DE60125342T2 - Humane pankreatische epitheliale stammzellen, verfahren zur ihrer isolierung und verwendungen davon - Google Patents

Humane pankreatische epitheliale stammzellen, verfahren zur ihrer isolierung und verwendungen davon Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie und der Zellbiologie. Genauer gesagt, betrifft diese Erfindung eine Population von epithelialen Pankreas-Vorläuferzellen, die in der Lage sind zu funktionellen endokrinen und exokrinen Zellen zu differenzieren, Verfahren zum Isolieren der epithelialen Pankreas-Vorläuferzellen, Charakterisierung von epithelialen Pankreas-Vorläuferzellen und Verwendungen der epithelialen Pankreas-Vorläuferzellen.
  • STAND DER TECHNIK
  • Isolierung und Charakterisierung von Stammzellen und Vorläuferzellen sind wegen des großen Potenzials solcher Zellen die Gegenstände intensiver Forschung. Die totipotenten Stammzellen, welche die Fähigkeit aufweisen, jede Art von Zelle in einem menschlichen Körper zu werden, rufen Vorläuferzellen hervor, die stärker differenziert sind als die totipotenten Zellen. Eine dieser Arten von Vorläuferzellen ist die vorbestimmte epitheliale Pankreas-Vorläuferzelle. Die epithelialen Pankreas-Vorläuferzellen haben die Fähigkeit, verschiedene Arten von epithelialen Pankreaszellen zu werden. Die unterschiedlichen Arten von epithelialen Pankreaszellen schließen Azinuszellen, Inselzellen und Ductuszellen ein. Azinuszellen werden im Allgemeinen nahe dem Pankreaskopf gefunden und enthalten Zymogen-Granula, welche mit einem Elektronenmikroskop leicht sichtbar sind. Azinuszellen führen exokrine Funktionen durch Absondern von alkalischen Verdauungssäften in den Dünndarm durch. Ungefähr 1500 ml an Verdauungssäften werden pro Tag sezerniert und schließen Enzyme ein, welche zum Aufbrechen von Lipiden und Proteinen benötigt werden. Ganong, William F. Review of Medical Physiology, Kapitel 26 "Regulation of Gastrointestinal Function", 15. Aufl., Appleton and Lange (1991). Es gibt vier Arten von Inselzellen, auch bekannt als Langerhans'sche Inseln, α-Inseln, β-Inseln, δ-Inseln und PP-Inseln. α-Inselzellen sezernieren Glucagon, das die Gluconeogenese, d.h. den Abbau von Energiereserven fördert, um mehr zirkulierende Glucose zu erzeugen. β-Inselzellen sezernieren Insulin, welches die Speicherung von zirkulierender Glucose in erschließbaren Energiequellen fördert. Bei Typ I Diabetes mellitus, sonst als juveniler Diabetes bekannt, wird vermutet, dass Autoimmun-Angriffe auf β-Inselzellen eine defekte β-Inselzellfunktion verursachen, wodurch ein Fehlen von Insulin verursacht wird, um die Spiegel von zirkulierender Glucose zu vermindern. β-Inselzellen sezernieren Somatostatin, welches die Sekretion von Glucagon und Insulin regelt. Die vierte Art von Inselzellen PP(Pankreas-Polypeptid)-Inselzellen hat bislang keine bekannte Funktion innerhalb des Pankreas'. Eine weitere Art von Sub-Pankreaszellen ist die Ductuszelle. Diese Zellen kleiden die Kanäle aus, welche die unterschiedlichen Teile des Pankreas' verbinden.
  • Eine Isolierung von epithelialen Pankreas-Vorläuferzellen ist, wie bei anderen Arten von Vorläuferzellen wegen der kurzlebigen Natur von Vorläuferzellen schwierig. Eine Manipulation von Vorläuferzellen, die zur Isolierung erforderlich ist, kann den zerbrechlichen Vorläufer-Status dieser Zellen stören und sie differenzieren lassen. Ein Kontakt mit Wachstumsfaktoren oder Substraten kann ebenfalls eine Pankreas-Vorläuferzelle dazu veranlassen, mit dem Differenzieren zu exokrinen oder endokrinen Zellen zu beginnen. Forschung auf dem Gebiet der Pankreaszellen ergab die Etablierung von mehreren, aus Ratten abgeleiteten, epithelialen Pankreaszelllinien. Stephan, J. et. al. Endocrinology 140: 5841–5854, (1999). Andere Forschung schließt die Isolierung von menschlichen, adulten Pankreaszellen und die Induktion dieser Pankreaszellen sich mit Hepatocyten-Wachstumsfaktor/Streuungsfaktor (HGF/SF) zu β-Insel-ähnlichen Strukturen zu vermehren ein. Jeffrey et. al. US Patent 5,888,705. Eine andere Forschungsarbeit beinhaltet das Induzieren von Wachstum der Inselzellen aus adulten Pankreaszellen durch zuerst in Serum-enthaltenden Medium mit wenig Glucose kultivieren und dann wechseln zu Medium mit höherem Serum- und Glucose-Gehalt. WO 9715310. Noch weitere Forschung auf dem Gebiet der Pankreas-Vorläuferzellen beinhaltet das Isolieren von Vorläuferzellen aus prä-diabetischen Erwachsenen und Kultivieren in einem Serum- enthaltenden, vordefinierten Medium, das das Wachstum von funktionalen Inselzellen fördert. US Patent 5,834,308. Alle diese "Vorläufer"-Zellen bringen jedoch nur Inselzellen hervor. Pankreaszellen der zuvor erwähnten Forschung weisen nicht die Fähigkeit auf, sowohl zu endokrinen als auch exokrinen Zellenarten zu differenzieren. Es erscheint wahrscheinlich, dass die Pankreaszellen der zuvor erwähnten Forschung weiter auf dem Differenzierungsweg der Pankreas-Vorläuferzellen festgelegt sind und daher andere Arten von Pankreaszellen als die menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen dieser Erfindung sind. Außerdem können die Kultivierungsbedingungen, die in der zuvor erwähnten Forschung verwendet werden, wobei Serum verwendet wird, um Medien zu ergänzen, nachteilige Konsequenzen haben. Serum, der flüssige Anteil des Blutes nachdem man das Blut gerinnen gelassen hat, enthält viele Biomoleküle wie Albumin und α,β-Globuline. In vivo werden Zellen normalerweise nicht einem Serumäquivalent ausgesetzt, wenn nicht eine Gewebeverletzung beteiligt war. Daher könnte eine Kultivierung von Pankreaszellen in Serum die physiologischen Parameter, innerhalb derer Pankreaszellen in vivo existieren, nicht genau wiedergeben.
  • Die ideale Population von Pankreas-Vorläuferzellen sollte in der Lage sein, zu exokrinen (d.h. azinaren) Zellen, endokrinen (d.h. α-Inselzellen, β-Inselzellen, δ-Inselzellen, PP-Inselzellen) sowie zu Ductuszellen zu differenzieren. Eine solche Population von Pankreas-Vorläuferzellen kann in klinischen Situationen, zum Beispiel zur Behandlung von bestimmten Arten des Diabetes oder zum Behandeln von funktionell defekten Pankreaszellen durch Transplantation von Pankreas-Vorläuferzellen, welche zu funktionellen Pankreaszellen differenzieren können, verwendbar sein. Entsprechend gibt es einen Bedarf für eine Population von Pankreas-Vorläuferzellen und Verfahren zur Isolierung und Kultivierung der Pankreas-Vorläuferzellen, so dass das Differenzierungspotenzial der Pankreas-Vorläuferzellen erhalten bleibt, während eine Vermehrung möglich ist und eine Alterung dieser Zellen vermieden wird. Die Pankreas-Vorläuferzellen und Verfahren zur Isolierung und Kultivierung dieser Pankreas-Vorläuferzellen, welche hierin offenbart werden, erfüllen diese Anforderungen und stellen verwandte Vorteile bereit.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Entwicklungs- und Zellbiologie. In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine isolierte Population von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen, welche eine pluripotente Fähigkeit aufweisen und zu Azinus-, Ductus- und Inselzellen differenzieren können, wobei die Pankreas-Vorläuferzellen durch die Expression von mindestens einem aus Cytokeratin-19, Carcinoembryonales Antigen, Carboanhydrase II und Mukoviszidose Transmembranleitfähigkeits-Regulator ausgewählten Zellmarker identifizierbar sind und wobei die Pankreas-Vorläuferzellen keine embryonalen Zellen sind.
  • In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Isolierung einer Population von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen, welche die pluripotente Fähigkeit aufweisen, zu Azinus-, Duktus- und Inselzellen differenzieren zu können, wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) Setzen einer gemischten Population von Pankreaszellen, die Pankreas-Vorläuferzellen umfasst, unter Kultivierungsbedingungen, die ausreichend sind, um das Leben der Pankreas-Vorläuferzellen zu erhalten, in Nährmedium, wobei die gemischte Population von Pankreaszellen aus einer Quelle von menschlichen, fötalen Pankreas-Vorläuferzellen mikrodissektiert wurde und wobei das Nährmedium Serum-frei ist und Insulin, Transferrin, Epidermalen Wachstumsfaktor, Ethanolamin, Phosphoethanolamin, Selen, Trijodthyronin, Progesteron, Hydrocortison, Forskolin, Heregulin, Aprotinin und Rinderhypophysenextrakt umfasst;
    • (b) Aufrechterhalten von geeigneten Kulturbedingungen, die ausreichend sind, um es Pankreas-Vorläuferzellen zu ermöglichen, eine Aggregat- oder Monolayer-Struktur zu bilden; und
    • (c) Subkultivieren der Aggregat- oder Monolayer-Struktur, um die Population von Pankreas-Vorläuferzellen zu selektieren.
  • Daher stellt die Erfindung eine isolierte Population von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen bereit, die in der Lage sind, in Azinus-, Ductus- und Inselzellen zu differenzieren, welche durch ein Verfahren dieser Erfindung erhältlich sind.
  • In einem noch weiteren Aspekt dieser Erfindung betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen einer Quelle eines Immunogens an einen heterologen Empfänger, umfassend das Einführen einer Mehrzahl von Pankreas-Vorläuferzellen der Erfindung in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort in dem Empfänger auszulösen.
  • In einem noch weiteren Aspekt dieser Erfindung betrifft die Erfindung Verfahren zur Erzeugung eines menschlichen Pankreasgewebsmodells in einem Immundefizienten oder immungeschwächten, nicht menschlichen Säugetier-Empfänger, umfassend den Schritt des Verabreichens einer Mehrzahl von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen aus der Population der Erfindung, wiedervereinigt mit mesenchymalem Gewebe, in den Empfänger an einer Stelle innerhalb des Empfängers, wobei die Stelle in der Lage ist, Wachstum und Differenzierung der Pankreas-Vorläuferzellen zu unterstützen.
  • In einem noch weiteren Aspekt dieser Erfindung betrifft die Erfindung eine Population von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen gemäß der Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie oder Diagnose.
  • In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung betrifft die Erfindung die Verwendung einer Population von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen der Erfindung in der Herstellung zur Zelltherapie.
  • In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung betrifft die Erfindung die Verwendung einer Population von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen der Erfindung oder irgendeines zellulären Teils davon als Targets für eine Arzneimittelentwicklung.
  • In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung einer Quelle für Nukleinsäuren oder Proteine in der Entwicklung von Bioassays, welche das Isolieren von Nukleinsäuren oder Proteinen aus der menschlichen Pankreas-Vorläuferzellpopulation der Erfindung umfassen und Verwenden der Nukleinsäuren oder Proteine als einen oder mehr der Grundbestandteile in den Bioassays.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt menschliche, epitheliale Ductus-Pankreaszellen, welche in zwei unterschiedlichen Arten von Medien gezüchtet wurden. 1A (links) zeigt epitheliale Pankreaszellen, die in CMRL 1066 Medium mit Fibronectin-Beschichtung auf der Platte gezüchtet wurden. Die großen, abgerundeten Zellen sind epitheliale Pankreaszellen. Figur IB (rechts) zeigt epitheliale Pankreaszellen, die in F12/DMEM Medium gezüchtet wurden. Die epitheliale Pankreaszellen haben sich abgeflacht, um einen einschichtigen Zellrasen (Monolayer) zu bilden.
  • 2 zeigt menschliche, epitheliale Pankreaszellen, die auf Collagenbeschichteten Platten gezüchtet wurden, nach drei Passagen. Die Pfeile kennzeichnen sich teilende Zellen.
  • 3 zeigt Färbeergebnisse von rekombinanten Gewebetransplantaten. 3A zeigt Inselbildung im rekombinanten Gewebetransplantat bei einer Vergrößerung von 20 ×. 3B zeigt Inselbildung in der Geweberekombination bei einer Vergrößerung von 60 ×. 3C zeigt die Bildung von Insel-, Duktus- und Azinusgewebe innerhalb des rekombinanten Gewebetransplantats. 3D zeigt Duktusbildung in dem rekombinanten Gewebetransplantat. 3E zeigt die Bildung von Clustern (oder Aggregaten) oder Azinuszellen im rekombinanten Gewebetransplantat.
  • 4 zeigt die Färbeergebnisse für Glucagon (blau) und Insulin (braun) in dem rekombinanten Gewebetransplantat.
  • 5 zeigt die Färbeergebnisse für Insulin (Braun) in dem rekombinanten Gewebetransplantat.
  • 6 zeigt Duktusbildung in der Geweberekombination
  • 7 zeigt die Färbeergebnisse für Glucagon (blau) und Insulin (braun) in einem in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitt aus einem Gewebetransplantat.
  • 8 ist eine schematische Darstellung der Entwicklung von Pankreaszellen aus einer totipotenten Stammzelle. Die gepunktete Linie deutet das Differenzierungsstadium an, in welcher sich die menschliche Pankreas-Vorläuferzelle dieser Erfindung befindet.
  • ARTEN DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung wird bereitgestellt, um dem Fachmann bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung zu helfen. Diese detaillierte Beschreibung sollte nicht so ausgelegt werden, dass sie die vorliegende Erfindung beschränkt, da Modifikationen der hierin offenbarten Ausführungsformen durch den Durchschnittsfachmann gemacht werden können, ohne vom Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Durch diese Offenbarung hindurch wird durch Zitierung auf verschiedene Publikationen, Patente und publizierte Patentbeschreibungen Bezug genommen. Die Offenbarung dieser Publikationen, Patente und publizierten Patente wird hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit in die vorliegende Offenbarung aufgenommen.
  • Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, wenn nicht anders angedeutet, herkömmliche Techniken der Immunologie, Molekularbiologie, Mikrobiologie, Zellbiologie und rekombinanter DNA, welche innerhalb des fachmännischen Könnens des Stands der Technik liegen, anwenden. Siehe z.B. Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. Hrsg, (1987)); die Serien METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames und G. R. Taylor Hrsg. (1995)), Harlow und Lane, Hrsg. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL und ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, Hrsg. (1987)).
  • Definitionen
  • Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, schließt die singuläre Form "ein", " eine" und "der, die, das" plurale Bezüge ein, wenn nicht der Zusammenhang klar etwas anderes bestimmt. Zum Beispiel schließt der Begriff "eine Zelle" eine Mehrzahl von Zellen ein, einschließlich Mischungen davon.
  • Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, sind die Begriffe "epitheliale Pankreas-Vorläuferzellen" und "Pankreas-Vorläuferzellen" untereinander austauschbar und beziehen sich auf "epitheliale Pankreas-Vorläuferzellen" und "Pankreas-Vorläuferzellen" menschlichen Ursprungs.
  • "Epitheliale Pankreas-Vorläuferzellen" und "Pankreas-Vorläuferzellen" betreffen sich teilende Vorläuferzellen, die im Pankreas gefunden werden, welche noch nicht auf ein im Wesentlichen sich nicht teilendes Stadium der Enddifferenzierung festgelegt sind. "Epitheliale Pankreas-Vorläuferzellen" und "Pankreas-Vorläuferzellen" werden letzten Endes von totipotenten Zellen abgeleitet, die pluripotente Gewebe-spezifische Zellen hervorbringen. Diese pluripotenten, Gewebe-spezifischen, sich teilenden Vorläuferzellen können Zellen des Endoderms, Ectoderms oder Mesoderms hervorbringen. Von den endodermalen, multipotenten Zellen differenzieren einige zu Darm-spezifischen, sich teilenden Vorläuferzellen. Von den Darm-spezifischen Vorläuferzellen sind einige vorbestimmt, Pankreas-Vorläuferzellen zu werden. In diesem Entwicklungsstadium befindet sich die Population der hierin beanspruchten Zellen. Genauer gesagt, befindet sich die Population der hierin offenbarten "epithelialen Pankreas-Vorläuferzellen" und "Pankreas-Vorläuferzellen" zwischen dem Stadium, in welchem eine Darm-spezifische Vorläuferzelle dazu vorbestimmt wird, ein Pankreas (oder ein Teil des Pankreas) zu werden und dem Stadium, in welchem eine Pankreas-spezifische Vorläuferzelle dazu bestimmt ist, eine Unterart von Pankreaszellen zu werden. Pankreas-spezifische Vorläuferzellen können zu verschiedenen Arten von Zellen differenzieren: Azinus-, Ductus- und α-Inselzellen, β-Inselzellen, δ-Inselzellen und PP-Inselzellen. Eine exokrine Funktion der Azinuszellen ist die Sekretion von Verdauungssäften in den Darm. Eine endokrine Funktion der Inselzellen ist die Sekretion von Glucagon (α-Inselzellen) und Insulin (β-Inselzellen). Die Pankreas-Vorläuferzellen dieser Erfindung sind noch nicht in eine der zuvor erwähnten Arten von subpankreatischen Zellen differenziert, sondern weisen die Fähigkeit auf, jede dieser Zellen zu werden.
  • "Subpankreatisch" betrifft die zelluläre Infrastruktur innerhalb des Pankreas' als ein Gesamtorgan. Beispiele für subpankreatische Zellen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Azinus-, Ductus- und Inselzellen.
  • "Totipotente Zellen" und "totipotente Stammzellen" werden überall untereinander austauschbar verwendet und betreffen eine Stammzelle, welche die Fähigkeit aufweist, irgendeine Art von Zelle in einem Säugetierkörper zu werden.
  • "Pluripotent" und "multipotent" werden überall untereinander austauschbar verwendet und betreffen ein Stadium, in welchem die Zelle immer noch eine aus einer Mehrzahl von Zellen werden kann, aber nicht mehr jede Art von Zelle im Körper werden kann. "Pluripotente" Zellen werden nicht als "Stammzellen", sondern besser als "Vorläuferzellen" bezeichnet, weil sie Vorläufer für eine oder mehrere Arten von einer Mehrzahl von Zellen sind.
  • Wie hierin verwendet, betrifft "vorbestimmte Pankreas-" ein Stadium der Entwicklung einer multipotenten Zelle, die jenseits des Stadiums ist, eine Darm-spezifische zu sein und vor dem Stadium einer enddifferenzierten Pankreaszelle (wie eine Azinus-, Insel- oder Ductuszelle) ist. Zellen, welche "vorbestimmte Pankreas-" Zellen sind, sind darauf festgelegt, Pankreaszellen zu werden, haben aber noch nicht begonnen, sich zu enddifferenzierten Pankreaszellen zu entwickeln. Verschiedene Faktoren bewirken, dass vorbestimmte Pankreaszellen zu differenzieren beginnen. Nicht einschränkende Beispiele schließen ein Aussetzen gegenüber Serum, ein Aussetzen gegenüber Insulinwachstumsfaktor (IGF) oder epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Kontakt mit umgebenden Gewebe, die Mikroumgebung der Zellen und Zell-Zellkontakt mit umgebenden Gewebe ein. Die Kette der Entwicklung beginnt mit einer totipotenten Stammzelle, welche jede Zelle im Körper werden kann. Die totipotente Stammzelle ist wegen ihrer zellulären Omnipotenz eine echte Stammzelle. In jedem Stadium jenseits der totipotenten Stammzellen, werden Zellen "vorbestimmte Vorläufer", weil sie auf einen Weg festgelegt sind, der es der Zelle nicht länger ermöglicht, jede Art von Zelle im Körper zu werden.
  • Ein "Antikörper" ist ein Immunglobulin-Molekül, welches in der Lage ist, ein Antigen zu binden. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff nicht nur intakte Immunglobulin-Moleküle, sondern auch anti-idiotypische Antikörper, Mutanten, Fragmente, Fusionsproteine, humanisierte Proteine und Modifikationen des Immunglobulin-Moleküls, welche eine Antigenerkennungsstelle mit der erforderlichen Spezifität umfassen.
  • Der Begriff "Antigen" ist ein Molekül, welches eines oder mehrere Epitope, an denen ein Antikörper binden kann, einschließen kann. Ein Antigen ist eine Substanz, welche immunogene Eigenschaften aufweisen, d.h. eine Immunantwort auslösen kann. Antigene werden als eine Art von Immunogen betrachtet. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Antigen" ein Protein von voller Länge sowie Peptidfragmente davon bedeuten, welche ein oder eine Mehrzahl von Epitopen umfassen.
  • Die Begriffe "Oberflächen-Antigen" und "Zellenoberflächen-Antigen" werden hierin untereinander austauschbar verwendet und betreffen die Plasmamembran-Bestandteile einer Zelle. Diese Bestandteile schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, integrale und periphere Membranproteine, Glycoproteine, Polysaccharide, Lipide und Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verknüpfte Proteine. Ein "integrales Membranprotein" ist ein transmembranenes Protein, welches sich durch die Lipiddoppelschicht der Plasmamembran einer Zelle hindurch erstreckt. Ein typisches integrales Membranprotein besteht aus mindestens einem membrandurchdringenden Segment, das im Allgemeinen hydrophobe Aminosäurereste umfasst. Periphere Membranproteine erstrecken sich nicht in das hydrophobe Innere der Lipiddoppelschicht und sie sind durch nicht-kovalente Wechselwirkung mit anderen Membranproteinen an die Membranoberfläche gebunden. GPI-verknüpfte Proteine sind Proteine, welche durch einen, in die Lipiddoppelschicht geschobenen, Lipid-Schwanz auf der Zelloberfläche gehalten werden.
  • Der Begriff "monoklonaler Antikörper", wie hierin verwendet, betrifft eine Antikörper-Zusammensetzung mit im Wesentlichen homogener Antikörperpopulation. Eine Beschränkung hinsichtlich der Quelle des Antikörpers aus oder der Art und Weise, in der er hergestellt wird (z.B. durch Hybridom oder rekombinante Synthese), ist nicht beabsichtigt. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch, wobei sie gegen eine einzelne antigene Stelle gerichtet sind. Im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparationen, welche typischerweise verschiedene, gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper einschließen, ist jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet.
  • "Eine Population von monoklonalen Antikörpern" betrifft eine Mehrzahl von heterogenen, monoklonalen Antikörpern, d.h. die individuellen monoklonalen Antikörper, welche die Population umfassen, können antigene Determinanten erkennen, die sich voneinander unterscheiden.
  • "Immunogen" betrifft jede Substanz, die eine Immunantwort auslöst. Eine Substanz, die ein Immunogen ist, wird als "immunogene" beschrieben. Ein Auslösen einer Immunantwort schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, eine Aktivierung der humoralen Antworten (z.B. Herstellen von Antikörpern) oder zellulären Antworten (z.B. Auslösen cytotoxischer T-Zellen), Entzündungsantworten (z.B. Rekrutierung von Leukozyten) und Sekretion von Cytokinen und Lymphokinen.
  • Der Begriff "heterolog" auf eine Zelle angewandt, die zur Immunisierung oder zu Transplantationszwecken verwendet wird, bedeutet, dass die Zelle von einer genotypisch vom Empfänger getrennten Entität abgeleitet ist. Zum Beispiel kann eine heterologe Zelle von einer unterschiedlichen Spezies oder einem unterschiedlichen Individuum der gleichen Spezies wie der Empfänger abgeleitet sein. Eine embryonale Zelle, die von einem Individuum einer Spezies abgeleitet ist, ist heterolog zu einem Erwachsenen der gleichen Spezies.
  • Eine Zelle ist von "ektodermalen", "endodermalen" oder "mesodomalen" Ursprung, wenn die Zelle jeweils von einem der drei Keimblätter, Ektoderm, dem Endoderm oder dem Mesoderm eines Embryos abgeleitet ist. Das Ektoderm ist die äußere Schicht, welche die Zellen der Epidermis und des Nervensystems herstellt. Das Endoderm ist die innere Schicht, welche die Auskleidung des Verdauungstrakts und damit verbundener Organe produziert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Pankreas und Leber. Die mittlere Schicht Mesoderm ruft verschiedene Organe (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Herz, Nieren und Geschlechtsorgane), Bindegewebe (z.B. Knochen, Muskeln, Sehnen) und die Blutzellen hervor.
  • Die Begriffe "Medium", "Zellkulturmedium" und "Kulturmedium" werden untereinander austauschbar verwendet. Die Begriffe betreffen die wässrige Mikroumwelt, in welcher die Säugetierzellen in Kultur gezüchtet werden. Das Medium umfasst die physikochemische, Nährstoff und die hormonelle Mikroumwelt.
  • Ein Zellkulturmedium ist "im Wesentlichen Serum-frei", wenn der Prozentsatz nach Volumen von Serum im Medium antigene Stellen oder Antikörperbindungsstellen auf den Zelloberflächen nicht maskiert. Der Begriff "im Wesentlichen Serum-frei" trifft im Allgemeinen zu, wenn das Zellkulturmedium weniger als ungefähr 50% Serum (nach Volumen), vorzugsweise weniger als ungefähr 25% Serum, noch weiter bevorzugt weniger als ungefähr 5% Serum und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 0,1% Serum umfasst.
  • Eine Zelloberfläche ist "im Wesentlichen frei von Serum-Biomolekülen", wenn mindestens ungefähr von 70% der Pankreas-Vorläuferzelloberflächen, bevorzugt mindestens ungefähr 90% der Pankreas-Vorläuferzelloberflächen, noch weiter bevorzugt mindestens ungefähr 95% der Pankreas-Vorläuferzelloberflächen und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% der Pankreas-Vorläuferzelloberflächen keine von Serum abgeleiteten Serum-Biomolekülen aufweist, welche an die Zelloberflächen binden, so dass antigene Stellen oder Antikörperbindungsstellen gebunden sind oder für eine Antigenerkennung durch einen Antikörper oder einen Teil eines Antikörpers nicht zur Verfügung stehen. Die Zelloberfläche kann durch Messen der Zellgröße, entweder durch Mikroskopie oder Durchflusscytometrie bestimmt werden. Zum Beispiel werden synthetische Kügelchen von verschiedenen, bekannten Größen im Allgemeinen zur Kalibrierung in der Durchflusscytometrie verwendet. Eine kleine Menge von kalibrierten Kügelchen kann mit Pankreas-Vorläuferzellen gemischt werden und die sich ergebende Population wird durch Durchflusscytometrie analysiert. Pankreas-Vorläuferzellen können dann mit der Größe der kalibrierten Kügelchen verglichen werden. Eine Berechnung der Menge an Zelloberfläche kann erreicht werden, weil die Größen der Kügelchen bekannt sind.
  • Wie hierin verwendet, ist eine "im Wesentlichen reine" Population von Pankreas-Vorläuferzellen eine Population von Zellen, die aus mindestens ungefähr 85% Pankreas-Vorläuferzellen, vorzugsweise mindestens ungefähr 90% und noch weiter bevorzugt mindestens ungefähr 95% oder mehr besteht.
  • Ein "definiertes Medium" und "Basismedium, das die Zellen erhält" werden hierin untereinander austauschbar verwendet und betreffen ein Medium, welches Nährstoff- und hormonelle Erfordernisse umfasst, die zum Überleben und/oder für das Wachstum der Zellen in Kultur notwendig sind, so dass die Bestandteile des Mediums bekannt sind. Traditionell ist das definierte Medium durch Zugabe von Nährstoff und Wachstumsfaktoren, welche zum Wachstum und/oder Überleben notwendig sind, formuliert worden. Typischerweise stellt das definierte Medium mindestens einen Bestandteil aus einer oder mehreren der folgenden Kategorien bereit:
    a) alle essentiellen Aminosäuren, und normalerweise die Grundausstattung von 20 Aminosäuren plus Cystein; b) eine Energiequelle, normalerweise in der Form eines Kohlenhydrats wie Glucose; c) Vitamine und/oder andere organische Verbindungen, die in geringen Konzentrationen notwendig sind; d) freie Fettsäuren und e) Spurenelemente, wobei Spurenelemente als anorganische Verbindungen oder natürlich vorkommende Elemente definiert sind, die typischerweise in sehr geringen Konzentrationen notwendig sind, normalerweise im mikromolaren Bereich. Das definierte Medium kann außerdem wahlweise mit einem oder mehreren Bestandteilen aus irgendeiner der folgenden Kategorien ergänzt werden: a) eines oder mehrere mitogene Mittel; b) Salze und Puffer, wie zum Beispiel Calcium, Magnesium und Phosphat; c) Nucleoside und Basen, wie zum Beispiel Adenosin und Thymidin, Hypoxanthin; und d) Protein und Gewebehydrolysate.
  • Wie hierin verwendet, betrifft "konditioniertes Medien" Kulturmedien, frei von intakten Zellen, in welchen epitheliale Pankreas-Vorläuferzellen gezüchtet worden sind. Pankreaszellen, die in Nährstoffmedien gezüchtet wurden, können Faktoren freisetzen, welche das fortgesetzte Überleben, Wachstum und Erhaltung eines vorher existierenden Stadiums der Prä-Differenzierung der Pankreas-Vorläuferzellen fördern. Konditionierte Medien können verwendet werden, um ein Zellpellet zu rekonstituieren oder um zu Zellen, die bereits auf Kulturschalen existieren, zugegeben zu werden. Konditionierte Medien können außerdem allein verwendet werden oder um die Nährstoffmedien, welche verwendet werden, um Pankreaszellen zu füttern, zu ergänzen. Da konditionierte Medien, die von Nährstoffmedien abgeleitet und Nährstoffmedien wie hierin beschrieben, im Wesentlichen Serum-frei sind, sind konditionierte Medien ebenfalls im Wesentlichen Serum-frei.
  • "Standard-Inkubationsbedingungen" betrifft die physikochemischen Bedingungen in einem Inkubator, der für Gewebekultur ausgelegt ist, in welchen Zellen gestellt werden. Im Allgemeinen sind die Standard-Inkubationsbedingungen ungefähr 37 Grad Celsius und ungefähr 5% CO2-Gehalt mit Befeuchtung. Alle Gewebekultur-Techniken und Ausrüstung sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Die Gewebekultur-Behälter betreffen jede Art von Behälter, der zur Kultivierung von Zellen verwendet werden kann. Nicht einschränkende Beispiele schließen Flaschen und Platten ein.
  • Ein "mitogenes Mittel" oder "Wachstumsfaktor" ist ein Molekül, welches die Mitose von Säugetierzellen anregt. Im Allgemeinen verstärkt das mitogene Mittel oder der Wachstumsfaktor das Überleben und die Vermehrung von Säugetierzellen in Zellkultur und ist ein Polypeptid. Das mitogene Polypeptid kann ein "natives" Polypeptid oder mit "nativer Sequenz" (d.h. es weist die Aminosäurensequenz von einem natürlich vorkommenden Wachstumsfaktor auf) sein, ungeachtet dessen mit welchem Verfahren es hergestellt wurde (z.B. kann es von einer endogenen Quelle des Molekül isoliert worden sein oder durch synthetische Techniken einschließlich rekombinanten Techniken hergestellt worden sein) oder eine Variante oder Mutante (siehe Definition unten) davon. Nicht einschränkende Beispiele schließen Aktivatoren von einem oder mehreren Mitgliedern der erbB Rezeptorfamilie ein, Mittel, welche die cAMP-Spiegel in dem Kulturmedium erhöhen (z.B. Forskolin, Choleratoxin, cAMP oder Analoga davon); Adhäsionsmoleküle wie das neurale Zelladhäsionsmolekül (N-CAM), Laminin oder Fibronectin; Progesteron; neurotrophe Faktoren wie vom Knochen abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF) und ciliärer neurotropher Faktor (CNTF); Neurotrophin-3, -4, -5, oder -6; Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF); Fibroblasten-Wachstumsfaktor, wie saurer FGF (aFGF) und basischer FGF (bFGF); vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF); ein transformierender Wachstumsfaktor (TGF) wie TGF-α und TGF-β; Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren einschließlich IGF-I und IGF-II; Hormone, wie Estrogen, Testosteron, Schilddrüsenhormon, Insulin und jedes der Mitogene, die in Tabelle 8.2 auf den Seiten 138–139 von Mather, J. P. und Roberts, P. E. (1998) "Introduction to Cell and Tissue Culture", Plenum Press, New York aufgelistet sind.
  • "Pankreas-Vorläuferzellaggregate", "Pankreas-Vorläuferzellkugeln", und "Pankreaszellcluster" werden überall untereinander austauschbar verwendet und betreffen eine Masse aus einer Mehrzahl von Pankreas-Vorläuferzellen, welche eine dreidimensionale Struktur, die ungefähr einer Kugel ähnelt, bilden können.
  • Eine "Transplantatrekombination", wie hierin verwendet, betrifft die kombinierte Einheit aus Pankreas-Vorläuferzellaggregaten, die mit mesenchymalen Gewebe eingesetzt wird. Mesenchymales Gewebe kann von Pankreas- oder Nichtpankreas-Ursprung sein. Mesenchymales Gewebe kann aus einer Spezies, die zum Empfänger des Transplantats heterolog ist, sein. Mesenchymales Gewebe kann auch von einer Spezies sein, die zur Quelle der Pankreas-Vorläuferzellen heterolog ist. Transplantatrekombinationen können auf Substrat inkubiert werden, vorzugsweise einem weichen, biologischen Substrat (z.B. Agar) für einen Zeitraum, der von 1 Stunde bis 72 Stunden reicht, weiter bevorzugt zwischen 6 Stunden bis 24 Stunden und noch weiter bevorzugt über Nacht mit einem Inkubationszeitraum von ungefähr 8 bis 16 Stunden. Olumi A. F., et. al Cancer Research 59, 5002–5011, (1999).
  • "Serum", wie hierin verwendet, betrifft die flüssige Phase von Säugetierblut, die zurückbleibt, nachdem man das Blut gerinnen ließ.
  • "Serum-Biomoleküle", wie hierin verwendet, betrifft biologische Zusammensetzungen, die im Serum gefunden werden. Beispiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Albumin, α1-Globulin, α2-Globulin, β-Globulin und γ-Globulin. Serum-Biomoleküle können biologische Zusammensetzungen, ganze oder partielle, die entweder natürlicherweise im Serum gefunden werden oder durch Verarbeiten und Behandlung von Serum abgeleitet werden, einschließen.
  • Die Begriffe "Säugetiere" oder "Säugetier-" betreffen warmblütige Vertebraten, welche Menschen, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Affen, Sporttiere und Haustiere einschließen, aber darauf nicht beschränkt sind.
  • Isolierung und Aufrechterhaltung von Pankreas-Vorläuferzellen
  • Pankreas-Vorläuferzellen dieser Erfindung werden aus menschlichem, fötalem Pankreasgewebe isoliert. Das Alter des Fötus liegt zwischen ungefähr Woche 6 und ungefähr Woche 40, aber nicht embryonal, vorzugsweise zwischen ungefähr Woche 8 und ungefähr Woche 26 und noch weiter vom bevorzugt zwischen ungefähr Woche 12 und ungefähr Woche 22. Das Pankreasgewebe kann durch grobe Anatomie, äußeres Aussehen und Lage innerhalb des Fötus identifiziert werden. Einige Eigenschaften der groben Anatomie und des Aussehens, die einen Pankreas unterscheiden, sind: eine verlängerte, lobuläre retroperitoneale Drüse, Fehlen einer Kapsel und ein Erstrecken von der Duodenumhöhlung des Darms zur Milz. Der Pankreas besteht aus einem abgeflachten Kopf oder Caput innerhalb der Duodenumhöhlung, einem verlängerten, dreiseitigen Körper, der sich quer über das Abdomen erstreckt und einem Schwanz mit Kontakt zur Milz. Sobald es identifiziert ist, wird fötales Pankreasgewebe mikrodissektiert. Der Zweck der Mikrodissektion besteht darin, Strukturen die epitheliale Zellen enthalten vom Bindegewebe und von nicht-Pankreasgewebe, Fett, Membranen usw. zu trennen oder die Zellen voneinander zu trennen. Nicht einschränkende Beispiele für Mikrodissektion schließen Vorrichtungen ein, die mechanische Scherkräften liefern (d.h. Homogenisator Mörser und Pistill, Mischer usw.), Vorrichtungen, die Schnitte oder Risse liefern (d.h. Skalpell, Spritzen, Pinzetten usw.), oder Ultraschallvorrichtungen. Als Alternative ist ein anderes Verfahren zur Mikrodissektion von fötalem Pankreasgewebe die Verwendung von Enzymbehandlung. Verschiedene Enzymbehandlungen, die zum Mikrodissektieren von Gewebe verwendet werden, sind im Stand der Technik gut bekannt. Ein Verfahren schließt die Verwendung von Collagenase-Dispase ein, um teilweise geschertes Pankreasgewebe in einem gepufferten Medium, welches die Lebensfähigkeit der aus dem Pankreasgewebe isolierten Zellen erhalten wird, zu verdauen. Eine Konzentration von mindestens ungefähr 0,5 mg/ml Collagenase-Dispase wird verwendet, weiter bevorzugt mindestens ungefähr 1 mg/ml und noch weiter bevorzugt mindestens ungefähr 5 mg/ml. Die Menge an Enzym wird vom Alter des Fötus und davon, wie groß das Pankreasgewebe ist, abhängen. In der bevorzugten Ausführungsform wird Pankreasgewebe von einem Fötus zwischen ungefähr 14 Wochen und ungefähr 22 Wochen mit ungefähr 5 mg/ml Collagenase-Dispase verdaut. Eine große Auswahl von Zellen erhaltenden Basismedien, welche verwendet werden können, um den pH der Flüssigkeit in einem Bereich zu halten, der das Überleben der Pankreas-Vorläuferzellen fördert, und um zusätzliches Flüssigkeitsvolumen bereitzustellen, in welchem der enzymatischen Verdau stattfinden kann. Nicht einschränkende Beispiele schließen F12/DMEM, Ham's F10 (Sigma), CMRL-1066, Minimales essentielles Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) und Iscove's Modifiziertes Eagle's Medium (IMEM) ein. Zusätzlich kann jedes der Grundnährstoffmedien, welche in Ham und Wallace Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes und Sato Anal Biochem., 102: 255 (1980), oder Mather, J. P. und Roberts, P. E. "Introduction to Cell and Tissue Culture", Plenum Press, New York (1998) beschrieben sind, ebenfalls verwendet werden. Beispiele für andere Enzyme, die verwendet werden können, um Gewebe zu verdauen, schließen neutrale Proteasen, Serinproteasen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Trypsin, Chymotrypsin, Elastase, Collagenase und Thermolysin ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Enzyme, die DNA verdauen, wie DNAase, verwendet um die DNA in kleinere Stücke zu schneiden, um eine Gewebeaggregation durch freie DNA zu vermeiden. Eine Behandlung von fötalem Pankreasgewebe mit Enzym ergibt Zellausbeuten von unterschiedlichen Mengen. Einige Zellen sind in Einzelzellsuspensionen, andere sind in Zellaggregaten. Zellen, die nicht mit fester Gewebesubstanz verbunden sind, können voneinander oder von fester Gewebesubstanz oder von Gewebetrümmern unter Verwendung eines Dichtegradienten getrennt werden. Verbindungen, die verwendet werden können, um einen Dichtegradienten zu erzeugen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Serum (d.h. Rinderserumalbumin oder BSA), Ovalbumin, nicht-ionische synthetische Polymere aus Sucrose (d.h. FicollTM), colloidales mit Polyvinylpyrrolidon-beschichtetes Siliziumdioxid (d.h. PercollTM), Polyvinylpyrrolidon oder PVP und Methylcellulose. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Dichtegradienten verwendet, welche in der Lage sind, die zum Verdauen der Pankreasgewebe verwendeten Enzyme zu neutralisieren. Ein Beispiel für einen solchen Dichtegradienten ist BSA. Die Menge an verwendetem BSA beträgt ungefähr 50% Volumen-zu-Volumen-Verhältnis, weiter bevorzugt ungefähr 25%, weiter bevorzugt ungefähr 10% und noch weiter bevorzugt ungefähr 5%. Die Menge an Gewebetrümmern, die entfernt werden muss, hängt von verschiedenen Faktoren, wie dem Ausmaß des Verdaus oder der mechanische Scherkräfte, welche auf das Pankreasgewebe angewandt wurden, ab. In einigen Fällen ist ein Dichtegradient ausreichend, um die Gewebetrümmer (z.B. mesenchymales Gewebe, Fettpartikel oder gebrochene Zellmembranen) zu entfernen. In anderen Fällen wird mehr als eine Anwendung eines Dichtegradienten benötigt werden. Das erwünschte Produkt ist eine Population von relativ reinen Pankreaszellaggregaten.
  • Die Pankreaszellen werden dann in einem Zellen-erhaltenden Basismedium resuspendiert. Eine Auswahl von Zellen-erhaltenden Basismedien steht zur Verwendung zur Verfügung. Beispiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Ham's F12 Medium, RPMI-1640 und CMRL-1066. Für optimalere Bedingungen, um Überleben und Wachstum von Pankreas-Vorläuferzellen zu fördern, kann eine Auswahl von Nährstoffen zur Ergänzung zu den Basismedien zugegeben werden. Beispiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Insulin, Transferrin, epidermaler Wachstumsfaktor, Ethanolamin, Phosphoethanolamin, Selen, Trijodthyronin, Progesteron, Hydrocortison, Forskolin, Heregulin, Aprotinin, Rinderhypophysenextakt und Gentamycin. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die folgenden Mengen an Nährstoffen verwendet, um Überleben und Wachstum von Pankreas-Vorläuferzellen zu fördern: mindestens ungefähr 1 μg/ml Insulin und nicht mehr als ungefähr 100 μg/ml Insulin, weiter bevorzugt ungefähr 10 μg/ml Insulin; mindestens ungefähr 1 μg/ml Transferrin und nicht mehr als ungefähr 100 μg/ml Transferrin, weiter bevorzugt ungefähr 10 μg/ml Transferrin; mindestens ungefähr 1 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor und nicht mehr als ungefähr 100 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor, weiter bevorzugt ungefähr 5 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor; mindestens ungefähr 1 × 10–8 M Ethanolamin und nicht mehr als ungefähr 1 × 10–2 M Ethanolamin, weiter bevorzugt ungefähr 1 × 10–6 M Ethanolamin; mindestens ungefähr 1 × 10–9 M Phosphoethanolamin und nicht mehr als ungefähr 1 × 10–1 M Phosphoethanolamin, weiter bevorzugt ungefähr 1 × 10–6 M Phosphoethanolamin; mindestens ungefähr 5 × 10–12 M Selen und nicht mehr als ungefähr 1 × 10–1 M Selen, weiter bevorzugt ungefähr 2,5 × 10–8 M Selen; mindestens ungefähr 1 × 10–15 M Trijodthyronin und nicht mehr als ungefähr 5 × 10–1 M Trijodthyronin, weiter bevorzugt ungefähr 1 × 10–12 M Trijodthyronin; mindestens ungefähr 1 × 10–12 M Progesteron und nicht mehr als ungefähr 1 × 10–1 M Progesteron, weiter bevorzugt ungefähr 1 × 10–9 M Progesteron; mindestens ungefähr 1 × 10–15 M Hydrocortison und nicht mehr als ungefähr 1 × 10–1 M Hydrocortison, weiter bevorzugt ungefähr 1 × 10–9 M Hydrocortison; mindestens ungefähr 0,001 μM Forskolin und nicht mehr als ungefähr 50 μM Forskolin, weiter bevorzugt ungefähr 1 μM Forskolin; mindestens ungefähr 0,1 nM Heregulin und nicht mehr als ungefähr 100 nM Heregulin, weiter bevorzugt ungefähr 10 nM Heregulin, mindestens ungefähr 1 μg/ml Aprotinin und nicht mehr als ungefähr 100 μg/ml Aprotinin, weiter bevorzugt ungefähr 25 μg/ml Aprotinin; mindestens ungefähr 1 μg/ml Rinderhypophysenextrakt und nicht mehr als ungefähr 500 μg/ml Rinderhypophysenextrakt, weiter bevorzugt ungefähr 75 μg/ml Rinderhypophysenextrakt; mindestens ungefähr 1 μg/ml Gentamycin und nicht mehr als ungefähr 1 mg/ml Gentamycin, weiter bevorzugt ungefähr 100 μg/ml Gentamycin. Die Pankreas-Vorläuferzellen können auf verschiedenen Substraten gezüchtet werden, abhängig von der gewünschten Art der physikalischen Orientierung der Zellen. Nicht einschränkende Beispiele für Substrate, die verwendet werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Fibronectin, Laminin, Collagen, Polylysin, Nitrocellulose, Nylon und Polytetrafluorethylen. In einer Ausführungsform werden Pankreas-Vorläuferzellen auf Fibronectin-beschichteten Gewebekulturplatten in den wie oben beschriebenen bevorzugten Nährstoffmedien gezüchtet. Pankreas-Vorläuferzellen bilden Zellaggregate, wenn sie in den bevorzugten Nährstoffmedien auf Fibronectin-beschichteten Platten gezüchtet werden. Außerdem ermöglicht diese Kultivierungskombination die Trennung von unerwünschten, mesenchymalen Zellen und Pankreas-Vorläuferaggregaten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Reinigung von Pankreas-Zellenaggregaten einfach durch Kultivieren der Pankreas-Vorläuferzellen in bevorzugten Medien unter Verwendung von CMRL 1066 als Basismedium in einer Fibronectinplatte erreicht. Pankreas-Vorläuferzellen bilden große, runde Cluster von Zellen, die sich nicht anheften, während andere Zellarten (d.h. mesenchymale Zellen) sich an die Fibronectinbeschichtung anheften. Die Cluster von Pankreas-Vorläuferzellen können dann gesammelt und in einen anderen Gewebekulturbehälter zur Subkultivierung und Vermehrung übertragen werden. Wenn die Vermehrung von mehr Pankreas-Vorläuferzellclustern gewünscht wird, wird der Gewebekulturbehälter mit Fibronectin beschichtet und die Pankreas-Vorläuferzellen werden in den bevorzugten, hierin offenbarten Medien unter Verwendung von CMRL 1066 als Basismedium kultiviert. In einer anderen Ausführungsform werden Pankreas-Vorläuferzellen in den bevorzugten Nährstoffmedien unter Verwendung von F12/DMEM als Basismedium in Collagen-beschichteten Gewebekulturbehältern gezüchtet. Pankreas-Vorläuferzellen bilden in dieser Ausführungsform einschichtige Zellrasen.
  • Die Frequenz mit der Pankreas-Vorläuferzellen gefüttert werden, kann einmal pro Tag sein oder jeden zweiten Tag. In einer Ausführungsform können Pankreas-Vorläuferzellen durch Ersetzen der Gesamtheit der alten Nährstoffmedien mit neuen Nährstoffmedien gefüttert werden. In einer anderen Ausführungsform können Pankreas-Vorläuferzellen mit konditionierten Medien, in welchen diese Zellen gezüchtet wurden, gefüttert werden. Eine Subkultivierung von Pankreas-Vorläuferzellen, um eine größere Anzahl von Zellen zu erhalten, wird durch Aufnehmen von Pankreas-Vorläuferzellen in Clusterform (auf Fibronectin gezüchtet) oder in Form eines einschichtigen Zellrasens (auf Collagen gezüchtet) und Aufteilen der Vielzahl von Zellen auf mehrere Gewebelculturbehälter erzielt. Dann werden Nährstoffmedien zu jedem der Gewebekulturbehälter zugegeben, um eine geringere Konzentration an Pankreas-Vorläuferzellen als im ursprünglichen Gewebekulturbehälter zu erreichen. Die Nährstoffmedien, welche zugegeben werden, hängen von der Art der gewünschten Anordnung der Pankreas-Vorläuferzellen ab. Wenn eine Anordnung als einschichtiger Zellrasen gewünscht ist, dann werden F12/DMEM als Basismedien in den bevorzugten, hierin offenbarten Nährstoffmedien, zusammen mit Collagenbeschichtung in den Gewebekulturbehältern verwendet. Wenn Pankreas-Zellcluster gewünscht sind, werden CMRL 1066 als Basismedien in den bevorzugten, hierin offenbarten Nährstoffmedien, zusammen mit Fibronectinbeschichtung in den Gewebekulturbehältern verwendet. Weil die beanspruchten Pankreas-Vorläuferzellen einzigartig für diese Erfindung sind und Faktoren sezernieren, welche spezifisch für diese Zellen sind, sind die konditionierten Medien, welche von den Pankreas-Vorläuferzellen abgeleitet sind, ebenfalls einzigartig. In dieser Erfindung bilden Pankreas-Vorläuferzellen Aggregate, wenn sie in den bevorzugten Nährstoffmedien, wie oben definiert, in Fibronectin-Gewebekulturplatten gezüchtet werden. Wenn das Substrat Collagenbeschichtete Gewebekulturplatten sind, bilden Pankreas-Vorläuferzellen einen angehefteten, stromalen einschichtigen Zellrasen. Zugabe von konditionierten Medien fördert eine größere Vitalität in den Pankreas-Vorläuferzellen. Eine bevorzugte Menge von konditionierten Medien beträgt mindestens ungefähr 1% bis mindestens ungefähr 25% des Medien-Gesamtvolumens. Eine noch weiter bevorzugte Menge an konditionierten Medien beträgt ungefähr 15% des Medien-Gesamtvolumens. Eine Fütterungsfrequenz, die zur Förderung des Überlebens und das Wachstums von Pankreas-Vorläuferzellen bevorzugt ist, beträgt einmal pro Woche, beträgt weiter bevorzugt zweimal pro Woche und beträgt am meisten bevorzugt jeden zweiten Tag. Die Pankreas-Vorläuferzellen dieser Erfindung können mehrfach passagiert werden, während die Teilungsfähigkeit erhalten bleibt, und ohne eine Differenzierung dieser Pankreas-Vorläuferzellen zu enddifferenzierten Azinus-, Insel- und Ductuszellen auszulösen.
  • Charakterisierung von Pankreas-Vorläuferzellen
  • Die Populationen von Pankreas-Vorläuferzellen diese Erfindung, die in der hierin offenbarten Weise isoliert wurden, haben einige definierende Eigenschaften. Erstens sind die Pankreas-Vorläuferzellen in einem Stadium, das als "vorbestimmte Pankreas-" beschrieben werden kann. Von den Darm-spezifischen Vorläuferzellen sind einige dazu vorbestimmt Pankreaszellen zu werden. Es ist dieses Stadium der Entwicklung, in welchem sich die Population der hierin beanspruchten Pankreas-Vorläuferzellen befindet (8). Die Pankreas-Vorläuferzellen dieser Erfindung haben die Fähigkeit entweder exokrine oder endokrine Zellen zu werden. Wie hierin verwendet, sind endokrine und exokrine Zellen durch ihre Sekretionen definiert. Die endokrinen Zellen, wie α-Inselzellen und β-Inselzellen sezernieren Glucagon beziehungsweise Insulin. Exokrine Zellen, wie Azinuszellen sezernieren eine Reihe von Verdauungssäften des Pankreas wie Trypsinogen, α-Amylase und Lipasen.
  • Eine Identifizierung von Pankreas-Vorläuferzellen kann durch Morphologie oder durch spezifische Marker oder einer Kombination von beiden Techniken erreicht werden. Wie hierin offenbart, können Pankreas-Vorläuferzellen gerundet und Zysten-ähnlich in Erscheinung sein oder verlängert in einer einschichtigen Zellrasenformation, abhängig von den Kultivierungsbedingungen, in welchen die Pankreas-Vorläuferzellen gezüchtet werden. Eine Identifizierung von differenzierten Pankreas-Vorläuferzellen kann ebenfalls durch Morphologie erreicht werden. Die Morphologie von Inselzellen eine eiförmige Form, von ungefähr 75 μm bis 175 μm Größe (lange Achse). Die Inselzellen tendieren dazu, mehr zum Ende der Schwanz eines Pankreas zu liegen (entfernt von der Duodenumhöhlung). Marker, die dazu verwendet werden können, Inselzellen nachzuweisen, schließen ein sind aber nicht beschränkt auf Glucagon für α-Inselzellen, Insulin für β-Inselzellen, Somatostatin für δ-Inselzellen und Pankreas-Polypeptid für PP-Inselzellen. Marker, die dazu verwendet werden können Ductuszellen nachzuweisen, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Cytokeratine (CK) 7, CK 8, CK 18, CK 19, Mucin MUC1, Carboanhydrase II, und Kohlenhydratantigen 19.9 (Sialyl-Lewis-a). Die Morphologie von Ductuszellen ist klein, rund, ungefähr 10 μm im Zelldurchmesser, scheint ein eng gepacktes, würfelförmiges Epithel zu sein. Die Morphologie von Azinuszellen schließt eine größere Größe als Ductuszellen, Form und Zymogen-Granula, die innerhalb der Azinuszellen vorhanden sind, ein. Marker, in die verwendet werden können, um Azinuszellen zu identifizieren, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Carboxypeptidase A und Amylase.
  • Ki67 oder PCNA sind Marker, die dazu verwendet werden können die Proliferation von Pankreas-Vorläuferzellen zu bestimmen. Vorbestimmte Pankreas-Vorläuferzellen sind immer noch in der Lage, sich zu teilen, während "enddifferenzierte" exokrine oder endokrine Zellen im Wesentlichen nicht teilungsfähig sind. Färbung mit Ki67 oder PCNA kann den proliferativen Zustand einer Pankreaszelle unter Analyse bestimmen.
  • Pankreas-Vorläuferzellen diese Erfindung werden in ihrem vorher existierenden Prä-Differenzierungszustand in Serum-freien Medien aufrechterhalten. Zellen-erhaltende Basismedien oder die hierin offenbarten bevorzugten Nährstoffmedien oder konditionierte Medien können verwendet werden, um die Pankreas-Vorläuferzellen in vitro zu kultivieren. Verschiedene Arten von Substrat können auf Gewebekulturplatten verwendet werden, um entweder Aggregate oder einschichtige Zellrasen von Pankreas-Vorläuferzellen zu erhalten. Die Verwendung von Fibronectin zusammen mit den hierin offenbarten bevorzugten Nährstoffmedien ergibt Aggregate von Pankreas-Vorläuferzellen, während die Verwendung von Collagen auf Gewebekulturplatten einschichtige Zellenrasen von Pankreas-Vorläuferzellen ergibt.
  • Pankreas-Vorläuferzellen diese Erfindung haben die Fähigkeit mehrfach in den hierin offenbarten bevorzugten Serum-freien Nährmedien passagiert zu werden. Die Multipotenz wird während jeder Passage erhalten und nach jedem Punkt jeder Passage können Pankreas-Vorläuferzellen diese Erfindung zu funktionellen exokrinen oder endokrinen Zellen differenzieren. Zusätzlich können an jedem Punkt nach jeder Passage Pankreas-Vorläuferzellen, wie hierin offenbart, als Immunogen zur Zelltherapie, für Bioassays, um ein menschliches Pankreasmodel zu schaffen oder zur Arzneimittelentdeckung und/oder -entwicklung verwendet werden.
  • Eine weitere Eigenschaft der Pankreas-Vorläuferzellen dieser Erfindung ist die Fähigkeit bei Transplantation unter eine Nierenkapsel eines Empfängersäugetieres zu exokrinen oder endokrinen Zellen zu differenzieren. Vor der Transplantation stellen Pankreas-Vorläuferzellen keine Verdauungsenzyme, wie Amylase oder Lipase, her und färben sich nicht positiv auf Verdauungsenzyme. Wie hierin offenbart, können Pankreas-Vorläuferzellen entweder in Pankreas-Vorläufer-Zellaggregaten oder in einschichtigen Zellrasen gezüchtet und dann mit mesenchymalem Gewebe kombiniert und unter einer Nierenkapsel eines Empfängersäugetieres gesetzt werden. Vorzugsweise werden menschliche Pankreas-Vorläufer-Zellaggregate mit mesenchymalem Gewebe aus Samenbläschen von Ratten kombiniert und unter die Nierenkapsel eines Empfängersäugetieres gesetzt. Ein Anteil des Implantats kann zur Analyse unter Verwendung der Marker, Morphologie oder einer Kombination davon entfernt werden, um die Pankreaszellen zu identifizieren.
  • Antikörper, entweder monoklonal oder polyklonal, welche verwendet werden können, um diese Populationen von Pankreas-Vorläuferzellen zu identifizieren, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf anti-Cytokeratin 19, anti-Carcinoembryonales Antigen (CEA), anti-Carboanhydrase II, anti-Mukoviszidose Transmembranleitfähigkeits-Regulator (CFTR).
  • Verwendungen von Pankreas-Vorläuferzellen
  • Verwendungen als Immunogen
  • Eine Verwendung für Pankreas-Vorläuferzellen ist die als ein Immunogen. Wie in dieser Erfindung offenbart, ermöglichen die einzigartigen Serum-freien Kultivierungsbedingungen, dass die Zelloberflächen der Pankreas-Vorläuferzellen frei von Serumproteinen oder Serum-Biomolekülen bleiben, die an die Oberfläche binden können. Das potenzielle Problem von antigenen Stellen, die durch Bindung durch Serum-Biomoleküle "maskiert" sein können, wird durch die Verwendung der offenbarten, Serumfreien Isolierungs- und Kultivierungstechniken vermieden. Entsprechend kann eine Reihe von Antikörpern gegen neu erhältliche Antigene, die "maskiert waren", wenn Serum enthaltende Kultivierungsbedingungen verwendet wurden, erzeugt werden.
  • Mit den hierin offenbarten Verfahren isolierte und kultivierte Pankreas-Vorläuferzellen können als ein Immunogen verwendet werden, welches einem heterologen Empfänger verabreicht wird. Eine Verabreichung von Pankreas-Vorläuferzellen als ein Immunogen kann durch mehrere Verfahren erreicht werden. Verfahren zur Verabreichung von Pankreas-Vorläuferzellen als Immunogene an einem heterologen Empfänger schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Immunisierung, Verabreichen auf eine Membran durch direkten Kontakt wie Reiben oder eine Katzvorrichtung, Verabreichen auf eine Schleimhaut durch Aerosol und orale Verabreichung. Wie im Stand der Technik gut bekannt ist, kann eine Immunisierung entweder eine aktive oder passive Immunisierung sein. Die Immunisierungsverfahren können auf verschiedenen Wegen auftreten, welche einschließen, aber nicht beschränkt sind auf intraperitoneale Injektion, intradermale Injektion, lokale Injektion. Subjekte einer Immunisierung können Säugetiere wie Mäuse einschließen. Der Weg und das Schema der Immunisierung stehen im Allgemeinen im Einklang mit etablierten und herkömmlichen Techniken zu Antikörperstimulierung und -herstellung. Während Mäuse in dieser Ausführungsform eingesetzt werden, kann jedes Säugetier-Subjekt, einschließlich von Menschen, oder Antikörper-produzierende Zellen davon gemäß der Verfahren in dieser Erfindung manipuliert werden, um als Basis für die Herstellung von Säugetier-Hybridoma-Zelllinien zu dienen. Typischerweise werden Mäuse intraperitoneal oder in wechselseitigen Bereichen (d.h. Pfote, Schwanzansatz usw.) mit einer immunogenen Menge an Pankreas-Vorläuferzellen geimpft und dann mit einer ähnlichen Menge des Immunogens aufgefrischt. In einer Alternative werden auf einer nicht-biologischen Membranmatrix gezüchtete Zellen chirurgisch intraperitoneal in das Wirtssäugetier implantiert. Lymphzellen, vorzugsweise Lymphzellen aus der Milz der Mäuse werden ein paar Tage nach der letzten Auffrischungsimpfung gesammelt und daraus eine Zellensuspension zur Verwendung in der Fusion hergestellt.
  • Hybridome werden aus den Lymphozyten und immortalisierten Myelomzellen unter Verwendung der allgemeinen Techniken für somale Zellhybridisierung von Köhler, B. und Milstein, C. Nature 256: 495–497 (1975) modifiziert durch Buck, D. W., et al., In Vitro, 18: 377–381 (1982) hergestellt. Erhältliche Myelomlinien einschließlich aber nicht beschränkt auf X63-Ag8.653 und solche des Salk Instituts, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, können in der Hybridisierung verwendet werden. Die Technik beinhaltet ein Fusionieren der Myelomzellen und Lymphzellen unter Verwendung eines Fusogen wie Polyethylenglycol, oder durch elektrische Mittel, die dem Fachmann gut bekannt sind. Nach der Fusion werden die Zellen vom Fusionsmedium getrennt und in einem selektiven Wachstumsmedium, wie HAT Medium, gezüchtet um nicht-hybridisierte Elternzellen zu beseitigen. Jedes der hierin beschriebenen Medien kann zur Kultivierung von Hybridome, welche monoklonale Antikörper sezernieren, verwendet werden. Als eine andere Alternative zur Zellfusionstechnik können mit EBV immortalisierte B-Zellen verwendet werden, um die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zu produzieren. Die Hybridome werden expandiert und subkloniert, falls erwünscht, und die Überstände werden auf anti-Immunogen-Aktivität durch herkömmliche Immunassayverfahren (z.B., Radioimmunassay, Enzymimmunassay oder Fluoreszenzimmunassay) getestet.
  • Hybridome, die solche Antikörper produzieren, können in vitro oder in vivo unter Verwendung von bekannten Verfahren gezüchtet werden. Die monoklonalen Antikörper können, wenn erwünscht, aus den Kulturmedien oder Körperflüssigkeiten durch herkömmliche Immunglobulin-Aufreinigungsverfahren wie Ammoniumsulfat-Fällung, Gelelektrophorese, Dialyse, Chromatographie und Ultrafiltration isoliert werden. Eine unerwünschte Aktivität kann, wenn vorhanden entfernt werden, z.B. durch ein Laufenlassen der Präparation über Absorptionsmittel, die aus dem Immunogen angeheftet an eine feste Phase gemacht sind, und Eluieren oder Entlassen der erwünschten Antikörper vom Immunogen.
  • Auf diese Weise kann einer Reihe von neuen Antikörpern gegen Zelloberflächen-Antigene, die spezifisch für ein Stadium von Pankreas-Vorläuferzellen sind, unter Verwendung der Pankreas-Vorläuferzellen dieser Erfindung erzeugt werden. Sobald monoklonale Antikörper gegen Zelloberflächen-Antigene auf Pankreas-Vorläuferzellen durch das hierin offenbarten Verfahren hergestellt wurden, können die Antikörper für mehrere Verwendungen verwendet werden. Die Antikörper können für Zwecke der Erzeugung von rekombinanten Antikörpern oder humanisierten Antikörpern sequenziert und kloniert werden. Andere Verwendungen für Antikörper, die für Pankreas-Vorläuferzellen spezifisch sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf biologisches Testen oder Reinigen (d.h. Isolierung von Pankreas-Vorläuferzellen durch Verfahren wie Durchflusscytometrie und Panning), therapeutische Verwendungen (d.h. Fördern oder Anhalten des Zellwachstums durch Bindung von Antikörper an eine Zielzelle oder Fördern oder Anhalten des Wachstums einer Zellmasse durch Bindung von Antikörper an eine Zielzelle), klinische Diagnose und biologische Marker (d.h. Identifizierung von anderen Pankreas- oder nicht-Pankreaszellen).
  • Eine andere Verwendung als ein Immunogen besteht darin, die allgemeine Immunantwort in einem heterologen Empfänger zu modulieren. Wie im Stand der Technik gut dokumentiert ist, können fremde Substanzen, wie Zellen und Organe, die in einen heterologen Empfänger eingeführt werden, eine Vielzahl von Immunantworten auslösen. Die Immunantworten können die Form einer Abstoßung (z.B. bei Organtransplantation), T-Zellaktivierung (z.B. Kreuzaktivierung), Reaktionslosigkeit oder Toleranz haben. Die allgemeine Immunantwort kann systemisch oder lokal begrenzt sein. Im Falle, dass eine lokal begrenzte Immunantwort gewünscht ist, zum Beispiel in der Darmregion, wird ein Immunogen wie Pankreas-Vorläuferzellen in einer wirksamen Menge in die Darmregion eingeführt. Eine wirksame Menge kann in einer schrittweisen Art bestimmt werden, in welcher ansteigende Mengen von Pankreas-Vorläuferzellen in einen heterologen Empfänger eingeführt werden und die nachfolgende Immunantwort überwacht wird. Eine allgemeine Immunantwort (z.B. Antikörperproduktion, Cytokinproduktion, T-Zellproliferation, Reaktionslosigkeit, Toleranz, usw.) kann durch eine Reihe von Verfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, ELISA, Proliferationsassays, Durchflusscytometrie mit Zellenoberflächenmarkern und Immunhistochemie überwacht werden.
  • Verwendung von Pankreas-Vorläuferzellen zur Arzneimittelentdeckung
  • Eine andere Verwendung von Pankreas-Vorläuferzellen bezieht sich auf die Arzneimittelentdeckung. Weil die prä-differenzierte, multipotente Pankreas-Vorläuferzell-Population nicht in der offenbarten Art und Weise isoliert und kultiviert worden war, kann die Pankreas-Vorläuferzell-Population Proteine sezernieren, die vordem noch nicht entdeckt oder charakterisiert wurden. Frühere Kultivierungstechniken unter Verwendung von Serum können die Sekretion von Proteinen hemmen. Als Alternative können sich Proteine in Funktion, Konformation oder Aktivität verändern, wenn sie sezerniert werden oder mit Serum-Biomolekülen wechselwirken. Durch Pankreas-Vorläuferzellen sezernierte Proteine weisen eine minimale Wechselwirkung durch Serum-Biomoleküle auf und können daher physiologisch und topologisch genauer sein. Daher können durch Pankreas-Vorläuferzellen sezernierte Proteine als Targets für eine Arzneimittelentwicklung verwendet werden. In einer Ausführungsform können Arzneimittel hergestellt werden, um auf spezifische Proteine auf Pankreas-Vorläuferzellen in vivo abzuzielen Eine Bindung des Arzneimittels kann eine Differenzierung der Pankreas-Vorläuferzellen zu spezifischen sub-Pankreaszellen, wie Inselzellen, fördern. Dieser Ansatz kann nützlich sein, wenn eine Neogenese von Inselzellen gewünscht ist, zum Beispiel bei einer Diabetesbehandlung. In einer anderen Ausführungsform kann ein Arzneimittel, das für regulatorische Proteine der Pankreas-Vorläuferzellen spezifisch ist, verwendet werden, um das Wachstum einer bestimmten Art von Zelle aufzuhalten, zum Beispiel im Fall von Mukoviszidose, wo die Azinuszellen durch Duktuszellen ersetzt werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein Arzneimittel ein Inhibitor für das Wachstum von Stammzellen oder Krebszellen, welche fötale Antigene exprimieren, sein. Jedes dieser Proteine kann als Target verwendet werden, um therapeutische Antikörper-, therapeutische Protein- oder kleine Molekül-Arzneimittel zu entwickeln.
  • Verwendungen von Pankreas-Vorläuferzellen zur Zelltherapie
  • In einer anderen Verwendung werden Pankreas-Vorläuferzelllinien zur Zelltherapie verwendet. Transplantation von Pankreas-Vorläuferzellen ist ein solches Beispiel für Zelltherapie. In den Fällen, in denen unterschiedliche Arten von Pankreaszellen, wie Inselzellen oder Azinuszellen, nicht in der Lage sind ihre Funktion des Sezernierens von Insulin beziehungsweise Glucagon auszuführen, stellt eine Transplantation von Pankreas-Vorläuferzellen ein Heilmittel dar, weil die Pankreas-Vorläuferzellen dieser Erfindung multipotent sind und zu funktionellen, exokrinen und endokrine Zellen differenzieren können. Um diese Verwendung auszuführen, werden Pankreas-Vorläuferzellen isoliert und in Serum-freiem, Nährstoff definierten Medien unter Verwendung der offenbarten Verfahren kultiviert. Pankreas-Vorläuferzellen werden auf Fibronectin-beschichteten Gewebekulturplatten gezüchtet, um Pankreas-Vorläuferzellaggregate zu erhalten. Pankreas-Vorläuferzellaggregate werden unter Standard-Inkubationsbedingungen für ungefähr einen halben bis ungefähr 7 Tage, weiter bevorzugt für ungefähr 1 Tag bis ungefähr 5 Tage und noch weiter bevorzugt ungefähr 3 Tage gezüchtet. Pankreas-Zellaggregate können dann einem Empfänger verabreicht und differenzieren gelassen werden. In einer Alternative können Pankreas-Zellaggregate als zelluläre Träger für eine Gentherapie verwendet werden, wobei Pankreaszellen mit einem oder mehreren Genen transfiziert und in einer Beförderungsvorrichtung eingeschlossen sind und dann einem Empfänger verabreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform werden Pankreas-Zellaggregate unter eine Nierenkapsel gesetzt und zu Azinus-, Ductus- oder Inselzellen differenzieren gelassen. In einer weiteren Ausführungsform werden Pankreas-Zellaggregate in einer Vorrichtung verwendet, welche Zellen enthält und den Zugang von anderen Zellen beschränkt (d.h. Theracyte®) um Immunsystemantworten zu beschränken.
  • Verwendungen von Pankreas-Vorläuferzellen um menschliche Gewebemodelle herzustellen
  • Eine andere Verwendung von Pankreas-Vorläuferzellen besteht darin, menschliche Gewebemodelle in nicht-menschlichen Säugetieren zu erzeugen. Pankreas-Vorläuferzellaggregate werden auf die Oberseite von mesenchymalem Gewebe gesetzt, um Transplantatrekombinationen zu bilden. Um Transplantatrekombinationen zu bilden werden ungefähr 1 bis 15 Pankreas-Zellkugeln, weiter bevorzugt ungefähr 5 bis 8 Pankreas-Zellkugeln auf die Oberseite von mesenchymalem Gewebe gesetzt. Das mesenchymale Gewebe kann entweder Pankreas- oder nicht-Pankreasgewebe sein und kann von einer anderen Spezies, als der von welcher Pankreas-Vorläuferzellen isoliert werden, stammen. In einem Ausführungsbeispiel werden menschliche Pankreas-Vorläuferzellen auf die Oberseite von mesenchymalen Samenbläschen-Gewebe gesetzt, um eine Transplantatrekombinationen zu bilden. Ein erfahrener Fachmann kann die optimale Kombination in einer schrittweisen Art bestimmen, durch zuerst Isolieren von menschlichem Pankreas-Vorläuferzellen unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren und dann Kombinieren mit mesenchymalem Gewebe aus verschiedenen Organen. In einigen Ausführungsformen wird eine unterschiedliche Spezies, zum Beispiel Ratte, als Quelle für mesenchymales Gewebe in Kombination mit menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen verwendet. Die Verwendung von heterologen Spezies ermöglicht es, Menschen-spezifische Marker zu verwenden, um die Identität von differenzierten Pankreaszellen zu bestimmen. Die Wahrscheinlichkeit für falsch-Positive wird verringert, wenn mesenchymales Gewebe aus Ratten verwendet wird. Ebenso verringert die Verwendung von mesenchymalem Gewebe von Samenbläschen über mesenchymalem Pankreasgewebe die Wahrscheinlichkeit von falsch-Positiven beim Identifizieren von differenzierten Pankreaszellen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden ungefähr 1 bis 12 Pankreas-Vorläuferzellkugeln, noch weiter bevorzugt ungefähr 5 bis 8 Pankreas-Vorläuferzellkugeln auf die Oberseite von mesenchymalem Gewebe aus Ratten-Samenbläschen gesetzt. Vorzugsweise werden ungefähr 1 × 104 bis ungefähr 5 × 106 mesenchymale Zellen verwendet. Noch weiter bevorzugt werden ungefähr 2 × 105 bis ungefähr 5 × 105 mesenchymale Zellen verwendet. Eine Transplantatrekombination, welche auf mesenchymales Gewebe gesetzte Pankreas-Vorläuferzellkugeln umfasst, wird dann unter die Nierenkapsel, in das Fettpolster, subkutan oder in einer Vorrichtung, welche die Pankreas-Vorläuferzellen enthält aber den Zugang von anderen Zellen zu den Pankreas-Vorläuferzellen beschränkt (d.h.. Theracyte®), in das Empfänger-Säugetier gesetzt. Mögliche Empfänger-Säugetiere schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Mäuse und Ratten. Typischerweise ist in Transplantatsituationen das Spendergewebe anfällig für Angriffe durch das Immunsystem des Empfängers. Um eine Transplantatabstoßung zu lindern, können verschiedene Techniken verwendet werden. Ein Verfahren besteht in der Bestrahlung des Empfängers mit einer sub-letalen Dosis von Strahlung, um Immunzellen, welche das Transplantat angreifen können, zu zerstören. Ein anderes Verfahren besteht darin, dem Empfänger Cyclosporin oder andere T-Zell-immunsuppressive Arzneimittel zugeben. Mit der Verwendung von Mäusen als Empfänger-Säugetiere ist eine größere Vielzahl von Verfahren zur Linderung einer Transplantatabstoßung möglich. Ein solches Verfahren ist die Verwendung einer immundefizienten Maus (nackt oder schwere kombinierte Immundeffizienz oder SCID). In einem Ausführungsbeispiel werden menschliche Pankreas-Vorläuferzellkugeln auf mesenchymales Gewebe aus Ratten-Samenbläschen gesetzt und unter die Nierenkapsel einer immundefizienten Maus gesetzt. Die Transplantatrekombination verbleibt für ungefähr 1 bis ungefähr 52 Wochen, vorzugsweise ungefähr 5 bis ungefähr 40 Wochen und noch weiter bevorzugt ungefähr 6 bis ungefähr 8 Wochen im Empfänger bevor die Transplantate geerntet und auf Pankreas-Vorläuferzellen-Differenzierung analysiert werden. In einigen Fällen wird ein kleiner Anteil des Transplantats zur Analyse benötigt. Für Inselzellen (d.h. Insulin, Glucagon, usw.), Ductuszellen (d.h.. CK19, usw.), und Azinuszellen (d.h. Amylase, usw.) spezifische Marker werden in einer immunhistochemischen Analyse verwendet. Ein anderer Satz an Markern für exokrine und endokrine Funktionen, wie für Insulin oder Glucagon spezifische Marker, können auch verwendet werden, um die Effizienz der Transplantation zu analysieren. Diese Marker können getrennt oder in Kombination miteinander verwendet werden. Zusätzlich kann eine Kombination von einem oder mehreren diese Marker in Kombination mit Zellmorphologie verwendet werden, um die Effizienz der Transplantation zu bestimmen.
  • In einer Ausführungsform kann ein Modell für den menschlichen Pankreas in einer SCID (schwere kombinierte Immundeffizienz) Maus erzeugt werden. Dieses Modell für den menschlichen Pankreas kann unter Verwendung der menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen, welche mit hierin offenbarten Verfahren isoliert und kultiviert wurden, und Verwendung der menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen um Transplantatrekombinationen zu machen, hergestellt werden. Transplantatrekombinationen werden dann unter die Nierenkapsel von Mäusen gesetzt. Nach ungefähr 1 bis 10 Wochen, vorzugsweise ungefähr 6 bis 8 Wochen nach Implantation unter die Nierenkapsel wird das Transplantat oder ein Teil davon geerntet und durch Immunhistochemie analysiert. Für endokrine oder exokrine Funktion spezifische Marker, wie Insulin oder Glucagon, werden verwendet, um die Effizienz des Gewebemodellsystems zu analysieren. Als Alternative werden für Pankreasgewebe wie Inselzellen (d.h. PDX-1), Azinuszellen (d.h. Amylase), Ductuszellen (d.h. CK 19) spezifische Marker verwendet. Ein noch weiterer Weg, die Ergebnisse der Differenzierung von Pankreas-Vorläuferzellen zu beurteilen, ist durch Morphologie. Pankreas-Vorläuferzellen haben das Aussehen von klein und rund, ungefähr 10 μm im Zelldurchmesser und in einer sehr kompakten, hochprismatischen, epithelialen Form. Azinuszellen haben das Aussehen von großen Clustern, die Azini bilden. Ductuszellen haben das Aussehen von klein, rund, ungefähr 10 μm im Zelldurchmesser und ein kompaktes, würfelförmiges, hochprismatisches Epithel. Die Inselzellen haben das Aussehen von epithelialen Inseln, umgeben von exokrinen Azinuseinheiten. Außerdem wird Morphologie mit funktionellen Markern für Insulin und Glucagon und Zelloberflächenmarkern, die für Zellen spezifisch sind, für eine vollständigere Beurteilung kombiniert. Die rekombinanten Gewebe stellen daher einen vollständig menschlichen Minipankreas in einer Maus dar. Diese Gewebemodelle für den menschlichen Pankreas können verwendet werden, um die Effizienz und die Toxizität von Arzneimittelkandidaten zu beurteilen, die entwickelt werden, um Typ I und Typ II Diabetes, Pankreatitis, Pankreaskrebs und andere Pankreasstörungen zu behandeln. Sie können außerdem dazu verwendet werden, jedes Arzneimittel auf Pankreastoxizität zu untersuchen. In einer weiteren Verwendung würde das Empfängertier einer chirurgischen oder chemischen (d.h. Streptazoticin) Ablation von Pankreas- oder β-Inselzellen unterzogen, so dass das produzierte Insulin vom Transplantat kommt.
  • Verwendungen von Pankreas-Vorläuferzellen in Bioassays
  • Die hierin offenbarten Pankreas-Vorläuferzellen können in verschiedenen Bioassays verwendet werden. In einer Verwendung werden die Pankreas-Vorläuferzellen verwendet, um zu bestimmen, welche biologischen Faktoren zur Differenzierung erforderlich sind. Unter Verwendung der Pankreas-Vorläuferzellen in einer schrittweisen Art in Kombination mit unterschiedlichen biologischen Verbindungen (wie Hormonen, spezifischen Wachstumsfaktoren, usw.), kann von einer oder mehreren biologischen Verbindungen herausgefunden werden, dass sie eine Differenzierung zu Inselzellen auslösen. Unter Einsatz der gleichen schrittweisen Kombinationen kann von einer oder mehreren biologischen Verbindungen herausgefunden werden, dass sie eine Differenzierung zu Azinuszellen und ebenso zu Ductuszellen auslösen. Andere Verwendungen für Pankreas-Vorläuferzellen in Bioassays sind Differential Display (d.h. mRNA Differential Display) und Protein-Protein Wechselwirkungen unter Verwendung sezernierter Proteine aus Pankreas-Vorläuferzellen. Protein-Protein Wechselwirkungen können mit Techniken wie einem Hefe-zwei-Hybridsystem bestimmt werden. Proteine aus Pankreas-Vorläuferzellen können verwendet werden, um andere unbekannte Proteine und andere Zellenarten, die mit Pankreas-Vorläuferzellen wechselwirken, zu identifizieren. Diese unbekannten Proteine können eines oder mehrere aus den Folgenden sein: Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, Transkriptionsfaktoren, Translationsfaktoren und Tumorsuppressoren. Bioassays, welche Pankreas-Vorläuferzellen umfassen, und die Protein-Protein Wechselwirkung, welche diese Zellen bilden, und die Wirkungen von Protein-Protein- oder sogar Zell-Zellkontakt können verwendet werden, um zu bestimmen, wie umgebendes Gewebe, wie mesenchymales Gewebe, zur Differenzierung von Pankreas-Vorläuferzellen beiträgt.
  • Die folgenden Beispiele stellen eine detaillierte Beschreibung der Isolierung, Charakterisierung und Verwendung von Pankreas-Vorläuferzellen bereit. Diese Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Isolierung von Pankreas-Vorläuferzellen
  • Fötaler Pankreas (Gestationsalter 14–22 Wochen) wurde vor einer enzymatischen Dissoziation mechanisch durch Mikrodissektion unter einem Stereomikroskop auseinander gezogen. Enzymbehandlung bestand aus dem Setzen des teilweise dissoziierten Gewebes in 1 ml F12/DMEM Medium, enthaltend 5 mg/ml Collagenase-Dispase, 20 μg/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor und 50 μg/ml DNAase, für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.
  • Zellaggregate wurden auf die Oberseite eines 5% (nach Volumen) BSA-Gradienten geschichtet und durch Zentrifugation für 6 Minuten bei 900 UpM gewaschen. Pelletierte Zellen, die immer noch in Aggregatform vorlagen, wurden in Wachstumsmedium, bestehend aus CMRL 1066 Nährstoffmedium enthaltend die folgenden Faktoren:
    Insulin 10 μg/ml
    Transferrin 10 μg/ml
    Epidermaler Wachstumsfaktor 5 ng/ml
    Ethanolamin 10–6 M
    Phosphoethanolamin 10–6 M
    Selen 2,5 × 10–8 M
    Trijodthyronin 10–12 M
    Progesteron 10–9 M
    Hydrocortison 10–9 M
    Forskolin 1 μM
    Heregulin 10 nM
    Aprotinin 25 μg/ml
    Rinderhypophysenextrakt 75 μg/ml
    Gentamycin 100 μg/ml
    resuspendiert.
  • Resuspendierte Zellaggregate wurde in Fibronectin-beschichtete Vertiefungen (6–12) einer Platte mit 24 Vertiefungen aliquotiert und bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5% CO2 Inkubator für 72 Stunden inkubiert. Nach 72 Stunden bildeten die epithelialen Zellen suspendierte Kugelstrukturen (1A) und die mesenchymalen oder stromalen Zellen waren an der Oberfläche der Vertiefung angeheftet. Wenn die Bildung eines einschichtigen Zellrasens erwünscht war, wurden die Pankreasaggregate oder Pankreaskugeln von 6 der Vertiefungen mit einer Mikropipette gesammelt und auf eine Collagen-beschichtete 60 mm Platte gesetzt, unter Verwendung von F12/DMEM als Basisnährstofmedium mit den Nährstoffergänzungen wie offenbart. Innerhalb von 24 Stunden hefteten sich die Strukturen an und die Zellen der Struktur breiteten sich auf dem Collagen aus, um einen epithelialen einschichtigen Zellrasen zu bilden (1B). Diese Pankreas-Vorläuferzellen konnten mindestens dreimal passagiert werden (2).
  • Beispiel 2: Verwendung von Pankreas-Vorläuferzellen in Transplantaten
  • Für den Zweck des rekombinanten Transplantierens wurden die Zellen in dem Kugelzustand vom Zeitpunkt der ursprünglichen Ausplattierung belassen oder der einschichtige Zellrasen wurde vom Collagen freigesetzt und in nicht-beschichteten Flaschen gezüchtet, wo sie in Suspension blieben und zu Kugelstrukturen re-aggregierten.
  • Für den Zweck des Transplantierens wurden die Kugeln auf die Oberseite von Samenbläschen-Mesenchym von e15 Ratten gesetzt, normalerweise 5–8 Kugeln auf ein Mesenchymaggregat von 2 × 105 bis 5 × 105 Zellen. Jede Rekombination wurde auf Agar gesetzt und über Nacht bei 37 Grad in einer 5% CO2 befeuchteten Kammer inkubiert.
  • Die Transplantation bestand aus dem Setzen von 3–6 Rekombinationen unter die Nierenkapsel einer immundefizienten Maus (Nackt- oder SCID-) und wurde für 6–8 Wochen dort belassen. Die Transplantate wurden dann geerntet und zur Immunhistochemie weiter verarbeitet.
  • Das Ergebnis der Transplantation von rekombinanten Pankreas-Gewebetransplantaten wurde durch Morphologie bewertet. Pankreas-Vorläuferzellen haben das Aussehen von rund und klein, ungefähr 10 μm im Zelldurchmesser und in einer sehr kompakten, hochprismatischen, epithelialen Form. Azinuszellen haben das Aussehen von großen Clustern, die Azini bilden (3E). Ductuszellen haben das Aussehen von klein, rund, ungefähr 10 μm im Zelldurchmesser und in einer kompakten, würfelförmigen hochprismatischen, epithelialen Form (3D). Inselzellen haben das Aussehen von epithelialen Inseln, umgeben von exokrinen Azinuseinheiten (3A, 3B, 3C und 7).
  • Beispiel 3: Bestimmung der Identität von transplantierten Pankreas-Vorläufer-Transplantatzellen, des Differenzierungsstadiums der Pankreas-Vorläuferzellen und ihrer Funktion
  • Nachdem die Pankreaskugeln unter die Nierenkapsel von Mäusen transplantiert und an dieser Stelle für 6–8 Wochen belassen wurden, erntete man die Transplantate und analysierte die Identität der Pankreaszellen durch Immunhistochemie und Funktion. Von den Transplantaten wurde gezeigt, dass sie Insulin und Glucagon (4, 5 und 7) exprimieren. Außerdem haben die Gewebetransplantat-Rekombinationen die Bildung von ductalen Strukturen gezeigt (6). Daher ergaben die rekombinanten Gewebetransplantate funktionelle Pankreaszellen, die Insulin und Glucagon exprimieren und ductale Strukturen bilden konnten.

Claims (15)

  1. Isolierte Population von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen, wobei die Population von Pankreas-Vorläuferzellen eine pluripotente Fähigkeit bewahren und in Azinus-, Ductus- und Inselzellen differenzieren können, wobei die Pankreas-Vorläuferzellen durch die Expression von mindestens einem aus Cytokeratin-19, Carcinoembryonales Antigen, Carboanhydrase II und Mukoviszidose Transmembranleitfähigkeits-Regulator ausgewählten Zellmarker, identifizierbar ist und wobei die Pankreas-Vorläuferzellen keine embryonalen Zellen sind.
  2. Pankreas-Vorläuferzellen nach Anspruch 1, wobei die Pankreas-Vorläuferzellen in Serum-freiem Medium aufrechterhalten werden.
  3. Pankreas-Vorläuferzellen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Pankreas-Vorläuferzellen die Morphologie: klein und rund, ungefähr 10 μm im Zelldurchmesser und eine sehr kompakte, hochprismatische, epitheliale Form aufweisen.
  4. Pankreas-Vorläuferzellen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Azinuszellen Amylase exprimieren und das Aussehen von großen Clustern, die Azini bilden, aufweisen.
  5. Pankreas-Vorläuferzellen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Ductuszellen Cytokeratin-19 exprimieren und die Morphologie: klein und rund, ungefähr 10 μm im Zelldurchmesser und eine kompakte, würfelförmige, hochprismatische, epitheliale Form aufweisen.
  6. Pankreas-Vorläuferzellen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inselzellen Insulin und Glucagon exprimieren und das Aussehen von epithelialen Inseln, umgeben von exokrinen Azinuseinheiten, aufweisen.
  7. Verfahren zur Isolierung der Population von Pankreas-Vorläuferzellen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend: (a) Setzen einer gemischten Population von Pankreaszellen, die Pankreas-Vorläuferzellen umfasst, unter Kultivierungsbedingungen, die ausreichend sind, um das Leben der Pankreas-Vorläuferzellen zu erhalten, in Nährmedium, wobei die gemischte Population von Pankreaszellen aus einer Quelle von menschlichen, foetalen Pankreas-Vorläuferzellen mikrodissektiert wurde und wobei das Nährmedium Serum-frei ist und Insulin, Transferrin, Epidermalen Wachstumsfaktor, Ethanolamin, Phosphoethanolamin, Selen, Trijodthyronin, Progesteron, Hydrocortison, Forskolin, Heregulin, Aprotinin und Rinderhypophysenextrakt umfasst; (b) Aufrechterhalten von geeigneten Kulturbedingungen, die ausreichend sind, um es Pankreas-Vorläuferzellen zu ermöglichen, eine Aggregat- oder Monolayer- Struktur zu bilden; und (c) Subkultivieren der Aggregat- oder Monolayer-Struktur, um die Population von Pankreas-Vorläuferzellen zu selektieren.
  8. Verfahren zur Bereitstellung einer Quelle eines Immunogens an einen heterologen Empfänger, umfassend das Einführen einer Mehrzahl von Pankreas-Vorläuferzellen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 aufgeführt, in einer Menge, die wirksam ist, um eine Immunantwort in dem Empfänger auszulösen.
  9. Verfahren zur Erzeugung menschlicher Pankreasgewebsmodelle in einem immundefizienten oder immungeschwächten, nicht menschlichen Säugetier-Empfänger, umfassend den Schritt des Verabreichens einer Mehrzahl von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen aus der Population von einem der Ansprüche 1 bis 6, wiedervereinigt mit mesenchymalem Gewebe, in den Empfänger an einer Stelle innerhalb des Empfängers, wobei die Stelle in der Lage ist, Wachstum und Differenzierung der Pankreas-Vorläuferzellen zu unterstützen.
  10. Verwendung von Pankreas-Vorläuferzellen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 aufgeführt, oder irgendeines zellulären Teils davon als Targets für eine Arzneimittelentwicklung.
  11. Verfahren zur Bereitstellung einer Quelle für Nukleinsäuren oder Proteine in der Entwicklung von Bioassays, welche das Isolieren von Nukleinsäuren oder Proteine aus den menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 aufgeführt, umfassen und Verwenden der Nukleinsäuren oder Proteine als einen oder mehrere der Grundbestandteile in den Bioassays.
  12. Population von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie oder Diagnose.
  13. Verwendung einer Population von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in der Herstellung eines Medikaments zur Zelltherapie.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Empfänger immunsupprimiert ist und/oder die Pankreas-Vorläuferzellen in einer Barrierevorrichtung bereitgestellt werden, welche die Immunsystemantwort des Empfängers gegen die Pankreas-Vorläuferzellen begrenzt.
  15. Isolierte Population von nicht-embryonalen, menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen, welche fähig sind, in Azinus-, Ductus- und Inselzellen zu differenzieren, die durch das Verfahren von Anspruch 7 erhalten werden kann.
DE60125342T 2000-04-10 2001-04-10 Humane pankreatische epitheliale stammzellen, verfahren zur ihrer isolierung und verwendungen davon Expired - Lifetime DE60125342T2 (de)

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DE60125342T Expired - Lifetime DE60125342T2 (de) 2000-04-10 2001-04-10 Humane pankreatische epitheliale stammzellen, verfahren zur ihrer isolierung und verwendungen davon

Country Status (12)

Country Link
US (2) US6436704B1 (de)
EP (1) EP1272616B1 (de)
JP (2) JP4566499B2 (de)
KR (1) KR100823221B1 (de)
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HK (1) HK1050710A1 (de)
WO (1) WO2001077300A2 (de)

Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6946293B1 (en) * 1999-02-10 2005-09-20 Es Cell International Pte Ltd. Progenitor cells, methods and uses related thereto
EP1224259A4 (de) * 1999-09-27 2005-04-27 Univ Florida Rückbildung von insulinabhängigem diabetes durch inselbildende stammzellen, inselvorläuferzellen und inselähnliche strukturen
US6866843B2 (en) * 1999-12-06 2005-03-15 Viacell, Inc. Method of transplanting in a mammal and treating diabetes mellitus by administering a pseudo-islet like aggregate differentiated from a nestin-positive pancreatic stem cell
US6610535B1 (en) * 2000-02-10 2003-08-26 Es Cell International Pte Ltd. Progenitor cells and methods and uses related thereto
US20030096408A1 (en) * 2001-11-16 2003-05-22 Gerber David A. Cell substrates and methods of use thereof
CA2469209C (en) * 2001-12-04 2012-04-24 Jianjian Jin Cultured cells from pancreatic islets
JP4666567B2 (ja) * 2001-12-07 2011-04-06 ジェロン・コーポレーション ヒト胚幹細胞由来の膵島細胞
KR100973453B1 (ko) 2001-12-07 2010-08-02 제론 코포레이션 인간 배아 줄기 세포에서 유래되는 연골세포 전구체
WO2003068357A2 (en) * 2002-02-12 2003-08-21 Cornell Research Foundation, Inc. Identification and high-yield isolation of human pancreatic islet progenitor and stem cells
WO2003102134A2 (en) * 2002-05-28 2003-12-11 Becton, Dickinson And Company Pancreatic acinar cells into insulin producing cells
CA2486548A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Raven Biotechnologies, Inc. Animal model for toxicology and dose prediction
AU2003243749B2 (en) 2002-06-19 2010-03-11 Macrogenics West, Inc. Novel RAAG10 cell surface target and a family of antibodies recognizing that target
KR100492015B1 (ko) * 2003-01-13 2005-05-30 학교법인고려중앙학원 인슐린 분비세포 분화 기능을 갖는 췌장 세포 추출물
AU2004213714A1 (en) 2003-02-20 2004-09-02 Bios Research Institute Inc. Human salivary gland-origin stem cell
WO2004090120A2 (en) 2003-04-08 2004-10-21 Yeda Research And Development Co. Ltd Stem cells having increased sensitivity to sdf-1 and methods of generating and using same
FR2853551B1 (fr) 2003-04-09 2006-08-04 Lab Francais Du Fractionnement Formulation stabilisante pour compositions d'immunoglobulines g sous forme liquide et sous forme lyophilisee
EP1631822A2 (de) * 2003-05-27 2006-03-08 McGILL UNIVERSITY "in vitro" platttform zum screenen von stoffen, die die neogenese von inselzellen induzieren
KR20060032958A (ko) * 2003-06-03 2006-04-18 올간 리커버리 시스템즈, 인코포레이티드 전구 세포의 분리 및 증식
DE10362002B4 (de) 2003-06-23 2006-10-12 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Adulte pluripotente Stammzellen
US7875272B2 (en) 2003-06-27 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
US8518390B2 (en) 2003-06-27 2013-08-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells
US9592258B2 (en) 2003-06-27 2017-03-14 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells
US8491883B2 (en) 2003-06-27 2013-07-23 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells
AU2004252570C1 (en) 2003-06-27 2012-03-01 Ethicon, Incorporated Soft tissue repair and regeneration using postpartum-derived cells
US9572840B2 (en) 2003-06-27 2017-02-21 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
JP2007503815A (ja) * 2003-08-27 2007-03-01 ステムセルズ・カリフォルニア・インコーポレイテッド 富化された膵臓幹細胞および前駆細胞集団、ならびにこれらの集団の同定、単離および富化方法
IL158868A0 (en) * 2003-11-13 2004-05-12 Yeda Res & Dev Methods of generating and using stem cells enriched with immature primitive progenitor
CA2460602A1 (en) * 2004-03-05 2005-09-05 Raewyn Seaberg Pancreatic multipotent progenitor cells
KR100660473B1 (ko) * 2004-04-02 2006-12-22 학교법인연세대학교 췌장 선방세포로부터 이행분화된 췌장 전구세포주
US7622108B2 (en) * 2004-04-23 2009-11-24 Bioe, Inc. Multi-lineage progenitor cells
US7670596B2 (en) * 2004-04-23 2010-03-02 Bioe, Inc. Multi-lineage progenitor cells
US20060121512A1 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Organ Recovery Systems, Inc. Biological pathways in progenitor cells
US8017395B2 (en) 2004-12-17 2011-09-13 Lifescan, Inc. Seeding cells on porous supports
EP1833496B1 (de) 2004-12-23 2013-07-31 Ethicon, Incorporated Behandlung von schlaganfall und anderer akuter degenerativer nervenerkrankungen mit post partum erhaltenen zellen
PL1831356T3 (pl) 2004-12-23 2017-07-31 DePuy Synthes Products, Inc. Komórki poporodowe pochodzące z tkanki pępowinowej i sposoby ich wytwarzania i stosowania
AU2006202209B2 (en) * 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
SI1888123T1 (sl) * 2005-06-08 2013-04-30 Janssen Biotech, Inc. Celična terapija za okularno degeneracijo
JP2007000077A (ja) * 2005-06-23 2007-01-11 Hitachi Medical Corp 付着性動物細胞の無血清培養方法及び付着性動物細胞の無血清培養用培地
US7807459B2 (en) * 2005-09-27 2010-10-05 Reneuron, Inc. EphA4-positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
CN101374946B (zh) 2005-12-16 2017-07-18 伊西康公司 用于在组织相容性不匹配的移植中抑制有害的免疫反应的组合物和方法
JP5179376B2 (ja) * 2005-12-19 2013-04-10 エシコン・インコーポレイテッド ローラーボトルでの分娩後取り出し細胞の体外増殖
US9125906B2 (en) 2005-12-28 2015-09-08 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells
US11254916B2 (en) 2006-03-02 2022-02-22 Viacyte, Inc. Methods of making and using PDX1-positive pancreatic endoderm cells
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
EP2422799A3 (de) 2006-03-07 2013-03-06 Geeta Shroff Zusammensetzungen enhaltend menschliche embryonale Stammzellen und ihre Derivate, Verwendung davon und Verfahren zur ihrer Vorbereitung
CA2646491A1 (en) * 2006-04-17 2007-10-25 Bioe, Inc. Differentiation of multi-lineage progenitor cells to respiratory epithelial cells
US8741643B2 (en) * 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
EP1900810A1 (de) * 2006-09-15 2008-03-19 Celogos Verfahren zur Zellextraktion und Zellselektion
WO2008054716A2 (en) * 2006-10-31 2008-05-08 National Stem Cell Holding Inc. Methods for identifying, isolating, and utilizing endocrine progenitor cells from adult human pancreata
AU2007321928A1 (en) * 2006-11-24 2008-05-29 Regents Of The University Of Minnesota Endodermal progenitor cells
KR101523698B1 (ko) * 2007-01-22 2015-05-29 마크로제닉스 웨스트 인코퍼레이티드 사람 암 줄기세포
KR20080103637A (ko) * 2007-05-25 2008-11-28 주식회사 알앤엘바이오 지방유래 줄기세포를 함유하는 사지말단부 허혈성 질환의세포치료용 조성물
US9080145B2 (en) * 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
WO2009015343A2 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Bioe, Inc. Differentiation of multi-lineage progenitor cells to chondrocytes
WO2009018453A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
AU2008308531B2 (en) 2007-10-05 2014-04-24 Ethicon, Incorporated Repair and regeneration of renal tissue using human umbilical cord tissue-derived cells
WO2009062050A2 (en) 2007-11-08 2009-05-14 Neogenix Oncology, Inc. Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers
CN101878298B (zh) 2007-11-27 2017-08-15 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
US8236538B2 (en) 2007-12-20 2012-08-07 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Methods for sterilizing materials containing biologically active agents
US8551779B2 (en) * 2007-12-28 2013-10-08 Novo Nordisk A/S DDR1-mediated cell purification of pancreatic endocrine cells through their progenitors
BRPI0908033A2 (pt) 2008-02-21 2015-08-04 Centocor Ortho Biotech Inc Método placas de superfície modificada e composições para adesão, cultura e desprendimento de célula
CN101983336A (zh) * 2008-04-03 2011-03-02 诺沃-诺迪斯克有限公司 Dner介导的胰腺内分泌前祖细胞及其子代的细胞纯化
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US20090291494A1 (en) * 2008-05-21 2009-11-26 Bioe, Inc. Differentiation of Multi-Lineage Progenitor Cells to Pancreatic Cells
EP2318516A1 (de) * 2008-06-30 2011-05-11 Centocor Ortho Biotech Inc. Differenzierung pluripotenter stammzellen
PL2942392T3 (pl) 2008-06-30 2019-02-28 Janssen Biotech, Inc Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych
US20100028307A1 (en) * 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
US20100222315A1 (en) * 2008-09-24 2010-09-02 Harbor BioSciencs, Inc. Patient populations and treatment methods
MX349178B (es) * 2008-10-31 2017-07-17 Centocor Ortho Biotech Inc Diferenciación de células madre embrionarias humanas al linaje endocrino pancreático.
EP2346988B1 (de) 2008-10-31 2017-05-31 Janssen Biotech, Inc. Differenzierung menschlicher embryonaler stammzellen in die pankreatisch-endokrine linie
US8278106B2 (en) 2008-11-14 2012-10-02 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
KR101774546B1 (ko) 2008-11-20 2017-09-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양
MX2011005289A (es) * 2008-11-20 2011-06-01 Centocor Ortho Biotech Inc Metodos y composiciones para union y cultivo celular sobre sustratos planares.
BRPI0923068B1 (pt) 2008-12-19 2021-05-25 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Uso de células derivadas de tecido de cordão umbilical para tratar um paciente tendo uma doença, distúrbio ou injúria pulmonar
US10179900B2 (en) * 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
CN102498204B (zh) 2009-03-26 2015-02-04 德普伊新特斯产品有限责任公司 人脐带组织细胞作为用于阿尔茨海默病的疗法
US9328331B2 (en) * 2009-05-21 2016-05-03 Joslin Diabetes Center, Inc. Compositions and methods for promoting beta cell maturity
EP2456862A4 (de) 2009-07-20 2013-02-27 Janssen Biotech Inc Differenzierung menschlicher embryonischer stammzellen
CN103952372B (zh) 2009-07-20 2016-10-05 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
PL2456858T3 (pl) * 2009-07-20 2019-01-31 Janssen Biotech, Inc Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
US8709400B2 (en) * 2009-07-27 2014-04-29 Washington University Inducement of organogenetic tolerance for pancreatic xenotransplant
EP2464661B1 (de) 2009-08-13 2018-01-17 The Johns Hopkins University Verfahren zur modulierung der immunfunktion mittles anti-b7-h7cr antikörper
JP5957382B2 (ja) * 2009-10-29 2016-07-27 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞
US8759098B2 (en) 2009-12-04 2014-06-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Method for cloning pluripotent stem cells
WO2011069093A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Detecting and counting tissue-specific stem cells and uses thereof
WO2011079018A2 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
RU2701335C2 (ru) 2009-12-23 2019-09-25 Янссен Байотек, Инк. Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета
SG183535A1 (en) * 2010-03-01 2012-10-30 Janssen Biotech Inc Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
EP2569419B1 (de) 2010-05-12 2019-03-20 Janssen Biotech, Inc. Differenzierung menschlicher embryonischer stammzellen
EP3372672A1 (de) 2010-08-31 2018-09-12 Janssen Biotech, Inc. Differenzierung menschlicher embryonischer stammzellen
EP2611910B1 (de) 2010-08-31 2018-01-17 Janssen Biotech, Inc. Differenzierung menschlicher embryonischer stammzellen
US9181528B2 (en) 2010-08-31 2015-11-10 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
JP5784294B2 (ja) * 2010-09-22 2015-09-24 シスメックス株式会社 細胞分析装置および細胞分析方法
WO2013010045A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 Biotime Inc. Novel methods and formulations for orthopedic cell therapy
EP2594295A1 (de) 2011-11-16 2013-05-22 Servicio Andaluz De Salud Nervenimplantat basierend auf einem kompaktierten, zellhaltigen Biomaterial
MX2014007744A (es) 2011-12-22 2015-01-12 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionicas humanas en celulas individuales positivas de insulina hormonal.
US9611513B2 (en) 2011-12-23 2017-04-04 DePuy Synthes Products, Inc. Detection of human umbilical cord tissue derived cells
DK2817620T3 (en) 2012-02-22 2016-09-05 Verik Bio Inc IMMUNTERY TREATMENT SYSTEM FOR TUMOR FORMATION AND PROGRESSION
SG11201405052RA (en) 2012-03-07 2014-10-30 Janssen Biotech Inc Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
CA2875786C (en) 2012-06-08 2022-12-06 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
US9968639B2 (en) * 2012-06-26 2018-05-15 Seraxis, Inc. Stem cells and pancreatic cells useful for the treatment of insulin-dependent diabetes mellitus
GB201216796D0 (en) * 2012-09-20 2012-11-07 Cambridge Entpr Ltd In vitro pancreatic differentiation
US10138465B2 (en) 2012-12-31 2018-11-27 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using HB9 regulators
CN105008518B (zh) 2012-12-31 2020-08-07 詹森生物科技公司 在空气-液体界面处培养人胚胎干细胞以用于分化成胰腺内分泌细胞
EP2938722B1 (de) 2012-12-31 2021-12-08 Janssen Biotech, Inc. Suspension und zusammenlagerung von menschlichen pluripotenten zellen zur differenzierung in endokrine pankreaszellen
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
US9783784B2 (en) * 2013-01-04 2017-10-10 City Of Hope Methods for establishing and improving the survival of a population of pancreatic progenitor or stem cells
KR102232650B1 (ko) 2013-06-11 2021-03-29 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 SC-β 세포 및 조성물 그리고 그 생성 방법
JP6741580B2 (ja) 2013-12-31 2020-08-19 インフェクシャス ディズィーズ リサーチ インスティチュート 単一バイアルのワクチン製剤
KR102162138B1 (ko) 2014-05-16 2020-10-06 얀센 바이오테크 인코포레이티드 췌장 내분비 세포에서 mafa 발현을 향상시키기 위한 소분자의 용도
DK3234110T3 (da) 2014-12-18 2024-05-13 Harvard College FREMGANGSMÅDER TIL GENERERING AF STAMCELLE-AFLEDTE ß-CELLER OG ANVENDELSER DERAF
US10253298B2 (en) 2014-12-18 2019-04-09 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived beta cells and methods of use thereof
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
US10889804B2 (en) * 2015-05-11 2021-01-12 Alfred E. Mann Institute For Biomedical Engineering At The University Of Southern California Pancreatic stromal progenitor cells
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
GB201615714D0 (en) 2016-09-15 2016-11-02 Univ Of Sheffield The Otic progenitor identification and isolation
CA2983845C (en) * 2017-10-26 2024-01-30 University Of Copenhagen Generation of glucose-responsive beta cells
WO2019099725A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Semma Therapeutics, Inc. Islet cell manufacturing compositions and methods of use
AU2019320072A1 (en) 2018-08-10 2021-02-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
CN109694846A (zh) * 2018-12-25 2019-04-30 中国医学科学院北京协和医院 含有胰蛋白酶抑制剂的试剂盒及其应用
CN112553166A (zh) * 2020-12-21 2021-03-26 广西医科大学附属武鸣医院 基于活体成像技术的2型糖尿病小鼠胰腺癌模型构建方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0363125A3 (de) * 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Produkt, enthaltend vermehrungsfähige Bauchspeicheldrüsen-Endokrinezellen, und Verfahren
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6001647A (en) * 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US5587309A (en) 1994-04-29 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of stimulating proliferation and differentiation of human fetal pancreatic cells ex vivo
JPH11514877A (ja) 1995-10-25 1999-12-21 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデイション，インコーポレイテッド 機能性ランゲルハンス島のインビトロ成長およびそのインビボの使用
US6004528A (en) 1997-09-18 1999-12-21 Bergstein; Ivan Methods of cancer diagnosis and therapy targeted against the cancer stemline
JP2002538779A (ja) 1999-02-10 2002-11-19 キュリス インコーポレイテッド 膵臓細胞前駆細胞、それらに関する方法及び利用
EP1240518A4 (de) 1999-12-13 2006-05-17 Scripps Research Inst Marker zur identifizierung und zur isolierung von vorläuferzellen von a und b pankreasinselzellen

Also Published As

Publication number Publication date
JP2010046098A (ja) 2010-03-04
WO2001077300A2 (en) 2001-10-18
JP2003530102A (ja) 2003-10-14
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