺幹細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記細胞は、凍結保存されており、前記集団は、容器内に収容されている。また、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺幹細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記細胞は、凍結保存されており、前記集団は、容器内に収容されている。また、CD200⁺、OCT-4⁺幹細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記細胞は、凍結保存されており、前記集団は、容器内に収容されている。また、CD73⁺、CD105⁺幹細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記細胞は、凍結保存されており、前記集団は、容器内に収容され、前記幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において胎盤細胞の集団とともに培養されるとき、1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。さらに、CD73⁺、CD105⁺、HLA-G⁺幹細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記細胞は、凍結保存されており、前記集団は、容器内に収容されている。また、OCT-4⁺幹細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記細胞は、凍結保存されており、前記集団は、容器内に収容され、前記幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において胎盤細胞の集団とともに培養されるとき、1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。前記の凍結保存された集団のうちのいすれかの具体的な実施態様において、前記容器は、バッグである。多様な具体的実施態様において、前記集団は、約、少なくとも、或いは多くても、1×10⁶個の前記幹細胞、5×10⁶個の前記幹細胞、1×10⁷個の前記幹細胞、5×10⁷個の前記幹細胞、1×10⁸個の前記幹細胞、5×10⁸個の前記幹細胞、1×10⁹個の前記幹細胞、5×10⁹個の前記幹細胞、又は、1×10¹⁰個の前記幹細胞を含む。前記の凍結保存された集団のうちのいずれかの他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、約、少なくとも、或いは、5回以下、10回以下、15回以下、又は20回以下、継代された。前記の凍結保存された集団のうちのいずれかの他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、前記容器内で増殖されてきた。

さらに、鉱化コラーゲンマトリックスを調製するための方法であって、コラーゲンを鉱化すること、及び鉱化したコラーゲンマトリックスを架橋することを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、該コラーゲンは、胎盤コラーゲンである。ある実施態様において、該コラーゲンは、リン酸カルシウムで鉱化される。ある実施態様において、該コラーゲンは、ブタンジオールジグリシジルエーテルで架橋される。ある実施態様において、鉱化反応におけるリン酸カルシウムのコラーゲンに対する比は、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10又は95:5である。

(3.1 定義)
本明細書において使用する用語「SH2」とは、遺伝標識のCD105上に、エピトープに結合されている抗体を意味する。したがって、SH2⁺と称される細胞は、CD105⁺である。

本明細書において使用する用語「SH3」及び「SH4」とは、遺伝標識のCD73上に、エピトープに結合されている抗体を意味する。したがって、SH3⁺及び/又はSH4⁺と称される細胞は、CD73⁺である。

本明細書において使用する用語「単離された幹細胞」とは、他のもの、すなわち幹細胞が由来する、例えば、胎盤等の組織の非幹細胞から実質的に分離された幹細胞を意味する。例えば、幹細胞を回収及び/又は培養する間に、幹細胞が自然的に関連の非幹細胞の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は少なくとも99%が前記幹細胞から除去された場合、幹細胞は「単離される」。

本明細書において使用する用語「単離された細胞の集団」とは、細胞の集団が由来する、例えば、胎盤等の組織の他の細胞から実質的に分離されている細胞の集団を意味する。例えば、該幹細胞を回収及び/又は培養する間に、細胞の集団が由来する細胞又は細胞の集団が自然的に関連の細胞の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は少なくとも99%が該幹細胞から除去された場合、幹細胞は「単離される」。

本明細書において使用する用語「胎盤幹細胞」は、形態学、細胞表面の遺伝標識、又は初代培養後の継代の回数に関係なく、哺乳類の胎盤由来の幹細胞や前駆細胞を意味する。しかし、本明細書において使用する用語「胎盤幹細胞」は、トロホブラストを意味しない。若し、細胞が、少なくとも1つの幹細胞の特徴を保有していれば、細胞は「幹細胞」として見なされ、該幹細胞の特徴は、例えば、1個以上の幹細胞型と関連の遺伝標識又は遺伝子発現プロファイル;培養中に、少なくとも10〜40回複製する能力、すべての3つの遺伝子層の細胞に分化される能力;成体(すなわち、分化された)細胞特徴の不足等である。用語「胎盤幹細胞」及び「胎盤由来の幹細胞」は、交換的に用いられることがある。

本明細書において使用する「胎盤潅流液」とは、胎盤を流れている間に潅流溶液によって回収された複数の細胞を含む、胎盤、例えばヒト胎盤の少なくとも一部、例えば、胎盤血管系を流れた潅流溶液を指す。

本明細書において使用する、「胎盤潅流細胞」とは、胎盤潅流液から単離された、又は単離可能な有核細胞、例えば全有核細胞を指す。

この明細書において使用されているように、遺伝標識を検出することができる場合、幹細胞は、特定の遺伝標識に対して「陽性」である。例えば、胎盤幹細胞は、例えばCD73に対して陽性である。なぜなら、CD73は、胎盤幹細胞の上でバックグラウンド(例えば、アイソタイプ対照と比較して)よりも検出可能なほど、多量に検出することができるからである。遺伝標識を使用して、細胞を少なくとも1つの他の細胞型と区別することができる場合、又は細胞によって発現されるか、示される場合に、遺伝標識を使用して細胞を選択するか単離することができる場合、細胞は、また、前記遺伝標識に対して陽性である。

本明細書において使用する、「骨形成細胞」とは、骨の主要構成要素であるヒドロキシアパタイトを堆積することが可能であるか、又はヒドロキシアパタイトを堆積することが可能な細胞に分化することが可能である細胞である。「骨形成細胞」とは、具体的には、骨芽細胞又は骨細胞を通常指す細胞を包括するものと考えられる。

本明細書において使用する、「マトリックス」とは、三次元基質全体に分散された小腔を特徴とする三次元基質を指す。小腔は、例えば、マトリックス内の細胞、例えば、幹細胞、胎盤由来接着性幹細胞及び/又は骨形成細胞の成長に好適である。代表的なマトリックスとしては、リン酸β-三カルシウム基質、リン酸β-三カルシウム-コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、鉱化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質及びセラミック基質が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、マトリックスは、マトリックスの小腔に存在する骨形成細胞によって鉱化され得る。

(4. 図面の簡単な説明)
(A)潅流、(B)羊膜、(C)絨毛膜、(D)羊膜-絨毛膜プレート又は(E)臍帯からの胎盤幹細胞の生存能力を示す。X軸上の数字は、幹細胞が採取される胎盤を示している。

FACSCaliburによって決定されるものとして、(A)潅流、(B)羊膜、(C)絨毛膜、(D)羊膜-絨毛膜プレート又は(E)臍帯からのHLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺細胞の百分率である。X軸上の数字は、幹細胞が採取される胎盤を示している。

FACSAriaによって決定されるものとして、潅流(A)、羊膜(B)、絨毛膜(C)、羊膜-絨毛膜プレート(D)又は臍帯(E)からのHLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺細胞の百分率である。X軸上の数字は、幹細胞が採取される胎盤を示している。

胎盤潅流液から採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。

羊膜から採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。

絨毛膜から採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。

羊膜-絨毛膜プレートから採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。

臍帯から採取される幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現である。

(A)潅流、(B)羊膜、(C)絨毛膜、(D)羊膜-絨毛膜プレート又は(E)臍帯から採取された幹細胞内のHLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200の発現の平均発現である。

本研究において使用された、羊膜/絨毛膜(AC)、臍帯(UC)、骨髄由来の幹細胞(BM-MSC)、及びヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)細胞株に対する培養時間経過を示す。すべての培養は、同一の播種及び過程密度を用いて成長及び増殖された。円は、培養がRNA単離に使用されたことを表示する。最後の培養は、老化の直前に採取された。2つのUC培養は、38倍加UC-38)で採取され、遺伝子発現に対するトリプシン処理の効果を比べた。すべての他の培養は、RNA単離の前に、それらの培養フラスコの内で、直接溶解単離されている。

羊膜/絨毛膜(AC)、臍帯(UC)、骨髄由来の幹細胞(BM-MSC)、及びヒト皮膚線維芽細胞(DF)細胞内における8215個の遺伝子の相対的な発現レベルを表する線グラフである。X軸上におけるそれぞれの細胞株と関連の数字は、遺伝子発現レベルを評価する前に、細胞株が培養された日数を表示する。このチャートは、GeneSpringソフトウェアによって分析されたRNA発現より作成された。AC-03は、選択された条件として使用された。

羊膜/絨毛膜(AC)、臍帯(UC)、骨髄由来の幹細胞(BM-MSC)、及びヒト皮膚線維芽細胞(DF)細胞に対する、AC-03内における6倍以上の過発現された遺伝子を見せるすべての遺伝子リストのサブセットである。X軸上におけるそれぞれの細胞株に関連の数字は、遺伝子発現レベルを評価する前に、細胞株が培養された日数を意味する。このチャートは、GeneSpringソフトウェアによって分析されたRNA発現より作成さた。AC-03は、選択された条件として使用された。

羊膜/絨毛膜(AC)、臍帯(UC)、骨髄由来の幹細胞(BM-MSC)、及びヒト皮膚線維芽細胞(DF)細胞に対する層変化フィルタリングによって発見された、臍帯幹細胞特徴の遺伝子又は胎盤幹細胞特徴の遺伝子を示す。X軸上におけるそれぞれの細胞株に関連の数字は、遺伝子発現レベルを評価する前に、細胞株が培養された日数を意味する。このチャートは、GeneSpringソフトウェアによって分析されたRNA発現より作成された。AC-03は、選択された条件として使用された。

2つの異なる培地処方物で培養された胎盤幹細胞(図14A)及び間葉幹細胞(図14B)のアルカリホスファターゼ活性である。

2つの異なる培地処方物で培養された胎盤幹細胞(図15A)の鉱化である。

OS培地で誘発されたが、アントロ1B培地で誘発されなかった胎盤幹細胞による鉱物の堆積である。

2つの異なる骨格上で成長した胎盤幹細胞及び間葉幹細胞の成長の時間経過である。

リン酸β-三カルシウム基質上のOS培地及びアントロ1B培地で成長した胎盤幹細胞及び間葉幹細胞の走査電子顕微鏡写真(20倍)である。

リン酸β-三カルシウム基質上のOS培地及びアントロ1B培地で成長した胎盤幹細胞及び間葉幹細胞の走査電子顕微鏡写真(5000倍)である。 DMEMでなく、OS培地で培養後のカルシウム鉱化を示す、間葉幹細胞、及びヒト潅流胎盤細胞から得た幹細胞のアリザリン赤色染色である。リン酸β-三カルシウム基質の存在下にてOS培地で10日間培養した後の間葉幹細胞及び幹細胞のAP活性である。コラーゲン原線維(パネルA)及び鉱化コラーゲン原線維(パネルB)を示す電子顕微鏡写真である。架橋鉱化コラーゲンの最終鉱物/コラーゲン比は、入力鉱物/コラーゲン比に近かったことを示す図である。移植後3週間目の頭蓋欠損の組織切片である。欠損内の大きなボンドの堆積物を胎盤幹細胞HEALOS(商標)外植体に見ることができる。移植後7週間目の頭蓋欠損のX線解析である。図25A:矢印は、陽性対照の外植体BMP-2+HEALOS(商標)を示す。図25B:矢印は、骨堆積を示す胎盤幹細胞+HEALOS(商標)外植体を示す。図25C:陰性対照HEALOS(商標)単独、及び外植体を使用しない場合の頭蓋欠損。密度測定による骨形成の定量である。グレースケール(Y軸)の増加は、骨密度/体積の増加を示す。X軸:治療クラス。

(5. 詳細な説明)
(5.1 胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞集団)
胎盤幹細胞は、胎盤又はその一部から得られる幹細胞であり、これは、組織培養基材に接着されて、非胎盤細胞型に分化する能力を有する。胎盤幹細胞は、由来において胎児又は母親であってもよい(すなわち、母親又は胎児の遺伝子型を有することができる)。胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、由来において単独で胎児又は母親である胎盤幹細胞を含むか、又は胎児と母親由来の両方共の胎盤幹細胞が混合された集団を含むことができる。胎盤幹細胞及び胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、以下において説明される形態学的、遺伝標識及び培養特性によって選択され、確認することができる。

(5.1.1 物理的及び形態学的特性)
本明細書に示す非接着性のCD34⁺幹細胞は、一次培養又は細胞培養で培養されたときに、典型的には、組織培養基質に接着しない。培養における非接着性幹細胞は、典型的には、骨髄又は末梢血液からのCD34⁺幹細胞と同様に、丸みを帯びているように見える。
本明細書に示された接着性の胎盤幹細胞は、初代培養中に又は細胞培養中に培養されるとき、組織培養基材、例えば、組織培養容器の表面(例えば、組織培養プラスチック)に接着される。培養において胎盤幹細胞は、一般に、中心細胞本体から拡張される多くの細胞質の突起とともに、星型のような外観の、線維芽細胞型と推定される。しかし、胎盤幹細胞が線維芽細胞よりも非常に多い数のそのような突起を示すように、胎盤幹細胞は、同一の条件下において培養される線維芽細胞から形態学的に区別することができる。形態学的に、胎盤幹細胞は、さらに造血幹細胞から分化することができ、この際、一般に、培養状態で、より丸いか又は敷石形態と推定される。

(5.1.2 細胞表面、分子及び遺伝的標識)
非接着性胎盤幹細胞:一実施態様において、非接着性である単離された胎盤幹細胞を本明細書に示す。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD34⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD44^-である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、単離された幹細胞は、潅流によって、又は胎盤組織の物理的若しくは生化学的破壊、例えば酵素消化によってヒト胎盤から単離されている。ある実施態様において、ある実施態様において、単離された幹細胞は、潅流によってヒト胎盤から単離されている。ある実施態様において、単離された幹細胞は、胎盤細胞の集団が、鉱化マトリックスの形成を可能にする条件下で培養されたときに前記集団における鉱化マトリックスの形成を促進する。

別の実施態様において、非接着性である単離された胎盤細胞の集団を本明細書に示す。ある実施態様において、該集団は、CD34⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD44^-である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD34⁺及びCD44^-である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、前記細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-幹細胞である幹細胞を含む。ある実施態様において、該集団は、前記細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-幹細胞である幹細胞を含む。

別の態様において、CD34⁺及びCD44^-である単離された胎盤幹細胞の集団を本明細書に示す。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-幹細胞である。ある実施態様において、該幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-幹細胞である。

接着性胎盤幹細胞:本明細書に示す接着性胎盤幹細胞、及び胎盤幹細胞の集団は、該幹細胞、及び該幹細胞を含む細胞の集団を同定及び/又は単離するのに使用できる複数のマーカを発現する。本明細書に示された接着性胎盤幹細胞及び幹細胞集団(すなわち、2つ以上の胎盤幹細胞)は、胎盤又はその任意の部位(例えば、羊膜、絨毛膜、胎盤葉、臍帯等)から直接得られる、幹細胞及び幹細胞を含む細胞集団を含む。また、胎盤幹細胞の集団は、培養状態で(すなわち、2つ以上の)接着性胎盤幹細胞の集団と、例えばバッグのような容器内で集団を含む。しかし、胎盤幹細胞は、トロホブラストではない。

本明細書に示された接着性胎盤幹細胞は、一般に、標識、CD73、CD105、CD200、HLA-G、及び/又はOCT-4を発現し、CD34、CD38、又はCD45を発現しない。胎盤幹細胞は、さらに、HLA-ABC(MHC-I)及びHLA-DRを発現することができる。このような標識は、胎盤幹細胞を同定して、胎盤幹細胞を他の幹細胞型から区分するために用いることができる。胎盤幹細胞は、CD73及びCD105を発現することができるため、それらは、間葉系幹細胞のような特徴を有することができる。しかし、胎盤幹細胞は、胎児-特異性標識である、CD200及びHLA-Gを発現することができるため、それらは、CD200もHLA-Gも発現することができない、例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞のような間葉系幹細胞から区分することができる。同様に、CD34、CD38及び/又はCD45の発現不足は、胎盤幹細胞を非造血幹細胞として同定する。しかし、胎盤幹細胞のある部分集合は、例えば、CD34を発現することができ、依然として本明細書に示す胎盤幹細胞と考えられ得る。

したがって、一実施態様において、CD200⁺又はHLA-G⁺である、単離された接着性胎盤幹細胞を本明細書に示す。具体的な実施態様において、該幹細胞は、胎盤幹細胞である。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺である。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記CD200⁺又はHLA-G⁺幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団内で胚様体様組織体の形成を促進する。

他の実施態様において、さらに、多数の胎盤細胞から胎盤幹細胞を選択する方法を本明細書に示すが、該方法は、CD200又はHLA-G胎盤細胞を選択することを含み、ここで、前記細胞は、胎盤幹細胞である。具体的な実施態様において、前記選択は、CD200⁺及びHLA-G⁺の両方である胎盤細胞を選択することを含む。具体的な実施態様において、前記選択は、また、CD73⁺及びCD105⁺である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、さらに、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団内で胚様体様組織体の形成をさらに促進する胎盤細胞を選択することを含む。

他の実施態様において、単離されたCD200⁺、HLA-G⁺胎盤幹細胞を含む、細胞の単離された集団を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記集団は、胎盤細胞の集団である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、単離されたCD200⁺、HLA-G⁺胎盤幹細胞の集団である。多様な実施態様において、前記細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、CD200⁺、HLA-G⁺幹細胞である。好ましくは、前記細胞の少なくとも約70%は、CD200⁺、HLA-G⁺幹細胞である。より好ましくは、前記細胞の少なくとも約90%、95%、又は99%は、CD200⁺、HLA-G⁺幹細胞である。該単離された集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、またCD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、またCD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、またCD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺である。他の実施態様において、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、前記単離された集団は、1個以上の胚様体様組織体を生成する。

他の実施態様において、多数の胎盤細胞から胎盤幹細胞集団を選択する方法を本明細書に示すが、該方法は、前記細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%がCD200⁺、HLA-G⁺幹細胞である胎盤細胞の集団を選択することを含む。具体的な実施態様において、前記選択は、またCD73⁺及びCD105⁺である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-、又はCD45^-である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、また胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、1個以上の胚様体様組織体を形成する胎盤幹細胞の集団を選択することを含む。

他の実施態様において、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺である、単離された幹細胞を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記単離された幹細胞は、単離された接着性胎盤幹細胞である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、及びHLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、該単離されたCD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において前記集団が培養されるとき、幹細胞を含む胎盤細胞の集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。

他の実施態様において、本発明は、さらに、多数の胎盤細胞から胎盤幹細胞を選択する方法を本明細書に示すが、該方法は、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺胎盤細胞を選択することを含み、ここで、前記細胞は、胎盤幹細胞である。具体的な実施態様において、前記選択は、またHLA-G⁺である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-、又はCD45^-である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-及びCD45^-である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、さらに、胚様体様組織体の形成を促進する条件下において該集団が培養されるとき、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する、CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺幹細胞を選択することを含む。

他の実施態様において、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺幹細胞を含む、細胞の単離された集団を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胎盤幹細胞である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺である単離された胎盤幹細胞の集団である。多様な実施態様において、前記細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺幹細胞である。他の実施態様において、前記細胞の集団において前記細胞の少なくとも約70%は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺幹細胞である。他の実施態様において、前記細胞の集団において前記細胞の少なくとも約90%、95%又は99%は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、またCD34^-、CD38^-及びCD45^-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、及びHLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、前記細胞の集団は、1個以上の胚様体様組織体を生成する。

他の実施態様において、多数の胎盤細胞から胎盤幹細胞集団を選択する方法を本明細書に示すが、該方法は、胎盤細胞の集団を選択することを含み、ここで、前記細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺幹細胞である。具体的な実施態様において、前記選択は、またHLA-G⁺である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-、又はCD45^-である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-及びCD45^-である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-、CD45^-、及びHLA-G⁺である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、また、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において該集団が培養されるとき、1個以上の胚様体様組織体を生成する胎盤細胞の集団を選択することをさらに含む。

また、CD200⁺及びOCT-4⁺である、単離された幹細胞を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胎盤幹細胞である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、該幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において該集団が培養されるとき、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団により、1個以上の胚様体様組織体の生成を促進する。

他の実施態様において、多数の胎盤細胞から胎盤幹細胞を選択する方法を本明細書に示すが、該方法は、CD200⁺及びOCT-4⁺胎盤細胞を選択することを含み、ここで、前記細胞は、胎盤幹細胞である。具体的な実施態様において、前記選択は、またHLA-G⁺である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において該集団が培養されるとき、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団により、また1個以上の胚様体様組織体の生成を促進する胎盤幹細胞を選択することを含む。

また、CD200⁺、OCT-4⁺幹細胞を含む、細胞の単離された集団を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胎盤幹細胞である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、CD200⁺、OCT-4⁺幹細胞の集団である。多様な実施態様において、前記細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、CD200⁺、OCT-4⁺幹細胞である。他の実施態様において、前記細胞の集団において前記細胞の少なくとも約70%は、CD200⁺、OCT-4⁺幹細胞である。他の実施態様において、前記細胞の集団において前記細胞の少なくとも約90%、95%又は99%は、CD200⁺、OCT-4⁺幹細胞である。該単離された集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、HLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、またCD34^-、CD38^-及びCD45^-である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。他の具体的な実施態様において、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、該集団は、1個以上の胚様体様組織体を生成する。

他の実施態様において、多数の胎盤細胞から胎盤幹細胞集団を選択する方法を本明細書に示すが、該方法は、胎盤細胞の集団を選択することを含み、ここで、前記細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%は、CD200⁺、OCT-4⁺幹細胞である。具体的な実施態様において、前記選択は、またCD73⁺及びCD105⁺である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またHLA-G⁺である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-及びCD45^-である幹細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、またCD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。

また、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である、単離された幹細胞を本明細書に示す。具体的な実施態様において、該幹細胞は、胎盤幹細胞である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において前記集団が培養されるとき、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団において胚様体様組織体の形成を促進する。

他の実施態様において、また、多数の胎盤細胞から胎盤幹細胞を選択する方法を本明細書に示すが、該方法は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺胎盤細胞を選択することを含み、ここで、前記細胞は、胎盤幹細胞である。具体的な実施態様において、前記選択は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またOCT-4⁺である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD200⁺である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、またCD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である胎盤細胞を選択することを含む。他の具体的な実施態様において、前記選択は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において前記集団が培養されるとき、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団において1個以上の胚様体様組織体の形成をさらに促進する胎盤細胞を選択することを含む。

また、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞を含む、細胞の単離された集団を本明細書に示す。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胎盤幹細胞である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞の集団である。多様な実施態様において、前記細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、又は少なくとも約60%は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞である。他の実施態様において、前記細胞の集団において前記細胞の少なくとも約70%は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞である。他の実施態様において、前記細胞の集団において前記細胞の少なくとも約90%、95%又は99%は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、またCD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である。他の実施態様において、多数の胎盤細胞から胎盤幹細胞集団を選択する方法を本明細書に示すが、該方法は、胎盤細胞の集団を選択することを含み、ここで、前記細胞の大多数は、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺である。具体的な実施態様において、前記細胞の大多数は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。別の具体的な実施態様において、前記細胞の大多数は、また、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記細胞の大多数は、またCD200⁺である。他の具体的な実施態様において、前記細胞の大多数は、またCD34^-、CD38^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である。

他の実施態様において、CD73⁺及びCD105⁺である、単離された幹細胞を本明細書に示し、ここで、この幹細胞は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において前記集団が培養されるとき、前記幹細胞を含む単離された幹細胞の集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。

また、CD73⁺、CD105⁺幹細胞を含む、単離された胎盤細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記集団は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において、1個以上の胚様体様組織体を形成する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、胎盤幹細胞である。別の具体的な実施態様において、前記集団は、CD73⁺、CD105⁺幹細胞である胎盤幹細胞の集団であり、前記集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で1つ以上の胚様体を形成する。多様な実施態様において、前記単離された胎盤細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%は、CD73⁺、CD105⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回の継代で、拡大されてきた。

また、OCT-4⁺である、単離された幹細胞を本明細書に示し、これは、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、前記幹細胞を含む単離された胎盤細胞の集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。

また、OCT-4⁺幹細胞を含む、単離された胎盤細胞の集団を本明細書に示し、ここで、前記集団は、胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において培養されるとき、1個以上の胚様体様組織体を形成する。具体的な実施態様において、該幹細胞は、胎盤幹細胞である。別の具体的な実施態様において、前記集団は、OCT-4⁺幹細胞である胎盤幹細胞の集団であり、前記集団は、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに1つ以上の胚様体を形成する。多様な実施態様において、前記単離された胎盤細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%は、OCT-4⁺幹細胞である。上記集団の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺及びCD105⁺である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD34^-、CD38^-、又はCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD200⁺である。より具体的な実施態様において、前記幹細胞は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-、及びCD45^-である。他の具体的な実施態様において、前記集団は、例えば、少なくとも1回、少なくとも3回、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも15回、又は少なくとも20回の継代で、拡大されてきた。

さらに、酵素による消化(5.2.3節を参照)や潅流(5.2.4節を参照)によって得られる胎盤幹細胞を本明細書に示す。例えば、下記の方法によって作成された胎盤幹細胞の単離された集団を本明細書に示すが、該方法は、臍帯血が除去され、潅流されて、残留血液を除去された哺乳類の胎盤を潅流させることと、前記胎盤を潅流液とともに潅流させることと、前記潅流液を回収することであって、潅流後の前記潅流液は、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を含み、及び、前記細胞の集団から多数の前記胎盤幹細胞を単離すること、を含む。具体的な実施態様において、潅流液は、胎盤から染み出た後に、臍帯静脈及び臍帯動脈の両方ともに通過して、回収される。該方法で作成された胎盤幹細胞の集団は、典型的に、胎児と母親の細胞の混合物を含む。他の具体的な実施態様において、潅流液は、臍帯静脈を通過して、臍帯動脈から回収されるか、或いは、臍帯動脈を通過して、臍帯静脈から回収される。該方法で作成された胎盤幹細胞の集団は、典型的に、由来において実質的に単独に胎児系である。すなわち、該集団において該胎盤幹細胞の90%、95%、99%、又は99.5%より多くが、由来において胎児系である。

多様な実施態様において、胎盤の潅流から得られた細胞の集団の内に含まれている胎盤幹細胞は、胎盤細胞の前記集団の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%又は少なくとも99.5%である。他の具体的な実施態様において、潅流により回収された該胎盤幹細胞は、胎児及び母親の細胞を含む。さらに他の具体的な実施態様において、潅流により回収された前記胎盤幹細胞は、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%又は少なくとも99.5%胎児細胞である。

他の具体的な実施態様において、潅流により回収した、単離された胎盤幹細胞の集団を含む組成物を本明細書に示すが、ここで、前記組成物は、少なくとも、前記胎盤幹細胞を回収するために使用される潅流液の一部分を含む。

さらに、本明細書に記述された、下記の方法で作成された胎盤幹細胞の単離された集団を本明細書に示すが、該方法は、組織崩壊酵素で胎盤組織を消化させて、胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団を得ること、及び前記胎盤細胞の残りから多数の胎盤幹細胞を単離することを含む。該胎盤の全体、又はある部分は、胎盤幹細胞を獲得するために消化されることができる。具体的な実施態様において、例えば、前記胎盤組織は、全体胎盤、羊膜、絨毛膜、羊膜と絨毛膜の組合せ、又はこれらのうちのいずれかの組合せであることができる。他の具体的な実施態様において、前記組織崩壊酵素は、トリプシンやコラゲナーゼである。多様な実施態様において、胎盤を消化させて得られる細胞の集団の内に収容された該胎盤幹細胞は、前記胎盤細胞の集団の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%又は少なくとも99.5%である。

遺伝子プロファイリングは、単離された接着性胎盤幹細胞、及び単離された胎盤幹細胞の集団が、他の細胞、例えば、間葉系幹細胞や骨髄由来の幹細胞等と区別可能であることを確認する。本明細書中に記述された該接着性胎盤幹細胞は、1個以上の遺伝子の発現に基づいて間葉系幹細胞と区別することができ、この発現は、骨髄由来の間葉系幹細胞と比較して、胎盤幹細胞や臍帯幹細胞に特異的である。とりわけ、接着性胎盤幹細胞は、1個以上の遺伝子の発現に基づいて間葉系幹細胞と区別することができ、この発現は、間葉系幹細胞よりも胎盤幹細胞内において有意により高く(すなわち、少なくとも、2倍高い)、ここで、該1個以上の遺伝子は、ACTG2、ADARBl、AMIGO2、ATRS-1、B4GALT6、BCHE、C11orf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、ICAMl、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAKl、PCDH7、PDLIM3、PJP2、RTNl、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A、又はこれらのいずれかの組合せであって、ここで、均等の条件下において幹細胞が成長させられる場合、骨髄由来の幹細胞よりも胎盤幹細胞や臍帯幹細胞内において、このような遺伝子の発現がより高い。具体的な実施態様において、該胎盤幹細胞に特異的な、又は臍帯幹細胞に特異的な遺伝子は、CD200である。

このような遺伝子の発現レベルは、少なくとも多数の胎盤幹細胞等を含むことにより、胎盤細胞の集団の正体を同定するか、細胞の集団を同定することに使用することができる。正体が同定された胎盤幹細胞の集団は、クローン化することができる。例えば、拡大された胎盤幹細胞の集団は、単一の胎盤幹細胞、又は幹細胞の混合された集団を形成し、ここで、混合された集団の例としては、複合胎盤幹細胞から増殖された胎盤幹細胞を単独に含む細胞の集団、又は胎盤幹細胞と少なくとも1個の他の型の細胞とを含む細胞の集団が挙げられる。

このような遺伝子の発現のレベルは、接着性胎盤幹細胞の集団を選択することに使用することができる。例えば、若し1個以上の遺伝子の発現が、間葉系幹細胞の同一の集団よりも細胞の集団からの標本において有意により高い場合、細胞の集団、例えば、クローン的に拡大された細胞の集団が選択される。そのような選択は、多数の胎盤幹細胞集団から、正体の知られていない多数の細胞集団からの集団になり得る。

接着性胎盤幹細胞は、1個以上のそのような遺伝子の発現レベルに基づいて、間葉系幹細胞対照において、前記1個以上の遺伝子における発現のレベルに比較して、選択することができる。一実施態様において、同等の数の間葉系幹細胞を含む試料において、前記1個以上の遺伝子の発現レベルは、対照として使用される。他の実施態様において、特定の条件下において試験された胎盤幹細胞に対する該対照は、前記条件下において、間葉系幹細胞における前記1個以上の遺伝子の発現レベルを表示する、数値である。

上記接着性又は非接着性胎盤幹細胞の単離された集団、及び一般的に胎盤幹細胞の集団は、約、少なくとも、又は1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹以下又はそれ以上、胎盤幹細胞を含むことができる。

(5.1.3 培養における成長)
本明細書に記述された胎盤幹細胞の成長は、部分的に、任意の哺乳類細胞に関する限り、成長のために選択された特殊な培地に依存している。最適の条件下において、胎盤幹細胞は、典型的に、3〜5日で数値的には2倍となる。培養の間に、本明細書に示された胎盤幹細胞は、培養基内の基材、例えば、組織培養容器の表面(例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンがコーティングされたプラスチック等)に接着して、単分子層を形成する。

本明細書に示された胎盤幹細胞を含む単離された接着性胎盤細胞の集団は、適切な条件下において培養されるとき、胚様体様組織体を形成する。すなわち、細胞の3次元的なクラスターが、接着した幹細胞レイヤの上に成長する。胚様体様組織体の内の細胞は、非常に初期の幹細胞、例えば、OCT-4、Nanog、SSEA3及びSSEA4と関連した標識を発現する。本明細書に記述された胎盤幹細胞は、接着力はあるが、該胚様体様組織体の内の細胞は、典型的に培養基材に対する接着力がない。しかし、培養の間、接着された細胞に接着した状態のままである。胚様体様組織体は、接着した幹細胞がなければ形成されないように、胚様体様組織体の細胞は、生存能力に対して、接着された胎盤幹細胞に依存的である。接着された胎盤幹細胞は、したがって、該接着された胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団において、1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する。理論に縛られることなく、該胚様体様組織体の細胞は、胚性幹細胞が細胞のフィーダー層上で生育するように、多くの該接着された胎盤幹細胞の上に生育するものと考えられる。間葉系幹細胞、例えば、骨髄由来の間葉系幹細胞は、培養状態で胚様体様組織体を発達させることがない。

(5.2 胎盤幹細胞を得る方法)
(5.2.1 幹細胞回収した組成物)
さらに、胎盤幹細胞を回収して、単離する方法を本明細書に示す。一般的に、幹細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば、幹細胞回収した組成物を使用して、哺乳類の胎盤から得られる。幹細胞回収した組成物は、2005年12月29日付で出願された、「胎盤幹細胞を回収して器官臓器を保護するための改善された培地」と題された米国仮出願第60/754,969号に詳しく説明されている。

幹細胞回収した組成物は、幹細胞の回収及び/又は培養に適した、どのような生理的に許容し得る溶液でも含むことができる。例えば、食塩水(例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クレブス溶液、又は改質されたクレブス溶液、イーグル溶液(0.9%NaCl等)、培養培地(例えば、DMEM、H.DMEM等)のようなものが挙げられる。

幹細胞回収した組成物は、回収時点から培養時点まで胎盤幹細胞を保護しようとする傾向がある、すなわち、細胞死から胎盤幹細胞を保護したり、或いは胎盤幹細胞の死を遅延させたり、死ぬ細胞の集団において胎盤幹細胞の数を減少させたりする、1個以上の成分を含むことができる。そのような組成物は、例えば、アポトーシス抑制剤(例えば、カスパーゼ阻害剤又はJNK阻害剤);血管拡張剤(例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン又は硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤等);壊死阻害剤例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、又はクロナゼパム);TNF-α阻害剤;及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボン(例えば、ペルフルオロオクチルブロマイド、ペルフルオロデシルブロマイド等)がある。

幹細胞回収した組成物は、1個以上の組織分解酵素を含むことができ、このようなものの例として、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、又はデオキシリボヌクレアーゼ等がある。そのような酵素は、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III又はIV、クロストリジウム・ヒストリチクム菌由来のコラゲナーゼ等)、ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、リベラーゼ、ヒアルロニダーゼ等を含むが、これに限定されるものではない。

幹細胞回収した組成物は、細菌を殺すか、細菌の発育を阻止するのに効果的な量の抗生剤を含むことができる。特定の制限のない実施態様において、抗生剤は、マクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフィキシム又はセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV)又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン又はノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等である。具体的な実施態様において、グラム(+)及び/又はグラム(-)バクテリア、例えば、緑膿菌、黄色ブドウ球菌等に対して有効である。

幹細胞回収した組成物は、また、1個以上の下記化合物を含むことができる:アデノシン(約1mM〜約50mM);D-グルコース(約20mM〜約100mM);マグネシウムイオン(約1mM〜約50mM);一実施態様において、内皮保全と細胞の生存能力を維持するために十分な量の分子量が20,000ダルトンよりも大きい巨大分子(例えば、合成又は自然発生的なコロイド、約25g/l〜約100g/l又は約40g/l〜約60g/lの、デキストラン又はポリエチレングリコール等の多糖類;酸化防止剤(例えば、約25μM〜約100μMのブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC又はビタミンE);還元剤(例えば、約0.1mM〜約5mMのN-アセチルシステイン);細胞内へのカルシウムの侵入を防止する薬剤(例えば、約2μM〜約25μMのベラパミル);ニトログリセリン(例えば、約0.05g/L〜約0.2g/ L );一実施態様において、現在残留血液の凝固を防止するのに十分な量の抗凝血剤(例えば、約1000 units/l〜約100,000 units/lの濃度のヘパリンやヒルジン);又は、化合物を含むアミロライド(例えば、約1.0μM〜約5μMのアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド又はイソブチルアミロライド)。

(5.2.2 胎盤の処理及び回収)
一般に、ヒトの胎盤は、誕生後の胎盤の放出後に直ぐ回収される。好ましい例では、胎盤と関連した患者の全病歴を記録した後、そして患者からのインフォームドコンセントを得た後に、胎盤は、患者から回収される。好ましくは、このような病歴は放出後にも続く。その病歴は、採取された胎盤や幹細胞の後続的使用を調整することに用いることができる。例えば、ヒト胎盤幹細胞は、その病歴を踏まえて、該胎盤と関連した幼児のための、又は親、兄弟姉妹若しくは幼児の他の血縁者のための個体用薬として使用することができる。

胎盤幹細胞の回収前に、臍帯血及び胎盤血液は除去される。具体的な実施態様において、分娩後に、胎盤にある臍帯血は回収される。胎盤は、従来の臍帯血の回収過程で処理することができる。典型的に針又はカニューレは、重力の補助で胎盤の放血をするために利用される(例えば、Andersonの米国特許第5,372,581号;Hesselらの米国特許第5,415,665号を参照)。針又はカニューレは、通常、臍帯静脈内に位置して、胎盤から臍帯血を排出するために、胎盤は、穏やかにマッサージすることができる。そのような臍帯血の回収は、商業的に実施され得る。例えば、LifeBank USA、Cedar Knolls、N.J.,ViaCord、Cord Blood Registry and Cryocellがある。好ましくは、胎盤は、臍帯血を回収する間、組織崩壊を最小化するために、これ以上の操作無しに重力排出される。

典型的に、胎盤は、分娩室(the delivery and birthing room)から別の位置、例えば実験室まで、臍帯血の回収のために、及び、例えば潅流や組織解離による幹細胞の回収のために輸送される。胎盤は、好ましくは、無菌の熱的に遮蔽された(20-28℃の間に胎盤の温度を維持する)輸送装置内、例えば、臍帯あたりをクランプで締めた状態で、無菌のジップロックビニールバッグの中に入れて、その後、遮蔽された容器内に胎盤を置いて、輸送される。他の実施態様において、胎盤は、2005年9月19日出願の係属中の米国特許出願第11/230,760号で説明されているように、実質的に臍帯血の回収キット内で輸送される。好ましくは、胎盤は、分娩後、実験室へ4〜24時間内に移送される。ある実施態様において、臍帯近傍の部分は、好ましくは、臍帯血の回収前に胎盤本体の中に、好ましくは4〜5cmの範囲で挿入され、クランプで締められる。他の実施態様において、臍帯近傍の部分は、臍帯血の回収後に、しかし、胎盤のさらなる処理の以前にクランプで締められる。

幹細胞の回収前に、胎盤は、無菌条件下、且つ室温又は5〜25℃(摂氏)で保存することができる。胎盤を48時間より長い時間にわたって、好ましくは、残留する帯血を除去するために胎盤を潅流する前に、4から24時間の時間にわたって保管することができる。胎盤は、好ましくは、5〜25℃の温度で、抗凝血剤溶液中に保存される。適当な抗凝血剤溶液は、当分野において周知である。例えば、ヘパリンやワルファリンナトリウム溶液を使用することができる。好ましい実施態様において、抗凝血剤薬は、ヘパリン溶液(例えば、1:1000溶液中で1%w/w)を含む。血液を抜かれた胎盤は、胎盤幹細胞が回収される前に、好ましくは36時間を超えない程度の時間保存される。

一般的に上記のように調製されて一度回収された哺乳類の胎盤又はその一部は、いずれかの当業者における周知の方法で処理することができ、例えば、潅流させ、又は崩壊させることができ、例えば、幹細胞を得るために、1つ以上の組織崩壊酵素で消化することができる。

(5.2.3 胎盤組織の物理的崩壊及び酵素による消化)
一実施態様において、幹細胞は、器官の物理的破壊、例えば酵素消化によって哺乳動物の胎盤から回収される。例えば、胎盤又はその一部を本明細書に示す幹細胞回収組成物と接触させながら、破砕するか、切断するか、細断するか、さいの目に切るか、切り刻むか、又は裂く等し、続いて組織を1つ以上の酵素で消化させることができる。胎盤又はその一部を物理的に破壊し、1つ以上の酵素で消化させ、得られた材料を幹細胞回収組成物に浸漬又は混入することができる。物理的崩壊の方法は、任意の方法を使用することができる。但し、崩壊方法は、例えば、トリパンブルー排除によって決定されるように、前記生存可能な器官内の該細胞の多数を、より好ましくは大部分を、また、さらに好ましくは、少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、98%、又は99%残す。

胎盤は、物理的な崩壊及び/又は酵素による消化と幹細胞の回収前に、構成成分に解剖されることができる。例えば、胎盤幹細胞は、羊膜、絨毛膜、臍帯、胎盤葉、又は、これらのいずれかの組合せから、得ることができる。好ましくは、胎盤幹細胞は、羊膜と絨毛膜とを含む胎盤組織から得ることができる。典型的に、胎盤幹細胞は、胎盤組織の小さなブロック、例えば、体積で、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900又は約1000立方ミリメートルの胎盤組織のブロックの崩壊から得ることができる。

好ましい幹細胞回収した組成物は、1個以上の組織崩壊酵素を含む。酵素による消化は、好ましくは、酵素の組合せ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの組合せ、例えば、コラゲナーゼとディスパーゼの組合せを用いることができる。一実施態様において、胎盤組織の酵素による消化は、ヒアルロン酸の消化のために、マトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ及び粘液質溶解剤酵素の組合せ、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ及びヒアルロニダーゼの組合せ又はリベラーゼ(Boehringer Mannheim社、Indianapolis社)とヒアルロニダーゼの組合せを使用する。胎盤組織を崩壊させるために使用される他の酵素は、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、例えば、トリプシン、チモトリブシン、又はエラスターゼを含む。セリンプロテアーゼは、血清中にあるα2マイクログロブリンによって阻止されることもでき、これにより、消化に使用される培地は、一般に、血清のないものである。EDTAとDNaseは、細胞の回収効果を増加させるために、通常、酵素消化過程において使用される。粘性の消化物内に幹細胞がトラップされることを避けるために、消化性物質は、好ましくは希釈される。

組織消化酵素のいずれの組合せであっても使用することができる。組織消化酵素の典型的な濃度は、コラゲナーゼIとコラゲナーゼIVについて50〜200U/mL、ディスパーゼについて1〜10U/mL、さらに、エラスターゼについて10〜100U/mLを含む。プロテアーゼは、組み合わせて使用することができる。すなわち、2つ以上のプロテアーゼが、幹細胞を抽出するために、同じ消化反応において順次使用することができる。例えば、一実施態様において、胎盤又はその一部分は、最初にコラゲナーゼIの適当な量によって2mg/mlで30分間消化され、その後、0.25%の濃度のトリプシンで、37℃の温度で10分間消化される。セリンプロテアーゼは、好ましくは、他の酵素の使用後に連続的に使用することができる。

他の実施態様において、幹細胞回収した組成物で幹細胞を単離する前に、例えば、エチレングリコールビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N'N'-テトラ酢酸(EGTA)又はエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)等のキレート剤を、幹細胞を含む幹細胞回収した組成物に又は組織が崩壊及び/又は消化された溶液に添加することにより、組織は、さらに崩壊することができる

胎盤全体又は胎盤の一部が胎児性と母親細胞の両方を含む箇所に(例えば、胎盤の一部が絨毛膜又は子葉を含む箇所に)、回収された胎盤幹細胞は、胎児と母親との両方共由来の胎盤幹細胞の混合を含むようになることが理解されるだろう。胎盤の一部分が母親細胞(例えば、羊膜)を含まないか、ごくわずかの母親細胞の数を含む所に、回収された胎盤幹細胞は、ほぼ独占的に胎児性胎盤幹細胞を含むことになる。

(5.2.4 胎盤潅流)
さらに、胎盤幹細胞は、哺乳類の胎盤の潅流によって得ることができる。幹細胞を得るために哺乳類の胎盤を潅流させる方法は、例えば、2005年12月29日付で出願された、「胎盤幹細胞を回収して器官を保護する改善した培地」と題された、Haririの米国仮出願第60/754,969号と、米国出願公開第2002/0123141号に開示されている。

胎盤幹細胞は、例えば潅流溶液として幹細胞回収した組成物を使用して、例えば胎盤血管系を通じて、潅流により回収することができる。一実施態様において、哺乳類の胎盤は、臍帯動脈と臍帯静脈の両方ともに又はそのうちの1つを通じた潅流溶液の通過により潅流される。胎盤を通じた潅流溶液の流れは、例えば、胎盤の中への重力流れを用いて達成することができる。好ましくは、潅流溶液は、胎盤を通じて、ポンプ、例えば蠕動ポンプの使用により、流れることになる。臍帯静脈に、例えば、無菌チューブ等の無菌の接続装置に接続されるテフロン(TEFLON)(登録商標)又はプラスチックカニューレ等の、カニューレを挿入することができる。無菌の接続装置は、潅流多岐連絡管に接続される。

潅流に関する調製において、胎盤は、好ましくは、臍帯動脈と臍帯静脈が胎盤の最も高い位置に位置されるような方法で向けられる(例えば、ぶら下げられる)。胎盤は、胎盤血管系及び周囲組織を通じた潅流流体の通過により潅流することができる。胎盤は、また、臍帯静脈内への潅流流体の通過と臍帯動脈からの回収により、又は臍帯動脈内への潅流流体の通過と臍帯静脈からの回収により、潅流することができる。

一実施態様において、例えば、臍帯動脈と臍帯静脈は、例えば、可撓性の接続具を介して潅流液の貯留槽に接続されたピペットに同時に接続される。潅流液は、臍帯静脈及び動脈の中を通過する。潅流液は、胎盤を取り囲む組織の中へ血管壁から染み出て、及び/又は血管壁を通じて通過し、姙娠期間の間に母の子宮に接着されていた胎盤表面から適した開放血管中で回収される。潅流液は、また、臍帯を開放して導入することができ、妊婦の子宮壁と境界を成す胎盤壁内の開口部の外に流れるか、潅流することを可能にできる。「パン」方法として呼ばれることがあるこの方法で回収された胎盤細胞は、典型的に、母親細胞と胎児細胞との混合物である。

他の実施態様において、潅流液は、臍帯静脈を通過して臍帯動脈から回収されるか、臍帯動脈を通過して臍帯静脈から回収される。「閉鎖回路」方法と呼ばれることがあるこの方法で回収された胎盤細胞は、典型的にほぼ例外なく胎児性である。

潅流液が胎盤の母親側から染み出た後に回収されるパン方法を用いた潅流は、胎児と母親細胞との混合をもたらすことが理解されるだろう。その結果として、該方法で回収された細胞は、胎児と母親由来の両方の胎盤幹細胞が混合された集団を含む。逆に、潅流流体が1つ又は2つの胎盤血管を通過し、胎盤血管系を通じて単独に回収される、閉鎖回路方法による胎盤血管系を通じた単独潅流は、ほぼ独占的に胎児由来の胎盤幹細胞の集団の回収をもたらす。

閉鎖回路潅流方法は、一実施態様において、以下のように達成することができる。分娩後の胎盤は、出生後約48時間以内に得られる。臍帯は、クランプで締められ、クランプより上部を切り出される。臍帯は、廃棄されるか、又は、例えば臍帯幹細胞を回収して、及び/又は生体材料の生成のために臍帯膜を処理に供するために処理することができる。羊膜は、潅流の間に維持され得るか、又は、例えば、鈍的切開にて絨毛膜から分離することができる。若し、羊膜が潅流の前に絨毛膜から分離されると、羊膜は、廃棄されるか又は処理されて、例えば、酵素による消化によって幹細胞を得るか、又は、例えば、羊膜生体材料を生成するが、生体材料は、例えば、米国出願公開第2004/0048796号に開示されている。目に見えるすべての血餅及び残留血液の胎盤を、例えば、無菌のガーゼを用いてクリーニングした後、臍帯管は露出され、例えば、臍帯膜を部分的に切って、血管の断面を露出させる。血管は、例えば、それぞれの血管の切られた端を通じて、閉鎖されたワニ口クランプを進むことにより、確認されて、開かれる。潅流装置、例えば蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブは、それぞれの胎盤動脈の中に挿入される。ポンプは、目的に叶う場合、いずれのものでもよく、その例として、蠕動ポンプが挙げられる。その後、無菌の回収貯留槽、例えば、250mLの回収バッグのような血液バッグに接続されるプラスチックチューブは、胎盤静脈の中に挿入される。或いは、ポンプに接続されたチューブは、胎盤静脈の中に挿入され、回収貯留槽に接続されたチューブは、1つ又は2つの胎盤動脈の中に挿入される。それから、胎盤は、一定の体積の潅流液、例えば、約750mLの潅流液とともに潅流される。潅流液中の細胞は、その後、例えば、遠心分離により回収される。

一実施態様において、臍帯近傍は、潅流の間にクランプで締められ、より好ましくは、胎盤本体の中に臍帯挿入の4〜5cmの範囲内をクランプで締められる。

放血過程の間、哺乳類の胎盤からの潅流流体の第一の回収物は、一般的に、臍帯血及び/又は胎盤血液の残りの赤い血液細胞に染色される。潅流が進行して、残りの臍帯血細胞が胎盤の外に洗い流されることで、潅流流体は、より一層無色に変わる。一般に、30〜100ml(ミリリットル)の潅流流体が、胎盤を初期に放血するために好適であるが、それ以上又はそれ以下の潅流流体は、観察結果によって使用することができる。

胎盤幹細胞を回収することに使用される潅流液体の体積は、回収された幹細胞の個数、胎盤の大きさ、1つの胎盤からなされる回収の回数等に応じて変わることがある。多様な実施態様において、潅流液体の体積は、50mL〜5000mL、50mL〜4000mL、50mL〜3000mL、100mL〜2000mL、250mL〜2000mL、500mL〜2000mL、又は750mL〜2000mLであってもよい。典型的に、胎盤は、放血後、700〜800mLの潅流液体で潅流される。

胎盤は、数時間又は数日間の過程の間に複数回潅流することができる。胎盤が複数回潅流されるところで、容器や他の適した管内で、無菌条件下で維持されたり培養されることができ、抗凝血剤(例えば、ヘパリン、ワルファリンナトリウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン)、及び/又は抗菌剤(例えば、β-メルカプトエタノール(0.1mM);ストレプトマイシン(例えば、40〜100g/ml)、ペニシリン(例えば、40U/ml)、アンフォテリシンB(例えば、0.5g/ml)等の抗生剤)の有無にかかわらず、幹細胞回収した組成物又は標準的な潅流液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)等の一般食塩水)とともに潅流することができる。一実施態様において、単離された胎盤は、潅流液を回収することなく、一定の時間に維持され、培養される。すなわち、潅流及び潅流液の回収前に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24時間、或いは2又は3日間以上の間に、該胎盤は維持され、又は培養される。潅流された胎盤は、1以上の追加的な時間、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間以上の時間、維持されることができ、例えば、700〜800mLの潅流流体とともに第2回目潅流されることができる。胎盤は、1、2、3、4、5回以上の回数で、例えば、1、2、3、4、5又は6時間毎に1回潅流することができる。好ましい実施態様において、胎盤の潅流及び潅流液、例えば、幹細胞回収した組成物の回収は、回収された有核細胞の数が100 細胞/ml未満に下がるまで繰り返される。他の時点における潅流液の各々は、さらに処理されて、時間依存的な細胞の集団、例えば、幹細胞を回収することができる。他の時点の潅流液は、また、プールすることができる。

理論に縛られることなく、放血後、且つ胎盤を十分に潅流した後に、胎盤幹細胞は、放血されて、潅流された該胎盤の微小循環系内に移動するものと考えられ、この微小循環系は、好ましくは潅流によって回収管内に洗浄されることで、幹細胞が回収される箇所である。単離された胎盤を潅流させることは、残りの臍帯血を除去することだけではなく、さらに、胎盤に、酸素を含め、適切な栄養物質を提供することである。胎盤は、また、好ましくは、抗凝血剤を添加することなく、残りの臍帯血細胞を除去するために使用される類似の溶液とともに、培養して、潅流することができる。

本明細書に示された方法にかかる潅流は、前記溶液で潅流されていない、そして幹細胞を得るために他の方法(例えば、組織崩壊や酵素による消化)で未処理の哺乳類の胎盤から得ることができる数よりも、有意により多くの胎盤幹細胞の回収をもたらす。この文脈において「有意により多く」は、少なくとも約10%よりも多いことを意味する。潅流は、例えば、胎盤又はその一部が培養された培養培地から得ることができる胎盤幹細胞の数と比較して、有意により多くの胎盤幹細胞を算出する。

幹細胞は、胎盤から潅流によって1個以上のプロテアーゼや他の組織崩壊酵素を含む溶液とともに単離することができる。具体的な実施態様において、胎盤又はその一部(例えば、羊膜、羊膜及び絨毛膜、胎盤小葉若しくは子葉、臍帯血、又はそれらのいずれかの組合せ)は、25〜37℃に達し、そして1個以上の組織崩壊酵素とともに、200mLの培養培地中において30分間培養される。潅流液の細胞は回収され、4℃にして、また5mM EDTA、2mM ジチオスレイトール及び2mM β-メルカプトエタノールを含む低温の阻害剤混合物とともに洗浄される。幹細胞は、数分後に、冷たい(例えば、4℃)幹細胞回収した組成物とともに洗浄される。

(5.2.5 胎盤潅流液及び胎盤潅流細胞)
胎盤潅流液及び胎盤潅流細胞、例えば、胎盤潅流液から単離された全有核細胞は、細胞の不均一な集合体を含む。典型的には、胎盤潅流液及び胎盤潅流細胞は、使用前に、赤血球が除去される。そのような除去は、有核血球から赤血球を分離する既知の方法によって実施され得る。ある実施態様において、胎盤潅流液又は潅流細胞は、凍結保存される。ある実施態様において、胎盤潅流液又は胎盤潅流細胞は、胎児細胞のみ、又は胎児細胞と母胎細胞の組合せを含む。

典型的には、単一の潅流液からの胎盤潅流液は、約1億から約5億個の有核細胞を含む。ある実施態様において、胎盤潅流液又は潅流細胞は、CD34⁺細胞、例えば、造血幹細胞又は前駆細胞を含む。そのような細胞は、より具体的な実施態様において、CD34⁺CD45^-幹細胞又は前駆細胞、CD34⁺CD45⁺幹細胞又は前駆細胞、骨髄前駆体、リンパ前駆体及び/又は赤血球前駆体を含むことができる。他の実施態様において、胎盤潅流液及び胎盤潅流細胞は、接着性胎盤幹細胞、例えばCD34^-幹細胞、例えば、上記セクション5.1に記載の接着性胎盤幹細胞を含む。他の実施態様において、胎盤潅流液及び胎盤潅流細胞は、例えば、内皮前駆細胞、骨芽前駆細胞及びナチュラルキラー細胞を含む。ある実施態様において、胎盤から回収され、赤血球が除去された胎盤潅流液、又はそのような潅流液から単離された潅流細胞は、流動細胞計測法、例えば、FACS分析によって測定された約6〜7%のナチュラルキラー細胞(CD3^-、CD56⁺);約21〜22%のT細胞(CD3⁺);約6〜7%のB細胞(CD19⁺);約1〜2%の内皮前駆細胞(CD34⁺、CD31⁺);約2〜3%の神経前駆細胞(ネスチン⁺);約2〜5%の造血前駆細胞(CD34⁺);及び約0.5〜1.5%の接着性胎盤幹細胞(例えば、CD34^-、CD117^-、CD105⁺及びCD44⁺)を含む。

ヒト胎盤潅流液におけるCD34⁺幹細胞又は前駆細胞は、臍帯血から単離された同等数のCD34⁺細胞より検出可能に高レベルの血管形成関連マーカ、例えば、CD31、VEGF-R及び/又はCXCR4を発現する。ある実施態様において、VEGFを含むENDOCULT(登録商標)培地(CFU-Hillコロニー成長用;StemCell Technologies, Inc.)で培養される、単回潅流からのヒト胎盤潅流液単核細胞は、約20個まで、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個のCFU-Hillコロニー(内皮細胞前駆体)を生成する。液体培養におけるCFU-Hillコロニーの発生を、例えば、ENDOCULT(登録商標)培地での培養の7日目にヒト胎盤潅流液から得られた内皮前駆細胞によるジアセチル化低密度リポタンパク質(Dil-asLDL)の吸収量を測定することによって実証及び評価することができる。

さらに、ヒト胎盤潅流液からのCD34⁺CD45^-細胞は、CD34⁺CD45⁺細胞より血管形成関連マーカCD31及び/又はVEGFRの検出可能に高い発現を有する。

典型的には、胎盤潅流液及び潅流細胞は、臍帯血細胞と比較して、MHCクラスIの低い発現を有し、多くはMHCクラスIIマーカに対して陰性である。

(5.2.6 胎盤幹細胞の単離、分類及び特徴付け)
潅流や酵素による消化によって得られた、哺乳類の胎盤から採取した幹細胞は、Ficoll勾配遠心分離により、初期に他の細胞から精製(すなわち、単離)することができる。そのような遠心分離は、遠心分離速度等に対する任意の標準的なプロトコルに従うことができる。一実施態様において、例えば、胎盤から回収された細胞は、15分間、室温、5000×gで遠心分離により潅流液から回収され、この遠心分離は、細胞を例えば、汚染された組織片と血小板から分離する。他の実施態様において、胎盤潅流液は、約200mlに濃縮され、Ficoll上で穏やかに層を形成し、そして、22℃で、20分間、1100 × gで遠心分離をし、該細胞の低密度の界面層は、さらに処理に供するために回収される。

新しい幹細胞回収した組成物又は幹細胞の維持に適した培地、例えば、2U/mlのヘパリンと2mM EDTA(GibcoBRL社、NY)を含むIMDM無血清培地において、細胞のペレットは、再懸濁することができる。全体の単核細胞画分は、例えば、製造者の推奨の手順に従って、Lymphoprep(Nycomed Pharma社,オスロ,ノルウェー)を用いて単離することができる。

本明細書で使用されているように、胎盤幹細胞を「単離すること」は、無傷の哺乳類の胎盤において、幹細胞が正常に関連する細胞の少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%又は99%を除去することを意味する。幹細胞が、無傷の器官において、幹細胞が正常に関連する細胞の50%未満を含む細胞の集団に存在するとき、器官の幹細胞は、「単離されている」。

潅流や消化によって得られた胎盤細胞は、例えば、0.2%EDTA(Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)とともに0.05%のトリプシン溶液を用いて、分化トリプシン処理により、例えば、さらに、又は初期に単離することができる。胎盤幹細胞は、典型的に、約5分間でプラスチックの表面からはがれるため、分化トリプシン処理が可能である。一方、他の接着性のある集団は、典型的に20〜30分以上の培養を必要とする。はがれた該胎盤幹細胞は、トリプシン処理と、例えばトリプシン中和溶液(TNS、Cambrex社)を用いるトリプシン中和を経て収穫され得る。接着性細胞の単離の一実施態様において、例えば、約5〜10×10⁶細胞の一定分量が、それぞれいくつのT-75フラスコ、好ましくは、フィブロネクチンがコーティングされたT-75フラスコの中に置かれる。そのような実施態様において、該細胞は、市販の間葉系幹細胞成長培地(MSCGM)(Cambrex社)で培養され、組織培養インキュベーター(37℃、5%CO₂)内に置かれる。10〜15日後に、非接着性細胞は、PBSで洗浄され、フラスコから除去される。該PBSは、その後、MSCGMに代替される。フラスコは、多様な接着性細胞型の存在について、そして特に、線維芽細胞様細胞のクラスターの確認及び増殖のために、好ましくは毎日調査される。

哺乳類の胎盤から回収された細胞の型と数は、モニタリングすることができ、例えば、フローサイトメトリー、細胞分類、免疫細胞化学(例えば、組織に特異的なか又は細胞標識に特異的な抗体とで染色)、蛍光活性化細胞分類(FACS)、磁気活性細胞分類(MACS)等の標準的な細胞検出技術を利用して、形態学的に及び細胞表面標識における変化を測定することにより、光又は共焦点顕微鏡法を利用して細胞の形態を調査することにより、及び/又は、PCRと遺伝子発現プロファイリング等の当業者における周知の技術を利用して、遺伝子発現の変化を測定することにより、モニタリングを行うことができる。このような技術は、同様に、1個以上の特定の標識に対して陽性である細胞を同定するために使用することができる。例えば、CD34に対する抗体を用いて、上記技術を使用し、細胞が、CD34を検出することができるほどの量で含むかどうかが分かる;若しそうである場合、該細胞は、CD34⁺である。同様に、若し細胞がRT-PCRで検出されるのに十分なOCT-4 RNAを生成する場合、又は、成体細胞よりも有意により多くのOCT-4 RNAを生成すれば、該細胞は、OCT-4⁺である。細胞表面標識(例えば、CD34のようなCD標識)に対する抗体とOCT-4のように幹細胞に特異的な遺伝子のシーケンスは、当分野において周知である。

胎盤細胞、特に、Ficoll分離によって単離された細胞、分化された接着、又はこれらの組合せは、蛍光活性化細胞分離装置(FACS)を用いて分類することができる。蛍光活性化細胞分類(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づいた、細胞を含む粒子を分離する周知の方法である(Kamarchの文献、1987、Methods Enzymol、151:150-165)。個別の粒子における蛍光部分のレーザ刺激は、小さな電気的変化を誘発して、混合物から陽性粒子と陰性粒子の電気-磁場分離が発生する。一実施態様において、細胞表面標識に特異的な抗体又はリガンドは、明らかな蛍光ラベルでラベリングされる。細胞は、細胞分離装置を通じて処理され、それらの使用された抗体に対する結合能力に基づいて細胞の分離が可能となる。FACSで分類された粒子は、直接に96-ウェル、又は384-ウェルプレートのそれぞれのウェル内に置かれ、分離とクローニングを促進することができる。

1つの分類スキームにおいて、胎盤から採取した幹細胞は、標識CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4及び/又はHLA-Gの発現に基づいて分類される。これは、培養状態においてそれらの接着特性に基づき、幹細胞を選択する過程に関連して達成することができる。例えば、標識の発現に基づいて、例えば、分類の前又は後に、接着選択ステムは達成することができる。一実施態様において、細胞は、最初は、CD34の発現に基づいて分類される;CD34^-細胞は保有され、そして、CD200⁺、HLA-G⁺である細胞は、すべての他のCD34^-細胞から分離される。他の実施態様において、胎盤からの細胞は、CD200及び/又はHLA-Gのそれら標識の発現に基づいている;例えば、このような標識のうちのいずれかを表示する細胞が、追加の使用のために単離される。例えば、CD200及び/又はHLA-Gを発現する細胞は、具体的な実施態様において、CD73及び/又はCD105の発現、又は抗体SH2、SH3又はSH4によって認識されるエピトープ、或いはCD34、CD38又はCD45の発現がないことに基づいてさらに分類されることができる。例えば、一実施態様において、胎盤細胞は、CD200、HLA-G、CD73、CDl05、CD34、CD38及びCD45の発現やそれらの不足によって分類され、CD200⁺、HLA-G⁺、CD73⁺、CD105⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である胎盤細胞は、追加の使用のために、他の胎盤細胞から単離される。

他の実施態様において、磁性ビーズは細胞を分離することに使用することができる。細胞は、それらの磁性ビーズ(直径0.5〜100μm)を結合する能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁性活性化細胞分類(MACS)技術を用いて分離することができる。特定の細胞表面分子又はハプテンを特別に認識する抗体に共有結合の添加を含む、多様で有用な修正が、磁性マイクロスフェア上で行うことができる。ビーズは、その後、細胞と混合されて、結合される。細胞は、次いで、磁場を通過して、特定の細胞表面標識を有する細胞を分離する。一実施態様において、このような細胞は、その後に分離され、追加的な細胞表面標識に対する抗体とカップリングされた磁性ビーズと、再び混合されることができる。細胞は、また、磁場を通過して、両方の抗体と結合した細胞を分離する。そのような細胞は、その後、クローン単離のためのマイクロタイター皿のような分離皿内に希釈されることができる。

胎盤幹細胞は、また、細胞形状及び成長特徴に基づいて特徴付けされ、及び/又は分類されることができる。例えば、胎盤幹細胞は、例えば、培養状態で線維芽細胞のような外観を有することで特徴付けされることができ、及び/又はそのような外観に基づいて選択されることができる。胎盤幹細胞は、例えば、胚様体様組織体を形成するそれらの能力に基づいて、それを有することで特徴付けされ、及び/又は選択されることができる。一実施態様において、例えば、形態において線維芽細胞状であり、CD73及びCD105を発現し、培養状態で1個以上の胚様体様組織体を生成する胎盤細胞は、他の胎盤細胞から単離される。他の実施態様において、且つ培養状態で1個以上の胚様体様組織体を生成するOCT-4⁺胎盤細胞は、他の胎盤細胞から単離される。

他の実施態様において、胎盤幹細胞は、コロニー形成単位アッセイによって同定されて、特徴付けされることができる。コロニー形成単位アッセイは、通常、当分野においてMESEN CULT(商標) medium(Stem Cell Technologies社、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州)のように周知である。

胎盤幹細胞は、当分野において周知である、トリパンブルー排除アッセイ、フルオレセインジアセテート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ(生存能力を評価するために);及び、チミジン取込みアッセイ、MTT細胞増殖アッセイ(増殖を評価するために)等の標準技術を用いて、生存能力、増殖能力、及び寿命について評価することができる。寿命は、増量した培養状態において集団倍加の最大数を決定する等の、当分野において周知の方法により、測定することができる。

胎盤幹細胞は、当分野において周知の以下のような方法で他の胎盤細胞から分離することができる:所望の細胞の選択的成長(陽性選択)、不要な細胞の選択的破壊(陽性選択);例えば、ダイズ凝集素のように、混合された集団における分化された細胞凝集力に基づいた分離;冷凍-解凍過程;ろ過;従来のゾーン遠心分離;遠心洗浄(向流遠心分離);単位重力分離;向流分配;電気泳動法;等。

(5.3 胎盤幹細胞の培養)
(5.3.1 培養培地)
単離された胎盤幹細胞、又は胎盤幹細胞の集団、又は細胞若しくは胎盤幹細胞が成長した胎盤組織は、細胞培養を開始するか、播種するために使用することができる。細胞は、一般的に、ラミニン、コラーゲン(例えば、自己由来又は変性された)、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン及び細胞外膜タンパク質(例えば、MATRIGEL(BD Discovery Labware社、ベッドフォード、マサチューセッツ州))等の細胞外マトリックス又はリガンドでコーティングされているか或いはコーティングされていない無菌の組織培養管に移送される。

胎盤幹細胞は、幹細胞の培養に適したものとして当業者に認識されている任意の条件下で、且つ任意の培地中で培養することができる。好ましくは、培養培地は、血清を含む。胎盤幹細胞は、例えば、以下のような培地中で培養することができる:ITS(インスリン-トランスフェリン-セレニウム)、LA+BSA(リノール酸-ウシ血清アルブミン)、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF-I、及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM-LG(Dulbeccoの変性必須培地、低グルコース)/MCDB201(ニワトリ線維芽細胞基礎培地;10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むDMEM-HG(高グルコース);15%FBSを含むDMEM-HG;10%FBS、10%ウマ血清、及びハイドロコルチゾンを含むIMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium);10%FBS、EGF、及びヘパリンを含むM199;10%FBS、GLUTAMAX(商標)及びゲンタマイシンを含むα-MEM(最小必須培地);10%FBS、GLUTAMAX(商標)及びゲンタマイシンを含むDMEM、等。好ましい培地は、2%FBS、ITS、LA+BSA、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM-LG/MCDB-201である。

胎盤幹細胞の培養に使用可能な他の培地は、DMEM(高又は低グルコース)、Eagle's基礎培地、Ham's F10培地(F10)、Ham's F-12培地(F12)、Iscove's modified Dulbeccoの培地、間葉系幹細胞成長培地(MSCGM)、LiebovitzのL-15培地、MCDB、DMEM/F12、RPMI 1640、高度DMEM(Gibco社)、DMEM/MCDB201(Sigma社)、及びCELL-GRO FREEである。

培養培地は、例えば、以下を含む1個以上の成分で補充されていてもよい:血清(例えば、ウシ胎仔血清(FBS)、好ましくは、約2-15%(v/v);ウマ血清(ES);ヒト血清(HS));β-メルカプトエタノール(BME)、好ましくは、約0.001%(v/v);1個以上の成長因子、例えば、血小板由来の成長因子(PDGF)、上皮成長因子(EGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、インスリン様成長因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管上皮成長因子(VEGF)、及びエリスロポエチン(EPO);L-バリンを含むアミノ酸;及び、微生物汚染を制御する、例えば、ペニシリンG、ストレプトマイシンスルフェート、アムフォテリシンB、ゲンタマイシン、及びニスタチン、これらを単独で或いは組み合わせて用いる、1個以上の抗生剤及び/又は抗真菌剤。

胎盤幹細胞は、例えば、組織培養皿やマルチウェルプレート等の標準的な組織培養条件で培養することができる。胎盤幹細胞は、また、懸滴方法を用いて培養することができる。該方法では、胎盤幹細胞は、約5mLの培地の中にmL当たり約1×10⁴細胞で懸濁されて、培地の1個以上の滴は、例えば、100mLペトリ皿等の組織培養容器の蓋の内側に位置される。滴は、例えば、単一滴、又は多チャンネルピペットからの多数の滴であってもよい。蓋は、注意しながらひっくり返して、皿の雰囲気内で水蒸気含量を維持するのに十分な、例えば無菌のPBS等の液体の容積を含むように、皿底の上部に置き、且つ該幹細胞を培養する。

(5.3.2胎盤幹細胞の増殖(Expansion)及び急増(Proliferation))
一度単離された胎盤幹細胞、又は幹細胞の単離された集団(例えば、幹細胞又は幹細胞の集団が、生体内で正常に関連する胎盤細胞の少なくとも約50%から単離された幹細胞の集団又は幹細胞)が得られる場合、該幹細胞又は幹細胞の集団は、インビトロで、急増されて、増殖することができる。例えば、胎盤幹細胞の集団は、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレート又はその他のもの等の組織培養容器の中で、該幹細胞が70〜90%密集度に急増するのに十分な時間培養されることができ、それはすなわち、該幹細胞及びそれらの子孫が、組織培養容器の培養表面エリアの70〜90%を占有するまでである。

胎盤幹細胞は、培養管内で細胞成長可能な密度で、例えば、細胞は、低密度(約1000〜約5000細胞/cm²)から高密度(例えば、約50,000又はそれ以上の細胞/cm²)まで播かれることができる。好ましい実施態様において、細胞は、空気中の二酸化炭素体積で約0〜約5%の状態で培養される。一部の好ましい実施態様において、細胞は、空気中に酸素が約2〜約25%存在するか、好ましくは、空気中に酸素が約5〜20%存在するときに、培養される。細胞は、好ましくは、約25℃〜約40℃で、好ましくは37℃で培養される。細胞は、好ましくは、インキュベーター内で培養される。細胞培地は、静止したり、例えば、生体反応器を利用して撹拌することができる。胎盤幹細胞は、好ましくは、低い酸化ストレス(例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセチルシステイン、等の添加とともに)下で成長させられる。

一度70〜90%密集度が得られると、細胞は、継代される。例えば、細胞は、それらを組織培養表面から分離するために、当業者に公知の技術を用いて、酵素によって処理すること、例えば、トリプシン化されることができる。細胞をピペットで移動させて、計数して細胞を除去した後、約20,000〜100,000の幹細胞、好ましくは、約50,000の幹細胞が、新しい培養培地を含む新しい培養容器に継代される。典型的に、該新しい培地は、幹細胞が除去された培地と同じ種類である。少なくとも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、又は20回以上継代された胎盤幹細胞の集団を本明細書に示す。

(5.3.3 胎盤幹細胞集団)
さらに、胎盤幹細胞の集団を本明細書に示す。胎盤幹細胞の集団は、1個以上の胎盤から直接単離することができる;すなわち、胎盤幹細胞の集団は、潅流液から得られるか、潅流液中に含まれた、又は消化物(すなわち、胎盤やその一部の酵素による消化によって得られる細胞の回収)から得られるか、その中に含まれた胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団であってもよい。本明細書に示された単離された胎盤幹細胞は、さらに、培養されて、増殖され、胎盤幹細胞集団を作成することができる。胎盤幹細胞を含む胎盤細胞の集団は、また、培養されて、増殖され、胎盤幹細胞集団を作成することができる。

本明細書に示された胎盤幹細胞の集団は、胎盤幹細胞、例えば、本明細書に記載の胎盤幹細胞を含む。多様な実施態様において、単離された胎盤幹細胞集団の中の細胞の少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、又は99%は、胎盤幹細胞である。すなわち、胎盤幹細胞の集団は、例えば、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%程度の非幹細胞を含むことができる。

例えば、酵素による消化や潅流液に由来して、特定の標識及び/又は特定の培養又は形態学的な特徴を発現する胎盤幹細胞を選択することにより、単離された胎盤幹細胞の集団を作成する方法を本明細書に示す。一実施態様において、例えば、細胞集団を作成する方法であって、(a)基質に接着する、且つ(b)CD200及びHLA-Gを発現する胎盤細胞を選択すること;及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む方法を本明細書に示す。別の実施態様において、細胞集団を作成する方法は、(a)基質に接着する、且つ(b)CD73、CD105及びCD200を発現する胎盤細胞を選択すること;及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む。別の実施態様において、細胞集団を作成する方法は、(a)基質に接着する、且つ(b)CD200及びOCT-4を発現する胎盤細胞を選択すること;及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む。他の実施態様において、細胞集団を作成する方法は、(a)基材に接着されて、(b)CD73及びCD105を発現して、かつ(c)胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において前記集団が培養されるとき、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進すること、及び前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む。他の実施態様において、細胞集団を作成する方法は、(a)基材に接着されて、かつ(b)CD73、CD105及びHLA-Gを発現する胎盤細胞を選択すること;及び、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む。他の実施態様において、細胞集団を作成する方法は、(a)基材に接着されて、(b)OCT-4を発現して、かつ(c)胚様体様組織体の形成が可能となる条件下において前記集団が培養されるとき、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団において1個以上の胚様体様組織体の形成を促進する胎盤細胞を選択すること;及び、前記細胞を他の細胞から単離して細胞集団を形成することを含む。上記の実施態様のいずれかにおいて、該方法は、さらに、ABC-p(胎盤に特異的なABC運搬タンパク質;例えば、Allikmetsらの文献,Cancer Res. 58(23):5337-9(1998)を参照)を発現する胎盤細胞を選択することを含むことができる。該方法は、また、例えば、間葉系幹細胞に特異的な、少なくとも1つの特徴、例えば、CD29の発現、CD44の発現、CD90の発現、又はこれらの組合せの発現を示す細胞を選択することを含むことができる。

上記実施態様において、基材は、細胞、例えば、胎盤幹細胞の培養及び/又は選択が行われる任意の表面であってもよい。典型的に、基材は、プラスチック、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、例えば、ラミニンやフィブロネクチンのような生体分子でコーティングすることができる。

細胞、例えば胎盤幹細胞は、胎盤幹細胞の集団のために、細胞選択の分野において公知の任意の方法で選択することができる。例えば、細胞は、1個以上の細胞表面標識に対する抗体又は抗体を使用して、例えば、フローサイトメトリー又はFACSにおいて選択することができる。選択は、磁性ビーズと結合された抗体を用いて達成することができる。特定の幹細胞と関連の標識に特異的な抗体は、当分野において周知である。例えば、OCT-4(Abcam社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)、CD200(Abcam社)、HLA-G(Abcam社)、CD73(BD Biosciences Pharmingen、サンディエゴ、カリフォルニア州)、CD105(Abcam社;Bio Design International、ソーコ、メイン州)等に対する抗体がある。他の標識に対する抗体も市販されており、例えば、CD34、CD38及びCD45が、例えば、StemCell Technologies又はBio Design Internationalから入手可能である。

単離された胎盤幹細胞の集団は、さらに、幹細胞ではない胎盤細胞又は胎盤細胞ではない細胞を含むことができる。

単離された胎盤幹細胞の集団は、1個以上の非幹細胞又は非胎盤細胞の集団、例えば、胎盤幹細胞の単離された集団は、血液(例えば、胎盤血液又は臍帯血)、血液由来の幹細胞(例えば、胎盤血液又は臍帯血由来の幹細胞)、血液由来の核細胞の集団、骨髄由来の間葉系幹細胞、骨由来の幹細胞集団、生骨髄(crude bone marrow)、成体(体性)幹細胞、組織内に含まれた幹細胞の集団、培養された幹細胞、完全に分化された細胞の集団(例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓細胞等)等と結合することができる。単離された胎盤幹細胞集団における細胞は、それぞれの集団において全有核細胞の数を比較して、約100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1;1:2;1:5;1:10;1:100;1:200;1:500;1:1,000;1:2,000;1:5,000;1:10,000;1:20,000;1:50,000;1:100,000;1:500,000;1:1,000,000;1:2,000,000;1:5,000,000;1:10,000,000;1:20,000,000;1:50,000,000;又は約1:100,000,000の割合で、他の種類の多数の細胞と結合することができる。単離された胎盤幹細胞集団内における細胞は、また、多数の細胞型の多数の細胞と結合することができる。

1つにおいて、胎盤幹細胞の単離された集団は、多数の造血幹細胞と結合される。そのような造血幹細胞は、胎盤血液、臍帯血又は周辺血液からの全有核細胞内に;胎盤血液、臍帯血又は周辺血液からのCD34⁺細胞の単離された集団内に;未処理の骨髄内に;骨髄からの全有核細胞内に;骨髄からのCD34⁺細胞の単離された集団内に、等、例えば、未処理の胎盤、臍帯血又は周辺血液内に収容されることができる。

(5.4 胎盤幹細胞と胎盤潅流液又は胎盤潅流細胞の組合せ)
胎盤潅流液と、単離された潅流細胞及び/又は胎盤幹細胞との組合せを本明細書に示す。本明細書において、該胎盤幹細胞は、CD34⁺胎盤幹細胞、CD34^-胎盤幹細胞又はそれらの組合せであり得る。一実施態様において、例えば、複数の胎盤潅流細胞及び/又は複数の胎盤幹細胞が補給された一定容量の胎盤潅流液を本明細書に示す。具体的な実施態様において、例えば、各1ミリリットルの胎盤潅流液に約1×10⁴個、5×10⁴個、1×10⁵個、5×10⁵個、1×10⁶個、5×10⁶個又はそれ以上の胎盤潅流細胞又は胎盤幹細胞が補給される。別の実施態様において、複数の胎盤潅流細胞に胎盤潅流液及び/又は胎盤幹細胞が補給される。別の実施態様において、複数の胎盤幹細胞に胎盤潅流液及び/又は複数の胎盤潅流細胞が補給される。ある実施態様において、潅流液が補給に使用される場合は、潅流液の容量は、細胞(溶液中)+潅流液の全容量の約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%又は1%、又はそれを超える、又はそれ未満である。胎盤潅流細胞を使用して、複数の胎盤幹細胞を補給する場合は、胎盤潅流細胞は、一般には、胎盤潅流細胞+胎盤幹細胞の総数の約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%又は1%、又はそれを超える数又はそれ未満の数を含む。同様に、胎盤幹細胞を使用して、複数の胎盤潅流細胞を補給する場合は、胎盤幹細胞は、一般には、胎盤潅流細胞+胎盤幹細胞の総数の約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%又は1%、又はそれを超える数又はそれ未満の数を含む。胎盤幹細胞又は胎盤潅流細胞を使用して胎盤潅流液を補給する場合は、細胞が懸濁された溶液(例えば、食塩水又は培地等)の容量は、潅流液+細胞の全容量の約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、4%、2%又は1%、又はそれを超える容量又はそれ未満の容量を含み、該胎盤幹細胞は、補給前に、1ミリリットル当たり約1×10⁴個、5×10⁴個、1×10⁵個、5×10⁵個、1×10⁶個、5×10⁶個、1×10⁷個、5×10⁷個、1×10⁸個、5×10⁸個又はそれ以上まで懸濁される。

さらに、2つ以上の供給源、例えば、2つ以上の胎盤から得られ、混合、例えば蓄積された蓄積胎盤潅流液を本明細書に示す。そのような蓄積潅流液は、各供給源からのほぼ同等の容量の潅流液を含むか、又は各供給源からの異なる容量を含むことができる。各供給源からの相対的な容量を無作為に選択するか、或いは例えば1つ以上の細胞因子、例えば、サイトカイン、成長因子若しくはホルモン等;各供給源からの潅流液における胎盤細胞の数;又は各供給源からの潅流液の他の特性に基づいて選択することができる。同一の胎盤の複数の潅流による潅流液を同様に蓄積することができる。

同様に、2つ以上の供給源、例えば2つ以上の胎盤から得られ、蓄積された胎盤潅流細胞及び胎盤幹細胞を本明細書に示す。そのような蓄積細胞は、2つ以上の供給源からのほぼ同数の細胞、又は1つ以上の蓄積供給源からの異なる数の細胞を含むことができる。各供給源からの細胞の相対的な数を、蓄積される細胞における1つ以上の特定の細胞型の数、例えば、CD34^-幹細胞の数等に基づいて選択することができる。

蓄積物は、例えば、胎盤潅流細胞が補給された胎盤潅流液;胎盤幹細胞が補給された胎盤潅流液;胎盤潅流細胞及び胎盤幹細胞の両方が補給された胎盤潅流液;胎盤潅流液が補給された胎盤潅流細胞;胎盤幹細胞が補給された胎盤潅流細胞;胎盤潅流液及び胎盤幹細胞の両方が補給された胎盤潅流細胞;胎盤潅流液が補給された胎盤幹細胞;胎盤潅流細胞が補給された胎盤幹細胞;又は胎盤潅流細胞及び胎盤潅流液の両方が補給された胎盤幹細胞を含むことができる。

ある実施態様において、胎盤潅流液、胎盤潅流細胞及び胎盤幹細胞は、医薬グレードの投与可能単位として提供される。そのような単位を個別の容量、例えば、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL又は500mL等で提供することができる。そのような単位を、特定数の、例えば、胎盤潅流細胞、胎盤潅流液由来中間体なナチュラルキラー細胞、又はその両方、例えば、1ミリリットル当たり1×10⁴個、5×10⁴個、1×10⁵個、5×10⁵個、1×10⁶個、5×10⁶個、1×10⁷個、5×10⁷個、1×10⁸個、5×10⁸個又はそれ以上の細胞、或いは1単位当たり1×10⁴個、5×10⁴個、1×10⁵個、5×10⁵個、1×10⁶個、5×10⁶個、1×10⁷個、5×10⁷個、1×10⁸個、5×10⁸個、1×10⁹個、5×10⁹個、1×10¹⁰個、5×10¹⁰個、1×10¹¹個又はそれ以上の細胞を含むように提供することができる。そのような単位を、特定数の胎盤潅流液、胎盤潅流細胞及び/又は胎盤幹細胞のいずれか2つ又は3つすべてを含むように提供することができる。

胎盤潅流液、胎盤潅流細胞及び/又は胎盤幹細胞の上記組合せにおいて、胎盤潅流液、胎盤潅流細胞及び/又は胎盤幹細胞のいずれか1つ、いずれか2つ、又は3つすべては、受給者にとって自己由来のもの(すなわち受給者から得られたもの)、又は受給者にとって同族のもの(すなわち、前記受給者と異なる少なくとも1つの他の個体から得られたもの)であり得る。

また、胎盤幹細胞を胎盤潅流細胞及び/又は胎盤潅流液と組み合わせて含む組成物を本明細書に示す。したがって、別の態様において、単離された胎盤幹細胞を含む組成物であって、前記胎盤幹細胞は、胎盤潅流液から単離され、前記胎盤幹細胞は、該組成物における細胞の少なくとも50%を含む。具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、該組成物における細胞の少なくとも80%を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、単離された胎盤潅流液を含む。より具体的な実施態様において、前記胎盤潅流液は、前記胎盤幹細胞と同じ個体からのものである。別のより具体的な実施態様において、前記胎盤潅流液は、前記胎盤幹細胞と異なる個体からの胎盤潅流液を含む。別の具体的な実施態様において、該組成物は、胎盤潅流細胞を含む。より具体的な実施態様において、前記胎盤潅流細胞は、前記胎盤幹細胞と同じ個体からのものである。別のより具体的な実施態様において、前記胎盤潅流細胞は、前記胎盤幹細胞と異なる個体からのものである。別の具体的な実施態様において、該組成物は、また、単離された潅流液及び単離された胎盤潅流細胞を含み、前記単離された潅流液及び前記単離された胎盤潅流細胞は、異なる個体からのものである。胎盤潅流液を含む上記実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、前記胎盤潅流液は、少なくとも2つの個体からの胎盤潅流液を含む。胎盤潅流細胞を含む上記実施態様のいずれかの別のより具体的な実施態様において、前記単離された胎盤潅流細胞は、少なくとも2つの個体からのものである。

(5.5 胎盤幹細胞バンクの作成)
分娩後の胎盤から採取した幹細胞は、多くの異なる方式で培養されて、例えば、それぞれを管理できる用量のセット、胎盤幹細胞のセットのようなロット(lot)のセットを作成することができる。そのようなロットは、例えば、胎盤潅流液からの、又は酵素で消化された胎盤組織からの幹細胞から得ることができる。多数の胎盤から得られる胎盤幹細胞のロットのセットは、例えば、長期間の保存に備えて、胎盤幹細胞のバンクの中に配置されることがある。一般的に、接着性幹細胞は、胎盤物質の初代培養から得られ、シード培養を形成し、制御された条件下において増殖されて、約同等の数の倍加から細胞の集団を形成する。ロットは、好ましくは、単一の胎盤組織由来であるが、多数の胎盤組織由来であることもできる。

一実施態様において、幹細胞ロットは、以下のように得られる。胎盤組織は、まず崩壊されて、例えば細かく切り刻まれ、例えばコラゲナーゼ(上記5.2.3節を参照)等の適当な酵素により消化される。胎盤組織は、好ましくは、単一胎盤からの全体羊膜、全体絨毛膜、又はそれらを両方共含むが、羊膜又は絨毛膜の一部のみを含むことができる。消化された組織は、例えば、1〜3週間、好ましくは、約2週間培養される。非接着性細胞を除去した後、形成された高密度のコロニーは、例えば、トリプシン処理によって回収される。このような細胞は、回収されて、使い易い体積の培養培地中で再懸濁されて、継代0細胞として定義される。

継代0細胞は、その後に、増殖培養を播種するために使用される。増殖培養は、例えば、NUNC(商標)によるセルファクトリ等の独立した細胞培養装置の任意の配列であることができる。継代0培養中の細胞は、例えば、1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、又は10×10⁴幹細胞とともに、増殖培養を播種するように、ある程度までさらに分割される。好ましくは、約2×10⁴から約3×10⁴までの継代0細胞は、それぞれの増殖培養を播種するために使用される。増殖培養の数は、継代0細胞の数に依存的であり、幹細胞が得られる特定の胎盤に応じた数においてより大きいか、より小さくてもよい。

増殖培養は、培養状態にある細胞の密度が、特定の数値、例えば、1x10⁵細胞/cm²に到逹するまで続けられる。細胞は、また、回収されて、この時点で凍結保存されるか、先に記述したように、新たな増殖培養の中に継代されることができる。細胞は、例えば、使用に先立って、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20回継代されることができる。集団倍加の累積数の記録は、好ましくは、増殖培養の間に維持される。継代0培養からの細胞は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38又は40倍加、或いは60倍加までの間に増殖されることができる。しかし、好ましくは、集団倍加の数は、それぞれの用量に細胞の集団を分割する前に、約15から約30の範囲内、好ましくは、約20倍加である。細胞は、増殖過程を経て培養し続けることができ、或いは、増殖の間、1個以上の時点で冷凍されることもできる。

それぞれの用量にて使用される細胞は、冷凍されるべき数、例えば、後続使用のために凍結保存することができる。それぞれの量は、例えば、ml当たり、約100万から1億個の細胞を含むことができ、全体として約10⁶から約10⁹までの細胞を含むことができる。

本方法にかかる具体的な実施態様において、継代0細胞は、約4倍加の間培養されて、第1の細胞バンク内で冷凍される。第1の細胞バンクからの細胞は、冷凍され、且つ第2の細胞バンクを播種するために使用されて、該細胞は、さらに約8倍加の間増殖される。このステップにおける細胞は、回収されて、冷凍され、細胞倍加の累積数を約20に到達させる、約8の追加の倍加の間に続行できるようにする、新しい増殖培養を播種するために使用される。継代において中間段階の細胞は、後続の増殖培養において使用するために、ml当たり約100,000〜約1千万細胞、好ましくは、約100万細胞の単位で冷凍されることができる。約20倍加における細胞は、幹細胞を含む組成物を作成することに使用するために又は運営のために、ml当たり約100万〜約1億個の範囲内の細胞のそれぞれの用量で冷凍されることができる。

好ましい実施態様において、胎盤が得られるドナー(例えば、母親)は、少なくとも1つの病原体に対して検査される。若し、母親が、検査された病原体に対して陽性である場合、胎盤からの全ロットが廃棄される。そのような検査は、胎盤幹細胞ロットの生成の間、継代0細胞の成立の前後、又は増殖培養の間を含め、何時でも行うことができる。存在に対して検査が行われる病原体には、制限なく、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス(類型IとII)、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス等が含まれる。

(5.6 接着性胎盤幹細胞の分化)
(5.6.1 神経又は神経原性細胞への分化誘導)
胎盤幹細胞のニューロン分化は、例えば、胎盤幹細胞を、ニューロンへの分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。方法の一例において、神経性培地は、DMEM/20%FBSと1mM β-メルカプトエタノールを含み;そのような培地は、培養後の約24時間は、DMEMと1-10mM β-メルカプトエタノールを含む培地と取り替えることができる。他の実施態様において、細胞は、DMEM/2% DMSO/200μMブチル化ヒドロキシアニソールと接触する。具体的な実施態様において、分化培地は、無血清DMEMIF-12、ブチル化ヒドロキシアニソール、塩化カリウム、インスリン、ホルスコリン、バルプロ酸、及びハイドロコルチゾンを含む。他の具体的な実施態様において、ニューロン分化は、B27補充及びL-グルタミンを含み、選択的にbFGF及び/又はEGFで補充された神経細胞培養用基礎培地(Neurobasal-A medium)(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)において、ラミニンがコーティングされたプレート上に胎盤幹細胞を平板培養することにより達成される。胎盤幹細胞は、さらに、神経細胞とともに共同培養によって、又はニューロン調節された培地内での培養によってニューロン分化を誘導することができる。

ニューロン分化は、例えば、ニューロンの様な形態(例えば、拡大された工程を含む両極細胞)を探知することにより;例えば、神経成長因子レセプタ及びニューロフィラメント重鎖遺伝子の発現をRT-PCRで探知することにより;又は、電気的活動を、例えばパッチクランプで探知することにより、検査することができる。

(5.6.2 脂肪細胞への分化誘導)
胎盤幹細胞の脂肪細胞分化は、例えば、胎盤幹細胞を、脂肪細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。好ましい脂質生成培地は、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清で補充されたDMEMを含む。一実施態様において、胎盤幹細胞は、脂肪組織生成誘導培地(Cambrex社)に供給されて、3日間(37℃、5%二酸化炭素)培養されて、脂肪組織生成維持培地(Cambrex社)の中で1〜3日間培養される。誘導/維持の完全な3サイクル後に、脂肪組織生成維持培地の中で、2〜3日おきに培地を交換しながら、細胞は、さらに7日間培養される。

他の実施態様において、胎盤幹細胞は、1μMデキサメタゾン、0.2mMインドメタシン、0.01mg/mlインスリン、0.5mMIBMX、DMEM-高グルコース、FBS、及び抗生剤を含む培地の中で培養される。さらに、胎盤幹細胞は、1個以上のグルココルチコイド(例えば、デキサメタゾン、インドメタソン、ハイドロコルチゾン、コルチゾン)、インスリン、cAMPの細胞内レベルを上昇させる化合物(例えば、ジブチリル-cAMP;8-CPT-cAMP(8-(4)クロルフェニルチオ)-アデノシン、3',5'サイクリック一リン酸塩);8-ブロモ-cAMP;ジオクタノイル-cAMP;ホルスコリン)、及び/又はcAMPの分解を阻害する化合物(例えば、イソブチルメチルキサンチン(IBMX)、メチルイソブチルキサンチン、テオフィリン、カフェイン、インドメタシン等のホスホジエステラーゼ阻害剤)を含む培地内で培養することにより、脂肪組織生成へ誘導することができる。

脂肪組織生成の特質は、多数の細胞質内の脂質小胞の発達であり、これは、親油性ステインオイルレッドOを使用して容易に観察することができる。タンパク質遺伝子に結合したリパーゼ及び/又は脂肪酸の発現は、脂肪細胞に分化し始めた胎盤幹細胞において、RT/PCRにより確認される。

(5.6.3 軟骨細胞への分化誘導)
胎盤幹細胞の軟骨形成分化は、例えば、胎盤幹細胞を、軟骨細胞への分化を誘導する細胞培地条件下に置くことにより達成することができる。好ましい軟骨形成培地は、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清が補充されたDMEMを含む。一実施態様において、胎盤幹細胞は、無菌のポリプロピレンチューブ内に等分されて、遠心分離を行い(例えば、5分間150×gで)、さらに不完全軟骨形成培地(Cambrex社)の中で2回洗浄される。細胞は、0.01μg/mlのTGF-β-3を、約1-20×10⁵細胞/mlの濃度で含む完全軟骨形成培地(Cambrex社)中で再懸濁される。他の実施態様において、胎盤幹細胞は、アスコルビン酸塩の有無に関係なく、外因性成長因子、例えば、GDF-5又は形質転換成長因子β3(TGF-beta3)と接触される。軟骨形成培地は、プロリンとグルタミン、ピルビン酸ナトリウム、デキサメタゾン、アスコルビン酸、及びインスリン/トランスペリン/セルレニウムを含むアミノ酸で補充することができる。軟骨形成培地は、水酸化ナトリウム及び/又はコラーゲンで補充することができる。胎盤幹細胞は、高密度又は低密度で培養されていてもよい。細胞は、好ましくは、血清の存在下で培養される。

軟骨形成は、例えば、ヘマトキシリン/エオシン染色、細胞の形態の評価、及び/又はコラーゲン2とコラーゲン9遺伝子の発現のRT/PCRによる確認;グリコサミノグリカン発現に対するサフラニン-O染色、好酸性グラウンド物質の生成の観察により、評価することができる。また、軟骨形成は、例えば、懸濁液内において細胞を(例えば、約5分間で約800gを)穏やかに遠心分離することで形成された、ペレット内で幹細胞を成長させることによって観察することができる。約1〜28日間後に、幹細胞のペレットはタフなマトリックスを形成し始め、そして、誘導されていない、又は非軟骨形成の細胞株において、刺激されたときに別々に離れる傾向にあるペレットにおいて発見されない構造的強度を示す。例えば、そのような細胞のペレットにおいて、例えばシリアスレッドのようなコラーゲンを染色する染料で、及び/又は、例えばアルシアンブルー等のグリコサミノグリカン(GAG)を染色する染料で染色することにより、軟骨形成も示すことができる。

(5.6.4 骨細胞への分化誘導)
胎盤幹細胞の骨形成分化は、例えば、胎盤幹細胞を、骨形成細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。好ましい骨形成培地は、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清が補充されたDMEMを含み、0.1μMデキサメタゾン、0.05mMアスコルビン酸-2-リン酸塩、10mMベータグリセロリン酸塩を含む骨形成誘導培地(Cambrex社)が続けられる。他の実施態様において、胎盤幹細胞は、約10^-7〜約10^-9Mデキサメタゾン、約10-50μMアスコルビン酸塩リン酸塩(例えば、アスコルビン酸塩-2-リン酸塩)及び約10nM〜約10mM β-グリセロリン酸塩を含む培地(例えば、DMEM-低グルコース)の中で培養される。骨形成培地は、また、血清、1個以上の抗生剤/抗真菌剤、形質転換成長因子-ベータ(例えば、TGF-β1)及び/又は骨形態形成タンパク質(例えば、BMP-2、BMP-4、又はそれらの組合せ)を含むことができる。

分化は、カルシウムに特異的な染料、例えば、von Kossa染色、及び、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、オステオカルシン、骨シアロタンパク質及び/又はオステオポンチン遺伝子発現のRT/PCRによる探知を使用して評価することができる。

(5.6.5 膵臓細胞への分化誘導)
胎盤幹細胞のインスリン生成膵臓細胞への分化は、例えば、胎盤幹細胞を、膵臓細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。

膵臓細胞を形成する培地の一例は、塩基性線維芽細胞成長因子、10ng/ml;及び、形質転換成長因子β-1、2ng/mlで補充されたDMEM/20%CBSを含む。この培地は、50/50v/vでネスチン陽性のニューロン細胞培養からのならし培地と結合される。ノックアウト血清代替は、CBSの代わりに使用することができる。細胞は、14〜28日間、3〜4日おきに供給しながら培養される。

分化は、例えば、インスリンタンパク質生成、又はRT/PCRによるインスリン遺伝子の発現に対して評価することにより確認することができる。

(5.6.6 心臓細胞への分化誘導)
胎盤幹細胞の筋肉組織で発生する(心原性)分化は、例えば、胎盤幹細胞を、心筋細胞に分化を誘導する細胞培養条件下に置くことにより達成することができる。好ましい心臓細胞培地は、レチノイン酸で補充されたDMEM/20%CBS、1μM;塩基性線維芽細胞成長因子、10ng/ml;及び、形質転換成長因子ベータ-1、2ng/ml;及び、内皮成長因子、100ng/mlを含む。ノックアウト血清代替(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)は、CBSの代わりに使用することができる。或いは、胎盤幹細胞は、50ng/mlカルディオトロピン-1で補充されたDMEM/20%CBSの中で、24時間培養することができる。他の実施態様において、胎盤幹細胞は、10〜14日間培養することができる。タンパク質の無い培地中において5〜7日間、その後、例えば、1%臍帯血清で補充される1%HEPES緩衝液内においてヒトの心筋を均質化することで生成される、ヒト心筋抽出物で刺激される。

分化は、例えば、RT/PCRにより心臓アクチン遺伝子の発現を示すことで確認することができる。

(5.7 胎盤幹細胞の保存)
胎盤幹細胞は、保存することができる。すなわち、長期間の保存が可能となる条件、又は、例えばアポトーシス若しくは壊死等の細胞死を抑制する条件下に置くことができる。

胎盤幹細胞は、例えば、2005年12月25日付で出願された「胎盤幹細胞を回収して器官を保護する改良培地」と題された米国仮出願第60/754,969号に記述されたように、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤及び/又は酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物を使用して保存することができる。一実施態様において、幹細胞の集団を保全する方法を本明細書に示すが、該方法は、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む幹細胞回収した組成物と前記幹細胞の集団とを接触させることを含み、ここで前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団においてアポトーシスを低減させるか、防止するのに十分な時間、且つ十分な量で存在する。具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。他の具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤は、JNK阻害剤である。より具体的な実施態様において、前記JNK阻害剤は、前記幹細胞の分化又は急増を調節しない。他の実施態様において、前記幹細胞回収した組成物は、分離された相で前記アポトーシス阻害剤及び前記酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。他の実施態様において、幹細胞回収した該組成物は、前記アポトーシス阻害剤及び前記酸素運搬ペルフルオロカーボンをエマルジョン状で含む。他の実施態様において、該幹細胞回収した組成物は、追加に、レシチン等の乳化剤を含む。他の実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記ペルフルオロカーボンは、幹細胞と接触するとき、約0℃〜約25℃の間にある。他のより具体的な実施態様において、前記アポトーシス阻害剤及び前記ペルフルオロカーボンは、幹細胞と接触するとき、約2℃〜約10℃の間、又は約2℃〜約5℃の間にある。他のより具体的な実施態様において、前記接触は、前記幹細胞の集団を運搬する間に達成される。他のより具体的な実施態様において、前記接触は、前記幹細胞の集団を冷凍及び解凍する間に達成される。

他の実施態様において、胎盤幹細胞の集団を保存する方法を本明細書に示すが、該方法は、前記幹細胞の集団を、アポトーシス阻害剤及び器官保存化合物と接触させることを含み、ここで前記アポトーシス阻害剤は、アポトーシス阻害剤と接触しない幹細胞の集団と比較して、幹細胞の集団においてアポトーシスを低減するか防止させるのに十分な時間、且つ十分な量で存在する。具体的な実施態様において、該器官保存化合物は、UW溶液(米国特許第4,798,824号に記述されて;またViaSpanとして知られ;Southardらの文献,Transplantation 49(2):251-257(1990)を参照)又はSternらの米国特許第5,552,267号に記述された溶液である。他の実施態様において、該器官保存化合物は、ヒドロキシエチルスターチ、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はこれらの組合せである。他の実施態様において、幹細胞回収した該組成物は、さらに、酸素運搬ペルフルオロカーボンを、2相で或いはエマルジョンとして含む。

本発明の他の実施態様において、潅流する間に、胎盤幹細胞は、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボン、器官保存化合物、又はこれらの組合せを含む幹細胞回収した組成物と接触する。他の実施態様において、前記幹細胞は、例えば、酵素による消化等の組織崩壊過程の間に接触する。他の実施態様において、潅流による回収の後、又は酵素による消化等の組織崩壊による回収の後に、胎盤幹細胞は、前記幹細胞回収化合物と接触する。

典型的に、胎盤細胞回収、濃縮及び単離の間、酸素欠乏又は機械的ストレスによる細胞ストレスを最小化するか、除去することが好ましい。本方法の他の実施態様において、したがって、幹細胞又は幹細胞の集団は、前記保存するうちに、6時間未満で、回収、濃縮及び単離の間に酸素欠乏状態に曝露され、ここで酸素欠乏状態とは、酸素の濃度が、正常血液酸素濃度よりも低いことを意味する。より具体的な実施態様において、前記幹細胞の集団は、前記保存するうちに、2時間未満で、酸素欠乏状態に曝露される。他のより具体的な実施態様において、前記幹細胞の集団は、回収、濃縮又は単離の間に1時間未満又は30分未満で酸素欠乏状態に曝露されるか、或いは酸素欠乏状態に曝露されない。他の具体的な実施態様において、前記幹細胞の集団は、回収、濃縮又は単離の間にせん断応力に曝露されない。

本明細書に示された胎盤幹細胞は、例えば、アンプル等の小さな容器の凍結保存培地内において、凍結保存する。好ましい凍結保存培地は、例えば、成長培地を含む培養培地、或いは、例えば市販のC2695、C2639又はC6039(Sigma社)等の細胞冷凍培地を含むが、これに限定されるものではない。凍結保存培地は、好ましくは、DMSO(ジメチルスルホキシド)を、例えば約10%(v/v)の濃度で含む。凍結保存培地は、追加的な試薬、例えば、メチルセルロース及び/又はグリセロールを含む。凍結保存する間、胎盤幹細胞は、好ましくは約1℃/分で冷却される。好ましい凍結保存温度は、約-80℃〜約-180℃、より好ましくは、約-125℃〜約-14O℃である。凍結保存した細胞は、使用のために解凍する前に、液体窒素に運搬することができる。一部の実施態様において、例えば、アンプルが約-90℃に到逹すれば、それらは、液体窒素保存領域に運搬される。凍結保存した細胞は、好ましくは、約25℃〜約40℃の温度で、より好ましくは約37℃の温度で解凍される。

(5.8 胎盤幹細胞の使用)
(5.8.1 胎盤潅流液、幹細胞及び幹細胞集団)
胎盤幹細胞の集団は、幹細胞集団の投与で治療を受けることが可能な任意の疾患、障害又は状態を治療することに使用される。本明細書において使用されているような「治療」とは、病気、障害又は状態の治療、矯正、改善、痛症の節減、又は経時変化の低減、或るいはそれらの任意のパラメーター又は症状を含む。

胎盤幹細胞、及び胎盤幹細胞の集団は、幹細胞又は幹細胞から分化された細胞を必要とする固体への投与に備えて、生体内で又は生体外で、特定の細胞型に分化するように誘導することができる。例えば、胎盤幹細胞は、生体内で器官組織の新生と損傷の回復のために、損傷された器官内に注入することができる。そのような傷害は、癌に起因する病変、骨折、及び例えば脊椎固定で治療可能な脊椎状態を含む骨欠損を含むが、それらに限定されないそのような状態及び障害によるものであってもよい。胎盤幹細胞を損傷した骨に単独で注入するか、又は本明細書に記載の移植可能な基質とともに導入することができる。具体的な実施形態において、胎盤幹細胞の単離された集団を使用して、多発性骨髄腫、骨癌、神経芽細胞種、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨の悪性線維性組織球腫、骨の線維肉腫、転移癌、多発性骨髄腫、及び骨転移を特徴とする任意の形の転移癌を含む癌を含むが、それらに限定されない特定の疾患又は状態を治療することができる。当業者が理解するように、癌によって引き起こされる骨欠損の治療は、必ずしも癌そのものを軽減しない。本明細書に示す骨欠損の治療は、さらなる癌治療の前、後又は該治療と同時に起こりえる。したがって、一実施態様において、骨欠損は、癌が抗癌治療で治療される前に治療される。別の実施態様において、骨欠損は、癌が抗癌治療で治療されるのと同時に、又はほぼ同時に治療される。別の実施態様において、骨欠損は、癌が抗癌治療で治療された後に治療される。

単離された胎盤潅流液、胎盤潅流細胞及び/又は胎盤幹細胞の単離された集団を使用して、骨折、例えば、偽関節骨折を治療することもできる。胎盤幹細胞の単離された集団を使用して、例えば、脊椎固定を必要とする対象における脊椎固定を完了するために、脊椎同士を固定することもできる。胎盤幹細胞の単離された集団を幹細胞又は前駆細胞集団と組み合わせて使用して、先述の障害を治療することもできる。

骨欠損を治療する上記方法のある実施態様において、胎盤潅流液、胎盤潅流細胞及び/又は胎盤幹細胞、例えば、接着性又は非接着性胎盤幹細胞を、骨欠損を有する個体に投与することができる。そのような個体に、例えば、胎盤から得られた胎盤潅流液;1つ以上の細胞型、例えば、赤血球を除去するように処理された胎盤潅流液;胎盤潅流液から単離された胎盤幹細胞、又はそれらのいずれかの組合せを投与することができる。そのような組合せは、本明細書の他の箇所に記載されているように、単離された接着性胎盤幹細胞及び/又は単離された非接着性胎盤幹細胞を含むこともできる。骨欠損、又は骨欠損を有する個体を治療するのに有用な胎盤潅流液、単離された胎盤潅流細胞及び/又は胎盤幹細胞の組合せは、上記セクション5.4に記載されている。

該治療方法の具体的な実施態様において、胎盤細胞は、全(未処理)胎盤潅流液中に含まれる。別の具体的な実施態様において、胎盤細胞は、胎盤潅流細胞である。別の具体的な実施態様において、胎盤細胞は、胎盤幹細胞である。あるより具体的な実施態様において、該幹細胞は、非接着性である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD34⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD44^-である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、前記幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-である。該方法のある他の実施態様において、該胎盤幹細胞は、接着性である。具体的な実施態様において、該接着性胎盤幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺であるか;CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺であるか; CD200⁺及びOCT-4⁺であるか; CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であるか; CD73⁺及びCD105⁺であり、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;又はOCT-4⁺であり、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;或いはそれらの組合せである。非接着性胎盤幹細胞のより具体的な実施態様において、単離されたCD200⁺、HLA-G⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺であり;単離されたCD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺であり;単離されたCD200⁺、OCT-4⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であり;前記CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞がCD34^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である請求項1の単離された細胞であり;1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたCD73⁺及びCD105⁺幹細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-であり;且つ/又は1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたOCT-4⁺は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。ある実施態様において、胎盤幹細胞の集団は、増殖されている。

胎盤潅流液、胎盤潅流細胞又は胎盤幹細胞が懸濁液又は液体注射剤として投与されるときは、該細胞を静脈内に、又は好ましくは、骨欠損、例えば破損の部位に投与することができる。

また、対象における骨欠損を治療するための方法であって、該治療を必要とする対象に対して、本明細書に示す幹細胞の集団を含む移植可能又は注射可能組成物を投与することによって、該対象における骨欠損を治療することを含む方法を本明細書に示す。ある実施態様において、骨欠損は、癌関連溶骨性病変、骨折、又は例えば固定を必要とする脊椎である。ある実施態様において、溶骨性病変は、多発性骨髄腫、骨癌又は転移癌に関連する。ある実施態様において、骨折は、偽関節骨折である。ある実施態様において、非接着性幹細胞の集団を含む移植可能組成物を該対象に投与する。ある実施態様において、移植可能組成物を例えば骨欠損の部位に外科移植する。ある実施態様において、非接着性幹細胞の集団を含む注射可能組成物を該対象に投与する。ある実施態様において、注射可能組成物を骨欠損の領域に外科投与する。ある実施態様において、注射可能組成物を全身投与する。

別の態様において、注射可能組成物を処方するための方法であって、胎盤細胞の集団を注射可能ヒアルロン酸又はコラーゲンと組み合わせることを含む方法を本明細書に示す。具体的な実施態様において、胎盤細胞は、全(未処理)胎盤潅流液中に含まれる。別の具体的な実施態様において、胎盤細胞は、胎盤潅流細胞である。別の具体的な実施態様において、胎盤細胞は、胎盤幹細胞である。あるより具体的な実施態様において、該幹細胞は、非接着性である。該幹細胞は、CD34⁺である。ある実施態様において、該幹細胞は、CD44^-である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺又はCD166⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD9⁺、CD54⁺、CD90⁺及びCD166⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺又はCD200⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞は、CD31⁺、CD117⁺、CD133⁺及びCD200⁺である。ある実施態様において、前記幹細胞の少なくとも約70%がCD34⁺及びCD44^-である。ある実施態様において、前記幹細胞の少なくとも約90%がCD34⁺及びCD44^-である。該方法のある他の実施態様において、該胎盤幹細胞は、接着性である。具体的な実施態様において、該接着性胎盤幹細胞は、CD200⁺及びHLA-G⁺であるか;CD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺であるか; CD200⁺及びOCT-4⁺であるか; CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であるか; CD73⁺及びCD105⁺であり、前記幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;又はOCT-4⁺であり、該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が、胚様体の形成を可能にする条件下で培養されたときに、前記集団における1つ以上の胚様体の形成を促進するか;或いはそれらの組合せである。非接着性胎盤幹細胞のより具体的な実施態様において、単離されたCD200⁺、HLA-G⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺及びCD105⁺であり;単離されたCD73⁺、CD105⁺及びCD200⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-及びHLA-G⁺であり;単離されたCD200⁺、OCT-4⁺幹細胞は、CD34^-、CD38^-、CD45^-、CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺であり;前記CD73⁺、CD105⁺及びHLA-G⁺幹細胞がCD34^-、CD45^-、OCT-4⁺及びCD200⁺である請求項1の単離された細胞であり;1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたCD73⁺及びCD105⁺幹細胞は、OCT-4⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-であり;且つ/又は1つ以上の胚様体の形成を促進する単離されたOCT-4⁺は、CD73⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34^-、CD38^-及びCD45^-である。ある実施態様において、胎盤幹細胞の集団は、増殖されている。ある実施態様において、前記組成物は、注射可能ヒアルロン酸を含む。ある実施態様において、該組成物は、注射可能コラーゲンを含む。また、非接着性幹細胞の集団及び注射可能ヒアルロン酸又はコラーゲンを含む組成物を本明細書に示す。

幹細胞を分化させる条件下で培養されていない胎盤幹細胞を投与することができる。或いは、該幹細胞を、投与前に、例えば約1〜20日にわたって例えば骨形成培地で培養することができる。或いは、胎盤幹細胞を単離し、マトリックス上に接種し、次いで例えば約1〜20日間にわたって骨形成培地で培養することができる。別の実施態様において、胎盤幹細胞を、例えば、約1〜20日間にわたって例えば骨形成培地で培養し、次いでマトリックス上に接種し、次いで、例えば約1〜20日間にわたって本明細書に記載するように骨形成培地で培養することができる。

他の実施態様において、胎盤幹細胞の単離された集団は、自己若しくは異種の組織再生又は代替治療又はプロトコルにおいて、角膜上皮欠損の治療、軟骨修復、顔面皮膚剥離(擦傷)、粘膜、鼓膜、腸の内層、神経構造(例えば、網膜、基底膜中の聴覚神経細胞、嗅上皮内の嗅覚ニューロン)、肌の外傷性負傷に対する熱傷や創傷の治癒、又は他の損傷した又は病気の器官や組織の再建のために使用することができるが、これらに限定されるものではない。

ある実施態様において、胎盤幹細胞の単離された集団は、造血幹細胞の部分的な又は全体的な消失を経験した個体に、例えば、(産業分野、医学的又は軍隊でも)致命的な又は致死量に近い放射線に露出した個体に;例えば、癌治療又はそのようなことの一部として骨髄節制を受けた個体において、造血の再構成に使用される。胎盤由来の幹細胞の単離された集団は、骨髄又は骨髄由来の幹細胞集団の代わりをするか、補充して使用することができる。典型的に、骨髄移植術において生着のために患者体重のkg当たり約1×10⁸から2×10⁸の骨髄単核細胞が注入される(すなわち、約70kgのドナーに対して約70mlの骨髄)。70mlを収得するためには、供血過程においてドナー血液の集中的な供血と重要な喪失を必要とする。造血再構成に対する胎盤幹細胞の単離された集団は、多様な実施態様において、約、少なくとも、又は1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹以下或いはそれ以上の胎盤幹細胞を含むことができる。

本明細書に示された胎盤幹細胞は、単独で或いは他の幹細胞又は前駆細胞の集団と結合して、組織や器官を生体内で作成することに使用することができる。本明細書に示された方法は、胎盤から採取した細胞、例えば、マトリックスを播種して、該細胞がマトリックスを分化し、集団化することを可能とする適切な条件下において培養される幹細胞又は前駆細胞を使用することを含む。本明細書に示された方法で得られた組織と器官は、研究及び治療の目的を含む多様な目的のために使用することができる。

好ましい実施態様において、本明細書に示された接着性胎盤幹細胞とそのような幹細胞の集団は、マッチングされているかマッチングされていないHLA型造血移植を含んで、自己移植及び同種移植のために使用することができる。胎盤幹細胞を同種造血移植として使用する一実施態様において、宿主は、ドナー細胞の免疫学的拒絶を緩和するために、又は免疫寛容を与えるために処理される(例えば、米国特許第5,800,539号及び同5,806,529号を参照)。他の実施態様において、宿主は、免疫学的拒絶を緩和させるために、又は免疫寛容を与えるために処理されない。

胎盤幹細胞は、単独で又は1個以上の他の幹細胞集団と結合して、例えば、以下の幹細胞や前駆細胞を増強するか或いは取り替えるために、治療移植プロトコルにおいて使用することができる: 肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋肉系、骨、骨髄、胸腺、脾臓、粘膜組織、生殖腺、又は体毛。また、胎盤幹細胞は、前駆細胞が典型的に使用される治療又は研究プロトコルにおいて、前駆細胞の特定の分類(例えば、軟骨細胞、肝細胞、造血細胞、膵臓実質細胞、神経芽細胞、筋肉前駆細胞、等)の代わりに使用することができる。

本明細書に示された胎盤幹細胞と胎盤幹細胞の集団は、軟骨、腱又は靭帯の増加、修復又は置換のために使用することができる。例えば、特定の実施態様において、人工補綴(例えば、人工股関節)が、本明細書に示された胎盤幹細胞から育つ代替軟骨組織構成体でコーティングされることができる。他の実施態様において、関節(例えば、膝)は、胎盤幹細胞から育つ軟骨組織構成体で再建することができる。軟骨組織構成体は、また、関節の他の種類に対する主要な再建術に使用することができる(Resnick及びNiwayama編、1988、「骨関節疾患の診断」第2版、W.B.Saunders社を参照)。

本明細書に示された接着性胎盤幹細胞は、例えば、外傷、物質代謝異常又は疾患に起因する組織や器官の損傷を治療するために使用することができる。そのような実施態様において、患者に胎盤幹細胞が、単独で或いは他の幹細胞集団や前駆細胞集団と結合して投与されて、疾患の結果として損傷された器官や組織を再生したり再建することができる。

(5.8.2 胎盤幹細胞を含む組成物)
胎盤幹細胞を含む組成物又はそれからの生体分子を本明細書に示す。本明細書に示された接着性胎盤幹細胞は、任意の生理学的に許容し得る或いは医学的に許容し得る化合物、組成物又は研究や治療において使用するための装置と組み合わせることができる。

(5.8.2.1 凍結保存した胎盤幹細胞)
本明細書に示された胎盤幹細胞の集団は、保存、例えば、後続の使用のために凍結保存することができる。幹細胞等の細胞の凍結保存方法は、当分野において周知である。胎盤幹細胞の集団は、個体に容易に投与可能な形態で調製される。例えば、医療用として適切な容器内に収容されている胎盤幹細胞を本明細書に示す。そのような容器は、例えば、無菌のプラスチック製バッグ、フラスコ、瓶又は胎盤幹細胞の集団が容易に分注されることのできるその他の容器であってもよい。例えば、該容器は、血液バッグ又は他のプラスチック、受容体への液体の静脈投与に適した、医療用途において許容可能なバッグであってもよい。容器は、好ましくは、結合された幹細胞集団の凍結保存を可能とするものである。

凍結保存した胎盤幹細胞の集団は、単一ドナー由来の、又は多数のドナー由来の胎盤幹細胞を含むことができる。胎盤幹細胞の集団は、意図された受容体に完全にHLAがマッチングすることができ、又は部分的に若しくは完全にHLAがミスマッチングすることもある。

したがって、一実施態様において、容器内に胎盤幹細胞の集団を含む組成物を本明細書に示す。具体的な実施態様において、幹細胞集団は、凍結保存される。他の具体的な実施態様において、容器は、バッグ、フラスコ、又は瓶であってもよい。より具体的な実施態様において、前記バッグは、無菌のビニールバッグであってもよい。より具体的な実施態様において、前記バッグは、前記胎盤幹細胞集団の静脈投与に好適であるか、静脈投与を可能とし、又は促進する。バッグは、投与の間又は投与の前に、該胎盤幹細胞が1個以上の他の溶液、例えば、薬と混合されることを可能にする、互いに接続された多数の内腔(lumen)や区画を含むことができる。他の具体的な実施態様において、該組成物は、結合された幹細胞集団の凍結保存を促進する、1個以上の化合物を含む。他の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞の集団は、生理的に許容し得る水溶液の中に含まれている。より具体的な実施態様において、前記生理的に許容し得る水溶液は、0.9%NaCl水溶液である。他の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞の集団は、胎盤細胞を含むが、それは、前記幹細胞集団の受容体にHLAマッチングされている。他の具体的な実施態様において、前記結合された幹細胞集団は、胎盤細胞を含むが、それは、前記幹細胞集団の受容体に少なくとも部分的にHLAがミスマッチングされている。他の具体的な実施態様において、前記胎盤幹細胞は、多数のドナー由来のものである。

(5.8.2.2 医薬組成物)
胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団は、生体内での使用のための医薬組成物に調製することができる。そのような医薬組成物は、生体内への投与のために医薬品として許容可能な運搬体、例えば、食塩水又は他の許可された生理的に許容可能な溶液中に胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞を含む細胞の集団を含む。本明細書に示された医薬組成物は、本明細書に記述された胎盤幹細胞の集団又は胎盤幹細胞類型のいずれでも含むことができる。該医薬組成物は、胎児、母親、又は胎児と母親の両方である胎盤幹細胞を含むことができる。本明細書に示された医薬組成物は、さらに、単一個体又は単一胎盤から得た胎盤幹細胞、又は多数の個体又は胎盤から得た胎盤幹細胞を含むことができる。

本明細書に示された医薬組成物は、胎盤幹細胞のどのような数でも含むことができる。例えば、胎盤幹細胞の単一単位量は、多様な実施態様において、約、少なくとも、又は1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹以下又はそれ以上の胎盤幹細胞を含むことができる。

本明細書に示された医薬組成物は、50%生存可能な細胞又はそれ以上(すなわち、集団における前記細胞の少なくとも約50%は、機能的であるか或いは生きている)を含むことができる。好ましくは、集団における細胞の少なくとも約60%は、生存可能である。より好ましくは、医薬組成物中の集団における細胞の少なくとも約70%、80%、90%、95%、又は99%は、生存可能である。

本明細書に示された医薬組成物は、1個以上の、例えば、生着を促進する化合物(例えば、アンチ-T-細胞レセプタ抗体、免疫抑制剤、又はそのようなもの等);アルブミン、デキストラン40、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ等の安定剤、を含むことができる。

(5.8.2.3 胎盤幹細胞のならし培地)
本明細書に示された胎盤幹細胞は、ならし培地、すなわち幹細胞によって分泌されるか排泄された1個以上の生体分子を含む培地を生成するのに使用することができる。多様な実施態様において、ならし培地は、胎盤幹細胞が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14以上の日数の間成長した培地を含むことができる。他の実施態様において、ならし培地は、胎盤幹細胞がある少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%密集度、又は最大100%までの密集度まで成長した培地を含むことができる。そのようなならし培地は、胎盤幹細胞又は他の種類の幹細胞の分離された集団の培養を維持させるために使用される。他の実施態様において、該ならし培地は、胎盤幹細胞が成体細胞型に分化されてきた培地を含む。他の実施態様において、本明細書に示されたならし培地は、胎盤幹細胞と非胎盤幹細胞が培養されてきた培地を含む。

(5.8.2.4 胎盤幹細胞を含むマトリックス)
さらにまた、胎盤幹細胞又は胎盤幹細胞の集団を含むマトリックス、ハイドロゲル、骨格等を本明細書に示す。ある実施態様において、該マトリックスは、骨欠損を治療するのに有用であることが当業者に知られている任意の基質であり得る。例えば、該マトリックスは、リン酸β-三カルシウム基質、リン酸β-三カルシウム-コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、鉱化コラーゲン基質及びヒアルロン酸基質であり得る。いくつかの実施態様において、該マトリックスにおけるコラーゲンは、胎盤コラーゲンであり得る。胎盤コラーゲンを単離及び調製するための方法及び組成物は、例えば、2006年6月9日出願の米国特許出願第11/450,934号に詳しく記載されている。

胎盤幹細胞を、分化工程の前又は後に、骨を治療するためにマトリックス上に接種することができる。例えば、胎盤幹細胞を、例えば約1〜20日間にわたって、例えば骨形成培地で培養することができる。或いは、胎盤幹細胞を単離し、マトリックス上に接種し、次いで例えば約1〜20日間にわたって、本明細書に記載するように骨形成培地で培養することができる。別の実施態様において、胎盤幹細胞を、例えば約1〜20日間にわたって、例えば骨形成培地で培養し、次いでマトリックス上に接種し、次いで例えば約1〜20日間にわたって本明細書に記載するように骨形成培地で培養する。

胎盤幹細胞は、天然のマトリックス、例えば、羊膜物質等の胎盤生体材料上に播種することができる。そのような羊膜物質は、例えば、哺乳類の胎盤から直接切除された羊膜;固定されたり、又は熱処理された羊膜、実質的に乾燥した(すなわち＜20%H₂O)羊膜、絨毛膜、実質的に乾燥した絨毛膜、実質的に乾燥した羊膜及び絨毛膜等であり得る。その上に胎盤幹細胞を播種することのできる好ましい胎盤生体材料は、Haririによる米国特許出願第2004/0048796号に記載されている。

本明細書に示された胎盤幹細胞は、例えば、注射に適したハイドロゲル溶液中に懸濁されている。そのような組成物に適したハイドロゲルは、RAD16等の自己集合的ペプチドを含む。一実施態様において、細胞を含むハイドロゲル溶液は、例えばモールド内で固まって、体内移植のためにその中に分散された細胞を含むマトリックスを形成する。そのようなマトリックス内の胎盤幹細胞は、さらに培養することができ、よって、細胞は、移植の前に類似分裂的に増殖される。ハイドロゲルは、例えば、ゲルを形成するために水分子をトラップする3次元的に開いた格子構造を形成する共有、イオン、又は水素結合を介して架橋された有機高分子(天然又は合成)である。ハイドロゲルを形成する物質は、イオン的に架橋されるアルギン酸とその塩等の多糖類、ペプチド、ポリホスファジン、及びポリアクリレート、又は温度若しくはpHによって架橋されるポリエチレン酸化物-ポリプロピレングリコールブロック共重合体等のブロック共重合体を含む。いくつかの実施態様において、ハイドロゲル又はマトリックスは、生分解可能である。

一部の実施態様において、製剤は、その場で重合反応を起こすことができるゲルを含む(例えば、米国特許出願第2002/0022676;Ansetheらの文献、J. Control Release,78(1-3):199-209(2002);Wangらの文献、Biomaterials、24(22):3969-80(2003)を参照)。

一部の実施態様において、高分子は、少なくとも部分的に、水、緩衝食塩水、又は側基若しくはそれらの1価のイオン塩を有するアルコール水溶液等の水溶液に溶解可能である。カチオンと反応することのできる酸性側基を含む高分子の例としては、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体、ポリ(ビニルアセテート)、及びスルホン化されたポリスチレン等のスルホン化重合体が挙げられる。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテル単量体、又は重合体の反応によって形成される酸性側基を含む共重合体が、また使用可能である。酸性期の例としては、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくは、フッ化)アルコール基、フェノールOH基、及び酸性OH基が挙げられる。

胎盤幹細胞又はそれらの共培養は、生体内で移植された3次元の骨組み又は骨格上に播種することができる。そのような骨組みは、1個以上の成長因子、細胞、薬又は組織形成を促進するか強化する、或いは組織の修復を改善する他の成分のうちのいずれかと結合して、移植することができる。

使用可能な骨格の例としては、不織布マット、多孔性フォーム、又は自己集合的ペプチドを含む。不織布マットは、グリコール酸と乳酸の合成吸収性コポリマーを含む纎維を用いて形成することができる(例えば、PGA/PLA)(VICRYL、Ethicon社、サマービル、ニュージャージー州)。例えば、ポリ((ε-カプロラクトン)/ポリ(グリコール酸)(PCL/PGA)共重合体で構成されるフォームは、凍結乾燥(freeze-drying)若しくは凍結乾燥(lyophilization)等の方法(例えば、米国特許第6,355,699号を参照)により形成され、また骨格として使用することができる。

本明細書に示された胎盤幹細胞は、さらに、生理的に許容し得るセラミック物質上に播種するか、或いはこのようなセラミック物質と接触することができ、このようなセラミック物質は、以下を含むが、これらに限定されるものではない:モノ-、ジ-、トリ-、アルファ-トリ-、ベータ-トリ-、及びテトラ-カルシウムリン酸塩、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、硫酸カルシウム、フッ化カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、マグネシウムカルシウムリン酸塩、BIOGLASS(登録商標)等の生物学的に活性であるガラス、及び、これらの混合物。現在市販の多孔性の生体適合性セラミック物質は、SURGIBONE(登録商標)(CanMedica社,カナダ)、ENDOBON(登録商標)(Merck Biomaterial France、フランス)、CEROS(登録商標)(Mathys、AG、Bettlach、スイス)、並びにHEALOS(商標)(DePuy社、Raynham、マサチューセッツ州)及びVITOSS(登録商標)、RHAKOSS(商標)、及びCORTOSS(登録商標) (Orthovita社、マルヴァーン、ペンシルベニア州)等の無機物を含む膠原質(コラーゲン)骨移植製品を含む。骨組みは、天然及び/又は合成物質の混合物、又は複合物であってもよい。

他の実施態様において、胎盤幹細胞は、例えば、PGA、PLA、PCL共重合体若しくは混合物、又はヒアルロン酸等の生体に吸収される物質からなるマルチフィラメント糸で構成可能なフェルト上に播種したり、又はフェルトと接触することができる。

本明細書に示された胎盤幹細胞は、他の実施態様において、混成構造であってもよいフォーム骨組み上に播種することができる。そのようなフォーム骨格は、修復されるか、置換されるか増強されなければならない本体において特別な構造の一部分のような、有効な形態にモールディングすることができる。一部の実施態様において、骨組みは、例えば、0.1M酢酸で処理することができる。そして、細胞接着を強化するために、胎盤幹細胞の植菌前に、ポリリジン、PBS及び/又はコラーゲンの中での培養が伴われる。マトリックスの外部表面を以下により修飾して、細胞の接着又は成長及び組織の分化を改善することができる：例えば、マトリックスをプラズマ-コーティングすることにより、又は1種以上のタンパク質(例えば、コラーゲン、弾性纎維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸塩、コンドロイチン-4-硫酸塩、コンドロイチン-6-硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラチン硫酸塩、等)、細胞マトリックス、及び/又はゼラチン、アルギン酸、寒天、アガロース、植物ゴム等のしかしこれらに限定されない他の材料の添加。

一部の実施態様において、骨組みは、血液を凝固させない物質を含むか、これらとともに処理することができる。このような処理と物質は、また、内皮成長、移動、及び細胞外マトリックスの堆積を促進して、維持することができる。このような物質と処理の例としては、ラミニン及びタイプIVコラーゲン等の基底膜タンパク質等の天然物質、EPTFE等の合成物質、及びPURSPAN(商標)(The Polymer Technology Group社、バークリー、カリフォルニア州)等の分断されたポリウレタン尿素シリコーンを含むが、これらに限定されるものではない。骨組みは、さらに、ヘパリン等の抗血栓剤(anti-thrombotic agent)を含むことができる;骨組みは、また、胎盤幹細胞とともに播種する以前に、処理されて、表面チャージを変更することができる(例えば、プラズマによるコーティング)。該骨格は、骨成長を刺激し、及び/又は骨再吸収を阻害する薬剤をさらに含むことができる。例えば、該骨格は、骨形態形成タンパク質、例えば、BMP-2及び/又はBMP-7及びWNT阻害薬等を含むことができる。

(5.8.3 不死化された胎盤幹細胞株)
哺乳類の胎盤細胞は、成長促進遺伝子、すなわち、適切な条件下で、形質転換された細胞の成長を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む、任意の適切なベクターとともにトランスフェクションによって条件付きで不死化することができる。この結果、成長促進タンパク質の生成及び/又は活性は、外部因子によって調節可能である。好ましい実施態様において、成長促進遺伝子は、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス、又はヒトパピローマウイルスE7タンパク質等であるが、これらに限定されない、癌遺伝子である。

成長促進タンパク質の外部調節は、成長促進遺伝子を外的に調節可能なプローモーター、例えば、形質転換される細胞の温度又は細胞と接触する培地の組成物を修正することにより制御することのできる活性のプローモーターの制御下に置くことで、達成することができる。一実施態様において、テトラサイクリン(tet)調節された遺伝子発現システムが、採用され得る(Gossenらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:5547-5551、1992;Hoshimaruらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:1518-1523、1996を参照)。テトラサイクリンの非存在下で、このベクター内のテトラサイクリンが調節されたトランス活性化因子(tTA)は、テトラサイクリン作動遺伝子シーケンスに融合されたヒトサイトメガロウイルスから最小プローモーター、ph_CMP*-1、から転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌のトランスポゾン10由来のtet抵抗性オペロンのリプレッサー(tetR)の融合タンパク質及び単純ヘルペスウイルスのVP16の酸性ドメインである。テトラサイクリンの低くて且つ非毒性濃度(例えば、0.01〜1.0μg/mL)は、トランス活性化因子によるトランス活性化を廃止する。

一実施態様において、ベクターは、さらにまた、選択可能な標識(例えば、薬抵抗を与えるタンパク質)をコードする遺伝子を含む。バクテリアネオマイシン抵抗遺伝子(neo^R)は、本明細書に示されたように使用することのできる、1つのそのような標識である。neo^Rを運搬する細胞は、当分野の技術者に既知の手段で、例えば、100〜200μg/mLのG418を成長培地に添加することで、選択することができる。

トランスフェクションは、当業者に周知の多様な方法のうちのいずれかによって達成することができ、該方法は、レトロウイルス感染を含むが、これに限定されるものではない。一般的に、細胞培養は、生成者細胞株から回収されたならし培地の混合物とともに、N2補充を含むベクターとDMEM/F12に対して培養することで形質転換することができる。例えば、上記の通り調製された胎盤細胞培養は、例えば、ならし培地の1体積の中で、そして、N2補充を含むDMEM/F12の2体積の中で5日後に、インビトロで、約20時間の培養によって形質転換されてもよい。選択可能な標識を運搬する、形質転換された細胞は、その後、下記のように選択することができる。

トランスフェクションの後、培養は、急増を可能にする、例えば、24時間の間に少なくとも細胞の約30%を二倍にする表面の上へ継代される。好ましくは、基材は、ポリオルニチン(10μg/mL)及び/又はラミニン(10μg/mL)でコーティングされた組織培養プラスチックから構成されるポリオルニチン/ラミニン基材、ポリリジン/ラミニン基材、又はフィブロネクチンで処理された表面である。培養基には、その後、3〜4日おきに培地の成長とともに供給し、1個以上の急増-増強因子で補充されても、補充されていなくてもよい。培養基が50%未満の集密度であるとき、急増増強因子は、成長培地に添加されることができる。

条件付きで不死化された胎盤幹細胞株は、80〜95%が集密度であるとき、トリプシン処理等の標準的な技術を用いて、継代培養することができる。約20回目の継代まで、一部の実施態様において、選択を維持する方が有益である(例えば、ネオマイシン抵抗遺伝子を含む細胞へのG418の添加によって)。細胞は、また液体窒素の中で長期間の保存のために冷凍されることができる。

クローン細胞株は、上記の通り調製された条件付きで不死化されたヒト胎盤幹細胞株から単離することができる。一般的に、そのようなクローン細胞株は、限界希釈により、又はクローニングリングを使用する等の標準的な技術を利用して単離され、増殖されることができる。クローン細胞株は、一般に、上記の通りフィーディングされて、継代され得る。

クローン化することはできるが、必要とはしない条件付きで不死化されたヒトの胎盤幹細胞株は、一般に、分化を促進する条件下、成長促進タンパク質の生成及び/又は活性を抑制することによってさらに分化するように誘導することができる。例えば、若し成長促進タンパク質をコードする遺伝子が、外的に調節可能なプローモーターの統制下にある場合、条件、例えば、温度又は培地組成物は改変されて、成長促進遺伝子の転写を抑制することができる。以上で論議された、テトラサイクリンが制御された遺伝子発現システムに対して、分化は、テトラサイクリンの添加によって達成されて、成長促進遺伝子の転写を抑制することができる。一般的に、4〜5日間、1μg/mLのテトラサイクリンは、分化を開始するに当たって十分である。追加的な分化を促進するために、追加的な試薬が成長培地に含まれることができる。

(5.8.4 アッセイ)
本明細書に示された胎盤幹細胞は、アッセイにおいて使用され、培養条件、環境要因、分子(例えば、生体分子、小さな無機分子等)等の幹細胞急増、増殖、及び/又は分化に対する影響を、そのような条件に曝露しない胎盤幹細胞と比較して測定することができる。

好ましい実施態様において、本明細書に示された胎盤幹細胞は、分子と接触して、急増、増殖又は分化における変化に対してアッセイされる。例えば、アルカリホスファターゼ活性及び/又はカルシウム鉱化をモニタリングすることによって骨形成分化を評価することができる。

一実施態様において、例えば、多数の胎盤幹細胞の急増を調節する化合物を同定する方法を本明細書に示すが、該方法は、急増を可能にする条件下において前記化合物と前記多数の幹細胞を接着させることを含み、ここで前記化合物と接触しない多数の幹細胞と比較して、前記化合物が、前記多数の幹細胞の急増において検出できるほどの変化を惹起すれば、前記化合物は、胎盤幹細胞の急増を調節する化合物として同定される。具体的な実施態様において、前記化合物は、急増抑制剤として同定される。他の具体的な実施態様において、前記化合物は、急増促進剤として同定される。

他の実施態様において、多数の胎盤幹細胞の増殖を調節する化合物を同定する方法を本明細書に示すが、該方法は、増殖が可能となる条件下において前記化合物と前記多数の幹細胞を接触させることを含み、ここで前記化合物と接触しない多数の幹細胞と比較して、若し多数の幹細胞の増殖において前記化合物が検出できるほどの変化を惹起すれば、前記化合物は、胎盤幹細胞の増殖を調節する化合物として同定される。具体的な実施態様において、前記化合物は、増殖抑制剤として同定される。他の具体的な実施態様において、前記化合物は、増殖促進剤として同定される。

他の実施態様において、胎盤幹細胞の分化を調節する化合物を同定する方法を本明細書に示すが、該方法は、分化が可能となる条件下において前記化合物と前記多数の幹細胞を接触させることを含み、ここで前記化合物と接触しない多数の幹細胞と比較して、若し幹細胞の分化において前記化合物が検出できるほどの変化を惹起すれば、前記化合物は、胎盤幹細胞の分化を調節する化合物として同定される。具体的な実施態様において、前記化合物は、分化抑制剤として同定される。他の具体的な実施態様において、前記化合物は、分化促進剤として同定される。

(6. 実施例)
以下の実施例は、本実施態様を例示することを意図するものであって、いずれの場合も限定するものと見なされるべきではない。本明細書に引用されているすべての参考文献は、特許文献、論文又は他の文献にかかわらず、あらゆる目的で引用により本明細書中に組み込まれている。

(6.1. 実施例1:胎盤幹細胞の培養)
胎盤幹細胞は、潅流によるか又は物理的崩壊、例えば、酵素による消化によって、分娩後の哺乳類の胎盤から得られる。該細胞は、以下を含む培養培地内で培養される:60%DMEM-LG(Gibco社)、40%MCDB-201(Sigma社)、2%ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories)、1×インスリン-トランスフェリン-セレニウム(ITS)、1×リノール酸-ウシ血清-アルブミン(LA-BSA)、10^-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10^-4Mアスコルビン酸2-リン酸塩(Sigma社)、上皮成長因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来の成長因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシン。

該細胞が培養される培養フラスコは、下記のように調製する。5ng/mlヒトFN(Sigma社 F0895)を含む5mlPBSをフラスコに添加することにより、T75フラスコは、フィブロネクチン(FN)でコーティングされる。FN溶液とともに該フラスコは、37℃で30分間放置される。FN溶液は、その後、細胞培養の前に除去される。処理後、フラスコを乾燥する必要はない。或いは、フラスコは、FN溶液と接触した状態で、4℃で一晩中又はより長い時間放置される;培養前に、フラスコは、暖められ、FN溶液は、除去される。

(潅流により単離された胎盤幹細胞)
胎盤潅流液からの胎盤幹細胞の培養は、次のようにして成立させることができる。Ficoll勾配遠心分離で得た細胞は、FNがコーティングされたT75フラスコ中に播種され、上記の通り、15mlの培養培地において50〜100×10⁶細胞/フラスコで調製される。典型的に、5〜10フラスコが播種される。フラスコは、37℃で12〜18時間培養され、接着性細胞の接着を許可する。10mlの暖かいPBSは、それぞれのフラスコに添加されて懸濁状態の細胞を除去し、穏やかに混合される。15mLの培地は、その後に除去されて、15mLの新しい培養培地に取り替えられる。すべての培地は、培養開始後3〜4日おきに変えられる。後続の培養培地の交換は、培地の50%又は7.5mlが除去される間に達成される。

約12日目でスタートし、培養は、顕微鏡の下でチェックされて接着性細胞コロニーの成長を検査する。細胞培養が約80%融合されたとき、典型的に、培養開始後の13日目〜18日目の間に、接着性細胞がトリプシン消化によって採取される。このような初代培養から採取された細胞は、継代0(ゼロ)と指定される。

(物理的崩壊及び酵素による消化によって単離された胎盤幹細胞)
胎盤幹細胞の培養は、以下のように消化された胎盤組織から樹立される。潅流された胎盤は、無菌のペーパシート上に母体側が上方に向かうように置かれる。胎盤の母体側上に約0.5cmの表面層がブレードで擦り落とされ、ブレードは、約1×2×1cmの胎盤組織ブロックを除去するために使用される。この胎盤組織は、その後、約lmm³小片に細かく切られる。このような小片は、50mlファルコンチューブ内に回収されて、コラゲナーゼIA(2mg/ml、Sigma社)で30分間消化され、続いて、トリプシン-EDTA(0.25%、GIBCOBRL社)によって10分間、37℃の水槽の中で処理される。その結果溶液は、室温で10分間、400gで遠心分離されて、消化溶液が除去される。ペレットは、約10体積で、PBSとともに再懸濁されて(例えば、5mlペレットが45mlPBSとともに再懸濁される)、さらに、チューブは、室温で、10分間400gが遠心分離される。組織/細胞ペレットは、130mL培養培地の中で再懸濁され、細胞は、フィブロネクチンがコーティングされたT-75フラスコ当たり13mlで播種される。細胞は、5%CO₂を含む湿気のある環境において37℃で培養される。胎盤幹細胞は、このステップにおいて選択的に凍結保存される。

(胎盤幹細胞の継代培養及び増殖)
凍結保存した細胞は、直ちに37℃の水槽内で解凍される。胎盤幹細胞は、直ちに冷凍容器から10mlの暖かい培地とともに除去され、15mlの無菌管に移動される。細胞は、400gで10分間室温で遠心分離を行う。細胞は、ゆっくりとピペットで移すことにより、10mlの暖かい培養培地内に再懸濁され、生存可能な細胞の総数は、トリパンブルー排除によって測定される。細胞は、その後、cm²当たり6000〜7000個細胞で、FNがコーティングされたフラスコ内に播種されて、上記の通りに調製される(T-75フラスコ当たり約5×10⁵細胞)。細胞は、37℃、5%CO₂及び90%湿度で培養される。細胞が75-85%の密集度に到逹したとき、すべての使用済みの培地は、フラスコから無菌状態で除去されて、廃棄される。3mlの0.25%トリプシン/EDTA(w/v)溶液が添加されて、細胞層を覆う。そして細胞は、37℃、5%CO₂及び90%湿度で5分間培養される。フラスコは、1、2回軽く叩いて、細胞単離を促進する。細胞の95%より多い細胞が丸くなって分離されると、7mlの暖かい培養培地がそれぞれのT-75フラスコに添加され、溶液は、数回、細胞レイヤ上にピペッティングで分散される。

上記のように細胞を数えて、生存能力を測定した後、細胞は、1000RPMで5分間、室温で遠心分離を行う。細胞は、培養培地とともに1つのT-75フラスコから細胞ペレットをゆっくり再懸濁して、2個のFNがコーティングされたT-75フラスコ上に細胞を平らに平板培養することにより継代される。

上記の方法を用いて、接着性胎盤幹細胞の集団は、標識CD105、CD117、CD33、CD73、CD29、CD44、CD10、CD90及びCD133を発現することで同定された。この細胞の集団は、CD34又はCD45を発現しなかった。一部はHLA-ABC及び/又はHLA-DRを発現するが、しかし、このような胎盤幹細胞のすべての培養が、HLA-ABC及び/又はHLA-DRを発現するのではない。

(6.2 実施例2:胎盤構造から胎盤幹細胞の単離)
(6.2.1 材料及び方法)
(6.2.1.1 対象となる表現型の単離)
胎盤細胞の5つの異なる集団は、正常な満期妊娠の胎盤から採取された。すべてのドナーは、研究目的のための彼らの胎盤の使用に対して、自筆で書かれた同意書を提供した。5つの胎盤細胞集団、すなわち(1)(胎盤血管系の潅流からの)胎盤潅流液;並びに(2)羊膜、(3)絨網膜、(4)羊膜-絨網膜板及び(5)臍帯の消化酵素物を調べた。多様な胎盤組織は、無菌のPBS(Gibco-Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)において洗浄され、分離された無菌のペトリ皿上に置かれた。多様な組織は、無菌の外科用メスを使用して細かく切り刻まれ、50mLのファルコンコニカルチューブ内に置かれた。細かく切り刻まれた組織は、1×コラゲナーゼ(Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州)で20分間、37℃の水槽中で消化されて、遠心分離し、その後、0.25%トリプシン-EDTA(Gibco-Invitrogen社)で10分間、37℃の水槽中で消化した。多様な組織は、消化後に遠心分離をし、無菌のPBS(Gibco-Invitrogen社)で1回洗浄された。再構成された細胞は、2回ろ過されるが、1回は、100μm細胞フィルタで、もう1回は、30μmの分離フィルタでろ過され、残留細胞外マトリックス又は細胞残屑を除去した。

(6.2.1.2 細胞の生存能力評価及び細胞数)
トリパンブルー排除法のマニュアルは、消化後に細胞数を計算し、細胞の生存能力評価するために採用された。細胞は、トリパンブルー染料(Sigma-Aldrich社)と1:1の比率で混合され、細胞は、血球計で読み取られた。

(6.2.1.3 細胞表面標識の特徴付け)
HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺である細胞が、特徴付けのために選択された。このような表現型を有する細胞は、2つのBecton-Dickinsonフローサイトメトリー、FACS Calibur及びFACS Aria(Becton-Dickinson社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国)によって同定されて、定量されて、特徴付けされた。多様な胎盤細胞は、100万個の細胞当たり約10μLの抗体の比で、30分間、室温で、振盪機上で染色された。以下の抗ヒト抗体が使用された:HLA-G(Serotec社、ローリー、ノースカロライナ州)、CD10(BD Immunocytometry systems、サンノゼ、カリフォルニア州)、CD44(BD Biosciences Pharmingen、サンノゼ、カリフォルニア州)、及びCD105(R&D Systems社、ミネアポリス、ミネソタ州) に対するフルオレセインイソチオシアネート(FITC)が結合されたモノクローナル抗体;CD44、CD200、CD117、及びCD13(BD Biosciences Pharmingen)に対するフィコエリトリン(PE)が結合されたモノクローナル抗体;CD117(BD Biosciences Pharmingen)に対するフィコエリトリン-Cy5(PECy5)が結合されたストレプトアビジンとモノクローナル抗体;CD33及びCD10(BD Biosciences社)に対するフィコエリトリン-Cy7(PECy7)が結合されたモノクローナル抗体;CD38(BD Biosciences Pharmingen)に対するアロフィコシアニン(APC)が結合されたストレプトアビジンとモノクローナル抗体;及び、ビオチン化CD90(BD Biosciences Pharmingen)。培養後に、細胞は、1回洗浄され、結合されていない抗体を除去し、4%パラホルムアルデヒド(USB社、クリーブランド、オハイオ州)で、4℃、一晩中、固定した。翌日、細胞は、2回洗い、30μm分離フィルタを通じてろ過され、フローサイトメトリー上で駆動された。

抗マウス兔疫グロブリン抗体(BD Biosciences Pharmingen)で染色された試料は、陰性対照として使用され、光電管(PMTs)を調節するために使用された。抗ヒト抗体で1回染色された試料は、陽性対照として使用され、スペクトルの重複/補償を調節するために使用された。

(6.2.1.4 細胞分類及び培養)
(潅流液、羊膜、又は絨毛膜から採取した)胎盤細胞の1つのセットは、7-アミノ-アクチノマイシンD(7AAD;BD Biosciences Pharmingen)及び対象とする表現型に対して特異的なモノクローナル抗体で染色された。細胞は、100万個細胞当たり10μLの抗体の割合で染色されて、振盪機上で室温で30分間培養された。次いで、この細胞は、BD FACS Aria上で対象とする表現型を発現する、生きている細胞に対して陽性に分類され、培養基中で平板培養された。分類された(対象とする集団)及び「あらゆる」(分類されていない)胎盤細胞集団は、比較のために平板培養された。細胞は、フィブロネクチン(Sigma-Aldrich社)がコーティングされた96ウェルプレート上で、表1に示された細胞密度(細胞/cm²)で平板培養された。細胞密度、並びに細胞が2倍で或いは3倍で平板培養されたかどうかが判定され、対象とする表現型を発現した細胞の数によって制御された。

完全な培地(60%DMEM-LG(Gibco社)及び40%MCDB-201(Sigma社);2%ウシ胎仔血清(Hyclone Labs社);1×インスリン-トランスフェリン-セレニウム(ITS);1×リノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA);10^-9Mデキサメタゾン(Sigma社);10-⁴Mアスコルビン酸2-リン酸塩(Sigma社);上皮成長因子10ng/mL(R&D Systems社);及び、血小板由来の成長因子(PDGF-BB)10ng/mL(R&D Systems社))は、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加され、プレートは、5%CO₂/37℃インキュベーター内に置かれた。第7日目に、100μLの完全な培地が、それぞれのウェルに添加された。96ウェルプレートは、約2週間モニタリングされ、培養の最終評価は、第12日目に完了された。

(6.2.1.5 データ解析)
FACSCaliburデータは、Flow Jo(Tree star社)で標準的なゲーティング技術を用いて解析された。BD FACSAriaデータは、FACSDivaソフトウェア(Becton-Dickinson社)を用いて解析された。FACS Ariaデータは、標準的なゲーティング技術だけではなく、ダブレット(doublet)を最小化する、ダブレット識別ゲーティング技術を用いて解析された。すべての結果は、マイクロソフトエクセルに収集されており、ここで、すべての値は、平均±標準偏差(数、平均標準誤差)で示されている。

(6.2.2 結果)
(6.2.2.1 細胞生存能力)
消化後の生存能力は、トリパンブルー排除法のマニュアルを用いて評価された(図1)。多数の(羊膜、絨毛膜又は羊膜-絨毛膜プレートからの)消化された組織から得た細胞の平均生存能力は、約70%であった。羊膜は、74.35%±10.31%(n=6、SEM=4.21)の平均生存能力を有して、絨毛膜は、78.18%±12.65%(n=4、SEM=6.32)の平均生存能力を有して、羊膜-絨毛膜プレートは、69.05%±10.80%(n=4、SEM=5.40)の平均生存能力を有して、臍帯は、63.30%±20.13%(n=4、SEM=10.06)の平均生存能力を有した。消化過程を経ていない潅流からの細胞は、最高の平均生存能力、89.98±6.39%(n=5、SEM=2.86)を保有した。

(6.2.2.2 細胞定量化)
胎盤由来細胞の5つの異なる集団は、HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺細胞の数を測定するために解析された。BD FACSCaliburデータの解析から、羊膜、潅流液及び絨毛膜は、最大合計数のこのような細胞、それぞれ30.72±21.80細胞(n=4、SEM=10.90)、26.92±22.56細胞(n=3、SEM=13.02)、及び18.39±6.44細胞(n=2、SEM=4.55)を含むものと観察された(データ図示せず)。羊膜-絨毛膜プレート及び臍帯は、対象とする表現型を発現する、最も少ない合計数の細胞を、それぞれ、4.72±4.16細胞(n=3、SEM=2.40)と3.94±2.58細胞(n=3、SEM=1.49)を含んでいた(データ図示せず)。

同様に、対象とする表現型を発現する全体細胞の割合を解析した場合、羊膜と胎盤潅流液が、このような表現型を発現する細胞の最も高い百分率を含むものと観察された(それぞれ、0.0319%±0.0202%(n=4、SEM=0.0101)及び0.0269%±0.0226%(n=3、SEM=O.0130)(図2))。臍帯は、対象とする表現型を発現する細胞の小さな数を含んでいるものの(図2)、臍帯は、対象とする表現型を発現する細胞の第3番目で高い百分率、0.020±0.0226%(n=3、SEM=0.0131)を含んでいた(図2)。絨毛膜と羊膜-絨毛膜プレートは、対象とする表現型を発現する細胞の最も低い百分率、それぞれ、0.0184±0.0064%(n=2、SEM=0.0046)及び0.0177±0.0173%(n=3、SEM=0.010)を含んでいた(図2)。

BD FACSCalibur解析結果と一致するように、BD FACS Ariaデータも、また、残りのソースと比較して、羊膜、潅流液及び絨毛膜が、HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺細胞の高い数を提供するものと確認された。羊膜、潅流液及び絨毛膜の間の対象とする表現型を発現する細胞の平均合計数は、それぞれ、126.47±55.61細胞(n=15、SEM=14.36)、81.65±34.64細胞(n=20、SEM=7.75)、及び51.47±32.41細胞(n=15、SEM=8.37)であった(データ図示せず)。羊膜-絨毛膜プレート及び臍帯は、対象とする表現型を発現する、最も少ない合計数の細胞を、それぞれ、44.89±37.43細胞 (n=9、SEM=12.48)と11.00±4.03細胞(n=9、SEM=1.34)を含んでいた(データ図示せず)。

BD FACS Ariaデータは、B及びAの細胞源が最も高い百分率のHLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺細胞を、すなわち、それぞれ0.1523±0.0227%(n=15、SEM=0.0059)及び0.0929±0.0419%(n=20、SEM=0.0094)を含んでいたことを明らかにした(図3)。Dの細胞源は、対象とする表現型を発現する細胞の最も高い百分率、0.0632±0.0333%(n=9、SEM=0.0111)を含んでいた(図3)。C及びEの細胞源は、対象とする表現型を発現する細胞の最も低い百分率を、それぞれ、0.0623±0.0249%(n=15、SEM=0.0064)及び0.0457±0.0055%(n=9、SEM=0.0018)を含んでいた(図3)。

HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺細胞は、それぞれの細胞源から同定されて、定量された後に、細胞は、さらに、細胞表面標識HLA-G、CD10、CD13、CD33、CD38、CD44、CD90、CD105、CD117、CD200、及びCD105の発現に対して解析され、特徴付けされた。

(6.2.2.3 胎盤潅流液由来の細胞)
潅流液由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105、及びCD13に対して陽性であった(図4)。潅流液由来の細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下の通りである:細胞の37.15%±38.55%(n=4、SEM=19.28)は、HLA-Gを発現した;細胞の36.37%±21.98%(n=7、SEM=8.31)は、CD33を発現した;細胞の39.39%±39.91%(n=4、SEM=19.96)は、CD117を発現した;細胞の54.97%±33.08%(n=4、SEM=16.54)は、CD10を発現した;細胞の36.79%±11.42%(n=4、SEM=5.71)は、CD44を発現した;細胞の41.83%±19.42%(n=3、SEM=11.21)は、CD200を発現した;細胞の74.25%±26.74%(n=3、SEM=15.44)は、CD90を発現した;細胞の35.10%±23.10%(n=3、SEM=13.34)は、CD38を発現した;細胞の22.87%±6.87%(n=3、SEM=3.97)は、CD105を発現した;そして、細胞の25.49%±9.84%(n=3、SEM=5.68)は、CD13を発現した。

(6.2.2.4 羊膜由来の細胞)
羊膜由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105、及びCD13に対して陽性であった(図5)。羊膜由来の細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下の通りである:細胞の57.27%±41.11%(n=3、SEM=23.73)は、HLA-Gを発現した;細胞の16.23%±15.81%(n=6、SEM=6.46)は、CD33を発現した;細胞の62.32%±37.89%(n=3、SEM=21.87)は、CD117を発現した;細胞の9.71%±13.73%(n=3、SEM=7.92)は、CD10を発現した;細胞の27.03%±22.65%(n=3、SEM=13.08)は、CD44を発現した;細胞の6.42%±0.88%(n=2、SEM=0.62)は、CD200を発現した;細胞の57.61%±22.10%(n=2、SEM=15.63)は、CD90を発現した;細胞の63.76%±4.40%(n=2、SEM=3.11)は、CD38を発現した;細胞の20.27%±5.88%(n=2、SEM=4.16)は、CD105を発現した;そして、細胞の54.37%±13.29%(n=2、SEM=9.40)は、CD13を発現した。

(6.2.2.5 絨毛膜由来の細胞)
絨毛膜由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、及びCD13に対して陽性であったが、一方、CD33及びCD105に対する発現は、変化した(図6)。絨毛膜細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下の通りである:細胞の53.25%±32.87%(n=3、SEM=18.98)は、HLA-Gを発現した;細胞の15.44%±11.17%(n=6、SEM=4.56)は、CD33を発現した;細胞の70.76%±11.87%(n=3、SEM=6.86)は、CD117を発現した;細胞の35.84%±25.96%(n=3、SEM=14.99)は、CD10を発現した;細胞の28.76%±6.09%(n=3、SEM=3.52)は、CD44を発現した;細胞の29.20%±9.47%(n=2、SEM=6.70)は、CD200を発現した;細胞の54.88%±0.17%(n=2、SEM=0.12)は、CD90を発現した;細胞の68.63%±44.37%(n=2、SEM=31.37)は、CD38を発現した;細胞の23.81%±33.67%(n=2、SEM=23.81)は、CD105を発現した;そして、細胞の53.16%±62.70%(n=2、SEM=44.34)は、CD13を発現した。

(6.2.2.6 ソースDの胎盤細胞)
羊膜-絨毛膜プレート由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD117、CD10、CD44、CD200、CD90、CD38、CD105、及びCD13に対して陽性であった(図7)。羊膜-絨毛膜プレート由来の細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下の通りである:細胞の78.52%±13.13%(n=2、SEM=9.29)は、HLA-Gを発現した;細胞の38.33%±15.74%(n=5、SEM=7.04)は、CD33を発現した;細胞の69.56%±26.41%(n=2、SEM=18.67)は、CD117を発現した;細胞の42.44%±53.12%(n=2、SEM=37.56)は、CD10を発現した;細胞の32.47%±31.78%(n=2、SEM=22.47)は、CD44を発現した;細胞の5.56%(n=l)は、CD200を発現した;細胞の83.33%(n=l)は、CD90を発現した;細胞の83.52%(n=l)は、CD38を発現した;細胞の7.25%(n=l)は、CD105を発現した;そして、細胞の81.16%(n=l)は、CD13を発現した。

(6.2.2.7 臍帯由来の細胞)
臍帯由来の細胞は、一貫して、HLA-G、CD33、CD90、CD38、CD105、及びCDl3に対して陽性であったが、一方、CD117、CD10、CD44、及びCD200の発現は、変化した(図8)。臍帯由来の細胞に対するそれぞれの標識の平均発現は、以下の通りである:細胞の62.50%±53.03%(n=2、SEM=37.50)は、HLA-Gを発現した;細胞の25.67%±11.28%(n=5、SEM=5.04)は、CD33を発現した;細胞の44.45%±62.85%(n=2、SEM=44.45)は、CD117を発現した;細胞の8.33%±11.79%(n=2、SEM=8.33)は、CD10を発現した;細胞の21.43%±30.30%(n=2、SEM=21.43)は、CD44を発現した;細胞の0.0%(n=l)は、CD200を発現した;細胞の81.25%(n=l)は、CD90を発現した;細胞の64.29%(n=l)は、CD38を発現した;細胞の6.25%(n=l)は、CD105を発現した;そして、細胞の50.0%(n=l)は、CDl3を発現した。

すべての標識の発現平均の要約は、図9に示した。

(6.2.2.8 BD FACS Aria分類報告)
HLA ABC、CD45、CD34、及びCD133の最も高い百分率を発現した胎盤細胞の3つの異なる集団(潅流液、羊膜及び絨毛膜由来の細胞)は、このような標識に対する抗体及び7AADで染色された。3つの集団は、対象とする表現型を発現する生きている細胞に対して陽性に分類された。BD FACS Aria分類の結果は、表2に示されている。

陽性に分類された細胞の3つの異なる集団及びそれらの対応する非分類された細胞は、平板培養されており、培養結果は、第12日目に評価された(表3)。分類された潅流液由来の細胞は、40,600/cm²の細胞密度で平板培養されており、その結果として小さくて丸い非接着性細胞が形成された。非分類潅流液由来の細胞の3つのセットのうち2つは、それぞれ、40,600/cm²の細胞密度で平板培養されており、その結果として、大半が小さくて丸い、非接着性細胞がいくつかの接着性細胞とともにウェル周辺に位置するように形成された。非分類潅流液由来の細胞は、93,800/cm²の細胞密度で平板培養されており、その結果として、大半が小さくて丸い非接着性細胞がいくつかの接着性細胞とともにウェル周辺に位置して形成された。

分類された羊膜由来の細胞は、6,300/cm²の細胞密度で平板培養されており、その結果として、小さくて丸い、非接着性細胞が形成された。非分類羊膜由来の細胞は、6,300/cm²の細胞密度で平板培養されており、その結果として、小さくて丸い非接着性細胞が形成された。非分類羊膜由来の細胞は、62,500/cm²の細胞密度で平板培養されており、その結果として、小さくて丸い非接着性細胞が形成された。

分類された絨毛膜由来の細胞は、6,300/cm²の細胞密度で平板培養されており、その結果として、小さくて丸い非接着性細胞が形成された。非分類絨毛膜由来の細胞は、6,300/cm²の細胞密度で平板培養されており、その結果として、小さくて丸い非接着性細胞が形成された。非分類絨毛膜由来の細胞は、62,500/cm²の細胞密度で平板培養されており、その結果として、小さくて丸い非接着性細胞が形成された。

上記の胎盤幹細胞の集団は、組織培養プラスチック上で培養すると、表面に接着し、特徴的な線維芽様形状を示した。

(6.3 実施例3: 閉鎖回路潅流による胎盤幹細胞の回収)
本実施例は、潅流によって胎盤幹細胞を回収する1つの方法を示す。

分娩後の胎盤は、生まれた後24時間以内に獲得される。臍帯は、胎盤本体の約3から4インチ(約7.62〜10.16cm)の部位に臍帯クランプで締められ、臍帯は、クランプより上部を切り出される。臍帯は、廃棄されるか、又は、例えば臍帯幹細胞を回収するために、及び/又は生体材料の生成のために臍帯膜を処理に供するために処理することができる。過剰の羊膜と絨毛膜は胎盤から切り出され、胎盤の端部周辺に約1/4インチ(0.635cm)を残す。トリミングされた材料は、廃棄される。

胎盤膜の端部から始まって、羊膜は、鈍的切開にて絨毛膜から分離される。羊膜が絨毛膜から全体的に分離されるとき、羊膜は、はさみで臍帯の下方の周辺から切られて、胎盤本体から分離される。羊膜は、廃棄されるか、例えば、酵素による消化によって幹細胞を得るために、又は、例えば、羊膜生体材料を生成するために処理することができる。

胎児側の残された胎盤物質は、無菌のガーゼを用いて、目に見えるすべての血餅及び残留血液を除去し、その後、アルコール綿棒よりヨード綿棒で拭きだされ殺菌される。臍帯は、その後、臍帯クランプの下の無菌の止血鉗子とともに、十字状で交差するようにクランプで締められる。そして、止血鉗子は回転されて、クランプの上で臍帯を引き上げ、ひだを形成する。臍帯は、その後、部分的に止血鉗子の下を切除して、クランプに支持される臍帯の断面を露出する。或いは、臍帯は、無菌の止血鉗子で締められる。続いて、臍帯は、無菌のガーゼ上に載置されて、止血鉗子で締められて張力を提供する。臍帯は、その後、止血鉗子の下でまっすぐ横切してストレートに切られ、血管近傍の臍帯の断面は、再びクランプで締められる。

先に記述されたように、露出された血管である、普通1つの静脈と2つの動脈が確認され、次のように開放される。閉鎖されたワニ口クランプは、それぞれの血管の切られた端を通じて進むことにより、血管壁にクランプが孔を空けないように注意する。クランプの端がほぼ臍帯の下の部分上にあるとき、挿入は停止される。クランプは、その後に、わずかに開かれて、ゆっくりと血管から抜け出して、血管を拡張させる。

潅流装置や蠕動ポンプに接続されたプラスチックチューブは、それぞれの胎盤動脈の中に挿入される。250mL回収バッグに接続されたプラスチックチューブは、胎盤静脈の中に挿入される。チューブは、所定の位置にテープで貼り付けられる。

小さい体積の無菌の等級0.9%注射液は、漏れをチェックするために使用される。若し漏れがなければ、ポンプ速度は増加する。そして、約750mLの等級0.9%のNaCl注射液は、胎盤血管の中にポンプされる。潅流は、臍帯の外端から胎盤本体を穏やかにマッサージすることにより、促進することができる。回収バッグが満たされると、バッグは、バッグにチューブを接続する接続器から除去され、新しいバッグがチューブに接続される。

回収が終了すると、回収バッグを秤量し、遠心分離のためにバランスをとる。遠心分離の後、それぞれのバッグは、細胞のペレットを邪魔することなく、血漿抽出機内に位置される。その後、バッグの中の上澄みは除去されて、廃棄される。次いで、バッグは、穏やかにマッサージされ、残った上澄み中に細胞を再懸濁する。無菌の1mLシリンジを使用して、細胞の約300-500μLが、回収バッグから標本抽出位置接続器を介して抽出され、1.5mL遠心分離チューブに移動される。残された潅流液の重さと体積が測定され、1/3体積のヘタスターチは、潅流液に添加されて、全体的に混合する。mL当たりの細胞の数が測定される。赤い血液細胞は、血漿抽出機を用いて潅流液から除去される。

胎盤細胞は、その後に直ぐに培養して胎盤幹細胞を単離するか、或いは後続の使用のために凍結保存される。

(6.4 実施例4:胎盤幹細胞の分化)
(6.4.1 ニューロンへの分化誘導)
胎盤幹細胞のニューロン分化は、以下のようにして達成することができる:
1. 胎盤幹細胞を、DMEM/20%FBSと1mM β-メルカプトエタノールを含む誘導前の培地の中で、24時間、培養する。
2. 誘導前の培地を除去し、細胞をPBSで洗浄する。
3. DMEMと1-10mM β-メルカプトエタノールを含むニューロン神経誘導培地を、細胞に添加する。或いは、DMEM/2% DMSO/200μMブチル化ヒドロキシアニソールを含む誘導培地を使用することができる。
4. ある実施態様において、形態及び分子の変化は、無血清培地とβ-メルカプトエタノールに露出されてから60分以内に発生することができる。
RT/PCRは、例えば、神経成長因子レセプタ及びニューロフィラメント重鎖遺伝子の発現を評価するために使用することができる。

(6.4.2 脂肪細胞への分化誘導)
羊膜の酵素による消化由来の胎盤幹細胞のいくつかの培養は、50〜70%密集度で、(1)2%FCS、0.5%ハイドロコルチゾン、0.5mMイソブチルメチルキサンチン、60μMインドメタシンを含有するDMEM/MCDB-201;又は、(2)2%FCSと0.5%リノール酸を含有するDMEM/MCDB-201;を含む培地内で誘導される。細胞は、形態学的変化に対して検査され;3-7日間後に、油滴が現われた。分化は、脂質生成に関連した特定の遺伝子、すなわちPPAR-γ2、aP-2、リポタンパク質リパーゼ、及びオステオポンチンの発現を調査する、定量的なリアルタイムPCRによって評価された。胎盤幹細胞の2つの培養は、それぞれ、脂肪細胞に特異的な遺伝子の発現において、6.5倍及び24.3倍の増加を示した。4つの他の培養は、脂質生成誘導後、PPAR-γ2の発現において穏やかな増加(1.5〜2.0倍)を示した。

他の実験において、潅流液から得た胎盤幹細胞は、2%FCSを含有するDMEM/MCDB-201(ニワトリ線維芽細胞基礎培地)の中で培養された。細胞は、トリプシン化されて、遠心分離された。細胞は、脂肪誘導培地(AIM)1又は2の中に再懸濁された。AIM1は、間葉系幹細胞脂質生成補充物(StemCell Technologies社)で補充されたヒト間葉系幹細胞のためのMesenCult基礎培地(StemCell Technologies社)を含んでいる。AIM2は、LA-BSA(1%)と2%FCSで補充されたDMEM/MCDB-201を含んでいる。約1.25×10⁵胎盤幹細胞は、5mLのAIMl又はAIM2の中でT-25フラスコにおいて育てられた。細胞は、インキュベーターの中で7-21日間培養された。細胞は、赤色オイル染色によって確認されるように、細胞質内に油滴の液胞を形成し、これは、脂肪細胞への幹細胞の分化を示唆する。

胎盤幹細胞の脂肪形成分化は、以下のようにして達成することができる:
1. 胎盤幹細胞を、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清で補充されたDMEMの中で培養する。
2. 3つの誘導/維持サイクルが使用される。それぞれのサイクルは、脂肪組織生成誘導培地(Cambrex社)で胎盤幹細胞を供給することと、細胞を、3日間(37℃、5%CO₂で)培養することと、それに続く脂肪組織生成維持培地(Cambrex社)中での1〜3日間の培養からなる。使用可能な他の誘導培地は、1μMデキサメタゾン、0.2mMインドメタシン、0.01mg/mlインスリン、0.5mM IBMX、DMEM-高グルコース、FBS、及び抗生物質を含む。
3. 誘導/維持の完全な3サイクル後に、細胞は、脂肪組織生成維持培地中位でさらに7日間培養され、培地は、2〜3日おきに交換される。
4. 脂質生成の特徴は、多数の細胞質内脂質小胞の発達であり、これは親油性ステインオイルレッドOを使用して容易に観察されることができる。タンパク質遺伝子と結合するリパーゼ及び/又は脂肪酸の発現はRT/PCRによって脂肪細胞に分化され始める胎盤幹細胞の中で確認される。

(6.4.3 骨形成細胞への分化誘導)
骨形成培地は、185mLカムブレキス(Cambrex社)分化基礎培地-骨形成及びSingleQuots(デキサメタゾン、l-グルタミン、アスコルビン酸塩、ペニシリン/ストレプトマイシン、MCGS、及びベータグリセロリン酸塩のうちのそれぞれ1つ)から調製された。潅流液からの胎盤幹細胞は、組織培養表面積のcm²当たり約3×10³細胞で組織培養面積cm²当たり0.2〜0.3mLのMSCGMの中で平板培養された。典型的に、すべての細胞は、37℃、5%CO₂の中のMSCGMにおいて、4〜24時間、培養表面に接着した。骨形成分化は、培地を骨形成分化培地に取り替えることによって誘導された。細胞形態は、接着性胎盤幹細胞の典型的な紡錘状の外観から、無機化によって達成される立方形外観に変化し始めた。一部の細胞は、分化の間、組織培養表面から離層される。

骨形成分化は、以下のようにして達成することができる:
1. 胎盤幹細胞の接着性培養は、MSCGM(Cambrex社)又は15%臍帯血清で補充されたDMEMの中で培養される。
2. 培養は、組織培養フラスコ内で24時間培養される。
3. 骨形成分化は、MSCGMを、0.1μMデキサメタゾン、0.05mMアスコルビン酸-2-リン酸塩、10mMベータグリセロリン酸塩を含む骨形成誘導培地(Cambrex社)で取り替えることで誘導される。
4. 細胞は、2〜3週間、骨形成誘導培地で、3〜4日おきに供給される。
5. アルカリ性ホスファターゼ及びオステオポンチン遺伝子の発現に対するRT/PCR及びカルシウムに特異的な染色を用いて、分化はアッセイされる。

(6.4.4 膵臓細胞への分化誘導)
膵臓の分化は、以下のようにして達成される:
1. 胎盤幹細胞は、形質転換成長因子β-1、2ng/mlと塩基性線維芽細胞成長因子10ng/mlで補充されたDMEM/20%CBSの中で培養される。ノックアウト血清代替は、CBSの代わりに使用することができる。
2. ネスチン-陽性ニューロン細胞培養からのならし培地は、50/50濃度で培地に添加される。
3. 細胞は、14-28日間培養されて、3〜4日おきに再度供給する。
4. 分化は、RT/PCRによってインスリンタンパク質又はインスリン遺伝子発現に対してアッセイすることによって特徴付けされる。

(6.4.5 心臓細胞への分化誘導)
筋肉組織で発生する(心原性)分化は、以下のようにして達成される:
1. 胎盤幹細胞は、レチノイン酸1μM;塩基性線維芽細胞成長因子10ng/ml;及び形質転換成長因子ベータ-1、2ng/ml;並びに、上皮成長因子100ng/mlで補充されたDMEM/20%CBSの中で培養される。ノックアウト血清代替(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)は、CBSの代わりに使用することができる。
2. 或いは、胎盤幹細胞は、50ng/mlカルディオトロピン-1で補充されたDMEM/20%CBSの中で、24時間培養される。
3. 或いは、胎盤幹細胞は、タンパク質の無い培地中において5〜7日間培養され、その後、ヒト心筋抽出物で刺激される。(用量漸増解析)心筋抽出物は、1%臍帯血清で補充される1%HEPES緩衝液内において1gmのヒトの心筋を均質化することにより生成される。懸濁液は、60分間培養されて、その後、遠心分離して、上澄みが回収される。
4. 細胞は、10-14日間培養され、3〜4日おきに再供給する。
5. 分化は、RT/PCRによる心臓アクチン遺伝子の発現を示すことによって確認される。

(6.4.6 軟骨細胞への分化誘導)
(6.4.6.1 一般的な方法)
胎盤幹細胞の軟骨形成分化は、一般に、以下のようにして達成される:
1. 胎盤幹細胞は、15%臍帯血清で補充されたDMEM又はMSCGM(Cambrex社)の中で維持される。
2. 胎盤幹細胞は、無菌のポリプロピレンチューブ内に等分される。細胞は、(5分間、150×gで)遠心分離を行い、不完全軟骨形成培地(Cambrex社)の中で2回洗浄される。
3. 最後の洗浄後に、細胞は、0.01μg/mlのTGF-β-3を、約5×10(5)細胞/mlの濃度で含む完全軟骨形成培地(Cambrex社)中で再懸濁される。
4. 0.5mlの細胞は、15mlのポリプロピレン培養チューブ内に等分される。細胞は、5分間、150×gでペレット化される。ペレットは、培地中にそのまま残される。
5. 緩くキャッピングされたチューブは、24時間、5%CO₂、37℃で培養される。
6. 細胞ペレットは、新しく調製された完全軟骨形成培地で、2〜3日おきに供給される。
7. ペレットは、培地において毎日低速で撹拌されることで、維持されて、再懸濁される。
8. 軟骨形成細胞ペレットは、培養状態で14〜28日間後に採取される。
9. 軟骨形成は、例えば、アルシアンブルー細胞化学的染色によって確認されるように、コラーゲン2及び/又はコラーゲン9遺伝子の発現及び/又は軟骨マトリックス酸粘液多糖質の生成をRT/PCRで確認することで、且つ/又は細胞形態を評価する、好酸性グラウンド基材の生成有無の観察によって特徴付けされる。

(6.4.6.2 軟骨形成細胞への胎盤及び臍帯幹細胞の分化)
本実施例は、軟骨形成細胞への胎盤幹細胞の分化とそのような細胞から軟骨様組織の増殖を示す。

軟骨は、神経分布のない無血管性、無血性組織である。軟骨は、低い軟骨細胞密度(＜5%)を有するが、このような細胞は、それらのまわりに細胞外マトリックスを維持するのに驚くほど効果的である。軟骨の3つの主要形態は、身体において以下のように存在する:(1)関節において関節を滑らかにすることを促進する関節軟骨;(2)例えば、半月板と椎間板において衝撃吸収をする線維軟骨;及び、(3)例えば、鼻や耳等における解剖学上の構造を提供する弾性軟骨。3つのすべての類型の軟骨は、生体化学的構造において類似している。

関節痛は、障害の主な原因であり、整形外科分野において関節痛を無くすにはまだ到っていない(関節退行を起こす原因となるおそれのある)初期変形性関節症、及び外傷は、苦痛の2つの一般的な原因である。米国人口の約9%は、骨盤や膝に変形性関節症を有し、200万例を超える膝手術が毎年行われる。不幸にも、現在の治療は、軟骨を治療するよりむしろ症候に対処する方向で進められている。線維芽細胞様細胞が領域に侵入し、正常組織のように弾力性も弾性もない纎維組織で領域を満たすとき、自然治癒が起き、それ故により損傷をもたらす。治療の選択肢としては、伝統的に、組織移植、軟骨下骨のドリルリング、又は全関節換置換を含むことができる。より最近の治療は、しかしCARTICEL(登録商標)、自己組織軟骨細胞注入;一時的な痛みの軽減のためのヒアルロン酸注入である、ORTHOVISC(登録商標)及びSYNVISC(登録商標);並びに、CHONDROGEN(商標)の半月板治療のための成熟した間葉系幹細胞の注入を含む。一般的に、傾向は、細胞療法及び/又は軟骨細胞や幹細胞を含む、組織処理に供した製品の方により傾いているように見える。

(材料と方法)
AC61665、P3(継代3)及びAC63919、P5と命名された2つの胎盤幹細胞株と、UC67249、P2及びUC67477、P3と命名された2つの臍帯幹細胞株を、以下に略述された研究に使用した。ヒトの間葉系幹細胞(MSC)は、陽性対照として使用され、骨肉腫細胞株、MC3T3及びヒトの皮膚線維芽細胞(HDF)は、陰性対照として使用された。

胎盤と臍帯幹細胞は、酵素による消化によって満妊のヒトの胎盤から単離し、精製した。ヒトのMSC細胞とHDF細胞は、カムブレキス(Cambrex社)から購入、MC3T3細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション社から購入した。使われたすべての細胞株は、ポリプロピレン遠心分離チューブの中、800RPMで5分間ペレット内に遠心分離し、2つの軟骨形成誘導培地(Cambrex社)と非誘導基礎MSC培地(Cambrex社)の中で育てられた。ペレットは、採取され、グリコサミノグリカン(GAGs)に対してアルシアンブルーで、及び/又はシリアスレッドでコラーゲンに対して染色することにより7、14、21及び28日目に組織分析を行った。コラーゲン類型は、さらに、免疫染色で分析された。軟骨に特異的な遺伝子に対するRNA分析は、7日目及び14日目に実施された。

(結果)

(実験1):
軟骨形成研究は、次の3つの主な目標を果たすために計画された:(1)胎盤と臍帯幹細胞が分化して、軟骨組織を形成することができるかどうかを示すこと;(2)胎盤と臍帯幹細胞が、機能的に軟骨細胞へと分化することができるかどうかを示すこと;及び、(3)対照細胞株を評価することにより幹細胞から得られた結果を確認すること。

目標1について、予備研究で、1つの胎盤幹細胞株は、骨形成タンパク質(BMP)を含むか含まないかのいずれかで、最終濃度500ng/mLで軟骨形成の誘導培地中に培養された。ペレットは、4週の間、毎週の軟骨形成誘導のエビデンスで分析された。結果としては、ペレットが期間に対して大きさが増加するということが示された。しかし、ある可視的な分化が、BMP⁺及びBMP^-試料の間で示されなかった。ペレットは、また、軟骨組織の表示子であるGAG'sに対してアルシアンブルーで染色し、組織学的に分析された。BMP⁺細胞は、一般に、蒼白色の液胞を伴い物質代謝的に活性であるものと示された。一方、BMP^-細胞は、濃く染みのついた核に対してより小さくて、細胞質に対してより少ない(低い物質代謝的な活性を反映する)。7日目に、BMP⁺細胞は、濃い青色に染色されたが、一方、BMP^-は、わずかに染色されたのみであった。誘導の28日目に、BMP⁺及びBMP^-細胞は、ほぼ同様にアルシアンブルーで染色された。結局、細胞密度は、時間によって増加し、マトリックスは、ペレットを上回った。一方、MC3T3陰性細胞株は、アルシアンブルーで染色されたとき、GAGの存在を全く示さなかった。

(実験2):
実験1の結果に基づいて、2つの胎盤幹細胞と2つの臍帯幹細胞株の軟骨形成分化能力を分析するためのより具体的な研究が計画された。アルシアンブルー組織学的検査に加え、細胞は、またサイナスレッドで染色され、これは、類型IIコラーゲンに対して特異的である。誘導培地の有無に関係なく、多数のペレットが、それぞれの細胞株に対して作成された。

ペレット化された、培養された細胞株は、まず、軟骨の巨視的な生成に対して徹底的な観察により評価された。結局、幹細胞株は、早ければ1日でペレットを作成するものと観察された。このようなペレットは、時間の経過とともに成長し、白くて輝く軟骨のような硬いマトリックスを形成し、機械的に強固となった。肉眼での検査により、胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞からのペレットは、MSC対照よりもずっと大きくなった。非誘導培地中の対照ペレットは、11日目に単離し始め、28日目には、軟骨形成誘導培地中で培養された細胞が増殖したペレットよりもずっと小さくなった。肉眼による観察では、胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞によって形成されたペレットの間に相違はなかった。しかし、デキサメタゾンのない培地内で初期化されたUC67249幹細胞株は、より大きいペレットを形成した。陰性対照MC3T3細胞は、ペレットを形成しなかった;しかし、HDFは、ペレットを形成した。

すべてのテストグループの内から代表的なペレットは、その後、GAG'sとコラーゲンに対して組織学的分析を受けた。一般に、誘導条件下で幹細胞によって形成されたペレットは、非誘導条件下で形成されたペレットよりもずっと大きくなり、より無傷のままであった。誘導条件下で形成されたペレットは、早ければ7日で、GAG'sの形成と、時間の経過とともに増加するコラーゲン含量を見せ、一方、非誘導条件下で形成されたペレットは、弱めのアルシアンブルー染色によって立証されるように、コラーゲン形成がほとんどないか或いは全くないことを示した。一般に、胎盤幹細胞と臍帯幹細胞は、肉眼検査によってhMSCよりもっと硬くてより大きいペレットを形成するものと示され、時間の経過とともにより多いコラーゲンを生成しているものと示された。また、この研究を通して、偏光下の纎維の色における変化によって立証されているように、コラーゲンは、厚くなり、コラーゲン類型は、変わるものと示された(色は、コラーゲン類型を表示することのできる纎維の厚さに関連する)。誘導された幹細胞と比較して、非誘導胎盤幹細胞は、たとえあるとしても、はるかに少ないタイプIIコラーゲンを生成した。28日の期間に、軟骨組織の特性であるマトリックスの生成が増強されたことにより、細胞密度は減少した。

このような研究は、胎盤と臍帯幹細胞が、軟骨形成の経路に沿って分化することができ、軟骨組織を形成するように容易に誘導されることを確認する。初期の観察は、そのような幹細胞は、軟骨組織の形成に対し、MSCにとって好ましいことを示す。

(6.5 実施例5:胎盤幹細胞の懸滴法培養)
培養状態の胎盤接着性幹細胞は、約5分間、37℃でトリプシン化され、軽く叩いて培養皿から緩くなる。10%FBSは、培養に添加されて、トリプシン化処理を中断する。細胞は、約5mLの培地内で約mL当たり1×10⁴細胞で希釈される。複数チャンネルのマイクロピペットからの滴り(一滴であるか又は滴りである)は、100mLペトリ皿の蓋の内側に位置される。蓋は、注意しながらひっくり返して、皿底の上部に位置され、これは、約25mlの無菌PBSを含んで、皿の雰囲気内で水気含量を維持する。細胞を6〜7日間培養する。

(6.6 実施例6:胎盤幹細胞を得るための胎盤組織消化)
本実施例は、酵素消化による胎盤幹細胞の規模が大きくなった単離を示す。

約10グラムの胎盤組織(羊膜と絨毛膜)を得て、浸軟し、約30mlの全体積の中で、約30分間、37℃で、同じ体積のコラゲナーゼA(1mg/ml)(Sigma社)とトリプシン-EDTA(0.25%)(Gibco-BRL)を用いて消化する。消化によって解放された細胞は、培養培地で3回洗浄され、4つのT-225フラスコ内に分配されて、実施例1に記載されているように培養される。胎盤幹細胞の収率は、10g出発物質当たり約4×10⁸と5×10⁸細胞の間である。継代3で特徴付けされた細胞は、主に、CD10⁺、CD90⁺、CD105⁺、CD200⁺、CD34⁺、及びCD45^-である。

(6.7 実施例7:凍結保存した幹細胞製品の生成と幹細胞バンク)
この実施例は、胎盤幹細胞の単離と冷凍された幹細胞に基づく製品の生成を示す。

要約:胎盤組織は、切除して消化され、初代培養と増殖培養がその後に伴われ、多くの細胞量を生成する増殖された細胞製品を形成する。細胞は、二段重ねの細胞バンク内に保存され、冷凍細胞製品として区分される。単一ドナー胎盤由来のすべての細胞量は、1つのロットと定義され、専用のルーム及びクラス100層流フード(Class100 laminar flow hood)の中で無菌技術を用いて、1つの胎盤ロットを同時に処理した。細胞製品は、CD105⁺、CD200⁺、CD10⁺及びCD34^-であると定義され、正常な核型を有し、母親細胞の含量がない。

(6.7.1 幹細胞を得ること)
組織分解と消化:胎盤は、放出後に24時間以内に得られる。胎盤組織は、羊膜、羊膜と絨毛膜の組合せ、又は絨毛膜から得られる。組織は、約1mmの大きさの小片に細かく切り刻まれる。細かく切り刻まれた組織は、37℃で1時間、lmg/mlコラゲナーゼIAの中で消化され、その後、37℃で30分間、トリプシン-EDTAで処理される。PBSにおいて5%FBSの中で3回洗浄された後、組織は、培養培地に再懸濁される。

初代培養:初代培養の目的は、消化された胎盤組織から細胞を樹立することにある。消化された組織は、培養培地中に懸濁されて、コーニングT-フラスコ内に注入されて、5%CO₂を含んで且つ37℃に維持される加湿チャンバ内で培養される。培地の半分は、培養の5日目の後に再び補給される。細胞の高密度のコロニーは、培養の2週間までに形成される。コロニーは、トリプシン-EDTAで採取され、その後、PBSの中で2%FBSで不活化される。細胞は、遠心分離して、増殖培養を播種するための培養培地中に再懸濁される。このような細胞は、0回倍加された継代0細胞として定義される。

増殖培養:初代培養から採取された、増殖培養から採取された、又は細胞バンクから解凍された細胞は、増殖培養を行うために使用される。セルファクトリ(NUNC(商標))を、10分間、5%CO₂を含む空気の中において50ml/分/トレイで、無菌のフィルタを通じて処理し、37℃に維持され且つ5%CO₂を含む加湿インキュベーター内で暖めた。細胞シードは、トリパンブルーとともに血球計で計算されて、細胞数、生存能力、継代回数、及び倍加の累積数が記録される。細胞は、培養培地中において約2.3×lO⁴細胞/mlで懸濁され、110ml/トレイは、セルファクトリにおいて播種される。培養後3〜4日目に、そしてまた5〜6日目に、培養培地は除去されて、新たな培地と交換されて、空気中の5%CO₂とともにまた他の処置が伴われる。細胞が、約10⁵細胞/cm²に逹するとき、細胞は、トリプシン-EDTAで採取され、PBSの中で2%FBSとともに不活化される。細胞は、その後、遠心分離して、培養培地中に再懸濁される。

凍結保存:冷凍されるべき細胞は、培養からトリプシン-EDTAで採取され、PBSの中で2%FBSで不活化されて、血球計で再び補給される。遠心分離の後、細胞は、細胞バンクのアセンブリーのために使用されるml当たり約100万細胞の濃度で、そしてそれぞれの冷凍された細胞量のためにml当たり約1千万細胞の濃度で、FBS中に10%DMSOで再懸濁される。細胞溶液は、冷凍容器に移動されて、イソプロピルアルコール槽内に、約-80℃の冷凍機内に置かれる。翌日、細胞は、液体窒素に移動される。

(6.7.2 幹細胞バンクの設計)
単一ドナーの胎盤由来のすべての細胞量を「ロット」と定義する。細胞は、増殖培養の間に8継代と30倍加に対して、正常な成長、核型、及び細胞表面標識表現型を維持した。このような限界が与えられた状態で、用量は、5継代及び約20倍加からの細胞を含む。同量の細胞の供給を生成するため、単一ロットは、培養状態で増殖され、2段重ねの細胞バンクと冷凍量内に貯蔵される。特に、0(ゼロ)倍加を経った継代0細胞と定義される、初代培養から採取された細胞は、増殖培養を開始するために使用される。最初継代の後、約4つの倍加が起き、細胞は、マスタセルバンク(MCB)中で冷凍される。MCBからのバイアルは、追加的な増殖培養を播種するために使用される。MCBから解凍された細胞の2つの追加的な継代の後、約12回の累積する倍加の間、細胞は、ワーキングセルバンク(WCB)において冷凍される。WCBからのバイアルは、他の2つの継代に対して増殖培養を播種するために使用され、その結果として、それぞれの量で冷凍された、約20個の倍加で継代5細胞が形成される。

(6.7.3 培養用細胞の解凍)
細胞の冷凍された容器は、封止されたビニールバッグの中に仕込まれ、37℃の水浴中に入れられる。容器は、内容物が小さな氷小片を除いてすべて溶解するまで穏やかに回転される。容器は、封止されたビニールバッグから除去されて、約10倍の体積の培養培地を、穏やかに混合しながら、ゆっくり細胞に添加される。試料は、血球計で計算され、増殖培養に播種される。

(6.7.4 注入用細胞の解凍)
細胞の冷凍容器は、乾燥窒素容器において投与サイトに移動される。投与の前に、容器は、封止されたビニールバッグ中に仕込まれ、37℃で水浴に供する。容器は、内容物が小さな氷小片を除いて溶解するまでに穏やかに回転されている。容器は、封止されたビニールバッグから除去されて、同じ体積の2.5%HSA/5%デキストランが添加される。細胞は、これ以上の洗浄することなく、注入される。

(6.7.5 実験及び特性)
母体血液試料は、すべてのドナー胎盤を同伴する。試料は、B型肝炎コア抗体と表面抗原、C型肝炎ウイルス抗体と核酸、そしてHIV I及びII抗体と核酸に対してスクリーニングされる。胎盤処理と初代培養は、テスト結果を受領する前に始まるが、すべてのウイルスに対して陰性とテストされた母体血液試料と関連の胎盤に対してのみ続けられる。若し、ドナーがどのような病原体に対して1つでも陽性である場合、ロットは、拒絶される。また、表3に示されたテストは、MCB、WCB及びWCBのバイアル由来の細胞量の物質の試料に対して達成される。ロットは、すべての条件が満足されるときにだけ、放出される。

* 40mlの冷凍された細胞/用量と最大5EU/mlとなるように造られている製品に対して、細胞製品は、体重において40kg以上の受容体に対して上限5EU/kg/用量以下である。

(6.7.6 表面標識表現型分析)
細胞は、PBS内の1%パラホルムアルデヒド(PFA)の中で20分間放置されて、染色されるまでに(最長1週間)冷蔵庫内に貯蔵される。細胞は、PBS(染色緩衝物)中の2%FBS、0.05%アジ化ナトリウムで洗浄され、その後、染色緩衝物内に再懸濁される。細胞は、次の抗体結合体で染色される:CD105-FITC、CD200-PE、CD34-PECy7、CD10-APC。細胞は、また、アイソタイプ対照で染色される。30分間の培養後、細胞は、洗浄されて、染色緩衝物で再懸濁され、フローサイトメトリーにて分析される。アイソタイプ対照に比較して、増加された蛍光性を有する細胞は、標識に対して陽性と判定される。

(6.8 実施例8:胎盤幹細胞に特異的な遺伝子の同定)
羊膜-絨毛膜(AC)と臍帯由来(UC)の胎盤幹細胞からの遺伝子発現パターンは、最終的に分化されるものと思われる多能性骨髄由来の間葉系幹細胞(BM)及び皮膚線維芽細胞(DF)の遺伝子発現パターンに比較される。細胞は、1回のみの継代、中程度の回数の継代及び複数回の継代(老衰期時まで含んで)で成長させられた。結果は、集団倍加の数は、遺伝子発現において主な影響を持つことが示された。遺伝子の一セットは、ACとUCにおいて上方調節されて、またBMとDFでは下方調節されるか或いは調節されず、継代の回数に関係なく、発現するものと確認された。胎盤幹細胞又は臍帯幹細胞に特異的な遺伝子のこのようなセットは、母系-胎仔免疫耐性に関連するCD200である兔疫グロブリン様表面タンパク質と上皮細胞に関する細胞-細胞接着タンパク質と細胞骨格の数をコードする。胎盤幹細胞と臍帯幹細胞は、以下、本実施例において集合的にAU/UC幹細胞に言及され、分析された。

(6.8.1 方法と材料)
(6.8.1.1 細胞と細胞培養)
BM(Cat#PT-2501)とDF(Cat#CC-2511)は、Cambrex社から購入された。AC及びUCは、継代0組織の培養フラスコに由来したものである。フラスコの中のAC及びUCは、2063919に設計されたドナー胎盤から消化によって得られた。T-75培養フラスコは、6000細胞/cm²で播種され、細胞は、融合されるとき、継代された。集団倍加は、トリパンブルー細胞数から推定された。培養は、3,11-14、及び24-38集団倍加の後に遺伝子発現に対して分析された。

(6.8.1.2 RNA、マイクロアレイ、及び分析)
細胞溶解(単離)前にトリプシン化された1つの培養を除いて、細胞は、それらの組織培養フラスコから直接溶解(単離)される。全体RNAは、QIAGEN社のRneasy キットで単離した。RNA強度と濃度は、Agilent2100 Bioanalyzerで測定された。それぞれの培養から全体RNAの10マイクログラムは、Affymetrix GENECHIP(登録商標)platform上でハイブリタイズされた。全体RNAはラベリングされたcRNAに転換され、製造者方法に従ってオリゴヌクレオチドヒトゲノムUl33A 2.0配列にハイブリダイズされた。映像ファイルはAffymetrix MAS5.0ソフトウェアの処理に供し、Agilent GeneSpring7.3ソフトウェアに標準化され、分析された。

(6.8.2 結果)
(6.8.2.1 BM-MSC、AC/UC幹細胞及びDFの選択、マイクロアレイ分析における培養時間-点数)
AC/UC幹細胞に唯一の遺伝子発現パターンを樹立するために、2つの幹細胞株であるAC(6)とUC(6)がBM-MSCとDFと平行に培養された。細胞起源に起因する遺伝子発現プロファイルを確認することを極大化するために、そして、外因性影響を最小化するために、すべての細胞は、同じ培地内において生育されて、播種され、同じ基準で第2次培養された。いずれが最初になるか関係なく、細胞は、3つの集団倍加、11-14の倍加、又は35の倍加或いは老衰期の後に採取された。AC/UC幹細胞の中で発現が培養時間によって変わらなく、BMとDFに関して上方調節される遺伝子は、AC/UC幹細胞に特異的な遺伝子に対する候補である。

図10は、本研究において4個の細胞株に対する成長プロファイルを示す:円は、RNA単離のために採取された培養を示す。合計12個の試料が回収された。BM、AC(6)及びUC(6)は、3回の集団倍加後に採取された;このような試料は、時間の「短い」期間の間に培養状態にあるものと見なされた。短い期間、DF試料は回収されなかった。中間長さの培養、11〜14の倍加が、すべての細胞類型に対して回収された。約35の集団倍加で、又は老衰期の直前に、いずれが最初になっても、長期間培養は、すべての細胞株から回収された。老衰期は、BMに対しては15の倍加前に、且つDFに対しては25倍加で発生した。購入されたBM及びDF細胞は、遺伝子分析の前に多数増殖され、早い段階であるとは考えられなかった。しかし、作業的に、3つの倍加(BM-3)の間に生育したBMは、短期間培養と見なされる。同様に、BM-11は、作業的に中間長さ培養と見なされるが、老衰期が14倍加で生じたため、BM-11は、生物学的にほぼ長期間培養である。

(6.8.2.2 階層的クラスタリングは、BM、AC/UC幹細胞とDFの間に関連性を表す)
マイクロアレイ分析は、遺伝子発現のパターンを同定し、階層的クラスタリング(hierarchical clustering)(HC)は、第1の次元で遺伝子と、第2の次元で他の条件(他のRNA試料)である2つの次元の関係において類似点を見つけることを試みる。本実験で使用されたジーンチップは、22,000より多い(「すべての遺伝子リスト」という)プローブセットを含んだが、このようなセットの多数は、どのような条件下でも発現しない遺伝子に信号を送る。すべての遺伝子リストを縮小するために、すべての試料において低いレベル(250未満の未処理数値)で発現したり発現しない遺伝子は除去されて、8,215個の遺伝子のリストを得た。

(6.8.2.3 株グラフの調査を使用した遺伝子発現の分析)
8215個の遺伝子の遺伝子発現パターンは、GeneSpringにおいて線グラフの調査を使用して現わした(図11)。x軸は12個の実験条件を示し、y軸は標準化されたプロブセットの発現数値をログスケールで表した。y軸は10,000倍に及んで、非常に低いレベルで発現したり発現しない遺伝子は、0.01値に決定される。基本的に、平準化された数値は、1と決定される。それぞれの線は、単一遺伝子(実際、遺伝子セット、いくつかの遺伝子は、多数のプロブセットを有する)を示し、単一色としてすべての12個の条件を捜し出す。熱地図(heatmap)に対して記載されるように、色は相対的な発現レベルを表現するが、カラーリングパターンは、1つの条件を選択することで測定される。AC-03は、図11における選択された条件である。標準化された数値に関連して上方調節された遺伝子は、ソフトウェアにより赤い色で現われて、下方調節されたものは、青色で現われる。AC-03からUC-11の間で明白な上向きであって、下向きで向けるスパイクは多くの遺伝子がこのような条件にかけてお互いに違うように発現されるということを表す。AC-03とUC-03間で色パターンにおける顕著な類似性は、これらの2つの試料で多くの同じ遺伝子が上向き又は下方調節されることを示す。平行した線部分は、遺伝子の発現レベルが、多数の条件にわたって変わらないということを表す。これは、UC-36、UC-38、及びUC-38-Tを比較することにより、最も注目すべきことである。UC-36とUC-38-Tとの間には明白なスパイクはないものの、多数の赤い株が、標準化数値1よりも低いという微妙な傾向がある。これは、AC-03とUC-03で上方調節されたこのような遺伝子が、後続の培養において下方調節されることを示す。UC-38とUC-38-Tとの間で発現パターンが類似するという事実は、RNA単離の直前にトリプシン化する細胞が、ただ遺伝子発現にほとんど影響を与えないということを示す。

数値的に強いHC方法に加えて、肉眼での検査により、2つのBM試料は、他の条件よりも互いに対してさらに類似している。同じことが、2つのDF培養に対しても言える。そして、BMとDF試料で存在する多数の差分的に発現した遺伝子にもかかわらず、一般的な様相は、2つのBMと2つのDFはAC/UC幹細胞よりも互いに対して類似することを提示する。これは、先に説明されたHC結果によって確認される。

上記過程が選択された条件通りにAC-11を使用して適用される場合、AC-11及びUC-11が、多くの同じ、差分的に発現された遺伝子を共有することは明らかである。しかし、これらの2つの条件の間に共通の遺伝子の合計数は、AC-03とUC-03によって分けられた、差分的に発現された遺伝子の数よりも少なく示される。図12は、AC-03で、ベースラインに関して、6倍以上差分的に過剰に発現された遺伝子を示す。AC-03で上方調節された多数の遺伝子は、また、UC-03で上方調節され、BMとDFでより分岐する。

(6.8.2.4 AC/UC幹細胞に特異的な遺伝子を同定するために使用されるフィルタリング方法)
すべてのAC/UC試料を通して一定して残り、且つBM及びDFで下方調節される遺伝子は、AC/UC幹細胞に特異的なものと考えられる。2つのフィルタリング方法を結合して、58個のAC/UC幹細胞に特異的な遺伝子のリストを作成した(表4)。

第一に、58個の遺伝子は、すべてのBMとDF試料と係わる8個のAC/UC幹細胞条件のうちで、少なくとも7個の中で3倍以上に過量発現されたそれらの遺伝子を選択することにより同定された(図13)。8個のAC/UC幹細胞条件のうちから8個をフィルタリングして、類似のリストを得た。第2のフィルタリング方法は、Affymetrix MAS5.0ソフトウェアによって提供された「非存在」及び「存在する」細胞を使った。すべてのBMとDF条件に非存在の遺伝子とAC-03、AC-11、UC-03、及びUC-11に存在する遺伝子を同定することにより、リストが作成された。後続のAC/UC幹細胞条件において遺伝子呼びは、明記されなかった。

2つのリストは、有意に重なり、結合された。結合されたリストは、次を除去することでより整えられた:(1)大部分、又はすべてのAC/UC幹細胞条件において非常に低レベルで発現されるいくつかの遺伝子、及び(2)Y染色体上に移される遺伝子。本研究で使用されたAC及びUC細胞は、FISH分析によって男性のものと確認され、BM及びDFは、女性ドナーから得られた。46個のAC/UC幹細胞に特異的な遺伝子の結果リストは、表5に示されている。

46個の遺伝子の該リストは、多数の本体論グループを示すタンパク質の回収物をコードする。最も高く示されたグループである、細胞接着は、8個の遺伝子を含む。いずれの遺伝子も、DNA複製又は細胞分裂と関連のタンパク質をコードしない。上皮と特異的関連のある16個の遺伝子も、また明記される。

(6.8.3 討論)
胎盤幹細胞に特異的であり、骨髄由来の間葉細胞と区別可能な発現パターンが確認された。作用的に、このパターンは、すべてのBMとDF試料に関連のすべての胎盤幹細胞試料で過量発現される、46個の遺伝子を含む。

実験計画は、培養状態で短い、培地そして長時間の期間に培養された細胞を比較した。AC及びUC細胞に対して、それぞれの培養期間は、差分的に発現された遺伝子の特徴的なセットを有する。短い期間又は初期時期(AC-03及びUC-03)の間の200個の上方調節された遺伝子が8回の集団倍加後に平均に戻る。理論に制限されずに、このような初期状態の遺伝子の発現パターンは、自然胎盤環境の中にいる限り、AC及びUCの発現プロファイルに似ているようである。このような細胞が活動的に分裂しない胎盤では、それらは栄養素を代謝し、それらの間で信号を伝達し、それらの位置を細胞外の環境をリモデリングすることで確保している。

中間長さ培養による遺伝子の発現は、迅速な細胞分裂によって定義され、この時点で差分的に発現する遺伝子は、初期時期の間、差分的に発現したものとは非常に異なる。BM-03及びDF-14とともに、AC-11及びUC-11において、上方調節された多くの遺伝子は、染色体複製及び細胞分裂に関連がある。遺伝子発現に基づいて、BM-03は、生物学的に中間期間培養であるものと示される。この中間状態で細胞類型に特異的な遺伝子発現は、細胞急増によって無色になる。付加的に、短い期間AC又はUC培養で過量発現されたほぼすべての遺伝子は、中間、そしてその後の段階状態で下方調節される。143個の遺伝子は、この高く急増される時期の間、5倍以上上方調節され、発現された遺伝子の約1.7%を構成した。

長期間培養は、最終時期又は老衰期を示す。この時期において、細胞は、それらの分裂することのできる能力を無くした。そして、特に、AC及びUCに対して、差分的に発現される絶対数は、顕著に減る。これは、それらの培養環境に完璧に適応される細胞の結果、そして、その結果縮小された生合成量であることができる。驚くべきことに、後期のBMとDF培養は、これと同様の行動を示さない;多数の遺伝子は、標準化された数値1と、AC及びUCに係わったBM-11とDF-24の中で差分的に発現される。AC及びUCは、BMとDFと区別することができ、長期間培養で、最も明らかに区別される。

本明細書に記載される胎盤幹細胞に特異的な遺伝子のリストは、多様である。COL4A1及びCOL4A2は、同等に調節され、KRT18とKRT8は、また、共同発現されるようである。8個の遺伝子は、細胞と細胞との間の接触に係わるタンパク質をコードし、この中の3個(DSC3、DSG2、及びPKP2)は、ケラチン18とケラチン8等の細胞中間フィラメント細胞骨格タンパク質に接着した細胞内接合接着斑で局部化される。細胞間の固い接合は、上皮と内皮成長細胞の特徴であり、線維芽細胞と典型的に関連されてはいない。表3は、全体46個のうち、特徴的な上皮細胞を有する16個の遺伝子について記載している。胎盤幹細胞は、一般的に線維芽細胞のような小さな紡錘模様の細胞で描写される。このような形態は、典型的に、特により低い細胞密度でBMとDFとは異なる。また、注目すべき点は、CD200の発現パターンであり、これは、すべてのBMとDF試料にはないが、AC/UC幹細胞にはある。さらに、CD200は、胎児発達の間、胎盤で免疫耐性と関連されているものと示される(例えば、Clarkらの文献、Am.J.Reprod.Immunol.50(3):l87-195(2003)を参照)。

46個の遺伝子のうちこれら遺伝子の部分集合は、AC/UC幹細胞を骨髄由来の間葉系幹細胞又は線維芽細胞と区別する、分子生物標識の集合を構成する。

(6.9. 実施例6.9:接着性胎盤幹細胞の骨形成細胞への分化)
本実施例では、骨形成細胞に分化する胎盤幹細胞の能力を実証する実験の結果を記載する。本実施例では、また、インビトロで適切な骨格を鉱化させる、又はその鉱化に寄与するそのような骨形成細胞の能力を実証する。

(6.9.1 分化した胎盤幹細胞による骨形成マーカの発現)
最初に、アルカリホスファターゼ(AP)活性をモニタリングすることによって、骨形成前駆体に分化する胎盤幹細胞の能力を評価した。AP活性は、広く使用されている骨形成に対する初期のマーカである(例えば、Kastenら、2005、Biomaterials 26:5879-89参照)。

(6.9.1.1 試薬)
DMEM-LG、インスリン-トランスフェリン-セレニウム-Gサプリメント(ITS)、ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)、PicoGreen dsDNA蛍光アッセイをInvitrogen社(オレゴン州Eugene)から購入した。MCDB201、リノレン酸、デキサメタゾン、L-アスコルビン酸及び表皮成長因子をSigma社(ミズーリ州St. Louis)から購入した。ウシ胎児血清(FBS)及び血小板由来成長因子をそれぞれHyclone社(ユタ州Logan)及びR&D Systems社(ミネソタ州Minneapolis)から入手した。凍結保存した骨髄由来間葉幹細胞(MSC)、間葉幹細胞成長培地(本実施例では「基本」と呼ぶ)及び骨形成分化培地(OS)をCambrex社(ニュージャージー州East Rutherford)から購入した。上記のセクション5.5.4も参照されたい。

(6.9.1.2 細胞培養)
胎盤内のいくつかの異なる解剖部位からの組織の物理的破壊を含むいくつかの方法の1つによって、接着性胎盤幹細胞を胎盤から単離した。接着性胎盤幹細胞を確定し、アントロ1B培地(60%のDMEM-LG、40%のMCDB201、2%のFBS、1XP/S、180ng/mLのリノレン酸、0.05μMのデキサメタゾン、0.1mMのL-アスコルビン酸、10ng/mLの血小板由来成長因子及び10ng/mLの表皮成長因子)にて5×10³個/cm²で副次培養した。骨髄-MSCを基本培地にて5×10³個/cm²で副次培養した。組織培養ポリスチレンに対する実験的調査では、胎盤幹細胞及び/又は間葉幹細胞を基本培地又はアントロ1B培地に5×10³個/cm²で接種し、次いでアントロ1B培地に維持するか、又は5週間までの期間にわたってOSで誘発した。隔週で新鮮な培地を細胞に供給した。3次元骨格に対する調査では、100μlの容量のアントロ1B培地における胎盤幹細胞をリン酸カルシウム(CaP、BD Biosciences社、カリフォルニア州San Jose)骨格又はリン酸β-三カルシウム(TCP、Therics、Akron、OH;VITOSS(登録商標)、Orthovita, Inc.;ペンシルベニア州Malvern;HEALOS(商標)II;Depuy Spine, Inc.;マサチューセッツ州Raynham)骨格上に(2.5×10⁵個/骨格で)接種した。37℃で1〜2時間インキュベートした後に、骨格を含むウェルに180μlの培地を補給した。3〜4日後、試料の半分をアントロ1B培地に維持し、試料の他の半分をOS培地で誘発した。培地を1週間に2回ずつ交換した。

(6.9.1.3 アルカリホスファターゼアッセイ)
p-ニトロフェノール生成物の形成を測定する比色アッセイ(Cell Biolabs社、カリフォルニア州San Diego)を用いて、細胞可溶化物におけるアルカリホスファターゼ(AP)活性を測定した。PicoGreen dsDNA蛍光アッセイ(Invitrogen社、オレゴン州Eugene)を用いて、(細胞数のあらゆる差に対応するために)AP活性をDNAのμgに対して正規化した。骨格上で培養された細胞のAP活性を確認するために、細胞-骨格構造体をPBSで洗浄し、細胞溶解緩衝液に浸し、ピペット先端で潰し、12000gで遠心した。次いで、上記のように、AP活性及びDNA含有量のために上清を分析した。

(6.9.1.4 結果及び考察)
胎盤幹細胞及び間葉幹細胞を基本培地(Cambrex)又はアントロ1B培地に接種し、基本培地、OS培地又はアントロ1B培地に3週間維持した(図14において、基本培地に接種され、OS培地で誘発された細胞を「基本-OS」と呼ぶ)。図14A及び14Bに示すように、基本培地に接種及び維持された細胞は、予測通り最も低いAP活性を示すのに対して、基本培地に接種され、OS培地で誘発された細胞は、比較的高レベルのAP活性を示す。興味深いことに、アントロ1Bに接種及び維持された細胞は、アントロ1B培地に接種され、OS培地で誘発された細胞よりさらに高い最も高レベルのAP活性を示す。したがって、PDACは、適切な培地で培養されたときに骨形成前駆細胞に分化できることがこの実験によって証明された。

(6.9.2 骨形成細胞へのPDACの分化の機能的特性)
本実施例では、胎盤幹細胞から分化した骨形成細胞の機能的能力を評価するための実験の結果を記載する。具体的には、鉱化マトリックスを堆積させる骨形成細胞の能力を評価した。胎盤幹細胞をアントロ1B培地に接種し、3日間培養し、次いで3週間にわたってアントロ1B培地に維持するか、又はOS培地で誘発したことを除いては、上記の実施例6.9.1に記載したように胎盤幹細胞を調製及び培養した。鉱化をフォンコッサ染色、カルシウムアッセイ及び走査型電子顕微鏡(SEM)映像によって評価した。

(6.9.2.1 フォンコッサ染色)
検体をフォンコッサ法によって鉱物に対して染色した。特に、細胞層を10%ホルマリンで10分間固定し、紫外光下で5%硝酸銀とともに20分間インキュベートし、脱イオン水で洗浄し、5%チオ硫酸塩とともに5分間インキュベートし、脱イオン水で十分に洗浄した。

(6.9.2.2 カルシウムアッセイ)
細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回濯ぎ、0.5NのHClで皿から剥ぎ取った。環状シェーカ上にて4℃で一晩インキュベートすることによって、蓄積されたカルシウムを細胞構成要素から抽出した後、2000gで10分間遠心した。Stanbio Laboratory社(テキサス州Boerne)のカルシウム定量キットを使用したカルシウム測定のために上清を使用した。細胞数のあらゆる差に対応するために、カルシウム量を全細胞タンパク質に対して正規化した。

(6.9.2.3 SEM分析)
SEM用試料を10%ホルマリンで15分間固定し、PBSで洗浄し、一連の等級のエタノール(20、40、60、80及び100%)で脱水した。切出しを容易にするために、エタノール脱水後に骨格をパラフィンに埋め込んだ。切出し後、試料をキシレン中でインキュベートし、上記の一連のエタノールで脱水した。次いで、すべての検体に金をスパッタコーティングし、JEOL JSM-6400F電界放出SEM(Evans Analytical Group社、ニュージャージー州East Windsor)を使用して分析した。

(6.9.2.4 結果及び考察)
図15Aに示すように、OS培地で誘発された接着性胎盤幹細胞は、フォンコッサ染色によるカルシウム堆積物の形跡を示す。これらの堆積物は、アントロ1B培地に維持された細胞には観察されなかった。これらの鉱化マトリックスのレベルを定量化するために、細胞単層に付随するカルシウムを測定した。図15Bに示すように、OS培地で誘発された細胞層からは、アントロ1B培地で培養されたものと比較して、3倍を超えるカルシウムが回収された。フォンコッサ染色データとともに、カルシウム抽出結果は、OS培地で誘発された胎盤幹細胞が鉱化マトリックスを形成することを示している。鉱化マトリックスを高解像度で映像化するために、アントロ1B培地に維持された(図16A)、又はOS培地で誘発された(図16B)胎盤幹細胞の試料をSEM分析した。

OS培地で誘発された胎盤幹細胞には、鉱化されたマトリックスの堆積物が明確に認められるのに対して、アントロ1B培地で培養された胎盤幹細胞には鉱化堆積物のそのような蓄積物は見られない。X線解析による図16Bの堆積物の元素写像により、これらの団塊は、カルシウム及びリン酸塩で構成されていることが確認される。

図14の結果(アントロ1B培地の存在下でAP活性が高くなる)と図15及び16の結果(アントロ1B培地の存在下で鉱化が欠如)との相関性の明らかな欠如は、アントロ1B培地が、マトリックスの鉱化のためのリン酸塩の供給源として必要とされるβ-グリセロリン酸塩を含まないことによって説明され得る。アントロ1B培地並びにOS培地に存在するデキサメタゾン及びアスコルビン酸は、幹細胞における骨形成分化の一般的な誘発剤である(例えば、Sunら、2006、Biomaterials 27:5651-7参照)。β-グリセロリン酸塩は、マトリックスの細胞媒介鉱化を可能にするリン酸塩の供給源として骨形成分化培地に通常含まれる。概して、本質的に骨形成分化の誘発剤として認識されていない。AP活性データは、アントロ1Bに接種及び維持された胎盤幹細胞が最も高い骨形成分化の可能性を有することを示唆している。β-グリセロリン酸塩の欠如により、アントロ1B培地で培養された胎盤幹細胞には鉱化が観察されなかった可能性が極めて高い。

(6.9.3 3次元骨格上のPDACの分化)
本実施例では、3次元基質上での胎盤幹細胞の骨形成細胞への分化について記載する。リン酸カルシウム及びアパタイトベースの生体材料が骨折及び骨欠損の治療に臨床的に適用されてきたため、3次元(3D)骨格上の胎盤幹細胞の接着及び骨形成機能を評価するために2つの市販のセラミック骨格を選択した。胎盤幹細胞及び間葉幹細胞を骨格上に接種し、生体外培養において骨格に接着し、長期間接着性を維持するそれらの能力について評価を行った。図17に示すように、胎盤幹細胞並びに間葉幹細胞は、リン酸カルシウム(CaP)骨格と比較してリン酸β三カルシウム(TCaP)に優先的に接着し、胎盤幹細胞及び間葉幹細胞は、TCaP骨格に対して類似の接着性レベルを示す。加えて、その時間経過の間の全体を通じて、CaP骨格上よりTCaP骨格上の方が一貫して多くの細胞(胎盤幹細胞及び間葉幹細胞)が存在する。培養の2週間目までに、接着性胎盤幹細胞及び間葉幹細胞の両方が、CaP骨格上で検出されなくなった。これらのデータは、酸素センサプレートを使用した培地における酸素消費量の分析によって裏づけられる。それとともに、これらの結果は、少なくともある条件下で、TCaP骨格は、CaP骨格よりPDAC生活能力を維持するのに好ましいことを示唆している。

骨格上の骨形成分化を評価するために、骨格上で培養された細胞のAP活性を上記のようにAPアッセイでモニタリングした。胎盤幹細胞及び間葉幹細胞をアントロ1B培地に接種し、次いで実験の持続時間にわたってアントロ1B培地又はOS培地に維持した。図18に示すように、TCaP骨格上の胎盤幹細胞は、アントロ1B培地で培養されてもOS培地で培養されても、類似のAP活性を示すのに対して、TCaP骨格上のMSCは、OS培地で培養された細胞よりアントロ培地の方が高いAP活性を示した。これらの結果は、2D表面について得られたAP活性データと一致する。すなわち、アントロ1B培地に存在する因子は、OS培地と類似したレベルまでAP活性を刺激していると考えられる。MSC及びPDACの両方について、CaP骨格上に継代されている細胞にAP活性が検出されなかった。

3D骨格上の胎盤幹細胞骨マトリックス形性を機能的に評価するために、骨格上に接種され、アントロ1B培地又はOS培地で3〜5週間培養された接着性胎盤幹細胞をSEM分析した。図19に示すように、細胞の不在下で培養されたTCaP骨格のSEMは、豊富な孔の存在により(矢印で示される)高度に多孔性の表面を示した。胎盤幹細胞又は間葉幹細胞とともに培養された骨格は、表面多孔性の欠如を示し、細胞が、細胞二層、又は骨格を取り囲む細胞外マトリックスタンパク質のいずれか又は両方からなる単層を形成していることを示唆している。

鉱化骨マトリックス形性が細胞により骨格内部で生じたかどうかを解明するために、細胞-TCaP骨格構造体の断面を高解像度(5000x)のSEMによって分析した。図19に示すように、細胞の不在下で培養された骨格は、骨格を構成するTCaP結晶の鋭角を特徴としていた。しかし、胎盤幹細胞又は間葉幹細胞が継代されている骨格は、これらの鋭角が欠如している代わりに、図17に観察されるものと非常に類似した結節状構造体で修飾されており、TCaP骨格上の胎盤幹細胞及び間葉幹細胞の両方による鉱化骨マトリックスの形成を示唆している。

(6.10 実施例10:胎盤幹細胞の骨形成前駆体への分化)
本実施例では、潅流によって単離された胎盤幹細胞の骨形成前駆細胞への分化を評価する実験の結果を記載する。細胞を実施例6.3による潅流によってヒト胎盤から単離した。

回収後、ヒト胎盤潅流(HPP)細胞を、VITOSS(登録商標)(Orthovita, Inc.;ペンシルベニア州Malvern) 上で10日間にわたって、10%FBS又はOSを含むDMEM培地で培養した。細胞を5分間にわたる1200rpmの遠心によってペレット化した。残留する液体を細胞ペレットから除去した後、細胞を指定の細胞数(25k、50k又は100k)で20μlのPBS-2%胎児ウシ血清に再懸濁させた。次いで、骨格を2×3×5mm³の片に切断し、96ウェルプレートの各ウェルに入れた。細胞懸濁物を骨格上に直接充填し、5%CO₂の存在とともに37℃で30分間インキュベートした後、200μlのCambrex骨細胞分化培地(カタログ#PT-3002)を分配して、細胞-骨格を浸した。細胞生死判別アッセイでは、細胞が充填された骨格をBD酸素バイオセンサシステム(BD Bioscience社、カタログ#353830)に移し、200μlのCambrex骨細胞分化培地に浸した。

次いで、骨形成能力を染色及びAP活性のモニタリングによって評価した。特に、カルシウムの存在について、従来の技術に従って、細胞をアリザリンレッドで染色した。図20に示すように、幹細胞及びMSCの両方が、OS培地でカルシウム含有鉱化マトリックスを堆積したが、DMEMでは堆積しなかった。

OSで10日間培養した後にAPアッセイを実施した。そのために、2回にわたって凍結及び解凍を行うことによって、0.2%トリトンX-100を含む100μlのPBSに骨格上HPPを溶解させた。BioAssay Systems社のQuantiChromアルカリホスファターゼアッセイキット(カタログ#DALP-250)を供給元の指針に指示されているように使用することによって、アルカリホスファターゼ活性を測定するために、5μlの細胞可溶化液を使用した。該アッセイの結果は、図21に示され、MSC及びHPPの両方が、OS培地で10日間培養後AP活性を示したことを示している。したがって、これらの実験は、上記のようにして得られた細胞を含む幹細胞断片も骨形成前駆細胞に分化する能力を有していたことを証明している。

(6.11 実施例11:胎盤幹細胞を含む組成物による骨修復のための生体内モデル)
本実施例では、胎盤幹細胞を含む組成物による骨欠損の治療を評価するために実施する実験について記載する。骨疾患のいくつかのモデルを、異なる骨疾患に対するそのような治療の適用を評価するように適応させる。

頭蓋両側欠損をモデル化するために、雄の胸腺欠損ラットの頭蓋の各側に3mm×5mmの欠損を外科的に作成する。該欠損をマトリックスのみ、マトリックスとPDACの組合せ及びマトリックスとHPPの組合せで治療する。異なる治療薬の投与量依存性を評価するために、PDACの量を異ならせる。マトリックスと幹細胞の異なる組合せの効果を試験するために、異なるマトリックス材料の評価も行う。

6匹のラットを各治療グループに割り当て、欠損を指定のマトリックスと細胞の組合せで満たす。4週間目に、血清を回収し、ラットを殺す。血清を移植片に対する免疫反応について試験する。ラットの頭蓋をマイクロラジオグラフィーのために回収し、10%NBF中に入れる。

頭蓋冠をパラフィン埋込み及び切出しのために処理する。頭蓋冠の冠状組織切片を従来の技術に従ってトルイジン染料で染色する。マトリックス担体の欠損及び残骸への骨内植を、4が内植の最大量である0から4のスケールに従って評価する。炎症及び線維症も評価する。

癌転移に起因する骨病変の治療をBauerleら、2005、Int. J. Cancer 115:177〜186の手順の適応に応じて評価することができる。手短に述べると、大腿動脈と腸骨動脈の間の網状血管にヒト乳癌細胞を動脈内注射することによって、部位に特異的な溶骨性病変をヌードラットに誘発させる。次いで、転移癌を従来の抗癌療法(例えば、化学療法、放射線療法、免疫療法又は他の療法)で治療するか、或いは外科切除する。次に、癌転移から残留する病変を上記のように異なるマトリックスの組合せで満たす。動物を放射線学的にモニタリングすることによって決定された適切な時間の後に、それらの動物を屠殺する。マトリックスに対する免疫反応、炎症、線維症、骨内植の程度及びマトリックス担体の量を評価する。

骨欠損を治療するための胎盤幹細胞を含む組成物の効果を評価するために使用できるか、又は適応させることができる骨疾患のモデルについて記載しているさらなる参考文献としては、Mitsiadesら、2003、Cancer Res. 63:6689-96;Chakkalakalら、2002、Alcohol Alcoholism 37:13-20;Chibaら、2001、J. Vet. Med. Sci. 63:603-8;Garrettら、1997, Bone 20:515-520;及びMiyakawaら、2003、Biochem. Biophys. Res. Comm. 313:258- 62が挙げられる。

(6.12 実施例12:ヒト胎盤コラーゲンからの鉱化コラーゲンの製造)
〜3mg/mlの4℃のヒト胎盤コラーゲン(HPC)溶液を中和緩衝液(200mMのNa₂HPO₄、pH9.2)と85:15の比で混合して、30mMの最終Na₂HPO₄濃度及び7.2のpHを得た。撹拌しながら1NのNaOH又はHClを添加することによってわずかなpH調整を遂行した。pHが調整されると、撹拌を停止し、反応物を1℃/分で32℃まで昇温させた。該反応物を20〜24時間恒温に保ち、原線維コラーゲンを遠心によって単離した。該コラーゲンをリン酸緩衝生理食塩水(PBS、20mMのNa₂HPO₄、130mMのNaCl、pH7.4)で3回再懸濁させ、遠心してコラーゲンを単離した。最終洗浄原線維コラーゲンを10mg/mlまでPBSに再懸濁させ、使用するまで4℃で保管した。HPCの原線維形成は、図22aに示す短原線維及び長繊維として可溶性コラーゲンを構成する。

(6.12.1 コラーゲン原線維の鉱化)
コラーゲンを鉱化するために、Ca(OH)₂を199.9mmol/Lで分散させながら、59.7mMのH₃PO₄溶液を作製した。Ca(OH)₂及びH₃PO₄をそれぞれ2:1の比で混ぜ合わせ、水ジャケット反応容器中でpHを9に調整した。これにより、Ca/P比が1.67になる。それぞれ循環式水浴及び自動滴定装置によって温度を40℃に、pHを9に保持しながら反応物を激しく撹拌した。PBS中の原線維コラーゲンを反応混合物に徐々に添加し、pHを9に戻した。最終的な鉱物対コラーゲン比は、80:20であった。反応物を18時間にわたって激しく撹拌し、鉱化コラーゲン(MC)を遠心によって単離し、PBSで3回洗浄した。鉱化反応中に、図22bに示す電子顕微鏡写真に示されるように、繊維に沿ってCa-P鉱物が形成した。最終的な反応収率は高く(＞80%)、該材料の最終的な鉱物/コラーゲン比は、TGAを使用して測定した場合に、入力した鉱物/コラーゲン比に近かった(図23)。

(6.12.2 複合体の架橋)
鉱化コラーゲン(MC)を約2.5mg/mlのコラーゲン濃度までPBSに再懸濁させ、水ジャケット反応容器に入れた。pHを9.5に調整し、自動滴定装置により反応全体を通じて一定に保持し、温度を循環式水浴により25℃の一定温度に保持した。ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)を50mMの最終濃度まで添加した。反応物を24時間にわたって激しく撹拌し、その時点で、生成物を遠心によって単離し、PBSで1回洗浄し、0.5Mグリセリンを含むPBS(pH10)に再懸濁させて、すべての未反応の残留エポキシド基を失活させた。反応物を25℃で24時間にわたって激しく撹拌し、次いでPBSで3回洗浄した。遠心を用いて、架橋鉱化コラーゲン(CMC)を単離した。光学顕微鏡測定及び走査型電子顕微鏡測定、熱重量分析(TGA)、示差走査熱測定(DSC)、X線回折計(XRD)及びフーリエ変換赤外分光光度法(FTIR)によってCMC処方物の特性決定を行った。

DSCで測定した〜50から〜70℃のコラーゲンの変性温度の上昇によって架橋を確認した。架橋した物質は、架橋していない物質より機械的結着性が強く、立体顕微鏡測定及び走査型電子顕微鏡測定(SEM)によって調査した場合により繊維状であった。FTIRにより、炭酸リン酸カルシウム鉱物の存在が示された。XRDにより、該鉱物が不十分に結晶化したヒドロキシアパタイトであることが確認された。

(6.13 実施例13:鉱化ヒト胎盤コラーゲンマトリックス上のPDACの成長)
本実施例では、鉱化HPCマトリックス上で接着及び成長する接着性胎盤幹細胞の能力を評価する実験の結果を記載する。これらの実験において、上記のように製造されたCMCを抗菌試薬及び抗真菌試薬で滅菌した。湿った試料を、製造元の説明書に従って標準的なラクトース脱水素酵素細胞毒性アッセイ(LDH)で胎盤幹細胞を使用する非接触毒性調査のために、トランスウェルに充填した。培地内に放出されたLDHを細胞毒性と関連づけた。

次に、上記のように調製されたCMCをPDAC接着性及び増殖試験に使用した。胎盤幹細胞を上記のようにCMC上に接種した。1、5及び7日目にPicoGreen DNAアッセイ(Molecular Probes社;オレゴン州Eugene)を用いてPDAC細胞数を分析した。PDACは、CMCに曝露された場合のLDH産生が、組織培養ポリスチレン(TCPS)に曝露された場合と類似していることを示し、CMCの毒性が低いことが示された。PDACは、また、試験したすべての接種密度において、非架橋鉱化コラーゲンよりCMCにより多く接着した。接種後7日間にわたってこの傾向が続き、胎盤幹細胞は、CMC上で最も細胞数が多かった。

(6.14 実施例14:胎盤幹細胞及び移植可能マトリックスを使用した頭蓋欠損の修復)
組織又は臓器移植に代わる有望な選択肢として、幹細胞を使用する組織工学が出現している。産後の胎盤から単離された新規の幹細胞(胎盤由来接着性細胞、PDAC)は、多分化能幹細胞の特徴及び表現型を有する。PDACは、損傷又は疾患組織の修復のための治療選択肢として使用することが可能である幹/前駆細胞の重要且つ明白な供給源を構成する。本試験において、インビトロ及びインビボのPDACの骨形成挙動を調べた。

(方法)
インビトロ試験:胎盤幹細胞を異なる解剖部位からの組織の物理的破壊によって胎盤から得て、基本培地に接種し、次いで上記のように骨形成分化培地(OS)で誘発した。PDACの生体外骨形成活性をアルカリホスファターゼ(AP)活性によって評価し、細胞外マトリックスの鉱化をアリザリンレッド染色によって検出した。3次元骨格上の胎盤幹細胞の処理量及び生存度を、それぞれDNAアッセイ及びCELLTITER GLO(登録商標)発光アッセイを用いて測定した。

インビボ試験:胎盤幹細胞を骨格(VITOSS(登録商標)Orthovita又はHEALOS(商標)DePuy)上に充填し、生体外で1時間まで培養して、移植用細胞/骨格構造体を形成した。異所性モデルでは、胎盤幹細胞充填VITOSS(登録商標)構造体を40匹の胸腺欠損マウスに皮下移植し、移植の6週間後に回収した。外植体を免疫組織化学(IHC)によって分析した。骨欠損モデルでは、両側頭蓋欠損(3mm×5mm)を96匹の雄のHsd:RH-Foxn^rnu胸腺欠損ラット(Charles River、マサチューセッツ州Wilmington)に生成し、胎盤幹細胞+HEALOS(商標)、陽性対照としての骨形態発生タンパク質-2(BMP-2)+HEALOS(商標)、陰性対照としての骨格(HEALOS(商標))単独及び空欠損(治療なし)を比較するために使用した。ラットは、試験時の年齢が約6週間であり、16匹のラットを各グループに割り当てた。実験条件用外植体に1ミリリットル当たり5×10⁶個で500μLの幹細胞懸濁物を充填した。陽性対照は、担体25mg当たり5μgのBMP-2を含んでいた。陰性対照は、500μLの細胞培地を含むHEALOSを含んでいた。外植体を移植の3又は7週間後に回収し、マイクロラジオグラフ、鉱化組織密度(画像化ソフトウェア-ImageJ 1.37v)、Lunar PIXI X線濃度計及び組織検査によって分析した。ヘマトキシリン&エオシン、Tブルー及びビメンチン染料を使用して、切除した骨組織に対して組織検査を行った。

(結果)
AP活性の誘発、及びアリザリンレッド陽性堆積物を形成する細胞の能力によって、胎盤幹細胞の生体外骨形成挙動を実証した。インビボ結果:胎盤幹細胞+VITOSS(登録商標)皮下外植体は、ヒトオステオカルシンに対する陽性免疫組織化学染色を示し、胎盤幹細胞の生体内骨形成能力を実証した。頭蓋欠損試験において、3週間の胎盤幹細胞+HEALOS(商標)外植体は、組織検査、並びにX線及びPIXIによる高密度鉱化で相当の骨形成を示した。これらの骨形成活性は、移植の7週間後に増大した。欠損部の鉱化の組織検査スライド、マイクロラジオグラフ半定量測定を図24〜26に示す。これらの結果は、胎盤幹細胞が骨格とともに骨修復過程を増大させることができることを証明している。

結論:接着性胎盤幹細胞は、インビトロで適切な刺激が与えられると骨形成経路に沿って機能的に分化し、無細胞条件と比較して生体内の骨修復が有意に向上することを証明している。したがって、これらの試験から、胎盤幹細胞を適切な骨格とともに骨組織工学用途における細胞治療薬として使用できると結論づける。

(同等物)
本明細書に示す組成物及び方法は、本明細書に記載の具体的な実施態様によって範囲が限定されない。実際、先述の説明及び付随する図面から、記載の実施態様に加えて、実施態様の様々な変更が当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付の請求項の範囲内に含まれることを意図する。

その開示内容の全体が引用により本明細書中に組み込まれている様々な文献、特許及び特許出願が本明細書に引用されている。

Claims

マトリックスを鉱化する能力を有する骨形成細胞を作成する方法であって、請求項1記載の複数の幹細胞又は請求項12記載の単離された幹細胞の集団を、前記幹細胞が骨形成細胞に分化する条件下で培養することを含み、前記培養は、前記骨形成細胞がカルシウム又はリン酸塩に富む検出可能な量の鉱化マトリックスを生成するのに十分な時間にわたって行われる、前記方法。
前記細胞をデキサメタゾン又はアスコルビン酸と接触させることを含む、請求項1記載の方法。
マトリックスを処方するための方法であって、非接着性CD34⁺及びCD44^-胎盤幹細胞の集団を、リン酸β-三カルシウム基質、リン酸β-三カルシウム-コラーゲン基質、コラーゲン基質、リン酸カルシウム基質、鉱化ヒト胎盤コラーゲン基質、ヒアルロン酸基質又はセラミック基質である移植可能な骨格基質と組み合わせることを含む、前記方法。
注射可能組成物を処方するための方法であって、非接着性CD34⁺、CD44^-胎盤幹細胞の集団を注射可能ヒアルロン酸又はコラーゲンと組み合わせることを含む、前記方法。
対象における骨欠損を治療するための方法であって、該治療を必要とする対象に対して、非接着性幹細胞の集団を含む移植可能又は注射可能組成物を投与することによって、該対象における骨欠損を治療することを含む、前記方法。
前記骨欠損が、癌関連溶骨性病変、骨折、又は固定を必要とする脊椎である、請求項5記載の方法。
前記溶骨性病変が、多発性骨髄腫、骨癌又は転移癌に関連する、請求項6記載の方法。
前記骨折が偽関節骨折である、請求項6記載の方法。
前記移植可能組成物を外科移植する、請求項5記載の方法。
非接着性幹細胞の集団を含む注射可能組成物を前記対象に投与する、請求項5記載の方法。
前記注射可能組成物を前記骨欠損の領域に外科投与する、請求項5記載の方法。
前記注射可能組成物を全身投与する、請求項5記載の方法。
マトリックスを処方するための方法であって、幹細胞の集団を移植可能な骨格基質と組み合わせることを含み、前記幹細胞が、CD200⁺又はHLA-G⁺、或いはCD34⁺及びCD44^-である、前記方法。
注射可能組成物を処方するための方法であって、幹細胞の集団を注射可能ヒアルロン酸又はコラーゲンと組み合わせることを含み、前記幹細胞が、CD200⁺又はHLA-G⁺、或いはCD34⁺及びCD44^-である、前記方法。
対象における骨欠損を治療するための方法であって、該治療を必要とする対象に対して、CD200⁺若しくはHLA-G⁺、又はCD34⁺及びCD44^-である幹細胞の集団を含む移植可能又は注射可能組成物を投与することによって、該対象における骨欠損を治療することを含む、前記方法。
前記骨欠損が、多発性骨髄腫、骨癌若しくは転移癌に関連する溶骨性病変、骨折、又は固定を必要とする脊椎である、請求項15記載の方法。
非接着性幹細胞の集団を含む移植可能組成物を前記対象に投与する、請求項15記載の方法。
前記移植可能組成物を外科移植する、請求項17記載の方法。
非接着性幹細胞の集団を含む注射可能組成物を前記対象に投与する、請求項15記載の方法。
前記注射可能組成物を全身投与する、請求項19記載の方法。