KR20030032934A - 인간 췌장 상피 기원 세포 및 그것의 분리 및 이용 방법 - Google Patents

인간 췌장 상피 기원 세포 및 그것의 분리 및 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실질적으로 순수한 인간 췌장 기원 세포의 집단 및 췌장 기원 세포의 분리 및 배양 방법을 개시한다. 췌장 기원 세포의 미세 환경을 신중히 조작함으로써, 췌장 기원 세포가 노화하지 않고, 더욱이 기능적인 외분비 또는 내분비 세포가 되는 것이 가능한 다수의 계대를 이룰 수 있다. 나아가, 인간 췌장 기원 세포의 여러 이용 방법이 여기에 개시된다.

Description

인간 췌장 상피 기원 세포 및 그것의 분리 및 이용 방법{HUMAN PANCREATIC EPITHELIAL PROGENITOR CELLS AND METHODS OF ISOLATION AND USE THEREOF}
근간세포와 기원세포의 분리 및 특성결정은 그들의 광대한 잠재성 때문에 활발한 연구의 대상이다. 인체내에서 어떠한 형태의 세포로도 될 수 있는 능력을 가진 분화전능성의 근간세포는 분화전능성 세포보다 더 분화된 기원세포가 된다. 기원세포들의 한가지 형태는 사전-결정된 췌장 상피 기원 세포이다. 이 췌장 상피 기원 세포는 췌장 상피 세포의 다른 형태로 될 능력을 가지고 있다. 다른 형태의 췌장 상피 세포에는 선포세포와 섬세포, 그리고 관상세포등이 포함된다. 선포세포는 일반적으로 췌두부에서 발견되며 전자현미경으로 관찰되는 효소전구체 입자를 함유하고 있다. 이 선포세포는 소장내로 염기성 소화액을 분비함으로써 외분비기능을 한다. 1일당 약 1500ml의 췌장액이 분비되며 여기에는 지방과 단백질의 분해에 필요한 효소들이 포함된다. Ganong, William F.Review of Medical Physiology,Chapter 26 "Regulation of Gastrointestinal Function", Fifteenth Edition, Appleton and Lange(1991). 섬세포는 랑게르한스섬이라고도 알려진, 섬-α, 섬-β, 섬-δ,섬-PP 네가지 형태로 존재한다. 섬-α세포는 당신생, 즉 더 많은 순환 포도당을 생성하는 에너지 비축의 붕괴를 촉진시키는 글루카곤을 분비한다. 섬-β세포는 순환하는 포도당의 저장분을 이용가능한 에너지 자원으로 촉진하는 인슐린을 분비한다. 아동 당뇨라고도 알려진 형태I의 진성 당뇨병에서는 자동면역기능이 섬-β세포를 공격하여 이 세포의 기능장애를 유발하며 그럼으로써 순환하는 포도당의 양을 줄이는 인슐린의 부족이 초래된다고 생각되어진다. 섬-δ세포는 글루카곤과 인슐린의 분비를 조절하는 소마토스타틴을 분비한다. 네번째 섬 세포 형태인 섬-PP(췌장 폴리펩티드)는 아직 췌장내에서의 기능에 대해 밝혀진 바가 없다. 또 다른 형태의 하부-췌장 세포는 관상세포이다. 이들 세포는 췌장의 다른 부분과 연결되어 있는 관에 정렬한다.
췌장상피기원세포의 분리는 다른 형태의 기원세포들과 같이 기원세포의 짧은 생존기간으로 인해 어려움이 있다. 분리를 요하는 모세포의 조작은 연약한 기원세포적 상태를 방해하여 그들로 하여금 분화하게 만든다. 성장인자나 기질과의 접촉 또한 췌장모세포가 내/외분비세포로 분화되는 것을 유도한다. 췌장세포에 대한 연구 결과, 래트 유래 여러 개의 췌장 상피 세포주들이 얻어졌다. Stephan, J.et.al.Endocrinology 140:5841-5854,(1999). 다른 연구는 인간의 성숙한 췌장세포의 분리및 간세포 성장 인자/산란 인자(HGF/SF)를 이용하여 췌장세포들을 섬-β와 유사한 구조로의 분열을 유도하는 것을 포함한다. Jeffreyet.al.US Patent 5,888,705.또 다른 연구는 성숙한 췌장세포를 우선 혈청을 함유한 낮은 포도당 농도의 배지에서 배양한 후, 더 높은 농도의 혈청과 포도당 성분의 배지로 바꿈으로써 섬세포로 성장하도록 유도했다. WO9715310. 췌장기원세포 분야의 또 다른 연구는 당뇨초기 성인으로부터 기원세포를 분리하고 이를 기능하는 섬 세포의 성장을 촉진하는 배지에서 배양하는 방법을 포함한다. US Patent 5,834,308. 그러나, 이 모든 "기원세포"들은 오로지 섬세포로만 된다. 전술된 연구에서의 췌장세포는 내분비나 외분비 세포의 어떤 형태로도 분화할 수 있는 능력은 가지고 있지 않다. 이는 앞서 말한 연구에서의 췌장세포가 췌장 기원 세포의 분화과정 중 좀더 아래쪽에 구속되어 있어서 본 발명의 췌장 기원 세포와는 다른 형태의 췌장세포가 된 것으로 보인다. 더구나. 배지를 보충하기 위하여 혈청을 사용하는, 전술된 연구에서 이용된 배양 조건은 반대의 결과를 가져올지 모른다. 혈액이 응고되고 난 후의 액체부분인 혈청은 알부민과 α,β-글로불린같은 많은 생물학적 분자들을 함유하고 있다. 생체내에서, 세포들은 일반적으로 조직의 손상이 일어나지 않는 한, 혈청균등물에 노출되지 않는다. 그러므로, 혈청에서 배양된 췌장세포는 생체내에서 췌장세포가 존재하는 생리학적 척도를 정확하게 반영하지 않을 수 있다. 이상적인 췌장기원세포의 집단은 관상 세포뿐만 아니라 내분비 세포(즉, 선포세포), 외분비 세포(즉, 섬-α, 섬-β, 섬-δ,섬-PP)로도 분화가 가능해야 할 것이다. 췌장기원세포의 이러한 집단은 임상적 세팅에서 유용할 수 있는데 그 예로, 당뇨의 어떤 형태를 다루거나, 기능적인 췌장 세포로 분화가 가능한 췌장기원세포를 이식함으로써 기능 장애가 있는 췌장세포를 치료하는 것등이 있다. 그러므로, 췌장 기원 세포의 집단과, 췌장 기원 세포들의 분열이 가능하고 노화가 회피되면서도 분화 잠재성을 보유할 수 있도록 이들을 분리 및 배양하는 방법을 필요로 한다. 여기에 개시된 췌장기원세포들과 이들 세포의 분리및 배양법은 이러한 필요성을 충족시키고, 또한 관련된 이점들을 제공한다.
(본 발명의 개시)
본 발명은 발생과 세포 생물학의 분야에 관련된다. 한 양태에서, 본 발명은 기능하는 외분비 또는 내분비 췌장 세포로 분화할 수 있는 분화다능성 능력을 가지는, 실질적으로 순수한 인간 췌장 기원 세포 집단과 관련된다.
다른 양태에서, 본 발명은 기능하는 외분비 및 내분비 췌장 세포로 분화할 수 있는 분화다능성 능력을 가지는, 실질적으로 순수한 인간 췌장 기원 세포 집단을 분리하는 방법과 관련된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 기능적인 외분비 및 내분비 췌장 세포로 분화할 수 있는 분화다능성 능력을 가지는, 실질적으로 순수한 인간 췌장 기원 세포 집단을 유지시키는 방법 및 노화를 회피하면서 그 분화다능성 능력을 유지하도록 이들 췌장 기원 세포를 유지시키거나 배양하는 방법과 관련된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 면역원의 공급원을 제공하는 방법과 실질적으로 순수한 췌장 기원 세포 집단의 면역원으로서의 사용과 관련된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 순수한 췌장 기원 세포를 췌장 세포의 공급원으로 사용하고 췌장 기원 세포를 비-인간, 포유 동물 수용체 내로 투여하여 인간 췌장 조직 모델을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 순수한 인간 췌장 기원 세포 집단이 수용체 내로 도입되는 세포 치료법을 제공하는 방법과 관련된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 순수한 인간 췌장 기원 세포 집단이 췌장의 생물학적 성분의 공급원으로서 사용되는 약제학적 약물로서, 하나 이상의 이들 췌장의 생물학적 성분이 개발되는 약물의 표적이 되는 것을 특징으로 하는 약물을 개발하기 위한 수단을 제공하는 방법과 관련된다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 실질적으로 순수한 인간 췌장 기원 세포 집단이 핵산이나 단백질의 공급원으로서 사용되며 이들 핵산이나 단백질은 생물학적검정 또는 생물학적검정의 개발에서 하나 이상의 주성분으로서 사용되는, 생물학적 검정 개발을 제공하는 방법과 관련된다.
본 발명은 발생생물학과 세포생물학의 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 기능하는 내분비와 외분비 세포로의 분화가 가능한 췌장 상피 기원 세포의 집단과 췌장 상피 기원 세포의 분리 방법, 췌장 상피 기원 세포의 특성결정 및 췌장 상피 기원 세포의 이용과 관련된다.
도 1은 두가지 다른 형태의 배지에서 배양된 인간 췌장 관상 상피 세포를 도시한다. 도 1A(좌측)는 피브로넥틴으로 피복된 배양접시의 CMRL 1066 배지에서 성장한 췌장 상피 세포를 도시한다. 크고 둥근 세포가 췌장 상피 세포이다. 도 1B(우측)은 F12/DMEM 배지에서 성장한 췌장 상피 세포이다. 평평하게 되어 단일층을 이룬다.
도 2는 세 차례의 세포계대 후 콜라겐으로 코팅된 배양접시에서 성장한 인간 췌장 상피 세포를 도시한다. 화살표는 분열하는 세포를 가리킨다.
도 3은 조직 재조합 이식편의 염색 결과를 도시한다. 도 3A는 조직 재조합 이식편에서 섬형성을 20배로 확대하여 도시한다. 도 3B는 조직 재조합 이식에서 섬형성을 60배로 확대하여 도시한다. 도 3C는 조직 재조합 이식편에서 섬, 관, 선포조직 형성을 도시한다. 도 3E는 조직 재조합 이식편에서 선포세포의 집괴(또는 응집체)형성을 도시한다.
도 4는 조직 재조합 이식편에서 글루카곤(청색)과 인슐린(갈색)의 염색 결과를 도시한다.
도 5는 조직 재조합 이식편에서 인슐린(갈색)의 염색 결과를 도시한다.
도 6은 조직 재조합체에서의 관 형성을 도시한다.
도 7은 조직 이식편의 파라핀-고정 조직 절편에서 글루카곤과 인슐린의 염색 결과를 도시한다.
도 8은 분화전능성의 근간세포로부터 췌장 세포의 발생에 대한 개괄적 도식을 도시한다. 점선은 본 발명의 인간 췌장 기원 세포가 존재하는 발상 단계를 나타낸다.
본 발명의 수행 방식
본발명의 다음 상세한 기재는 당업계 숙련자가 본 발명을 실시하는 것을 돕기 위하여 제공된다. 본 발명의 요지와 범위를 벗어나지 않고 여기에 개시된 구체예의 변형이 당업자에 의하여 이루어질 수 있으므로, 이 상세한 설명은 본 발명을 제한하도록 해석되어서는 안된다. 본 개시를 통하여, 다양한 간행물, 특허, 및 공개된 특허 명세서가 인용 문헌으로써 참고되었다. 이들 간행물, 특허, 및 공개된 특허는 전체로서 본 개시에 참조문헌으로써 여기에 수록된다.
본 발명의 실시는 다르게 지시되지 않는 한, 당업계 기술에 속하는 면역학, 분자생물학, 생물학, 미생물학, 세포생물학 및 재조합 DNA의 종래 기술을 채용할 것이다. 예를 들어, Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987); 시리즈물인 METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, 및 ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)) 참조.
정의
여기에서 사용될 때, 단수형태는 문맥상 분명히 다르게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, "세포"는 그것의 혼합물을 포함하는 다수의 세포를 포함한다.
명세서와 특허청구범위에서 사용될 때, 용어 "췌장 상피 기원 세포" 및 "췌장 기원 세포"는 호환적으로 사용되고, 인간 유래의 "췌장 상피 기원 세포"와 "췌장 기원 세포"를 지칭한다.
"췌장 상피 기원 세포"와 "췌장 기원 세포"는 분화 말기의 본질적인 비분화 시기에 아직 도달하지 않은 췌장에서 발견되는, 분열하는 기원 세포를 지칭한다. "췌장 상피 기원 세포"와 "췌장 기원 세포"는 분화다능성, 조직-특이적 세포가 되는 분화전능성 세포로부터 궁극적으로 유래한다. 이러한 분화다능성, 조직 특이적, 분열하는 기원 세포는 내배엽, 외배엽 및 중배엽 세포로 될 수 있다. 내배엽성 복수분화능 세포에 있어서, 몇몇은 소화관-특이적, 분열하는 기원 세포로 분화한다. 소화관-특이적 기원 세포에 있어서, 몇몇은 췌장 세포가 되기로 사전-결정된다. 여기 청구된 세포의 집단은 이 발생 단계의 것이다. 더 구체적으로, 여기에 개시된 "췌장 상피 기원 세포"와 "췌장 기원 세포"의 집단은 소화관-특이적 기원 세포가 췌장(또는 췌장의 부분)로 되기로 사전-결정된 시기와 췌장-특이적 기원 세포가 하부-췌장 세포 형태로 되도록 결정되는 시기 사이의 것이다. 췌장-특이적 기원 세포는 여러 형태의 세포: 선포, 관상 및 섬-α, 섬-β, 섬-δ 및 섬-PP 세포로 분화할 수 있다. 선포 세포의 한 외분비 기능은 소장내로 소화액을 분비하는 것이다. 섬 세포의 한 내분비 기능은 글루카곤(섬-α)과 인슐린(섬-β)의 분비이다. 본 발명의 췌장 기원 세포는 전술된 어떤 형태의 하부-췌장 세포로도 분화되지 않았으나 이들 세포의 어떤 것으로도 될 수 있는 능력을 가지고 있다.
"하부-췌장"는 전체 기관으로써의 췌장 내에서 세포성 하부구조를 지칭한다. 하부-췌장 세포의 예는, 제한적이진 않지만, 선포, 관상, 섬 세포를 포함한다.
"분화전능성 세포"와 "분화전능성 근간세포"는 상호 호환적으로 사용되며, 포유동물 체세포의 어떤 형태의 세포도 될 수 있는 능력을 가진 근간 세포를 지칭한다.
"분화다능성" 및 "복수분화가능성"은 상호 호환적으로 사용되며, 다수의 세포중 하나로는 될수 있으되 체세포의 모든 형태의 세포로는 될 수 없는 시기를 지칭한다. "분화다능성"세포는 그들이 하나 이상의 세포 형태의 시조가 되므로 "근간세포"보다는 "기원세포"를 지칭한다.
여기에서 사용될 때, "사전-결정된 췌장"는 소화관-특이적이 되는 시기 후와 (선포, 섬 또는 관사세포 같은) 최종적으로 분화된 췌장 세포의 시기 이전을 지칭한다. "사전-결정된 췌장"인 세포는 췌장 세포로 되도록 구속된 세포이지만 아직 최종적으로 분화된 췌장 세포로의 분화는 일어나지 않았다. 상이한 인자들이 사전-결정된 췌장 세포가 분화를 개시하도록 유발한다. 이에 제한되지 않는 예는 혈청에의 노출, 인슐린 성장 인자(IGF) 또는 상피 성장 인자(EGF)에의 노출, 주변 조직과의 접촉, 세포의 미세환경 및 주위 조직과의 세포-세포간 접촉을 포함한다. 분화의 연쇄는 체세포의 어떤 세포로도 될 수 있는 분화전능성 근간 세포에서 시작된다. 분화전능성 근간세포는 그것의 세포성 전분화능 때문에 진정한 근간 세포이다. 분화전능성 근간 세포의 다음 어느 시기에서도, 세포는 그들이 더이상 모든 종류의 세포로 될 수는 없는 과정에 구속되므로, "사전-결정된 기원세포"가 된다.
"항체"는 항원을 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 여기에서 사용될 때, 이 용어는 원상태의 면역글로불린 분자 뿐 아니라, 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는, 항-이디오타입성 항체, 돌연변이체, 단편, 융합 단백질, 인간화된 단백질 및 면역글로불린의 변형을 포괄한다.
용어 "항원"은 항원이 결합할 수 있는 하나 또는 다수의 에피토프를 함유할 수 있는 분자이다. 항원은 면역원성 성질을 가질 수 있는, 즉 면역 반응을 유도할 수 있는 물질이다. 항원은 면역원의 한 유형으로 생각될 수 있다. 여기에서 사용될 때, 용어 "항원"은 하나 또는 다수의 에피토프를 함유하거나 포함하는, 전장 단백질 뿐 아니라 그것의 펩티드 단편도 의미하도록 의도된다.
용어 "표면 항원" 및 "세포 표면 항원"은 여기에서 호환적으로 사용되며 세포의 원형질막 성분을 지칭한다. 이 성분은 통합 및 주변 막단백질, 당단백질, 다당류, 지질 및 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-결합 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "통합 막단백질"은 세포의 원형질막 지질이중층을 가로질러 뻗어 있는 막횡단 단백질이다. 전형적인 통합 막단백질은 일반적으로 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 하나의 막 통과 세그먼트로 구성된다. 주변 막단백질은 지질 이중층의 소수성 내부 내로 뻗어 있지 않고 다른 막 단백질과의 비공유 상호작용에 의하여 막 표면에 결합된다. GPI-결합 단백질은 지질 이중층 내로 삽입된 지질 꼬리에 의하여 세포 표면 상에 고정된 단백질이다.
용어 "단일클론 항체"는 여기에서 사용될 때 실질적으로 동종의 항체 집단을 가지는 항체 조성물을 지칭한다. 이것은 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식(예를 들어, 하이브리도마 또는 재조합 합성에 의한 것)에 관하여 한정하려는 의도가 아니다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이며 단일 항원성 부위에 대하여 영향을 미친다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대하여 영향을 미치는 상이한 항체를 포함하는 종래(폴리클론) 항체 제제와 대조적으로, 단일 클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대하여 영향을 미친다.
"단일클론 항체의 집단"은 다수의 이종 단일클론 항체를 지칭한다, 즉, 집단을 포함하는 개별 단일클론 항체는 서로 구별되는 항원 결정인자를 인식한다.
"면역원"은 면역반응을 유도하는 어떤 물질을 지칭한다. 면역원인 물질은 "면역원성"이라고 기재된다. 면역 반응의 유도는 체액성 반응 (예를 들어 항체 생산) 또는 세포성 반응 (예를 들어, 세포독성 T 세포를 초회감작함), 염증 반응 (예를 들어 백혈구의 모집), 및 사이토카인 및 림포카인의 분비를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "이종의"는 면역화 또는 이식에 사용되는 세포에 적용될 때 세포가 수용체와 유전적으로 구별되는 존재로부터 유래함을 의미한다. 예를 들어, 이종 세포는 수용체와 상이한 종 또는 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래한다. 한 종의 개체로부터 유래한 배자 세포는 동일한 종의 성체와 이종이다. "이종"은 수용체에 적용될 때 수용체가 수용체로 도입되는 세포의 공급원과 유전적으로 구별되는 존재임을 의미한다.
세포가 각각 세가지 배엽층 - 배(胚)의 외배엽, 내배엽 또는 중배엽-중 하나로부터 유래하였다면 세포는 "외배엽성", "내배엽성", 또는 "중배엽성"이다. 외배엽은 표피 및 신경계의 세포를 만드는 외층이다. 내배엽은 소화관 및 그것의 관련 기관의 안쪽을 만드는 내층이다. 중간층인 중배엽은 (심장, 신장, 중피 및 생식선을 포함하지만 이에 한정되지 않는) 몇몇 기관, 연결조직 (예를 들어 뼈, 근육, 힘줄), 및 혈 세포가 된다.
용어 "배지" "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 호환적으로 사용된다. 이 용어는 포유동물 세포가 배양물 내에서 성장하는 수성 미세환경을 지칭한다. 배지는 생리학적, 영양학적, 및 호르몬적 환경을 포함한다.
배지내 혈청의 부피백분률이 항원성 부위 또는 세포 표면 상의 항체결합부위를 피복하지 않으면, 세포 배양 배지는 "본질적으로 무혈청"이다. "본질적으로 무혈청"은 세포 배양 배지가 (부피로) 약 50 % 미만의 혈청, 바람직하게는 약 25 % 미만, 더 바람직하게는 약 5 % 미만의 혈청, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 % 미만의 혈청을 포함할 때 일반적으로 적용된다.
항원성 부위 또는 항체 결합부위가 결합되거나 항체나 항체의 부분에 의한 항원성 인식에 대하여 이용가능하지 않도록, 췌장 기원 세포 표면의 적어도 약 75 %, 더 바람직하게는 췌장 기원 세표 표면의 적어도 약 90 %, 그리고 더 바람직하게는 췌장 기원 세포 표면의 적어도 약 95 %가 세포표면에 결합하는 혈청으로부터 유래한 혈청 생물학적 분자를 가지지 않는 경우, 세포 표면은 "혈청 생물학적분자가 실질적으로 없는" 것이다. 세포의 크기를 측정하거나, 현미경 또는 유동세포계측법에 의하여 세포표면을 결정할 수 있다. 예를 들어, 유동세포계측에서 조정을 위하여 다양한 기지 크기의 합성 비드가 일반적으로 사용된다. 소량의 조정된 비드를 췌장 기원 세포와 혼합하고 결과의 집단을 유동세포계측에 의하여 분석한다. 그 후 췌장 기원 세포를 조정된 비드의 크기와 비교한다. 비드의 크기가 기지이므로 세포 표면 양의 조정이 달성될 수 있다.
여기에서 사용될 때, "실질적으로 순수한" 췌장 기원 세포 집단은 적어도 약 85 %, 바람직하게는 적어도 약 90 %, 및 더 바람직하게는 약 95 % 또는 그 이상의 췌장 기원 세포를 포함하는 세포집단이다.
"특정 배지", "기초 세포-유지 배지", "영양 배지" 및 "기초 영양 배지"는 여기에서 호환적으로 사용되고, 배지의 성분을 알 수 있도록 세포의 생존 및/또는 성장에 필수적인 영양분과 호르몬 요구량을 포함하는 배지를 지칭한다. 전통적으로, 특정 배지는 성장 및/또는 생존에 필수적인 영양 및 성장 인자의 첨가에 의하여 조제되었다. 전형적으로, 특정배지는 하나 이상의 다음 카테고리: a) 모든 필수 아미노산과 보통 기본 20 아미노산 세트 + 시스테인; b) 보통 포도당 같은 탄수화물의 형태로서의 에너지원 c) 낮은 농도로 요구되는 비타민 및/또는 다른 유기 화합물 d) 자유 지방산; 및 e) 전형적으로 보통 마이크로몰 범위인 매우 낮은 농도로 요구되는 무기 화합물 또는 천연적으로 존재하는 원소로 정의되는 미량원소로부터의 적어도 한가지 성분을 제공한다. 특정 배지는 또한 선택적으로 다음: a) 하나 이상의 분열촉진제; b) 염과 완충액, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 및 인산염; c) 뉴클레오시드와 염기, 예를 들어, 아데노신과 티미딘, 하이포잔틴; 및 d) 단백질과 조직 가수분해물로부터의 하나 이상의 성분이 보충된다.
여기에서 사용될 때, "조건배지"는 췌장 상피 기원 세포가 성장한, 온전한 세포가 없는 배양배지 지칭한다. 영양 배지에서 성장된 췌장 세포는 췌장 기원 세포의 분화전의 사전-존재 시기의 연속적 생존, 성장 및 유지를 촉진하는 인자를 배출한다. 조건 배지는 세포 펠릿을 재구성하는데 사용되거나 배양 플레이트에 이미 존재하는 세포에 첨가된다. 조건 배지는 또한 췌장 세포를 기르는데 단독 또는 영양배지를 보충하여 사용된다. 조건 배지는 영양배지로부터 유래하고, 영양배지는 여기에서 기재될 때 본질적으로 무혈청이므로, 조건 배지 또한 본질적으로 무혈청이다.
"표준 배양 조건"은 세포가 위치할 조직 배양을 위하여 고안된 배양기내의 물리화학적 조건을 지칭한다. 표준 배양 조건은 약 섭씨 37 도 및 가습과 함께 약5 % CO2를 함유한다. 모든 조직 배양 기술 및 장비는 멸균 조건하에서 수행되어야 한다. 조직 배양 용기는 세포의 배양에 이용될 수 있는 모든 형태의 용기를 지칭한다. 이에 제한되지 않는 예로 플라스크와 플레이트가 포함된다.
"분열유발 작용제" 또는 "성장 인자"는 포유동물의 체세포분열을 자극시키는 분자이다. 일반적으로, 분열유발 작용제 또는 성장 인자는 세포 배양에 있어서 포유동물 세포의 생존과 증식을 증강시키는 폴리펩티드다. 분열유발 폴리펩티드는 그것이 생산되는 (예로 이것은 분자의 내인성 공급원으로부터 분리되거나 재조합 기술을 포함한 합성 기술에 의해 생산될 수 있다)방법 또는 변체 및 그것의 돌연변이체 (아래 정의 참조)와는 상관없이 "자연적" 또는 " 자연적 서열을 갖는" (즉, 선천적으로 생기는 성장 인자의 아미노산 서열을 갖는)폴리펩티드가 될 수 있다. 이에 제한되지 않는 예는 erbB 수용체 가족중 하나 또는 그 이상의 구성원의 활성화제; 배양 배지내에서 cAMP의 농도를 상승시키는 작용제(예로 포스콜린, 콜레라 독소, cAMP와 그의 유사체); 신경 세포 유착 분자(N-CAM)같은 유착 분자, 라미닌 또는 피브로넥틴; 프로게스테론; 골-유래 향신경성 췌장(BDNF) 및 섬모 향신경성 인자(CNTF)같은 향신경성 인자; 뉴로트로핀-3, -4, -5 및 -6; 혈소판-유래 성장 인자(PDGF); 산성 FGF(aFGF)와 염기성 FGF(bFGF) 같은 섬유모세포 성장 인자; 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF); TGF-α 및 TGF-β같은 형질전환 성장 인자(TGF); IGF-I 및 IGF-II를 포함하는 인슐린-유사 성장 인자; 에스트로겐, 테스토스테론, 스테로이드 호르몬, 인슐린 및 Mather, J.P. and Roberts, P.E.(1998) "Introduction toCell and Tissue Culture", Plenum Press, New York의 138-139쪽 표 8.2에 나열된 모든 분열유발물질과 같은 호르몬을 포함한다.
"췌장 기원 세포 응집체", "췌장 기원 세포 구상체" 및 "췌장 세포 집괴"는 호환적으로 사용되고, 거의 공과 유사한 3차원적 구조를 형성할 수 있는 췌장 기원 세포 다수의 덩어리를 지칭한다.
"이식 재조합체"은 여기에서 사용될 때 중간엽조직과 함께 위치한 췌장 기원 세포 응집체의 조합된 단위를 지칭한다. 중간엽조직은 췌장 또는 비췌장 기원일 수 있다. 중간엽조직은 이식 수용체에 대하여 이종인 종으로부터 유래할 수 있다. 중간엽조직은 또한 췌장 기원 세포의 공급원과 이종인 종으로부터 유래할 수 있다. 이식 재조합체는 기질, 바람직하게는 연질의, 생물학적 기질(예를 들어 한천) 상에서 1 시간 내지 72 시간 동안, 더 바람직하게는 약 6 시간 내지 24 시간 동안, 더욱 더 바람직하게는 약 8 내지 16 시간의 배양시간으로 하룻밤 동안 배양될 수 있다.
"혈청"은 여기에서 사용될 때 혈을 응고되도록 허용한 후 남는 포유동물 혈의 유체상을 지칭한다.
"혈청 생물학적분자"는 여기에서 사용될 때 혈청에서 발견되는 생물학적 조성물을 지칭한다. 예는 알부민, α-글로불린, β-글로불린 및 γ-글로불린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 혈청 생물학적분자는 천연적으로 혈청에서 발견되거나 혈청의 처리나 취급으로부터 유래하는, 전체 또는 부분적인 생물학적 조성물을 포함할 수 있다.
"포유 동물" 또는 "포유동물의"는 인간, 생쥐, 쥐, 토끼, 유인원, 스포츠 동물, 및 애완동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항온척추동물을 지칭한다.
췌장 기원 세포의 분리와 유지
본 발명의 췌장 기원 세포는 인간 태아 췌장 조직으로부터 분리된다. 태아의 연령은 약 제 6 주 내지 제 40 주, 바람직하게는 약 제 8 주 내지 제 26 주, 및 더 바람직하게는 약 제 12 주 내지 제 22 주이다. 췌장 조직은 육안해부학, 외견 및 태아내 위치에 의하여 식별될 수 있다. 췌장을 구별시키는 육안 해부학과 외견상의 여러 특징은: 신장된 소엽상의 복막후방 분비샘, 캡슐의 결여, 및 십이지장의 오목한 면으로부터 비장으로의 신장이다. 췌장은 십이지장 오목면의 평평한 췌두부 또는 두부, 복부를 가로질러 확장하는 신장된 삼면의 몸통, 그리고 비장과 접촉한 꼬리로 구성된다. 일단 식별되면, 태아 췌장 조직은 미세절단된다. 미세절단의 목적은 결합 조직과 지방, 막구조 등과 같은 비-췌장 조직으로부터 상피 세포를 함유한 구조를 분리하거나 세포 각각을 분리하는 것이다. 미세절단의, 이에 제한되지 않는 예는 기계적 절단력을 부여하는 장치(즉, 호모지나이져, 막자사발, 블렌더 등), 절단 또는 파열을 부여하는 장치(즉, 외과용 매스, 주사기, 포르셉, 등) 또는 초음파장치를 포함한다. 대안으로, 태아 췌장 조직을 미세절단하는 다른 방법은 효소 처리의 사용이다. 조직을 미세절단하기 위하여 사용되는 다양한 효소 처리가 당업계 주지이다. 한 방법은 췌장 조직으로부터 분리된 세포의 생존성을 유지할 완충 배지에서 부분적으로 절단된 췌장 조직을 분해하기 위한 콜라게나제-디스파제의 사용을 포함한다. 적어도 약 0.5mg/ml 콜라게나제/디스파제, 더 적당하게는 적어도 약 1mg/ml, 더욱 더 적당하게는 적어도 약 5mg/ml이 사용된다. 효소의 양은 태아의 연령 및 췌장 조직의 질량에 따라 다를 것이다. 한 구체예에서, 약 14주 내지 약 22주 사이의 태아유래의 췌장 조직을 5mg/ml의 콜라게나제-디스파제로 분해하였다. 췌장 기원 세포의 생존을 촉진시키는 범위로 액체의 pH를 유지시키기 위하여 및 효소 분해가 일어날 수 있는 추가적 부피의 액체를 제공하기 위하여, 광범위한 기초 세포-유지 배지가 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않는 예는 F12/DMEM, Ham's F10 (Sigma), CMRL-1066, 최소 필수 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma), 및 Iscove's Modified Eagle's Medium (IMEM)를 포함한다. 또한, Ham 및 Wallace (1979)Meth. Enz., 58:44, Barnes 및 Sato (1980) Anal. Biochem., 102:255, 또는 Mather, J. P. 및 Roberts, P. E. (1998) "Introduction to Cell and Tissue Culture", Plenum Press, New York에 기재된 기초 영양 배지 또한 사용될 수 있다. 조직을 분해할 수 있는 다른 효소의 예는 중성 프로티아제, 트립신, 키모트립신, 및 써모리신을 포함하는 세핀 프로티아제, 엘라스타제 및 콜라게나제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구체예에서, DNA를 분해하는 효소는 자유 DNA에 의한 조직의 응집을 막기 위해 DNA를 작은 조각으로 자르는데 사용된다. 태아 췌장 조직의 효소 처리는 다양한 양의 세포 수득 결과를 나타낸다. 어떤 세포는 단일 세포로 현탁되고, 다른것은 세포 응집체를 형성한다. 고형 조직 물질과 결합하지 않은 세포는 농도 구배의 사용에 의하여 각각의 세포로부터 또는 고형 조직 물질이나 찌꺼기로부터 분리될 수 있다. 농도 구배를 만드는데 이용되는 구성물은, 혈청(소 혈청 알부민 또는BSA), 오발부민, 비이온성 자당의 합성 중합체(FicollTM), 아교질의 폴리비닐피로리돈-피복 무수규소(PercollTM), 폴리비닐피로리돈 또는 PVP, 및 메틸셀룰로오즈를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 췌장 조직을 분해하는데 사용되는 효소를 중성화시킬수 있는 농도 구배가 사용되었다. 이러한 농도 구배의 한 예가 BSA이다. 사용된 BSA의 양은 50% 부피대 부피 비율이고, 더 적당하게는 약 25%, 더 적당하게는 약 10%, 더욱 적당하게는 적어도 약 5%이다. 제거되어야 할 찌꺼기의 총량은 여러 인자들에 기인하는데, 분해의 정도 또는 췌장 조직에 적용된 기계적 분해력 같은 것이 그것이다. 몇몇 경우에 있어서, 하나의 농도 구배로 찌꺼기(예로, 간엽 조직, 지방 입자, 또는 파괴된 세포막)를 제거하기에 충분하다. 다른 경우에 있어서, 하나 이상의 농도 구배를 적용하는 것이 필요할 것이다. 원하는 산물은 상대적으로 순수한 난소 중피 세포 응집체의 집단이다.
췌장 세포는 기초 세포-유지 배지에 위치시킨다. 다양한 기초 세포-유지 배지가 사용하기 위하여 구입가능하다. 예는 Ham's F12 배지, RPMI-1640, 및 CMRL-1066를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 췌장 기원 세포 생존과 성장을 촉진시키는 더 최적 조건을 위하여, 기초 배지를 보충하기 위한 다양한 영양소가 첨가된다. 예는 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자. 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 셀레늄, 트리요오도티로닌, 프로게스테론, 하이드로콜티손, 포스콜린, 헤레굴린, 아프로티닌, 소 뇌하수체 추출물 및 겐타마이신을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 바람직한 구체예에서 다음 양의 영양소: 적어도 약 1 ㎍/ml 인슐린 및 약 100㎍/ml를 넘지 않는 인슐린, 더 바람직하게는 약 10 ㎍/ml 인슐린; 적어도 약 1 ㎍/ml 트랜스페린 및 약 100 ㎍/ml을 넘지 않는 트랜스페린, 바람직하게는 약 10 ㎍/ml 트랜스페린; 적어도 약 1 ng/ml 상피 성장 인자 및 약 100 ng/ml를 넘지않는 상피 성장 인자, 더 바람직하게는 약 5 ng/ml 상피 성장 인자; 적어도 약 1x10-8M 에탄올아민 및 1x10-2M을 넘지 않는 에탄올아민, 더 바람직하게는 약 1x10-6M 에탄올아민; 적어도 1x10-9M 포스포에탄올아민 및 약 1x10-1M을 넘지 않는 포스포에탄올아민, 더 바람직하게는 약 1x10-6M 포스포에탄올아민; 적어도 약 5x10-12M 셀레늄 및 약 1x10-6M을 넘지 않는 셀레늄, 더 바람직하게는 약 2.5x10-8M 셀레늄; 적어도 약 1x10-15M 트리요오도티로닌 및 약 5x10-1M을 넘지 않는 트리요오도티로닌, 더 바람직하게는 약 1x10-12M 트리요오도티로닌; 적어도 약 1x10-12M 프로게스테론 및 약 1x10-1M을 넘지 않는 프로게스테론, 더 바람직하게는 약 1x10-9M 프로게스테론; 적어도 약 1x10-15M 하이드로코티손 및 약 1x10-1M을 넘지 않는 하이드로코티손, 더 바람직하게는 약 1x10-9M 하이드로코티손; 적어도 약 0.001uM 포스콜린 및 약 50uM을 넘지 않는 포스콜린, 더 바람직하게는 약 1uM 포스콜린; 적어도 약 0.1nM 헤레굴린 및 약 100nM을 넘지 않는 헤레굴린, 더 바람직하게는 약 10nM헤레굴린; 적어도 약 1㎍/ml 아프로티닌 및 약 100㎍/ml을 넘지 않는 아프로티닌, 더 바람직하게는 약 25㎍/ml아프로티닌; 적어도 약 1㎍/ml 소 뇌하수체 추출물 및 약 500㎍/ml을 넘지 않는 소 뇌하수체 추출물, 더 바람직하게는 약 75㎍/ml 소 뇌하수체 추출물; 적어도 약 1㎍/ml 겐타마이신 및 약 1mg/ml을 넘지 않는 겐타마이신, 더 바람직하게는 약 100㎍/ml 겐타마이신이 췌장 기원 세포 생존과 성장을 촉진시키는데 사용된다. 췌장 기원 세포는 요구되는 세포의 물리적 적응 형태에 따라 다른 기질에서 성장될 수 있다. 이에 제한되지 않는, 사용되는 물질의 예는 피브리노넥틴, 라미닌, 콜라겐, 폴리리신, 니트로셀룰로스, 나일론, 및 폴리테트라플로로에틸렌을 포함한다. 한 구체예에서, 췌장 기원 세포는 상기된 영양 배지 내에의 피브로넥틴-피복 조직 배양 플레이트 상에서 배양된다. 바람직한 영양 배지를 담은 피브리넥틴-피복 플레이트에서 배양될 때, 췌장 기원 세포는 세포 응집체를 형성한다. 더구나, 이러한 배양 조합은 원치 않는 간엽 세포와 췌장 기원 세포 응집체의 분리를 허용한다. 바람직한 구체예에서, 췌장 세포 응집체의 순수분리는 기초 배지로써 CMRL 1066을 사용한 바람직한 배지를 담은 피브로넥틴 플레이트에 췌장 기원 세포를 배양함으로써 손쉽게 이루어진다. 췌장 기원 세포는 다른 형태의 세포(중엽 세포)가 피브로넥틴 피복에 부착하는 반면, 비부착되는 크고 둥근 세포 집괴를 형성한다. 췌장 기원 세포의 집괴는 그 후 수집되고 계대 배양과 증식을 위하여 다른 조직 배양 용기로 옮겨진다. 더 많은 췌장 기원 세포 집괴의 증식이 요구될 때, 조직 배양 용기를 피브로넥틴으로 피복시키고, 췌장 기원 세포를 기조 배치로써 CMRL 1066을 이용한 전술된 바람직한 배지에서 배양한다. 다른 구체예에서, 췌장 기원 세포는 기초 배지로써 F12/DMEM을 이용한 바람직한 영양 배지를 담은 콜라겐-피복 조직 배양 용기에서 배양된다. 이 구체예에서 췌장 기원 세포는 단일층을 형성한다.
췌장 기원 세포에 대한 영양공급 빈도는 하루 한 차례 또는 격일에 한 차례이다. 한 구체예에서 췌장 기원 세포는 오래된 영양 배지 전체를 신선한 영양 배지와 교체시킴으로써 영양공급할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 췌장 기원 세포는 그 세포가 배양되었던 조건배지로 영양공급될 수 있다. 많은 수의 세포를 얻기 위한 췌장 기원 세포의 계대배양은 집괴 형태(피브로넥틴에서 배양) 또는 단일층 형태(콜라겐에서 배양)의 췌장 기원 세포를 취하여 여러개의 조직 배양 용기로 세포 집단을 분할함으로써 이룩될 수 있다. 영양 배지는 그 후 원래의 조직 배양 용기에서보다 낮은 농도의 췌장 기원 세포를 만들기 위해 각각의 조직 배양 용기에 첨가된다. 첨가된 영양 배지는 요구되는 췌장 기원 세포의 배치 형태에 의존한다. 단일층 배치가 요구될 때는, 콜라겐으로 피복된 조직 배양 용기와 더불어 여기에 개시된 바람직한 영양배지에 F12/DMEM을 기초 배지로 사용한다. 췌장 세포 집괴가 요구될 때는, 피브로넥틴으로 피복된 조직 배양 용기와 더불어 여기에 개시된 바람직한 영양 배지에 CMRL 1066을 기초 배지로 사용한다. 청구된 췌장 기원 세포가 본 발명에서 고유한 것이고, 이들 세포에 특이한 인자를 분비할 것이므로, 췌장 기원 세포 유래의 조건 배지 또한 고유하다. 본 발명에서 췌장 기원 세포는 피브로넥틱 조직 배양 플레이트내의 상기된 바람직한 영양 배지에서 배양될 때 응집체를 형성한다. 기질이 콜라겐-피복 조직 배양 플레이트일 때에는, 췌장 기원 세포는 부착된 간질성 단일층을 형성한다. 조건 배지의 첨가는 췌장 기원 세포에 있어서 더 광대한 생명력을 증진시킨다. 바람직한 양의 조건 배지는 전체 배지 부피의 최소한 약 1% 내지 최소한 약 25%이다. 더욱 바람직한 조건 배지의 양은 전체 배지 부피의 약 15%이다. 췌장 기원 세포의 생존과 성장을 증진시키기에 바람직한 영양 공급 빈도는 일주일에 한차례, 더 바람직하게는 일주일에 두 차례, 가장 바람직하게는 격일에 한 차례씩이다. 본 발명의 췌장 기원 세포는 분열 능력을 보유한 채, 그리고 이들 췌장 기원 세포들이 최종적으로 분화된 형태인 선포, 섬, 또는 관상 세포로 분화됨 없이 여러 차례 계대될 수 있다.
췌장 기원 세포의 특성결정
여기에 개시된 방식으로 분리된 본 발명의 췌장 기원 세포 집단은 몇가지 뚜렷한 특징을 가진다. 첫째, 췌장 기원 세포는 "사전-결정 췌장"로 기재될 수 있는 시기에 있다. 소화관-특이적 기원 세포중 몇몇은 췌장 세포로 되도록 사전-결정되었다. 여기에 청구된 췌장 기원 세포의 집단(도 8)이 이런 발생 단계이다. 본 발명의 췌장 기원 세포는 외분비 또는 내분비 세포 어느 것으로도 될 수 있는 능력을 가진다. 내분비와 외분비 세포는, 여기 이용된 대로, 그들의 분비에 의해 식별된다. 섬-α와 섬-β같은 내분비 세포는 각각 글루카곤과 인슐린을 분비한다. 선포 세포같은 외분비 세포는 트립시노겐, α-아밀라아제 및 리파아제 같은 다양한 종류의 췌장 소화액을 분비한다.
췌장 기원 세포의 식별은 형태학 또는 특이적 마커 또는 두 기술 모두의 조합에 의하여 달성된다. 여기 개시된 바, 췌장 기원 세포는 외견상으로 원형이나 낭포-유사 형태를 이룰 수 있고 또는 췌장 기원 세포가 배양된 배양 조건에 따라서 단일층을 형성하면서 신장될 수 있다. 분화된 췌장 기원 세포의 식별은 또한 형태학에 의해서 이룰 수 있다. 섬 세포의 형태학는 난형으로, 약 75㎛ 내지 175㎛의 크기(장축)이다. 섬 세포는 췌장의 꼬리 말단 좀더 앞쪽 십이지장강에서 먼쪽에 위치하는 경향이 있다. 섬 세포를 검출할 수 있는 마커는 섬-α세포를 위한 글루카곤, 섬-β세포를 위한 인슐린, 섬-δ세포를 위한 소마토스타틴 및 섬-PP 세포를 위한 췌장 폴리펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 관상 세포를 검출하는데 이용될 수 있는 마커는 사이토케라틴(CK)7, CK 8, CK 18, CK 19, 뮤신 MUC1, 카르보닉 안하이드라제 II 및 카르보하이드레이트 항체 19.9(시알일-Lewis-a)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 관상 세포의 형태학는 작고, 둥글며 세포 직경 약 10㎛이고, 단단히 밀집된 형태로 나타나며, 입방형의 상피이다. 선포 세포의 형태학는 관상 세포보다 크고, 선포 세포 내에 효소원 과립을 갖는다. 선포 세포를 식별하는데 이용될 수 있는 마커는 카르복시펩티다아제 A와 아밀라아제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Ki67 또는 PCNA는 췌장 기원 세포의 증식을 결정하는데 이용될 수 있는 마커이다. 최종적으로 분화된 외분비 또는 내분비 세포는 본질적으로 분열하지 않는 반면 사전-결정된 췌장 기원 세포는 여전히 분열이 가능하다. Ki67 또는 PCNA로 염색한 것은 분석하에 있는 췌장 세포의 증식 상태를 결정할 수 있다.
본 발명의 췌장 기원 세포는 무혈청 배지에서 그들의 사전-존재하는 분화 전 상태로 유지된다. 기초 세포-유지 배지 또는 여기 개시된 바람직한 영양 배지 또는 조건 배지가 시험관내에서 췌장 기원 세포를 배양하는데 이용된다. 조직 배양 플레이트 상의 다른 형태의 기질이 췌장 기원 세포의 응집체나 단일층을 얻는데 사용될수 있다. 콜라겐으로 피복된 조직 배양 플레이트를 사용하면 췌장 기원 세포의 단일층을 얻는 반면 여기 개시된 바람직한 영양배지와 피크로넥틴을 함께 사용하면 췌장 기원 세포의 응집체를 얻는다.
본 발명의 췌장 기원 세포는 여기 개시된 바람직한 무혈청 영양 배지에서 수차례 계대할 수 있는 능력을 가진다. 각 계대간 복수분화가능성은 유지되며, 계대후 어느 시점에서도 본 발명의 췌장 기원 세포는 기능하는 외분비 또는 내분비 세포로 분화할 수 있다. 더구나, 각 계대 후 어느 시점에서도, 췌장 기원 세포는 세포 치료법, 생물학적 검정, 인간 췌장 모델의 확립 또는 여기 개시된 신약 발명 및 또는 개발을 위한 면역원으로 이용될 수 있다.
본 발명의 췌장 기원 세포의 또 다른 특성은 수용체 포유동물의 신장 피막하로 이식되어도 외분비 또는 내분비 세포로 분화될 수 있는 능력이다. 이식되기 전, 췌장 기원 세포는 아밀라아제나 리파아제 같은 소화효소를 만들지 않고, 소화 효소에 양성적으로 염색되지 않을 것이다. 여기 개시한 대로, 췌장 기원 세포는 췌장 기원 세포 응집체나 단일층 세포로 성장할 수 있으며 그 후, 간엽 조직과 조합되어 수용체 포유동물의 신장 피막하에 위치되었다. 바람직하게는, 인간 췌장 기원 세포 응집체를 래트 요생식 중엽 조직과 결합하여 수용체 포유동물의 신장 피막 아래 위치시킨다. 이식편의 부분은 췌장 세포을 식별하기 위한 마커, 형태학, 또는 이들의 조합을 이용하여 분석하기 위해 분리된다.
췌장 기원 세포의 이 집단을 규명할 수 있는, 단일클론 또는 폴리클론 항체는 항-사이토케라틴 19, 항-암종배아성 항체(CEA), 항-카르보닉 안하이드라제 II,항-낭성 섬유증 막간 전도성 조절자(CFTR)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
췌장 기원 세포의 사용
면역원으로서 용도
췌장 기원 세포의 한 용도는 면역원으로서이다. 본 발명에서 개시된 바와 같이, 고유한 무혈청 배양 조건은 췌장 기원 세포의 세포 표면을, 표면에 결합하는 혈청 또는 혈청 생물학적분자가 없는 상태로 유지시킨다. 개시된 무혈청 분리와 배양기술을 사용함으로써, 혈청 생물학적분자에 의한 결합에 의하여 "피복된" 항원성 부위의 잠재적 문제점이 회피된다. 따라서, 혈청을 함유하는 배양조건을 사용할 때, 피복된, 새롭게 이용가능한 항원에 대하여 항체군이 제조된다.
여기에 개시된 방법으로 분리되고 배양된 췌장 기원 세포는 이종 수용체에게로 투여되는 면역원으로서 사용될 수 있다. 면역원으로서 췌장 기원 세포의 투여는 몇가지 방법에 의하여 달성될 수 있다. 이종 수용체에서 면역원으로서 췌장 기원 세포를 투여하는 방법은: 면역화, 도포 또는 소파 기구 같은 직접 접촉에 의한 막으로의 투여, 에어로졸에 의한 점막에의 투여, 및 경구투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업계 주지인 바와 같이, 면역화는 수동 또는 능동 면역화일 수 있다. 면역화의 방법은 복강내 주사, 피하주사, 국소주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는 상이한 경로를 통하여 수행될 수 있다. 면역화 피험체는 마우스 같은 포유동물을 포함한다. 면역화의 경로와 일정은 예를 들어, 수주동안 매주 한 차례 발바닥에 면역원을 주사함과 같은 일반적으로 항체자극과 생산에 대한 확립된 종래 기술을 따른다. 본 구체예에서 마우스가 채용되지만, 인간 또는 그것으로부터의 항체 생산 세포를 포함한 어떤 포유동물 피험체도 본 발명의 방법에 따라 조작되어 포유동물 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기초로서 역할을 할 수 있다. 전형적으로, 마우스를 면역원성 양의 췌장 기원 세포로 복강내 또는 대안의 부위(즉, 발바닥, 꼬리 등)에 접종시키고 유사한 양의 면역원을 추가접종시킨다. 대안에서, 비-생물학적 막 기질상에서 성장한 세포를 숙주 포유동물내로 임상적으로 복강내 이식시킨다. 림포이드 세포, 바람직하게는 래트 유래 비장 림포이드 세포를 최종 추가접종 수일 후에 채취하고 그것으로부터 세포 현탁물을 융합 용도로 제조한다.
하이브리도마는 Buck, D. W., et al., (1982) In Vitro, 18:377-381에 의하여 변형된 Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 의 일반적 체세포 혼성화 기술을 사용하여 림프구와 불사화 골수종 세포로부터 제작된다. X63-Ag8.653과 Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA로부터의 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 구입가능한 골수종 계통이 혼성화에 사용된다. 기술은 폴리에틸렌 글리콜 같은 융합제 또는 당업계 숙련자에게 주지인 전기적 수단을 사용하여 골수종 세포와 림포이드 세포를 융합하는 것을 포함한다. 융합 후, 세포를 융합배지로부터 분리하고, 비혼성화 모세포를 제거하기 위하여 HAT 배지 같은 선택성장배지에서 성장시킨다. 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하기 위하여 여기에서 기재된 어떤 배지도 사용될 수 있다. 세포 융합 기술의 다른 대안으로서, EBV 불사화 B 세포를 사용하여 대상 발명의 단일클론 항체를 제작한다. 만일 바람직하다면, 하이브리도마는 확장되고 서브클로닝되고 상청액은 종래 면역검정 방법(예를 들어, 방사성면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광면역검정)에 의하여 항-면역원 활성에 대하여 검정된다.
이와 같은 항체를 생산하는 하이브리도마는 알려진 방법을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 성장된다. 단일클론 항체는 바람직하다면 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과 같은 종래 면역글로불린 정제 방법에 의하여 배양배지 또는 체액으로부터 분리된다. 바람직하지 않은 활성이 존재하면, 이는 예를 들어 제조물을 고상에 부착된 면역원으로부터 제조된 흡착물에 전개시키고 바람직한 항체를 면역원으로부터 용출 또는 배출함으로써 제거할 수 있다.
이와 같은 방식으로, 본 발명의 췌장 기원 세포를 사용하여 췌장 기원 세포에 특이적인 세포 표면 항원에 대한 신규 항체군을 제조할 수 있다. 일단 여기 개시된 방법에 의하여 췌장 기원 세포 상의 세포표면 항원에 대한 단일클론 항체가 제조되면, 항체는 몇가지 용도를 가진다. 항체는 재조합 항체 또는 인간화된 항체 제조의 목적으로 서열 결정 및 클로닝된다. 췌장 기원 세포-특이적 항체의 다른 용도는 생물학적 시험 및 정제(즉, 예를 들어 유동세포 계측 및 항체 선별같은 방법에 의한 췌장 기원 세포의 분리), 치료학적 용도(즉, 표적 세포에 대한 항체의 결합에 의한 세포의 성장 촉진 또는 정지 또는 표적 세포에 대한 항체의 결합에 의한 세포체의 성장 촉진 또는 정지), 임상적 진단, 및 생물학적 마커(즉, 다른 췌장 또는 비-췌장 세포의 식별)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
면역원으로서의 다른 용도는 이종 수용체에서 종합적 면역 반응을 조절하는 것이다. 당업계에서 잘 증명된 바와 같이, 이종 수용체 내로 도입된 세포 또는 기관 같은 외부 물질은 다양한 면역반응을 유도한다. 면역반응은 (예를 들어 기관 이식에서) 거부반응, (예를 들어 교차-초회감작하는) T 세포 활성화, 무감작, 또는 면역관용의 형태일 수 있다. 종합적 면역 반응은 전신성 또는 국소적일 수 있다. 예를 들어 생식샘 영역에서의 국소적 면역 반응이 바람직한 경우, 췌장 기원 세포 같은 면역원이 유효량으로 생식샘 영역 내로 도입된다. 유효량은 췌장 기원 세포의 증가되는 양이 이종 수용체로 도입되고 이어지는 면역반응을 모니터링하는 단계적 방식으로 구하여질 수 있다. ELISA, 증식검정, 세포표면 마커로의 유동세포계측, 및 면역조직화학을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 방법에 의하여 종합적 면역 반응(예를 들어, 항체 생산, 사이토카인 생산, T 세포 증식, 무감작, 면역관용 등)이 모니터링된다.
췌장 기원 세포의 신약 발견을 위한 용도
췌장 기원 세포의 다른 용도는 신약 발견과 관련된다. 사전-결정 분화다능성 췌장 기원 세포 집단은 개시된 방법으로 분리되고 배양되지 않았으므로, 췌장 기원 세포 집단은 종래에는 발견되거나 특성결정되지 않은 단백질을 분비한다. 혈청을 사용한 종래의 배양기술은 단백질의 분비를 저해한다. 그렇지 않으면, 단백질은 분비되고 혈청 생물학적분자와 상호작용하면서 기능, 입체구조, 또는 활성이 변화한다. 췌장 기원 세포에 의하여 분비되는 단백질은 혈청 생물학적분자로부터의 방해가 최소화 되고, 따라서 생리적 및 형태학적으로 더 정확하다. 그러므로, 췌장 기원 세포에 의하여 분비되는 단백질은 약물 개발에 대한 표적으로 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 약물은 췌장 기원 세포상의 표적 특이적 단백질에 생체내 표적화하도록 제작될 수 있다. 약물의 결합은 췌장 기원 세포가 섬 세포 같은 하부-췌장분화전능성분화전능성하는 것을 촉진시킨다. 이런 접근법은 섬 세포의 신생이 바람직한 경우에, 예를 들어 당뇨의 치료의 경우 유용하다. 또 다른 구체예에서, 췌장 기원 세포의 조절 단백질에 특이적인 약물은 특정 형태의 세포 성장을 정지시킬 수 있는데, 예로 선포 세포가 관상 세포에 의해 대치되는 곳에서 생기는 낭성 섬유증의 경우가 있다. 또 다른 구체예에서, 약물은 근간 세포나 치명적인 항원을 발현하는 암 세포의 성장에 저해제가 될 수 있다. 이들 단백질 중 어떤 것도 치료적 항체, 단백질, 또는 작은 분자 약물을 개발하는 표적으로 이용될 수 있다.
췌장 기원 세포의 세포 치료를 위한 용도
다른 용도에서, 췌장 기원 세포주는 세포치료에서 사용될 수 있다. 췌장 기원 세포와 그것으로부터 유래한 세포의 이식은 이와 같은 세포치료의 한 예이다. 섬세포 또는 선포 세포같은 상이한 형태의 췌장 세포들이 그들 각각의 인슐린이나 글루카곤의 분비 기능을 수행할 수 없을 때, 본 발명의 췌장 기원 세포는 복수분화 가능성이고 기능적인 외분비 및 내분비 세포로 분화할 수 있으므로 췌장 기원 세포의 이식은 치료법을 제공한다. 이 용도를 수행하기 위하여, 개시된 방법을 사용하여 췌장 기원 세포를 분리하고 무혈청, 영양-특정 배지에서 배양한다. 췌장 기원 세포는, 췌장 기원 세포 응집체를 얻기 위하여 피브로넥틴-피복된 조직 배양 플레이트 상에서 성장시킨다. 췌장 기원 세포 응집체는 표준 배양 조건하에서 약 12시간 내지 1일, 더 바람직하게는 약 1일 내지 5일, 더욱 더 바람직하게는 약 3일간 배양한다. 췌장 세포 응집체를 그 후 수용체에 투여하고 분화하도록 둔다. 다른 대안에서, 췌장 세포 응집체는, 췌장 세포가 하나 이상의 유전자로 트랜스펙션되고,송달 장치에 봉입된 후 수용체에 투여되는 유전자 요법의 세포성 담체로서 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 췌장 세포 응집체는 신장 피막하에 위치되어 선포, 관상 또는 섬 세포로 분화하도록 허용된다. 다른 구체예에서, 췌장 세포 응집체는 면역계 반응을 제한하기 위하여 세포를 함유하고 다른 세포의 접근을 제한하는 장치(즉, Theracyte)에서 사용된다.
인간 조직 모델을 제작하기 위한 췌장 기원 세포의 용도
췌장 기원 세포에 다른 용도는 비-인간 포유동물에서 인간 조직 모델을 제작하는 것이다. 췌장 기원 세포 응집체는 중간엽조직의 정단상에 위치시켜 이식편 재조합체를 형성시킨다. 이식편 재조합체를 형성하기 위해, 약 1 내지 15 췌장 세포 구상체, 더 바람직하게는 약 5 내지 8 췌장 세포 구상체가 간엽 조직의 정단에 위치된다. 중간엽조직은 췌장 또는 비췌장 조직이고, 췌장 기원 세포가 분리되는 상이한 종으로부터 유래한다. 유효한 실시예에서, 인간 췌장 기원 세포를 래트의 간엽 정낭 조직의 정점상에 위치시켜 이식편 재조합체를 형성시킨다. 당업계 숙련자는 먼저 여기에서 개시된 방법을 사용하여 인간 췌장 기원 세포를 분리한 후 상이한 기관으로부터의 중간엽조직을 조합하는 단계적 방식으로 최적 조합을 정한다. 몇몇 구체예에서, 췌장 기원 세포와 조합하여, 상이한 종, 예를 들어, 래트를 중간엽조직의 공급원으로 사용하였다. 이종 종의 사용은 분화된 췌장 세포의 정체를 확인하기 위하여 인간-특이적 마커의 사용을 가능케한다. 래트 중간엽조직이 사용되면 거짓 포지티브 가능성이 감소된다. 마찬가지로, 췌장 간엽 조직에 대하여 비뇨생식 간엽 조직을 사용하는 것은 분화된 췌장 세포의 식별에서 거짓 포지티브 가능성을 감소시킨다. 바람직한 구체예에서, 약 1 내지 12 췌장 기원 세포 구상체, 더욱 바람직하게는 약 5 내지8 췌장 기원 세포 구상체가 래트 정낭 간엽 조직의 정단에 위치되었다. 바람직하게는, 약 1x104내지 약 5x106의 간엽 세포가 이용된다. 더욱 바람직하게는, 약 2x105내지 약 5x105의 간엽 세포가 이용된다.간엽 조직상의 췌장 기원 세포 구상체로 구성된 이식편 재조합체는 그 후 신장 피막하, 지방 패드 내, 피하, 또는 췌장 기원 세포를 함유하지만 다른 세포들이 췌장 기원 세포로 접근하는 것을 제한하는 장치(즉, Theracyte)에 위치된다. 가능한 수용체 포유동물은 마우스와 래트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적으로 이식 조건에서는, 공여체 조직이 수용체 면역체계에 의하여 공격받기 쉽다. 이식편 거부반응을 완화하기 위하여, 몇가지 기술이 사용된다. 한 방법은 수용체를 치사량 이하의 방사선을 조사하여 이식편을 공격할 수 있는 면역세포를 파괴하는 것이다. 다른 방법은 수용체에게 사이클로스포린 또는 다른 T 세포 면역저하 약물을 수여하는 것이다. 마우스를 수용체 포유동물로 사용하는 경우, 이식편 거부반응을 완화하기 위한 다양한 방법이 가능하다. 이 같은 방법 중 하나는 면역결핍 (누드 또는 중증복합면역결핍 즉 SCID) 마우스의 사용이다. 유효한 실시예에서, 인간 췌장 기원 세포 구상체를 래트 비뇨생식 중간엽조직 상에 위치시키고 면역결핍 마우스의 신장 캡슐 하에 위치시켰다. 이식편 재조합체는 이식편을 수확하고 췌장 기원 세포 분화에 대하여 분석하기 전에, 수용체에서 약 1 주 내지 52 주 동안, 바람직하게는 약 5 주 내지 약 40 주 동안, 더욱 더 바람직하게는 약 6 중 내지 약 8 주 동안 유지되었다. 몇몇 경우에, 이식편의 작은 부분이 분석을 위하여 필요하였다. 섬 세포(즉, 인슐린, 글루카곤 등), 관상 세포(즉, CK 19등) 및 선포 세포(즉, 아밀라아제 등)에 특이적인 마커가 면역조직화학 분석에 사용된다. 외분비 및 내분비 기능을 위한 또다른 마커 세트가 인슐린과 글루카곤에 특이적인 마커 같은, 이식의 효율성을 분석하는데 또한 이용된다. 이들 마커는 독립적으로 또는 각각을 조합하여 사용될 수 있다. 더구나, 이들 마커의 하나 이상의 조합은 이식의 효율성을 결정하는 세포 형태학과의 조합에 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 인간 췌장 모델이 SCID(중증복합면역결핍) 마우스에서 제조될 수 있다. 이 인간 췌장 모델은 여기에 개시된 방법으로 분리되고 배양된 인간 췌장 기원 세포를 사용하고 이식편 재조합체를 제조하기 위하여 인간 췌장 기원 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 이식편 재조합체는 그후 마우스 신장 피막하에 위치된다. 신장 피막하 이식 후 약 1 내지 10 주, 바람직하게는 약 6 내지 8 주 후, 이식편 또는 그것의 부분이 수확되고 면역조직화학에 의하여 분석된다. 인슐린 또는 글루카곤과 같은 외분비 또는 내분비성 기능에 특이적인 마커는 조직 모델 시스템을 분석하는데 이용된다. 대안으로, 섬 세포(즉, PDX-1), 선포세포(즉, 아밀라아제), 관상 세포(즉, CK 19)과 같은 췌장 조직에 특이적인 마커가 이용된다. 췌장 기원 세포 분화의 결과를 평가할 수 있는 또 다른 방법은 형태학에 의한 것이다. 췌장 기원 세포는 작고 둥근 외형과, 약 10㎛의 세포 직경을 가지며, 고도로 응집된 원주 상피를 형성한다. 선포 세포는 샘꽈리를 형성하는 거대한 집괴의 모습을 같는다. 관상 세포는 작고 둥근 모습을 지니며, 약 40㎛의 세포 직경에 밀집된 입방형 원주 상피를 나타낸다. 섬 세포는 선포성 외분비 단위로 둘러싸인 상피성 섬의 모습을 갖는다. 더욱이, 형태학은 인슐린와 글루카곤의 기능적 마커 및 좀더 완전한 평가를 위한 특이적 세포의 세포 표면 마커와 조합된다. 재조합 조직은 그러므로 마우스에서 완전한 인간의 축소-췌장을 나타낸다. 이러한 인간 췌장 조직 모델은 I형 및 II형 당뇨병, 췌장염, 췌장암 그리고 다른 췌장 질환을 다루는 개발중인 약품 후보의 효능 및 독성을 평가하는데 이용될 수 있다. 그들은 또한 췌장 독성에 대한 어떤 약의 스크리닝에도 사용될 수 있다. 더 나아간 용도에서, 생산되는 인슐린이 이식편에서 오도록, 수용체 동물에서 외과적 또는 화학적(즉, 스트렙타조티신)으로 췌장 또는 섬-β 세포를 제거할 수도 있다.
생물학적검정에서 췌장 기원 세포의 사용
여기에서 개시된 췌장 기원 세포는 다양한 생물학적검정에서 사용될 수 있다. 한 용도에서, 췌장 기원 세포는 분화에 어떤 생물학적 인자가 요구되는지를 결정하는데 사용된다. 상이한 (호르몬, 특이적 성장인자 등 같은) 생물학적 화합물과 조합한 단계적 방식으로 췌장 기원 세포를 사용함으로써, 하나 이상의 특이적 생물학적 화합물이 섬세포로 분화하는 것을 유도한다는 것을 발견할 수 있다. 동일한 단계적 조합을 채용하여, 하나 이상의 특이적 생물학적 화합물이 선포 세포로 분화하는 것을 유도하고 관상 세포에 있어서도 동일하다는 것을 발견할 수 있다. 췌장 기원 세포에 대한 생물학적검정에서의 다른 용도는 구별 디스플래이(즉, mRNA 구별 디스플래이) 및 췌장 기원 세포로부터 분비된 단백질을 사용한 단백질-단백질 상호작용이다. 단백질-단백질 상호작용은 효모 2-혼성체 시스템 같은 기술로 구하여질수 있다. 췌장 기원 세포 유래 단백질은 췌장 기원 세포와 상호작용하는 다른 미지의 단백질 또는 다른 세포 유형을 동정하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 미지의 단백질은 다음: 성장인자, 호르몬, 효소, 전사인자, 번역인자, 및 종양억제제 중 하나 이상이다. 췌장 기원 세포와 이들 세포가 만드는 단백질-단백질 상호작용과 관련된 생물학적검정 및 단백질-단백질, 또는 더 나아가 세포-세포 접촉의 효과는, 중간엽조직 같은 주변 조직이 췌장 기원 세포 분화에 기여하는 방식을 알아내기 위하여 사용된다.
하기 실시예는 췌장 기원 세포의 분리, 특성결정 및 용도의 상세한 기재를 제공한다. 이들 실시예는 본 발명을 어떤 방식으로든 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1 췌장 기원 세포의 분리
태아의 췌장(임신연령 14-22주)를 효소성 분해 전에 실체 현미경하에서 미세절단에 의해 기계적으로 분리하였다. 부분적으로 분해된 조직을 5mg/ml의 콜라게나제 -디스파제와 20㎍/ml의 대두 트립신 저해물질, 그리고 50㎍/ml의 DNA분해효소를 함유한 1ml F12/DMEM 배지에 넣고 37℃에서 15분동안 효소처리하였다.
세포 응집체를 5%의 BSA 구배 정단에 층을 형성케 하고 6분동안 900rpm의 원심분리로 세척하였다. 여전히 응집체의 형태를 하고 있는 세포 펠릿를 다음 인자들이 함유된 CMRL 1066 영양배지에 재현탁시켰다:
인슐린 10㎍/ml
트렌스페린 10㎍/ml
표피 성장 인자 5ng/ml
에탄올아민 10-6M
포스포에탄올아민 10-6M
셀레늄 2.5 x 10-8M
트리요드사이로닌 10-12M
프로게스테론 10-9M
하이드로코티손 10-9M
포스콜린 1uM
헤레굴린 10nM
아파로토닌 25㎍/ml
소 뇌하수체 추출물 75㎍/ml
겐타마이신 100㎍/ml
재현탁시킨 세포를 24-웰 접시 중 피브로넥틴으로 피복된 웰(6-12)에 분주한 후 37℃의 온도에서 가습한 5% 이산화탄소 배양기내에서 72시간동안 배양하였다. 72시간 후, 상피세포들은 현탁된 구상 구조를 형상하였고(도 1A), 간엽세포 또는 간질세포들은 웰의 표면에 부착되었다. 단일층의 형성이 필요할 때, 췌장세포 집괴 또는 췌장세포 구상체를 미세피펫으로 6개의 웰로 부터 수집하여 개시된 영양적 보충물이 첨가된 F12/DMEM 을 기본영양배지로 이용하여 콜라겐으로 피복된 60mm 배양접시에 옮겼다. 24시간 내에, 콜라겐 위로 구조체가 접착되고 그 구조체의 세포들은 넓게 펴져서 단일 상피세포층을 형성하였다(도 1B). 이러한 췌장 기원 세포들을 적어도 세 차례 이상 계대할 수 있었다(도 2).
실시예 2 이식에서 췌장 기원 세포의 이용
재조합 이식술의 목적으로, 세포를 원래 도말 시기로부터 구상 상태로 방치하거나 또는 단일층을 콜라겐으로부터 분리하여 그 세포들이 현탁액 상태로 남아 재집괴화되는 피복되지 않은 플라스크에서 배양하였다.
이식술을 할 목적으로, 구상체를 e15 래트 유래 정낭성 간엽 정단에 위치시키되, 보통 2x105내지 5x105세포의 간엽 응집체에 5 내지 8개의 구상체를 위치시켰다. 각 재조합체는 한천 위에 위치되어 37℃의 5% CO2가습 배양기에서 하룻밤동안 배양되었다.
이식술은 3 내지 6개의 재조합체로부터 면역결핍 마우스(누드 또는 SCID)의 신장 피막하에 위치시키는 것으로 구성되었으며 6 내지 8주간 방치했다. 이식편을 그 후 수집항어 면역조직화학에 맞게 처리하였다.
췌장 조직 재조합체 이식편 이식의 결과는 형태학에 의해 평가되었다. 췌장 기원 세포는 작고 둥근 모습과 약 10㎛의 세포 직경, 그리고 고도로 밀집된 원주 상피 형태이다. 선포세포는 선포를 형성하는 큰 집괴모양을 갖는다.(도 3E). 관상세포는 작고 둥근 약 40㎛ 직경의 세포, 그리고 밀집된 입방형 원주 상피이다(도 3D). 섬 세포는 선포성 외분비 단위에 둘러싸인 상피성 섬을 나타낸다(도 3A, 3B, 3C 및 도 7).
실시예 3 이식된 췌장 기원 이식편 세포의 정체, 췌장 기원 세포의 분화 상태 및 기능 결정
췌장 구상체를 마우스의 신장 피막 하에 이식시키고 6 내지 8주간 방치한 후, 이식편을 수확하여 면역조직화학 및 기능에 의해 췌장 세포의 식별을 위한 분석을 했다. 이식편이 인슐린과 글루카곤을 발현하는 것으로 나타났다(도 4, 5 및 7). 나아가, 조직 이식편 재조합체는 관상 구조의 형성을 나타냈다(도 6). 그러므로, 조직 재조합 이식편은 인슐린과 글루카곤을 발현하고 관상 구조를 형성할 수 있는 기능하는 췌장 세포를 생산했다.

Claims (16)

  1. 인간 태아 췌장 조직으로부터 분리된 세포의 일차 배양에서 계대배양되었으며, 선포 세포, 관상 세포 또는 섬 세포로 분화될 수 있고 외분비 및 내분비 세포 모두를 가지는 췌장 조직을 형성할 수 있는 분화다능성 능력을 보유하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 집단의 인간 췌장 기원 세포.
  2. 제 1 항에 있어서, 췌장 기원 세포는 무혈청 배지에서 분리되고 유지되는 것을 특징으로 하는 췌장 기원 세포.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 췌장 기원 세포는 적어도 하나의 세포 마커 발현에 의하여 식별될 수 있는 것을 특징으로 하는 췌장 기원 세포.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 세포 마커는 사이토케라틴-19, 암종배아성 항원, 카르보닉 안하이드라제-Ⅱ, 및 낭성 섬유증 막간 전위 조절자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 췌장 기원 세포.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 췌장 기원 세포는 작고 둥글며, 약 10㎛의 세포 직경, 및 고도로 밀집된 원주 상피세포 형태의 형태학를 갖는 것을 특징으로 하는 췌장 기원 세포.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 췌장 기원 세포는 아밀라아제를 발현하고 샘꽈리를 형성하는 큰 집괴의 모습을 갖는 선포 세포로 더 분화할 수 있는 것을 특징으로 하는 췌장 기원 세포.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 췌장 기원 세포는 사이토케라틴 19를 발현하고 작고, 둥글며, 약 40㎛의 세포 직경 및 밀집된, 입방형 원주 상피세포 형태의 형태학를 갖는 관상 세포로 더 분화할 수 있는 것을 특징으로 하는 췌장 기원 세포.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 췌장 기원 세포는 인슐린 및 글루카곤을 발현하고 선포 외분비 단위로 둘러싸인 상피성 섬의 모습을 갖는 섬 세포로 더 분화할 수 있는 것을 특징으로 하는 췌장 기원 세포.
  9. (a) 인간 태아 췌장 기원 세포의 공급원을 미세절단하여 췌장 기원 세포를 포함하는 췌장 세포의 혼합된 집단을 생산하는 단계;
    (b) 혼합된 췌장 세포의 집단을 상기 췌장 기원 세포의 생명을 유지하기에 충분한 배양 조건 하에서 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자. 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 셀레늄, 트리요오도티로닌, 프로게스테론, 하이드로콜티손, 포스콜린, 헤레굴린, 아프로티닌 및 소 뇌하수체 추출물로 구성된 영양물을 함유한 영양 배지중에 위치시키는 단계;
    (c) 췌장 기원 세포가 응집체 또는 단일층 형태를 형성하도록 허용하기에 충분한 적당한 배양 조건을 유지하는 단계; 및
    (d) 실질적으로 순수한 집단의 췌장 기원 세포를 선별하기 위해 상기 응집체 또는 단일층 형성체를 계대배양하는 단계를 포함하는, 제 1 항의 실질적으로 순수한 집단의 인간 췌장 기원 세포를 분리하는 방법.
  10. 제 1 항에 기재된 것과 같은 췌장 기원 세포 다수를 수용체에서 면역반응을 유도하는 유효량으로 도입하는 단계를 포함하는, 이종 수용체에게 면역원의 공급원을 제공하는 방법.
  11. 간엽 조직과 재조합된 제 1 항의 실질적으로 순수한 집단 유래의 인간 췌장 기원 세포 다수를 상기 기원 세포의 성장과 분화를 지지할 수 있는 수용체의 위치에서 상기 수용체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역결핍 또는 면역장애 비-인간 포유동물 수용체에서 인간 췌장 조직 모델을 제작하는 방법.
  12. 제 1 항의 실질적으로 순수한 집단 유래의 인간 췌장 기원 세포를 상기 췌장 기원 세포의 성장과 분화를 지지할 수 있는 수용체의 위치에서 상기 수용체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간 수용체에 세포 치료법을 제공하는 방법.
  13. 제 1 항에 기재된 것과 같은 인간 췌장 기원 세포의 집단을 분리하는 단계및, 하나 이상의 개발중인 약품의 표적으로서 상기 췌장 기원 세포 또는 그것의 세포의 어떤 부분을 사용하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 약의 약제학적 개발에 췌장 조직-특이성 생물학적 성분의 공급원을 제공하는 방법.
  14. 제 1 항에 기재된 것과 같은 인간 췌장 기원 세포 유래의 핵산 또는 단백질을 분리하는 단계 및 생물학적 검정에서 하나 이상의 중요한 구성물로서 상기 핵산 또는 단백질을 이용하는 단계를 포함하는, 생물학적 검정의 개발에 핵산 또는 단백질의 공급원을 제공하는 방법.
  15. 제 12 항에 있어서 수용체를 면역억제시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 췌장 기원 세포에 대항한 수용체의 면역 체계 반응을 제한하는 제한 장치에 상기 췌장 기원 세포를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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