WO2005114178A1 - Multizelluläre testsysteme - Google Patents

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WO2005114178A1
WO2005114178A1 PCT/EP2005/002197 EP2005002197W WO2005114178A1 WO 2005114178 A1 WO2005114178 A1 WO 2005114178A1 EP 2005002197 W EP2005002197 W EP 2005002197W WO 2005114178 A1 WO2005114178 A1 WO 2005114178A1
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WO
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cells
organoid
bodies
cell
organoid bodies
Prior art date
Application number
PCT/EP2005/002197
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English (en)
French (fr)
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Charli Kruse
Günter FUHR
Original Assignee
Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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Priority to EP05707686A priority patent/EP1747459A1/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues

Definitions

  • the invention relates to methods for testing substances using multicellular, in particular organ-like, in vitro test systems and devices and kits for carrying out these methods.
  • tissue cultures from explanted tissue samples see, for example, US 5726009 and US 2002/192638
  • cultures of differentiated cells obtained from stem cells have been used in vitr ⁇ test systems.
  • the former approach has the disadvantage that it is difficult to maintain the cultures over longer periods of time and to produce larger amounts of cells without changing the properties of the cells or of the tissue.
  • the stem cells are conventionally induced to differentiate into individual cell types, for example nerve cells, fibroblasts etc., by adding special factors and then the effect of various chemicals, for example active pharmaceutical ingredients, on these special cells is investigated.
  • various special cell cultures have to be prepared and tested.
  • the object of the invention is to provide improved multicellular, in particular human, in vitro test systems and methods with which the action of substances on different cell types and in particular on a combination of different cell types, as is present in natural tissues and organs, can be determined quickly and easily.
  • the present invention is based on the finding that multipotent or pluripotent adult stem cells, as can be obtained from exocrine glandular tissue (PCT 2004/003810), with simple means for aggregation and differentiation in three-dimensional cell aggregates, so-called organoid bodies or organoid bodies, which contain a spectrum of at least two cell types without the addition of special differentiation factors. With an adequate supply of nutrients, these organic bodies continue to grow and develop tissue or organ-like structures. At this stage they are also referred to as tissue bodies. If these organoid bodies are exposed to chemical substances, their effect, if present, can be determined by a morphological or otherwise detectable change in these organoid bodies or the cell types contained therein. In this way, different cell types can be tested simultaneously or one after the other, and in particular tissue or organ-like cell groups can also be examined.
  • Multipotent or pluripotent adult stem cells are used to form the organoid bodies or organoid bodies used according to the invention. These pluripotent stem cells are preferably isolated from exocrine gland tissue.
  • the exocrine glandular tissue can come from an adult individual or juvenile individual.
  • the term "adult” as used in the present application thus refers to the developmental stage of the starting tissue and not to that of the donor from which the tissue comes.
  • “Adult” stem cells are non-embryonic stem cells.
  • the exocrine gland tissue is isolated from a salivary gland, lacrimal gland, sebum gland, sweat gland, from genital tract glands including prostate, or from gastrointestinal tissue including pancreas or secretory tissue from the liver.
  • it is acinar tissue.
  • the acinar tissue very particularly preferably originates from the pancreas, the parotid gland or the submaxillary gland.
  • feeder cells encompasses all cells which promote the growth of the cells which are actually to be cultivated by releasing growth factors and / or providing an extracellular matrix or preventing the differentiation of the stem cell culture.
  • These adult stem cells can be easily stimulated to differentiate without the addition of special growth or differentiation factors - by culturing them under spatial conditions which ensure three-dimensional contact of the cells.
  • these conditions are cultivation in hanging drops, as has already been described for embryonic stem cells (Wobus et al., Biomed. Biochim. Acta 47: 965-973 (1988). This method is described in more detail below in the examples However, it goes without saying that alternative cultivation methods which are suitable for the desired three-dimensional contact of the cells and are known and available to the person skilled in the art, can also be used.
  • Examples of such alternative methods are cultivation in agitated suspension culture, cultivation in an electromagnetic field cage or laser tweezer, cultivation on surfaces to which the cells do not adhere or adhere poorly, or sowing non-resuspended cells of the primary culture.
  • Such surfaces can be, for example, glass, polystyrene or surfaces treated with an anti-adhesion layer, for example PTFE or poly-HEMA-coated surfaces.
  • organoid bodies or organoid bodies.
  • organoid bodies or organoid bodies.
  • organoid bodies can be transferred to suspension cultures or adhesion cultures and further cultivated. With an adequate supply of nutrients, these organoid bodies continue to grow and can reach diameters of a few millimeters or more.
  • tissue bodies are also called “tissue bodies” at this stage to distinguish them from simple cell aggregates.
  • organoid bodies are brought back into surface culture, a single cell layer emerges from growing individual cells, from which multilayer areas emerge, from which secondary organoid bodies with properties comparable to those of the primary organoid bodies are spontaneously formed.
  • the organoid bodies according to the invention can, for example, be stored frozen at the temperature of the liquid nitrogen without their viability, ability to reproduce. loss of ability to grow and differentiate.
  • the organoid bodies contain different cell types of all three cotyledons. No differentiation factors are necessary for differentiation and the cells do not have to be transplanted to differentiate. However, it can be advantageous to use such differentiation factors in order to produce larger quantities of a certain cell type in a targeted manner or to produce organoid bodies with a certain cell type composition.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • vascular endothelial growth factor (“vascular endothelial growth factor”), DMSO and isoproterenol, fibroblast growth actuator 4 (FGF4), hepatocyte
  • HGF Growth factor
  • TGF-beta transforming growth factor betal
  • EGF epidermal growth factor
  • KGF keratinocyte growth factor
  • cortisone keratinocyte growth factor
  • retinoic acid for the increased formation of nerve, heart and kidney cells
  • beta-NGF beta nerve growth factor
  • BMP-4 "bone morphogenic protein 4”
  • Activin-A for the formation of mesodermal cells in general, but are not limited to this.
  • Differentiated cells that can be contained in the organoid bodies include bone cells (osteoblasts and osteoclasts), chondrocytes, adipocytes, fibroblasts (eg skin and tendon fibroblasts), muscle cells, endothelial cells,
  • bone cells osteoblasts and osteoclasts
  • chondrocytes eg skin and tendon fibroblasts
  • fibroblasts eg skin and tendon fibroblasts
  • muscle cells eg skin and tendon fibroblasts
  • endothelial cells e.g epithelial cells, hematopoietic cells, sensory cells, endocrine and exocrine gland cells, glial cells, neuronal cells, oligodendrocytes, blood cells, intestinal cells, heart, lung, liver, kidney or pancreatic cells are not limited to this.
  • the substance to be tested is brought into contact with the organoid bodies and their effect is determined, if appropriate, by a morphological or otherwise detectable change in these organoid bodies or the cell types contained therein.
  • This test method is, for example, a method for analyzing the effect of known or potential active substances or toxins or mutagens on all or special cell types of the organoid body. In a more specific embodiment, it is a method for screening active pharmaceutical ingredients or cosmetics.
  • test substance can be of the most varied chemical nature, e.g. a protein, lipid, a nucleic acid, e.g. RNA, DNA or a derivative thereof, a low molecular or high molecular chemical compound, a chemical element or a mixture of these substances.
  • Two or more test substances can also be tested in succession or simultaneously with the same organoid bodies, for example to determine interactions between the test substances.
  • test substance a nucleic acid, for example RNA, DNA or a derivative thereof
  • it can be (s) by any known method of genetic engineering. technology, including the use of vectors, viruses, electroporation etc., into which cells of the organoid body are introduced.
  • a test substance that is soluble or solubilizable in the culture medium is preferably simply added to the cell culture medium in which the organoid bodies are located, and the organoids are incubated with the test substance in suitable concentrations for various desired periods of time.
  • used cell culture medium can be replaced by fresh medium with the desired concentration of test substance during the incubation, for example in order to keep the active substance concentration in the medium approximately constant.
  • the effective concentrations of the test substance can vary to a large extent, but can easily be determined by the person skilled in the art through routine tests.
  • the contact period can vary from a few minutes to a few hours and several days and weeks. Contact periods of several weeks are not uncommon. Suitable contact periods will also depend on the type of active ingredient and can be determined by the person skilled in the art through routine tests.
  • the treated organoids and a control without test substance, which was incubated for the same length of time, are then subjected to a detection method.
  • the detection method will depend on the type of active substance and the type of change to be observed in the organoid body or the differentiated cells contained therein.
  • the detection of the action of a substance comprises the use of one or more methods, which or those from the group consisting of protein assays, unoassays, enzymatic assays, receptor binding assays, ELISA assays, RIA assays , electrophoretic and chromatographic assays, including HPLC, Northern blots, Southern blots, Western blots, colorimetric assays, immunohistochemical, electrophysiological methods (ie current, voltage and impedance measurements), microscopic and spectroscopic detection methods are selected.
  • protein assays unoassays, enzymatic assays, receptor binding assays, ELISA assays, RIA assays
  • electrophoretic and chromatographic assays including HPLC, Northern blots, Southern blots, Western blots, colorimetric assays, immunohistochemical, electrophysiological methods (ie current, voltage and impedance measurements), microscopic and spectroscopic detection methods are selected
  • the effect of the substance can e.g. a change in the morphology or proliferation capacity, growth capacity or viability of all cell types or special cell types of the organoid body.
  • direct visual and optical detection methods including cytometric, microscopic and colorimetric methods, can be used favorably.
  • the effect can be a change in the activity of specific or all cell types of the organoid body.
  • this change in activity can manifest itself in an increased or reduced or first-time occurrence of a detectable marker substance in or on the affected cells.
  • the proof of the effect of the chemical substance is preferably carried out by proof of the presence or absence or quantity a marker substance that is formed by special or all cell types of the organoid body.
  • This marker substance can e.g. A protein, including, but not limited to, antibody, receptor, enzyme, hormone, ion channel, neurotransmitter, surface marker, RNA, DNA, a proteoglycan, a lectin or other suitable substance.
  • Some cell type-specific examples of marker substances are mentioned in the following, but are in no way to be regarded as restrictive: PGP 9.5 and NF for nerve cells, S 100 and GFAP for glial cells, SMA for muscle cells (or myofibroblasts), collagen type II for cartilage cells, amylase and Trypsin for exocrine gland cells, insulin for endocrine gland cells, vigilin for highly translational cells and cytokeratin for epidermal cells, collagen type II for chondrocytes, osteonectin for osteoblasts and progenitor cells, osteocalcin for mature osteoblasts, CD45, CD34, CD13 cells for hematoplastos cardiac troponin I "), cTNT (" cardiac troponin T ”) and A
  • marker substances can be detected, for example, by binding to a specific binding partner that is conjugated to a detectable group.
  • the detectable group can be, for example, a dye, fluorescent dye, a radioactive label, enzyme label, luminescent label, magnetic resonance label or another label known in the art.
  • the binding partner will preferably be a labeled or labelable antibody.
  • labeled antibodies are already known for a large number of marker substances and can either be obtained commercially or can be easily produced by known processes.
  • labeled or labelable secondary antibodies can also be used.
  • the specific binding partner can also be re-labeled, but bound to an affinity column or other carrier. In these cases, cells that have the marker substances on their surface can be detected by the specific binding to these carriers.
  • the marker substance can also be detected by its own activity, e.g. if it is an ion channel or neurotransmitter or an enzyme that can be reacted with a detectable substrate.
  • the marker substance is a DNA or RNA, it can either be detected directly by complementary and possibly labeled probes or indirectly by the detection of a gene product if it is a complete coding sequence or a regulatory sequence.
  • Another possibility is an increased DNA or RNA synthesis per se or an increased DNA repair activity.
  • activities can e.g. can be determined by incorporating radioactive or otherwise labeled nucleotides.
  • the detection can be carried out while maintaining the cell structure, for example in microscopic and unhistochemical methods, or with destruction of the cell structure, for example in an electrophoresis method such as Southern blots, Northern blots or Western blots.
  • the organoid bodies In an advanced stage of differentiation, the organoid bodies have tissue-like or organ-like structures which are formed by two or more different cell types (cf. FIGS. 2-4). Such structures are, for example, neuromuscular structures or glia-nerve cell structures or skin cell structures.
  • the formation of desired structures can be promoted by cultivating the organoid bodies in a medium with special differentiation factors.
  • the test substance effects a change in these structures.
  • This change can be, for example, a destruction of the structures, inhibition or stimulation of the development of the structures or a change in the activity of one or more cell types, from which these structures are composed.
  • the detection of the effect of the test substance can consist of the change in these structures.
  • Suitable detection methods can e.g. include direct observation of the morphological changes, possibly coupled with immunological, immunohistochemical or other detection methods.
  • the cell type composition of the organoid bodies can be determined by culturing them in the presence of specific differentiation factors, this means that the cell type composition of the organoid bodies can be matched in more specific embodiments to the putative cell type-specific effect of the test substance.
  • organoid bodies with a high proportion of epithelial cells or with skin-like structures can be used in a test of test substances which presumably act via the surface.
  • Other such special test systems will be readily apparent to those skilled in the art and can be implemented.
  • the organoid bodies are located in cavities, matrices or other carrier and / or shaping systems.
  • the organoids can be introduced, for example, by waxing.
  • the cavities can be, for example, microchannels or capillaries for impedance measurement.
  • the proof of the effect of the test substance can then e.g. consist in an impedance change.
  • a gradient e.g. pH, electrochemical, signal factors, etc.
  • the effect of the test substance can be displayed by changing this gradient.
  • Another aspect of the invention relates to a device for carrying out the method according to the invention, comprising the organoid bodies in a suitable container, carrier or shaping system, means for contacting the organoid bodies with a chemical substance to be tested and means for detecting a morphological or other change thereof organoid body or the cell types it contains.
  • the organoid bodies are located in cavities, for example microchannels or capillaries, or in matrices.
  • the means for carrying out the method according to the invention are provided in the form of a kit.
  • kits comprises adult stem cells or the organoid bodies derived therefrom or differentiated cells in a suitable culture medium for maintaining the cells or the organoid bodies, optionally cryopreserved.
  • the kit can contain further aids, for example reagents for cultivating and differentiating the stem cells into organoid bodies of a desired cell type composition, means for contacting the organoid bodies with a chemical substance to be tested, means for detecting a morphological or other change in these organoid bodies or the cell types contained therein.
  • Figure 1 shows schematically the cultivation of the stem cells in surface culture and in hanging drops as well as the formation and further cultivation of organoid bodies.
  • a, b PGP 9.5-labeled nerve cells show multipolar extensions, which show numerous varicosities.
  • c, d the neurofilament system (bright arrows, marked green in the original photo) extends through the pericaryon into the cytoplasmic foothills. GFAP-immunoreactive glial cells are located in close proximity (dark arrows, marked red in the original photo).
  • e, f -SMA-labeled cells (dark arrows, in the original red) and NF-marked nerve cells (bright arrows, in the original green) form a primitive neuro-muscular network (e), whereby contacts are established over considerably long distances (f).
  • g Immunostaining of GFAP (dark arrows, originally red) and NF (bright arrows, originally green) in 3-week-old OB with concentrations of nerve and glial cells.
  • h Immunostaining of ⁇ -SMA (dark arrows, originally red) and NF (bright arrows, originally green) in 3-week-old OBs in an advanced stage of the formation of a neuromuscular network.
  • i, j Cross sections of 8-week-old OBs were found for NF immunoreactive cells in the immediate vicinity of cells that were immunoreactive for ⁇ -SMA, similar to native tissues, k: a subset of cells showed a positive staining for Amylase (bright arrows, originally green). 1: Another cell subgroup contains granular vesicles with an inactivity for insulin. The cores are contrast-dyed with DAPI (originally blue).
  • a, b Globular (a) and fibrillary (b) stores of proteoglycans resulted in staining with Alcian blue.
  • ce The globular (c) and fibrillary (d) areas are immunoreactive for the cartilage matrix protein collagen II.
  • Two individual cells show cytoplasmic labeling of collagen II.
  • f Cells that are immunoreactive for cytokeratins are arranged in clusters, g: confocal laser canning microscopy of an OB.
  • the collagen II immunoreactivity dark arrows, originally red marked
  • Vigilin im unreactive cells (bright arrows, marked green in the original) are mainly located on the outer edge of the OB, which indicates their high translational activity.
  • the cores are contrast colored with DAPI.
  • Fig. 4 shows the transmission electron microscopy of differentiated OB.
  • a-c smooth muscle cells with myofilaments.
  • the myofilament system extends across the cytoplasm in disseminated bundles (a) and shows typical dense bodies (arrows) (b).
  • the myoblasts show star-shaped cell extensions that form a connecting network (c).
  • d Cell extension with a cluster of numerous small-sized vesicles, which most likely correspond to nerve fiber varicosities.
  • e collagen and reticular fibers.
  • f-h Secretory cells show electro-tight vesicles. f). Secretory cells often contact each other to form acinar structures (g).
  • a subset of secretory cells contains vesicles (arrow) that correspond to ultrastructural features of endocrine granules (h), e.g. Beta granules from insulin-producing cells.
  • h endocrine granules
  • Beta granules from insulin-producing cells.
  • 1 Beginning of the formation of an epithelial surface (arrow) in eight-week-old OBs.
  • j typical cell contacts between keratinocytes and desmosomes (arrows)
  • FIG. 5A shows microscopic comparative images of an untreated and an organoid body treated with puromycin.
  • FIG. 5B shows Western blots of protein separations of the homogenates of the organoids shown in FIG. 5A with the detection of the translation marker vigiline.
  • FIG. 6 shows Western blots of protein separations of the homogenates of retinoic acid-treated and untreated organoid bodies with the detection of the protein marker ⁇ -SMA (FIG. 6A) or the detection of neurofilaments (NF) (FIG. 6B).
  • FIG. 7 shows western blots of protein separations of the homogenates of HGFR-treated and untreated organoid bodies with the detection of the liver protein ⁇ -fetoprotein.
  • FIG. 8 shows Western blots of protein separations of the homogenates of organoid bodies treated and treated with conditioned medium from chondrocyte primary cultures with the detection of the cartilage protein collagen-II.
  • FIG. 9 shows a basic structure and test sequence for testing substances using the methods and systems according to the invention.
  • exocrine gland tissue e.g. Acinary tissue - preferably a salivary gland or the pancreas (pancreas) - mechanically and enzymatically comminuted in culture (step 10 in Figure 1).
  • tissue blocks are not cultivated from which cells should grow, but the tissue is shredded more under the condition that the cell groups of the acini remain largely intact.
  • These cells and cell assemblies are cultivated in culture vessels for several weeks.
  • the medium is used every 2 to 3 days changed, removing all differentiated cells.
  • the cells that persist in culture are undifferentiated cells with unlimited ability to divide.
  • a second step (12) approximately 400 to 800 cells are cultivated in 20 ⁇ l medium in hanging drops.
  • the drops are placed on the lid of bacteriological petri dishes, turned over and placed over the petri dish filled with medium, so that the drops hang down.
  • the cell aggregates (14) known as organoid bodies are formed within 48 hours, which are converted into a suspension culture for about 6 days (16).
  • the partial view (18) from FIG. 1 shows a microscopic image of such an organoid body.
  • FIGS. 2-4 show microscopic and electron microscopic images of differentiated cells which were obtained from such organoid bodies or organoid bodies.
  • a neuromuscular network For example, the formation of a neuromuscular network can be observed:
  • glial fibrillary acidic protein glial fibrillary acidic protein
  • glial fibrillary acidic protein glial fibrillary acidic protein
  • the filamentous proteins did not extend through the entire cytoplasm, but were limited to areas next to the nerve cells.
  • smooth muscle cells and nerve cells were not scattered arbitrarily, but instead formed connected networks with easily distinguishable connections (Fig. 2e, f). Nerve fiber stretches spanned considerable distances to contact neighboring smooth muscle cells as their putative targets. Because of their topographical arrangement, the two cell types thus showed features of a primitive neuromuscular network. In 3-week-old OBs, the beginning formation of tissue-like structures was found (Fig. 2g-j).
  • OBs showed chondrogenic properties.
  • Alcian blue staining revealed areas with high concentrations of proteoglycans (chondroitin sulfate), which were either globular (Fig. 3a) or fibrillar (Fig. 3b) deposits.
  • Immunohistochemical staining with antibodies that were directed against the cartilage matrix protein collagen II also demonstrated The chondrogenic activity was within these globular (Fig. 3c) and fibrillar (Fig. 3d) areas.
  • the immunoreactivity was highest in the middle of the cellular aggregates, which were most likely to correspond to areas of developing extracellular cartilage matrix. This observation was confirmed by confocal microscopy (Fig.
  • cytokeratins In addition to esenchymal markers, some cells also expressed several cytokeratins, indicating their potential for differentiation in epithelial cells. However, cells that were immunoreactive for cytokeratins were found less frequently than cells that expressed smooth muscle cell and neuron markers. Typically, they were arranged in clusters that were disseminated within the OBs (Fig. 3f). Typical cell contacts between keratinocytes were found by electron microscopic examinations (FIG. 4j) and epithelial cells were found on the surface of 8-week-old OBs, which grew from the cell culture medium into the air.
  • PGP 9.5 and NF for nerve cells S 100 and GFAP for glial cells
  • SMA for muscle cells (or myofibroblasts)
  • collagen type II for cartilage cells SMA for muscle cells (or myofibroblasts)
  • amylase and trypsin for exocrine gland cells insulin for endocrine gland cells
  • vigilin for strongly translating cells
  • cytokeratin for epidermal cells.
  • different types of cells could be morphologically characterized by electron microscopy, and cell-cell contacts could be found as a sign of cellular interactions.
  • smooth muscle cells neurons, glial cells, epithelial cells, fat cells, heart cells, kidney cells, fibroblasts (e.g. skin and tendon fibroblasts), chondrocytes, endocrine and exocrine gland cells and thus cell types of all three cotyledons in these organoid bodies morphologically / histologically and / or immunochemically detected ,
  • HEPES stock solution pH 7.6
  • HEPES Eagle Medium pH 7.4
  • MEM Modified Eagle Medium
  • Isolation medium (pH 7.4) 32 ml HEPES-Eagle medium 8 ml 5% BSA in A. bidest. 300 ⁇ l 0.1 M CaC12 100 ⁇ l trasylol (200,000 KIE)
  • Digestion medium pH 7.4 20 ml isolation medium 4 ml collagenase (Collagenase NB 8 from Serva) Incubation medium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FCS inactivated
  • 1 ml / 100 ml pen / strep 10000 U / l 0000 ⁇ g / ml
  • DMEM + 10% own plasma 1 ml / 100 ml pen / strep, warm to 37 ° C before use
  • Differentiation medium 380 ml DMEM 95 ml 30 min at 54 ° C inactivated FCS 5 ml glutamine (GIBCO BRL) 5 ml (3.5 ⁇ l ß-mercaptoethanol on 5 ml PBS) 5 ml non-essential amino acids (GIBCO BRL) 5 ml penicillin / Streptomycin (GIBCO BRL) (10000 U / 10000 ⁇ g / ml)
  • the nutrient medium and differentiation medium can also contain another suitable base medium known for the cultivation of eukaryotic cells, in particular mammalian cells, in which the differentiated cells die and the desired stem cells multiply. Isolation medium, incubation medium and differentiation medium can also contain another customary and suitable base medium.
  • FCS fetal calf serum
  • human tissue was obtained from adult patients immediately after a surgical operation and processed immediately. Healthy tissue was separated from the surgically removed tissue, for example pancreatic tissue, and in digestion medium containing HEPES-Eagle medium (pH 7.4), 0.1 mM HEPES buffer (pH, 7.6), 70% (vol. / Vol.) Modified Eagle's medium, 0.5% (vol. / Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen, Germany), 1% (wt. / Vol.) Bovine serum albumin), 2.4 mM CaCl 2 and collagenase (0.63 P / mg, Serva, Heidelberg, Germany), added (at 20 ° C, lower metabolism).
  • pancreatic tissue was shredded very finely with scissors, fatty tissue floating at the top was sucked off and the tissue suspension was gassed with carbogen (Messer, Krefeld, Germany) without the nozzle getting into the medium with the cells (reduction of mechanical stress) and thus to pH 7 , 4 set.
  • carbogen Merase, Krefeld, Germany
  • the suspension was then placed in a 25 ml Erlenmeyer flask (covered with aluminum foil) with constant shaking (150-200 cycles per minute) at 37 ° C in 10 ml digestion medium.
  • the floating fat and medium were suctioned off and the tissue was again crushed and rinsed with medium without collagenase (repeat the process at least twice, preferably until the cell fraction is transparent), whereupon digestion medium was added and again with carbogen for about 1 minute was fumigated.
  • Digestion with collagenase followed again for 15 minutes at 37 ° C. in a shaker using the same buffer.
  • the acini were dissociated by successively pulling up and pushing out through 10 ml, 5 ml and 2 ml glass pipettes with narrow openings and through a single-layer nylon sieve (Polymon PES-200/45, Angst & Pfister AG, Zurich, Switzerland) with a mesh size of around 250 ⁇ m.
  • the acini were centrifuged (at 37 ° C. and 600-800 rpm in a Beckman GPR centrifuge, corresponds to approximately 50-100 g) and further purified by washing in incubation medium containing 24.5 mM HEPES (pH 7.5), 96 mM NaCl, 6 mM KC1, 1 mM MgCl 2 , 2.5 mM NaH 2 PO 4 , 0, mM CaCl 2 , 11.5 mM glucose, 5 mM sodium pyruvate, 5 mM sodium glutamate, 5 mM sodium fumarate, 1% (Vol. / Vol.) Modified Eagle medium, 1% (wt. / Vol.) Bovine serum albumin, equilibrated with carbogen and adjusted to pH 7.4. The washing procedure (centrifugation, suction, suspension) was repeated five times. Unless otherwise stated, the above insulation works at about 20 ° C.
  • the acini were resuspended in incubation medium and cultivated at 37 ° C. in a humidified atmosphere with 5% CO 2 .
  • the acinar tissue died quickly (within two days) and the dying differentiated cells detached from the neighboring cells without damaging them (gentle isolation), the non-dying stem cells. len sank to the ground and attached themselves.
  • the differentiated acini sizes are not able to do this.
  • the incubation medium was changed for the first time on the second or third day after sowing, with a large part of the free-floating A-5 cini and acinar cells being removed. At this point, the first stem cells or their precursors had settled on the ground and began to divide. The medium change was then repeated every third day and differentiated acinar pancreatic cells were removed with each medium change.
  • the cells were passaged with a solution consisting of 2 ml PBS, 1 ml trypsin (+ 0.05% EDTA) and 2 ml incubation medium. The cells detach themselves from it
  • the cells were passaged again, but this time with 6 ml PBS, 3 ml trypsin / EDTA and 6 ml incubation medium.
  • the cell suspension is centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant is suctioned off and the cell
  • Pancreatic acini were obtained from male Sprague-Dawley rats (20-300 g) who had been anesthetized (CO 2 ) and bled through the dorsal aorta. A cannula was inserted into the pancreatic duct, and 10 ml of digestion medium containing HEPES-Eagle medium (pH 7.4), 0.1 mM HEPES buffer (pH, 7.6), 70% was introduced into the pancreas from behind. (Vol. / Vol.) Modified Eagle medium, 0.5% (Vol. / Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen, Germany), 1% (wt. / Vol.) Bovine serum albumin), 2.4 mM CaCl 2 and collagenase (0.63 P / mg, Serva, Heidelberg, Germany) were injected.
  • HEPES-Eagle medium pH 7.4
  • 0.1 mM HEPES buffer pH, 7.6
  • 70% was introduced into the pancre
  • the exocrine tissue of the parotid gland was a mixture of acinar tissue and tubular tissue. 2. Since salivary glands contain fewer proteases and amylases than pancreas, it is possible to store the salivary gland tissue in the refrigerator for some time at about 4 ° C without damaging the tissue too much. In the specific example, the retention time was 15 hours and had no adverse consequences for the isolation of the desired stem cells.
  • organoid bodies organoid bodies
  • differentiated cells differentiated cells
  • EXAMPLE 4 The undifferentiated cells are trypsinized with a solution of 10 ml PBS, 4 ml trypsin, 8 ml differentiation medium and centrifuged for 5 minutes. The resulting pellet is resuspended in differentiation medium so that a dilution of 3000 cells per 100 ⁇ l medium is obtained. The cells are then suspended again well with a 3 ml pipette.
  • the lid is removed from bacteriological Petri dishes, which have previously been coated with 15 ml PBS (37 ° C) per plate, and turned over. With the help of an automatic pipette, about fifty 20 ⁇ l drops are placed on a lid. The lid is then quickly turned over and placed on the Petri dish filled with differentiation medium so that the drops hang down. The Petri dishes are then carefully placed in the incubator and incubated for 48 h.
  • organoid bodies The cells aggregated in the hanging drops, which are to be called organoid bodies (OB) here, are then transferred from four lids into a bacteriological petri dish with 5 ml of incubation medium with 20% FCS and cultured for a further 96 h.
  • the organoid bodies are now carefully collected with a pipette and transferred into cell culture vessels coated with 0.1% gelatin with differentiation medium.
  • 6 cm petri dishes coated with 0.1% gelatin are used as the culture vessel, into which 4 ml of differentiation medium has been placed and which are then loaded with 6 organoid bodies each.
  • Another preferred culture vessel are Chamber Südes coated with 0.1% gelatin, into which 3 ml of different
  • the differentiation ability of the cells in the organoid bodies is activated and the cells differentiate into cells of the three cotyledons Mesoderm, Entoderm 20 and Ektoderm.
  • the cells can be stored and cultivated both as organoid bodies and as individual cells and retain their pluripotency.
  • stem cells after the 42nd day of cultivation were preferably stem cells after the 42nd day of cultivation used.
  • the cells were transferred to differentiation medium with the composition given above and placed on a sealing set at about 3 x 10 4 cells / ml; eg by trypsin treatment of a stem cell culture in nutrient medium, centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes and resuspending the pellet in differentiation medium and dilution as necessary.
  • the organoid bodies were then carefully collected with a pipette and transferred to cell culture vessels coated with 0.1% gelatin with differentiation medium.
  • the OBs now multiplied and in some cases grew into individual cell colonies that could be multiplied, separated and multiplied again.
  • Another preferred culture vessel were Chamber Südes, coated with 0.1% gelatin 3 ml of differentiation medium was placed in front of each of which were subsequently loaded with 3-8 organoid bodies, and Therma nox plates (Nalge Nonc International, USA) for electron microscopic studies.
  • Another alternative was 24-well microtiter plates, which were coated with 0.1% gelatin and into which 1.5 ml of differentiation medium was placed in each well and which were then loaded with 4 organoid bodies each.
  • OBs were cultured in the gelatin-coated 6 cm Petri dishes for about 7 weeks and then individual OBs were cut out with the microdissector (Eppendorf, Hamburg, Germany) according to the manufacturer's instructions and then e.g. transferred to fresh 6 cm Petri dishes, Chamber Südes or Thermanox plates.
  • individual OBs with pipette tips were detached and transferred by gentle suction, then e.g. Observation under the inverse microscope.
  • the primary antibodies were against the protein gene product 9.5 (PGP 9.5, polyclonal rabbit antibody, 1: 400, Ultraclone, Drei Wight), neurofilaments (NF-Pan-Cocktail, polyclonal rabbit antibody, 1: 200, Biotrend, Germany), ⁇ - smooth muscle actin ( ⁇ -SMA , mouse monoclonal antibody, 1: 100, DAKO, Denmark), güales fibrillar acidic protein (GFAP, mouse monoclonal antibody, 1: 100, DAKO, Denmark), collagen II (mouse monoclonal antibody II-II-6B3, 1:20, de- velopmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA), Vigiün FP3 (1: 200, kugler et al., 1996), Cytokeratine (Pan Cytokeratin, monoclonal mouse antibody, 1: 100, Sigma, USA), Alpha-Amylase (polyclonal rabbit antibody, 1: 100, Calbiochem, Germany) and insulin (mouse monoclo
  • OBs were cultured on Thermanox plates (Nalge Nonc International, USA) for at least 3 weeks. Samples adhering to the Thermanox plates were incubated at pH 7.4 for 24 hours by immersion in 0.1 M cocodylate buffer containing 2.5% glutaraladehyde and 2% paraformaldehyde. After post-fixation in 1% Os0 4 , "en bloc" staining with 2% uranyl acetate and dehydration in pure alcohols, the samples were embedded in Araldite. After removing the Thermanox plate, Semithin cuts were made either tangentially or vertically made for embedded cell culture and cut with methylene blue and Azure II. Ultrathin sections were cut out from the regions of interest, stained with lead citrate and examined under a transmission electron microscope (Philips, EM 109).
  • Examples 7 to 10 describe the contacting of organoid bodies, which were produced as described above, with various active substances and the detection of a change in the organoid body and / or the differentiated cells contained therein by direct visual detection or the detection of marker proteins.
  • organoid bodies of a batch which have been grown together e.g. produced by separating suitable organoids and re-enlarging to the desired number
  • organoids usually at least 6 in a group
  • organoid bodies were exposed to various micromolar concentrations of puromycin, an agent that inhibits translation, for a period of 1 to 2 days. The size of the treated organoid bodies was then compared to that of an untreated control (see microscopic comparison picture in FIG. 5A).
  • the organoids were taken up in 10 ml lysis buffer containing 7.5 ml PBS, 2.5 ml NP-40 and 1 mM PEFA block, stored overnight in the refrigerator at 4 ° C. and then in mini homogenizers for Eppendorf tubes homogenized. The homogenate was centrifuged, the supernatant removed and electroplated using standard methods. separated phoretically and the gel subjected to a Western immunoblot.
  • 5B shows the results of the treatment via the detection of the translation marker Vigiün.
  • the first four bands result from the different amounts of puromycin, the last two show the amount of Vigiün in the untreated organoids; the same amount of total protein was always applied to each lane.
  • EXAMPLE 8 The organoid bodies were incubated with 2 x 10 ⁇ 6 M retinoic acid or without retinoic acid for 7, 11, 14 and 17 days. The organoid bodies were then homogenized as described in Example 7 and subjected to a Western blot assay. The markers ⁇ -SMA ( ⁇ -smooth muscle actin) and a mixture of neurofilaments (NF) were stained (FIG. 6). While the amount of actin during the entire treatment period is higher than in the control, the amount of NF detected in the Western blot changes only on the 7th and 11th day of treatment.
  • ⁇ -SMA smooth muscle actin
  • NF neurofilaments
  • the organoid bodies were incubated with 40 ng / ml HGF (“hepatocyte growth factor”) or without HGF for 7, 11, 14 and 17 days.
  • the organoid bodies were then homogenized as described in Example 7 and subjected to a Western blot assay The formation of the liver protein ⁇ -fetoprotein was examined (Fig. 7) After 7 and 11 days of incubation, a clear synthesis of the fetoprotein can be observed, while a longer exposure time rather inhibits the formation.
  • HGF hepatocyte growth factor

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren, zum Testen von Substanzen unter Verwendung multizellulärer, insbesondere organähnlicher, in vitro-Testsysteme und Vorrichtungen und Kits zur Durchführung dieser Verfahren.

Description

Multizelluläre Testsysteme
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Testen von Substanzen unter Verwendung multizellulärer, insbesondere organähnlicher, in vitro-Testsysteme und Vorrichtungen und Kits zur Durchführung dieser Verfahren.
Die Durchführung von Tierversuchen für pharmazeutische und kosmetische Untersuchungen stellt einen enormen Kostenfaktor dar und ist oftmals ethisch problematisch. Für die Kosmetikindustrie sind sie sogar in vielen Ländern, z.B. in Europa, völlig verboten. Die Entwicklung multizellulärer, insbesonde- re humaner, in vitro-TestSysteme stellt für viele Untersuchungen eine gute Alternative dar und solche humanen Testsysteme können natürlichen menschlichen Geweben/Organen in ihren Eigenschaften sogar näher als Tiermodelle kommen.
Im Stand der Technik wurden als in vitrσ-Testsysteme bisher sowohl Gewebekulturen aus explantierten Gewebeproben (siehe z.B. US 5726009 und US 2002/192638) als auch Kulturen differenzierter Zellen, die aus Stammzellen erhalten wurden, eingesetzt. Der erstere Ansatz hat den Nachteil, daß es schwie- rig ist, die Kulturen über längere Zeiträume aufrechtzuerhalten und größere Mengen an Zellen zu produzieren, ohne die Eigenschaften der Zellen bzw. des Gewebes zu verändern. Beim zweiten Ansatz werden die Stammzellen herkömmlicherweise durch Zugabe spezieller Faktoren gezielt zur Differenzierung in einzelne Zelltypen, z.B. Nervenzellen, Fibroblasten etc., veranlaßt und dann die Wirkung verschiedener Chemikalien, z.B Arzneiwirkstoffe, auf diese speziellen Zellen untersucht. Zur Untersuchung eines breiten Spektrums von differenzierten Zel- len müssen verschiedene spezielle Zellkulturen hergestellt und getestet werden. Bei Verwendung herkömmlicher adulter Stammzellen mit einem begrenzten Differenzierungsspektrum e- fordert dies gewöhnlich die Züchtung der differenzierten Zellkulturen aus unterschiedlichen Ausgangsstammzellen mit oft sehr unterschiedlichen Anforderungen an die Wachstumsbedingungen. Dies ist in der Regel mit einem Mehraufwand an Zeit und Kosten verbunden. Dieser Nachteil kann durch Verwendung pluripotenter embryonaler Stammzellen, die in unter- schiedlichste Zelltypen aller drei Keimblätter differenzieren können, teilweise vermieden werden. Allerdings ist die Verwendung humaner embryonaler Stammzellen aus ethischen Gründen ebenfalls bedenklich und deren Verfügbarkeit ist begrenzt. Überdies sind selbst bei der Verwendung pluripotenter e bryo- naler Stammzellen in diesen herkömmlichen Testsystemen mehrere verschiedene und räumlich getrennte Zellkulturen erforderlich. Ein weiterer, wesentlicher Nachteil dieser Zellmonokulturen besteht darin, daß die Wirkung einer Substanz auf einen Verbund verschiedener Zellen, wie er in einem natürlichen Ge- webe oder Organ vorliegt, nicht untersucht werden kann.
Demgemäß besteht die Aufgabe der Erfindung darin, verbesserte multizelluläre, insbesondere humane, in vitro-Testsysteme und Verfahren bereitzustellen, mit denen die Wirkung von Substan- zen auf verschiedene Zelltypen und insbesondere auf einen Verbund verschiedener Zelltypen, wie er in natürlichen Geweben und Organen vorliegt, schnell und einfach festgestellt werden kann.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß multipotente oder pluripotente adulte Stammzellen, wie sie aus exo- krinem Drüsengewebe gewonnen werden können (PCT 2004/003810) , mit einfachen Mitteln zur Aggregierung und Differenzierung in dreidimensionale Zellaggregate, sogenannte organoide Körper oder Organoid Bodies, veranlasst werden können, welche bereits ohne Zugabe spezieller Differenzierungsfaktoren ein Spektrum von mindestens zwei Zelltypen enthalten. Diese orga- noiden Körper wachsen bei ausreichender Nährstoffversorgung ständig weiter und entwickeln gewebe- oder organartige Strukturen, in diesem Stadium werden sie auch als Gewebekörper bezeichnet. Setzt man diese organoiden Körper chemischen Substanzen aus, kann deren Wirkung, falls vorhanden, durch eine morphologische oder anderweitig nachweisbare Veränderung dieser organoiden Körper bzw. der darin enthaltenen Zelltypen festgestellt werden. Auf diese Weise können verschiedene Zelltypen gleichzeitig oder nacheinander schnell getestet werden und insbesondere auch gewebe- bzw. organähnliche Zell- verbände untersucht werden.
Somit werden die obengenannten Probleme erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Testen von Substanzen gemäß Anspruch 1 sowie von Vorrichtungen und Kits zur Durchführung dieses Verfahrens nach den Ansprüchen 23, 24 und 28. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Zur Bildung der erfindungsgemäß verwendeten organoiden Körper oder Organoid Bodies werden multipotente oder pluripotente adulte Stammzellen verwendet. Vorzugsweise werden diese plu- ripotenten Stammzellen aus exokrinem Drüsengewebe isoliert.
Das exokrine Drüsengewebe kann von einem erwachsenen Indivi- duum oder juvenilen Individuum stammen. Der Begriff "adult", wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich somit auf das Entwicklungsstadium des Ausgangsgewebes und nicht auf dasjenige des Donors, aus dem das Gewebe stammt. "Adulte" Stammzellen sind nicht-embryonale Stammzellen.
Vorzugsweise wird das exokrine Drüsengewebe aus einer Spei- cheldrüse, Tränendrüse, Talgdrüse, Schweißdrüse, aus Drüsen des Genitaltrakts, einschließlich Prostata, oder aus gastro- intestinalem Gewebe, einschließlich Pankreas, oder sekretorischem Gewebe der Leber isoliert. In einer stark bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um acinäres Gewebe. Ganz besonders bevorzugt stammt das acinäre Gewebe aus dem Pankreas, der Ohrspeicheldrüse oder Unterkieferspeicheldrüse.
Die aus solchen Quellen erhaltenen adulten Stammzellen sind leicht zu isolieren und in einer stabilen Langzeitkultur ohne Feederzellschicht oder spezielle Zusätze im weitgehend undif- ferenzierten Zustand zu halten. Der Begriff Feederzellen, wie hier verwendet, umfasst alle Zellen, die das Wachstum der eigentlich zu kultivierenden Zellen dadurch fördern, dass sie Wachstumsfaktoren freisetzen und/oder eine extrazelluläre Matrix bereitstellen, bzw. die Differenzierung der Stammzellkultur verhindern.
Diese adulten Stammzellen können ohne Zusatz spezieller Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren auf einfache Weise zur Differenzierung angeregt -werden, indem sie unter räumlichen Bedingungen kultiviert werden, welche für einen dreidimensionalen Kontakt der Zellen sorgen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind diese Bedingungen die Kultivierung in hängenden Tropfen, wie sie für embryonale Stammzellen bereits beschrieben wurde (Wobus et al., Biomed. Biochim. Acta 47:965-973 (1988). Dieses Verfahren wird nachfolgend in den Beispielen noch näher beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass alternative Kultivierungsverfahren, die für den ge- wünschten dreidimensionalen Kontakt der Zellen sorgen und dem Fachmann bekannt und verfügbar sind, ebenso verwendet werden können. Beispiele für solche alternativen Verfahren sind die Kultivierung in bewegter Suspensionskultur, die Kultivierung in einem elektromagnetischen Feldkäfig oder Laser-Tweezer, die Kultivierung auf Oberflächen, an denen die Zellen nicht oder schlecht haften, oder die Aussaat nicht resuspendierter Zellen der Primärkultur. Solche Oberflächen können z.B. Glas, Polystyrol oder mit einer Anti-Adhäsionsschicht behandelte Oberflächen, z.B. PTFE- oder Poly-HEMA-beschichtete Oberflächen, sein.
Unter diesen Bedingungen entwickeln sich spontan dreidimensionale Zellverbände oder Zellaggregate, welche in Anlehnung an bereits für embryonale Stammzellen beschriebene "embryoid bodies" als "organoid bodies" oder organoide Körper bezeichnet wurden. Diese organoiden Körper oder Organoid Bodies können in Suspensionskulturen oder Adhäsionskulturen überführt und weiter kultiviert werden. Bei ausreichender Nährstoff- Versorgung wachsen diese organoiden Körper weiter und können Durchmesser von einigen Millimetern oder mehr erreichen. Diese großen Organoid Bodies zeigen eine gewebeartige Struktur und werden in diesem Stadium zur Unterscheidung von den einfachen Zellaggregaten auch als "Gewebekörper" bezeichnet.
Bringt man die Organoid Bodies wieder in Oberflächenkultur, entsteht aus auswachsenden einzelnen Zellen eine zelluläre Monoschicht, aus der Multilayerbereiche hervorgehen, aus denen spontan sekundäre Organoid Bodies mit vergleichbaren Ei- genschaften wie denjenigen der primären Organoid Bodies gebildet werden. Die erfindungsgemäßen Organoid Bodies können z.B. bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs eingefroren gelagert werden, ohne ihre Lebensfähigkeit, Vermehrungsfähig- keit, Wachstumsfähigkeit und Differenzierbarkeit zu verlieren.
Die organoiden Körper enthalten verschiedene Zelltypen aller drei Keimblätter. Zur Differenzierung sind keine Differenzierungsfaktoren notwendig und die Zellen müssen auch nicht transplantiert werden, um zu differenzieren. Es kann jedoch von Vorteil sein, solche Differenzierungsfaktoren einzusetzen, um gezielt größere Mengen eines bestimmten Zelltyps her- zustellen bzw. um organoide Körper mit einer bestimmten Zelltypzusammensetzung zu erzeugen.
Differenzierungsfaktoren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen z.B. bFGF ("basic fibroblast growth factor") zur verstärkten Bildung von Herzzellen und Fibroblasten, VEGF
("vascular endothelial growth factor") , DMSO und Isoprotere- nol, Fibroblastenwachstums aktor 4 (FGF4), Hepatozyten-
Wachstumsfaktor (HGF) zur verstärkten Bildung von Herz- und
Leberzellen, TGF-betal ("transforming growth factor betal") zur verstärkten Bildung von Herzzellen, EGF ("epidermal growth factor") zur verstärkten Bildung von Haut- und Herzzellen, KGF ("keratinocyte growth factor") (machmal zusammen mit Cortison) zur Bildung von Keratinozyten, Retinsäure zur verstärkten Bildung von Nerven-, Herz- und Nierenzellen, be- ta-NGF ("beta nerve growth factor") zur verstärkten Bildung von Gehirn-, Leber-, Pankreas- und Nierenzellen, BMP-4 ("bone morphogenic protein 4") und Activin-A zur Bildung mesoderma- ler Zellen generell, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Differenzierte Zellen, die in den organoiden Körpern enthalten sein können, umfassen Knochenzellen (Osteoblasten und Osteoclasten) , Chondrozyten, Adipozyten, Fibroblasten (z.B. Haut- und Sehnenfibroblasten) , Muskelzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, hematopoetische Zellen, sensorische Zellen, endokrine und exokrine Drüsenzellen, Gliazellen, neuronale Zellen, Oligodendrozyten, Blutzellen, Darmzellen, Herz-, Lungen-, Leber-, Nieren- oder Pankreaszellen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren wird die zu testende Substanz in Kontakt mit den organoiden Körpern gebracht und deren Wirkung gegebenenfalls durch eine morphologische oder anderweitig nachweisbare Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen festgestellt. Bei diesem Testverfahren handelt es sich beispielsweise um ein Verfahren zur Analyse der Wirkung bekannter oder potenzieller Wirkstoffe oder Giftstoffe oder Mutagene auf alle oder spezielle Zelltypen der organoiden Körper. In einer spezielleren Ausführungsform handelt es sich um ein Verfahren zum Screenen von Arzneiwirkstoffen oder Kosmetika.
Die Testsubstanz kann von unterschiedlichster chemischer Na- tur sein, z.B ein Protein, Lipid, eine Nukleinsäure, z.B. RNA, DNA oder ein Derivat davon, eine niedermolekulare oder hochmolekulare chemische Verbindung, ein chemisches Element oder eine Mischung dieser Substanzen. Es können auch zwei o- der mehr Testsubstanzen nacheinander oder gleichzeitig mit denselben organoiden Körpern getestet werden, um beispielsweise Wechselwirkungen der Testsubstanzen festzustellen.
Das Kontaktieren der Testsubstanz (en) mit den organoiden Körpern kann, abhängig von der Art der Testsubstanz, auf jede geeignete Weise erfolgen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt. Falls es sich bei der Testsubstanz um eine Nukleinsäure, z.B. RNA, DNA oder ein Derivat davon, handelt, kann diese (s) mit irgendeinem bekannten Verfahren der Gen- technik, einschließlich der Verwendung von Vektoren, Viren, Elektroporation etc., in die Zellen der organoiden Körper eingeführt werden. Eine im Kulturmedium lösliche oder solubi- lisierbare Testsubstanz wird vorzugsweise einfach dem Zell- kulturmedium, in dem sich die organoiden Körper befinden, zugegeben und die Organoide werden mit der Testsubstanz in geeigneten Konzentrationen für verschiedene gewünschte Zeiträume inkubiert. Gewünschtenfalls kann verbrauchtes Zellkulturmedium während der Inkubation durch frisches Medium mit der gewünschten Konzentration an Testsubstanz ersetzt werden, z.B. um die Wirkstoffkonzentration im Medium etwa konstant zu halten. Je nach Art des Wirkstoffes können die wirksamen Konzentrationen der Testsubstanz in großem Umfang variieren, können jedoch vom Fachmann unschwer durch Routineversuche be- stimmt werden. Der KontaktZeitraum kann von einigen Minuten bis einigen Stunden und mehren Tagen und Wochen variieren. Kontaktzeiträume von mehreren Wochen sind dabei nicht unüblich. Geeignete Kontaktzeiträume werden ebenfalls von der Art des Wirkstoffs abhängen und können vom Fachmann durch Routi- neversuche bestimmt werden. Anschließend werden die behandelten Organoide und eine Kontrolle ohne Testsubstanz, die genauso lange inkubiert wurde, einem Nachweisverfahren unterworfen.
Das Nachweisverfahren wird von der Art des Wirkstoffes und Art der zu beobachtenden Veränderung der organoiden Körper bzw. der darin enthaltenen differenzierten Zellen abhängen.
Eine Reihe von Methoden zum Nachweis der Wirkung von Arznei- Stoffen oder Giftstoffen auf Säugerzellen wird von A. Vickers in „In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997, beschrieben. Grundlegende Methoden für das Arz- neiwirkstoff-Screening werden von Smith, CG., „The process of New Drug Development, CRC Press, 1992, und in „Advances in Drug Discovery Tchniques", Hrsg. Alan L. Harvey, John Wiley & Sons, 1998, beschrieben.
In speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfaßt der Nachweis der Wirkung einer Substanz die Anwendung eines oder mehrerer Verfahren, das oder die aus der Gruppe aus Protein-Assays, Im unoassays, enzymatischen Assays, Re- zeptorbindungs-Assays, ELISA-Assays, RIA-Assays, elektropho- retischen und chromatographischen Assays, einschließlich HPLC, Northernblots, Southernblots, Westernblots, kolori- metrischen Assays, immunhistochemisehen, elektrophysiologi- schen Methoden (d.h. Strom- Spannungs- und Impedanzmessungen) , mikroskopischen und spektroskopischen Nachweismethoden ausgewählt ist bzw. sind.
Die Wirkung der Substanz kann z.B. eine Veränderung der Morphologie oder des Proliferationsvermögens, Wachstumsvermögens oder der Lebensfähigkeit aller Zelltypen oder spezieller Zelltypen der organoiden Körper sein. In diesem Fall können z.B. direkte visuelle und optische Nachweisverfahren, einschließlich zytometrischer, mikroskopischer und colorimetri- scher Verfahren, günstig eingesetzt werden.
Alternativ oder gleichzeitig kann die Wirkung eine Veränderung der Aktivität spezieller oder aller Zelltypen der organoiden Körper sein. Bespielsweise kann sich diese Aktivitätsänderung in einem vermehrten oder verringerten oder erstmaligen Auftreten einer nachweisbaren Markersubstanz in oder auf den betroffenen Zellen äußern. In diesem Fall erfolgt der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz vorzugsweise ü- ber den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit oder Menge einer Markersubstanz, die von speziellen oder allen Zelltypen der organoiden Körper gebildet wird.
Diese Markersubstanz kann z. B. ein Protein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Antikörper, Rezeptor, Enzym, Hormon, Ionenkanal, Neurotransmitter, Oberflächenmarker, RNA, DNA, ein Proteoglycan, ein Lektin oder eine andere geeignete Substanz sein. Einige zelltypspezifische Beispiele von Markersubstanzen werden im folgenden genannt, sind jedoch kei- neswegs als beschränkend anzusehen: PGP 9.5 und NF für Nervenzellen, S 100 und GFAP für Gliazellen, SMA für Muskelzellen (bzw. Myofibroblasten) , Kollagen Typ II für Knorpelzellen, Amylase und Trypsin für exokrine Drüsenzellen, Insulin für endokrine Drüsenzellen, Vigilin für stark translatierende Zellen und Cytokeratin für epidermale Zellen, Kollagen Typ II für Chondrozyten, Osteonektin für Osteoblasten und Vorläuferzellen, Osteocalcin für reife Osteoblasten, CD45, CD34, CD13 für hematopoetische Zellen, cTNI („cardiac troponin I"), cTNT („cardiac troponin T") und ANF („atrial natriuretic factor") für Kardiomyozyten, Kollagenase 1 und TIMP-1 („tissue inhibi- tor of metalloproteinase I") für Fibroblasten, Skelett-Alpha- Aktin und Tropomyosin für gestreifte Muskelzellen, Lipopro- teinlipase (LPL) für Adipozyten, Alpha-Fetoprotein für Leberzellen. Eine sehr große Anzahl solcher Markersubstanzen ist im Stand der Technik bekannt.
Diese Markersubstanzen können z.B durch Bindung an einen spezifischen Bindungspartner, der mit einer nachweisbaren Gruppe konjugiert ist, nachgewiesen werden. Die nachweisbare Gruppe kann z.B. ein Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff, eine radiaktive Markierung, Enzymmarkierung, Lumineszenzmarkierung, Magnetresonanzmarkierung oder eine andere im Stand der Technik bekannte Markierung sein. Falls die Markersubstanz ein Prote- in ist, wird der Bindungspartner vorzugsweise ein markierter oder markierbarer Antikörper sein. Solche markierten Antikörper sind bereits für eine Vielzahl von Markersubstanzen bekannt und können entweder im Handel bezogen oder unschwer nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Gegebenenfalls können auch markierte oder markierbare sekundäre Antikörper verwendet werden. Der spezifische Bindungspartner kann auch ummarkiert, jedoch an eine Affinitätsäule oder einen anderen Träger gebunden sein. In diesen Fällen können Zellen, welche die Markersubstanzen auf ihrer Oberfläche aufweisen, durch die spezifische Bindung an diese Träger nachgewiesen werden.
In einigen Fällen kann die Markersubstanz auch durch ihre eigene Aktivität nachgewiesen werden, so z.B. wenn es sich um einen Ionenkanal oder Neurotransmitter handelt oder um ein Enzym, das mit einem nachweisbaren Substrat umgesetzt werden kann. Falls die Markersubstanz eine DNA oder RNA ist, kann sie entweder direkt durch komplementäre und gegebenenfalls markierte Sonden nachgewiesen werden oder indirekt durch den Nachweis eines Genprodukts, falls es sich um eine vollständige kodierende Sequenz oder um eine regulatorische Sequenz handelt. Ein weitere Möglichkeit ist eine gesteigerte DNA- oder RNA-Synthese an sich oder eine gesteigerte DNA- Reparatur-Aktivität. Solche Aktivitäten können z.B. durch den Einbau von radioaktiv oder anderweitig markierten Nukleotiden festgestellt werden.
Der Nachweis kann unter Erhalt der Zellstruktur, z.B. in mikroskopischen und im unhistochemischen Verfahren, oder unter Zerstörung der Zellstruktur, z.B. in einem Elektrophoreseverfahren wie Southernblots, Northernblots oder Westernblots, erfolgen. In einem fortgeschrittenen Stadium der Differenzierung weisen die organoiden Körper gewebe- oder organähnliche Strukturen auf, die von zwei oder oder mehr verschiedenen Zelltypen gebildet werden (vgl. Fig. 2-4). Solche Strukturen sind z.B. neuromuskuläre Strukturen oder Glia-Nervenzell-Strukturen o- der Hautzellstrukturen. Durch Kultivierung der organoiden Körper in einem Medium mit speziellen Differenzierungsfaktoren kann die Ausbildung gewünschter Strukturen gefördert werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bewirkt die Testsubstanz eine Veränderung dieser Strukturen. Diese Veränderung kann z.B eine Zerstörung der Strukturen, Hemmung oder Stimulation der Entwicklung der Strukturen oder eine Veränderung der Aktivität eines oder mehrerer Zelltypen, aus denen sich diese Strukturen zusammensetzen, sein. Demgemäß kann der Nachweis der Wirkung der Testsubstanz in einem Nachweis der Veränderung dieser Strukturen bestehen. Geeignete Nachweismethoden können z.B. eine direkte Beobachtung der morphologischen Veränderungen, gegebenenfalls gekoppelt mit immunologischen, immunhistochemischen oder anderen Nachweismethoden, umfassen.
Nachdem, wie bereits oben erwähnt, die Zelltypzusammensetzung der organoiden Körper durch deren Kultivierung in Gegenwart spezifischer Differenzierungsfaktoren festgelegt werden kann, bedeutet dies, daß die Zelltypzusammensetzung der organoiden Körper in spezielleren Ausführungsformen auf die mutmaßliche zelltypspezifische Wirkung der Testsubstanz abgestimmt werden kann. Das bedeutet konkret, daß z.B organoide Körper mit einem hohen Anteil an Nervenzellen oder organoide Körper, die vorwiegend oder ausschließlich neuromuskuläre Strukturen oder Nerven-Gliazell-Strukturen aufweisen, in einem Testsystem verwendet werden, bei dem Testsubstanzen mit einer mutmaßlichen Wirkung auf das Nervensystem untersucht werden. Analog dazu können organoide Körper mit einem hohen Anteil an Epithelzellen oder mit hautähnlichen Strukturen bei einem Test von Testsubstanzen, die mutmaßlich über die Oberfläche wirken, eingesetzt werden. Weitere derartige spezielle Testsysteme werden für den Fachmann unschwer ersichtlich und realisierbar sein.
In weiteren spezielleren Ausführungsformen befinden sich die organoiden Körper in Hohlräumen, Matrices oder anderen Träger- und/oder Formgebungssystemen. Das Einbringen der Organoiden kann beispielsweise durch Einwachsenlassen geschehen. Die Hohlräume können beispielsweise Mikrokanale oder Kapilla- ren zur Impedanzmessung sein. Der Nachweis der Wirkung der Testsubstanz kann dann z.B. in einer Impedanzänderung bestehen. Alternativ kann auch ein Gradient (z.B pH, elektrochemisch, Signalfaktoren etc.) über einen organoiden Körper erzeugt werden und die Wirkung der Testsubstanz durch eine Än- derung dieses Gradienten angezeigt werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend die organoiden Körper in einem geeigneten Behälter, Träger- oder Formgebungssystem, Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden chemischen Substanz sowie Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen. In einer spezielleren Ausführungsform dieses Aspekts befinden sich die organoiden Körper in Hohlräumen, z.B. Mikrokanälen oder Kapillaren, oder in Matrices. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Kits bereitgestellt. Ein solcher Kit umfaßt adulte Stammzellen oder die davon abgeleiteten organoiden Körper oder diffe- renzierten Zellen in einem geeigneten Kulturmedium zur Aufrechterhaltung der Zellen bzw. der organoiden Körper, gegebenenfalls kryokonserviert . Ferner kann der Kit weitere Hilfsmittel, z.B. Reagenzien zur Kultivierung und Differenzierung der Stammzellen zu organoiden Körpern einer gewünschen Zell- typzusammensetzung, Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden chemischen Substanz, Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen, umfassen.
FIGURENBESCHREIBUNG
Figur 1: zeigt schematisch die Kultivierung der Stammzellen in Oberflächenkultur und in hängenden Tropfen sowie die Bildung und weitere Kultivierung von organoiden Körpern.
Fig. 2 zeigt die Expression von Markern neuronaler Zellen, glialer Zellen und glatter Muskelzellen sowie von Amylase und Insulin in den differenzierten Zellen der organoiden Körper. a,b: PGP 9.5-markierte Nervenzellen zeigen multipolare Ausläufer, welche zahlreiche Varikositäten zeigen. c,d: das Neurofilament-System (helle Pfeile, im Originalfoto grün markiert) reicht durch das Pericaryon in die cytoplasmatischen Ausläufer. In enger Nachbarschaft liegen GFAP-immunreaktive Glia- zellen (dunkle Pfeile, im Originalfoto rot markiert) . e,f: -SMA-markierte Zellen (dunkle Pfeile, im Original rot) und NF-markierte Nervenzellen (helle Pfeile, im Original Grün) bilden ein primitives neuro-muskuläres Netzwerk (e) , wobei Kontakte über beträchtlich lange Entfernungen etabliert wer- den (f) . g: Immunfärbung von GFAP (dunkle Pfeile, im Original rot) und NF (helle Pfeile, im Original grün) in 3 Wochen alten OB mit Konzentrationen an Nerven- und Gliazellen. h: Immunfärbung von α-SMA (dunkle Pfeile, im Original rot) und NF (helle Pfeile, im Original grün) in 3 Wochen alten OBs in einem fortgeschrittenen Stadium der Bildung eines neuro-muskulären Netzwerks. i,j: in Querschnitten von 8 Wochen alten OBs wurden für NF immunreaktive Zellen in direkter Nachbarschaft von Zellen gefun- den, die immunreaktiv für α-SMA waren, ähnlich wie in nativen Geweben, k: eine Untergruppe von Zellen zeigt eine positive Färbung für Amylase (helle Pfeile, im Original grün). 1: Eine weitere Zelluntergruppe enthält granuläre Vesikel mit Im unreak- tivität für Insulin. Die Kerne sind mit DAPI kontrastgefärbt (im Original blau) .
Fig. 3 zeigt die Expression von extrazellulären Matrixkomponenten und Cytokeratinen. a,b: Globuläre (a) und fibrilläre (b) Speicher von Proteoglycanen ergaben eine Färbung mit Alcianblau. c-e: Die globulären (c) und fibrillären (d) Bereiche sind immunreaktiv für das Knorpelmatrixprotein Kollagen II. Zwei individuelle Zellen (e) zeigen eine cytoplasmatische Markierung von Kollagen II. f: Zellen, die für Cytokeratine immunreaktiv sind, sind in Clustern angeordnet, g: konfokale Lasers- canningmikroskopie eines OB. Die Kollagen II- Immunreaktivität (dunkle Pfeile, im Original rot markiert) nimmt zur Mitte des OB hin zu. Vigilin- im unreaktive Zellen (helle Pfeile, im Original grün markiert) sind hauptsächlich am äußeren Rand des OB lokalisiert, was deren hohe Translationsak- tivität anzeigt. Die Kerne sind mit DAPI kontrastgefärbt .
Fig. 4 zeigt die Transmissionselektronenmikroskopie differenzierter OB. a-c: glatte Muskelzellen mit Myofilamenten. Das My- ofilamentsystem erstreckt sich über das Cytoplasma in disseminierten Bündeln (a) und zeigt typische dichte Körper (Pfeile) (b) . Die Myoblasten zeigen sternförmige Zellausläufer, die ein verbindendes Netzwerk bilden (c) . d: Zellausläufer mit einer An- Sammlung von zahlreichen Vesikeln kleiner Größe, die höchstwahrscheinlich Nervenfaservarikositäten entsprechen. e: Kollagen- und Retikulumfasern. f-h: Sekretorische Zellen zeigen elektrodichte Ve- sikel. f) . Häufig kontaktieren sekretorische Zellen einander, um acinusartige Strukturen zu bilden (g) . Ein Untergruppe von sekretorischen Zellen enthält Vesikel (Pfeil) die Ultrastruktur-Merkmalen von endokrinen Granula entsprechen (h) , z.B. Beta-Granula von insulinproduzierenden Zellen. 1: Beginn der Ausbildung einer Epitheloberfläche (Pfeil) in acht Wochen alten OBs. j: typische Zellkontakte zwischen Keratinozyten und Desmosomen (Pfeile)
Figur 5A: zeigt mikroskopische Vergleichsaufnahmen eines un- behandelten und eines mit Puromycin behandelten or- ganoiden Körpers.
Figur 5B: zeigt Westernblots von Proteinauftrennungen der Ho- mogenisate der in Figur 5A gezeigten Organoide mit dem Nachweis des Translationsmarkers Vigilin. Figur 6: zeigt Westernblots von Proteinauftrennungen der Ho- mogenisate von mit Retinsäure behandelten und unbe- handelten organoiden Körpern mit dem Nachweis des Proteinmarkers α-SMA (Fig. 6A) bzw. dem Nachweis von Neurofilamenten (NF) (Fig. 6B) .
Figur 7 : zeigt Westernblots von Proteinauftrennungen der Ho- mogenisate von mit HGFR behandelten und unbehandel- ten organoiden Körpern mit dem Nachweis des Leberproteins α-Fetoprotein. Figur 8: zeigt Westernblots von Proteinauftrennungen der Ho- mogenisate von mit konditioniertem Medium von Chondrozyten-Primärkulturen behandelten und unbe- handelten organoiden Körpern mit dem Nachweis des Knorpelproteins Kollagen-II.
Figur 9: zeigt einen prinzipiellen Aufbau und Versuchsablauf für das Testen von Substanzen unter Einsatz der erfindungsgemäßen Verfahren und Systeme.
Entsprechend dem in Figur 1 dargestellten Schema wird zur Gewinnung der Stammzellen exokrines Drüsengewebe, z.B. acinäres Gewebe - bevorzugt einer Speicheldrüse oder der Bauchspeicheldrüse (Pankreas) - mechanisch und enzymatisch zerkleinert in Kultur genommen (Schritt 10 in Figur 1) . Entgegen den An- gaben von Bachern et al., Gastroenterol . 115:421-432 (1998), und Grosfils et al., Res. Co m. Chem. Pathol. Pharmacol. 79:99-115 (1993), werden keine Gewebeblöcke kultiviert, aus denen Zellen auswachsen sollen, sondern unter der Bedingung, dass die Zellverbände der Acini weitestgehend intakt bleiben, das Gewebe stärker zerkleinert.
Über mehrere Wochen werden diese Zellen und Zellverbände in Kulturgefäßen kultiviert. Alle 2 bis 3 Tage wird das Medium gewechselt, wobei alle differenzierten Zellen entfernt werden. Bei den in Kultur persistierenden Zellen handelt es sich um undifferenzierte Zellen mit uneingeschränkter Teilungsfähigkeit .
Ähnliche Zellen sind unter gleichen Bedingungen aus dem Pankreas isoliert und beschrieben und als eine Art Myo- fibroblasten bzw. pankreatische Sternzellen bezeichnet worden (Bachern et al., 1998). Im Gegensatz zu den Zellen der vorlie- genden Erfindung konnte eine uneingeschränkte Teilungsfähigkeit jedoch nicht beobachtet werden. Weiterhin konnten diese Zellen auch nicht unbegrenzt passagiert werden, ohne an Vitalität zu verlieren.
In einem zweiten Schritt (12) werden ungefähr 400 bis 800 Zellen in je 20 μl Medium in hängenden Tropfen kultiviert. Dazu werden die Tropfen auf Deckel von bakteriologischen Pet- rischalen gegeben, umgedreht und über die mit Medium gefüllte Petrischale gelegt, so dass die Tropfen nach unten hängen.
Durch diese Art der Kultivierung bilden sich innerhalb von 48h die als organoide Körper bezeichneten Zellaggregate (14), die für ungefähr 6 Tage in eine Suspensionskultur umgesetzt werden (16). Die Teilansicht (18) aus Figur 1 zeigt eine mik- roskopische Aufnahme eines solchen organoiden Körpers.
Die in Suspensionskultur wachsenden Organoid Bodies bilden neue Organoid Bodies, die auch bei Einzelzellen die Bildung von neuen Organoid Bodies induzieren. Die Zellen sind sowohl als Organoid Bodies als auch als Einzelzellen einfrierbar und behalten dabei ihre Vitalität und ihr Differenzierungspotenzial . Die Figuren 2-4 zeigen mikroskopische und elektronenmikroskopische Aufnahmen von differenzierten Zellen, die aus solchen Organoid Bodies oder organoiden Körpern erhalten wurden.
Dabei konnte z.B. die Bildung eines neuro-muskulären Netzwerks beobachtet werden:
Aus OBs erhaltene Zellen exprimierten stark α-SMA ("s ooth- muscle-actin") (Fig. 2e-f) . Die Anwesenheit verbreiteter Bündel von Myofilamenten, welche sich über das Cytoplasma er- streckten, wurde durch Elektronenmikroskopie bestätigt (Fig. 4a-c) . Ferner wurden Zellen identifiziert, welche für den pan-Neuronenmarker PGP 9.5 und für Neurofilamente (NF) immunreaktiv waren. Das Neurofilamentsystem reichte vom Pericaryon in die radialen cytoplasmatischen Ausläufer (Fig. 2c, d). PGP 9.5-immunreaktive Zellen zeigten zahlreiche Varikositäten entlang ihrer verzweigten Ausläufer (Fig. 2a, b, 4d) und entsprachen damit typischen morphologischen Merkmalen autonomer Nervenfasern. Zellen, die für GFAP ("glial fibrillary acidic protein") immunreaktiv waren, befanden sich in enger Nachbar- schaft zu Zellen, die neuronale Marker exprimierten (Fig. 2c, d). Häufig erstreckten sich die filamentösen Proteine nicht durch das gesamte Cytoplasma, sondern waren auf Gebiete neben den Nervenzellen beschränkt. Ferner waren glatte Muskelzellen und Nervenzellen nicht willkürlich verstreut, son- den bildeten zusammenhängende Netzwerke mit unschwer unterscheidbaren Verbindungen (Fig. 2e,f). Nervenfaserausläufer erstreckten sich über beträchtlich große Entfernungen, um benachbarte glatte Muskelzellen als ihre mutmaßlichen Ziele zu kontaktieren. Somit zeigten die beiden Zelltypen aufgrund ih- rer topographischen Anordnung Merkmale eines primitiven neu- romuskulären Netzwerks. Bei 3 Wochen alten OBs wurde eine beginnende Bildung von gewebeähnlichen Strukturen festgestellt (Fig. 2g-j ) . Hier wurde ein Cluster von faserförmigen Nerven- zellen in Kontakt mit Gliazellen gefunden (Fig. 2g) oder weiter entwickelt zu einem dreidimensionalen neuro-muskulären Netzwerk (Fig. 2h), was in Querschnitten von 8 Wochen alten OBs bestätigt wurde (Fig. 2i,j).
Nachweis der Expression exokriner und endokriner pankreati- scher Proteine:
Immunhistochemische Anfärbungen zeigten, dass zelluläre Untergruppen positiv für Amylase waren (Fig. 2k) . Das Immunre- aktionssignal war auf klar unterscheidbare Vesikel inerhalb des apikalen Cytoplasmas beschränkt. Darüber hinaus waren die meisten Zellcluster, die für Amylase immunreaktiv waren, in Kreisen angeordnet, wobei die sekretorischen Vesikel eine Position zur Mitte hin aufwiesen, welches eine morphologische Anordnung ähnlich der von exokrinen Pankreas-Acini ist. Andere zelluläre Untergruppen zeigten Immunreaktivität für Insulin (Fig. 21). Ähnlich wie bei den Amylase-positiven Zellc- lustern, war das sekretorische Produkt in vesikulären Strukturen gespeichert, die an einem Zellpol konzentriert waren. Die Anwesenheit sekretorischer Zellen wurde durch Elektronenmikroskopie bestätigt, welche dicht verteilte elektrodichte Partikel zeigte, wie sie charakteristisch für exkretorische oder inkretorische Funktionen sind (Fig. 4f-h) .
Ebenfalls beobachtet wurde eine Differenzierung in chondroge- ne Zellen und Epithelzellen:
Nach einer Wachstumsperiode von zwei Monaten zeigten OBs chondrogene Eigenschaften. Eine Alcianblaufärbung offenbarte Bereiche mit hohen Konzentrationen an Proteoglycanen (Chondroitinsulfat) , die entweder als globuläre (Fig. 3a) o- der fibrilläre (Fig. 3b) Ablagerungen vorkamen. Immunhistochemische Anfärbungen mit Antikörpern, die gegen das Knorpelmatrixprotein Kollagen II gerichtet waren, belegten zusätz- lieh die chondrogene Aktivität innerhalb dieser globulären (Fig. 3c) und fibrillären (Fig. 3d) Bereiche. Die Immunreaktivität war am höchsten in der Mitte der zellulären Aggregate, die am wahrscheinlichsten Bereichen von sich entwickeln- der extrazellulärer Knorpelmatrix entsprach. Diese Beobachtung wurde durch konfokale Mikroskopie bestätigt (Fig. 3g) : während die Menge der Kollagen-Speicher zur Mitte der zellulären Agregate hin zunahm, waren die Randbereiche durch aktiv translatierende Zellen charakterisiert, wie durch deren hohe Vigilin-Expression demonstriert, die gewöhnlich bei Zellen mit aktiver Translationsmaschinerie, z.B. Kollagen-syn- thetisierenden Chondrozyten oder in Fibroblasten während der Chondroinduktion, gefunden wird. Typische einzelne Kollagen II-trans-latierende Chondrozyten wurden auch in auswachsenden Zellen von OBs beobachtet, die eine Kollagen II-haltige Matrix produzierten, welche die Einzelzellen umgab (Fig. 3e) . Eine Ultrastruktur-Untersuchung dieser Bereiche konnte klar ein Netzwerk von Retikulumfasern und Kollagenfasern zeigen, wobei die letzteren durch ihre charakteristisches Bandenmus- ter identifiziert wurden (Fig. 4e) . Einige Zellen exprimierten neben esenchymalen Markern auch mehrere Cytokeratine, was deren Potenzial zur Differenzierung in Epithelzellen anzeigt. Jedoch wurden Zellen, die für Cytokeratine immunreaktiv waren, weniger häufig gefunden als Zellen, die Marker von glatten Muskelzellen und Neuronen exprimierten. Typischerweise waren sie in Clustern angeordnet, die innerhalb der OBs disseminiert waren (Fig. 3f) . Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen wurden typische Zellkontakte zwischen Kerati- nozyten gefunden (Fig. 4j) und bei 8 Wochen alten OBs wurden Epithelzellen auf der Oberfläche gefunden, welche aus dem Zellkulturmedium in die Luft wuchs. Insgesamt konnten bisher z.B. folgende Marker für spezifische Zellen positiv getestet werden: PGP 9.5 und NF für Nervenzellen, S 100 und GFAP für Gliazellen, SMA für Muskelzellen (bzw. Myofibroblasten) , Kollagen Typ II für Knorpelzellen, Amylase und Trypsin für exokrine Drüsenzellen, Insulin für endokrine Drüsenzellen, Vigilin für stark translatierende Zellen und Cytokeratin für epidermale Zellen. Neben den lichtmikroskopischen Untersuchungen konnten auch elektronenmikroskopisch verschiedene Zelltypen morphologisch charakte- risiert werden, sowie Zell-Zell-Kontakte als Zeichen für zelluläre Interaktionen gefunden werden.
Es wurden bisher u.a. glatte Muskelzellen, Neuronen, Gliazellen, Epithelzellen, Fettzellen, Herzzellen, Nierenzellen, Fibroblasten (z.B. Haut- und Sehnenfibroblasten) , Chondrozyten, endokrine und exokrine Drüsenzellen und damit Zelltypen aller drei Keimblätter in diesen organoiden Körpern morpholσ- gisch/histologisch und/oder immunochemisch nachgewiesen.
In den folgenden, nicht-beschränkenden Beispielen soll die vorliegende Erfindung näher erläutert werden.
Die allgemeinen Arbeitsanweisungen, wie sie für Verfahren zur Kultivierung von Säugerzellen, insbesondere humanen Zellen, gebräuchlich sind, sind zu beachten. Eine sterile Umgebung, in der das Verfahren durchgeführt werden soll, ist - auch wenn hierzu keine weitere Beschreibung erfolgt - in jedem Fall einzuhalten. Folgende Puffer und Medien wurden verwendet: HEPES-Stammlösung (pH 7.6) 2,3 83 g HEPES auf 100 ml A. bidest. HEPES-Eagle-Medium (pH 7,4) 90 ml Modifϊed Eagle Medium (MEM) 10 ml HEPES-Stammlösung
Isolationsmedium (pH 7,4) 32 ml HEPES-Eagle-Medium 8 ml 5% BSA in A. bidest. 300 μl 0,1 M CaC12 100 μl Trasylol (200.000 KIE)
Digestionsmedium (pH 7,4) 20 ml Isolationsmedium 4 ml Kollagenase (Kollagenase NB 8 von Serva) Inkubationsmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
Nährmedium Dulbecco's Modifϊed Eagle Medium (DMEM) DMEM + 4500 mg/1 Glucose + L-Glutamin - Pyruvat + 20 % FKS (inaktiviert) + 1 ml/100 ml Pen/Strep (10000 E/l 0000 μg/ml) oder DMEM + 10 % Eigenplasma + l ml/100 ml Pen/Strep, vor Gebrauch auf 37°C erwärmen
Differenzierungsmedium 380 ml DMEM 95 ml 30 min bei 54 °C inaktiviertes FKS 5 ml Glutamin (GIBCO BRL) 5 ml (3,5 μl ß-Mercaptoethanol auf 5 ml PBS) 5 ml Non-essential arnino acids (GIBCO BRL) 5 ml Penicillin/Streptomycin (GIBCO BRL) (10000 E/l0000 μg/ml)
Statt fötalem Kalbserum (FKS) im Nährmedium und Differenzie- rungsmedium kann gegebenenfalls auch Plasma oder Serum einer anderen geeigneten Spezies, insbesondere Humanplasma oder, weniger bevorzugt, Humanserum, verwendet werden. Das Nährmedium kann als Basismedium statt des verwendeten DMEM-Mediums auch ein anderes für die Kultivierung von euka- ryotischen Zellen, insbesondere Säugerzellen, bekanntes geeignetes Basismedium enthalten, in dem die differenzierten Zellen absterben und sich die gewünschten Stammzellen vermehren. Auch Isolationsmedium, Inkubationsmedium und Differenzierungsmedium können ein anderes übliches und geeignetes Basismedium enthalten.
Die folgenden Beispiele 1 bis 3 beschreiben Arbeitsprotokolle zur Isolierung und Kultivierung adulter pluripotenter Stammzellen aus acinärem Gewebe des Pankreas bzw. aus acinärem und tubulösem Gewebe der Speicheldrüse. BEISPIEL 1
Zur Isolierung und Kultivierung von humanen adulten Stammzellen wurde humanes Gewebe von erwachsenen Patienten unmittelbar nach einem chirurgischen Eingriff erhalten und sofort aufgearbeitet. Aus dem chirurgisch entfernten Gewebe, z.B. Pankreasgewebe, wurde gesundes Gewebe abgetrennt und in Digestionsmedium, enthaltend HEPES-Eagle-Medium (pH 7,4), 0,1 mM HEPES-Puffer (pH, 7,6), 70% (Vol. /Vol.) modifiziertes Ea- gle-Mediu , 0,5 % (Vol. /Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland), 1 % (Gew. /Vol.) Rinderserumalbumin), 2,4 mM CaCl2 und Kollagenase (0,63 P/mg, Serva, Heidelberg, Deutschland) , aufgenommen (bei 20 °C, geringerer Stoffwechsel) . Das Pankreasgewebe wurde mit einer Schere sehr fein zerkleinert, oben schwimmendes Fettgewebe abgesaugt und die Gewebesuspension mit Carbogen (Messer, Krefeld, Deutschland) begast, ohne dass die Düse in das Medium mit den Zellen gelangt (Verringerung von mechanischem Streß) und damit auf pH 7,4 eingestellt. Danach wurde die Suspension in einem 25-ml-Erlen- meyerkolben (mit Alufolie bedeckt) unter konstantem Schütteln (150-200 Zyklen pro Minute) bei 37 °C in 10 ml Digestionsmedium inkubiert. Nach 15-20 Minuten wurde das oben schwimmende Fett und das Medium abgesaugt und das Gewebe wurde erneut zerkleinert und mit Medium ohne Kollagenase gespült (Vorgang mindestens zweimal wiederholen, vorzugsweise solange bis Zellfraktion transparent) , worauf Digestionsmedium zugegeben und erneut etwa 1 Minute lang mit Carbogen begast wurde. Es folgte wiederum eine Digestion mit Kollagenase für 15 Minuten bei 37 CC im Schüttler unter Verwendung desselben Puffers. Nach der Digestion wurden die Acini durch sukzessives Hochziehen und Ausstossen durch 10 ml-, 5 ml- und 2 ml-Glaspi- petten mit engen Öffnungen dissoziiert und durch ein einlagiges Nylonsieb (Polymon PES-200/45, Angst & Pfister AG, Zürich, Schweiz) mit einer Maschengröße von etwa 250 μm filt- riert. Die Acini wurden zentrifugiert (bei 37 °C und 600-800 UpM in einer Beckman-GPR-Zentrifuge, entspricht etwa 50-100 g) und weiter gereinigt durch Waschen in Inkubationsmedium, enthaltend 24,5 mM HEPES (pH 7,5), 96 mM NaCl, 6 mM KC1, 1 mM MgCl2, 2,5 mM NaH2P04, 0, mM CaCl2, 11,5 mM Glucose, 5 mM Na- triumpyruvat, 5 mM Natriumglutamat, 5 mM Natriumfumarat , 1 % (Vol. /Vol.) modifiziertes Eagle-Medium, 1 % (Gew. /Vol.) Rinderserumalbumin, mit Carbogen äquilibriert und auf pH 7,4 eingestellt. Die Waschprozedur (Zentrifugation, Absaugen, Re- suspension) wurde fünfmal wiederholt. Soweit nicht anders an- gegeben, wird bei der obigen Isolierung bei etwa 20 °C gearbeitet .
Die Acini wurden in Inkubationsmedium resuspendiert und bei 37 °C in einer angefeuchten Atmosphäre mit 5 % C02 kultiviert. Das acinäre Gewebe starb dabei schnell (innerhalb von zwei Tagen) ab und die sterbenden differenzierten Zellen lösten sich dabei von den benachbarten Zellen, ohne diese zu schädigen (schonende Isolierung) , die nicht absterbenden Stammzel- len sanken zu Boden und hefteten sich an. Die differenzierten Acinize-llen sind dazu nicht in der Lage. Das Inkubationsmedium wurde am zweiten oder dritten Tag nach dem Aussäen erstmals gewechselt, wobei ein Großteil der frei schwimmenden A- 5 cini und acinären Zellen entfernt wurde. Zu diesem Zeitpunkt hatten sich die ersten Stammzellen bzw. deren Vorläufer am Boden festgesetzt und begannen sich zu teilen. Der Mediumwechsel wurde danach an jedem dritten Tag wiederholt und differenzierte acinäre Pankreaszellen wurden bei jedem Medium- 10 Wechsel entfernt.
Am siebenten Tag in Kultur wurden die Zellen mit einer Lösung bestehend aus 2 ml PBS, 1 ml Trypsin (+ 0,05 % EDTA) und 2 ml Inkubationsmedium passagiert. Dabei lösen sich die Zellen vom
15 Boden der Kulturschale. Die Zellsuspension wurde 5 Minuten bei etwa 1000 UpM (Beckmann GPR-Zentrifuge) zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zellen in 2 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf eine mittlere Zellkulturflasche überführt und 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben.
20 Am vierzehnten Tag in Kultur wurden die Zellen erneut, aber diesmal mit 6 ml PBS, 3 ml Trypsin/EDTA und 6 ml Inkubationsmedium, passagiert. Die Zellsuspension wird 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und die Zel-
2.5 len in 6 ml Inkubationsmedium resuspendiert, auf 3 mittlere Zellkulturflaschen überführt und jeweils 10 ml Inkubationsmedium dazugegeben.
Am Tag 17 erfolgte ein drittes Passagieren auf insgesamt 6 30 mittlere Zellkulturflaschen und am Tag 24 ein viertes Passagieren auf insgesamt 12 mittlere Zellkulturflaschen. Spätestens jetzt waren alle primären Zellen bis auf die Stammzellen aus der Zellkultur entfernt. Die Stammzellen können weiter kultiviert werden und so oft passagiert und ausgesät wie gewünscht. Das Aussäen erfolgt vorzugsweise jeweils in einer Dichte von 2-4 x 105 Zellen/cm2 in Inkubationsmedium.
BEISPIEL 2 Pankreas-Acini wurden von männlichen Sprague-Dawley-Ratten (20-300 g) erhalten, die narkotisiert (C02) und über die dorsale Aorta ausgeblutet worden waren. Eine Kanüle wurde trans- duodenal in den Pankreasgang eingeführt und dem Pankreas wurde von hinten 10 ml Digestionsmedium, enthaltend HEPES-Eagle- Medium (pH 7,4), 0,1 mM HEPES-Puffer (pH, 7,6), 70% (Vol. /Vol.) modifiziertes Eagle-Medium, 0,5 % (Vol. /Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland), 1 % (Gew. /Vol.) Rinderserumalbumin), 2,4 mM CaCl2 und Kollagenase (0,63 P/mg, Serva, Heidelberg, Deutschland) injiziert.
Vor der Entfernung wurde der Pankreas von anhaftendem Festgewebe, Lymphknoten und Blutgefäßen teilweise befreit. Dann wurde gesundes Pankreasgewebe in Digestionsmedium abgeholt (bei 20 °C, geringerer Stoffwechsel) und das Pankreasgewebe mit einer Schere sehr fein zerkleinert und verarbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben. BEISPIEL 3 Die Isolierung und Kultivierung aus exokrinem Gewebe der Ohrspeicheldrüse erfolgte analog dem Pankreas-Protokoll mit den folgenden Abweichungen:
1. Das exokrine Gewebe der Ohrspeicheldrüse war eine Mischung von acinärem Gewebe und tubulösem Gewebe. 2. Nachdem Speicheldrüsen weniger Proteasen und Amylasen als Pankreas enthalten, ist es möglich, das Speicheldrüsengewebe vor der Aufarbeitung einige Zeit im Kühlschrank bei etwa 4°C aufzubewahren, ohne dass das Gewebe zu sehr geschädigt wird. Im konkreten Beispielsfall betrug die Aufbewahrungszeit 15 h und brachte keine nachteiligen Folgen für die Isolierung der gewünschten Stammzellen mit sich.
Die folgenden Beispiele 4 und 5 beschreiben detailliert zwei Arbeitsprotokolle zur Herstellung von organoiden Körpern (Organoid Bodies) und differenzierten Zellen.
BEISPIEL 4 Die undifferenzierten Zellen werden mit einer Lösung aus 10 ml PBS, 4 ml Trypsin, 8 ml Differenzierungsmedium abtrypsi- niert und 5 Minuten abzentrifugiert . Das resultierende Pellet wird so in Differenzierungsmedium resuspendiert, dass sich eine Verdünnung von 3000 Zellen je 100 μl Medium einstellt. Anschließend werden die Zellen nochmals gut mit einer 3 ml Pipette suspendiert.
Von bakteriologischen Petrischalen, die vorher mit jeweils 15 ml PBS (37 °C) pro Platte beschichtet worden sind, wird der Deckel abgenommen und umgedreht. Mit Hilfe einer automatischen Pipette werden auf einen Deckel ca. fünfzig 20 μl Tropfen gegeben. Der Deckel wird dann schnell umgedreht und auf die mit Differenzierungsmedium gefüllte Petrischale gegeben, sodass die Tropfen nach unten hängen. Die Petrischalen werden anschließend vorsichtig in den Brutschrank gestellt und für 48 h inkubiert.
Daraufhin werden die in den hängenden Tropfen aggregierten Zellen, die hier Organoid Bodies (OB) genannt werden sollen, aus jeweils vier Deckeln in je eine bakteriologische Petrischale mit 5 ml Inkubationsmedium mit 20 % FKS überführt und für weitere 96 h kultiviert. Die Organoid Bodies werden nun vorsichtig mit einer Pipette aufgesammelt, und in mit 0,1 % Gelatine beschichtete Zellkulturgefäße mit Differenzierungsmedium überführt. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens verwendet 5 man als Kulturgefäß mit 0,1 % Gelatine beschichtete 6 cm Petrischalen, in die 4 ml Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und die anschließend mit je 6 Organoid Bodies beschickt werden. Ein weiteres bevorzugtes Kulturgefäß sind mit 0,1 % Gelatine beschichtete Chamber Südes, in die 3 ml Differenzie-
10 rungsmedium vorgelegt wurde und die anschließend mit je 3-8 Organoid Bodies beschickt werden. Daneben können auch 24-Mulden-Mikrotiterplatten verwendet werden, die mit 0,1 % Gelatine beschichtet wurden und in die je 1,5 ml pro Mulde Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und anschließend mit
15 je 4 Organoid Bodies beschickt werden.
Derart kultiviert, ist die Differenzierungsfähigkeit der Zellen in den Organoid Bodies aktiviert und die Zellen differenzieren sich in Zellen der drei Keimblätter Mesoderm, Entoderm 20 und Ektoderm. Die Zellen können sowohl als Organoid Bodies als auch als einzelne Zellen gelagert und kultiviert werden und behalten ihre Pluripotenz.
BEISPIEL 5
25.. Für die Induktion der Differenzierung wurden vorzugsweise Stammzellen nach dem 42. Tag der Kultivierung verwendet. Die Verwendung von Stammzellen nach der 3. oder 4. Passage oder von Zellen, die bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff 12-18 Monate lang gelagert worden waren, war ebenfalls prob-
30 lemlos möglich.
Zunächst wurden die Zellen in Differenzierungsmedium mit der oben angegebenen Zusammensetzung überführt und auf eine Dich- te von etwa 3 x 104 Zellen/ml eingestellt; z.B. durch Tryp- sinbehandlung einer Stammzellkultur in Nährmedium, 5-minütige Zentrifugation bei 1000 UpM und Resuspendierung des Pellets in Differenzierungsmedium und Verdünnung soweit erforderlich.
Anschließend wurden mit einer 20-μl-Pipette ca. 50 20-μl- Tropfen (600 Zellen/20 μl) auf die Innenseite des Deckels einer bakteriologischen Petrischale gegeben (gestopfte Spitzen) und die Deckel vorsichtig auf die mit PBS gefüllten Petrischalen gestülpt, sodass die Tropfen nach unten hängen. Für jeden Deckel wurde eine neue Spitze verwendet. Die Petrischalen wurden anschließend vorsichtig in den Brutschrank gestellt und 48 h lang bei 37 °C inkubiert.
Danach wurden die in den hängenden Tropfen aggregierten Zellen, die Organoid Bodies (OB), aus jeweils vier Deckeln in je eine bakteriologische Petrischale mit 5 ml Inkubationsmedium mit 20 % FKS überführt (Deckel schräg halten und die OBs mit etwa 2,5 ml Nährmedium abspülen) und für weitere 5-9 Tage, vorzugsweise 96 h, kultiviert.
Die Organoid Bodies wurden nun vorsichtig mit einer Pipette aufgesammelt und in mit 0,1 % Gelatine beschichtete Zellkul- turgefäße mit Differenzierungsmedium überführt. Die OB vermehrten sich nun und wuchsen in zum Teil einzelnen Zelkolo- nien, die wieder vermehrt, vereinzelt und vermehrt werden konnten. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wurden als Kulturgefäß mit 0,1 % Gelatine be- schichtete 6 cm Petrischalen verwendet, in die 4 ml Differenzierungsmedium vorgelegt worden war, und diese mit je 6 Organoid Bodies beschickt. Ein weiteres bevorzugtes Kulturgefäß waren mit 0,1 % Gelatine beschichtete Chamber Südes, in die 3 ml Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und die anschließend mit je 3-8 Organoid Bodies beschickt wurden, und Therma- nox-Platten (Nalge Nonc International, USA) für elektronenmikroskopische Studien. Eine weitere Alternative waren 24-Mulden-Mikrotiterplatten, die mit 0,1 % Gelatine beschichtet wurden und in die je 1,5 ml pro Mulde Differenzierungsmedium vorgelegt wurde und die anschließend mit je 4 Organoid Bodies beschickt wurden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wurden OBs etwa 7 Wochen lang in den gelatine-beschichteten 6-cm- Petrischalen kultiviert und danach wurden einzelne OBs mit dem Microdissector (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) nach den Anweisungen des Herstellers ausgeschnitten und dann z.B. auf frische 6-cm-Petrischalen, Chamber Südes oder Thermanox- Platten überführt. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wurden einzelne OBs mit Pipettenspitzen durch leichtes Ansaugen abgelöst und transferiert, anschließend z.B. Beobachtung unter dem inversen Mikroskop.
BEISPIEL 6 Charakterisierung differenzierter Zellen in den organoiden Körpern
1. Immunohistochemiθ Organoid Bodies, die mindestens 3 Wochen lang auf Chamber Südes kultiviert worden waren, sowie Querschnitte von "Langzeit"-OBs wurden zweimal in PBS gespült, fünf Minuten lang mit Methanol :Aceton (7:3), enthaltend 1 g/ml DAPI (Röche, Schweiz) bei -20°C fixiert und dreimal in PBS gewaschen. Nach Inkubation in 10%igem normalem Ziegenserum bei Raumtemperatur für 15 Minuten wurden die Proben über Nacht mit primären Antikörpern bei 4°C in einer Befeuchtungskammer inkubiert. Die primären Antikörper waren gegen das Proteingenprodukt 9.5 (PGP 9.5, polyklonaler Kaninchenantikörper, 1:400, Ultraclo- ne, Insel Wight) , Neurofilamente (NF-Pan-Cocktail, polyklonaler Kaninchenantikörper, 1:200, Biotrend, Deutschland), α- Smooth-muscle-actin (α-SMA, monoklonaler Mausantikörper, 1:100, DAKO, Dänemark), güales fibrilläres saures Protein (GFAP, monoklonaler Mausantikörper, 1:100, DAKO, Dänemark), Kollagen II (monoklonaler Mausantikörper II-II-6B3, 1:20, De- velopmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, USA), Vigiün FP3 (1:200, Kügler et al . , 1996), Cytokeratine (Pan Cytokeratin, monoklonaler Mausantikörper, 1:100, Sigma, USA), Alpha-Amylase (polyklonaler Kaninchenantikörper, 1:100, Calbiochem, Deutschland) und Insulin (monoklonaler Mausantikörper, 0,5 g/ml, Dianova, Deutschland) gerichtet. Nach dreimaligem Spülen mit PBS wurden Objektträger 45 Minuten lang bei 37 °C mit entweder Cy3-markiertem Antimaus-IgG oder FITC- markiertem Antikaninchen-IgG (Dianova), beide 1:200 verdünnt, inkubiert. Die Objektträger wurden dreimal in PBS gewaschen, mit Vectashield Mounting Medium (Vector, USA) beschichtet und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Axiosop Zeiss, Deutschland) oder mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop (LSM 510 Zeiss, Deutschland) analysiert. Eine Alcianblaufärbung wurde mittels Standardverfahren durchgeführt.
2. Transmissionselektronenmikroskopie OBs wurden auf Thermanox-Platten (Nalge Nonc International, USA) mindestens 3 Wochen lang kultiviert. An den Thermanox- Platten haftende Proben wurden durch Eintauchen in 0,1 M Ca- codylat-Puffer, enthaltend 2,5 % Glutaraladehyd und 2 % Para- formaldehyd, bei pH 7,4 24 h lang inkubiert. Nach einer Nach- fixierung in 1% Os04, "en bloc"-Anfärbung mit 2% Uranylacetat und Dehydrierung in reinen Alkoholen wurden die Proben in A- raldite eingebettet. Nach Entfernung der Thermanox-Platte wurden Semithin-Schnitte entweder tangential oder senkrecht zur eingebetteten Zellkultur vorgenommen und mit Methylenblau und Azur II geschnitten. Ultradünne Schnitte wurden aus den Regionen von Interesse ausgeschnitten, mit Bleicitrat angefärbt und unter einem Transmissionselektronenmikroskop (Phil- lips, EM 109) untersucht.
Die folgenden Beispiele 7 bis 10 beschreiben das Kontaktieren von organoiden Körpern, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, mit verschiedenen Wirkstoffen und die Feststellung einer durch den jeweiligen Wirkstoff verursachten Veränderung der organoiden Körper und/oder der darin enthaltenen differenzierten Zellen durch direkten visuellen Nachweis bzw. den Nachweis von Markerproteinen. BEISPIEL 7
Bei diesem und den folgenden Beispielen werden mehrere gemeinsam vermehrte organoide Körper einer Charge (z.B. durch Trennung geeigneter Organoide und erneute Vergrößerung bis zur gewünschten Anzahl erzeugt) , üblicherweise mindestens 6 in einer Gruppe, für einen Versuch eingesetzt.
Bei diesem Beispiel wurden organoide Körper für einen Zeitraum von 1 bis 2 Tagen verschiedenen mikromolaren Konzentrationen von Puromycin, einem Wirkstoff, der die Translation hemmt, ausgesetzt. Danach wurde die Größe der behandelten organoiden Körper mit derjenigen einer unbehandelten Kontrolle verglichen (siehe mikroskopische Vergleichsaufnahme in Fig. 5A) . Bei einem zweiten Nachweisverfahren wurden die Organoide in 10 ml Lysispuffer, enthaltend 7,5 ml PBS, 2,5 ml NP-40 und 1 mM PEFA-Block aufgenommen, über Nacht im Kühlschrank bei 4 °C gelagert und dann in Minihomogenisatoren für Eppendorf- röhrchen homogenisiert. Das Homogenisat wurde zentrifugiert, der Überstand entnommen und nach Standardverfahren elektro- phoretisch aufgetrennt und das Gel einem Western-Immunoblot unterworfen. Fig. 5B zeigt die Ergebnisse der Behandlung über den Nachweis des Translationsmarkers Vigiün. Die ersten vier Banden entstehen durch die verschiedenen Wirkmengen von Puro- mycin, die letzten beiden zeigen die Vigiünmenge in den un- behandelten Organoiden; pro Spur wurde immer die gleiche Menge Gesamtprotein aufgetragen.
BEISPIEL 8 Die organoiden Körper wurden mit 2 x 10~6 M Retinsäure oder ohne Retinsäure 7, 11, 14 und 17 Tage lang inkubiert. Danach wurden die organoiden Körper wie in Beispiel 7 beschrieben homogenisiert und einem Westernblot-Assay unterworfen. Es wurden die Marker α-SMA (α-smooth muscle actin) und ein Ge- misch von Neurofilamenten (NF) angefärbt (Fig. 6). Während die Menge des Aktins während der gesamten Behandlungszeit höher ist als bei der Kontrolle, verändert sich die Menge der im Westernblot nachweisbaren synthetisierten NF nur am 7. und 11. Tag der Behandlung.
BEISPIEL 9
Die organoiden Körper wurden mit 40 ng/ml HGF („hepatocyte growth factor") oder ohne HGF 7, 11, 14 und 17 Tage lang inkubiert. Danach wurden die organoiden Körper wie in Beispiel 7 beschrieben homogenisiert und einem Westernblot-Assay unterworfen. Es wurde die Bildung des Leberproteins α- Fetoprotein untersucht (Fig. 7) . Nach 7 und 11 Tagen Inkubation ist eine deutliche Synthese des Fetoproteins zu beobachten, während eine längere Einwirkdauer die Bildung eher wie- der hemmt. BEISPIEL 10
Organoide Körper wurden ohne oder mit konditioniertem Medium von Chondrozyten-Primärkulturen inkubiert und das Vorhandensein von Kollagen-II als typischem Knorpelprotein wieder mit einem Westernblot wie oben untersucht (Fig. 8) . Beide Ansätze mit Chondrozyten-Kultur-Überständen zeigen eine leichte Zunahme des Kollagen-II gegenüber der Kontrolle mit einfachem Medium.
Die obigen Beispiele demonstrieren nur eine prinzipielle Vorgehensweise bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung mit einer kleinen Auswahl chemischer Wirkstoffe und Nachweisverfahren. Die Erfindung ist jedoch keineswegs auf diese Ausführungsbeispiele beschränkt. Alternativen, insbesondere alter- native Nachweisverfahren, sind dem Fachmann bekannt oder anhand der detaillierten Offenbarung dieser Anmeldung in Verbindung mit dem zitierten Stand der Technik unschwer aufzufinden.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln oder auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Testen von Substanzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf biologische Zellen unter Verwendung multizellulärer Zellaggregate, als organoide Körper bezeichnet, dadurch gekennzeichnet, daß die zu testende Substanz in Kontakt mit den organoiden Körpern gebracht wird und deren Wirkung, falls vorhanden, durch eine morphologische oder anderweitig nachweisbare Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen festgestellt wird, wobei die organoiden Körper durch Aggregation und Differenzierung multipotenter oder pluripotenter adulter Stammzellen gebildet wurden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Verfahren zur Analyse der Wirkung bekannter oder potenzieller Wirkstoffe oder Mutagene auf alle oder spezielle Zelltypen der organoiden Körper handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Verfahren zum Screenen von Arzneiwirkstoffen oder Kosmetika handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellaggregate Säugerzellaggregate, insbesondere humane Zellaggregate, sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die zu testende Substanz ein Protein, Pep- tid, eine Nukleinsäure, z.B DNA, RNA oder ein Derivat davon, oder eine niedermolekulare chemische Substanz ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekenn- zeichnet, daß die multipotenten oder pluripotenten adulten Stammzellen aus exokrinem Drüsengewebe isoliert wurden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem exokrinen Drüsengewebe um acinäres Gewebe handelt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkung der Substanz ei- ne Veränderung der Morphologie oder des Proüferations- vermögens, Wachstumsvermögens oder der Lebensfähigkeit oder einer anderen Aktivität aller Zelltypen oder spezieller Zelltypen der organoiden Körper ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz über den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit oder Menge einer Markersubstanz, die von speziellen oder allen Zelltypen der organoiden Kör- per gebildet wird, erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz über den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit oder Menge eines Markerproteins erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Markerprotein durch Bindung von Farbstoffen, Anti- körpern oder Rezeptoren, durch einen Westernblot, durch enzymatische oder sonstige Aktivität des Markerproteins nachgewiesen wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz über den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit oder Menge einer Nukleinsäure, z.B. DNA oder RNA oder ein Derivat davon, erfolgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Wirkung der chemischen Substanz die Anwendung eines oder mehrerer Verfahren ausgewählt aus der Gruppe aus Protein-Assays, Immunoas- says, enzymatischen Assays, Rezeptorbindungs-Assays, E- LISA-Assays, RIA-Assays, elektrophoretischen und chromatographischen Assays, einschließlich HPLC, Northernblots, Southernblots, Westernblots, kolorimetri- schen Assays, immunhistochemischen, elektrophysiologi- sehen, mikroskopischen und spektroskopischen Nachweismethoden umfaßt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelltypen der organoiden Körper aus der Gruppe aus Osteoblasten, Osteoclasten, Chondrozyten, Adipozyten, Fibroblasten, Muskelzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, hematopoetischen Zellen, sensorischen Zellen, endokrinen und exokrinen Drüsenzellen, Gliazellen, neuronalen Zellen, Oügodendrozyten, Blutzellen, Darmzellen, Herz-, Lungen-, Leber-, Nieren- oder Pankre- aszellen ausgewählt sind.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelltypzusammensetzung der organoiden Körper durch Kultivierung in einem Medium, welches zelltyp-spezifische Differenzierungs- und/- oder Wachstumsfaktoren enthält, festgelegt wurde.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren aus der Gruppe bestehend aus bFGF, VEGF, DMSO und Isoproterenol, Fibroblastenwachstumsfaktor 4 (FGF4), Hepatozyten-Wachs- tumsfaktor (HGF) , TGF-betal, EGF, KGF, Retinsäure, beta- NGF, BMP-4 und Activin-A ausgewählt sind.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekenn- zeichnet, daß zwei oder mehr der verschiedenen Zelltypen der organoiden Körper gewebe- oder organähnliche Strukturen bilden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder mehr der verschiedenen Zelltypen der organoiden Körper neuromuskuläre Strukturen oder Glia-Nerven- zell-Strukturen oder Hautzellstrukturen bilden.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeich- net, daß die Testsubstanz eine Veränderung dieser Strukturen bewirkt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung eine Zerstörung der Strukturen, Hemmung oder Stimulation der Entwicklung der Strukturen und/oder eine Veränderung der Aktivität eines oder mehrerer Zelltypen, aus denen sich diese Strukturen zusammensetzen, ist .
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-20, dadurch gekennzeichnet, daß sich die organoiden Körper in Hohlräumen, Matrices oder anderen Träger- und/oder Formgebungssystemen befinden.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-21, dadurch gekennzeichnet, daß zwei oder mehr Testsubstanzen gleichzeitig oder nacheinander mit denselben organoiden Körpern getestet werden.
23. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-22, umfassend die organoiden Körper in einem geeigneten Behälter, Träger- oder Formgebungssystem, Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden Substanz sowie Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen.
24. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-22, umfassend die organoiden Körper wie in Anspruch 1 definiert in einem geeigneten Kulturmedium zur Aufrechterhaltung der organoiden Körper.
25. Kit nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sich die organoiden Körper in Hohlräumen, Matrices oder anderen Träger- und/oder Formgebungssystemen befinden.
26. Kit nach Anspruch 24 oder 25, umfassend ferner Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden Substanz.
27. Kit nach einem der Ansprüche 24-26, umfassend ferner Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen sowie gegebenenfalls weitere Reagenzien und Hilfsstoffe.
28. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-22, umfassend multipotente oder pluripotente adulte Stammzellen, aus denen die organoiden Körper wie in Anspruch 1 definiert herstellbar sind, in einem geeigneten Kulturmedium zur Aufrechterhaltung dieser adulten Stammzellen, sowie Reagenzien, einschließlich gegebenenfalls Differenzierungsfaktoren, und Kulturmedien, um organoide Körper einer gewünschten Zelltypzusammen- Setzung herzustellen.
29. Kit nach Anspruch 28, umfassend ferner Mittel zur Kontaktierung der organoiden Körper mit einer zu testenden Substanz .
30. Kit nach Anspruch 28 oder 29, umfassend ferner Mittel zum Nachweis einer morphologischen oder anderweitigen Veränderung dieser organoiden Körper oder der darin enthaltenen Zelltypen sowie gegebenenfalls weitere Reagen- zien und Hilfsstoffe.
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